Вносится Правительством Российской Федерации;doc

На правах рукописи
Сметанина Марина Викторовна
Морфофункциональные изменения щитовидной железы
и регионарных лимфатических узлов при различных
моделях атерогенеза
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Тюмень – 2014
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном
учреждении «Ижевская государственная медицинская академия» Министерства
здравоохранения Российской Федерации
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор,
заслуженный работник Высшей школы РФ,
заслуженный деятель науки УР
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор,
заведующий кафедрой гистологии,
эмбриологии и цитологии ФГБОУ ВПО
«Южно-Уральский государственный
медицинский университет» МЗ РФ
доктор медицинских наук, профессор,
заведующий кафедрой гистологии,
цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО
«Уральский государственный медицинский
университет»
Глумова Валентина Алексеевна
Брюхин Геннадий Васильевич
Сазонов Сергей Владимирович
Ведущая организация: ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова
Минздрава России, г. Москва.
Защита состоится 23 декабря 2014 года в ______ час. на заседании
диссертационного совета Д 208.101.02 при государственном бюджетном
образовательном учреждении высшего профессионального образования
«Тюменская
государственная
медицинская
академия»
Министерства
здравоохранения Российской Федерации, г. Тюмень, ул. Одесская, д. 54
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте государственного
бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального
образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства
здравоохранения Российской Федерации, http://www.tyumsma.ru
Автореферат разослан «__»_______2014 г.
Ученый секретарь Совета
Д 208.101.02
д.м.н
Вихарева Л.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность
темы.
Атерогенез
представляет
собой
длительный,
многоэтапный процесс, долгое время протекающий бессимптомно, часто
выявляющийся на клинической стадии уже в виде серьезных осложнений.
Задействованность многих систем, в том числе эндокринной, позволяет отнести
атеросклероз к системной патологии, что подтверждает целостность организма.
Проблеме морфофункционального состояния щитовидной железы при различных
патологических процессах уделяется внимание многими авторами (Федченко
Н.П., 1988; Хмельницкий О.К., Котович В.М., 1997; Дедов И.И. с соавт., 2001;
Васильева Е.В., 2009; Яглова Н.В., 2011; Bamashmoos S.A. et al., 2013; Geng H. et
al., 2014). Это связано с высокой значимостью тиреоидных гормонов в
поддержании гомеостаза организма, лабильностью щитовидной железы при
воздействии эндо- и экзогенных факторов.
В настоящее время считается приоритетным одновременное изучение
нескольких
функциональных
систем
(нервная,
гуморальная,
иммунная),
осуществляющих регуляторную функцию в тесной взаимосвязи друг с другом. По
современным представлениям наименее изученным остается взаимодействие
щитовидной
железы
с
ее
лимфатической
системой
при
раз
личных
патологических состояниях, в том числе, при атеросклерозе (Горчакова О.В.,
2010; Valentina V.N., 2011; Backteman K. et al., 2012; Tseng F.Y. et al., 2012; Hamze
M. et al., 2013).
Гипергомоцистеинемия является относительно молодой и малоизученной
проблемой современной медицины (Guo H.Y. et al., 2014; Wang S. et al., 2014). В
настоящее время нет описания структурно-функциональных преобразований во
многих органах при данном патологическом процессе. Щитовидная железа,
являясь лабильной структурой, чутко реагирующей на большинство экзо- и
эндогенных воздействий, обладая широким спектром регуляторных влияний,
представляет собой важный объект для исследования, ввиду возможности
выявления морфологических преобразований на ранних стадиях атерогенеза.
Помимо этого, интерес к щитовидной железе обусловлен патогенетической
взаимосвязью между атеросклерозом и гипотиреозом. Участие локального и
системного
воспаления
в
инициации
и
прогрессировании
атеросклероза
(Нагорнев В.А., Мальцева С.В., 2005; Libby P., 2013) делает целесообразным
изучение регионарных лимфоузлов, изменения в которых позволяют судить как о
состоянии щитовидной железы, так и сделать выводы об иммунологической
напряженности организма в целом (Backteman K. et al., 2012; Uchiyama R. et al.,
2012;
Hamze M. et al., 2013). В литературе отсутствуют сравнительные
морфологические
исследования
щитовидной
железы
и
лимфоузлов
при
атерогенезе, хотя эта зависимость обнаружена (Горчакова О.В., 2010). Проблема
гипергомоцистеинемии как предиктора атеросклероза остается малоизученным
вопросом и не всегда учитывается в диагностике и лечении современными
врачами.
Взаимосвязь
между
уровнями
гомоцистеина,
холестерина
и
тиреоидными гормонами прослеживается в единичных работах последних лет
(Bamashmoos S.A. et al., 2013).
Цель и задачи. Целью настоящего исследования явилось выяснение
специфичности реакций отдельных клеточных популяций в щитовидной железе и
регионарных (паратрахеальных) лимфатических узлах при различных моделях
атерогенеза (гиперхолестеринемия и гипергомоцистинемия).
Для достижения данной цели мы поставили перед собой следующие задачи:
1. Отработать гиперхолестериновую и гипергомоцистеиновую модели
атерогенеза у крыс.
2. Определить особенности морфофункциональных изменений щитовидной
железы и регионарных лимфатических узлов на различных уровнях организации
(органный, тканевой, клеточный, субклеточный) при гиперхолестериновой диете.
3. Дать морфофункциональную оценку указанных органов (щитовидная
железа и паратрахеальные лимфатические узлы) при гипергомоцистеиновой
модели атерогенеза.
4. Провести сравнительный анализ специфичности реакций отдельных
клеточных популяций в щитовидной железе и паратрахеальных лимфоузлах при
гиперхолестериновой и гипергомоцистеиновой моделях атерогенеза.
Методы исследования. Для выполнения поставленных задач на
животных были воспроизведены гиперхолестериновая и гипергомоцистеиновая
модели атерогенеза. Морфофункциональное состояние щитовидной железы и
лимфатических
узлов
гистохимических,
моноклональных
исследовано
биохимических,
антител,
с
помощью
общегистологических,
иммуноферментных
электронной
микроскопии
методов,
метода
(просвечивающая
и
сканирующая методика), проведена оценка цитологических показателей крови.
Для обобщения цифрового материала была применена статистическая обработка
материала с использованием стандартного пакета программ Statistica 6.
Научная новизна. Впервые показано, что гипергомоцистеинемия
является важнейшим триггерным фактором атерогенеза, и патогенетические
эффекты гомоцистеина приводят к более грубым морфофункциональным
изменениям биологических систем на клеточном и тканевом уровнях, в отличие
от
структурных
изменений
при
гиперхолестеринемии.
Впервые
изучен
морфофункциональный статус щитовидной железы при гипергомоцистеиновой
модели
атерогенеза,
сопровождающиеся
выявлены
дис-
и
атрофические
гипофункциональным
преобразования,
состоянием
органа,
сопровождающиеся гиперплазией регионарных лимфатических узлов. Впервые
показана асинхронность структурных преобразований и различная степень
выраженности компенсаторных изменений в органах при разных моделях
атерогенеза. Выявлены существенные изменения на субклеточном и клеточном
уровнях как в щитовидной железе, так и в лимфатических узлах, проявляющиеся
в
изменении
структуры
функционирующих
и
количества
тироцитов
и
ядер,
органелл,
числа
ядрышек,
обеспечивающих
активно
продукцию
специфических белков. Продемонстрирована разная по интенсивности и
направленности изменений реакция лимфатических узлов при атерогенезе,
индуцированном
различными
факторами
(гиперхолестеринемия
и
гипергомоцистеинемия). Впервые показано, что более мощным и быстрым
атерогенным потенциалом обладает гомоцистеин, в избыточном количестве
присутствующий
в
крови.
Впервые
выявлено,
что
в
ответ
на
гипергомоцистеинемию регионарные паратрахеальные лимфоузлы обнаруживают
разную реакцию. Структурные изменения самого крупного лимфатического узла
(фолликулярная гиперплазия) обеспечивают выполнение лимфоидной функции,
другие – лимфодренажной.
Теоретическая
и
практическая
значимость.
Наше
исследование
демонстрирует однонаправленность гистологических изменений в щитовидной
железе
и
регионарных
лимфоузлах
на
доклинических
этапах
развития
заболевания, что доказывает не только их топографическое единство, но и
функциональную взаимосвязь. Полученные данные расширяют существующие
представления о воздействии гипергомоцистеинемии на щитовидную железу и
регионарные лимфоузлы, тем самым позволяя более полно охарактеризовать
влияние гомоцистеина на организм в целом. Выявленные морфофункциональные
изменения изучаемых органов помогают объяснить отдельные механизмы
поддержания внутриорганного гомеостаза и подчеркивают важность изучения
тиреоидных гормонов при атеросклерозе. Полученные факты могут быть
использованы в последующих научных работах по изучению системного влияния
гомоцистеина.
Результаты данной работы позволяют рекомендовать для апробации в
клинической
практике
скрининговой
определение
диагностики,
что
уровня
позволит
гомоцистеина,
выявить
и
в
как
метода
последующем
скорректировать атерогенез на доклинических этапах развития патологического
процесса.
Углубленные
представления
о
внутриорганных
структурных
перестройках щитовидной железы могут способствовать нахождению новых
точек
приложения
патогенетического
лечения
и
разработке
наиболее
оптимальной схемы терапии данного состояния.
Положения, выносимые на защиту:
1) Глубина и выраженность морфофункциональных преобразований в
щитовидной железе и паратрахеальных лимфоузлах зависит от вида атерогенного
индуцирующего фактора (гиперхолестеринемия и гипергомоцистеинемия).
2) При гиперхолестериновой и гипергомоцистеиновой моделях атерогенеза
в
щитовидной
железе
свидетельствующие
о
происходят
дис-
гипофункциональном
и
атрофические
состоянии
органа.
изменения,
Наиболее
чувствительными структурами при атерогенезе в различных моделях его
воспроизведения
являются
фолликулярный
эпителий,
коллоид
и
соединительнотканная строма органа.
3) Степень морфофункциональных изменений в щитовидной железе при
гипергомоцистеинемии
выше,
чем
при
атерогенной
дислипидемии,
что
проявляется в более выраженном изменении процентного соотношения тканевых
компонентов органа (эпителий – коллоид – строма), а также в значительном
увеличении секреторной активности тучных клеток.
4) В
паратрахеальных
лимфоузлах
при
холестериновой
нагрузке
наблюдается паракортикальная гиперплазия, характеризующая активность Тклеточного звена иммунитета,
при гипергомоцистеинемии – фолликулярная
гиперплазия, отражающая усиление В-клеточного иммунитета; регионарные
лимфоузлы при гипергомоцистеинемии испытывают неодинаковую нагрузку.
Апробация. Материалы настоящего исследования доложены и обсуждены на
Объединенном
Иммунологическом
форуме
(Санкт-Петербург,
2008),
VI
Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Саратов, 2009), III
эмбриологическом симпозиуме Всероссийского Научного Общества анатомов,
гистологов, эмбриологов «Закономерности эмбриофетальных морфогенезов
человека
и
позвоночных»
(Ханты-Мансийск,
2011),
Объединенном
Иммунологическом форуме (Нижний Новгород, 2013), Всероссийской научной
конференции «Актуальные проблемы адаптогенеза и репаративных гистогенезов
(Оренбург, 2013), межвузовских научных конференциях молодых ученых и
студентов (Ижевск, 2010,
2012, 2013, 2014), совместных межкафедральных
конференциях Ижевской государственной медицинской академии в 2008-2014 г.г.
Апробация работы проведена на совместном заседании кафедр биологии с
экологией;
цитологии,
гистологии
и
эмбриологии;
анатомии
человека;
патологической анатомии; патофизиологии; микробиологии, вирусологии и
иммунологии;
здравоохранения;
нормальной
физиологии;
поликлинической
общественного
терапии
с
курсом
здоровья
и
клинической
фармакологии ФПК и ПП ГБОУ ВПО «Ижевская государственная медицинская
академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской
Федерации 25.06.2014 года.
Публикации
По теме диссертации опубликованы 22 научные работы, в том числе 5 статей
и 8 тезисных сообщений в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК
Министерства образования и науки РФ, оформлено одно рационализаторское
предложение.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 167 страницах
машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов
собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и
указателя литературы. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 76 рисунками.
Библиография включает 337 источников, в том числе 181 - на иностранном языке,
занимает 36 страниц.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал и методы исследования.
Работа выполнена на 200 беспородных
белых крысах-самцах Rattus norvegicus Berk в возрасте 2-3 месяца, массой тела
180-200 граммов. Исследование одобрено комитетом по биомедицинской этике
ГБОУ ВПО ИГМА МЗ РФ от 28.02.2012 (аппликационный № 290).
Для создания классической экспериментальной модели атерогенеза у крыс
была использована синтетическая гиперхолестериновая диета по Мещерской К.А.
(Николова Н.П., 1965) в нашей модификации (рационализаторское предложение
№01.12 от 19 июня 2012),
с включением дополнительных стрессирующих
факторов (ограничение двигательного режима, формированием зоосоциального
стресса и полового стресса). Контрольные животные содержались в стандартных
условиях вивария – стандартный режим питания и двигательная активность.
Для
создания
гипергомоцистеиновой
модели
атерогенеза
опытным
животным ежедневно внутрибрюшинно вводился раствор гомоцистеина в дозе
13,4 мг/кг (Смирнов А.В. с соавт., 2005). Забой животных производился
непосредственно после окончания курса инъекций через 1 месяц. Животные
контрольных
групп
получали
ежедневно
внутрибрюшинные
инъекции
изотонического раствора хлорида натрия.
Забой животных производился путем эфирного наркоза в летальной дозе в
соответствии
с
правилами
проведения
работ
с
использованием
экспериментальных животных (приказ Минздрава СССР от 12.08.1977 №755;
приказ Минздравсоцразвития РФ от 23.08.2010 №708н).
У животных проводили общий анализ крови с определением лейкоцитарной
формулы, а также выявляли липидный спектр плазмы крови: общий холестерин,
липопротеины высокой, низкой и очень низкой плостности, триглицериды,
рассчитывали атерогенный индекс. Для диагностики функционального состояния
щитовидной железы определяли уровни трийодтиронина (Т3) и тироксина (Т4).
Для выявления атеросклеротических изменений грудную часть аорты и ее дугу,
щитовидную
железу
и
паратрахеальные
лимфоузлы
фиксировали
в
формальдегиде («РЕАХИМ»), обезвоживали и заливали в парафиновую среду для
заливки (HISTOMIX). Срезы щитовидной железы и регионарных лимфоузлов
окрашивались гематоксилин-эозином для анализа общей структуры органа. В
щитовидной железе определяли объемную плотность тканевых компонентов,
размерные показатели фолликулов, митотическую активность тироцитов и
показатели
кариоцитометрии.
В
срезах
паратрахеальных
лимфоузлов,
окрашенных гематоксилин-эозином, определялось процентное соотношение
коркового и мозгового вещества, анализировались основные типы клеточных
популяций, проводили оценку состояния кровеносных сосудов. Для детального
изучения структурной организации ядер и ядрышек тироцитов использовалась
реакция AgNOR’s (Челидзе П.В., Зацепина О.В., 1988). Выявление метахромазии
тканевых базофилов, их количественная оценка и определение степени
грануляции в срезах щитовидной железы и лимфатических узлов изучали при
помощи окраски срезов азур-II-эозином. Подсчет субпопуляций тучных клеток и
расчет
индексов
(насыщения
гепарином,
дегрануляции,
гранулолизиса)
проводился по Линднеру Д.П. с соавт. (1980). ШИК-реакция по Мак-Манусу
позволила оценить содержание нейтральных и кислых гликозаминогликанов в
тироцитах и коллоиде. ШИК-реакция в лимфатических узлах дает представление
о состоянии венул с высоким эндотелием. Для выявления РНК в ядре и
цитоплазме клеток был использован метод окраски метиловым зеленымпиронином (по Браше). Для качественной оценки состояния соединительной
ткани был использован метод Вейгерта для окраски эластических волокон.
Активность кислой и щелочной фосфатазы определялась реакцией по Гомори.
Объемную плотность тканевых компонентов щитовидной железе определяли,
используя окулярную сетку с 64 равноудаленными точками. Количественно
определяли процентное соотношение малых, средних и крупных фолликулов
(Хмельницкий О.К., Быков В.Л., 1980; Крейчман Г.С., 1985). Для оценки
пролиферативной активности был использован иммуногистохимический метод
(верификация экспрессии в тканях белка Ki-67). Оценка активности апоптоза
проводилась с использованием метода моноклональных антител с Caspase-3. Для
изучения состояния щитовидной железы и регионарных лимфоузлов на
субклеточном уровне были использованы просвечивающий и сканирующий
варианты
электронной
микроскопии.
Формирование
сводных
таблиц
и
статистическая обработка материала велись в разработанной базе данных в
программе Microsoft Office Excel, Statistica 6.
Собственные данные и их обсуждение. Повышение количества экзогенно
введенного холестерина, социальный и половой стресс, гиподинамия приводят к
формированию гиперхолестеринемии (уровень общего холестерина 2,51±0,1
ммоль/л, у интактных животных – 2,2±0,27 ммоль/л, р≤0,1), триглицеридемии
(1,75±0,26 ммоль/л vs 1,07±0,11 ммоль/л, р≤0,05), сопровождается увеличением
наиболее атерогенных фракций крови (ЛПОНП, 0,8±0,12 ммоль/л vs 0,5±0,05
ммоль/л, р≤0,05), повышением коэффициента атерогенности (1,29±0,17 в опыте vs
1,02±0,13 в контроле, р≤0,1).
Изменения в лейкоцитарной формуле свидетельствуют об активации
клеточного иммунитета и неспецифической резистентности организма: рост
относительного содержания лимфоцитов (68,81±1,5%в опытной группе при
57,33±3,76% – в контрольной, р≤0,05) и моноцитов (15,86±0,86% vs 11,67±2,03%,
p≤0,1) в крови животных.
При
микроскопическом
исследовании
срезов
щитовидной
железы
экспериментальных животных с гиперхолестеринемией обращает на себя
внимание увеличение диаметра артерий, расширение капилляров, гемостаз,
разрастание и склероз стромы. Отмечается превалирование фолликулов крупного
диаметра по всему объему органа (рисунок 1). При этом количество фолликулов
малого диаметра достоверно уменьшается (рисунок 1). Соотношение фолликулов
разных размеров (малые:средние:крупные) при гиперхолестеринемии составляет
1:1:1 (у интактных 3:2:1). Выявлено снижение удельной площади тиреоидного
эпителия, увеличение процентной доли коллоида и стромы (рисунок 2). В полости
фолликулов обнаруживаются десквамированные клетки. Краевая вакуолизация
коллоида не выявляется. На субклеточном уровне отмечены следующие
изменения тироцитов: редукция микроворсинок, увеличение числа первичных и
вторичных лизосом, изменение плотности цитоплазматического матрикса,
набухание митохондрий, инвагинация кариолеммы. Средний диаметр ядер
статистически
достоверно
уменьшается
и
составляет
0,25±0,01
мкм
(у
контрольных животных 0,34±0,009 мкм), отмечается тенденция к уменьшению
количества ядрышек в тироцитах крупных фолликулов и к увеличению в
аденомерах среднего и крупного диаметров (таблица 1).
Таблица 1. Процентное соотношение тироцитов с разным числом ядрышек в фолликулах
интактных и экспериментальных групп (M±m)
Группа
Фолликулы
Интактные
Гиперхолестеринемия
Количество ядрышек в клетке
Количество ядрышек в клетке
1
2
3 и более
1
Крупные
22±2,08
30,7±1,45
49±1,53
19,7±0,88#
32,7±3,28
47,7±3,84
Средние
22,7±4,26
33,7±3,71
44,3±2,60
29,7±2,40#
23,7±3,48*
46,7±2,19
25±3,61
31,3±3,53
43,7±6,84
25,3±1,86
26,7±2,91*
48±4,60
Малые
2
3 и более
Примечание - * - р≤0,05 в сравнении с контрольными показателями; # - p≤0,1.
При атерогенной гиперхолестериновой диете отмечено уменьшение числа
тучных клеток на поле зрения. Мастоциты уменьшены в размере, соотношение
субпопуляций мастоцитов при гиперхолестеринемии следующее (в %): «А» 43,6 :
«В» 31,1 : «С» 12,6 : «D» 12,7.
Данные, полученные иммуногистохимическими методами исследования,
свидетельствуют об уменьшении белокпродуцирующей функции тироцитов, а
именно, - снижение концентрации РНК в цитоплазме тироцитов (реакция по
Браше) и тиреоглобулина в просвете фолликулов и цитоплазме клеток
фолликулярного эпителия (слабоположительная ШИК-реакция).
Исследование активности пролиферации (Ki-67) и апоптотических процессов
(Caspase-3)
не
выявило
значимых
преобразований
при
холестериновом
атерогенезе, что согласуется с данными, полученными другими методами.
Гипергомоцистеиновая модель атерогенеза сопровождается увеличением
гомоцистеина в крови до умеренных значений: 27±0,3 мкмоль/л. Изменений в
липидном
спектре
крови
не
отмечено.
В
крови
животных
данной
экспериментальной группы выявляется незначительная моноцитопения (до
3,13±0,57% против контрольных значений в 6,83±1,7%), снижение числа
эозинофилов (в 1,4 раза, р≤0,05), повышение лимфоцитов (в 1,1 раза, р≤0,1).
Повышенному уровню гомоцистеина плазмы крови сопутствуют изменения в
грудном отделе аорты, которые можно охарактеризовать как начальная стадия
развития атеросклеротического процесса. В срезах щитовидной железы обращает
на себя внимание увеличение количества крупных фолликулов (рисунок 1),
стенка которых образована уплощенными клетками. Коллоид плотный, густой,
без признаков краевой вакуолизации, содержит десквамированные клетки.
Локально определяются фолликулы с ретенцией коллоида. Имеет место
увеличение площади стромы (рисунок 2) за счет разрастания соединительной
ткани, имеются участки склерозирования. Количество клеток в состоянии
апоптоза нарастает преимущественно в соединительной ткани, вблизи сосудов.
При морфометрическом исследовании сосудистого компонента стромы выявлено
значительное расширение артерий. Стенка их утолщена за счет гиперплазии
мышечного и эндотелиального слоев. В состоянии ядрышкового аппарата
тироцитов обращает на себя внимание значительное преобладание одно- и
двуядрышковых форм. Среднее количество мастоцитов, приходящихся на поле
зрения, возрастает практически в 2 раза. Соотношение мастоцитов различных
форм следующее (в %): «А» 28,2 : «В» 35,4 : «С» 20,3 : «D» 16,2.
На субклеточном уровне организации щитовидной железы выявлены
следующие изменения. Микроворсинки тироцитов практически не выражены,
особенно в двуядерных клетках. В цитоплазме определяется значительное
количество митохондрий, элементов ЦПС, секреторных вакуолей, первичных и
вторичных лизосом.
Интенсивность
ШИК-реакции
коллоида
несколько
ниже,
чем
при
гиперхолестеринемии. При этом степень окрашивания тироцитов выше, чем в
группе с гиперхолестеринемией. Такие изменения в тинкториальных свойствах
являются показателем реакции функционального напряжения и носят мозаичный
характер. При окраске метиловым зеленым пиронином коллоид фолликулов
разных диаметров проявляет реакцию на РНК умеренно (+) (по сравнению с
контрольной группой ++). Интенсивность окраски цитоплазмы тироцитов
снижена по сравнению с контролем, но повышена относительно первой
экспериментальной группы, что можно выразить как соотношение: контроль (++):
ГХ (±): ГГЦ (+).
В обеих экспериментальных группах увеличивается количество крупных
фолликулов, отмечается тенденция к уменьшению количества малых и средних
аденомеров (рисунок 1).
Крупные
48,2
Средние
34,3*
31,9#
34,5
17,3
Контроль
33,8*
ГХ
Малые
45,3#
32,6
22,1*
ГГЦ
Рисунок 1 – Процентное соотношение фолликулов разных диаметров в норме и группах
эксперимента (ГХ – гиперхолестеринемия, ГГЦ - гипергомоцистеинемия): * - р≤0,05 по
сравнению с контрольными показателями; # - p≤0,1.
Как при холестеринемии, так и при гипергомоцистеинемии процентная доля,
приходящаяся на коллоид, повышена, отмечается снижение удельной площади
фолликулярного эпителия и увеличение доли стромального компонента (рисунок
2).
60 %
50
40
30
*
*
*
Контроль
*
*
ГХ
ГГЦ
20
10
0
Эпителий
Коллоид
Строма
Рисунок 2 – Процентное соотношение тканевых компонентов щитовидной железы в норме
и эксперименте (ГХ – гиперхолестеринемия, ГГЦ - гипергомоцистеинемия):
* - р≤0,05 по
сравнению с контрольными значениями; # - p≤0,1.
4
3,5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
*
ИД
ИГ
ИСГ
ГХ
ГГЦ
*
*
Контроль
ИНГ
Рисунок 3 – Индексы секреторной активности тучных клеток в норме и эксперименте (ГХ
– гиперхолестеринемия, ГГЦ - гипергомоцистеинемия): * - р≤0,05 при сравнении с
контрольными показателями.
Индексы
секреторной
активности
мастоцитов,
рассчитываемые
по
специальным формулам, позволяют оценить тип секреции клеток. Соотношение
процессов мерокриновой и апокриновой секреции при атерогенной дислипидемии
сохраняются на уровне показателей интактных животных (рисунок 3). При
экспериментальной
гипергомоцистеинемии
увеличиваются
индексы
дегрануляции (ИД) и гранулолизиса (ИГ), при этом индекс насыщения гепарином
(ИНГ) уменьшается практически в 2 раза (рисунок 3), что свидетельствует о
длительном тяжелом воспалительном процессе, при котором мастоциты не
успевают восстановить уровень медиаторов.
При формировании холестериновой модели атеросклероза изменяется
архитектоника ткани лимфатического узла и его структурно-функциональные
характеристики. Соотношение зон сдвигается в сторону преобладания коркового
вещества, оно занимает 80-85% среза, увеличен объем паракортикальной зоны.
Капсула лимфоузла отечна, резко расширен субкапсулярный синус, он заполнен
лимфоцитами, встречаются тучные клетки, эозинофилы, макрофаги и т.д.
Количество лимфатических узелков в корковой зоне выше, чем в норме. В
основном это фолликулы, не имеющие светлого центра, без выраженной короны,
окружающей узелок. Большей частью это центры, в которых преобладают малые
лимфоциты, митозов мало. Это наблюдение соотносится с данными окраски Ki67, при которой количество клеток, находящихся в состоянии митотического
деления ниже, чем в контроле. Исследование апоптотических элементов
иммуногистохимическим
методом
(на
выявление
каспазы-3)
показало
незначительное увеличение числа апоптозных клеток в корковом веществе
паратрахеальных лимфоузлов, что согласуется с данными морфометрического
анализа (таблица 2). Подобный вариант гистологической картины может
трактоваться как доброкачественная реактивная гиперплазия. Объем мозгового
вещества лимфатического узла снижен. Морфология синусов и мозговых тяжей
существенно не меняется, плотность клеток невысока, но соизмерима с
контролем. В паракортикальной зоне лимфоузлов выявляется ШИК-позитивное
окрашивание венул с высоким эндотелием, содержащих в просвете множество
малых лимфоцитов. Наличие в лимфоузлах аттенуированных фолликулов
считается морфологическим проявлением сниженной иммунной защиты (Белянин
В.Л. с соавт., 1999). Увеличение количества Т-лифоцитов свидетельствует в
пользу стимуляции клеточного звена
атерогенного рациона,
социального
иммунитета.
Возможно,
и полового стрессов,
сочетание
ограниченного
двигательного режима, приводит к перестройке гормонального статуса, активации
иммунных
процессов,
что
отражается
на
дренирующих
этот
орган
паратрахеальных лимфоузлах и впоследствии влечет за собой резкое их
истощение.
Сосуды лимфоузлов расширены, отмечается стаз форменных элементов.
Обращает на себя внимание эозинофильная инфильтрация соединительной ткани,
окружающей лимфатические узлы. Количество тучных клеток падает в сравнении
с контролем. Однако в отличие от контроля снижено количество мастоцитов
главным образом в капсуле, тогда как в синусах они могут формировать
скопления. Соотношение субпопуляций мастоцитов следующее (в %): «А» 4,3 :
«В» 28,2 : «С» 32,9 : «D» 34,6.
Повышенный уровень гомоцистеина в крови приводит к выраженным
морфологическим перестройкам в паратрахеальных лимфоузлах, интенсивность
которых выше в сравнении с предыдущей экспериментальной группой. У данных
животных незначительно расширен
субкапсулярный синус
узла,
в
нем
располагаются редкие лимфоциты, макрофаги, единичные плазматические
клетки, отмечается присутствие мастоцитов. Капсула лимфоузла утолщена,
инфильтрирована тучными клетками и их гранулами. Морфология узлов различна,
иногда прямо противоположна, что чаще связано с их величиной. Так, лимфоузлы
малого
размера
(чаще
2-3)
по
гистоархитектонике
относятся,
согласно
классификации Бородина Ю.И. с соавт. (1992), к фрагментированному типу и,
следовательно, выполняют преимущественно лимфодренажную функцию. Можно
предположить, что это узлы второго порядка, получающие лимфу от первичных
крупных реактивных лимфатических узлов, обеспечивающих, главным образом,
лимфоидную функцию.
Наиболее крупный лимфатический узел при гипергомоцистеинемии
характеризуется преобладанием коркового вещества (75-80%). Лимфатические
узелки в нем представлены в основном вторичными, с хорошо развитым
герминативным центром и выраженной короной узелка. Преобладание коркового
вещества в лимфоузлах, развитие фолликулов, имеющих светлый центр, активная
реакция мозгового вещества свидетельствуют в пользу выраженной стимуляции
гуморального звена иммунитета. На этот факт также указывает развитие
фолликулов на границе паракортикальной и мозговой
зоны
и
в
самом
мозговом веществе. Плотность элементов в герминативных центрах снижена по
сравнению с контролем, однако отличается большим разнообразием клеточных
элементов, входящих в их состав (лимфоциты, плазмоциты, макрофаги) в отличие
от контроля (таблица 2). Увеличенное количество делящихся элементов отмечено
и при окраске Ki-67 в герминативных центрах, они появляются в короне узелка.
Количество апоптотических элементов повышено в корковом веществе и
мозговых тяжах лимфоузлов. Паракортикальная зона не выражена. Для венул с
высоким эндотелием характерна размытость границ, они увеличены в размерах,
эндотелий
набухший.
В них отмечается
изобилие
клеточных элементов,
адгезированных к стенке как изнутри, так и снаружи, находящихся в процессе
миграции. Синусы мозгового вещества небольших размеров, площадь, занимаемая
мякотными тяжами, повышена. Характерным является сниженное количество
плазмоцитов в мозговом веществе (в 1,38 раза, р≤ 0,05) (таблица 2).
Таблица 2. Клеточный состав различных зон паратрахеальных лимфоузлов в норме и
эксперименте (М±m)
Клеточные элементы
Лимфоциты
Плазмоциты
Макрофаги
Митотические
элементы
Зоны ЛУ
Контроль
Кора
58,22±2,51
Гипергомо
теринемия
цистеинемия
55,42±4,61
58,63±3,82
ПКЗ
55,12±9,53
54,96±3,31
57,78±6,22
МВ
17,61±1,88
18,26±2,12
17,87±2,23
Кора
0,22±0,01
1,24±0,03*
0,53±0,01*
ПКЗ
8,45±1,30
10,33±2,14
7,0±1,56
МВ
21,88±2,57
24,66±1,89
15,90±2,44*
Кора
2,88±0,84
5,64±0,91*
7,12±1,11*
ПКЗ
1,62±0,06
1,59±0,32
2,8±0,81#
МВ
5,36±0,91
6,54±1,53
10,21±2,87*
Кора
0,20±0,02
0,25±0,02
0,83±0,03*
ПКЗ
0,82±0,10
0,71±0,22
1,24±0,20#
МВ
0,77±0,21
0,83±0,32
1,56±0,30*
Кора
0,33±0,01
0,82±0,09#
1,51±0,25*
ПКЗ
0,23±0,01
0,34±0,01
0,2±0,02
МВ
0
0
0,58±0,12*
Апоптотические
элементы
Гиперхолес
Примечание - в сравнении с контролем: * – р≤0,05; # – р≤0,1
Подобная гистологическая картина может трактоваться как фолликулярная
гиперплазия. Сосуды лимфоузлов расширены, эндотелий набухший, неровный, в
большинстве отмечаются застойные явления, признаки сладж-феномена. Число
мастоцитов в целом снижается 1,46±0,34 (σ=1,67), они располагаются главным
образом в соединительнотканной строме капсулы. Мастоциты представлены
преимущественно
активно
гранулирующими
клетками.
Соотношение
субпопуляций тучных клеток следующее (в %): «А» 16,3 : «В» 9,9 : «С» 45,9 : «D»
27,9.
Заключение. Морфофункциональные изменения щитовидной железы при
гиперхолестериновой и гипергомоцистеиновой моделях атерогенеза носят
однонаправленный характер. В щитовидной железе происходят гипо- и
атрофические изменения, свидетельствующие о гипофункциональном состоянии
органа. Это подтверждается показателями биохимического анализа крови на
содержание гормонов щитовидной железы. Так, при экспериментальной
гиперхолестеринемии уровень Т3 равен 2,8±0,02 нмоль/л, что составляет 90% от
контрольных значений (3,1±0,2 нмоль/л), а Т4 – 43,5±0,03 нмоль/л, т.е. 86,3% от
значений
группы
интактных
животных
(50,4±1,8нмоль/л).
При
гипергомоцистеинемии уровень Т3 составляет 77% от контрольных значений и
равен 2,4±0,01 нмоль/л, а Т4 – 82,3% (41,5±0,3 нмоль/л). Изменения при
гипергомоцистеиновой модели атерогенеза выражены в большей степени. Это
может быть связано с разнонаправленным и множественным токсическим
действием
гомоцистеина
на
клеточные
популяции
различного
генеза
(эпителиоциты, эндотелиоциты, тучные клетки). При гипергомоцистеиновой
модели атерогенеза больше триггерных факторов, которые вызывают как
непосредственно гипофункцию щитовидной железы (через цитотоксическое
действие гомоцистеина на тироциты и эндотелиоциты, окислительный стресс),
так и опосредованно (через атеросклеротические изменения сосудов) (рисунок 4).
Имеет место взаимное усугубляющее действие патологических процессов.
Увеличение в региональных лимфоузлах (при избыточном введении холестерина)
объема,
занимаемого
корковым
веществом
и
паракортикальной
зоной,
свидетельствует о напряженности как В-, так и Т-клеточного иммунитета. При
гипергомоцистеинемии обращают на себя внимание выраженные различия в
реакции лимфоузлов у одного и того же животного. Часть лимфоузлов (обычно
меньшего размера) при гипергомоцистеинемии меняют морфотип с компактного,
характерного для контрольных животных, на фрагментированный. Можно
предположить, что ряд лимфоузлов берет на себя преимущественно лимфоидную
функцию и отвечает реактивной перестройкой в ответ на активную антигенную
стимуляцию
организма,
тогда
как
другие
лимфоузлы
выполняют
преимущественно лимфодренажную функцию.
Гиперхолестеринем
ия
Дислипопротеинеми
я
Гипергомоцистеи
немия
Окислительный
стресс
Клетки
иммунной
системы
Стресс
ЭПР
Тироциты
Прямое
цитотоксическ
ое действие
Эндотелиоциты
Атерогенез
Гипофункция
ЩЖ
Рисунок 4 –
Возможные пути взаимосвязи атерогенеза и гипофункции щитовидной
железы при гиперхолестеринемии и гипергомоцистеинемии.
Таким образом, атерогенез, обусловленный введением гомоцистеина в
целом сопровождается угнетением функциональной активности щитовидной
железы, более выраженными ранними и разнонаправленными изменениями в
паратрахеальных лимфоузлах, свидетельствующими об активизации местного
иммунного ответа, усилении лимфодренажной функции.
Выводы
1. Морфофункциональные
изменения
щитовидной
железы
при
гиперхолестериновой и гипергомоцистеиновой моделях атерогенеза носят
однонаправленный характер. В щитовидной железе происходят гипо- и
атрофические изменения, свидетельствующие о гипофункциональном состоянии
органа. Данные изменения происходят на всех уровнях организации: органном,
тканевом, клеточном и субклеточном.
2. Структурно-функциональные
перестройки,
характерные
для
гипотиреоза,
значительно более выражены при гипергомоцистеиновой экспериментальной
модели атерогенеза. Данное явление обусловлено большим количеством
триггерных факторов, действующих при гипеогомоцистеинемии. А именно, –
непосредственное цитотоксическое действие на тироциты, тучные клетки и
эндотелиоциты;
способность
гомоцистеина
провоцировать
стресс
ЭПР;
гомоцистеин-индуцированный окислительный стресс.
3. Морфофункциональные
изменения
в
регионарных
лимфоузлах
при
гиперхолестеринемии свидетельствует о более выраженной локальной активации
клеточного звена иммунитета, при гипергомоцистеинемии – гуморального.
Степень и разнообразие структурных и цитологических преобразований в
лимфоузлах, характеризующих напряженность иммунных процессов, выше при
гипергомоцистеинемии.
4. Структурно-функциональные
зоны
и
при
регионарных
лимфатических
узлов
(реактивный
лимфоузел),
тогда
разнонаправлена:
один
из
узлов
как
цитологическая
характеристика
гиперхолестеринемии
при
испытывает
однотипна
гипергомоцистеинемиии
реактивные
перестройки,
характеризующиеся как фолликулярная гиперплазия, другие характеризуются
преобладанием мозгового вещества и сменой морфотипа лимфатического узла с
компактного на фрагментированный.
5. Атерогенез, независимо от типа инициирующего фактора (гиперхолестеринемия,
гипергомоцистеинемия), сопровождается снижением функциональной активности
щитовидной
железы
и
одновременной
гиперфункцией
окружающих
лимфатических узлов, что может быть обусловлено развитием адаптационнокомпенсаторных процессов, направленных на сохранение местного гомеостаза и
стабилизацию функционального состояния щитовидной железы.
Практические рекомендации.
Результаты
данной
работы
позволяют
рекомендовать определение уровня гомоцистеина для широкого применения в
клинической практике как метода скрининговой диагностики, что позволит
выявить и в последующем скорректировать атерогенез на доклинических этапах
развития патологического процесса, тем самым обеспечить раннее выявление
атеросклероза и предотвращение осложнений.
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
Содержание диссертации опубликовано в работах:
1. Чучкова, М.В. Морфофункциональная оценка гистогененеза некоторых
органов регуляторной системы / М.В. Чучкова // Иммунология Урала
(Материалы VI конференции иммунологов Урала, Ижевск), 2007. –№1(6). –
с. 33-35.
2. Глумова, В.А. Морфофункциональная характеристика надпочечников крыс
при экспериментальном атеросклерозе /В.А. Глумова, М.В. Чучкова //
Морфология, 2008. – т. 133, № 2. – с. 33.
3. Чучкова,
Н.Н.
Соотношение
эндокринных
и
иммунных
тканевых
компонентов щитовидной железы при экспериментальном атеросклерозе
/Н.Н.
Чучкова,
В.А.
Глумова,
М.В.
Чучкова
//
Российский
иммунологический журнал (Объединенный иммунологический форум,
Санкт-Петербург), 2008. – т. 2(11), №2-3. – с. 325.
4. Чучкова, М.В. Постнатальный гистогенез некоторых органов эндокринной
системы в норме и эксперименте / М.В. Чучкова, В.А. Глумова // Вестник
Уральской медицинской академической науки, 2008. – №1(19). – с. 7374.
5. Глумова, В.А. Онтогенетическая динамика популяции тучных клеток
щитовидной железы у человека в условиях экологического напряжения
/В.А. Глумова, И.А.Черенков, Н.А. Юминова, М.В.Чучкова // Морфология
(Материалы докладов VI всероссийского съезда анатомов, гистологов и
эмбриологов), 2009. – Т. 136, №4. – с.152.
6. Глумова, В.А. Морфофункциональные изменения щитовидной железы крыс
при экспериментальном атеросклерозе /В.А. Глумова, М.В. Чучкова, Н.В.
Кормилина
//
Актуальные
проблемы
эндокринологии.
Серия:
Эндокринология. Материалы VII межрегионального медико-социального
форума «Диабет. Человек. Общество». – Ижевск, 2009. – с. 117-118.
7. Чучкова, М.В. Особенности возрастных морфофункциональных изменений
щитовидной железы в норме и эксперименте / М.В.Чучкова // Материалы X
межвузовской научной конференции молодых ученых и студентов
«Современные аспекты медицины и биологии» – Ижевск, 2010. – с. 5-6.
8. Чучкова, Н.Н. Морфологические критерии активности иммуномодуляторов
с различным механизмом действия (экспериментальное исследование) /
Н.Н. Чучкова, Н.В. Кормилина, В.А. Глумова, М.В. Чучкова // Морфология
(Материалы докладов III эмбриологического симпозиума всероссийского
научного общества анатомов, гистологов, эмбриологов «Закономерности
эмбриофетальных морфогенезов у человека и позвоночных»), 2011. – №5. –
с. 126-127.
9. Чучкова,
Н.Н.
реорганизации
Морфологическая
тиреоидных
характеристика
комплексов
при
функциональной
экспериментальной
дислипидемии / Н.Н. Чучкова, В.А. Глумова, Н.В. Кормилина, М.В.
Чучкова // Вестник Удмуртского университета, 2011. – №3. – с. 151-153.
10. Чучкова, Н.Н. Морфофункциональный статус тучноклеточных популяций
периферических органов иммунной системы крыс / Н.Н. Чучкова, Н.В.
Кормилина,
В.А.
Глумова,
М.В.
Чучкова
//
Труды
Ижевской
государственной медицинской академии. Сборник научных статей. Ижевск, 2011. – т.49. – с. 33-34.
11. Чучкова, Н.Н. Особенности реактивных изменений лимфоузлов различной
локализации под влиянием иммуномодуляторов направленного действия /
Н.Н. Чучкова, Н.В. Кормилина, Э.Ш. Гайсина, М.А. Овчинников, М.В.
Чучкова // Вестник Уральской медицинской академической науки.
Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии, 2011. – №2/2 (35). –
с.75-76.
12. Сметанина, М.В. Морфометрическая характеристика ядер тироцитов при
экспериментальной гипергомоцистеинемии // Материалы XII межвузовской
научной конференции молодых ученых и студентов «Современные аспекты
медицины и биологии» – Ижевск, 2012. – с. 7-8.
13. Сметанина, М.В. Структурные особенности внутриорганной сосудистой
системы щитовидной железы крыс в норме и эксперименте // Материалы 4й Всероссийской научной конференции с международным участием
«Микроциркуляция в клинической практике». Ангиология и сосудистая
хирургия. Приложение. – 2012. – т.18. – с. 28.
14. Чучкова, Н.Н. Дислипопротеинемия приводит к снижению функциональной
активности AgNOR’s лимфоцитов крови/Н.Н. Чучкова, Н.В. Кормилина,
М.В. Сметанина, П.В. Смирнов // Вестник Уральской академической
науки (X конференция иммунологов Урала). 2012. – №4 (41). – с. 248-249.
15. Чучкова, Н.Н. Клеточный гомеостаз и процессы дегрануляции тучных
клеток в условиях атерогенной дислипидемии и иммуномодуляции /Н.Н.
Чучкова, Н.В. Кормилина, М.В. Сметанина // Морфология (Всероссийская
научная конференция «Актуальные проблемы адаптогенеза и репаративных
гистогенезов»). – 2013. – т. 144, №5. – с. 131.
16. Сметанина, М.В. Транскрипционная активность рибосомальных генов
фолликулярных
клеток
щитовидной
железы
в
норме
и
при
иммуномодуляции // Морфология (Всероссийская научная конференция
«Актуальные проблемы адаптогенеза и репаративных гистогенезов»). –
2013. – т. 144, 5. – с.114.
17. Чучкова, Н.Н. Влияние длительности введения иммуномодуляторов на
интегральные индексы лейкограммы (экспериментальные аспекты) / Н.Н.
Чучкова, Н.В. Кормилина., М.В. Сметанина, М.А. Овчинников // Сборник
научных трудов по материалам Международной конференции «Наука,
образование, общество: проблемы и перспективы развития». – 2013. – № 6.
– с. 140-141.
18. Чучкова,
Н.Н.
Иммунноэндокринные
взаимодействия
в
условиях
формирования гомоцистеиновой модели атеросклероза / Н.Н. Чучкова, В.А.
Глумова,
М.В.
Сметанина,
Н.В.
Кормилина
//
Российский
иммунологический журнал (Объединенный иммунологический форум),
2013. – т.7 (16), №2-3. – с. 301.
19. Чучкова, Н.Н. Нуклеологенез моноцитов крови при моделировании
долипидной стадии атеросклероза / Н.Н. Чучкова, Н.В. Кормилина, М.В.
Сметанина, М.А. Овчинников // Сборник материалов международной
научно-практической конференции, посвященной 80-летию профессора
Б.А. Никитюка «Проблемы современной морфологии человека». 2013. – с.
67-69.
20. Сметанина, М.В. Морфофункциональная характеристика щитовидной
железы при экспериментальной гипергомоцистеинемии // Материалы XIII
научно-практической конференции молодых ученых и студентов с
международным участием «Современные аспекты медицины и биологии». –
Ижевск, 2013 – с. 15-16.
21. Сметанина, М.В. Характеристика лаброцитов щитовидной железы при
различных моделях атергенеза // Материалы XIV межвузовской научнопрактической конференции молодых ученых и студентов «Современные
аспекты медицины и биологии». – Ижевск, 2014. – с. 20-21.
22. Сметанина, М.В. Морфометрическая характеристика щитовидной железы
при
различных
моделях
атеросклероза
/
М.В.
Морфологические ведомости, 2014. – №1. – с. 106-111.
Список сокращений
1. ГГЦ – гипергомоцистеинемия
2. ГХ – гиперхолестеринемия
3. ИГ – индекс гранулолизиса
4. ИД – индекс дегрануляции
5. ИНГ – индекс насыщения гепарином
6. ИСГ – индекс суммарного гранулолизиса
7. ЛУ – лимфатические узлы
8. МВ – мозговое вещество
9. ПКЗ – паракортикальная зона
10. Т3 – трийодтиронин
11. Т4 – тироксин
Сметанина
//