AutoRead 6.00 Part;pptx

УДК: 577.213/.217:591.8]:[575:614.876
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ТКАНЕЙ
ЖИВОТНЫХ ДЛЯ ОЦЕНКИ ГЕНОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ
ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ
С.С. Долматович, Д.Р. Петренёв
ГНУ «Институт радиобиологии НАН Беларуси»
Республика Беларусь, г. Гомель
Введение
Одним из эффектов воздействия ионизирующего излучения (ИИ) на клетки является
образование одно- и двунитевых разрывов ДНК. Двунитевые разрывы являются наиболее
биологически значимыми повреждениями ДНК, поскольку они приводят к потере
генетической информации и хромосомным перестройкам [1].
Восстановление повреждений ДНК в клетке происходит благодаря системе белков
репарации, осуществляющих гомологичную и негомологичную рекомбинацию [1]. В
зависимости от состояния систем репарации в момент действия излучения ДНК может
приобретать различную степень фрагментации. Аналогичные эффекты наблюдаются при
действии многих неблагоприятных факторов среды и часто реализуются посредством
развития окислительного стресса. При повреждении ДНК одним из методов оценки
воздействия ИИ является характеристика разрывов ДНК и модификаций отдельных
нуклеотидов. Ключевым аспектом анализа повреждений ДНК, возникающих при действии
неблагоприятных факторов среды, в частности ИИ, является высокая степень сохранности
нуклеиновой кислоты в образце и отсутствие модификаций ДНК, возникающих de novo в
процессе выделения.
В связи с этим, целью настоящего исследования является поиск метода выделения
ДНК с высокой степенью её сохранности.
Материалы и методы
В работе использовали образцы тканей из печени, селезёнки, мышц и сердца белых
крыс. Выделение ДНК из данных тканей проводили при помощи референсного метода
фенол- хлороформной экстракции (Ф-Х Э), метода с применением четвертичного
аммониевого основания с последующей экстракцией хлороформом (СТАБ) и коммерческих
наборов 1 и 2. Начальные условия были одинаковыми для всех методов, так как выделение
проводилось из одного образца ткани, разделённого на 8 равных частей весом ~10 мг.
Количественный и качественный анализ полученной ДНК проводили с помощью
спектрофотометрического метода и электрофореза в агарозном геле.
1. Выделение ДНК с использованием коммерческого набора 1 («Нуклеосорб», фирма
«Праймтех», г. Минск).
Выделение ДНК из животных тканей проводили согласно инструкции производителя.
Особенностью данного коммерческого набора является применение антиоксиданта 2меркаптоэтанола на стадии лизиса образцов, обработка протеиназой К и использование
соосадителя ДНК.
2. Выделение ДНК с использованием коммерческого набора 2 («ДНК- Экстран-2»,
фирма «Синтол», г. Москва).
При
выделении
ДНК
из
животных
тканей
использовали
протеиназу
К.
Принципиальным отличием данного набора от предыдущего является использование
универсального сорбента, аналогичного силикагелю.
3. Выделение ДНК с использованием четвертичного аммониевого основания с
последующей экстракцией хлороформом (СТАБ)
Использовали собственную модификацию метода. Для этого к образцам ткани печени,
селезёнки, мышц и сердца массой ~10 мг внесли 250 мкл СТАБ- буфера (1,4 М NaCl, 0,1 М
Tris HCl, 20 mM EDTA, 2% СТАБ). Образцы инкубировали 30 мин при t=65°С. К
охлаждённой до комнатной температуры суспензии добавляли 250 мкл смеси хлороформ/
изоамиловый
спирт.
Содержимое
мешали
на
вортексе,
после
чего
осаждали
центрифугированием в течение 10 минут при 13000 об/мин при комнатной температуре.
После этого пипеткой перенесли супернатант в новую пробирку и добавили 50 мкл 5х СТАБ
(5% СТАБ, 320 mM EDTA) и инкубировали в течение 10 мин при 65°С. Далее добавили 200
мкл хлороформа, тщательно перемешали и центрифугировали при тех же оборотах. Затем
добавили 2 объёма буфера для преципитации (1% СТАБ, 50 mМ TrisCl, 10 mM EDTA),
перемешали и оставили на ночь в холодильнике. Спустя ночь добавили 0,7V изопропанола,
перемешали,
инкубировали
15
мин
при
комнатной
температуре,
после
чего
центрифугировали. Супернатант отбрасывали, а полученный осадок ДНК промывали 250 мл
80% этанолом и центрифугировали.
После промывки этанолом полученную ДНК переосаждали: преципитат растворяли в
50 мкл HS-TE (1M NaCl, 10 mМ Tris Cl, 1 mM EDTA), после чего добавляли 150 мкл 80%
этанола и инкубировали 30 мин при -70°С. После инкубации центрифугировали 5 мин при
13000 об/мин, отбирали этанол и осадок растворяли в 50 мкл ТЕ.
4. Выделение ДНК с использованием фенольно- хлороформной экстракции
Выделение ДНК проводили по следующему протоколу:
Образцы ткани печени, селезёнки, мышц и сердца массой ~10 мг растирали до
гомогенного состояния в 700 мкл буферного раствора (100 mМ NaCI, 10 mM Tris CI pH8,2, 1
mM EDTA, 1% SDS, 2% Triton X-100, H2O). Добавляли 20 мкл протеиназы К (20 мкг/мкл),
перемешивали и инкубировали при
56оС 30 мин. Далее добавляли 300 мкл фенола,
тщательно перемешивали и центрифугировали при 13 000 об/мин 5 мин, переносили
верхнюю фазу в новую пробирку, добавляли 150 мкл фенола и 150 мкл хлороформа (24:1
изоамиловый спирт), тщательно перемешивали и центрифугировали при 13 000 об/мин 5
мин, отбирали верхнюю фазу, добавляли 300 мкл хлороформа, центрифугировали. Верхнюю
водную фазу переносили в чистую пробирку, добавляли 120 мкл 10 М ацетата аммония и 500
мкл изопропанола, тщательно перемешивали. Инкубировали в течение ночи при температуре
-20°С. Осадок промывали дважды 250 мкл 70% этанола, центрифугировали, подсушивали
осадок и растворяли в 50 мкл ТЕ.
Результаты и обсуждение
Чистоту выделенной ДНК оценивали по отношению оптической плотности при
длинах волн 260 и 280 нм. Результаты спектрофотометрических измерений представлены в
таблице 1. Согласно данным таблицы наибольшее количество ДНК удалось выделить с
помощью метода СТАБ, наименьшее количество- ком. набором 1.
Орган
печень
селезёнка
мышцы
сердце
печень
селезёнка
мышцы
сердце
печень
селезёнка
мышцы
сердце
печень
селезёнка
Ф- Х
Э
СТАБ
Метод
ком. набор ком. набор
2
1
Таблица 1. Данные спектрофотометрических измерений и практический выход ДНК
260 нм 280 нм
0,044
0,104
0,049
0,051
1,189
1,98
0,16
0,426
1,115
1,672
0,211
0,498
0,0497
0,749
0,018
0,045
0,026
0,015
0,605
0,985
0,071
0,224
0,527
0,801
0,09
0,23
0,255
0,383
260/280
2,21
2,091
2,234
2,199
2,147
2,032
2,082
2,002
2,15
2,079
2,11
2,098
1,95
1,96
Выход
ДНК
мг/г
0,347
0,935
0,458
0,717
10,2
21,08
1,92
4,24
5,18
9,09
1,15
2,72
3,37
5,3
Максимальный выход ДНК наблюдается для образцов ткани печени (5,18 мг/г) и
селезёнки (9,09 мг/г), что сопоставимо с литературными данными других экспериментов по
выделению ДНК похожими методами.
Полученные данные свидетельствуют о том, что осаждение нуклеиновых кислот с
помощью четвертичного аммониевого основания значительно повышает выход ДНК.
Результаты анализа размера фрагментов полученных образцов ДНК (см. рисунок
http://www.dx.doi.org/10.13140/2.1.1370.2725) показывают, что ДНК, выделенная всеми
методами, кроме ком. набора 1, имеет низкомолекулярные продукты, т.е. примеси РНК (50100 п.о.). Ранее было показано, что эти низкомолекулярные продукты эффективно
устраняются путём обработки РНКазой А [2]. Высокая степень сохранности ДНК была
получена всеми методами выделения.
Заключение и выводы
Учитывая полученные результаты спектрофотометрического метода и электрофореза
образцов ДНК, выделенных из печени, селезёнки, мышц и сердца разными методами, можно
утверждать, что наибольшее количество высокомолекулярной ДНК успешно выделяет метод,
основанный на использовании буфера СТАБ и фенольно- хлороформная экстракция. В
экологическом аспекте и в связи с токсичностью фенола преимущество следует отдать
методу с применением четвертичного аммониевого основания.
Для защиты образцов ДНК от возможных модификаций во время выделения,
дополнительно в состав растворов для лизиса тканей метода СТАБ можно внести
перехватчики радикалов и антиоксиданты.
1.
Буслов
К.Г.
Роль
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
полиморфизмов генов репарации
ДНК
в
формировании
предрасположенности к раку молочной железы: автореф. …дис. канд. мед. наук: 14.00.14 /
К.Г. Буслов; Рос. акад. наук.- Санкт- Петербург, 2006.- 5с.
2. Бакшаева М.А. Теоретические предпосылки применения внеклеточной ДНК для
коррекции пострадиационных состояний / М.А. Бакшаева, С.С. Сыманович, А.Е. Козлов,
А.В. Куликов, Д.Р. Петренёв // Радиобиология: Антропогенные излучения: материалы
междунар. науч. конф. (г. Гомель, 25-26 сент. 2014 г.) / Национальная академия наук Беларуси,
Институт радиобиологии; ред. кол.: А.Д. Наумов (гл.ред.) [и др.]. – Минск: Институт
радиологии, 2014. – 228 с. – С. 9-12 DOI: 10.13140/2.1.3944.7046