ДНЕПРОПЕТРОВСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ КАФЕДРА МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ И ИНФОРМАТИКИ Методическое пособие для студентов IV курса специальности " Фармация ", "Клиническая фармация" по теме: “ПЛАНИРОВАНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТА. ПРОВЕДЕНИЕ БИВАЛЕНТНОГО И МУЛЬТИВАЛЕНТНОГО ЭКСПЕРИМЕНТОВ. СПОСОБЫ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ЭКСПЕРИМЕНТА“ Составитель: преп. Каземир В.С. ДНЕПРОПЕТРОВСК 2013 Цель работы: Составить математическую модель эксперимента. Получить уравнение регрессии, отобрав значимые коэффициенты регрессии. Проверить адекватность модели по критерию Фишера. Теоретическая часть Экспериментальные исследования начинаются с формулировки цели эксперимента, перечня влияющих факторов и их уровней, выбора показателя, по которому будут оценивать результаты эксперимента. Составляется план эксперимента, математическая модель. 1. ПЛАНИРОВАНИЕ И ОБРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ В медицинских исследовательских задачах, в которых необходимо проведение большого числа опытов при учете нескольких факторов и их комбинаций, очень полезными могут оказаться специальные планы эксперимента, основанные на комбинаторных конфигурациях. Применяя специальные планы (используя латинский куб второго порядка), задачу можно решить с помощью меньшего количества опытов. При этом полученный экспериментальный материал будет удовлетворять всем требованиям. Задачи такого типа характерны для весьма многих областей исследования. Это и поиск новых лекарственных препаратов, удобрений, кормов, строительных материалов, сплавов, смазочных масел и многих других смесей. Планирование и анализ эксперимента представляют собой важную ветвь статистических методов, разработанную для обнаружения и проверки причинных связей между входными переменными (факторами) и выходными (откликами). 2. ПРОСТЫЕ ДВУХУРОВНЕВЫЕ ПЛАНЫ Под планированием эксперимента понимается процедура выбора числа опытов и условий их проведения, необходимых для решения поставленной задачи с требуемой точностью. Все факторы, определяющие процесс, изменяются одновременно по специальным правилам, а результаты эксперимента представляются в виде математической модели, обладающей некоторыми «хорошими» статистическими свойствами. При этом можно выделить следующие этапы: - сбор и анализ априорной информации; - выбор входных и выходных переменных, области экспериментирования; - выбор математической модели, с помощью которой будут представляться экспериментальные данные; - выбор критерия оптимальности и плана эксперимента; - определение метода анализа данных; - проведение эксперимента; - проверка статистических предпосылок для полученных экспериментальных данных; - обработка результатов; - интерпретация и рекомендации. Входные переменные (факторы) определяют состояние объекта. Факторы могут быть количественными и качественными. Выходные переменные - это реакции (отклики) на воздействие входных переменных (см. Методическое пособие “Применение дисперсионного анализа в фармации”). Обозначим наблюдаемый отклик через у, а факторы - через х1 , х2,...хк. Выбор модели зависит от наших знаний об объекте, целей исследования и математического аппарата. При изучении кинетики химических процессов принято пользоваться дифференциальными уравнениями. Химические равновесия часто описываются дробно-рациональными функциями, а колебательные процессы в химических реакторах - тригонометрическими. Если вид функции неизвестен, то полезным оказывается ее представление в виде разложения в степенные ряды. Пользуясь результатами эксперимента, можно получить лишь оценки параметров этой модели: y b0 bi x i bij x i x j ... где у - значение отклика, предсказанного этим уравнением. Оценки коэффициентов обычно получают с помощью метода наименьших квадратов. Чтобы убедиться в приемлемости такой оценки, нужно провести статистический анализ, задача которого- оценить параметры генеральной совокупности по данным выборки, учитывая экспериментального неопределенность, материала. вносимую При статистическом 3 ограниченностью анализе проверяется значимость коэффициентов регрессии и адекватность линейной модели (соответствие модели экспериментальным данным по выбранному критерию). Планированию экспериментов предшествует этап выбора области экспериментирования, центра эксперимента и интервалов варьирования факторов. При этом оцениваются границы областей определения факторов, задаваемых принципиальными ограничениями либо технико-экономическими соображениями. Построение наиболее простых планов сводится к выбору экспериментальных точек, симметричных относительно центра эксперимента. Мы будем здесь рассматривать именно такие симметричные двухуровневые планы. В этом случае все к факторов изменяются на двух уровнях и план эксперимента носит название плана типа 2 k . Интервалом варьирования факторов называется некоторое число (свое для каждого фактора), прибавление которого к основному уровню дает верхний уровень, а вычитание - нижний. Чтобы упростить и унифицировать запись условий опытов и облегчить обработку экспериментальных данных, масштабы по осям задаются в виде кодированных значений +1 и -1. Пусть в эксперименте по ускоренному старению лекарственных форм исследуется два фактора: температура хранения препарата без упаковки и продолжительность хранения. Изменяются два фактора на двух уровнях: x1 температура и х2 - время хранения. Для x1 основным уровнем является 600С, а интервал варьирования составляет 100С. Тогда для 700С будет верхним уровнем, а 500С нижним. Верхнему значению приписываем +1, нижнему -1. Эксперимент, в котором реализованы все возможные сочетания уровней факторов, называется полным факторным (ПФЭ). Для п уровней это будет ПФЭ типа пк. Условия эксперимента представляются в виде таблицы - матрицы планирования. Вот пример матрицы планирования с учетом свободного члена b0 и эффекта взаимодействия b12 Номер опыта 1 2 3 4 x0 x1 x2 x1 x2 у +1 +1 +1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 +1 -1 +1 +1 -1 -1 у1 у2 у3 у4 Этот план соответствует модели: y b0 b1 x1 b2 x 2 b12 x1 x 2 . Полное число всех возможных эффектов равно N - числу опытов ПФЭ. Для более сложных моделей выбираются планы с числом уровней, большим 2. 3. РЕГРЕССИОННЫЙ АНАЛИЗ ДЛЯ ОРТОГОНАЛЬНЫХ ДВУХУРОВНЕВЫХ ПЛАНОВ Рассмотрим 3-х факторный эксперимент. Нас будут интересовать линейные эффекты y b0 b1 x1 и b2 x 2 парные b3 x 3 взаимодействия. b12 x1 x 2 Модель b23 x 2 x 3 . b13 x1 x 3 объекта Наиболее имеет простой вид: план, допускающий оценку всех коэффициентов этой модели - полный факторный эксперимент 23. Для оценки ошибки воспроизводимости все опыты дублировались. Оценка дисперсий среднего арифметического. n yi ) 2 ( y ik S i2 k 1 n 1 , где yik- результат отдельного опыта, y i - среднее значение отклика по повторным опытам, п - количество параллельных опытов, q - номер параллельного опыта, i номер строки матрицы плана, i = 1... N. Проверка однородности дисперсий с помощью критерия Кохрена. Критерий Кохрена определяется отношением максимальной дисперсии к сумме всех дисперсий: 2 S max S i2 Y Гипотеза об однородности дисперсий не отвергается, если экспериментальное значение критерия Кохрена не превысит табличного. Оценка усредненной дисперсии воспроизводимости. рассчитывается, если дисперсии однородны: S cp 2 Вычисление коэффициентов уравнения. 5 S i2 N Эта оценка N N x ji y i bj i 1 x ji x ki y i , b jk N i 1 N где xji - значение j-го фактора в i-ом опыте, которые умножаются на средние значения отклика в i–ом опыте. Проверка гипотезы об адекватности модели. Проверка основана на расчетах дисперсии адекватности S A2 и критерия Фишера (F-критерия). N ( yi S A2 yˆ i ) 2 i 1 N m S A2 S cp2 ,F где yˆ i - рассчитанное по уравнению регрессии значение отклика, m - число значимых коэффициентов регрессии. Рассчитанное значение F-критерия сравнивается с табличным значением, определяемым числами степеней свободы Nm и N. Если экспериментальная величина F-критерия не превышает табличного значения, то гипотеза об адекватности модели не отвергается. Проверка значимости коэффициентов регрессии. Поскольку план ортогонален, коэффициенты регрессии определяются с одной и той же дисперсией: S2 S cp2 N . Далее для коэффициентов регрессии рассчитывается доверительный интервал с некоторой доверительной вероятностью: коэффициент Стьюдента для уровня значимости t( N ) S . t( , N ) - . Коэффициент значим, если его абсолютная величина больше доверительного интервала. Незначимые коэффициенты регрессии исключаются и вновь проводится проверка адекватности модели со значимыми коэффициентами. Статистический анализ завершается интерпретацией модели в терминах объекта исследования. Практическая часть. Оценка комплексного влияния нескольких факторов на содержание активного фармацевтического ингредиента (АФИ) при ускоренном старении лекарственных форм. Этапы планирования эксперимента: 1. Выбор входных переменных (факторов): х1 х2, ..., х п . 2. Определение области экспериментирования. 3. Выбор выходной переменной (отклика): у . 4. Выбор математической модели, с помощью которой будут представляться экспериментальные данные - функции взаимосвязи у и х1, х2, ..., х п . 5. Выбор плана эксперимента. 6. Кодирование факторов, построение матрицы планирования. 7. Проведение эксперимента. 8. Статистический анализ результатов эксперимента. 9. Интерпретация и рекомендации. Порядок выполнения работы: Факторы: х 1 - температура; х2 – время хранения; х3 – облучение видимым светом. Фак тор Обозна чение Содержа ние Единицы измерения Основной Интервал уровень варьирования Ниж Верхний ний 1 х1 °С 60 10 50 70 2 х2 температу ра облучение ч. в сут. 7 7 0 14 3 х3 время дней 14 7 7 21 Количество факторов 3. Количество уровней 2. Отклик: у – содержание примеси сульфамида в %. Математическая модель процесса: y b0 b1 x1 b2 x 2 b3 x 3 b12 x1 x 2 b13 x1 x 3 b23 x 2 x 3 (линейная зависимость) План эксперимента - полный факторный эксперимент. Количество опытов: N=23. 7 № Аддитивная постоянная Матрица планирования х0 1 2 3 4 5 6 7 8 х1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 х2 -1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 +1 Векторы-столбцы взаимодействия х3 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 1 -1 -1 1 -1 -1 1 1 1 -1 1 -1 -1 1 -1 1 1 1 -1 -1 1 -1 -1 1 у у1 у2 у3 у4 у5 у6 у7 у8 проведен два раза (для оценки -1 +1 +1 -1 -1 -1 +1 +1 х1х2 х1х3 Эксперимен– тальный отклик х2х3 Проведение эксперимента. Каждый опыт был ошибки воспроизводимости). Получены следующие экспериментальные данные: Номер опыта N 1 2 3 4 5 6 7 8 х1 -1 -1 -1 -1 +1 +1 +1 +1 Факторы х2 -1 +1 +1 -1 -1 -1 +1 +1 х3 -1 +1 -1 +1 -1 +1 -1 +1 у1 2,4 2,25 0,4 0,7 3,2 0,7 2,25 1,65 Отклики у2 2,05 2,05 0,65 0,8 3,55 0,4 2,55 1,15 Статистический анализ результатов эксперимента. Проверка воспроизводимости эксперимента по критерию Кохрена. Перед проведением дисперсионного анализа необходимо убедиться в однородности дисперсий. В случае одинакового числа повторных опытов для оценки однородности дисперсии применяется критерии Кохрена (У) – отношение максимальной дисперсии к сумме всех дисперсий: Y 2 S max S i2 Дисперсии вычисляются, как показано на рисунке выше или с помощью формулы =ДИСП.В(диапазон). Максимальная дисперсия Smax = 0,125 Критерий Кохрена: УЭКСП=0,31746. Определить Утабл. (табличное значение критерия Кохрена). Табличное значение берется для f=2-1=1 (число измерений в каждом опыте), N = 8 (число опытов) и выбранного уровня значимости а = 0,05. Критерий Кохрена Утабл= У (0,05;1;8) =0,6798 (см. Приложение 1). Сравнить Утабл. и Уэксп, и сделать вывод. Если Уэксп < Утабл , то эксперимент воспроизводим (гипотеза об однородности дисперсий подтверждается) и можно приступать к дисперсионному анализу экспериментальных данных. Дисперсия воспроизводимости равна среднему значению дисперсий: S cp 2 S i2 N 9 Вычисление коэффициентов уравнения линейной регрессии (математической модели). Для остальных 8 экспериментов проводят аналогичные вычисления, все значения в каждом столбце складываются и делятся на N=8. Проверка значимости коэффициентов по критерию Стъюдента. Критерий N N Стъюдента для уровня значимости 0,05 и числа опытов N = 8 рассчитывается с помощью функции СТЬЮДРАСПОБР. Коэффициент Стъюдента t( , N ) = 2,306004. Интервал значимости N ) * S cp2 / N =0,180876. t( Все коэффициенты, большие по модулю, чем , значимы. Уравнение регрессии: Ут е ор=b 0 x 0 +b 1 x 1 +b 3 x 3 +b 1 3 x 1 x 3 +b 2 3 x 2 x 3 Ут е ор=1,67 +0,26 x 1 – 0 , 4 6 x 3 –0,50 x 1 x 3 +0,62 x 2 x 3 Проверка адекватности модели по критерию Фишера. N ( yi S 2 A yˆ i ) 2 i 1 N m ,F S A2 S cp2 где yˆ i - рассчитанное по уравнению регрессии значение отклика, m - число значимых коэффициентов регрессии. m=5. 11 Дисперсию адекватности находим по формуле: N ( yi S A2 yˆ i )2 i 1 N m Дисперсия адекватности 0,07653. Критерий Фишера Fэксп= S A2 / S cp2 = 1,555026 Табличное значение критерия Фишера определяем для уровня значимости =0,05 с помощью функции =F.ОБР.ПХ(0,05;3;8)=4,06618 Если Fэксп<Fтабл, то гипотеза об адекватности модели не отвергается. Интерпретация и рекомендации. Необходимо установить, в какой мере каждый из факторов влияет на параметр оптимизации. Величина коэффициента регрессии - количественная мера этого влияния. Чем больше коэффициент, тем сильнее влияет фактор. О характере влияния факторов говорят знаки коэффициентов. Значимых коэффициентов регрессии пять: Модуль коэффициента b3 больше модуля коэффициента b1. Время хранения влияет существеннее, чем температура. b3 < 0 => Со временем процентное содержание АФИ уменьшается. b1 >0 => С увеличением температуры процентное содержание АФИ увеличивается. b2< => Влияние облучения не существенно. Контрольные вопросы 1) Как произвести проверку воспроизводимости эксперимента? 2) Какой вывод можно сделать, сравнивая табличное значение критерия Кохрена со значением, полученным в эксперименте? 3) Какова формулировка гипотезы H 0 , проверяемой по F–критерию? 4) Как определить значимость коэффициентов уравнения регрессии? 5) Как проверить адекватность модели? 6) Если экспериментальное значение критерия Фишера меньше табличного, то о чем это свидетельствует? 7) Привести математическую линейную модель процесса. 8) Какие выводы можно сделать при анализе полученных коэффициентов математической модели? Литература 1) Компьютерные технологии исследования лекарственных средств / Н.И. Лазарев, О.С. Островский, С.В. Бельма, Т.Д. Нессонова. –Харьков: Изд-во НФаУ «Золотые страницы», 2003. – 99 с. 2) Адлер Ю.П. Предпланирование экасперимента. – М.:Знание, 1978. – 72с. 3) Румшинский Л.З. Математическая обработка результатов эксперимента. – М.: Наука, 1971. – 192с. 4) Грошовый Т.А., Маркова Е.В., Головкин В.А. Математическое моделирование эксперимента в фармацевтической технологии (планы дисперсионного анализа). – Киев: Высш. шк., 1992. – 187с. 5) Шеффе Г. Дисперсионный анализ. Пер. с англ. –М.: Наука, 1980. – 512с. 6) Дягилева Ф.Г., Тиманюк В.А., Горбуненко Б.Ф. Учебное пособие по математической статистике. – Харьков: Основа, 1988. – 65 с. 13