Реестровый номер торгов 10;pdf

РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 8(17), № 1, с. 20–24
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ГОРМОНЫ РЕПРОДУКЦИИ В РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ
МОЛЕКУЛЫ CD16 ИНТАКТНЫМИ NK-КЛЕТКАМИ
© 2014 г.
С.В. Ширшев, Е.Г. Орлова, С.А. Заморина,
И.В. Некрасова, О.Л. Горбунова
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт экологии
и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия
Поступила: 27.11.2013. Принята: 21.01.2014
Исследовали влияние гормонов репродукции (ХГ, Е3, лептин, грелин, кисспептин) на
фенотипическое созревание интактных NK-клеток небеременных женщин. Установлено,
что в концентрациях, соответствующих первой половине физиологически протекающей
беременности, Е3 снижает, а кисспептин и грелин не влияют на активность NK-клеток,
в то время как ХГ и лептин способствуют терминальной дифференцировке (экспрессия
CD16) этих клеток. В концентрациях, соответствующих второй половине беременности,
Е3 и грелин не влияют на активность NK-клеток, кисспетин и лептин угнетают, а ХГ стимулирует фенотипической созревание NK-клеток. Таким образом, гормональная модуляция
одной из молекул терминальной дифференцировки NK-клеток (CD16) является одним из
возможных механизмов формирования специфического изменения баланса CD3-CD16+/
CD3-CD16– клеток во время физиологически протекающей беременности.
Ключевые слова: хорионический гонадотропин, эстриол, лептин, грелин, кисспептин,
NK-клетки
щественно в период беременности и только
в этот период способен оказывать влияние на
клетки иммунной системы [3, 4].
Во время беременности важную роль во
взаимоотношениях матери и плода играют
NK-клетки. Известно, что NK-клетки лизируют не только клетки-мишени, инфицированные внутриклеточными патогенами и
неоплазмы, а также клетки трофобласта [5].
В период ранней беременности NK-клетки
являются доминантными среди лимфоидных
клеток, локализованных в децидуальной оболочке [6]. Помимо реализации своих цитотоксических функций эти клетки, находясь
непосредственно в тканях, участвуют в формировании и моделировании спиральных
артерий, плацентации и регуляции инвазии
трофобласта за счет секреции интерлейкина
(IL)-8 и ряда других факторов [6]. NK-клетки потенцируют также индукцию Т-регуляторных лимфоцитов через интерферон
(IFN)-γ-зависимую активацию децидуальных
CD14+-клеток, сопровождаемую повышением активности индоламин-2,3-диоксигеназы
с последующим повышением уровня L-кину-
ВВЕДЕНИЕ
Объяснение причин толерантности иммунной системы матери к генетически чужеродному плоду является актуальной проблемой репродуктивной иммунологии, в рамках
которой важнейшим направлением является
анализ роли гормонов в регуляции иммунитета.
Известно, что основные репродуктивные
гормоны – хорионический гонадотропин
(ХГ) и эстрогены – играют важную роль в
регуляции иммунитета при беременности
[1]. Помимо этого исследования последних
лет убедительно доказывают, что пептидные
гормоны лептин и грелин – реципрокные
регуляторы энергетического гомеостаза, также являются модуляторами репродуктивной
и иммунной функций [2]. Одним из недавно
открытых гормонов является кисспептин,
который появляется в циркуляции преимуАдрес: 614081 Пермь, ул. Голева, 13, ФГБУ Институт
экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН,
Ширшеву С.В. E-mail: [email protected]
20
Гормоны репродукции в регуляции NK-клеток
21
ренина и продукцией трансформирующего
фактора роста-(TGF)-β [7]. Именно TGF-β, в
свою очередь, способствует трансформации
периферических CD16+CD9-NK-клеток в
децидуальные CD16-CD9+NK-клетки (uNK),
способствующие формированию иммунной
толерантности в период беременности [8].
NK-клетки с фенотипом CD16+CD56+
являются наиболее зрелыми и обладают высокой цитолитической активностью [8], поскольку молекула CD16 представляет собой
низкоаффинный рецептор для Fc-фрагмента
IgG1 и IgG3 (Fcγ RIII) и участвует в обеспечении реакции антителозависимой клеточной
цитотоксичности, а также в индукции секреции цитокинов [9]. Следует отметить, что экспрессия CD16 ассоциирована с терминальной
стадией дифференцировки NK-клеток и приобретением ими наибольшей цитолитической
активности [8].
Целью работы являлась оценка влияния
гормонов репродукции на экспрессию молекулы CD16 интактными NK-клетками.
спептин-54, Metastin, Synthetic, «Calbiochem»,
США) использовали в физиологических концентрациях, соответствующих его уровню
в периферической крови в I и II – III триместрах беременности – 4,6 пМ/л и 9,6 пМ/л,
соответственно [14].
После суточной инкубации с гормонами,
оценивали фенотип лимфоцитов, определяя
содержание NK-клеток с фенотипом CD3–
CD16+ с использование моноклональных антител анти-CD3-FITC и анти-CD16-PE, согласно методике производителя антител (Beckman
Coulter, США). Результаты учитывались
на проточном цитофлюориметре («Becton
Dickinson», США). Жизнеспособность лимфоцитов, определяемая в тесте с эозином
после 72 ч инкубации с гормонами, составляла 95–98%. Окрашивание поверхностных
и внутриклеточных маркеров осуществляли
согласно методике производителя моноклональных антител («eBioscience», США). При
учете результатов подсчитывали не менее
100 000 клеток. Для контроля неспецифического связывания и выделения негативного
по флюоресценции лимфоцитарного окна использовали соответствующие изотипические
контроли. Статистическая обработка данных
проводилась с помощью парного t-критерия
Стьюдента.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
В работе использовали суспензию мононуклеарных лейкоцитов периферической
крови здоровых небеременных женщин в
фолликулярной фазе менструального цикла
(n = 8). Мононуклеарные клетки получали
центрифугированием в градиенте плотности
фиколл-верографина (1,077 г/см3). Полученную суспензию (1 × 106 мл) после двойной
отмывки раствором Хэнкса инкубировали
в полной питательной среде (среда 199 с добавлением 10 мM HEPES; 2 mM L-глутамина;
100 мкг/мл гентамицина и 10% ЭТС) с гормоном
в течение суток при 37° С в условиях 5% СО2.
ХГ («Profasi», Италия) вносили в культуры в концентрациях, характерных для I и III
триместров беременности (100 МЕ/мл и 10
МЕ/мл, соответственно) [10]. Эстриол (Е3)
(«Biomedicals Inc.», Германия) использовали в
концентрациях 2 и 20 нг/мл, отражающих его
уровни в крови в I и III триместрах беременности, соответственно [11]. Лептин («Sigma»,
США) в культуры вносили в дозах 10 и 35 нг/мл,
отражающих его содержание в периферической крови в I и во II–III триместрах беременности, соответственно [12]. Грелин («Sigma»,
Израиль) использовали в концентрациях 1,25
и 0,83 нг/мл, соответствующих уровню гормона в периферической крови в I-II и III триместрах беременности [13]. Кисспептин (Кис-
РЕЗУЛЬТАТЫ
Как видно из рис. 1, ХГ, вне зависимости от
концентрации, повышает количество CD16+
NK-клеток в культуре. Суточная инкубация
клеточных культур с Е3 в концентрации, соответствующей I триместру беременности,
напротив, статистически значимо снижает
процент лимфоцитов, экспонирующих CD16.
При этом в концентрации, характерной для III
триместра беременности, гормон не влияет на
исследуемый показатель. Лептин в концентрации, характерной для I триместра беременности, повышает процент CD16+ NK-клеток,
тогда как в концентрации, сопоставимой со
II–III триместром, гормон снижает содержание этих клеток. В отличие от него грелин, вне
зависимости от используемых концентраций,
не влияет на процент CD16+ NK-клеток. Кисспептин, аналогично лептину, достоверно
понижает уровень CD16+ NK-клеток только
в концентрации, соответствующей II–III триместру беременности.
Таким образом, в первой половине физиологически протекающей беременности Е3
РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 8(17), № 1
22
С.В. Ширшев и др.
Рис. Влияние гормонов репродукции на фенотипическое созревание NK-клеток (n = 8).
Примечание: *p < 0,05 относительно контроля.
угнетает, а ХГ и лептин усиливают терминальную дифференцировку NK-клеток при отсутствии эффектов со стороны кисспептина и
грелина. Во второй половине беременности
Е3 и грелин не влияют, а кисспетин и лептин
угнетают формирование CD16+NK-клеток,
при неизменной стимуляции ХГ фенотипического созревания киллеров.
ОБСУЖДЕНИЕ
Обсуждая полученные результаты, необходимо отметить наиболее, с нашей точки зрения, важные моменты.
Во-первых, из всех гормонов только грелин
не принимает участия в контроле за терминальной дифференцировкой NK-клеток.
Во-вторых, за исключением ХГ остальные
гормоны оказывают влияние на экспрессию
CD16 в зависимости от потриместровой концентрации.
Угнетающее действие Е3 в отношении
цитотоксических CD3– CD16+ клеток в I
триместре, может быть обусловлено непосредственным влиянием гормона на процессы экспрессии молекулы CD16 или носит
опосредованное действие. Так, известно, что
низкие концентрации Е3 способны усиливать продукцию IL-10 [15], который снижает
функциональную активность NK-клеток [16].
Поскольку высокая концентрация гормона
не влияет на дифференцировку CD3-CD16+
клеток, второй вариант кажется наиболее вероятным.
Для кисспептина, чья концентрация во второй половине беременности вдвое больше,
угнетающее действие на терминальную дифференцировку NK-клеток, по-видимому, связано с его непосредственным эффектом на
данный тип клеток [4]. Так, установлено, что
при спонтанных абортах, связанных с увеличением NK-клеток, параллельно угнетается
выработка кисспептина синцититрофобластом [4]. Несмотря на то, что авторы не нашли
достоверной корреляции между уровнем децидуальных CD16+NK-клеток и экспрессией
кисспептина, наши данные подтверждают
участие кисспептина в снижении этой субпопуляции клеток. Разночтения касаются,
прежде всего срока гестации. Кисспептин
способен угнетать экспрессию CD16 только
в концентрации, которая наблюдается во второй половине беременности, в то время как
корреляция проводилась на ранних сроках
гестационного процесса [4].
Лептин, в отличие от всех изученных
гормонов, оказывает не только дозозависимые эффекты, но и разнонаправленные,
что, по-видимому, связано с особенностями трансдукции его гормонального сигнала
[17].
РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 8(17), № 1
Гормоны репродукции в регуляции NK-клеток
23
Наиболее интересные результаты получены по ХГ, который всегда позиционируется
как физиологический иммунодепрессант.
Известно, что клетки трофобласта устойчивы
к лизису цитотоксическими T-лимфоцитами
и NK-клетками, но чувствительны к лизису лимфокинактивированными киллерами
(LAK-клетки). Ранее нами было показано, что
на уровне NK-клеток ХГ ослабляет IL-2-стимулирующие эффекты на процессы экспрессии
молекулы CD16 [18]. По-видимому, усиление
гормоном экспрессии CD16 не связано с поддержанием агрессии NK-клеток, а дает возможность гормону контролировать процессы
трансформации NK в LAK на протяжении
всей беременности, интерферируя IL-2-зависимую трансдукцию экспрессии CD16.
Таким образом, три из пяти изученных
гормонов, синтез которых ассоциирован с
ростом и развитием фетоплацентарного комплекса, способны понижать уровень цитотоксических NK-клеток.
unique innate immunoregulatory role for the CD56
(bright) subset. Blood 2001, 97, 46–51.
6. Vacca P., Moretta L., Moretta A., Mingari M.C.
Origin, phenotype and function of human natural
killer cells in pregnancy. Trends in Immunol. 2011,
32, 517–523.
7. Vacca P., Cantoni C., Vitale M., Prato C., Canegallo F. et al. Crosstalk between decidual NK and
CD14+ myelomonocytic cells results in induction of Tregs and immunosuppression. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 2010, 107, 11918 – 11923.
8. Keskin D.B., Allan D.S., Rybalov B., Andzelm M.M.,
Stern J.N. et al. TGFbeta promotes conversion of
CD16+ peripheral blood NK cells into CD16- NK
cells with similarities to decidual NK cells. Proc.
Natl. Acad. Sci. U S A. 2007, 104, 3378–3383.
9. Mittag A., Lenz D., Gerstner A.O., Sack U., Steinbrecher M. et al. Polychromatic (eight-color) slidebased cytometry for the phenotyping of leukocyte,
NK, and NKT subsets. Cytometry 2005, 65, 103–
115.
10. Cole L.A. HCG, the wonder of today’s science. Reprod. Biol. Endocrinol. 2012, 10, 10–24.
11. Kase N.G., Reyniak J.V. Endocrinology of pregnancy. Mount Sinai J. Med. 1985, 52, 11–34.
12. Hardie L., Trayhurn P., Abramovich D., Fowler P.
Circulating leptin in women: a longitudinal study
in the menstrual cycle and during pregnancy. Clin.
Endocrinol. 1997, 47, 101–106.
13. Fuglsang J., Skjаеrbæk C., Espelund U., Frystyk J.,
Fisker S. et al. Ghrelin and its relationship to
growth hormones during normal pregnancy. Clin.
Endocrinol. 2005, 62, 554–559.
14. Horikoshi Y., Matsumoto H., Takatsu Y., Ohtaki T.,
Kitada C. et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J. Clin. Endocrinol. Metab. 2003, 2, 914 – 919.
15. Conti P., Kempuraj D., Kandere K., Di Gioacchino M., Barbacane R.C. et al. IL-10, an inflammatory/inhibitory cytokine, but not always. Immunol.
Lett. 2003, 86, 123–129.
16. Correale J., Arias M., Gilmore W. Steroid hormone
regulation of cytokine secretion by proteolipid
protein-specific CD4+ T cell clones isolated from
multiple sclerosis patients and normal control subjects. J. Immunol. 1998, 161, 3365–3374.
17. Ширшев С.В., Орлова Е.Г. Молекулярные механизмы регуляции лептином функциональной
активности лимфомиелоидных клеток. Успехи
современной биологии 2006, 5, 482 – 492.
18. Заморина С.А., Ширшев С.В., Горбунова О.Л. Регуляция фенотипического созревания интактных и интерлейкин-2-активированных NK- и
NKT-клеток хорионическим гонадотропином.
Доклады Академии наук 2010, 3, 411–413.
БЛАГОДАРНОСТИ
Работа выполнена при поддержке гранта
РФФИ № 13-04-96035-р_урал_а «Механизмы
гормонально обусловленной трансформации
NK-клеток в период беременности».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Ширшев С.В. Гормональные механизмы регуляции иммунной системы в период беременности. Успехи современной биологии 2005, 6,
555 – 566.
2. Орлова Е.Г., Ширшев С.В. Роль лептина и грелина в индукции дифференцировки ИЛ17-продуцирующих и Т-регуляторных лимфоцитов.
Бюл. эксперим. биологии и медицины 2013, 12,
786 – 791.
3. Горбунова О.Л., Ширшев С.В., Заморина С.А.
Влияние кисспептина на функциональную
активность моноцитов. Иммунология 2013, 5,
247 – 251.
4. Park D.W., Lee S.K., Hong S.R., Han A.R., KwakKim J. et al. Expression of Kisspeptin and its receptor GPR54 in the first trimester trophoblast of
women with recurrent pregnancy loss. Am. J. Reprod. Immunol. 2012, 67, 132–129.
5. Cooper M.A., Fehinger T.A., Turner S.C., Chen K.S.,
Ghaheri B.A. et al. Human natural killer cells: a
РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 8(17), № 1
24
С.В. Ширшев и др.
THE HORMONES OF REPRODUCTION IN THE REGULATION
OF CD16 MOLECULE EXPRESSION BY INTACT NK CELLS
S.V. Shirshev, E.G. Orlova, S.A. Zamorina,
I.V. Nekrasova, O.L. Gorbunova
Institute of Ecology and Genetics of Microorganisms Ural Branch of the Russian Academy
of Sciences, Perm, Russia
The effects of hormones of reproduction (hCG, E3, leptin, ghrelin, kisspeptin) on the phenotypic
maturation of intact NK-cells in nonpregnant women was investigated. It was found that E3 in
concentrations, corresponding to that in the first half of the physiological pregnancy, reduced
the activity of NK-cells, ghrelin and kisspeptin did not affect it, while hCG and leptin promoted
terminal differentiation (expression of CD16) of these cells. Ghrelin and E3 at concentrations,
corresponding to that in the second half of pregnancy, didn’t affect the activity of NK-cells,
leptin and kisspetin depressed phenotypic maturation of NK-cells and hCG stimulated it. Thus,
the hormonal modulation of the NK-cells terminal differentiation molecule (CD16) is one of the
possible mechanisms for the formation of specific changes in the balance of CD3-CD16+/CD3–
CD16– cells during physiological pregnancy.
РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2014, том 8(17), № 1