Лабораторная работа № 9

9
ТРАНСКРИПЦИЯ
И ПРОЦЕССИНГ РНК
ДНК содержит в закодированной форме наследственную информацию, необходимую для строения и функционирования компонентов живого организма, а также для
реализации метаболических процессов, характеризующих
жизнь. Синтез белков осуществляется на основе структурных генов и происходит в цитоплазме, на рибосомах.
Наследственная информация, необходимая для определения
последовательности аминокислот белка, находится в ядерной ДНК. Последняя не может покидать ядро, и поэтому
генетическая информация, соответствующая одному белку,
сперва копируется – транскрибируется в виде одной молекулы мРНК, которая значительно меньше по сравнению с
ДНК и которая затем проходит через ядерные поры и переносит информацию в цитоплазму.
Первым этапом экспрессии генов является транскрипция или копирование закодированной информации
ДНК (в виде специфической последовательности комплементарных нуклеотидов) в молекуле мРНК. Второй этап
состоит в трансляции (дешифровке) информации содержащейся в мРНК, при помощи молекул тРНК (которые связывают специфически одну аминокислоту); аминокислоты
располагаются в последовательности, указанной молекулой
мРНК, и соединяются посредством пептидных связей.
Синтез белка находится под строгим контролем онтогенетической программы организма или его потребно147
стей, что зависит от определенных условий метаболизма
или влияния среды.
Транскрипция осуществляется ферментами РНК–
полимеразами. Синтез РНК на основе матрицы ДНК происходит в направлении 5'→3' по принципу комплементарности (А=U; Т=А; G≡C; C≡G). Процесс протекает в несколько этапов (инициация, элонгация, терминация) с участием нескольких компонентов. Регуляция транскрипции
осуществляется специфическими последовательностями
промотора, терминатора и других модуляторных последовательностей (энхансер, сайлансер, оператор). Консервативные смысловые последовательности распознаются сайтспецифическими регуляторными белками, которые взаимодействуют с РНК-полимеразой и направляют, ускоряют
или замедляют процесс транскрипции.
Транскрипция у эукариот
В зависимости от РНК-полимеразы, осуществляющей транскрипцию, гены у эукариот подразделяются на три
класса:
 гены I-го класса - это гены, кодирующие рРНК – 5,8S,
18S, 28S и транскрибируемые РНК-полимеразой I. Относительная активность этого фермента равняется примерно 50-70%;
 гены II-го класса – это гены, кодирующие полипептидные цепи (структурные гены). Транскрипция осуществляется РНК-полимеразой II. Установлено, что около 10%
ДНК человека транскрибируется в мРНК. РНКполимераза II транскрибирует и несколько генов, кодирующих молекулы малой ядерной РНК (smal nuclear
RNA).
Синтетическая активность этого фермента
равняется примерно 20-40%;
 гены III-го класса – это гены, кодирующие 5S рРНК и
тРНК. Транскрипция осуществляется РНК-полимеразой
III, активность которой примерно 10%.
148
Транскрипция генов II-го класса
Аппарат транскрипции:
Ген с кодирующими и регуляторными последовательностями (промотор, терминатор):
- область промотора включает консервативные последовательности: ТАТА-box, СААТ-box, CG-box, октамер и
др., которые распознаются регуляторными белками;
- транскрибируемый участок ДНК включает: лидерную
последовательность (включая +1), экзоны, интроны,
терминатор (рис.9.1).
Рис. 9.1. Организация структурных генов эукариот
Цепь 5'→ 3' носит название кодогенной и является
нетранскрибируемой. Цепь 3'→5' называется антикодогенной цепью и служит матрицей для РНК. Расположение консервативных последовательностей определяет, с какой цепи
ДНК будет списываться информация на молекулу РНК.
РНК-полимераза II - это фермент, ответственный
за транскрипцию мРНК. В составе фермента различают 10
функциональных субъединиц, ответственных за узнавание
факторов транскрипции, денатурацию и ренатурацию ДНК,
149
катализ спаривания азотистых оснований ДНК и РНК. РНКполимераза присоединяет нуклеотиды в направлении 5'→3'
по принципу комплементарности, считывая цепь ДНК в
направлении 3'→5'. Этот фермент не может узнавать непосредственно последовательности промотора и соответственно не может инициировать транскрипцию, а действует
только в комплексе с регулирующими белками. В отличие
от ДНК-полимераз, РНК-полимеразы могут начинать синтез
РНК с нуля, в отсутствии праймера (рис.9.2). В качестве
мономеров для полимеризации используются рибонуклеозидтрифосфаты – АТР, GТР, СТР, UТР.
Рис. 9.2. Работа РНК-полимеразы
Белковые факторы транскрипции:
A. Общие факторы транскрипции – это белки, которые
распознают смысловые последовательности промотора,
точку инициации транскрипции (+1) и взаимодействуют
с РНК-полимеразой II. Эти белки участвуют в инициации и направлении, элонгации и терминации процесса
транскрипции всех генов II-го класса.
B. Специфические факторы транскрипции – это сайтспецифические белки, узнающие специфические последовательности в промоторе генов, экспрессирующихся в
определенных тканях. Они участвуют в активации определенных генов (деконденсация хроматина, освобожде150
ние промотора и активация общих факторов транскрипции).
Модуляторные последовательности ДНК, которые
контролируют скорость и эффективность транскрипции посредством некоторых регуляторных белков. Это усиливающие последовательности (энхансеры) и замедляющие последовательности (сайленсеры). Эти последовательности
могут располагаться как в зоне промотора, так и на значительном расстоянии от него.
Механизм транскрипции
Транскрипция – это процесс, состоящий из нескольких этапов: инициация, элонгация, терминация. Первичным продуктом транскрипции является молекула незрелой
мРНК – про-мРНК, которая образуется в результате полимеризации рибонуклеотидов по принципу комплементарности с антикодогенной цепью молекулы ДНК.
Инициация. Решающим моментом в инициации
процесса синтеза РНК является узнавание первого нуклеотида (+1) – это стартовая точка транскрипции которая определяется позицией смысловых последовательностей промотора, а РНК-полимераза ответственна только за синтез РНК.
Промотор и стартовая точка транскрипции распознаются
общими факторами транскрипции (около 20 различных белков образуют комплекс инициации транскрипции). Для
узнавания промотора транскрибируемого гена необходима
декомпактизация соответствующих участков ДНК, находящихся в виде нуклеосом. Гистоновые белки остаются присоединенными к одной цепи, локально освобождая вторую
цепь ДНК для осуществления транскрипции. Декомпактизация ДНК осуществляется с помощью специфических факторов транскрипции.
Инициация транскрипции характеризуется серией
последовательных событий (рис. 9.3).
1. Образование комплекса инициации транскрипции:
151
 присоединение к промотору специфических факторов транскрипции;
Рис. 9.3. Комплекс инициации транскрипции
152
 связывание фактора транскрипции ТFIID (ТВР) с
ТАТА-box (TF- Transcription Factor, гены II класса;
ТВР - ТАТА Binding Protein);
 связывание фактора транскрипции ТFIIА проксимально, который стабилизирует комплекс ТВРТАТА-box.
 Перед фактором ТВР располагается фактор ТFIIB,
который, обладая АТФ-азной активностью, способствует денатурации ДНК, в результате появляется
возможность считывания с ДНК-матрицы РНКполимеразой II.
 Для поддержания комплекса инициации в активном
состоянии, ТВР взаимодействует с другой молекулой
белка-регулятора, который приближает энхансер к
промотору (рис. 9.4).
Рис. 9.4. Взаимодействие между энхансером и инициирующим комплексом
2. Присоединение к белковому комплексу РНК-полимеразы
II, которая активируется фактором ТFIIF. ТFIIF выполняет
функцию АТФ-зависимой геликазы и производит локальную денатурацию молекулы ДНК:
 транскрипция начинается после присоединения факторов ТFIIЕ и ТFIIН, что приводит к скольжению
РНК-полимеразы по матрице;
153
 происходит считывание первого нуклеотида (+1) и
присоединение первого рибонуклеотида, как правило, аденозинтрифосфата.
3. Инициация заканчивается образованием первой фосфодиэфирной связи в молекуле РНК.
Область денатурированной ДНК образует открытый комплекс (рис.9.2).
Элонгация. Первым событием этого этапа является
изменение конфигурации транскрипционного белкового
комплекса. От РНК-полимеразы II отделяются факторы
ТFIIВ и ТFIIЕ, однако остаются факторы ТFIIF и ТFIIН.
Фактор ТFIIН является фактором элонгации, обладая активностью АТФ-зависимой геликазы, киназы и, возможно,
участвует в репарации ДНК. РНК-полимераза II считывает
антикодогенную цепь ДНК 3'→5' и полимеризует в направлении 5'→3' со скоростью 30 нуклеотидов в секунду.
В начале элонгации к РНК-полимеразе присоединяется TFIIS - фактор, который предупреждает преждевременное освобождение РНК-полимеразы. За РНКполимеразы, вдоль цепи РНК передвигается белковый фактор высвобождения.
У промотора остаются следующие белки: ТРIID,
ТFIIА и усиливающий белок-регулятор. Они необходимы
для присоединения других молекул РНК-полимеразы II, которые будут синтезировать новые цепи РНК до момента поступления регулирующих сигналов, блокирующих транскрипцию.
Терминация транскрипции. При достижении терминаторного сайта РНК-полимераза транскрибирует палиндромную последовательность. Молекула РНК моментально
образует петлю, которая замедляет перемещение РНКполимеразы (рис. 8.2). В результате факторы освобождения
154
достигают РНК-полимеразу, что приводит к диссоциации
комплекса ДНК, РНК, РНК-полимераза.
Процессинг РНК
Первичный продукт транскрипции не может сразу
покинуть ядро и перейти в цитоплазму. Во-первых, промРНК содержит некодирующие последовательности (интроны), во вторых, может быть легко расщеплена РНКазами. Для предупреждения деградации происходит обработка концов молекулы, а интроны – удаляются. Совокупность всех реакций изменения про-мРНК носит название
созревание мРНК или процессинг. Эти реакции происходят
в ядре и катализируются специфическими ферментами.
Этапами процессинга являются: модификация 5' конца
(кэпирование), модификация 3' конца (полиаденилирование), удаление интронов (сплайсинг) (рис. 9.5).
Рис. 9.5. Этапы процессинга генов II-го класса
Модификация концов молекулы про-мРНК
Обработка 5'-конца. 5'-конец молекулы РНК изменяется еще в процессе транскрипции. После синтеза первых
30 нуклеотидов РНК гуанилаттрансфераза присоединяет
метилированный Гуанин (GTP) к первому нуклеотиду (как
правило Аденину) посредством неспецифической связи 5'5'.
Структура 7меG5ppp5N носит название "CAP". Также
155
могут быть метилированы и следующие две рибозы в положении 2' (рис. 9.6).
Функции кэпа:
 обеспечивает стабильность молекул РНК благодаря неспецифической связи 5'-5';
 является сайтом распознавания для рибосом при инициации трансляции.
Рис. 9.6. Структура кэпа мРНК
Модификация 3'-конца. 3'-конец про-мРНК содержит палиндромную последовательность в виде шпильки. На
расстоянии 11-30 нуклеотидов от сайта AAUAAA молекула
расщепляется при помощи эндонуклеазы. Другой фермент –
poly(А)-полимераза присоединяет от 100 до 200 остатков
адениловой кислоты (т.н. poly(А)-"хвост"). мРНК, кодирующая гистоны, не подвергается полиаденилированию.
156
Функция последовательности poly(А):
- обеспечивает стабильность 3'-конца мРНК;
- контролирует транспорт молекул мРНК из ядра в
цитоплазму.
Сплайсинг
Удаление интронов из первичного транскрипта и
сшивание экзонов происходит в ядре с участием ферментативного комплекса, названного сплайсосомой. Компоненты
этого комплекса представлены малыми молекулами рибонуклеопротеидов - мяРНП (snRNP), которые были произвольно обозначены U1-U6. Интроны узнаются по последовательности GU (донорный сайт) на 5'-конце и AG (акцепторный сайт) на 3'-конце.
Рис. 9.7. Механизм сплайсинга мРНК
157
Удаление интронов протекает в несколько этапов
(рис. 9.7):
 к сайту GU интрона присоединяется рибонуклеопротеид
U1;
 рибонуклеопротеид U2 присоединяется к одному из
Аденинов внутри интрона;
 рибонуклеопротеиды U4, U5, U6 ассоциируются с U1 и
U2, образуя петлю. Петля формируется посредством соединения 5'-конца интрона с Аденином неспецифической связью 5'-2';
 освобождение рибонуклеопротеида U4 из комплекса
приводит к разрезанию 3'-конца интрона. Интрон удаляется в форме лассоподобной структуры вместе с рибонуклеопротеидами U5, U2 и U6;
 образование фосфодиэфирных связей 3' - 5' между экзонами.
В результате сплайсинга образуется зрелая мРНК,
которая в дальнейшем переносится в цитоплазму и служит
матрицей для синтеза белка.
У эукариот существует несколько типов сплайсинга:
 Конститутивный сплайсинг, при котором происходит
удаление всех интронов, а сшивание экзонов происходит
в той же последовательности, в которой они расположены.
 Альтернативный сплайсинг – происходит выборочное
соединение экзонов и/или дифференцированное удаление интронов, в результате из одной про-мРНК образуются разные варианты мРНК и соответственно разные
белки. В различных тканях и/или в различные периоды
развития с одного и того же гена могут синтезироваться
различные белки (рис. 9.8).
158


Сплайсинг путем смешивания экзонов (exon shuffling)
– молекулы мРНК могут образоваться при изменении
последовательности экзонов. Встречается очень редко.
Транс-сплайсинг – молекулы мРНК могут формироваться в результате комбинации экзонов разных генов.
Встречается у трипаносом, у некоторых нематод и трематод.
Рис. 9.8. Альтернативный сплайсинг РНК для тропомиозина
Эдитинг РНК
В результате процессинга в молекуле РНК могут
быть добавлены, заменены или удалены отдельные нуклеотиды. Это событие происходит в ядре с участием специфических ферментов. В результате информация, содержащаяся
159
в молекуле мРНК, не совпадает полностью с той, которая
содержится в молекуле ДНК.
Процесс модификации кодирующей последовательности мРНК носит название эдитинг РНК.
Особенности транскрипции генов I и III классов
Гены I класса кодируют синтез рРНК. Они
формируют тандемно повторяющиеся транскрипционные единицы, с локализацией в разных хромосомах (рис.8.8). Эти гены образуют ядрышковые организаторы.
РНК-полимераза I синтезирует предшественника рРНК с коэффициентом осаждения 45S.
В результате самосплайсинга образуется 3 фракции
рРНК: 5,8S, 18S, 28S.
Гены III класса кодируют синтез тРНК и
рРНК 5S. Также, как и гены I класса, они организованы в большие транскрипционные единицы. В результате процессинга первичного транскрипта образуются молекулы тРНК и рРНК 5S.
Регуляция транскрипции
у эукариот
Контроль на уровне транскрипции определяет возможность гена быть или не быть транскрибированным. Для
понимания механизмов контроля транскрипции генов эукариот необходимо знание некоторых особенностей генома
эукариот:
 ДНК эукариотической клетки имеет надмолекулярную
структуру в результате взаимодействия с различными
типами белков. В этом состоянии транскрипция невозможна, поскольку неспецифически блокирована гистонами. Некоторые последовательности ДНК метилируются, что приводит к инактивации молекулы.
160
 У эукариот большая часть генома не транскрибируется.
Большинство последовательностей ДНК – это частоповторяющиеся, некодирующие последовательности
(спейсеры, сателлитная ДНК).
 В многоклеточном организме эукариот наряду с ростом
и делением, клетки претерпевают морфологические и
физиологические модификации – дифференциацию, для
чего необходима дифференциальная экспрессия генов.
 Общая программа онтогенетического развития организма обеспечивает осуществление всех этапов онтогенеза
до старения и смерти. Каждый этап имеет свои особенности и длительность, а продолжительность жизни каждого индивида ограничена. Таким образом, экспрессия
генов варьирует и в зависимости от периода развития.
 Транскрипция генетической информации осуществляется в ядре. До переноса в цитоплазму к рибосомам первичный транскрипт подвергается определенным модификациям.
 У эукариот мРНК несет информацию для синтеза одного полипептида, поэтому необходим механизм регуляции экспрессии генов, контролирующих одну метаболическую цепь.
Уровни регуляции транскрипции
Предтранскрипционный контроль состоит в деконденсации хроматина, модификации гистонов, что делает
доступной молекулу ДНК для факторов транскрипции и денатурации. Происходит деметилирование и изменения конфигурации в молекуле ДНК, обеспечивающие ее взаимодействие с регулирующими белками.
Контроль инициации транскрипции. Для инициации транскрипции необходима активация промотора определенного гена. Элементы промотора имеют модульное
строение и состоят из серии определенных последовательностей нуклеотидов. Некоторые элементы промотора
(ТАТА-box) являются абсолютно необходимыми для ини161
циации транскрипции. Другие же элементы стимулируют
или тормозят транскрипцию генов. К ним относятся участки
ДНК, к которым присоединяются специфические регуляторные белки (рис. 9.9). В случае активации транскрипции
элемент промотора называется элементом позитивной регуляции, а регуляторный белок является белком позитивной
регуляции. Если транскрипция блокируется, элемент промотора называется элементом негативной регуляции. Регулирующий элемент промотора специализирован для каждого контролируемого им гена, так как связывается с определенной сигнальной молекулой. Каждый ген может иметь
один или несколько промоторных элементов в связи с тем,
что в различных условиях могут существовать один или
несколько белков-регуляторов, которые контролируют экспрессию этого гена (рис. 8.3).
Рис. 9.9. Регуляторные и модуляторные элементы, участвующие
в контроле транскрипции
Модель, которая показывает воздействие стимулирующих транскрипцию элементов (энхансеры) на расстоянии, следующая: специфический регуляторный белок связывается с энхансером; ДНК образует петлю таким образом,
что регуляторный белок связанный с энхансером может
взаимодействовать с другими регуляторными белками или
162
факторами, связанными с элементами промотора (рис. 9.4,
рис. 9.9).
Поэтому эффект воздействия одного регулирующего
элемента на транскрипцию зависит от комбинации различных связанных белков. Таким образом, различные комбинации белков-регуляторов контролируют определенным образом транскрипцию генов в различных типах клеток. Такой
тип регуляции носит название комбинативной генной регуляции.
Гены, которые контролируют один и тот же процесс
и/или метаболическую цепь, как правило, содержат похожие регулирующие последовательности, которые узнаются
одними и теми же белками–регуляторами. К примеру, гены,
участвующие в эмбриональном развитии содержат общую
последовательность, названную гомеобоксом. Эти гены локализуются на одной и той же хромосоме в порядке их
включения, образуя семейства генов. Другим примером
дифференцированной экспрессии генов в пространстве и
времени является синтез гемоглобинов у человека (рис.
9.10).
Рис. 9.10. Строение семейства генов для α-глобинов (на 16-й хромосоме)
и β-глобинов (на 11-й хромосоме)
Эмбриональный гемоглобин состоит из двух полипептидов ζ и двух ε и синтезируется вначале в желточном
163
мешке. Фетальный гемоглобин начинает синтезироваться в
печени и в селезенке из двух полипептидов α и двух γ. У
новорожденных и взрослых синтез гемоглобина переносится в красный костный мозг, и гемоглобин состоит из двух
цепей α и двух β, с небольшим процентом полипептидов δ
типа β.
Контроль синтеза РНК. После образования комплекса инициации транскрипции РНК-полимераза II синтезирует молекулы РНК до точки терминации. Скорость и
эффективность транскрипции определяется конфигурацией
промотора и его взаимодействием с белками-регуляторами.
Окончание процесса отмечается палиндромной последовательностью и образованием петли в молекуле РНК.
Посттранскрипционный контроль. Для предупреждения деградации РНК и транспорта ее в цитоплазму происходит кэпирование и полиаденилирование концов молекулы. Тип сплайсинга определяет, какой белок будет синтезироваться. Таким образом, с одного гена могут быть синтезированы различные белки. В результате один ген может
контролировать различные периоды онтогенеза или клеточной дифференциации.
Контроль транспорта мРНК в цитоплазму. Матричная РНК - продукт процессинга, связывается со специальными белками, взаимодействует с рецепторами порового
комплекса ядра и переносится из ядра в цитоплазму.
Транскрипция у прокариот
В 8-й главе представлена структура и молекулярная
организация генов прокариот. Единицей транскрипции является оперон, который состоит из регулирующих последовательностей (промотор / оператор, терминатор) и кодирующих последовательностей (структурные гены), в которых
отсутствуют интроны. У прокариот существует только одна
164
РНК-полимераза, обладающая теми же свойствами, что и
РНК-полимеразы у эукариот.
РНК-полимераза прокариот представляет собой фермент, состоящий из нескольких функциональных субъединиц. Таким образом, она узнает промотор, ответственна за
денатурацию и ренатурацию ДНК, катализирует полимеризацию рибонуклеотидов. Молекулы мРНК являются полицистронными и сразу же используются в качестве матрицы
для синтеза белков. В связи с тем, что эти молекулы не кэпируются, они быстро распадаются. Транскрипты генов
тРНК и мРНК подвергаются процессингу, в результате чего
образуются зрелые молекулы тРНК и мРНК (рис.8.11).
Регуляция транскрипции у прокариот
Особенности жизненного цикла прокариот, а так же
простая организация генетического аппарата способствует
тому, что реакция активации / инактивации синтеза белка
протекает очень быстро. Различают два типа генетического
контроля: негативный контроль и позитивный контроль.
Негативный контроль представляет собой механизм инактивации генов белком-репрессором. Репрессор
контролируется регуляторным геном, расположенным вне
оперона. Он связывается с промотором и препятствует перемещению РНК-полимеразы. Репрессор может быть инактивирован индуктором (фактором небелковой природы,
который может быть субстратом).
Позитивный контроль представляет собой механизм регуляции генов с помощью белка-активатора. Как
правило, активатор является неактивным и не имеет сродства к промотору. Индуктор способствует связыванию белка-активатора с промотором. В результате РНК-полимераза
узнает область промотора и осуществляет транскрипцию.
165
Контроль знаний:
1. Дайте определение: экспрессия гена, транскрипция,
промотор, экзон, интрон, фактор транскрипции, ТАТАbox, РНК-полимераза II, первичный транскрипт, промРНК, мРНК, сплайсинг, сплайсосома, энхансер, сайленсер, позитивный контроль, негативный контроль
транскрипции.
2. Каковы этапы транскрипции структурных генов?
3. Как образуются комплексы инициации транскрипции?
4. В чем особенности активности РНК-полимеразы II?
5. В чем состоит процессинг про-мРНК?
6. Каковы уровни регуляции транскрипции у эукариот?
166