RU 2 519 125 C2

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
(19)
RU
(11)
(51) МПК
G01N 33/53
(13)
2 519 125
C2
(2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
(12) ОПИСАНИЕ
(21)(22) Заявка:
ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
2012131072/15, 19.07.2012
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
19.07.2012
(43) Дата публикации заявки: 27.01.2014 Бюл. № 3
(45) Опубликовано: 10.06.2014 Бюл. № 16
2 5 1 9 1 2 5
R U
Адрес для переписки:
620028, г.Екатеринбург, ул. Репина, 1, ФГБУ
"НИИ охраны материнства и младенчества"
Минздравсоцразвития России, Патентный отдел
(54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ЛОКАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА ЭНДОМЕТРИЯ
(57) Реферат:
Изобретение относится к медицине, а именно
соотношении Th1/Th2 более 0,92 у.е. судят о
к гинекологии, и может быть использовано для
нарушениях на уровне локального иммунитета,
оценки локального иммунитета эндометрия. Для
а при Th1/Th2 менее 0,92 у.е. делают заключение
этого на исследование проводят забор
об
отсутствии
признаков
нарушений.
эндометриальной ткани у женщин с патологией
Использование данного способа позволяет
эндометрия на 7-9-й день менструального цикла
выявить нарушения локального иммунитета
путем
пайпель-биопсии.
Определяют
в
эндометрия и своевременно решить вопрос о
исследуемой ткани относительное содержание
необходимости проведения терапевтической
IFN-γ и IL-4-продуцирующих лимфоцитов с
коррекции выявленных нарушений у женщин с
вычислением соотношения Th1/Th2. При
патологией эндометрия. 3 пр.
(56) (продолжение):
воспаление, 2006, N4, стр.13-16. КУЗНЕЦОВ П.А. Оценка факторов врожденного иммунитета
слизистой цервикального канала в прогнозировании преждевременных родов // Автореферат
кмн, Москва, 2009, стр.22-23, [он-лайн], [найдено 24.01.2014]. Найдено из Интернет:
Стр.: 1
C 2
C 2
2405145 С1, 27.11.2010. ЧИСТЯКОВА Г.Н. и
др. Оценка цитокинового профиля при
физиологической и патологической
протекающей беременности // Цитокины и
воспаление, 2007, N1, стр.3-8 . ГИЗИНГЕР
О.А. и др. Система провоспалительных
цитокинов в цервикальном секрете у женщин
с урогенетальным хламидиозом // Цитокины
и (см. прод.)
2 5 1 9 1 2 5
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: RU 2008132411 А, 20.02.2010. RU
(73) Патентообладатель(и):
Федеральное государственное бюджетное
учреждение "Уральский научноисследовательский институт охраны
материнства и младенчества" Министерства
здравоохранения и социального развития
Российской Федерации (ФГБУ "НИИ ОММ"
Минздравсоцразвития России) (RU)
R U
Приоритет(ы):
(22) Дата подачи заявки: 19.07.2012
(72) Автор(ы):
Чистякова Гузаль Нуховна (RU),
Тарасова Марина Николаевна (RU),
Ремизова Ирина Ивановна (RU),
Газиева Ирина Александровна (RU)
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
(51) Int. Cl.
G01N 33/53
(13)
2 519 125
C2
(2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY
(12) ABSTRACT
(21)(22) Application:
OF INVENTION
2012131072/15, 19.07.2012
(24) Effective date for property rights:
19.07.2012
(43) Application published: 27.01.2014 Bull. № 3
(45) Date of publication: 10.06.2014 Bull. № 16
C 2
2 5 1 9 1 2 5
R U
Стр.: 2
C 2
(54) METHOD FOR ENDOMETRIAL LOCAL IMMUNITY ASSESSMENT
(57) Abstract:
FIELD: medicine.
Th1/Th2 calculated. If the relation Th1/Th2 is more
SUBSTANCE: invention refers to medicine,
than 0.92 standard units, the local immune disorders
namely gynaecology, and is applicable for endometrial
are stated, while the relation Th1/Th2 less than 0.92
local immunity assessment. That is ensured by a test
standard units enables stating no signs of the disorders.
involving endometrial tissue sampling from women
EFFECT: using the given method enables detecting
th
the
endometrial
local immunity and solving the problem
suffering from an endometrial pathology on the 7-9
of the necessity of a therapeutic correction of the detectday of menstruation by endometrial pipelle biopsy. The
ed disorders in good time in the women suffering from
sampled tissue is tested for the relative content of IFNthe endometrial pathology.
γ and IL-4-producing lymphocytes with the relation
3 ex
2 5 1 9 1 2 5
Mail address:
620028, g.Ekaterinburg, ul. Repina, 1, FGBU "NII
okhrany materinstva i mladenchestva"
Minzdravsotsrazvitija Rossii, Patentnyj otdel
(73) Proprietor(s):
Federal'noe gosudarstvennoe bjudzhetnoe
uchrezhdenie "Ural'skij nauchno-issledovatel'skij
institut okhrany materinstva i mladenchestva"
Ministerstva zdravookhranenija i sotsial'nogo
razvitija Rossijskoj Federatsii (FGBU "NII
OMM" Minzdravsotsrazvitija Rossii) (RU)
R U
Priority:
(22) Date of filing: 19.07.2012
(72) Inventor(s):
Chistjakova Guzal' Nukhovna (RU),
Tarasova Marina Nikolaevna (RU),
Remizova Irina Ivanovna (RU),
Gazieva Irina Aleksandrovna (RU)
RU
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2 519 125 C2
Область применения
Предлагаемое изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторной
диагностике.
Исследования последних лет показали, что хронические воспалительные заболевания
органов малого таза не сопровождаются нарушениями параметров клеточного и
гуморального иммунитета, определяемыми в периферической крови. В связи с этим
для определения состояния эндометрия возникает необходимость оценки локального
иммунитета. Бактериально-вирусная колонизация эндометрия является следствием
неспособности иммунной системы полностью элиминировать инфекционный агент, и
в то же время возникает ограничение его распространения за счет эффекторных свойств
Т-лимфоцитов, NK-клеток и макрофагов. Под воздействием специфических антигенов
в ткани эндометрия происходит изменение локального иммунитета, в частности,
дифференцировка Т-хелперов на субпопуляции Th-1 и Th-2, специализированные на
синтезе определенных цитокинов: IFN-γ (Th-1) и IL-4 (Th-2). Активация Th-1 может вести
к развитию избыточно выраженных воспалительных реакций в эндометрии даже в
условиях низкой концентрации инфекционного агента, что позволяет использовать
определение функциональных характеристик Т-хелперов для оценки выраженности
иммунопатологических процессов в эндометрии (1, 2, 3, 4).
Уровень техники
Аналогами данного изобретения являются внедренные в клиническую практику
акушерства и гинекологии современные методы диагностики состояния эндометрия:
гистологический, учитывающий совокупность общих морфологических признаков
хронического воспаления, иммуногистоцитохимический с определением спектра
параметров (4, 5, 6).
Прототипом предложенного изобретения является описанный в отечественной
литературе способ оценки активности локального воспаления, заключающийся в
определении методом ИФА уровня IFN-y в биоматериале, взятом путем мазка с
поверхности зоны трансформации шейки матки. Несмотря на очевидные достоинства
метода (отсутствие травматичности при заборе материала, наличие прогностических
пороговых уровней данного показателя), недостатком метода является то, что оценка
активности воспаления проводится с использованием одного параметра (7).
Сущность изобретения
Цель изобретения заключается в разработке способа оценки локального иммунитета
у женщин с патологией эндометрия, основанного на определении количества
лимфоцитов, экспрессирующих цитокины IFN-γ и IL-4.
Предлагаемый способ позволяет установить вовлеченность иммунной системы в
патологический процесс в исследуемой ткани (эндометрии).
Способ осуществляют следующим образом: у женщин с патологией эндометрия на
7-9-й день менструального цикла путем пайпель-биопсии проводят забор ткани
эндометрия. 1 мл полученного пайпель-биоптата помещают в пробирку со 100 Ед
гепарина натрия в 1 мл фосфатно-солевого буфера (ФСБ). Пайпель-биоптат в ФСБ
механически измельчают и доводят до гомогенизированного состояния, пропуская с
помощью шприца через иглы нисходящего диаметра. Из полученного гомогената
эндометрия выделяют фракцию мононуклеаров на градиенте плотности: 2 мл гомогената
аккуратно наслаивают на 2 мл фиколл-верографина и центрифугируют 40 минут при
1500 об/мин. После центрифугирования аккуратно с помощью дозатора собирают
опалесцирующее кольцо мононуклеаров, переносят в сухую чистую пробирку и
промывают ФСБ дважды путем центрифугирования 15 мин при 1500 об/мин.
Стр.: 3
RU
5
10
15
20
25
30
35
40
45
2 519 125 C2
- Определение содержания лимфоцитов, экспрессирующих цитокины IFN-γ и IL-4 в
мононуклеарах пайпель-биоптата эндометрия проводят согласно рекомендациям
фирмы-производителя реагентов (Becton Dickinson, США). Для этого в две пробирки
наливают по 200 мкл полной культуральной среды RPMI 1640 и добавляют по 200 мкл
мононуклеаров. В обе пробирки добавляют по 0,5 мкл ингибитора белкового транспорта
GolgiPlug. В одну пробирку для оценки стимулированной продукции цитокинов
добавляют 1 мкл Leukocyte Activation Coctail, содержащий активатор протеинкиназы С
форбол-12-миристат-13-ацетат (ФМА) в комбинации с ионофором кальция иономицином.
Инкубируют 4 часа при 37°С и 5% СO2. Затем добавляют в пробирки, в которых по
100 мкл стимулированных и нестимулированных мононуклеаров 4 мкл CD3PerCP.
Инкубируют 15-30 мин при комнатной температуре в темном месте. По окончании
инкубации лизируют эритроциты, добавив 1 мл готового лизирующего раствора (Lisyng).
Инкубируют при комнатной температуре в темном месте 10-15 мин. Центрифугируют
5 мин при 1500 об/мин и удаляют супернатант. Отмывают 1 раз добавлением 1 мл
буфера CellWASH с последующим центрифугированием. Добавляют 250 мкл раствора
Cytofix/Cytoperm. Инкубируют 20 мин при комнатной температуре в темноте.
Центрифугируют 5 мин при 1500 об/мин и удаляют супернатант. Добавляют 1 мл буфера
Perm/Wash и инкубируют 10 мин при комнатной температуре в темноте. Центрифугируют
5 мин при 1500 об/мин и удаляют супернатант. Добавляют 4 мкл меченых
моноклональных антител IFN-γFITC и IL-4PE. Инкубируют 30 мин при комнатной
температуре в темноте. Отмывают клетки один раз в 1 мл буфера Perm/Wash.
Ресуспендируют клетки в CellFIX буфере для анализа на проточном цитофлуориметре,
используя программу CELLQuest.
Проведено обследование 9 здоровых женщин благоприятного репродуктивного
возраста (18-35 лет) и 30 женщин с патологией эндометрия. Установлено, что
соотношение IFN-γ и IL-4-продуцирующих лимфоцитов Thl/Th2 более 0,92 у.е.
свидетельствует о нарушениях на уровне локального иммунитета у женщин с патологией
эндометрия. При Th1/Th2 менее 0,92 у.е. делают заключение об отсутствии признаков
нарушений.
Чувствительность метода составляет 83,3%, специфичность - 83,8%, эффективность
- 83,6%.
Пример 1. Пациентка С., 32 года, поступила в гинекологическое отделение ФГБУ
«НИИ ОММ» Минздравсоцразвития России с диагнозом хронический эндометрит.
Акушерский анамнез отягощен тремя регрессирующими беременностями.
Менструальная функция не нарушена (через 28-30 дней по 5-6 дней). При исследовании
пайпель-биоптата эндометрия Th1/Th2 составило 2,72 у.е., что выше установленного
критерия в 0,92 у.е. и свидетельствует о нарушениях локального иммунитета эндометрия.
После проведения терапии Th1/Th2 составило 0,64 у.е., что характеризует отсутствие
признаков нарушений. При гистологическом исследовании признаков воспаления
эндометриальной ткани не выявлено.
Пример 2. Пациентка Г., 27 лет, поступила в гинекологическое отделение ФГБУ
«НИИ ОММ» Минздравсоцразвития России с диагнозом хронический эндометрит.
Акушерский анамнез отягощен двумя регрессирующими беременностями.
Менструальная функция не нарушена (через 24-25 дней по 5 дней). При
бактериологическом исследовании мазка из шейки матки выделена Е. coli в
диагностическом титре. При исследовании пайпель-биоптата эндометрия Th1/Th2
составило 1,66 у.е., что выше установленного критерия в 0,92 у.е. и свидетельствует о
нарушениях локального иммунитета эндометрия. После проведения терапии Th1/Th2
Стр.: 4
RU
5
10
15
20
25
2 519 125 C2
составило 0,84 у.е., что характеризует отсутствие признаков нарушений. При
гистологическом исследовании признаков воспаления эндометриальной ткани не
выявлено.
Пример 3. Пациентка Т., 35 лет, гинекологически здорова, что подтверждено данными
гистологического исследования. При исследовании пайпель-биоптата эндометрия
соотношение Th1/Th2 составило 0,87 у.е., что ниже установленного критерия в 0,92 у.е.
и свидетельствует об отсутствии нарушений локального иммунитета эндометрия.
Таким образом, приведенные выше примеры наглядно демонстрируют, что
предлагаемый способ дает возможность выявить лабораторные признаки, характерные
для нарушений локального иммунитета эндометрия, что позволит своевременно решить
вопрос о необходимости проведения терапевтической коррекции выявленной патологии.
Источники информации
1. Плужникова Т.А. Диагностика и лечение хронического эндометрита у женщин с
невынашиванием беременности в анамнезе / Т.А. Плужникова, Е.К. Комаров // Журнал
акушерства и женских болезней. - 2012. - №2. - С.52-55.
2. Подзолкова Н.М. Клинические и патогенетические аспекты неразвивающейся
беременности / Н.М.Подзолкова, В.Г.Истратова, Т.В.Золотухина // Рос. вестник акуш.гинекол. - 2003. - №2. - С.40-43.
3. Скворцова М.Ю. Профилактика репродуктивных потерь и осложнений гестации
у пациенток с невынашиванием беременности / М.Ю.Скворцова, Н.М.Подзолкова //
Гинекология. - 2010. - №1. - С.46-49.
4. Михнина Е.А. Способ диагностики хронического эндометрита и характера
воспаления / Е.А.Михнина, В.Н.Элиниди и др. // Патент на изобретение №2236013.
5. Элиниди В.Н. Современные возможности диагностики хронического эндометрита
/ В.Н.Элиниди и др. // Журнал акушерства и женских болезней. - 2003. - №3. - С.64-68.
6. Сухих Г.Т. Хронический эндометрит / Г.Т.Сухих, А.В.Шуршалина // М., 2010.
7. Грибова С.Н. Способ оценки активности локального воспаления при фоновых
заболеваниях шейки матки. / Грибова С.Н., Захарова Н.Б., Хрипунова Г.И. // Патент
на изобретение №2405145.
30
35
Формула изобретения
Способ оценки локального иммунитета эндометрия, отличающийся тем, что у женщин
с патологией эндометрия на 7-9-й день менструального цикла в ткани эндометрия,
взятой путем пайпель-биопсии, определяют относительное содержание IFN-γ и IL-4продуцирующих лимфоцитов и по соотношению Th1/Th2 более 0,92 у.е. судят о
нарушениях на уровне локального иммунитета, а при Th1/Th2 менее 0,92 у.е. делают
заключение об отсутствии признаков нарушений.
40
45
Стр.: 5