Договор о материальной ответственности;pdf

ИНСТРУКЦИЯ
по применению набора реагентов
для количественного определения ДНК энтеробактерий,
стафилококков и стрептококков в биологическом материале
методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)
с гибридизационно-флуоресцентной детекцией
«АмплиСенс Флороценоз / Аэробы-FL»
АмплиСенс
ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора,
Российская Федерация, 111123,
город Москва, улица Новогиреевская, дом 3а
СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ....................................................................................................... 3
НАЗНАЧЕНИЕ ........................................................................................................................ 3
ПРИНЦИП МЕТОДА .............................................................................................................. 3
ФОРМАТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ................................................... 5
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ............................................................................... 6
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ........................................................................................... 7
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ................................................... 8
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА ........ 9
ФОРМАТ FRT ....................................................................................................................... 10
СОСТАВ ....................................................................................................................... 10
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ ..................................................................... 11
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ .............................................. 11
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО
ВРЕМЕНИ» .................................................................................................................. 12
А. Подготовка пробирок для амплификации ....................................................... 12
Б. Проведение амплификации с детекцией в режиме «реального времени» .. 13
АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ..................................................................................................... 15
СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ ......................... 18
ПРИЛОЖЕНИЕ 1.................................................................................................................. 19
СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ ............................................ 20
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 2 из 21
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения:
ВКО-FL
ДНК
ИППП
К–
ОК
ОКО
ПЦР
ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии
Роспотребнадзора
FRT
- внутренний контрольный образец для наборов с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией
- дезоксирибонуклеииновая кислота
- инфекции, передаваемые половым путем
- отрицательный контроль ПЦР
- отрицательный контроль экстракции
- отрицательный контрольный образец
- полимеразная цепная реакция
- Федеральное бюджетное учреждение науки «Центральный
научно-исследовательский институт эпидемиологии»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека
- флуоресцентная детекция в режиме «реального времени»
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор реагентов «АмплиСенс Флороценоз / Аэробы-FL» предназначен для
количественного определения ДНК энтеробактерий (семейства Enterobacteriaceae,
включая E.coli, Klebsiella spp., Proteus spp. и др.), стафилококков (Staphylococcus spp.)
и стрептококков (Streptococcus spp.) в биологическом материале методом ПЦР с
гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме
«реального времени». Материалом для проведения ПЦР служат пробы ДНК,
полученные путем экстракции из мазков (соскобов) со слизистых оболочек
влагалища.
ВНИМАНИЕ!
Результаты
ПЦР-исследования
учитываются
в
комплексной
диагностике заболевания1).
ПРИНЦИП МЕТОДА
Выявление и количественное определение содержания ДНК энтеробактерий,
стафилококков и стрептококков методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной
детекцией включает в себя два этапа: экстракцию ДНК из образцов биологического
материала
и
амплификацию
гибридизационно-флуоресцентной
участка
ДНК
детекцией,
данного
которая
микроорганизма
производится
в
с
режиме
«реального времени». Экстракция ДНК из биологического материала проводится в
присутствии
внутреннего
контрольного
образца
(ВКО-FL),
который
позволяет
контролировать выполнение процедуры исследования для каждого образца. Затем с
полученными пробами ДНК проводится реакция амплификации при помощи
1)
В соответствии с Директивой Европейского Союза 98/79/ЕС.
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 3 из 21
специфичных
праймеров
и
фермента
Taq-полимеразы
с
одновременной
флуоресцентной детекцией при помощи специфичных флуоресцентно-меченых
олигонуклеотидных зондов. К олигонуклеотидным зондам, специфичным к различным
ДНК-мишеням, прикреплены различные флуоресцентные метки. Это позволяет
регистрировать накопление специфического продукта амплификации каждой ДНКмишени
путем
измерения
интенсивности
флуоресцентного
сигнала
по
соответствующему каналу непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с
системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени».
Результаты амплификации ДНК энтеробактерий, стафилококков и стрептококков
регистрируются отдельно по трем различным каналам флуоресцентной детекции: для
энтеробактерий – по каналу для флуорофора FAM, для стафилококков – по каналу
для флуорофора JOE, для стрептококков – по каналу для флуорофора ROX. По
каналу для флуорофора Cy5 детектируется продукт амплификации ДНК ВКО-FL
(внутреннего контрольного образца).
Канал для
флуорофора
FAM2)
JOE2)
ROX2)
Cy52)
ДНК-мишень
Enterobacteriaceae
Staphylococcus
spp.
Streptococcus
spp.
ВКО
Количественное определение ДНК методом ПЦР в режиме «реального времени»
основывается на
существовании линейной
зависимости между логарифмом
исходной концентрации ДНК-мишени в исследуемом образце и циклом начала
экспоненциального увеличения флуоресцентного сигнала (пороговый цикл, Cycle
threshold, Ct). Для проведения количественного теста одновременно проводят
амплификацию с детекцией в режиме «реального времени» для проб ДНК,
полученных из исследуемых образцов, и для ДНК-калибраторов – образцов с
известной концентрацией ДНК-мишени. По результатам амплификации ДНКкалибраторов строится калибровочная линия, по которой происходит определение
концентрации ДНК-мишени в исследуемых образцах.
2)
Название каналов для соответствующего прибора см. в методических рекомендациях к набору
реагентов
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 4 из 21
ФОРМАТЫ И ФОРМЫ ВЫПУСКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ
Набор реагентов выпускается в 1 формате.
Формат FRT
Набор реагентов выпускается в 4 формах комплектации:
Форма 1 включает комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F.
Форма
2
включает
комплекты
реагентов
«ДНК-сорб-АМ»
вариант
100,
«Транспортную среду с муколитиком (ТСМ)» 100 пробирок по 0,5 мл, «ПЦРкомплект» вариант FRT-100 F.
Форма
3
включает
комплекты
реагентов
«ДНК-сорб-АМ»
вариант
100,
«Транспортную среду для мазков» 100 пробирок по 0,5 мл, «ПЦР-комплект» вариант
FRT-100 F.
Форма 4 включает наборы реагентов оптом, расфасованные по отдельным
реагентам, с маркировкой реагентов на их оптовой фасовке.
Форма комплектации 1 предназначена для проведения амплификации фрагментов
ДНК
энтеробактерий,
стафилококков
и
стрептококков
c
гибридизационно-
флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени». Для проведения
полного ПЦР-исследования необходимо использовать комплекты реагентов для
экстракции ДНК, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
Формы комплектации 2 и 3 предназначены для проведения полного ПЦРисследования, включающего взятие биологического материала, экстракцию из него ДНК и
амплификацию
ДНК
энтеробактерий,
стафилококков
и
стрептококков
c
гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени».
Форма комплектации 4 предназначена для производственных целей для
последующей маркировки на языке заказчика и комплектации по наборам.
ВНИМАНИЕ! Форма комплектации 4 используется только в соответствии с
регламентом, утвержденным ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 5 из 21
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Аналитическая чувствительность
Таблица 1
Вид
биологического
материала
Транспортная
среда
Мазок (соскоб)
со слизистых
оболочек
влагалища
«Транспортная
среда для
мазков»
или
«Транспортная
среда с
муколитиком
(ТСМ)»
или
транспортная
среда
«ТС-ЭДЭМ»
Комплект
для
экстракции
ДНК
Комплект для
амплификации Микроорганизмы
и детекции
«ДНК-сорбАМ»
ПЦР-комплект
вариант
FRT-100 F
Аналитическая
чувствительность,
ГЭ/мл3)
Enterobacteriaceae
2x103
Staphylococcus
spp.
2x103
Streptococcus spp.
2x103
Линейный диапазон измерения набора реагентов
Линейный
диапазон
измерений
для
4
каждой
из
групп
выявляемых
8
микроорганизмов составляет от 1х10 до 1х10 ГЭ/мл.
Аналитическая специфичность
Отсутствовали неспецифические реакции при тестировании образцов ДНК
человека
и
образцов
ДНК
следующих
микроорганизмов:
Lactobacillus
spp.,
Gardnerella vaginalis, Enterococcus faecium, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria spp.,
Chlamydia trachomatis, Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum, Trichomonas
vaginalis, Candida spp., HSV 1 и 2 типа, CMV.
При
тестировании
образцов
ДНК
микроорганизмов,
относящихся
к
Enterobacteriaceae, Staphylococcus spp. и Streptococcus spp., включая Escherichia coli,
Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus
epidermidis, Staphylococcus saprophyticus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus
pneumoniae,
Streptococcus
pyogenes,
для
каждой
группы
были
получены
положительные результаты только по каналу для детекции ДНК соответствующей
группы микроорганизмов, и отсутствовали неспецифические результаты по другим
каналам.
3)
Количество геномных эквивалентов микроорганизма (ГЭ) в 1 мл образца биологического
материала, помещенного в указанную транспортную среду.
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 6 из 21
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярнобиологические
(ПЦР)
исследования
биологического
материала
на
наличие
возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических
правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп
патогенности
(опасности)
и
возбудителями
паразитарных
болезней»,
СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с
медицинскими отходами» и методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация
работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при
работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности».
При работе всегда следует выполнять следующие требования:
-
Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные,
организовывать
работу
и
хранение
в
соответствии
«Безопасность
работы
с
микроорганизмами
III–IV
с
СП
групп
1.3.2322-08
патогенности
(опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
-
Убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя
дезинфицирующие средства в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность
работы
с
микроорганизмами
III–IV
групп
патогенности
(опасности)
и
возбудителями паразитарных болезней».
-
Лабораторный процесс должен быть однонаправленным. Анализ проводится в
отдельных помещениях (зонах). Работу следует начинать в Зоне Экстракции,
продолжать в Зоне Амплификации и Детекции. Не возвращать образцы,
оборудование и реактивы в зону, в которой была проведена предыдущая стадия
процесса.
-
Неиспользованные реактивы, реактивы с истекшим сроком годности, а также
использованные реактивы следует удалять в соответствии с требованиями
СанПиН
2.1.7.2790-10
«Санитарно-эпидемиологические
требования
к
обращению с медицинскими отходами».
ВНИМАНИЕ! При удалении отходов после амплификации (пробирок, содержащих
продукты ПЦР) недопустимо открывание пробирок и разбрызгивание содержимого,
поскольку это может привести к контаминации продуктами ПЦР лабораторной зоны,
оборудования и реагентов.
-
Использовать и менять при каждой операции одноразовые наконечники для
автоматических дозаторов с фильтром. Одноразовую пластиковую посуду
необходимо
сбрасывать
дезинфицирующее
средство,
в
специальный
которое
может
контейнер,
быть
содержащий
использовано
для
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 7 из 21
обеззараживания медицинских отходов.
-
Поверхности столов, а также помещения, в которых проводится постановка
ПЦР,
до
начала
и
после
завершения
работ
необходимо
подвергать
ультрафиолетовому облучению в течение 30 мин.
-
Применять набор строго по назначению, согласно данной инструкции.
-
Допускать к работе с набором только специально обученный персонал.
-
Не использовать набор по истечении срока годности.
-
Использовать одноразовые перчатки, лабораторные халаты, защищать глаза во
время работы с образцами и реактивами. Тщательно вымыть руки по окончании
работы.
-
Избегать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. При контакте
немедленно промыть пораженное место водой и обратиться за медицинской
помощью.
Листы безопасности материалов (MSDS – material safety data sheet) доступны по
запросу.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
1. Транспортная среда – «Транспортная среда с муколитиком (ТСМ)» (ТУ 9398-09801897593-2009), или «Транспортная среда для мазков» (ТУ 9398-088-018975932009), или транспортная среда «ТС-ЭДЭМ», или другие рекомендованные ФБУН
ЦНИИ
Эпидемиологии
Роспотребнадзора
–
при
работе
с
формой
комплектации 1.
2. Комплект реагентов для экстракции ДНК – «ДНК-сорб-АМ» (ТУ 9398-036-018975932009) или другие комплекты, рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии
Роспотребнадзора – при работе с формой комплектации 1.
3. Дополнительные материалы и оборудование для экстракции ДНК – согласно
инструкции к комплекту реагентов для экстракции ДНК.
4. Бокс
абактериальной
воздушной
среды
(ПЦР-бокс)
(например, «БАВ-ПЦР-
«Ламинар-С», «Ламинарные системы», Россия).
5. Центрифуга/вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
6. Автоматические дозаторы переменного объема (от 5 до 20 мкл, от 20 до 200 мкл)
(например, «Ленпипет», Россия).
7. Одноразовые наконечники с фильтром до 100 мкл в штативах (например, Axygen,
США).
8. Штативы для пробирок объемом 0,2 или 0,1 мл (в соответствии с используемыми
комплектами реагентов) (например, «ИнтерЛабСервис», Россия).
9. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой от минус 24 до минус 16 °С.
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 8 из 21
10. Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09.
11. Емкость для сброса наконечников.
12. Программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного сигнала
в режиме «реального времени», имеющий 5 (или более) независимых каналов
флуоресцентной
детекции
(например,
Rotor-Gene
6000
(Corbett Research,
Австралия), Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия), CFX96 (Bio-Rad, США) и
рекомендованные
ФБУН
ЦНИИ
Эпидемиологии
Роспотребнадзора
в
методических рекомендациях по применению данного набора реагентов).
13. Одноразовые полипропиленовые пробирки для ПЦР объемом 0,2 или 0,1 мл
а) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с круглой или плоской
оптически прозрачной крышкой или пробирки объемом 0,2 мл в стрипах по 8
шт. с прозрачными крышками (например, Axygen, США) – при использовании
прибора планшетного типа;
б) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с плоской крышкой
(например, Axygen, США) или пробирки для ПЦР к Rotor-Gene, объемом 0,1 мл
в стрипах по 4 шт. с крышками (например, Corbett Research, Австралия;
QIAGEN, Германия) – при использовании прибора роторного типа.
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА
Перед началом работы следует ознакомиться с методическими рекомендациями
«Взятие,
транспортировка,
хранение
клинического
материала
для
ПЦР-
диагностики», разработанными ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва, 2010 г.
Материалом для исследования служит мазок (соскоб) со слизистых оболочек
влагалища,
помещенный
в
транспортные
среды,
выпускаемые
или
рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора.
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 9 из 21
ФОРМАТ FRT
ФОРМАТ FRT
СОСТАВ
Транспортная среда с муколитиком (ТСМ):
Реактив
Транспортная среда с
муколитиком (ТСМ)
Описание
Прозрачная жидкость
розового цвета
Объем, мл
Количество
0,5
100 пробирок
Объем, мл
Количество
0,5
100 пробирок
Входит в состав формы комплектации 2.
Транспортная среда для мазков:
Реактив
Транспортная среда для мазков
Описание
Прозрачная бесцветная
жидкость
Входит в состав формы комплектации 3.
Комплект реагентов «ДНК-сорб-АМ» вариант 100 – комплект реагентов для
экстракции ДНК из биологического материала – включает:
Реактив
Описание
Прозрачная бесцветная
жидкость4)
Прозрачная бесцветная
жидкость
Объем, мл
Количество
30
1 флакон
100
1 флакон
Сорбент универсальный
Суспензия белого цвета
1,0
2 пробирки
ТЕ-буфер для элюции ДНК
Прозрачная бесцветная
жидкость
5,0
2 пробирки
Лизирующий раствор
Отмывочный раствор
К комплекту реагентов «ДНК-сорб-АМ» прилагаются следующие реагенты:
Реактив
ВКО комплексный
ВКО-FL
ОКО
Описание
Прозрачная бесцветная
жидкость
Прозрачная бесцветная
жидкость
Прозрачная бесцветная
жидкость
Объем, мл
Количество
1,0
1 пробирка
1,0
1 пробирка
1,2
1 пробирка
Комплект реагентов рассчитан на выделение ДНК из 100 образцов, включая
контроли. Входит в состав форм комплектации 2 и 3.
4)
При хранении лизирующего раствора при температуре от 2 до 8 °С возможно образование осадка в
виде кристаллов.
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 10 из 21
ФОРМАТ FRT
Комплект реагентов «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F – комплект реагентов
для
амплификации
и
количественного
определения
ДНК
энтеробактерий,
стафилококков и стрептококков c гибридизационно-флуоресцентной детекцией в
режиме «реального времени» – включает:
Реактив
ПЦР-смесь-FL
Флороценоз / Аэробы
Описание
Прозрачная бесцветная
жидкость
Прозрачная
бесцветная жидкость
Прозрачная
бесцветная жидкость
Прозрачная
бесцветная жидкость
Прозрачная
бесцветная жидкость
Прозрачная
бесцветная жидкость
ПЦР-буфер-В
Полимераза (TaqF)
K–
К1 AB
ДНК-калибраторы
К2 AB
Объем, мл
Количество
1,2
1 пробирка
0,6
1 пробирка
0,06
1 пробирка
0,2
1 пробирка
0,2
1 пробирка
0,2
1 пробирка
Комплект реагентов рассчитан на проведение 110 реакций амплификации, включая
контроли.
ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ
ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:
-
Экстракция ДНК из биологических образцов;
-
Амплификация
с
гибридизационно-флуоресцентной
детекцией
в
режиме
«реального времени»;
-
Анализ и интерпретация результатов.
Детальная
зависимости
информация
от
по
используемого
процедуре
проведения
оборудования
ПЦР-исследования
изложена
в
в
методических
рекомендациях по применению набора реагентов для количественного определения
ДНК энтеробактерий, стафилококков и стрептококков в биологическом материале
методом
ПЦР
с
гибридизационно-флуоресцентной
Флороценоз / Аэробы-FL»,
разработанных
ФБУН
детекцией
ЦНИИ
«АмплиСенс
Эпидемиологии
Роспотребнадзора.
ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
Для экстракции ДНК из биологического материала используется комплект
реагентов «ДНК-сорб-АМ» или другие комплекты, рекомендованные ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора в методических рекомендациях к данному набору
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 11 из 21
ФОРМАТ FRT
реагентов. Порядок работы с комплектом реагентов «ДНК-сорб-АМ» смотрите в
инструкции к данному комплекту.
ВНИМАНИЕ! Для экстракции недопустимо использование комплекта реагентов
«ЭДЭМ» и других экспресс-методов экстракции ДНК.
При использовании форм комплектации набора 2 и 3 для экстракции ДНК
используется входящий в набор комплект реагентов «ДНК-сорб-АМ».
Экстракция ДНК из каждого исследуемого образца проводится в присутствии
внутреннего контрольного образца – ВКО-FL.
Объемы реагентов и образцов при экстракции с помощью комплекта реагентов
«ДНК-сорб-АМ»:
Объем ВКО – 10 мкл в каждую пробирку.
Объем исследуемого образца – 100 мкл.
В пробирку отрицательного контроля экстракции внести 100 мкл ОКО.
Объем элюции – 100 мкл.
ПРОВЕДЕНИЕ АМПЛИФИКАЦИИ С ДЕТЕКЦИЕЙ В РЕЖИМЕ «РЕАЛЬНОГО
ВРЕМЕНИ»
Выбор
пробирок
для
амплификации
зависит
от
используемого
амплификатора с системой детекции в режиме «реального времени».
Для внесения в пробирки реагентов, проб ДНК и контрольных образцов
используются одноразовые наконечники с фильтрами.
А. Подготовка пробирок для амплификации
Общий объем реакционной смеси – 25 мкл, включая объем пробы ДНК –
10 мкл.
1. Перемешать
содержимое
пробирок
с
реагентами
ПЦР-смеси-FL
Флороценоз / Аэробы, ПЦР-буфера-В, полимеразы (TaqF) и осадить капли
кратковременным центрифугированием (1-2 с) с помощью центрифуги/вортекса.
2. Отобрать необходимое количество пробирок или стрипов для амплификации ДНК
исследуемых и контрольных проб.
3. В отдельной пробирке подготовить реакционную смесь. Компоненты реакционной
смеси
следует
исследования.
смешивать
Смешать
непосредственно
необходимое
перед
количество
проведением
реагентов
из
ПЦР-
расчета
расходования на одну реакцию: 10 мкл ПЦР-смеси-FL Флороценоз / Аэробы, 5
мкл ПЦР-буфера-В и 0,5 мкл полимеразы (TaqF) (см. приложение 1).
Перемешать
подготовленную
смесь
и
осадить
капли
кратковременным
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 12 из 21
ФОРМАТ FRT
центрифугированием с помощью центрифуги/вортекса.
Примечание – При большом объеме образцов для облегчения процедуры
приготовления допускается предварительное смешивание ПЦР-буфера-B и
полимеразы (TaqF). Для этого содержимое одной пробирки с полимеразой
(TaqF) (60 мкл) необходимо полностью перенести в пробирку с ПЦР-буфером-B
(600 мкл) и аккуратно перемешать на вортексе, не допуская образования пены.
Промаркировать пробирку, указав дату приготовления смеси.
ВНИМАНИЕ! Приготовленная смесь рассчитана на исследование 110 образцов.
Смесь хранить при температуре от 2 до 8 °С в течение 3 мес и использовать по
мере необходимости.
4. Внести в каждую пробирку по 15 мкл подготовленной смеси.
5. В подготовленные пробирки внести по 10 мкл проб ДНК, полученных в
результате экстракции из исследуемых образцов.
ВНИМАНИЕ! При добавлении проб ДНК, экстрагированных с помощью комплекта
реагентов «ДНК-сорб-АМ» необходимо избегать попадания сорбента в реакционную
смесь для ПЦР.
6. Поставить контрольные реакции:
а) отрицательный контроль экстракции (ОК) – внести в пробирку 10 мкл
пробы, экстрагированной из ОКО.
б) отрицательный контроль ПЦР (К–) – внести в пробирку 10 мкл К–.
в) ДНК-калибраторы (K1, K2) – в одну пробирку внести 10 мкл ДНК-калибратора
K1 AB, во вторую пробирку – 10 мкл ДНК-калибратора K2 AB
Б. Проведение амплификации с детекцией в режиме «реального времени»
Запрограммировать прибор (амплификатор с системой детекции в режиме
«реального времени») для выполнения соответствующей программы амплификации
и детекции флуоресцентного сигнала «АмплиСенс» или «АмплиСенс-1» (см. табл.
2, 3).
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 13 из 21
ФОРМАТ FRT
Таблица 2
Единая программа амплификации «АмплиСенс»
для приборов роторного5 и планшетного6 типа
Цикл
Температура, °С
Время
Измерение
флуоресценции
Кол.
циклов
1
50
15 мин
–
1
2
95
15 мин
–
1
95
10 с
–
20 с
FAM7), JOE7),
ROX7), Cy57),
Cy5.57)
3
60
45
ВНИМАНИЕ! С использованием единой программы можно одновременно проводить
в одном приборе любое сочетание тестов. В случае, если в одном приборе
одновременно проводятся только тесты для выявления ДНК возбудителя, можно
удалить из данной программы первый шаг (50 °С – 15 минут) для экономии времени.
Примечание – Канал для флуорофора Cy5.5 включается при необходимости, если
проводятся тесты в формате «мультипрайм», для которых используется этот канал.
Таблица 3
Программа «АмплиСенс-1»
Приборы роторного типа5)
Цикл
Температура, °С
Время
2
95
95
60
72
95
3
60
15 мин
5с
20 с
15 с
5с
20 с
детекция
флуоресц.
сигнала
15 с
1
72
Приборы планшетного типа6)
Кол.
циклов
1
Температура, °С
Время
5
95
95
60
72
95
40
60
15 мин
5с
20 с
15 с
5с
30 с
детекция
флуоресц.
сигнала
15 с
72
Кол.
циклов
1
5
40
Детекция флуоресцентного сигнала назначается по четырем каналам: для
флуорофоров FAM7), JOE7), ROX7) и Cy57).
5)
Например, Rotor-Gene 6000 (Corbett Research, Австралия), Rotor-Gene Q (QIAGEN, Германия) и
рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора в методических рекомендациях по
применению данного набора реагентов.
6)
Например, CFX (Bio-Rad, США) и рекомендованные ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
в методических рекомендациях по применению данного набора реагентов.
7)
Название каналов для соответствующего прибора см. в методических рекомендациях к набору
реагентов.
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 14 из 21
ФОРМАТ FRT
Примечание – Канал для флуорофора Cy5.5 включается при необходимости, если
проводятся тесты в формате «мультипрайм», для которых используется этот канал.
1. Установить пробирки в ячейки реакционного модуля прибора.
2. Запустить выполнение программы амплификации с детекцией флуоресцентного
сигнала.
3. По окончании выполнения программы приступить к анализу и интерпретации
результатов.
АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ
Анализ полученных результатов можно проводить с помощью программного
обеспечения прибора, используемого для проведения ПЦР c детекцией в режиме
«реального
времени»,
с
последующим
расчетом
концентраций
с
помощью
программного обеспечения в формате Microsoft® Excel, или в автоматическом режиме
с использованием программного обеспечения «RealTime Manager».
Анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по четырем каналам:
-
по каналу для флуорофора FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о
накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК энтеробактерий (семейства
Enterobacteriaceae);
-
по каналу для флуорофора JOE регистрируется сигнал, свидетельствующий о
накоплении
продукта
амплификации
фрагмента
ДНК
стафилококков
(Staphylococcus spp.);
-
по каналу для флуорофора ROX регистрируется сигнал, свидетельствующий о
накоплении
продукта
амплификации
фрагмента
ДНК
стрептококков
(Streptococcus spp.);
-
по каналу для флуорофора Cy5 регистрируется сигнал, свидетельствующий о
накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК внутреннего контроля
(ВКО).
Результаты
интерпретируются
на
основании
наличия
(или
отсутствия)
пересечения графика флуоресценции с пороговой линией, установленной на уровне
экспоненциального подъема сигнала, что определяет наличие (или отсутствие)
значения порогового цикла Ct в соответствующей графе таблицы результатов. В
соответствии со значениями Ct ДНК-калибраторов автоматически происходит
построение калибровочного графика (графика стандартов) и расчет концентраций
ДНК обнаруженных микроорганизмов в образце по полученным для него значениям
Ct.
ВНИМАНИЕ! Значения концентраций ДНК-калибраторов (стандартов) указываются
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 15 из 21
ФОРМАТ FRT
во вкладыше, прилагаемом к набору реагентов.
По полученным значениям Ct и калибровочному графику, программой прибора
автоматически рассчитываются значения количества копий ДНК энтеробактерий,
стафилококков
и
стрептококков
в
реакционной
пробирке
и
выдаются
в
соответствующей графе в таблице результатов (см. описание для используемой
модели
прибора
в
методических
рекомендациях).
Полученные
значения
используются для расчета количества геномных эквивалентов ДНК соответствующих
микроорганизмов,
содержащихся
в
1 мл
исходного
образца
биологического
материала, по формуле:
[Число копий] ДНК микроорганизмов x K = [Число геномных эквивалентов] на 1 мл
(ГЭ/мл)
ВНИМАНИЕ! Коэффициент К для расчета результата в ГЭ/мл указан во вкладыше,
прилагаемом к набору реагентов.
Полученные
стафилококков
при
и
расчете
значения
стрептококков
концентраций
отражают
общее
ДНК
энтеробактерий,
содержание
данных
микроорганизмов в исследуемом материале, помещенном в транспортную среду.
Если полученное значение составляет менее 1х104 ГЭ/мл, то указывается
результат «менее 1х104 ГЭ/мл», если полученное значение составляет более 1х108
ГЭ/мл, то указывается результат «более 1х108 ГЭ/мл» (с учетом линейного
диапазона набора).
Клиническая интерпретация результатов теста должна проводиться врачом
только при условии комплексного обследования пациента, с учетом данных
анамнеза,
клинического
и
эпидемиологического
статуса,
в
соответствии
с
существующими клиническими и методическими рекомендациями.
Результат ПЦР-исследования считается достоверным, если получены
правильные
результаты
отрицательного
контроля
для
отрицательного
экстракции
ДНК
и
контроля
амплификации,
ДНК-калибратора
K2,
в
соответствии с таблицей оценки результатов контролей (табл. 4), и показатель
эффективности амплификации E находится в диапазоне, указанном во
вкладыше, прилагаемом к набору реагентов.
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 16 из 21
ФОРМАТ FRT
Таблица 4
Результаты для контролей различных этапов ПЦР-исследования
Контроль
Контролируемый
этап ПЦРисследования
Значение расчетной концентрации или
порогового цикла Ct
по каналам для
флуорофоров
по каналу для
флуорофора Cy5
FAM, JOE, ROX
Определено значение
Ct меньше граничного
K2
ПЦР
ОК
Экстракция ДНК
К–
ПЦР
Значение концентрации
отсутствует или меньше
граничного
Значение концентрации
отсутствует или меньше
граничного
Определено значение Ct
меньше граничного
Определено значение Ct
меньше граничного
Не учитывается
Результат количественного ПЦР-исследования считается недостоверным в
следующих случаях:
1. Если для ДНК-калибраторов (K1, K2) значения порогового цикла Ct по каналам для
флуорофоров FAM и/или JOE, и/или ROX отсутствуют, или значение Сt для ДНКкалибратора K2 превышает указанное граничное значение, или показатель
эффективности E по графику стандартов меньше значения, указанного во
вкладыше. В этом случае необходимо повторить амплификацию для всех
образцов.
2. Если для отрицательного контроля экстракции ДНК (ОК)
и/или отрицательного
контроля ПЦР (К–) получено значение расчетной концентрации (в ГЭ/мл) ДНК
энтеробактерий
или/и
стафилококков,
или/и
стрептококков,
превышающее
граничное значение, указанное во вкладыше. В этом случае необходимо повторить
ПЦР-исследование для всех образцов, начиная с этапа экстракции ДНК.
3. Если для исследуемого образца полученное значение расчетной концентрации
ДНК энтеробактерий, стафилококков и стрептококков составляет менее 104 ГЭ/мл
или отсутствует, а по каналу для детекции ВКО (для флуорофора Cy5) значение Ct
отсутствует или превышает указанное граничное значение. В этом случае
необходимо повторно провести анализ для данного образца, начиная с этапа
экстракции ДНК.
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 17 из 21
СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ
Срок годности. 9 мес. Набор реагентов с истекшим сроком годности применению не
подлежит. Срок годности вскрытых реагентов соответствует сроку годности,
указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не указано
иное.
Транспортирование. Набор реагентов транспортировать при температуре от 2 до
8 °С не более 5 сут. «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F при получении
разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения.
Хранение.
Комплект
реагентов
«ДНК-сорб-АМ»,
«Транспортную
среду
с
муколитиком (ТСМ)» и «Транспортную среду для мазков» хранить при температуре
от 2 до 25 °С.
Реагенты ВКО комплексный, ВКО-FL и ОКО (из комплекта реагентов «ДНК-сорбАМ») хранить при температуре от 2 до 8 °С.
Комплект реагентов «ПЦР-комплект» хранить при температуре от 2 до 8 °С (кроме
ПЦР-буфера-В и полимеразы (TaqF)). Реагенты ПЦР-буфер-В и полимеразу (TaqF)
хранить при температуре от минус 24 до минус 16 С. ПЦР-смесь-FL Флороценоз /
Аэробы хранить в защищенном от света месте.
Рекламации по качеству набора реагентов «АмплиСенс Флороценоз / АэробыFL»
направлять
в
адрес
ООО
«ИнтерЛабСервис»
(115035,
г. Москва,
ул.
Садовническая, д. 20/13, стр. 2), в отдел рекламаций, организации обучения и
контроля качества (тел. (495) 664-28-84, (495) 925-05-54, факс (495) 664-28-89, e-mail:
[email protected])8).
8)
Отзывы и предложения о продукции «АмплиСенс» вы можете оставить, заполнив анкету
потребителя на сайте: www.amplisens.ru.
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 18 из 21
ПРИЛОЖЕНИЕ 1.
Схема приготовления реакционных смесей
Объем реагентов на указанное количество реакций, мкл
Объем реагентов на
одну реакцию, мкл
Количество
исследуемых
биологических
образцов 9)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
30
9)
10,0
5,0
ПЦР-смесь-FL
Флороценоз / Аэробы 9)
Смесь ПЦР-буфера-B
и полимеразы (TaqF)
60
70
80
90
100
110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
210
220
230
240
250
260
270
280
290
300
350
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
135
140
145
150
175
Приведены значения с учетом запаса (расчет на одну реакцию больше) и с учетом необходимости
постановки 4 контрольных реакций: К1, К2, OK и К–.
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 19 из 21
СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ
Номер в каталоге
Максимальное
число тестов
Код партии
Использовать до
Только для
исследовательских
целей
Обратитесь к
руководству по
эксплуатации
Дата изменения
Не допускать
попадания
солнечного света
Ограничение
температуры
Дата изготовления
Производитель
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 20 из 21
Лист вносимых изменений
Редакция
Место внесения
изменений
Список
сокращений
Проведение
амплификации с
детекцией в
режиме
«реального
времени»
А. Подготовка
пробирок для
амплификации
31.10.13
GA
Анализ
результатов
23.06.14
ME
Анализ
результатов
Суть вносимых изменений
Упорядочен в алфавитном порядке
В п. 1 удалена фраза «Разморозить пробирку с ПЦРсмесью-FL Флороценоз / Аэробы»
Фраза «Анализ полученных результатов можно
проводить
вручную
с
помощью
программного
обеспечения прибора, используемого для проведения
ПЦР c детекцией в режиме «реального времени» или в
автоматическом
режиме
с
использованием
программного обеспечения «RealTime Manager».»
заменена на «Анализ полученных результатов можно
проводить с помощью программного обеспечения
прибора, используемого для проведения ПЦР c
детекцией в режиме «реального времени», с
последующим расчетом концентраций с помощью
программного обеспечения в формате Microsoft® Excel
«AmpliSens
Флороценоз
/
Аэробы»,
или
в
автоматическом
режиме
с
использованием
программного обеспечения «RealTime Manager»»
Удалено название программного обеспечения в
формате Microsoft® Excel
Формат FRT Форма 1: REF R-B88-100-FT / VER 23.06.14 / стр. 21 из 21