Обзор текущей ситуации на российском рынке 16.03.2015;pdf

На правах рукописи
Акушская Алина Сергеевна
ИССЛЕДОВАНИЕ ПО СТАНДАРТИЗАЦИИ СЫРЬЯ И ПРЕПАРАТОВ
ЖЕНЬШЕНЯ (PANAX GINSENG C.A. MEYER)
14.04.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Самара – 2014
Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении
высшего профессионального
образования
«Самарский
государственный
медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Научный руководитель:
доктор фармацевтических наук, профессор Куркин Владимир Александрович
Официальные оппоненты:
Белоусов Михаил Валерьевич, доктор фармацевтический наук, профессор,
государственное
бюджетное
образовательное
учреждение
высшего
профессионального образования «Сибирский государственный медицинский
университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра
фармации факультета повышения квалификации и профессиональной
переподготовки специалистов, заведующий кафедрой
Клен Елена Эдмундовна, доктор фармацевтический наук, доцент,
государственное
бюджетное
образовательное
учреждение
высшего
профессионального образования «Башкирский государственный медицинский
университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра
фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии,
профессор кафедры
Ведущая организация:
государственное
бюджетное
образовательное
учреждение
высшего
профессионального образования «Казанский государственный медицинский
университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Защита состоится «___» ____________ 2014 г. в 10:00 часов на заседании
диссертационного совета Д 208.085.06 при государственном бюджетном
образовательном
учреждении
высшего
профессионального
образования
«Самарский государственный медицинский университет» Министерства
здравоохранения Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара,
пр. К.
Маркса, 165Б.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте государственного
бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального
образования
«Самарский
государственный
медицинский
университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации (443001. г. Самара, ул.
Арцыбушевская, 171; (http://www.samsmu.ru/science/referats/2014/akushskaya)
Автореферат разослан «___» ____________ 2014 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат фармацевтических наук,
доцент
Петрухина Ирина Константиновна
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В соответствии со стратегией развития
фармацевтической промышленности Российской Федерации на период до
2020 года одним из важнейших направлений развития современной
отечественной
фармацевтической
отрасли
является
расширение
ассортимента эффективных и безопасных лекарственных средств (ЛС) и
усиление мер по контролю качества производимых лекарственных
препаратов (ЛП) (Самылина И.А. др., 2003; 2010). В рамках реализации
данной стратегии также актуальными являются исследования по разработке
препаратов на основе лекарственного растительного сырья (ЛРС) и
совершенствование методов контроля качества ЛРС, субстанций и
фитопрепаратов (Самылина И.А. и др., 1995; Киселева Т.Л. и др., 2008;
Куркин В.А., 2002; 2007).
Особой социальной значимостью в настоящее время обладает сектор
фармацевтического
рынка
РФ,
представленный
ЛП
группы
«Общетонизирующие средства и адаптогены» (в соответствии с анатомотерапевтическо-химической
классификацией
ЛС).
Адаптогенные
фармакологические свойства ярко выражены у целого ряда растений,
например, у женьшеня настоящего (Panax ginseng C.A. Meyer) (Муравьева
Д.А. и др., 2002). Данный эффект растения обусловливает ведущая группа
биологически активных соединений (БАС) – сапонины, являющиеся
тритерпеноидами стероидного происхождения (Куркин В.А., 2007).
Несмотря на многолетний опыт изучения женьшеня настоящего и его
широкое применение, существуют нерешенные проблемы в области
стандартизации сырья и препаратов. Так, Государственная Фармакопея (ГФ)
СССР XI издания (статья 66, стр. 348) в качестве методики для определения
подлинности корней женьшеня предлагает метод тонкослойной
хроматографии (ТСХ), однако условия хроматографирования не позволяют
достичь четкого разделения веществ. В разделе «Числовые показатели»
нормируются величины экстрактивных веществ, влажности и золы, которые
не могут трактоваться как объективные, достоверные и надежные показатели
качества. Раздел «Количественное определение» в данной нормативной
документации (НД) отсутствует.
В соответствии с Европейской Фармакопеей стандартизацию корней
женьшеня проводят путем определения суммы гинзенозидов Rb1 и Rg1
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
4
Фармакопей США предложено определять содержание гинзенозидов Rb 1 и
Rg1 отдельно друг от друга, также используя метод ВЭЖХ. Однако в обоих
случаях не принимается во внимание наличие сопутствующих биологически
активных гинзенозидов, компонентный состав которых может варьировать
до 11 (Куркин В.А., 2007). Указанные методики предусматривают наличие
нескольких стандартных образцов, что значительно увеличивает стоимость
анализов. Количественное определение ведущей группы БАС отсутствует и в
Японской фармакопее: вместо этого в НД включено определение сухого
остатка (не менее 14%).
Кроме того, особого внимания заслуживает вопрос относительно
сырьевой базы женьшеня настоящего. Природные ресурсы данного растения
истощены, оно занесено в Международную Красную Книгу, и его сбор
является правонарушением (Международный союз охраны природы, 1998).
Экспортерами корней женьшеня являются, в основном, Корея и Китай. На
территории РФ женьшень настоящий культивируется в Приморском крае, на
Кавказе, в Калужской, Астраханской, Брянской областях, а также на
территории Самарской области (крестьянско-фермерское хозяйство (КФХ)
питомник «Женьшень»). Существуют также научные данные о
противогипоксическом,
гипогликемическом,
термопротекторном,
стресспротекторном и адаптогенном действии извлечений из травы
женьшеня. Поэтому с точки зрения ресурсосберегающих технологий
актуальным и перспективным является также изучение листьев и стеблей
женьшеня, сравнение их химического состава с активными компонентами
корней.
В этой связи актуально изучение химического состава, анатомоморфологического строения корней и надземной части женьшеня, а также
фармакологической активности лекарственных препаратов женьшеня,
культивируемого в Самарской области.
На фармацевтическом рынке РФ спектр ЛП женьшеня обширен, однако
доминирующими являются ЛС зарубежного производства. Отечественные
препараты представлены лишь настойкой женьшеня (Машковский М.Д.,
2002).
Таким
образом,
представляется
актуальным
углубленное
фармакогностическое исследование корней и надземной части женьшеня,
разработка отечественных импортозамещающих ЛП на основе данного
5
растения и обоснование объективных методов стандартизации сырья и
лекарственных препаратов женьшеня.
Цель и задачи исследования.
Цель работы: фармакогностическое исследование женьшеня настоящего
и разработка объективных методов стандартизации сырья и лекарственных
препаратов данного растения.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
1. Исследование анатомо-морфологических признаков корневищ с корнями
и надземной части женьшеня настоящего.
2. Обоснование новых подходов к стандартизации сырья и ЛП женьшеня
настоящего, учитывая принцип унификации методик в ряду ЛРС –
субстанция – лекарственный препарат.
3. Разработка методик качественного и количественного анализа корневищ
с корнями женьшеня.
4. Разработка методик качественного и количественного анализа надземной
части женьшеня.
5. Оптимизация технологии ЛП «Женьшеня настойка».
6. Обоснование состава и технологии ЛП «Женьшеня сироп» и «Женьшеня
таблетки».
7. Фармакологическое обоснование целесообразности создания ЛП на
основе корневищ с корнями женьшеня.
8. Разработка методик качественного и количественного анализа ЛП
«Женьшеня настойка», «Женьшеня сироп» и «Женьшеня таблетки».
9. Разработка проектов НД на корневища с корнями женьшеня, ЛП
«Женьшеня настойка» и «Женьшеня сироп».
Научная новизна. Впервые проведено анатомо-морфологическое,
фитохимическое и фармакологическое исследование корней женьшеня
настоящего, культивируемого в Самарской области (окр. г. Жигулевск, с.
Солнечная Поляна, КФХ питомник «Женьшень»).
Впервые в РФ с использованием цифровой микроскопии в
сравнительном плане изучено анатомо-морфологическое и гистологическое
строение отдельных частей растительного сырья – корневища, главного и
придаточного корней, которые в совокупности составляют ЛРС «Женьшеня
корневища с корнями».
Впервые изучены анатомические и морфологические особенности
потенциального ЛРС «Женьшеня трава», перспективного в качестве
6
источника БАС и в рамках комплексного использования растения. В
частности, исследовано строение черешка листа женьшеня, так как показано,
что петиолярная анатомия является узкоселективным методом диагностики
ЛРС (Сдобнина А.И., 2008).
Разработаны методические и методологические подходы к контрою
качества сырья и препаратов женьшеня настоящего, заключающиеся в
оценке суммы сапонинов в пересчете на один из доминирующих
компонентов – гинзенозид Rg1 с использованием методов ТСХ и
спектрофотометрии.
В результате фитохимического исследования из надземной части
женьшеня настоящего впервые выделен и идентифицирован флавоноид –
3-О-диксилозид 3,5,7,41-тетрагидроксифлавона (кемпферол-3-О-диксилозид).
Научно обоснована целесообразность более полного истощения ЛРС
при получении ЛП «Женьшеня настойка» (Патент РФ на изобретение №
2496509 от 27 октября 2013 г. «Способ получения средства, обладающего
тонизирующей активностью»; удостоверение на рационализаторское
предложение № 217 от 21 сентября 2012 г. «Способ получения настойки
женьшеня»), обладающего более высокой тонизирующей активностью по
сравнению с промышленным образцом.
Предложен состав и способ получения ЛП «Женьшеня сироп» (Патент
РФ на изобретение № 2514008 от 25 февраля 2014 г. «Сироп женьшеня»;
удостоверение на рационализаторское предложение № 218 от 21 сентября
2012 г. «Состав сиропа женьшеня настоящего»).
Предложен состав и способ получения ЛП «Женьшеня таблетки».
Предложены методики контроля качества разработанных ЛП,
основанные на определении действующих веществ (суммы сапонинов в
пересчете на гинзенозид Rg1), методами ТСХ и спектрофотометрии.
Практическая значимость. Разработан раздел «Микроскопия» в
проекте фармакопейной статьи (ФС) на корневища с корнями женьшеня для
включения в Государственную фармакопею Российской Федерации XII
издания, а также раздел «Микроскопия» на потенциальное перспективное
ЛРС – «Женьшеня трава».
Предложены методики качественного и количественного анализа
корневищ с корнями и надземной части женьшеня. Определены показатели
качества корней женьшеня, которые отражены в проекте ФС «Женьшеня
корневища с корнями», принятом на рассмотрение ФГБУ «Научный центр
7
экспертизы средств медицинского применения» ФС (вх. № 1021 от 28.01.13
г.).
Разработаны состав, способ получения, определены показатели качества
ЛП из корневищ с корнями женьшеня «Женьшеня сироп», «Женьшеня
таблетки». Оптимизирована технология ЛП «Женьшеня настойка».
Предложены методики качественного и количественного анализа
действующих веществ в лекарственных формах (ЛФ), отвечающие
принципам
унификации,
предъявляемым
к
современному
фармацевтическому анализу (Самылина И.А. и др., 1994; 2006).
Результаты диссертационных исследований используются в научной
работе и учебном процессе на кафедрах фармацевтической технологии,
фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии, управления и
экономики фармации, химии фармацевтического факультета ГБОУ ВПО
СамГМУ Минздрава России, ГБУЗ «Центр контроля качества лекарственных
средств Самарской области», ЗАО «Самаралектравы», КФХ питомник
«Женьшень» (акты о внедрении № 1-7).
Связь задач исследования с планами научных работ.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом
научно-исследовательских
работ
государственного
бюджетного
образовательного учреждения высшего профессионального образования
«Самарский государственный медицинский университет» Министерства
здравоохранения Российской Федерации по теме: «Комплексные
исследования по проблеме создания новых лекарственных препаратов
природного и синтетического происхождения» (№
Государственной
регистрации 01200900658), а также соответствует тематике Проблемной
комиссии по химико-фармацевтическим наукам университета.
Положения, выдвигаемые на защиту:
1. Результаты анатомо-морфологических и гистологических исследований
корневищ с корнями и надземной части женьшеня настоящего.
2. Результаты фитохимического исследования различных органов
женьшеня настоящего.
3. Результаты исследований по обоснованию состава и технологии ЛП
«Женьшеня сироп» и «Женьшеня таблетки».
4. Методики качественного и количественного анализа ЛРС «Женьшеня
корневища с корнями», ЛП «Женьшеня настойка», «Женьшеня сироп» и
8
«Женьшеня таблетки» с использованием методов ТСХ и
спектрофотометрии.
5. Способ получения средства, обладающего тонизирующей активностью
(Патент РФ на изобретение № 2496509 от 27 октября 2013 г).
6. Сироп женьшеня (Патент РФ на изобретение № 2514008 от 25 февраля
2014 г.)
Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на VI
Всероссийской научно-практической конференции «Научные проблемы
использования и охраны природных ресурсов России» (г. Самара, 2014);
XVII и XVIII Всероссийском конгрессе «Экология и здоровье человека» (г.
Самара, 2012; 2013; 2014); IV Всероссийском научно-практическом семинаре
молодых ученых с международным участием «Современные проблемы
медицинской химии. Направленный поиск новых лекарственных средств» (г.
Волгоград, 2012); Первой научно-практической конференции молодых
учёных и аспирантов «Молодые учёные и фармация XXI века»
(Всероссийский институт лекарственных и ароматических растений
(ВИЛАР), г. Москва, 2013); конференциях дипломированных специалистов
«Аспирантские чтения «Молодые ученые – медицине» (г. Самара, 2012;
2013;
2014).
Выполнение
фрагментов
диссертационной
работы
осуществлялось по линии программы «Участник Молодежного НаучноИнновационного Конкурса – 2010» («У.М.Н.И.К.»).
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 26
научных работах, из них 13 статей в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.
Личный вклад автора. Все экспериментальные результаты,
приведенные в диссертации, получены автором лично. Автором выполнены
исследования по изучению морфологических и анатомо-гистологических
особенностей строения лекарственного сырья женьшеня настоящего –
корневищ с корнями, а также надземной части растения, выявлены основные
диагностические признаки. Разработаны методики стандартизации корневищ
с корнями женьшеня, предложены способы контроля качества травы
женьшеня. Предложены состав и технология получения препаратов
«Женьшеня сироп» и «Женьшеня таблетки», усовершенствована технология
препарата «Женьшеня настойка». Приведены методики качественного и
количественного анализа суммы сапонинов в данных препаратах с
применением методов ТСХ и спектрофотометрии. Изучена стабильность
препаратов «Женьшеня сироп» и «Женьшеня таблетки», определены
9
основные показатели качества. Автором разработан проект ФС «Женьшеня
корневища с корнями». Проведены фармакологические исследования
нейротропной активности усовершенствованного препарата «Женьшеня
настойка» в сравнении с существующими аналогами.
Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 174
страницах машинописного текста, содержит 27 таблиц, 61 рисунок.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания
объектов и методов исследования (глава 2),
4-х глав, посвященных
результатам собственных экспериментальных исследований и их
обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы,
включающего 133 источников, из которых 30 – на иностранных языках.
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и
задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость
полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на
защиту.
Глава 1 содержит аналитический обзор литературы по современному
состоянию исследований женьшеня настоящего, в котором обобщены и
систематизированы сведения по изучению химического состава растения,
стандартизации сырья, фармакологической активности, применению в
медицинской практике.
В главе 2 представлена характеристика объектов и методов
исследования.
Приведены
методики
анатомо-морфологического,
гистологического,
химического
и
физико-химического
изучения
лекарственного растительного сырья, индивидуальных веществ и препаратов,
методики оценки фармакологической активности и технологии ЛП.
В главах 3-6 экспериментальной части приведены результаты
собственных исследований по изучению химического состава корней с
корневищами и надземной части женьшеня настоящего, совершенствованию
методик контроля качества ЛРС и ЛП на его основе, разработке новых
препаратов, их стандартизации и обоснованию целесообразности внедрения в
медицинскую практику в качестве тонизирующих ЛС.
В Приложения вынесены акты внедрения, проекты ФС на женьшеня
корневища с корнями, женьшеня настойку и женьшеня сироп, 2 патента РФ
на изобретение и 2 рационализаторских предложения.
10
Результаты, полученные при проведении исследований, статистически
обработаны и представлены в формулах, таблицах, на рисунках, которые
приведены в тексте диссертации.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Объекты и методы исследования
Объектами исследования служили образцы сырья – корневища, корни и
вегетативные органы надземной части женьшеня настоящего(Panax ginseng
C.A. Meyer), собранные в период 2009-2014 гг. на территории Самарской
области в КФХ питомнике «Женьшень». Временем сбора корней являлся
период их полного созревания (начиная с первой декады августа до начала
октября), траву заготавливали в период плодоношения (август).
Исследованию также подвергались
лекарственные препараты –
разработанные лабораторные образцы и полученные промышленным
способом, извлечения из ЛРС, индивидуальные вещества, выделенные из
корней и листьев, и государственный стандартный образец рутин.
Анатомо-гистологическое исследование проводили с использованием
цифровых микроскопов «Motic DM-111», «Motic DM-39» и «Motic DM1802А» с увеличениями × 8, × 16, × 20, × 40, × 100, × 400, × 1000.
Изучение химического состава корней и листьев, а также разработку
методик количественного определения суммы сапонинов проводили методом
адсорбционной жидкостной колоночной хроматографии с использованием
различных сорбентов: Силикагель марки L 40/100 мкм и L 100/250 мкм
(Чехия), Сефадекс LH-20 (Швеция), Полиамид марки «Wolem» (Германия).
Экстракцию осуществляли хлороформом, смесью хлороформ-этанол в
различных соотношениях, водным спиртом различной концентрации и водой
очищенной.
Для анализа извлечений из сырья, субстанций, выделенных веществ и
лекарственных препаратов методом тонкослойной хроматографии
использовали пластинки Silufol UV 254» (Чехия) и «Сорбфил ПТСХ-АФ-АУФ» (Россия). При этом готовили системы растворителей, содержащие
хлороформ, метанол и воду очищенную в различных соотношениях (70:30:4;
61:32:7; 13:7:2; 26:14:3), а также смеси этанола, н-бутанола, этилацетат,
уксусной кислоты и 25% аммиака в различных соотношениях.
Спектральные исследования проводили на спектрофотометре «Specord
40» (Analytik Jena) в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Растворами сравнения
11
служили вода очищенная и спирт этиловый различной концентрации (40%,
70% и 95%). 1Н-ЯМР-спектры регистрировали на приборе «Bruker AM 300
(300 мГц). Масс-спектры электронного удара регистрировали на приборе
«Kratos MS-30» при энергии ионизирующих электронов 70 эВ и
варьировании температуры ионного источника от 100 до 250 ºС.
Изготовление субстанций и лекарственных препаратов проводили в
соответствии с классическими правилами фармацевтической технологии.
Сравнительное изучение нейротропной активности разработанных и
существующих препаратов проводили с использованием модели
тиопенталового сна (гипногенная активность), методики выработки условной
реакции активного избегания (ноотропная активность) и теста «приподнятый
крестообразный лабиринт» (анксиолитическая активность).
2. Анатомо-морфологическое исследование женьшеня настоящего
В рамках диссертационного исследования проведено анатомоморфологическое и гистологическое исследование надземных и подземных
вегетативных органов женьшеня настоящего.
При сравнительном анатомическом изучении выявлено, что
лекарственное сырье состоит из корневища, главного и придаточных корней,
которое в совокупности составляет ЛРС «Женьшеня корневища с корнями».
Определено, что диагностическое значение могут иметь следующие
признаки: морфология цельного сырья, особенности анатомического
строения подземных органов и характер сложения их тканей,
гистологические составляющие корневищ и корней: вместилища выделений,
место их локализации, толщина пробкового слоя, а также форма и утолщение
пробковых клеток, гистологический рисунок коры и ксилемы (рис. 1).
Изучено
анатомо-гистологическое
строение
перспективного
лекарственного сырья «Женьшеня трава».
Выявлены диагностические признаки листа: дорзовентральный тип
листовой пластинки; характерная форма жилок на поперечном сечения;
выраженная паренхимизация центральной и вторичных жилок; аномоцитный
тип устьиц с ладьевидными замыкающими клетками; наличие крупных
эмергенцев на V-образных выступах края листа; наличие мелких друз
оксалата кальция в мезофилле (рис. 2).
Изучены особенности строения черешка листа женьшеня. Согласно
принципам петиолярной анатомии выявлен комплекс диагностических
признаков (рис. 2): особое очертание поперечного сечения, заключающееся в
12
овальной форме с неравномерно округлыми городчатыми краями;
проводящие элементы пучкового типа, пучки коллатеральные закрытые,
разноразмерные, расположены по окружности; самый крупный пучок
представляет собой центральную жилку; вместилища с липофильным
секретом во флоэмной части; колленхима уголково-пластинчатого типа с
клетками смятой формы в качестве основного армирующего элемента
черешка; наличие друз оксалата кальция. Определен также комплекс
диагностических признаков стебля (рис. 2).
Выявленные
диагностические
признаки
и
иллюстрации
микропрепаратов корневищ с корнями женьшеня положены в основу раздела
«Микроскопия» проекта ФС «Женьшеня корневища с корнями».
А
З
П
Б
Д
И
М
В
Е
К
Н
Г
Ж
Л
О
Р
Т
У
С
Рис. 1. Диагностические признаки корневищ с корнями женьшеня.
Обозначения: А – поперечный срез корневища, фрагмент; Б – элементы первичной коры
(пробка, феллоген, феллодерма); В – клетки пробки корневища, вид сверху;
Г – схизогенные вместилища в паренхиме коры; Д – секреторный канал с каплей
секрета; Е – друзы оксалата кальция; Ж – проводящие элементы древесины с
одревесневшими стенками; З – поперечный срез главного корня, фрагмент; И – клетки
пробки; К – крахмальные зерна в паренхиме сердцевинных лучей; Л – секреторный
канал; М – зона залегания камбия; Н – лучи ксилемы; О – сосуды ксилемы;
П – поперечный срез придаточного корня, фрагмент; Р – клетки пробки;
С – продольный срез придатоного корня; Т – сосуды ксилемы; У – клетки паренхимы
коры с крахмальными зернами.
13
А
Е
Л
Б
Г
Ж
И
М
В
Д
З
К
Н
Рис. 2. Диагностические признаки травы женьшеня.
Обозначения: А – поперечный срез черешка листа; Б – клетки уголоково-пластинчатой
колленхимы; В, Г – край листовой пластинки; Д – проводящий пучок черешка;
Е – поперечный срез листовой пластинки; Ж – паренхима листовой пластинки; З – клетки
нижнего эпидермиса; И – клетки верхнего эпидермиса; К – эмергенец пильчатого края
листочка; Л – поперечные срезы стебля; М – ткани периферической части; Н –
проводящие пучки двух типов.
Фитохимическое исследование лекарственного растительного
сырья женьшеня настоящего
Методом ТСХ проведен фитохимический анализ извлечений из корней,
листьев и стеблей женьшеня, полученных с использованием 40% и 70%
этилового спирта. Выявлено, что анализируемые вещества (сапонины)
наиболее четко разделяются в системе растворителей хлороформ - метанол вода в соотношении 26:14:3 (рис. 3). При этом относительно более
интенсивно окрашенными являются пятна веществ на хроматограммах
извлечений на 70% этиловом спирте.
В результате спектрофотометрического анализа получены кривые
поглощения в УФ и видимой области спектра извлечений из корней и
листьев женьшеня (рис. 4 и 5). Максимум поглощения водно-спиртового
3.
извлечения из корней женьшеня находится при длине волны 2682 нм,
извлечения из травы – при длине волны 273±2 нм и 320±3 нм, что
свидетельствует о различном химическом составе. Кривая поглощения из
травы обусловлена, в большей степени, флавоноидами, спектр извлечения из
корней – веществами терпеноидной природы.
14
А
Б
Рис. 3 Схема ТСХ в системе хлороформ - метанол - вода (26:14:3):
А - проявление 20% спиртовым раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК);
Б – проявление 3% спиртовым раствором алюминия хлорида.
Обозначения: 1 – извлечение из корней женьшеня (70% этанол); 2 – извлечение из корней
женьшеня (40% этанол); 3 – извлечение из надземной части женьшеня (70% этанол);
4 – извлечение из надземной части женьшеня (40% этанол).
[A] 2,5
2,25
2
1,75
1,5
1,25
1
0,75
0,5
0,25
0
200
250
300
350
400
450
Рис. 4. Спектр поглощения водноспиртового извлечения из корней
женьшеня.
500
[nm]
Рис. 5. Спектр поглощения водноспиртового извлечения из надземной части
женьшеня.
Методом адсорбционной колоночной хроматаграфии в сочетании с
перекристаллизацией и различными химическими превращениями
(ферментативный и кислотный гидролиз) из корней и листьев женьшеня
настоящего выделено 3 индивидуальных соединения (табл. 1). Для
установления структуры выделенных веществ использованы данные УФ-, 1НЯМР и масс-спектров. Фрагменты исследования структуры выделенных
соединений представлены на рисунках 6 и 7.
15
Таблица 1
Физико-химические константы и спектральные характеристики
соединений, выделенных из корней и травы женьшеня настоящего
№
в-ва
1
2
Название
3-[β-Dглюкопиранозил(1→2)β-Dглюкопиранозил]-20-[β-Dглюкопиранозил(1→6)β-Dглюкопиранозил](3β,6α,12β,20S)-3,6,12,20тетрагидроксидаммар-24-ен
(гинзенозид Rg1)
С42Н72О14
3-О-диксилозид 3,5,7,41 тетрагидроксифлавона
(кемпферол-3-О-диксилозид)
С25Н26О16
3
3,5,7,41 тетрагидроксифлавон
(кемпферол)
С15Н10О6
Химическая формула
Физико-химические
характеристики
Белое порошкообразное
вещество
Т. пл. 200-203 °С.
Светло-желтое
кристаллическое вещество
состава С25Н22О16
Т. пл. 175-178 oС (водный
спирт).
max EtOH 269, 350 нм.
Светло-желтое
кристаллическое вещество
состава С15Н10О6
Т. пл. 283-285 oС (водный
спирт).
max EtOH 267, 360 нм.
1. Гинзенозид Rg1: масс-спектр (m/z): (70 eV, 200 оС, m/z, %): 476,7 (М+
агликона); 1Н-ЯМР-спектр (300 МГц, DMSO-d6, δ, м.д., J/Гц): 5,05 (1H,
уш. т., J = 6 Гц, H-24), 4,82 (2Н, м, Н-23), 4,43 (1H, д, J= 7 Гц, H-111
глюкозы при С-20), 4,24 (1H, д, J= 7 Гц, H-11 глюкозы при С-6), 4,10 (1H,
дт, J =3 и 10 Гц, H-6), 3,55 (1H, м, H-12), 3,60 (2Н, м, Н-22), 3,33 (1H, дд,
м, H-3), 3,27 (1Н, м, Н-5), 2,8-3,8 (12Н, м, 12Н глюкозы), 2,17 (1H, м, H17), 1,72 (1H, т, J = 10 Гц, H-13), 1,3-1,5 (10Н, м, 2Н-1, 2Н-2, 2Н-Н-11, 2Н15, 2Н-16), 1,61 (3H, с, СH3-27), 1,55 (3H, с, СH3-26), 1,24 (6H, с, СH3-21 и
СH3-28), 1,00 (3H, с, СH3-18), 0,88 (3H, с, СH3-29), 0,82 (6H, с, СH3-19 и
СH3-30) (рис. 6).
2. Кемпферол-3-О-диксилозид: масс-спектр (70 eV, 200 оС, m/z, %): 286
(М+ агликона, 100 %), 153 (17), 121 (7). max EtOH 269, 350 нм; + NaOAc
274, 368 нм; + NaOAc + H3BO3 272, 355 нм; +А1С13 и +А1С13 + HCl 275,
305, 395 нм. 1Н-ЯМР-спектр (300 МГц, DMSO-d6, δ, м.д., J/Гц): 12,68 (с,
1Н, 5-ОН), 8,07 (д, 9 Гц, 2Н, Н-21,61), 6,87 (д, 9 Гц, 2Н, Н-31,51), 6,42 (д, 2,5
16
Гц, Н-8), 6,18 (д, 2,5 Гц, Н-6), 5,66 (д, 7 Гц, Н-111 ксилозы), 4,55 (д, 7 Гц,
Н-1111 ксилозы), 3,1-5,5 (м, 10Н двух молекул ксилозы) (рис. 7).
3. Кемпферол: max EtOH 267, 360 нм; + NaOAc 274, 368 нм; + NaOAc +
H3BO3 272, 355 нм; +А1С13 и +А1С13 + HCl 275, 305, 395 нм. 1Н-ЯМРспектр (300 МГц, DMSO-d6, δ, м.д., J/Гц): 12,51 (с, 1Н, 5-ОН), 8,06 (д, 9
Гц, 2Н, Н-21,61), 6,89 (д, 9 Гц, 2Н, Н-31,51), 6,50 (д, 2,5 Гц, Н-8), 6,21 (д, 2,5
Гц, Н-6).
Рис. 6. 1Н-ЯМР-спектр гинзенозида Rg1 в DMSO-d6.
Рис. 7. 1Н-ЯМР-спектр 3-О-диксилозида кемпферола в DMSO-d6.
По своим физико-химическим и спектральным характеристикам
гинзенозид Rg1 (соединение 1) является перспективным веществом в плане
17
использования в качестве РСО в методиках контроля качества сырья и
препаратов женьшеня.
Кемпферол-3-О-диксилозид
(3-О-диксилозид
3,5,7,41тетрагидроксифлавона) (соединение 2) представляет собой новое природное
соединение растения и является доминирующим флавоноидом травы
женьшеня настоящего. Для него впервые получены данные 1Н-ЯМР–спектра
и спектральные характеристики.
4. Совершенствование методов контроля качества корневищ с
корнями женьшеня и разработка методов стандартизации
надземной части женьшеня
Согласно ОСТ 91500.05.001-00 “Стандарты качества лекарственных
средств. Основные положения” разработаны методики определения
подлинности и количественного анализа суммы сапонинов в корневищах с
корнями женьшеня, а также суммы сапонинов и суммы флавоноидов в траве
женьшеня.
4.1. Качественный анализ корневищ с корнями женьшеня
Для определения подлинности корней женьшеня предложен метод ТСХ,
предусматривающий проявление хроматограммы 20% спиртовым раствором
ФВК и использование для сравнения спиртовой раствор РСО гинзенозида
Rg1 с величиной Rf около 0,3 (одно из доминирующих пятен). При этом на
хроматограмме должны обнаруживаться не менее 6 пурпурно-красных пятен,
принадлежащих гинзенозидам, с Rf от 0,10 до 0,50 (рис. 8).
Для качественного анализа корней также может служить спектр водноспиртового извлечения из корней женьшеня с коротковолновым максимумом
поглощения при 268 нм (рис. 3). Кроме того, аналитическими являются
максимумы кривой поглощения (3202 нм, 3902 нм и 5202 нм) после
проведения реакции комплексообразования с 70% серной кислотой (рис. 9).
4.2. Количественное определение суммы сапонинов корневищах с
корнями женьшеня
Показано, что применение 70% серной кислоты приводит к образованию
стабильного комплекса с сапонинами, окрашенного в розовый цвет. Раствор
имеет максимумы поглощения при длинах волн 3202 нм, 3902 нм (пл) и
5262 нм, при этом последний максимум совпадает с максимумом
поглощения гинзенозида Rg1 после проведения реакции с 70% серной
кислотой (рис. 9). Для исключения вклада сопутствующих веществ
предложено проводить очистку водно-спиртового извлечения на сорбенте
18
полиамиде. Оптимальными условиями получения анализируемого раствора
является экстрагирование сырья 70% этиловым спиртом в течение 90 минут и
проведение реакции с 70% серной кислотой в течение 10 минут.
Ошибка единичного определения суммы сапонинов в корнях женьшеня
с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,61 % (табл. 2).
4.3. Качественный анализ надземной части женьшеня
При оценке подлинности травы женьшеня предложено определение
двух групп БАС – сапонинов и флавоноидов, которые также вносят
существенный вклад в электронный спектр поглощения извлечения из травы.
Определение сапонинов в траве методом ТСХ целесообразно проводить
при условиях, аналогичных определению сапонинов в корнях (рис. 8).
Метод ТСХ также применим для определения наличия флавоноидов по
сравнению с государственным стандартным образцом (ГСО) рутина,
величина Rf которого совпадает со значением Rf кемпферол-3-О-диксилозида,
выделенного из листьев женьшеня (рис. 8).
А
Б
В
Рис. 8. Качественный анализ корневищ с корнями и травы женьшеня
(система растворителей хлороформ – метанол – вода в соотношении 26:14:3;
хроматографические пластинки марки «Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ»):
А – сапонинов в корневищах с корнями женьшеня (1 – извлечение на 70% этаноле,
2 – спиртовой раствор РСО гинзенозида Rg1; реактив – 20% спиртовой раствор ФВК);
Б – сапонинов в надземной части женьшеня (1 – извлечение на 70% этаноле,
2 – спиртовой раствор РСО гинзенозида Rg1; реактив – 20% спиртовой раствор ФВК);
В – флавоноидов в надземной части женьшеня (1 – извлечение на 70% этаноле,
2 – спиртовой раствор ГСО рутина).
4.4. Количественное определение суммы сапонинов и суммы
флавоноидов в надземной части женьшеня
19
За основу количественного определения суммы сапонинов взята
методика количественного определения данной группы БАС в корнях
женьшеня. Электронный спектр поглощения водно-спиртового извлечения из
травы после аналогичной пробоподготовки (упаривание, растворение в
спирте, фильтрование через слой полиамида, добавление реактива – серной
кислоты 70%) также имеет максимум поглощения при длине волны 526 нм.
Однако для очистки извлечения от хлорофилла и других липофильных
веществ, завышающих результаты при количественном определении
сапонинов, введена стадия очистки водно-спиртового извлечения
хлороформом. Максимальное экстрагирование сапонинов из травы
происходит при нагревании навески измельченного сырья 70% этиловым
спиртом в течение 90 минут.
Ошибка единичного определения суммы сапонинов в надземной части
женьшеня с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,48 % (табл. 2).
Для определения содержания суммы флавоноидов в траве предложен
метод дифференциальной спектрофотометрии с использованием ГСО рутина
при 412 нм (рис. 10) .
Ошибка единичного определения суммы флавоноидов в надземной
женьшеня с доверительной вероятностью 95% составляет ±3,21 % (табл. 2).
Разработанные методики качественного и количественного определения
суммы сапонинов в корнях женьшеня, а также предложенный нижний предел
содержания суммы сапонинов «не менее 2,0%» включены в проект ФС на
«Корневища с корнями женьшеня», принятой на рассмотрение ФГБУ
«Научный центр экспертизы средств медицинского применения».
[A] 1,6
1
1,4
1
1,2
1
2
2
0,8
0,6
0,4
0,2
0
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
[nm]
Рис. 9. Спектры комплекса водноспиртового извлечения из корня
женьшеня, очищенного на полиамиде, с
70% серной кислотой (1) и комплекса
гинзенозида Rg1 с 70% серной кислотой
(2).
Рис. 10. Спектры поглощения водноспиртового извлечения из надземной части
женьшеня (1) и комплекса извлечения с
раствором алюминия хлорида (2).
20
Таблица 2
Метрологические характеристики спектрофотометрических методик
количественного определения суммы сапонинов и суммы флавоноидов в
различных видах сырья женьшеня
Вид сырья, группы
БАС
Корневища с корнями
(сапонины)
Надземная часть
(сапонины)
Надземная часть
(флавоноиды)
f
X
S
P, %
t (P, f)
∆X
E, %
10
5,91
0,1222
95
2,23
±0,272
±4,61
6
3,10
0,0510
95
2,45
±0,125
±4,48
6
0,90
0,0118
95
2,45
±0,029
±3,21
Исследования
по
разработке
и
стандартизации
новых
лекарственных препаратов женьшеня
С помощью проведенных аналитических, технологических и
фармакологических исследований показана целесообразность разработки и
внедрения новых отечественных импортозамещающих лекарственных
препаратов из корневищ с корнями женьшеня.
Разработан новый способ получения настойки женьшеня с
использованием 40-80% этилового спирта (1:5). Разработаны и апробированы
методики качественного и количественного анализа настойки с
использованием гинзенозида Rg1, при этом основу взято определение суммы
сапонинов в корнях женьшеня. Содержание суммы сапонинов в образцах
настойки варьирует от 0,97±0,02% до 1,17±0,03%. Предложен нижний предел
содержания ведущей группы БАС «не менее 0,4%». Полученные данные
включены в проект ФС «Женьшеня настойка».
Предложен оригинальный состав сиропа женьшеня на основе фруктозы
и сорбита. Содержание суммы сапонинов в образцах разработанного сиропа
варьирует от 0,047±0,002% до 0,051±0,003%, при этом в качестве нижнего
предела содержания ведущей группы БАС предложено значение «не менее
0,04%». Полученные данные включены в проект ФС «Женьшеня сироп».
Разработана технология получения таблеток с жидким экстрактом
женьшеня, полученным в соотношении 1:1 на 70% этаноле, предложены
методы их стандартизации, определены показатели качества. Содержание
суммы сапонинов в образцах таблеткок в пересчете на гинзенозид Rg1
варьирует от 3,17 мг/таб. до 3,47 мг/таб.
В ходе проведенных фармакологических исследований выявлено, что
корневища с корнями женьшеня, произрастающего в Самарской области,
5.
21
обладают антигипногенным, ноотропным и анксиолитическим действием,
при этом анксиолитическая активность впервые выявлена для данного
растения.
ВЫВОДЫ
1. В результате анатомо-морфологических исследований изучено
корневище, главный и придаточный корень женьшеня, которые в
совокупности составляют лекарственное сырье «Женьшеня корни». На
основании полученных данных взамен ранее используемому названию
ЛРС «Женьшеня корни» предложено новое наименование – «Женьшеня
корневища с корнями», которое более полно отражает состав
используемого сырья.
2. Впервые изучено анатомическое строение и характер сложения тканей
листа, черешка листа и стебля женьшеня, представляющих собой
перспективное ЛРС «Женьшеня трава».
3. В результате изучения химического состава женьшеня, культивируемого
в
Самарской
области,
с
использованием
химических,
хроматографических и спектральных методов из корней женьшеня
выделен гинзенозид Rg1, а из листьев женьшеня – кемпферол и
кемпферол-3-О-диксилозид
(3-О-диксилозид
3,5,7,41тетрагидроксифлавона), представляющий собой новое природное
соединение.
4. Показана целесообразность контроля качества корней и препаратов
женьшеня по сумме сапонинов в пересчете на гинзенозид Rg1, а травы
женьшеня – по содержанию суммы сапонинов в пересчете на гинзенозид
Rg1 и по сумме флавоноидов в пересчете на рутин.
5. Разработаны методики качественного анализа корней женьшеня на
содержание сапонинов методами ТСХ и спектроскопии с
использованием РСО гинзенозида Rg1, а также методики качественного
анализа травы женьшеня на содержание сапонинов и флавоноидов
методом ТСХ.
6. Разработаны методики количественного анализа суммы сапонинов в
корнях женьшеня и в траве в пересчете на РСО гинзенозид Rg1 методом
прямой спектрофотометрии, а также методика количественного
определения суммы флавоноидов в траве женьшеня методом
дифференциальной спектрофотометрии в пересчете на ГСО рутин.
22
Определены показатели качества сырья «Женьшеня корневища с
корнями»: в качестве нижнего предела содержания суммы сапонинов в
пересчете на гинзенозид Rg1 предложено значение «не менее 2,0%»;
препарата «Женьшеня настойка» («не менее 0,4%»); препарата
«Женьшеня сироп» («не менее 0,04%»).
8. Экспериментально
доказана
тонизирующая,
ноотропная
и
анксиолитическая активность водно-спиртовых извлечений из корней
женьшеня, культивируемого в Самарской области, при этом
анксиолитическое действие выявлено впервые.
9. На основе химических, технологических и фармакологических
исследований
обоснована
целесообразность
использования
в
медицинской практике новых тонизирующих лекарственных препаратов
«Женьшеня сироп» и «Женьшеня таблетки».
10. Разработан проект ФС «Женьшеня корневища с корнями», который
направлен в ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского
применения» с целью включения в Государственную Фармакопею РФ
XII издания, а также проекты ФСП на лекарственные препараты
«Женьшеня настойка» и «Женьшеня сироп».
7.
23
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Куркин, В.А. Определение сапонинов в корнях женьшеня / В.А. Куркин, А.С.
Акушская // Фармация. – 2012. – Т. 60, № 4. – С. 18-20.
Акушская, А.С. Анатомо-морфологическое исследование корней женьшеня /
Акушская А.С., В.А. Куркин, В.М. Рыжов, Л.В. Тарасенко // Медицинский
альманах. – 2012. – № 4 (23). – С. 148-152.
Куркин, В.А. Изучение нейротропной активности лекарственных препаратов на
основе корней женьшеня / В.А. Куркин, А.С. Акушская, А.В. Дубищев, Д.В.
Корчагина // Традиционная медицина. – 2012. – № 5. – С. 119-123.
Акушская, А.С. Стандартизация сырья и препаратов женьшеня / Куркин, А.С.
Акушская, М.В. Шнытко, Л.А. Клейн // Известия Самарского научного центра
РАН. – 2012. – Т. 14, № 5 (3). – С. 691-694.
Куркин, В.А. Разработка методов контроля качества женьшеня настойки / В.А.
Куркин, А.С. Акушская // Химия растительного сырья. – 2013. – № 2. – C. 177-182.
Куркин, В.А. Нейротропные свойства препарата на основе корней Panax ginseng
(Araliaceae), культивируемого в Самарской области / Куркин, А.С. Акушская, А.В.
Дубищев, Д.В. Корчагина // Растительные ресурсы. –2013.–Т.49, вып.1. – С. 132-137.
Куркин, В.А. Стандартизация препарата «Женьшеня таблетки» / В.А. Куркин, А.С.
Акушская, С.В. Первушкин, Н.Н. Желонкин // Фармация. – 2013. – № 4. – С. 5-7.
Акушская, А.С. Изучение флавоноидов листьев женьшеня / А.С. Акушская //
Фундаментальные исследования. – 2013. – № 8, часть 2. – С. 385-388.
Акушская, А.С. Культивирование женьшеня настоящего в Самарской области как
вклад в сохранение вида / В.А. Куркин, А.С. Акушская, М.В. Шнытко, Л.А. Клейн //
Известия Самарского научного центра РАН. – 2013. – Т. 15, № 3 (6). – С. 17221724.
Куркин, В.А. Стандартизация нового лекарственного препарата «Женьшеня сироп» /
В.А. Куркин, А.С. Акушская // Химико-фармацевтический журнал. – 2014. – Т. 48,
№ 4. – С. 35-37.
Куркин, В.А. Петиолярная анатомия в рамках анатомо-морфологического
исследования перспективного лекарственного сырья – травы женьшеня / В.А. Куркин,
А.С. Акушская, В.М. Рыжов, Л.В. Тарасенко, П.Д. Топоркова // Фундаментальные
исследования. – 2014. - № 5, часть 6. – С. 1274-1278.
Акушская, А.С. Разработка методик количественного определения суммы сапонинов
и суммы флавоноидов в надземной части женьшеня / А.С. Акушская // Аспирантский
вестник Поволжья. – 2014. – № 1-2. – С. 245-248.
Куркин, В.А. Исследование номенклатуры адаптогенных лекарственных препаратов,
представленных на фармацевтическом рынке Российской Федерации / В.А. Куркин,
И.К. Петрухина, А.С. Акушская // Фундаментальные исследования. – 2014. - № 8,
часть 4. – С. 898-902.
Акушская, А.С. Качественный и количественный анализ сапонинов в корнях
женьшеня / Акушская А.С., В.А. Куркин // Материалы Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием, посвященной 45-летию
фармацевтического факультета КГМУ. – Курск, 2011. – С. 293-295.
Акушская, А.С. Диагностика корней женьшеня настоящего методом электронноцифровой микроскопии / Акушская А.С. // Материалы международной научнопрактической конференции «Молодежь и наука: модернизация и инновационное
развитие страны». – Пенза, 2011. – С. 47-50.
Акушская, А.С. Нейротропная активность настойки из корней культивируемого
женьшеня / А.С. Акушская, В.А Куркин, А.В. Дубищев, Д.В. Корчагина // Материалы
Всеукраинской научно-практической конференции студентов и молодых ученых
«Актуальные вопросы создания новых лекарственных средств». – Харьков, 2012. – С.
354.
24
17. Куркин, В.А. Изучение нейротропной активности новых препаратов женьшеня / В.А
Куркин, А.С. Акушская, А.В. Дубищев, Д.В. Корчагина // Сборник материалов
конгресса XIX Российского национального конгресса «Человек и лекарство»: тезисы
докладов. – М., 2011. – С. 349.
18. Акушская, А.С. Перспективы культивирования женьшеня в Самарской области / А.С.
Акушская // Тезисы докладов Всероссийской молодежной научной школы. – Казань,
2012. – С.90.
19. Акушская, А.С. Разработка и стандартизация новых препаратов женьшеня / А.С.
Акушская // Аспирантские чтения – 2012.: материалы Всероссийской конференции с
международным участием «Молодые ученые – медицине». – Самара, 2012. – С. 193195.
20. Акушская, А.С. Корни культивируемого женьшеня как источник нейротропных
лекарственных средств / А.С. Акушская // Вестник ВолгГМУ: приложение
(Материалы IV Всероссийского научно-практического семинара молодых ученых с
международным участием). – Волгоград, 2012. – С. 5-6.
21. Куркин, В.А. Современные подходы к стандартизации сырья и разработке новых
нейротропных препаратов женьшеня настоящего / В.А Куркин, А.С. Акушская //
Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник
научных трудов. – Пятигорск, Пятигорский медико-фармацевтический институт –
филиал ГБОУ ВПО ВолГМУ Минздрава России, 2013. – С. 177-178.
22. Акушская, А.С. Корень женьшеня: современный взгляд на создание препаратов и их
применения в медицинской практике / А.С. Акушская, В.А. Куркин // Медицина XXI
века: тенденции и перспективы: II международная научная Интернет-конференция. –
2013. – С. 10-14.
23. Акушская, А.С. Трава женьшеня настоящего как перспективное лекарственное
растительное сырье / А.С. Акушская // Аспирантские чтения – 2012: материалы
Всероссийской конференции с международным участием «Молодые ученые –
медицине». – Самара, 2013. – С. 258-260.
24. Куркин, В.А. Микроскопическая диагностика надземной части женьшеня настоящего
как перспективного лекарственного растительного сырья / В.А Куркин, А.С.
Акушская, В.М. Рыжов, Л.В. Тарасенко, П.Д. Топоркова // Разработка, исследование и
маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов. –
Пятигорск, Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ГБОУ ВПО
ВолГМУ Минздрава России, 2014. – Вып. 69. – С. 53-54.
25. Акушская, А.С. Перспективы комплексного использования корневищ с корнями и
травы женьшеня настоящего / А.С. Акушская // Сборник материалов IV
Всероссийской научной конференции студентов и аспирантов с международным
участием «Молодая фармация – потенциал будущего», Санкт-Петербург, 14-15 апреля
2014 г. – Спб.: Изд-во СПХФА, 2014. – С. 387-389.
26. Акушская, А.С. Роль флавоноидов в оценке качества травы женьшеня / А.С.
Акушская // Материалы IX годичной научно-практической конференций молодых
ученых и студентов ТГМУ им. Абуали ибни Сино с международным участием
«Достижения и перспективы развития медицинской науки», Душанбе, 25 апреля 2014
г. – С. 258-259.
27. Патент РФ на изобретение № 2496509 «Способ получения средства, обладающего
тонизирующей активностью» от 27 октября 2013 г.; заявка № 2012102367, приоритет
изобретения 21 января 2012 г. Авторы: Куркин В.А., Акушская А.С., Дубищев А.В.,
Корчагина Д.В.
28. Патент РФ на изобретение № 2514008 «Сироп женьшеня» от 25 февраля 2014 г.;
заявка № 20121410087, приоритет изобретения 25 сентября 2012 г. Авторы: Куркин
В.А., Акушская А.С.
25