Четыре составляющих духовной жизни;pdf

Молекулярные основы гемостаза
проф. Добровольский А.Б.
ФГБУ Российский кардиологический научнопроизводственный комплекс Минздрава России
22 апреля 2014 г., Москва
Схема активации свертывания крови (70 гг. ХХ века)
«Внутренний путь»
(каолин, стекло …
«Внешний путь»
(тканевый фактор)
?
XIIa
ТФ
VIIa
XIa
IXa
Тест АЧТВ
VIIIa
ПТ-тест
Xa
Va
Тромбин
Фибриноген
Фибрин
Основные реакции образования тромбина
XIa
IXa
ТФ
Тканевый фактор (ТФ) –
основной активатор ССК
ТФ
ТФ инициирует образование тромбина, который
VIIa
значительно усиливает
свое образование активируя тромбоциты,ФV и VIII
VIIIa
Xa
Va
Тромбин
Фибриноген
Фибрин
и еще больше - активируя
ФХI
Гемофилия А (В) – дефицит факторов VIII (IX)
ТФ
XIa
ТФ
IXa
VIIa
VIIIa
Xa
Нарушены фазы усиления
образования тромбина.
Кровоточивость зависит от
остаточной активности факторов:
< 1% - тяжелая, 1 - 8% - умеренная,
> 8% -мягкая формы.
Протромбин
Va
Тромбин
Фибриноген
Фибрин
Гемофилия C – дефицит фактора XI
Rugeri et al., 2010
ТФ
XIa
FXI<1%
ТФ
IXa
VIIa
VIIIa
Xa
Нарушена только одна фаза
усиления образования тромбина:
- спонтанные кровотечения –
редко, преимущественно при
повреждении тканей с активным
фибринолизом
- снижены риски ИИ, ВТЭ, но не ИМ ?
Va
Протромбин
Тромбин
Фибриноген
Фибрин
Основное количество тромбина образуется на поверхности
активированных тромбоцитов
Синдром Скотта: тромбоциты
при активации не экспонируют
прокоагулянтные фосфолипиды
ТФ
XIa
Тромбин (нМ)
+ фосфолипиды
ТФ
IXa
VIIa
VIIIa
Xa
Протромбин
мин
Wielders et al., Thromb Haemost, 2009;101:76-82
Va
Тромбин
Фибриноген
Фибрин
Тромбоциты усиливают образование тромбина, а стабильность
тромбоцитарных агрегатов in vivo зависит от образования тромбина
ТФ
XIa-/-
ТФ
IXa
VIIa
VIIIa
Xa
Va
5
10
20 30 мин
Wang et al., JTH, 2005
Тромбин
Фибриноген
Фибрин
Активированные тромбоциты – основное место образования
тромбина, тромбин – самый мощный из индукторов агрегации
ТФ
XIa
ТФ
IXa
VIIa
VIIIa
Xa
Протромбин
Va
Тромбин
Фибриноген
Storey RF Thromb Haemost 2011; 105 (Suppl 1): S75–S81
Фибрин
Ингибиторы образования тромбина
«Усиление» образования
тромбина ингибируется
антитромбином и системой
протеина С
АТ
ТФ
XIa
ТФ
IXa
VIIa
VIIIa
ПрС
ПрS
Xa
Va
ИПТФ
«Инициация» образования
тромбина ингибируется
Тромбин ингибитором пути
ТФ, который вначале
связывается с ФХа, а затем
Дефицит факторов VIII (IX) – ↑ риск кровотечений
комплексом ФVIIa-ТФ
Дефицит ингибиторов – ↑ риск тромбозов
Эндотелий – основной регулятор функции тромбина
Тромбомодулин
?
АТИФ
Тромбин
ЭРПС
Протеин Са
Протеин S
Тромбин
Стабилизация
тромба
Ф XI Ф VIII Ф V
ATIII
Ингибирование
образования
тромбина
Инактивация
Аспирин, статины, ингибиторы АПФ …. снижают образование
тромбина в тесте «время кровотечения»
N=13
120
Исходно
Аспирин 75 мг/день
Фрагмент 1+2 протромбина (нМ)
100
80
60
40
20
0
0
100
200
300
Время (сек)
A.Undas et al. JTH, 2006;4:2397-2404
Активация свертывания крови и фибринолиза
ТФ
XIa
ТФ
IXa
т-АП
ИАП-1
оц-уАП
VIIa
x
VIIIa
x
Xa
Va
Тромбин
Фибриноген
Фибрин
Плазминоген-Фибрин
Плазмин
x
ПДФ
α2Ап
Тромбин — ингибитор фибринолиза
Тромбин
0.5 нМ
20 нМ
F.Semeraro et al., 2007
Wolberg Blood Reviews 2007; 21, 131–142
C.Ammollo et al., 2010
Агрегаты
тромбоцитов
+Анти-lIIb/IIIa
Зона лизиса
Collet et al. Circ Res. 2002;90:428-434
Влияние ε-АКК на показатели ТЭГ у больных с тяжелой
формой гемофилии
Ghosh et al. Haemophilia (2007) 13, 734–39
Составляют одно целое,
их деление:
Заключение
Стенка
сосудов
тромбоциты
Система
свертывания
крови
– способ изложения
материала в учебниках
– и реальность нашей
лабораторной
диагностики
ТРОМБИН
Система
противосвертывания
Система
фибринолиза
ЗАДАЧИ ЛАБОРАТОРИИ
• Выявление нарушений в системе
гемостаза:
 кровотечения
 тромбозы
• Контроль терапии
Алгоритм начальной диагностики
нарушений системы гемостаза
Клинические проявления
Индивидуальный и
семейный
анамнез, провоциру
ющий фактор
Скрининговые
тесты
Решение о терапии или о необходимости
дополнительных исследований
СКРИНИНГОВЫЕ ТЕСТЫ




Протромбиновый тест
АЧТВ
Фибриноген
Д-димер
 Фактор фон Виллебранда
Устаревшие
(нестандартизованные) тесты
•Время свертывания
•Каолиновое и Кефалиновое время
•Тромбоэластография
 Время лизиса эуглобулинов
 Время кровотечения
 Агрегация тромбоцитов




Тест дожен иметь
установленные:
диагностическую значимость
метод калибровки
(стандартизации)
систему контроля качества
Что определяется в тестах, основанных на измерении
времени образования сгустка?
В клоттинговых тестах – ПТ, АЧТВ, …
определяется начальная скорость
образования тромбина. Она снижается при
дефиците факторов, но дефицит
антикоагулянтов на этот показатель не влияет.
Фибрин
Тромбин, образующийся внутри сгустка
, обеспечивает его стабилизацию и
участвует в регенерации тканей.
Тромбоз
Гемостаз
Геморрагия
Диагностическая значимость тестов, основанных на
измерении времени образования сгустка
 Выявление дефицита факторов:
- врожденного
- приобретенного (заболевания печени, дефицит витамина К,
патологические ингибиторы)
 Мониторинг:
- коагулопатии потребления
- заместительной или антикоагулянтной терапии
 «Укорочение» времени свертывания (АЧТВ):
- активация свертывания на преаналитическом этапе
- повышение (↑↑↑) фибриногена, фактора VIII
Клиническое значение тромбофилий
2479 родственников больных с ВТЭ+ тромбофилия (Lijfering et al., Blood, 2009, 113, 5314-5322)
Частота (%)
Тромбофилия
 Антитромбин
 Протеин С Высокий
риск
 Протеин S
ФV-Лейден
ПТ G20210A
 ФVIII
Средний
риск
Популяция
Б-ные ВТЭ
<0.5%
1 – 15%
<5%
5 – 25%
Высокий риск
Первичная профилактика – сомнительна
т.к.частота ВТЭ сравнима с риском Б.геморрагий
на терапии АВК (до2%)
Увеличение стандартных сроков лечения ВТЭ*
– скорее да, но не доказано
ОР 1-й ВТЭ
vs
популяции
Частота
ВТЭ
(%/год)
Частота
повторных
ВТЭ (%)
15 – 19
1.77
1.52
1.9
2 г. – 19%
5 л. – 40%
10 л. – 55%
3–5
0.49
0.34
0.49
2 г. – 7%
5 л. – 11%
10 л. – 25%
Средний риск
Первичная профилактика – не нужна т.к.частота
Б.геморрагий на терапии АВК превышает частоту ВТЭ
Увеличение стандартных сроков лечения ВТЭ* –
скорее да, но не доказано
* - альтернатива – определение Д-димера
В каких случаях целесообразен скрининг на
тромбофилю ?








спонтанного ВТЭ, или в возрасте до 50 лет
ВТЭ у беременных, или женщин на гормональной терапии
при повторных тромбозах
нетипичных местах локализации
членов семьи ностителей тромбофилии
повторных выкидышей, или гибели плода после 20-й недели
тяжелой преклампсии
при принятии решения о длительности антикоагулянтной
терапии после ТГВ/ТЭЛА, особенно при отсутствии
провоцирующего фактора
Атеротромбоз - ведущая причина смертности в мире
Murray et al. Lancet 1997;349:1269-1276
Ye Z et al, Lancet 2006;
Мета-анализ: 66155/91307
Атеротромбоз
Инфекции
Респираторные
заболевания
Рак
Насильственная
смерть
СПИД
0
2
4
6
8
10
12
14
Количество смертей (x 106)
FVII 10967A, GPIba –5C, GPIa 807T, GPIIIa 1565T - НЗ
16
Мутация
ОР (95%)
ФV R506Q
1.17
(1.08-1.28)
ПТ G20210A
1.31
(1.12-1.52)
ИАП-1
5G/4G
1.06
(1.02-1.10)
Becker RC Am Heart J.
2003;146:948-57
1.20
МТГФР ТТ
(1.02-1.41)
Дефицит ингибиторов системы свертывания крови и риск
атеротроботических осложнений в молодом возрасте
552 родственника из 88 семей, 308 – ↓ПрС, ПрS или Антитромбин
5.6 (1.7-19.1) р=0.008
1.3 (0.6-3.0) р=0.51
Гипертония
Гиперлипидемия
1.8 (1.1-3.0) р=0.03
2.0 (1.1-3.7) р=0.02
% больных без АТО
↓ПрС,S,AT
<55 лет
↓ПрС,S,AT
>55 лет
Курение
2.1 (1.1-3.6) р=0.03
Возраст
Mahmodi et al Circulation 2008; 118:1659-67
Тромбофилии и риск ишемического инсульта в возрасте до 18
лет ( G.Kenet et al. Circulation 2010;121;1838-1847)
Анализ: 1764 – ИИ, 1526 - ТЦВС и 2799 контрольных лиц
Тромбофилия
OR (95%CI) ИИ
OR (95%CI) ТЦВС
ПрС↓
11 (5.13-23.59)
6.12 (0.87-43.7)
АФС
6.95 (3.67-14.14)
-
Лп(а)↑
6.53 (4.46-9.55)
-
ФV-Лейден
3.7 (2.82-4.85)
2.74 (1.73-4.34)
Антитромбин↓
3.29 (0.7-15.48)
18.41 (3.25-104.29)
ФII-G20210A
2.6 (1.66-4.08)
18.41 (3.25-104.29)
МТГФР С677Т
1.58 (1.2-2.08)
-
ПрS↓
1.49 (0.32-6.92)
5.27 (1.53-18.21)
≥2 дефектов
18.75 (6.49-54.14)
5.27 (1.53-18.21)
Фибриноген – фактор риска ССЗ
12
10
Женщины
8
6
4
2
0
1
2
3
4
Квартили фибриногена
Смертность (% событий/8 лет)
ИБС (% событий/8 лет)
Мужчины
12
10
Мужчины
Женщины
8
6
4
2
0
1
2
3
4
Квартили фибриногена
Scottish Heart Health Study: 5113 м, 133 ж, 8 лет наблюдения
Факторы риска венозных тромбозов
Врожденные
Приобретенные
Lippi & Franchini. Semin Thromb Hemost , 2008
Маркеры активации системы свертывания крови
ФфВ тАП ИАП-1
VIIa + ТФ
VII
Ха
-ТГ
фактор 4
IXa + пептиды
Тромбин + Ф1+2
Фибриноген
область повреждения
интактный эндотелий
ПрСа
ТАТ
Фибрин-мономер
+ ФпА
(Д-димер, РКФМ)
Фибрин
Плазмин-антиплазмин
ПДФ
Образование фибрина
ФпА,В
ФпА,В
D-домен
E-домен
D-домен
Тромбин +
ФпА,В
После отщепления ФпА
(ФпВ) в центральном Едомене экспонируются
участки комплементарные
Д-доменам
РКФМ
Д-д – структура, которой нет в нативном Фг, но появляется
при связывании фибриногена с фибрин-мономером
ФпА,В
ФпА,В
D-домен
E-домен
D-домен
Тромбин +
РКФМ
ФпА,В
Д-димер
В тесте «Д-димер» определяются все производные
фибриногена, содержащие Д-д структуру
Производные фибрин(оген)а,
взаимодействующие с антителами
к Д-Д (FACT - Dempfle et al., 2001)
ФпА,В
ФпА,В
E-домен
{
D-домен
Тромбин +
} Олигомеры
(РКФМ)
ФпА,В
Д-Д
РКФМ
Контроль
ДВС
ТГВ
D-домен
Диагностикумы значительно различаются по чувствительности к
высоко- и низкомолекулярным производным фибриногена
A.Tripodi, V.Chantarangkul, JTH, 2007,5,184-185)
Производные фибрин(оген)а,
взаимодействующие с антителами
к Д-Д (FACT - Dempfle et al., 2001)
{
} Олигомеры
(РКФМ)
QC-1 - нормальная плазма, QC-2 & QC-3 – Д-димер,
полученный из расщепленного плазмином фибрина
QC-3 (Vidas/Dade-Behring  16)
Контроль
ДВС
ТГВ
Д-Д
Сравнение методов определения Д-димера
(A.Tripodi, V.Chantarangkul, JTH, 2007,5,184-185)
QC-1 - нормальная плазма
QC-2 & QC-3 – Д-димер,
полученный из расщепленного
плазмином фибрина
QC-3 (Vidas/Dade-Behring  16)
Д-димер (нг/мл)
6000
5000
4000
Vidas (32.5)
STA-Lia (6.2)
IL (5)
Biopool (10.2)
Dade-Behring (4)
3000
2000
1000
0
QC-1
QC-2
QC-3
Норма
Тромбозы
Погранчное значение
Д-димер в диагностике ТГВ/ТЭЛА
Д-димер – маркер ТГВ/ТЭЛА
 Чувствительность 90-100%
 Специфичность 40-50%
Определение Д-димера и
оценка клинической
вероятности – начальные
этапы обследования
при подозрении на ТГВ/ТЭЛА
Д-димер
норма
стоп
повышенный
Продолжение
поиска ТГВ/ТЭЛА
Эффективность определения Д-димера в диагностике ТЭЛА
(M.Righini et al., JTH, 2008, 6, 1059-1071)
Больные
Амбулаторные
Высокая клиническая вероятность
Невысокая клиническая вероятность
Онкология (+)
Онкология (-)
ТГВ в анамнезе
1-й эпизод
Количество определений
для исключения 1 ТЭЛА
3.3
9.1
2.2
9.1
3.1
6.3
3.1
Беременность <20 недель
6
Возраст >80 лет
20
Лежачие
30
Независимые предикторы повышения Д-димера
у больных ССЗ без признаков ВТЭО
1000 госпитализированных в РКНПК :
Д-димер >0.5 мкг/мл у 276 из 867 больных без признаков ВТЭО
Предиктор
ОР
95% ДИ
р
Женский пол
1,6
1,2-2,2
0,004
Возраст ≥ 68 лет
2,6
1,9-3,5
<0,001
Острый воспалительный
процесс
2,3
1,0-5,1
0,039
Лѐгочная гипертензия
1,6
1,1-2,2
0,016
Декомпенсация ХСН
5,9
2,9-12,1
<0,001
Воробьева и соавт. Ангиология и сосудистая хирургия 2010; 16: 34-42.
Using an age-dependent D-dimer cut-off value increases the number of older patients in whom
deep vein thrombosis can be safely excluded (R.A.Douma et al. Haematologica 2012; 97: 1507-1513)
D-d Tinaquant
HemosIL D-d HS500
D-d Vidas
MDA D-d bioMerieux
D-d STA-Lia,Tinaquant
Величина cut-off:
Больные ≤ 50 лет – 500 мкг/л FEU
Больные > 50 лет: возраст х 10 мкг/л FEU
Длительность симптомов ТГВ/ТЭЛА и уровень Д-димера
(Воробьева Н.М., Тер Арх., №8, 2010)
Д-димер (мкг/мл)
2,5
2
r=-0.44, p<0.001
1,5
1
0,5
0
n=21
n=22
n=26
n=23
<22
23-28
29-42
43-85
Длительность симптомов ТГВ/ТЭЛА (дни)
Динамика Д-димера при нормальном
протекании беременности
N=391
Szecsi et al. Thromb Haemost, 2010, 103, 718-727
Динамика маркеров активации ССК у больных ТЭЛА в период
терапии гепаринами (Schutgens et al., 2003)
Фрагмент1+2 активации протромбина
Д-Димер – снижается медленно
Д-димер и риск повторных ТГВ/ТЭЛА (PROLONG, G.Palareti et al., NEJM, 2006)
ТГВ/ТЭЛА (1-й эпизод)
+АВК в соответствии с рекомендациями
Накопительная частота ТГВ/ТЭЛА/Б.кровот.
Через 1 мес. после отмены АВК
Повышение Д-Д, без АВК
Д-Д , n=223
Нормальный Д-Д
АВК (+)
n=103
Д-Д N, n=385
АВК( -)
n=120
Повышение Д-Д, на АВК
1.4 года наблюдения
ТГВ/ТЭЛА
3%
ТГВ/ТЭЛА
15%
Кратность
ТГВ/ТЭЛА
6,4%
Накопительная частота осложнений
Динамика Д-димера и риск осложнений (Prolong II)
D-d↑к 3 мес после отмены варфарина
D-d↑после 3 мес
D-d норм
Дни наблюдения
Cosmi B et al. Blood 2010;115:481-488
Different cut-off values of quantitative D-dimer methods to predict the risk of venous
thromboembolism recurrence: a post-hoc analysis of the PROLONG study
(Legnani C et al. Haematologica 2008; 93(6):900-907).
Д-димер - фактор риска ССЗ
P.Willeit et al. PLOS ONE, 2013 (www.plosone.org)
Association of D-dimer levels with all-cause mortality in a healthy adult population:
findings from the MOLI-SANI study (Di Castelnuovo A. et al. DOI: 10.3324/haematol.2012.083410)
Популяция жителей юга Италии
(n=17,359, 47% муж., ≥35 лет) без
признаков сердечно-сосудистых
и онкологических заболеваний.
Наблюдение 4.2 года (73807
человеко-лет).
Q4 D-d ≥221 ng/ml (HemosIL-IL).
Число больных
КОАГУЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РИСКА СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ В ПОПУЛЯЦИИ НАСЕЛЕНИЯ г.ТОМСКА
(А.Б.Добровольский и соавт. Системные гипертензии 2013; 10 (№4), 50-54)
Д-димер
IQR 207; 505 ng/ml
Популяция жителей г. Томска (n=1104)
- мужчины – 377
- женщины – 727
- возраст: 48±11,3 лет
ТромбоРиск (ThromboPath)
IQR 84,3; 90,8 PICI%
Число больных
Фибриноген
IQR 2,67; 3,72 mg/ml
ТромбоРиск (ThromboPath)
276 обследованных <84 PICI%
В России частота ФV-L+II20210A ~5%, PrC,S и АФС <1%
~ 20% обследованных – снижение функции системы
протеина С (причины ???)
ThromboPath – глобальный тест на систему протеина С
В чем отличие
ThromboPath от других
глобальных тестов?
Имитируется
физиологический путь
активации свертывания.
Определяется
количество
Протеин С
тромбина, образовавшегос Протеин S
я в течение 90 сек
активации разбавленным
тромбопластином.
ТФ
ТФ
IXa
VIIa
VIIIa
Xa
Va
Тромбин
ИПТФ
Протеин S
Функции системы Протеина С
ПрS
Va/VIIIa
ТМ IIa ПрС
Arg46-Asn47
PAR-1
ERPC
Активация
ПрС
Антитромботическая
функция
Vai
VIIIai
Экспресс.
генов
ERPC
Клеточные
активности
Антивоспалит.
Антиапопт.
↓Межкл.
проницаем.
Bouwens EAM, Stavenuiter F, Mosnier LO. J Thromb Haemost 2013; 11 (Suppl. 1): 242–53.
PICI%
FVIII >150%
↓
Prothrombin >150%
↓
FVIII<50%
↑
Prothrombin <50%
↑
P. Ferroni et al. Association between increased tumor
necrosis factor alpha levels and acquired activated
protein C resistance in patients with metastatic
colorectal cancer. Int J Colorectal Dis
DOI 10.1007/s00384-012-1493-8.
P. Ferroni et al. Impact of Statins on the
Coagulation Status of Type 2 Diabetes Patients
Evaluated by a Novel Thrombin-Generation Assay.
Cardiovasc Drugs Ther (2012) 26:301–309.
Спасибо за внимание
Микрочастицы: возможные источники
A.P.Owens III, N.Mackman Circ Res. 2011;108:1284-1297
Микрочастицы: возможные механизмы действия
Lacroix R et al. J Thromb Haemost 2013; 11 (Suppl. 1): 24–35.
Микрочастицы: влияние центрифугирования на
динамику образования фибрина
Поглощение (А450 нм)
0,600
0,500
0,400
2x2500g, 15 min
0,300
0,200
2x2500g, 15 min + 20000g, 90 min
0,100
0,000
0
5
10
15
Время (мин)
20
25
30
www.noat.ru
Вход для специалистов:
Атерошколы:
- доклады
Журнал «Атеротромбоз», 2009 г.
Коагулологические факторы риска тромбозов и лабораторный
контроль антикоагулянтной терапии
Научная деятельность
образовательные материалы: калибровка
тромбопластина
таблица для перевода сек в %-ПТ и МНО
инструкция по построению калибровочного графика
Паракоагуляционные тесты (РКФМ)
Этаноловый
Протаминсульфатный
Образование геля
при смешивании плазмы
с реактивом
Thromb. Res. , 1973
Ложноположительные при Фг
Ложноотрицательные при Фг
о-фенантролиновый
Время появления хлопьев (сек)
70-87
88-120
>120
РКФМ (мкг/мл)
40
35
30
Тест «Глобальная фибринолитическая активность»
(D.C.Rijken et al., 2008)
Кровь забирали в два 2-мл вакутейнера:
один с 0.6 МЕ тромбина, другой - 0.6 МЕ тромбина + 400 KIU апротинина
Инкубировали 3 час при 37°С, центрифугировали и определяли Д-димер
r=-0.54
r=0.51
r=0.36
Маркеры образования фибрина: Исследование FACT
(Dempfle et al., Thromb. Haemost., 2001, 85,671-678)
1. Корреляции между методами количественного
определения:
 ФМ (n=5) от 0.303 до 0.87;
 Д-димера (n=23) линейная от 0.35 до 0.98, Spearman
Rho от 0.79 до 0.98.
 ФМ/Д-димер Spearman Rho от 0.62 до 0.85.
2. Выявлены значительные различия чувствительности
диагностикумов на Д-димер к конечным и
промежуточным фрагментам (коэффициент от 0.49 до
4.95).
3. Проблемы стандартизации.
Образование фибрина в процессе свертывания
плазмы (K.Mann et al. JTH, 1,1504-1515,2003)
момент образования сгустка
Д-димер и “растворимый фибрин” при разных патологиях
(H.Wada et al., JTH, 2006, 4,1253-1258)
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Д-димер
РКФМ
ПП
3д
Оп
ер
<
ОА
В
ТГ
ДВ
С
ИИ
ОИ
М
(-)
ом
б
тр
ко
нт
ро
ль
p<0.01 контр/б-ные
ДД/РФ - НЗ
Сравнение методов определения Д-димера
(A.Tripodi, V.Chantarangkul, JTH, 2007,5,184-185)
QC-1 - нормальная плазма
QC-2 & QC-3 – Д-димер,
полученный из расщепленного
плазмином фибрина
QC-3 (Vidas/Dade-Behring  16)
Д-димер (нг/мл)
6000
5000
4000
Vidas (32.5)
STA-Lia (6.2)
IL (5)
Biopool (10.2)
Dade-Behring (4)
3000
2000
1000
0
QC-1
QC-2
QC-3
Норма
Тромбозы
Погранчное значение