Кандидатская диссертация - Дыкман Р.Л.

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ И
МИКРООРГАНИЗМОВ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
________________________________________________________________
На правах рукописи
ДЫКМАН РОМАН ЛЬВОВИЧ
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ
ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ
С УЧАСТИЕМ АЛКИЛРЕЗОРЦИНОВ И ЖЕЛЕЗА(III)
02.00.04 – физическая химия
Диссертация
на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Научный руководитель
доктор химических наук,
профессор КАМНЕВ А.А.
Саратов – 2014
2
Оглавление
Введение................................................................................................................... 7
Глава 1. Химические свойства и биологические функции фенольных
соединений и их алкилированных производных (обзор литературы)............. 17
1.1. Химические свойства и биосинтез фенольных соединений.
Многоатомные фенолы............................................................................ 17
1.2. Регуляторные функции фенольных соединений ........................... 25
1.3. Антиоксидантные свойства фенольных соединений .................... 27
1.4. Химические и биохимические свойства алкилрезорцинов в
биологических системах.......................................................................... 30
1.5. Функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов ....... 32
1.6. Свойства алкилированных фенолов как адаптогенов ................... 34
1.7. Физико-химическое взаимодействие алкилированных фенолов с
нуклеиновыми кислотами ....................................................................... 36
1.8. Функция алкилированных фенолов как химических шаперонов 39
1.9. Алкилрезорцины как пищевые биомаркеры .................................. 39
1.10.
Химические
сигнальных
(абиотические)
молекул
–
взаимодействия
внеклеточных
с
участием
ауторегуляторов
микроорганизмов...................................................................................... 41
Глава 2. Материалы и методы исследования ..................................................... 45
2.1. Материалы и объекты исследования............................................... 45
2.2. Приготовление водного раствора 5-метилрезорцина в смеси с
хлоридом
железа(III)
и
измерения
электронных
спектров
поглощения ............................................................................................... 46
2.3. Приготовление исходного водного раствора 5-метилрезорцина и
измерения электронных спектров поглощения..................................... 48
3
2.4. Приготовление водно-этанольного раствора 4-н-гексилрезорцина
в смеси с хлоридом железа(III) и измерения электронных спектров
поглощения ............................................................................................... 48
2.5. Приготовление исходного водно-этанольного раствора 4-нгексилрезорцина и измерения электронных спектров поглощения ... 50
2.6. Приготовление смеси алкилрезорцинов с Fe(III) для исследования
методом спектроскопии ядерного гамма-резонанса ............................ 51
2.7. Спектроскопия в УФ-области .......................................................... 51
2.8. Мёссбауэровская (ядерная гамма-резонансная) спектроскопия .. 53
2.8.1. Особенности метода при количественных измерениях..…53
2.8.2. Измерения мёссбауэровских спектров…………………….56
2.9.
Теоретическое
активности
исследование
алкилрезорцинов
в
относительной
реакциях
химической
окисления
методом
квантовой химии ...................................................................................... 58
2.10.
Газовая
хроматография
с
масс-спектрометрическим
детектированием....................................................................................... 58
2.11. Рентгенофлуоресцентный анализ .................................................. 60
2.12. Инфракрасная спектроскопия........................................................ 60
Глава 3. Экспериментальные исследования, результаты и их обсуждение.... 62
3.1. Окислительно-восстановительные процессы с участием 5метилрезорцина ........................................................................................ 62
3.2. Окислительно-восстановительные процессы с участием 4-нгексилрезорцина ....................................................................................... 66
3.3.
Исследование
восстановления
железа(III)
в
присутствии
алкилрезорцинов методом мёссбауэровской спектроскопии.............. 71
3.4. Мёссбауэровское исследование влияния кислотности на скорость
редокс-взаимодействий железа(III) с 4-н-гексилрезорцином в водных
средах......................................................................................................... 77
4
3.5.
Анализ
кинетических
закономерностей
процессов
взаимодействия алкилрезорцинов с железом(III) ................................. 83
3.6. Результаты квантово-химического исследования и их обсуждение
в сравнении с экспериментальными данными ...................................... 95
3.7. Исследование продуктов взаимодействия 4-н-гексилрезорцина с
железом(III)
методом
газовой
хроматографии
с
масс-
спектрометрическим детектированием.................................................. 99
3.8. Исследование состава хлороформного экстракта продуктов
взаимодействия
4-н-гексилрезорцина
с
железом(III)
методом
рентгенофлуоресцентного анализа....................................................... 105
3.9. Исследование продуктов взаимодействия 4-н-гексилрезорцина с
железом(III) методом ИК-спектроскопии............................................ 107
Заключение .......................................................................................................... 110
Выводы ................................................................................................................. 113
Список использованных источников ............................................................... 115
5
Список сокращений
а.е.м. – атомная единица массы
АОБ – алкилоксибензол(ы) (распространенное обозначение алкилированных
фенолов в микробиологической русскоязычной литературе)
АТФ – аденозинтрифосфат
АР – алкилрезорцин(ы)
ГХ – газовая хроматография
ГХ-МС – газовая хроматография с масс-спектрометрическим
детектированием
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ДФПГ – 2,2’-дифенил-1-пикрилгидразил-радикал (DPPH)
ИК – инфракрасный
ИУК – индолил-3-уксусная кислота
МС – масс-спектрометрия
РФА – рентгенофлуоресцентный анализ
УФ – ультрафиолетовый
УФС – ультрафиолетовая спектроскопия
ЯГР – ядерный гамма-резонанс
ЯГР-спектроскопия – ядерная γ-резонансная (мёссбауэровская)
спектроскопия
4-н-ГР – 4-н-гексилрезорцин (1,3-дигидрокси-4-н-гексилбензол)
5-МР – 5-метилрезорцин (орцин; 1,3-дигидрокси-5-метилбензол)
5-н-ПР – 5-н-пропилрезорцин (1,3-дигидрокси-5-н-пропилбензол)
ABTS – 2,2′-азино-бис(3-этилбензтиазолино-6-сульфоновая кислота)
DFT – теория функционала плотности (Density Functional Theory)
DPPH – см. ДФПГ (2,2’-diphenyl-1-picrylhydrazyl)
6
IP – потенциал ионизации (ionization potential)
PM3 – полуэмпирический расчетный метод, использующийся в квантовой
химии (Parametric Model number 3)
QS – «quorum sensing» («ощущение кворума»)
TEAC – Trolox equivalent antioxidant capacity (“TEAC assay” – тест на
антиокислительную способность с тролоксом в качестве
эквивалента)
UV-Vis – ultraviolet and visible (УФ- и видимая [область спектра])
7
Введение
Актуальность темы
Алкилрезорцины (АР; м-дигидроксибензолы с различными по длине,
химической структуре и положению в бензольном кольце алкильными
заместителями) представляют собой природные фенольные соединения из
группы алкилированных гидроксибензолов с исключительно широким
спектром химических и биологических функций [1–6]. В частности, многие
микроорганизмы синтезируют и выделяют АР (с относительно короткими
алкильными заместителями) в окружающую среду, где посредством этих
соединений осуществляются сигнальные, ауторегуляторные и адаптогенные
функции, существенные для функционирования микробного консорциума в
целом.
Известно также, что АР, в зависимости от условий и природы
алкильного заместителя в молекуле, могут влиять на структуру ДНК и ее
химическую стабильность, на структурную организацию, проницаемость и
устойчивость мембранных комплексов; взаимодействовать с белками и
другими биополимерами; стабилизировать ферменты в водных средах,
одновременно усиливая или ингибируя их активность. Помимо этого, одним
из важнейших свойств АР, как и многих других фенольных соединений,
является
антиоксидантная
многочисленные
работы
и
Г.И.
антирадикальная
Эль-Регистан,
В.Ф.
активность
(см.
Гальченко,
А.С.
Капрельянца, Д.Г. Дерябина и их соавторов).
С другой стороны, химическая активность внеклеточных биогенных АР,
синтезируемых микроорганизмами и выделяемых ими во внешнюю среду,
может способствовать их абиотическому (химическому, фотохимическому)
разрушению под воздействием целого ряда факторов окружающей среды, что
представляется весьма существенным с точки зрения участия АР в процессах
микробного сигналинга и ауторегуляции. Так, для почв и природных
8
водоносных слоев (в том числе, имеющих повышенную кислотность водной
фазы) возможно протекание химических процессов (таких, как гидролиз,
комплексообразование,
окислительно-восстановительные
реакции),
в
частности – в присутствии ионов тяжелых металлов (Kamnev, 2008).
Протекание подобных процессов с участием сигнальных молекул (включая
АР) снижает их концентрацию в среде, что вполне может затруднять
достижение
пороговой
концентрации,
“ощущаемой”
клетками
микроорганизмов и необходимой для согласованного поведения микробного
консорциума в целом (данное явление, обнаруженное в последнее
десятилетие и активно исследующееся в настоящее время, называется
“ощущение кворума”, quorum sensing). Абиотическое разрушение или
химическая модификация сигнальной молекулы, эквивалентные прерыванию
“извне” межклеточной передачи сигнала (на этапе элиминирования либо
изменения состава и/или структуры самого химического молекулярного
“мессенджера”), безусловно, влияют на сопряженные процессы рецепции
(ввиду соответствия рецепторов определенной химической структуре
сигнальных молекул), передачи сигнала и, в конечном итоге, – на
формирование соответствующих клеточных метаболических откликов в
микробном консорциуме.
Одним из наиболее распространенных металлов в почве и природных
водоемах является железо, которое находится в основном в виде
разнообразных по химическому составу и кристаллической структуре
оксидных и/или гидроксидных (в различной степени гидратированных)
соединений железа(III). Если в условиях нейтральных и щелочных почв и
водных сред его растворимость и, соответственно, реакционная способность
минимальны, то в слабокислых средах, как было показано в ряде
исследований (Kamnev et al., 1997, 2009; Kamnev, 2008; Kovács et al., 2006,
2008; Johnson et al., 2012; см. литературный обзор), возможно его участие в
9
окислительно-восстановительных процессах с целым рядом биомолекул
самого различного строения.
Следует отметить, что в имеющейся специальной литературе, несмотря
на обилие биологических и, в частности, микробиологических исследований
свойств и роли АР как внеклеточных сигнальных молекул (аутоиндукторов)
и адаптогенов в жизнедеятельности различных микроорганизмов (см.
публикации Г.И. Эль-Регистан, В.Ф. Гальченко, А.С. Капрельянца, Д.Г.
Дерябина и их соавторов), изучению физико-химических свойств этих
важных биомолекул посвящено очень ограниченное число разрозненных
работ. Как следствие, информации о структурно-химических и физикохимических аспектах их взаимодействий с объектами окружающей среды
явно недостаточно.
В
связи
с
вышесказанным,
предпринятые
в
рамках
данной
диссертационной работы физико-химические исследования актуальны как с
точки зрения химии алкилрезорцинов, так и для более полного понимания
влияния
абиотических
(и,
в
первую
очередь,
окислительно-
восстановительных) процессов с их участием на микробный обмен
химическими
сигналами.
формулировку
цели
и
Вышеуказанные
постановку
задач
факторы
данного
определили
диссертационного
исследования.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей диссертационной работы являлось выяснение
физико-химических
закономерностей
окислительно-восстановительных
процессов с участием некоторых АР различного строения и железа(III) в
слабокислых водных средах.
Данные
условия
моделируют
абиотические
(физико-химические)
процессы, которые могут осуществляться в достаточно распространенных
кислых почвах и природных водоносных слоях, способствуя окислительной
10
деградации различных биологически активных соединений, а также
сигнальных молекул, выделяемых многими почвенными микроорганизмами,
включая молекулы АР.
Для достижения вышеуказанной цели исследования были поставлены и
решались следующие задачи:
1) изучить процессы восстановления железа(III) в присутствии АР
различного строения в слабокислых водных средах с помощью
методов
мёссбауэровской
(ЯГР)
спектроскопии
и
УФ-
спектрофотометрии;
2) провести сравнительное исследование кинетики окислительновосстановительных процессов в слабокислых водных средах с
участием железа(III) и ряда АР, отличающихся длиной и положением
алкильного заместителя;
3) с помощью квантово-химических расчетов оценить относительную
реакционную
способность
указанных
неалкилированного
аналога
восстановительных
процессах
молекул
(резорцина)
и
в
провести
АР
и
их
окислительносравнение
с
экспериментальными данными;
4) для наиболее реакционноспособного АР провести идентификацию
основных продуктов окисления с помощью методов газовой
хроматографии,
масс-спектрометрии
и
инфракрасной
фурье-
спектроскопии.
Научная новизна
Впервые предпринято систематическое сравнительное исследование
окислительно-восстановительных процессов, протекающих в слабокислых
водных средах с участием ряда алкилрезорцинов различной химической
структуры и железа(III). На основании полученных экспериментальных
11
данных впервые обнаружены существенные отличия кинетики изученных
редокс-процессов в зависимости от длины алкильного заместителя (С1 – С3 –
С6) и его положения в молекулах АР, а также показано соответствие
полученных экспериментальных данных по кинетике окисления АР в
присутствии
способности,
железа(III)
общему
предсказанной
на
тренду
изменения
основании
их
реакционной
выполненных
квантово-
химических расчетов адиабатических потенциалов ионизации молекул АР и,
для сравнения, их неалкилированного аналога (резорцина).
Для наиболее быстро окисляющегося АР (4-н-гексилрезорцина) впервые
установлены границы кислотности, в которых его окисление железом(III)
протекает с заметной скоростью, и показано, что первичной стадией его
окисления железом(III) в указанных условиях (при pH~3) является
дополнительное гидроксилирование ароматического цикла, что аналогично
описанному в литературе пути ферментативного окисления некоторых АР в
нейтральных средах.
Научно-практическая значимость
Результаты проведенных исследований позволяют прогнозировать
относительную устойчивость алкилрезорцинов различного химического
строения и возможность их абиотических (химических) превращений,
моделирующих процессы, протекающие в реальных природных условиях
(кислые почвы и водоносные слои), и косвенно влияющих на микробный
обмен данными молекулярными сигналами. Полученные новые сведения
также расширяют представления о роли абиотических факторов окружающей
среды в экологии почвенных микроорганизмов, заключающейся во влиянии
внешних условий среды на процессы молекулярного сигналинга и
ауторегуляции посредством химической модификации или деструкции
молекул ауторегуляторов.
12
Полученные в рамках данной работы результаты квантово-химических
исследований относительной химической активности ряда изученных
алкилрезорцинов (а также их неалкилированного аналога – резорцина)
используются в учебном процессе при чтении дисциплин «Физические
методы
исследования»,
«“Зелёная”
химия
и
дизайн
лекарств»,
«Аналитическая и структурная химия органических соединений» студентамхимикам на кафедре аналитической и экологической химии Института химии
Федерального
государственного
бюджетного
учреждения
высшего
профессионального образования «Саратовский государственный университет
им. Н.Г. Чернышевского».
На
защиту
выносятся
следующие
основные
результаты
и
положения:
1) результаты исследований восстановления железа(III) в водной среде
при pH~3 на воздухе в присутствии алкилрезорцинов (5-метилрезорцина, 5-нпропилрезорцина или 4-н-гексилрезорцина) до соединений железа(II);
2) влияние структуры молекул алкилрезорцинов (длины и положения
алкильного заместителя) на кинетику их окисления железом(III) в водных
средах при pH~3;
3) влияние скорости взаимодействия 4-н-гексилрезорцина, наиболее
быстро окисляющегося в ряду изученных алкилрезорцинов, с железом(III) от
pH среды (скорость максимальна при pH ≤ 3.0, резко уменьшается при pH > 3
и практически равна нулю при pH~4 и выше; при повторном снижении
величины pH до pH < 3 реакция возобновляется с относительно меньшей
скоростью);
4) результаты квантово-химических расчетов адиабатических
потенциалов ионизации исследованных алкилрезорцинов, а также их
неалкилированного аналога – резорцина (4-н-гексилрезорцин является
наиболее склонным к окислению, а резорцин – наименее);
13
5) экспериментально установленный факт, что доминирующим
процессом окисления 4-н-гексилрезорцина железом(III) при pH~3 в водной
среде на воздухе является гидроксилирование ароматического кольца.
Связь автора с научными программами и личный вклад автора
Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на
результатах собственных исследований автора, участвовавшего на всех
этапах в планировании и проведении экспериментов и расчетов, обсуждении
полученных
результатов,
публикаций.
На
защиту
формулировании
вынесены
только
выводов
те
и
подготовке
положения,
которые
сформулированы в процессе выполнения автором данного диссертационного
исследования.
Основная часть исследований автора, проведенных в лаборатории
биохимии ИБФРМ РАН (г. Саратов), в том числе при обучении в
аспирантуре в течение 2010–2013 гг., выполнялась в рамках следующих
госбюджетных тем НИР: «Биополимеры и низкомолекулярные соединения во
взаимодействии растений и микроорганизмов» (2009–2012 гг.; номер
госрегистрации 01200904391); «Роль биомакромолекул и низкомолекулярных
веществ в механизмах адаптации растительно-микробных ассоциаций в
составе антропобиоценозов к условиям аридного климата» (2013–2015 гг.;
номер госрегистрации 01201359049); научный руководитель указанных
госбюджетных тем НИР – заведующий лабораторией биохимии ИБФРМ
РАН, Заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук,
профессор В.В. Игнатов.
В 2011 г. автор проходил краткосрочную научную стажировку по
тематике диссертационного исследования в Лаборатории ядерной химии
Института химии Университета им. Л. Этвеша (Будапешт, Венгрия) с
участием в совместных научных исследованиях в рамках двустороннего
международного проекта № 28, осуществлявшегося в соответствии с
14
Соглашением о научном сотрудничестве между Российской академией наук
(РАН) и Венгерской академией наук (ВАН) на 2011–2013 гг. (руководители
проекта: с российской стороны – д.х.н. профессор А.А. Камнев; с венгерской
стороны – профессор, академик ВАН А. Вертеш (A. Vértes; в течение 2011
г.); профессор З. Хомоннаи (Z. Homonnay)).
Благодарности
Автор выражает глубокую признательность сотрудникам ИБФРМ РАН
(Саратов): своему научному руководителю д.х.н. профессору А.А. Камневу, а
также к.б.н. А.В. Тугаровой и к.б.н. Т.Е. Пылаеву за помощь в подготовке и
проведении некоторых экспериментальных работ; профессору кафедры
аналитической и экологической химии Института химии Федерального
государственного бюджетного учреждения высшего профессионального
образования
«Саратовский
государственный
университет
им.
Н.Г.
Чернышевского» д.х.н., профессору А.Н. Панкратову за помощь в
проведении
и
интерпретации
результатов
квантово-химических
исследований (расчетов адиабатических потенциалов ионизации ряда
исследуемых соединений и их обсуждения). Автор благодарен к.х.н. А.Г.
Щелочкову (Экспертно-криминалистический центр ГУ МВД РФ по
Саратовской области, г. Саратов) за помощь в проведении хромато-массспектрометрических
и
ИК-спектроскопических
измерений,
а
также
обсуждения отдельных этапов работы.
Автор также благодарит сотрудников Лаборатории ядерной химии
Института химии Университета им. Л. Этвеша (г. Будапешт, Венгрия) д-ра К.
Ковач (K. Kovács) и профессора Э. Кузманна (E. Kuzmann), а также
директора Института химии Университета им. Л. Этвеша профессора З.
Хомоннаи (Z. Homonnay) за любезно предоставленную возможность
использовать оборудование лаборатории и некоторые материалы (в
частности, препараты, обогащенные изотопом
57
Fe), помощь и советы при
15
проведении
экспериментальных
измерений
методом
мёссбауэровской
спектроскопии, обработке и анализе экспериментальных данных, а также при
обсуждении
результатов
совместных
исследований
и
подготовке
публикаций.
Апробация работы
Материалы исследований по теме диссертационной работы были
представлены и обсуждались на следующих научных мероприятиях: V
Всероссийская конференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия
микроорганизмов и растений с окружающей средой», г. Саратов, 28 сентября
– 1 октября 2010 г.; 5th Central-European Conference “Chemistry towards
Biology”, September 8–11, 2010, Primošten, Croatia; 4th European Conference on
Chemistry for Life Sciences, August 31 – September 3, 2011, Budapest, Hungary;
XII Международная конференция “Мёссбауэровская спектроскопия и её
применения”, г. Суздаль, Россия, 06–10 октября 2012 г.; Colloquium
Spectroscopicum Internationale XXXVIII, June 16–20, 2013, Tromsø, Norway.
Публикации
Основные результаты диссертационного исследования изложены в 11
печатных работах, в числе которых 3 статьи в рецензируемых научных
журналах из списка изданий, рекомендованных ВАК РФ для публикации
результатов диссертационных исследований, одна статья в сборнике
рецензируемых
трудов
международной
конференции,
а
также
7
опубликованных тезисов докладов.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 129 страницах компьютерного текста и
состоит из введения, 3-х глав, включая обзор литературы, описание
материалов и методов, главу результатов собственных исследований,
16
состоящую из 9 разделов; заключения, выводов, списка использованных
источников, содержащего 130 ссылок на публикации отечественных и
зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 4 таблицами и 29
рисунками.
17
Глава 1. Химические свойства и биологические функции
фенольных соединений и их алкилированных производных
(обзор литературы)
1.1. Химические свойства и биосинтез фенольных соединений.
Многоатомные фенолы
Фенольные
соединения
представляют
собой
большую
группу
соединений, широко распространенных в растительном и животном мире, в
котором они имеют целый ряд функций, отвечающих за рост, развитие и
защиту. Подавляющее большинство фенольных соединений имеют именно
растительное происхождение [1, 2]. Эти природные продукты включают в
себя сигнальные молекулы, пигменты и иного вида ароматические
соединения, которые могут защитить растения от насекомых, грибов,
бактерий и вирусов, а также организмы от повреждающего химического или
физико-химического воздействия агрессивных сред, излучений или иных
повреждающих факторов, имеющих, в первую очередь, окислительную
природу [36]. Данная группа включает в себя как простые фенолы и
полифенолы, так и их производные. В целом, термины «фенолы» или
«фенольные соединения» могут быть определены как химические вещества
ароматической
природы,
которые
содержат
одну
или
несколько
гидроксильных групп, связанных с атомами углерода ароматического кольца.
Эту группу широко распространенных в природе химических соединений во
многих биологических источниках описывают как «вторичные метаболиты»,
что предполагает их менее важную роль в клеточной физиологии и
биохимии.
В настоящее время выявлены два основных пути образования
фенольных соединений: через шикимовую кислоту (шикиматный) и
18
ацетатно-малонатный
биосинтеза
фенольных
(поликетидный).
соединений
по
Исходными
соединениями
шикиматному
пути
служат
фосфоенолпировиноградная кислота (фосфоенолпируват) и эритрозо-4фосфат, образующиеся соответственно при гликолизе и в пентозо-фосфатном
цикле при фотосинтезе. При их конденсации возникает семиуглеродное
соединение – 2-кето-3-дезокси-7-фосфоарабогептоновая кислота. Фермент
синтетаза осуществляет циклизацию кислоты в 5-дегидро-хинную кислоту
(рис. 1, соединение I), которая способна затем превращаться в хинную
кислоту либо, после дегидратации, в 5-дегидро-шикимовую кислоту
(соединение
II).
Последняя,
в
присутствии
фермента
редуктазы,
восстанавливается в шикимовую кислоту (соединение III):
Рис. 1. Образование шикимовой кислоты – предшественника фенольных
соединений
Шикимовая кислота имеет шестичленное кольцо, в котором имеется
лишь одна двойная связь, и она достаточно легко химическим путем может
быть переведена в соединения ароматического ряда. Из нее возможно
образование простых фенольных соединений ряда С6 – С1, например, пгидроксибензойной, протокатеховой и галловой кислот, а в дальнейшем и
дубильных веществ гидролизуемой группы (рис. 2).
19
Рис. 2. Шикиматный путь биосинтеза фенольных соединений
Однако в растительной и микробной клетке превращение шикимовой
кислоты в ароматические соединения идет значительно сложнее; процесс
этот многоступенчатый и протекает с участием аденозинтрифосфата (АТФ) с
образованием 5-фосфо-шикимовой кислоты (IV), а затем через несколько
стадий получается неустойчивое соединение — префеновая кислота (V). На
стадии префеновой кислоты пути биосинтеза расходятся. По первому пути
идет синтез фенилпировиноградной кислоты (VI), а по другому – поксифенилпировиноградной
кислоты
(VII).
При
аминировании
двух
последних веществ образуются α-аминокислоты – фенилаланин (VIII) и Lтирозин (IX). Данные аминокислоты могут участвовать в биосинтезе белков
и некоторых групп алкалоидов при дезаминировании аминокислот в
присутствии ферментов – аммонийлиаз – с получением транс-коричной и
транс-гидроксикоричной кислот (соединения X и XI, соответственно; см.
рис. 2).
Из
коричных
кислот
с
помощью
гидроксилирующих
и
метоксилирующих ферментов синтезируются соединения фенилпропанового
20
ряда – оксикоричные кислоты (например, кофейная, феруловая, синаповая) и
кумарины.
Второй путь – ацетатно-малонатный – связан с промежуточным
синтезом поликетометиленовых (поликетидных) предшественников (см.,
схему биосинтеза алкилрезорцинов и резорциновых кислот, рис. 3).
Рис. 3. Схема биосинтеза алкилрезорцинов и резорциновых кислот в
соответствии с ацетатно-малонатным (поликетидным) путём [7]
21
Исходный продукт для данного пути – ацилкоэнзим А (ацил-СоА) –
образуется в результате гликолиза сахаров и содержит макроэргическую
тиоэфирную связь. Ацил-СоА при участии карбоксилазы и АТФ в
присутствии ионов Mn2+ превращается в малонил-ацил-СоА. Таким путем
при постепенном наращивании углеродной цепи возникает поли-(3)кетометиленовая цепочка.
Циклизация поликетидной цепи приводит к образованию различных по
химической структуре фенольных соединений. Так, циклизация по С1- и С6атомам
приводит
к
синтезу
производных
флороглюцина
(1,3,5-
тригидроксибензола), а циклизация по C2- и С7-атомам – к возникновению
производных орселлиновой кислоты, которая является исходным продуктом
в биогенезе лишайниковых кислот.
Ацетатно-малонатный путь биосинтеза фенольных соединений широко
распространен у грибов, лишайников и микроорганизмов. У высших
растений он обычно реализуется в сочетании с шикиматным путем в
биосинтезе флавоноидов и антрахинонов. Надо заметить, что синтез
флавоноидных соединений – характерная особенность высших растений.
Опыты
с
меченными
по
углероду
14
С
продуктами
показали,
что
фенилпропановый скелет (кольцо B и трехуглеродный фрагмент) происходит
от п-кумаровой кислоты, которая получается шикиматным путем. С другой
стороны, кольцо А синтезируется по ацетатно-малонатному пути из трех
молекул малонил-СоА.
В результате взаимодействия п-кумароил-СоА с тремя молекулами
малонил-СоА образуется халкон или флаванон (рис. 4).
22
Рис. 4. Пути образования флавоноидных соединений
Природа первичного продукта циклизации пока не уточнена, что
объясняется легкостью взаимопревращений халконов и флаванонов. Из
последних образуются все остальные группы флавоноидов.
Флавоноиды – на сегодняшний день самая большая группа фенольных
соединений. Среди природных фенольных соединений распространены
фенолы с одним кольцом, а также их производные – фенольные липиды или
длинноцепочечные фенолы [8]. Они представляют собой амфифильные
соединения неизопреноидной природы, боковые цепи которых связаны с
бензольным кольцом и, как полагают, также образуемые поликетидным
путем,
как,
например,
6-пентадецилсалициловые
кислоты.
Такие
неизопреноидные фенольные липиды иногда могут рассматриваться как
жирные кислоты с карбоксильной группой вместо гидроксибензольного
кольца. Таким образом, они являются производными как моно-, так и
дигидроксифенолов, а именно, в последнем случае, – пирокатехина,
резорцина и гидрохинона. Биосинтез этих соединений рассмотрен в недавних
обзорах [8–11].
23
Биосинтез и химические функции алкилрезорцинов описаны в работах
[8,
9,
12].
Междисциплинарный
интерес,
помимо
чистой
химии,
алкилрезорцины представляют для сельскохозяйственных, биомедицинских
наук, а также в пищевой промышленности.
Ряд биологически важных природных фенолов содержат свыше одной
гидроксильной группы, хотя некоторые из этих групп могут быть
превращены в простые или сложные эфиры. Многоатомные фенолы обычно
носят тривиальные, а не систематические названия. Так, например, в случае
двух гидроксо-групп о-, м- и п-фенолы чаще называют пирокатехином,
резорцином и гидрохиноном соответственно. Многоатомные фенолы в
основном встречаются в растениях, и лишь иногда обнаруживаются в
животных организмах [13]. На рис. 5 приведены схемы химического синтеза
этих соединений.
Интересующие нас в данной работе алкилированные производные
резорцина, в частности, 4-н-гексилрезорцин, химическим путем получают
взаимодействием резорцина с соответствующими карбоновыми кислотами в
присутствии катализатора ZnCl2, в соответствии с нижеприведенной общей
схемой [13] (рис. 6).
24
Рис. 5. Химический синтез многоатомных фенолов
OH
OH
OH
С5H11COOH
OH
ZnCl 2
[H]
OH
Ni
COC 5H11
Рис. 6. Химический синтез 4-н-гексилрезорцина
OH
C6H13
25
1.2. Регуляторные функции фенольных соединений
Как известно, естественной защитой многих микроорганизмов от
воздействия негативных факторов являются гипометаболизм и анабиоз. При
этих состояниях в клетках повышается содержание алкилированных
фенолов, представляющих собой ауторегуляторы процессов роста и развития
микроорганизмов и обладающих выраженной антиоксидантной активностью.
Установлено, что алкилированные фенолы, включая АР, регулируют рост
численности
клеток
в
микробной
культуре,
ингибируют
споровые
прорастания и индуцируют развитие анабиотического состояния клеток.
Снижение метаболической активности клеток происходит вследствие
образования комплексов алкилированных фенолов с фосфолипидами
клеточных мембран и ферментами. Однако химические свойства продуктов,
образующихся при действии на алкилированные фенолы таких физикохимических факторов, как свет, радиация, окислители (О2 и Н2О2) и ионы
металлов, пока еще изучены недостаточно.
К настоящему времени накоплено много доказательств существования у
микроорганизмов (как и у других живых организмов) специализированных
ауторегуляторных систем, обеспечивающих межклеточную коммуникацию и
контролирующих поведение микробной популяции в целом в соответствии с
постоянно меняющимися условиями окружения, которые составляют
природный фон стрессорных воздействий. Для многих типов внеклеточных
ауторегуляторов известны химическая структура, феноменологические и
физиологические эффекты их действия; для некоторых показана их
функциональная активность в генетических механизмах адаптационного
ответа клеток, установлена роль в регуляции стадийности развития культур,
цитодифференцировке, вторичных синтезах [14].
Основной
функцией
внеклеточных
ауторегуляторов
является
обеспечение межклеточных взаимодействий, а также взаимодействий клеток
26
со средой, которые направлены на успешный рост микроорганизмов или
сохранение вида в неблагоприятных для роста условиях. С этих позиций все
ауторегуляторные
метаболиты
являются
адаптогенами,
однако
типы
взаимодействий, которые они контролируют, различаются, что определяется
целевым
биологическим
тестированием.
При
смене
биотеста
часто
выявляется новая функция биорегулятора; следовательно, многие из них
имеют многофункциональный (плейотропный) характер действия.
Более других изучены ауторегуляторы, адаптирующие микроорганизмы
к «запланированным стрессам», которые имеют место в онтогенезе развития
микробных культур [15, 16]. К данным видам стресса относятся стресс новой
среды, возникающий при перенесении старых или покоящихся клеток в
свежую среду, благоприятную для роста, и стрессы, обусловленные
исчерпанием источников питания (трофический стресс) или пространства
(критически высокая клеточная плотность), т.е. условия, в которых культура
завершает свой цикл развития, и которые часто объединяются термином
«стресс голодания» («starvation stress»).
Важными
свойствами
метаболизируемость,
необходимых
ауторегуляторов
благодаря
концентрациях,
чему
и
они
являются
могут
дозозависимый
их
низкая
накапливаться
эффект
в
действия
(чувствительности к ним клеток-реципиентов); зависимость их внеклеточных
концентраций от количества синтезирующих их клеток, другими словами, от
клеточной плотности популяции. Как синтетическая способность, так и
компетентность (чувствительность) клеток к рецепции внеклеточного
молекулярного сигнала зависят от фенотипических свойств клеток и их
физиологического возраста (стадии развития и фазы роста культуры) и
отражают гетерогенность популяции.
27
1.3. Антиоксидантные свойства фенольных соединений
В
процессе
воздействию
жизнедеятельности
многих
негативных
живые
факторов,
организмы
в
подвергаются
результате
чего
они
переживают стрессовые состояния. При этом в некоторых случаях
происходит нарушение окислительно-восстановительных процессов, в связи,
с чем чрезвычайно актуальными проблемами являются поиск и изучение
свойств биологически активных соединений-антиоксидантов, а также
изучение механизмов повышения устойчивости и метаболической адаптации
клеток к стрессовым воздействиям [17].
К числу ярко выраженных природных антиоксидантов относят
фенольные соединения, характерной особенностью которых является
способность к взаимодействию с белками посредством водородных и (или)
гидрофобных связей, а также с ионами металлов с образованием комплексов
различного строения. Сами фенолы легко окисляются кислородом воздуха,
при этом возникают активные промежуточные соединения; некоторые из них
тоже обладают антиокислительными свойствами [6].
Алкилированные
фенолы,
как
и
другие
природные
фенольные
соединения, обладают способностью защищать клеточные компоненты от
окислительных
процессов
[18].
Было
продемонстрировано,
что
длинноцепочечные 5-н-алк(ен)илрезорцины и их гомологи предотвращают
Fe2+-индуцированное пероксидное окисление липидов и фосфолипидов в
липосомальной мембране in vitro [19], а также предотвращают пероксидное
окисление липидов в мембранах клеток in vivo [20, 21]. При концентрациях
10–3–10–4 М бактериальные [22] и растительные [23] АР полностью
ингибировали Fe2+-индуцированное пероксидное окисление в микросомах
печени и фрагментах саркоплазматического ретикулума. Длинноцепочечные
АР растительного происхождения были также эффективны в защите мембран
эритроцитов против H2O2-индуцированного окисления [24].
28
Механизм антиоксидантного действия алкилированных фенолов в
физиологических
условиях
может
включать
дополнительное
гидроксилирование бензольного кольца с образованием, в случае 5алкилрезорцинов,
промежуточного
1,2,4-тригидрокси-6-алкилбензола
в
качестве первого продукта окисления [1, 25] (рис. 7). Это соединение, в свою
очередь, из-за легкого образования о- и п-хинонов при последующем
окислении, может действовать в дальнейшем в качестве более эффективного
антиоксиданта [26]. Кроме того, фенольное кольцо с длинной алифатической
боковой цепью играет важную роль в антиоксидантной активности
резорцинольных липидов. Так, орцин (5-метилрезорцин; 1,3-дигидрокси-5метилбензол) проявляет антиоксидантную активность при концентрации, по
крайней
мере,
на
один
порядок
выше,
чем
у
1,3-дигидрокси-5-
пентадецилбензола и высших гомологов, выделенных из зерновых. Следует,
однако, заметить, что это свойство может быть связано с повышенной
способностью молекул АР с длинной алифатической боковой цепью, в
отличие от АР с короткими алкильными заместителями, взаимодействовать с
мембранами клеток и, таким образом, искусственно «увеличивать свою
концентрацию»
непосредственно
на
поверхности
биологических
надмолекулярных структур, обеспечивая их повышенную защиту.
29
Рис. 7. Продукты окисления 5-н-алкилрезорцинов
Так, к примеру, в работах [27, 28] было проведено изучение
антиокислительной активности производных АР с длинными алкильными
заместителями по сравнению с такими популярными антиоксидантами, как
антоцианы, триптофан, токоферол и др. Авторы работы [27], используя две
модельные системы – с 2,2’-дифенил-1-пикрилгидразил-радикалом (ДФПГ;
DPPH) для оценки восстановительной (Н-донорной) способности, а также
модельную систему с окислением триацилглицеридных липидов для оценки
антирадикальной активности, – показали, что в обеих модельных системах 5н-пентадецилрезорцин был гораздо менее активен, чем α-токоферол,
показывая очень низкую Н-донорную способность и антирадикальную
активность по отношению к пероксил-радикалам. Авторы недавней работы
[28], отмечая, что выделенные экстракцией 80%-ным этанолом из пшеницы
АР были среди наиболее активных антиоксидантов по данным теста с
тролоксом в качестве эквивалента (“TEAC assay”), тем не менее, заметили,
что этот результат мог быть лишь следствием побочной цветной реакции, а
не собственно результатом обесцвечивания используемого в данном тесте
катион-радикала ABTS+ (ABTS – 2,2′-азино-бис(3-этилбензтиазолино-6сульфоновая кислота)). Данный вывод очень важен в отношении правильной
интерпретации данных различных антиокислительных и антирадикальных
тестов с участием АР различного строения.
Тем
не
менее,
предобработка
в
статье
[29]
длинноцепочечными
было
продемонстрировано,
растительными
АР
что
клеток
феохромоцитомы крыс (линии PC-12 AC) предотвращает их от повреждения
свободными радикалами при использовании прооксидантов. Более того, по
данным [30], подобные длинноцепочечные 5-н-АР способны ингибировать
Cu-индуцированное окисление липопротеидов низкой плотности в клетках
человека in vitro.
30
1.4. Химические и биохимические свойства алкилрезорцинов в
биологических системах
Наиболее часто встречающимися фенольными липидами являются
резорцинольные липиды, присутствующие в различных живых организмах и
представленные широким спектром гомологов и изомеров [1, 31]. Как
отмечалось выше, фенольные липиды, имеющие н-алкильный заместитель
(например, в положении 5 (гидрофобный «хвост»)) и две OH-группы в
положениях 1 и 3 (т.е. в мета-положении) (гидрофильная «голова», рис. 8),
называют алкилрезорцинами (АР). Следует заметить, что в русскоязычной
литературе (особенно микробиологической) чаще используется термин
“алкилоксибензолы” (и его аббревиатура – АОБ), которым обозначают и АР,
хотя АОБ – по сути, более широкий термин, включающий алкилированные
фенолы с различным количеством гидроксо-групп.
Орцин (5-метилрезорцин) – самый простой гомолог 1,3-дигидрокси-5-налк(ен)илбензольной серии. Их природные гомологи отличаются длиной
алкильного «хвоста» (чаще всего 11–29 атомов углерода) и степенью
ненасыщенности (0–4 двойные связи). Эти соединения имеют выраженный
амфифильный характер, что является следствием наличия как гидрофильных,
так и гидрофобных областей.
31
Рис. 8. Химическая структура 5-н-алкилрезорцинов
Имеющие
длинные
алк(ен)ильные
заместители
АР
практически
нерастворимы в воде и имеют очень низкие критические константы
мицеллообразования в диапазоне 4.5–8.5 нМ, которые варьируют в
зависимости от длины «хвоста» и степени ненасыщенности. Гидрофобность
этих
соединений
выражается
в
высоких
значениях
коэффициентов
распределения октанол/вода, чем легко объяснить присутствие их в
фосфолипидном бислое. Растения способны увеличить полярность этих
веществ путем гликозилирования, как это было показано для 5-н-АР в
листьях Grevillea robusta и корневых побегах риса [32, 33].
Необходимо также сказать, что алкилированные фенолы, относящиеся к
алкилрезорцинам, широко распространены в природе у организмов разных
уровней организации. Представители фенольных липидов были обнаружены
в высших растениях. Первым видом, в котором были найдены представители
резорцинольных липидов, стало растение Ginkgo biloba (Ginkgoaceae) [34].
Среди злаковых, широко используемых в пищу человеком, алкилрезорцины в
значимых концентрациях присутствуют в семенах пшеницы (Triticum
aestivum, Triticum durum), ржи (Secale cereale), тритикале, в невысоких – в
горохе (Pisum sativum), ячмене (Hordeum vulgare). Их наличие было
обнаружено и у других высших и низших растений, грибов [35]. Среди
животных фенольные липиды найдены лишь у морских губок.
В многочисленных работах показана роль ауторегуляторных факторов в
регуляции метаболизма микробных клеток. Следует еще раз подчеркнуть,
что алкилированные фенолы (и, в частности, АР), являясь продуктами
липидного обмена, плохо метаболизируются, что обеспечивает возможность
их накопления в микробных культурах. Аккумулируясь в клетках, данные
ауторегуляторы
индуцируют
развитие
у
микроорганизмов
гипометаболического или анабиотического состояния в зависимости от их
32
концентрации. При этом следует отметить, что чувствительность культуры к
одной и той же дополнительно вносимой концентрации ауторегулятора
возрастает по мере ее «старения», что может быть объяснено повышением
нативного уровня фактора в развивающейся культуре и (или) понижением
способности клеток к его метаболизации [36].
1.5. Функции внеклеточных ауторегуляторов микроорганизмов
В последнее десятилетие большое внимание уделяется одному из типов
плотностной регуляции роста микробных культур, получившему название
“quorum sensing” (QS, «ощущение кворума»). Эта ауторегуляторная система
построена на «ощущении минимума клеток – кворума», который необходим
для
включения
экспрессии
генов
(запуска)
бактерии,
совокупности
молекулярных
функционирующих
только
механизмов
в
условиях
определенной высокой плотности популяции – того самого «кворума» [16]. В
самом общем виде QS – это способность бактерий координировать поведение
с помощью передачи сигналов молекулами.
Сигнальными молекулами (т.е. своеобразным «химическим языком») в
QS-системах могут быть соединения различной химической природы.
Структуры некоторых из описанных в литературе сигнальных молекул
микроорганизмов и их химических аналогов приведены на рис. 9.
Если сигнальные метаболиты QS-систем позволяют «оценивать»
минимальную плотность клеточной популяции, достаточную для активации
собственного синтеза (аутоиндукция) и последующей экспрессии ряда генов,
ассоциированных со стационарной фазой, то другой тип ауторегуляторов,
также с плотностными функциями, контролирует максимально возможную
для данных условий численность клеток в пролиферирующей культуре, при
которой она переходит в стационарную фазу. К такого типа ауторегуляторам
относятся факторы d1 (фd1) – производные алкилированных фенолов.
33
Повышение их внеклеточной концентрации до критического уровня
обусловливает прекращение деления клеток и переход культуры в
стационарную фазу [37], а дальнейший рост концентраций фd1 индуцирует
переход части клеток в популяции (компетентных к действию фd1) в
анабиотическое состояние, сопровождающее образование покоящихся форм.
В связи с последней функцией они были названы аутоиндукторами анабиоза
[37]. Совокупно с факторами d2 (аутоиндукторами автолиза) [38] они
составляют кооперативную систему ауторегуляции развития микробных
культур, которая обнаружена у представителей разных таксономических
групп прокариот и эукариот.
Рис. 9. Структура некоторых из известных сигнальных молекул
микроорганизмов и их химических аналогов, включая алкилрезорцины
Как отмечено выше, ауторегуляторные факторы d1 (дифференцировки
клеток) микроорганизмов по своей химической природе относятся к
производным
алкилированных
фенолов.
Эти
сигнальные
молекулы
34
присутствуют в культурах микроорганизмов в виде смеси изомеров и
гомологов,
различающихся
положением
и
числом
заместителей
в
ароматическом кольце, а также конфигурацией и длиной алкильного
радикала. Они представлены у Pseudomonas carboxydoflava гомологами 5-ннонадецил- и 5-н-генейкозилрезорцинов [39]; у Bacillus cereus – смесью
изомеров и гомологов фенил-метанол-(3,5-диметокси)-2-метилпропила [40];
у Micrococcus luteus – смесью изомеров и гомологов алкилрезорцинов с
заместителями в положениях 2 и 4 [41]; у дрожжей Saccharomyces cerevisiae –
2-(4-гидроксифенил)-этан-1-олом (тирозолом) [42]. Как отмечено выше,
производные алкилированных фенолов группы алкилрезорцинов широко
распространены в природе и обнаружены не только у микроорганизмов, но и
в растениях, преимущественно в семенах [43], что позволяет проводить
аналогию их функции в регуляции стрессового ответа и контроле
покоящегося состояния у микроорганизмов и у растений.
Таким
образом,
внеклеточные
ауторегуляторы
микроорганизмов
обладают полимодальными функциями: амфифильность, антиоксидантная
активность, реакционная способность, поликристаллизация мембранных
липидов, повышение проницаемости мембран для моновалентных ионов,
индукция дегидратации клеток, стабилизация ферментов, сопряженная с
изменением их каталитической активности, ауторегуляция роста микробных
культур, аутоиндукция анабиоза, аутоингибирование спорового прорастания.
Проявление той или иной из них зависит от концентрации ауторегулятора,
структурно-функционального состяния молекул или клеток-рецепиентов и
факторов окружающей среды [44].
1.6. Свойства алкилированных фенолов как адаптогенов
35
Химическая структура фd1 – алкилированных фенолов (в частности,
гомологов и изомеров алкилрезорцинов) определяет их свойства, важные для
функционирования в качестве адаптогенов:
1) реакционную способность в процессах комплексообразования с
мембранными липидами и клеточными биополимерами (за счет слабых
гидрофобных и электростатических взаимодействий, а также образования
водородных связей), что обусловливает изменения структурной организации
и,
вследствие
этого,
функциональной
активности
мембран
и
биомакромолекул;
2) различия в степени полярности и гидрофобности, что влияет на
свойства алкилированных фенолов (АР) как лигандов при их взаимодействии
с субклеточными структурами;
3) амфифильность, обусловливающую способность алкилированных
фенолов перемещаться в системе «липид–вода» и проникать в клетку без
участия ацилпереносящих белков;
4) способность к многостадийному окислению и, следовательно,
антирадикальную активность, что определяет важную роль алкилированных
фенолов в неферментативной системе антиоксидантной защиты клеток.
В зависимости от степени гидрофобности изомеров и гомологов и
протонирования
компонентов
среды,
алкилированные
фенолы
преимущественно транспонируются к липофильной фазе и связываются с
мембранными липидами или клеточными биополимерами при рН < 7.0 или
переходят в водную фазу при рН > 7.0 [45]. Аккумулируясь в клетках,
алкилированные фенолы вызывают следующие изменения: повышение
микровязкости мембран [46]; изменение ионного транспорта и водного
баланса клетки, ее дегидратацию [47]; снижение функциональной активности
мембран, в том числе – ферментов электрон-транспортной цепи [47];
повышение в клетках уровня ионов кальция, участвующих в стабилизации
субклеточных структур и системе внутриклеточных эффекторов [48].
36
Образуя
комплексы
с
ферментами
(и
другими
белками),
алкилированные фенолы изменяют конформацию биомакромолекул, что
приводит к повышению стабильности последних (функции химических
шаперонов)
и
изменению
функциональной
активности
[49].
Вектор
изменения активности зависит от степени гидрофобности различных
гомологов алкилированных фенолов и их концентраций. Поэтому для их
регуляторных эффектов важны как их уровень в развивающейся культуре,
так и изменения в качественном составе изомеров и гомологов. При
взаимодействии с ДНК молекулы алкилированных фенолов стабилизируют
ее структуру, влияют на структурную организацию надмолекулярных
комплексов ДНК и транскрипционную активность [44].
Благодаря
этим
свойствам
алкилированные
фенолы
(фd1)
либо
аккумулируются в клетках, индуцируя развитие стрессового ответа и
развитие гипометаболического состояния (в концентрациях 10–5 ÷ 10–4 M), а в
более высоких концентрациях (10–4 ÷ 10–3 М) – анабиотического состояния,
либо высвобождаются в среду, что приводит к снятию метаболического
блока в клетках. Однако если плотность клеток бактерий (стационарных или
покоящихся) велика, то концентрация высвобождающихся фd1 также высока,
и при сверхпороговой плотности клеток инокулята рост ингибируется
критически высоким уровнем фd1.
1.7. Физико-химическое взаимодействие алкилированных фенолов с
нуклеиновыми кислотами
Ауторегуляторные d1-факторы микроорганизмов, представленные у ряда
бактерий и дрожжей соединениями группы алкилированных фенолов [38–
42], проявляют способность к физико-химическим взаимодействиям с
широким кругом (макро)молекул, что ведет к формированию целого спектра
биологических
эффектов.
В
частности,
результатом
взаимодействия
37
алкилированных фенолов с мембранными липидами является повышение
микровязкости мембран вплоть до поликристаллизации липидной стромы
[47–49].
Комплексообразование
алкилированных
фенолов
с
белками
обусловливает повышение их стабильности (шаперонный эффект), что в
случае ферментных белков сопряжено с неспецифическим снижением или
повышением
их
ферментативной
активности
в
зависимости
от
гидрофобности алкилированного фенола как лиганда и его концентрации
[48].
Показанная
ранее
способность
алкилированных
фенолов
к
взаимодействию с ДНК проявляется в развитии как мутагенных, так и
антимутагенных эффектов, что также зависит от их структуры.
АР могут повлиять на структуру и метаболизм нуклеиновых кислот. Они
способны как ингибировать синтез ДНК и РНК [50], так и вызвать разрыв
цепей ДНК [51]. Этот процесс, в частности, происходит в присутствии меди
и АР [52]. Гидроксилирование молекул 5-AР в присутствии меди(II) и O2
приводит к образованию 6-алкил-1,2,4-тригидроксибензола. Катехольный
фрагмент этих молекул окисляется медью(II), происходит синтез хинона с
последующим образованием активных форм кислорода и алкилирование
ДНК. Было показано, что ДНК-связывание опосредовано алкильным
заместителем АР и становится более эффективным, когда длина цепи
увеличивается. Образование пероксида водорода и гидроксильной группы
необходимо для расщепления ДНК.
АР могут препятствовать репарации ДНК ферментом ДНК-полимеразой.
Бис-АР
являются
более
эффективными
при
расщеплении
ДНК
и
ингибировании указанного фермента, чем 5-АР [53]. ДНК-полимераза
предотвращает повреждения, вызванные веществами, используемыми в
качестве противоопухолевых агентов, таких как цисплатин и блеомицин. За
счет АР и их производных может быть увеличена эффективность этих
противоопухолевых препаратов. Другие исследования показали, что АР
38
могут
являться
активными
конкурентными
ингибиторами
обратной
транскриптазы [54] и глицерол-3-фосфатдегидрогеназы [55, 56]. Кроме того,
АР способны ингибировать активность некоторых других ферментов. Этот
эффект может быть вызван прямым связыванием этих соединений с
гидрофобной областью белков, особенно вблизи остатков триптофана [57].
АР способны уменьшить мутагенную активность некоторых косвенных
мутагенов, тогда как воздействие их на прямые мутагены менее выражено.
По сравнению с антоцианами, АР являются сильными ингибиторами
скорости
и
частоты
индуцированных
мутаций
в
лимфоцитах.
Противоопухолевый эффект АР заключается в способности этих соединений
усиливать апоптоз в поврежденных клетках [58]. Хотя антимутагенная и
противоопухолевая
активность
АР
неплохо
изучены,
необходимы
дополнительные исследования, чтобы определить реальное воздействие этих
молекул in vivo.
На клеточном уровне наиболее общим и универсальным эффектом
алкилированных
фенолов
является
повышение
устойчивости
взаимодействующих с ними субклеточных структур и клетки в целом к
повреждающим воздействиям окружающей среды, что важно и экологически
значимо для развития стрессоустойчивости микроорганизмов и перехода
клеток в состояние анабиоза при образовании покоящихся форм. При этом
одной из хорошо документированных сторон подобного воздействия
алкилированных фенолов является повышение устойчивости белков и
нуклеиновых кислот к действию высоких температур, что хорошо
согласуется с представлениями о высоком уровне терморезистентности
самих цистоподобных покоящихся форм микроорганизмов, образование
которых индуцируется высоким уровнем алкилированных фенолов в
микробной культуре. С другой стороны, стабилизация биополимеров и,
особенно, нуклеиновых кислот должна проявляться также в длительности
сохранения их физико-химических свойств в денатурирующих условиях, что,
39
в свою очередь, будет предопределять сохранение их функциональной
активности [59].
1.8. Функция алкилированных фенолов как химических шаперонов
В
работах
по
изучению
механизмов
развития
анабиотического
состояния в покоящихся формах микроорганизмов, где в качестве
химического аналога факторов d1 бактерий использовали 4-н-гексилрезорцин
(водно-этанольный раствор), была показана его способность стабилизировать
структуру макромолекул ферментов в образующихся комплексах с белком
[60]. При этом обеспечивалось приобретение ферментами сопряженных
свойств – пониженной метаболической активности и высокой устойчивости к
денатурирующим воздействиям (фотоокислению, температуре, рН).
Полученные данные позволили заключить, что алкилгидроксибензолы
(активное начало факторов d1) обладают функциями химических шаперонов
и могут играть роль естественных структурных модификаторов ферментов,
принимая участие в блокировании метаболизма в гипометаболических и
анабиотических клетках путем образования каталитически низкоактивных и
термостабильных комплексов с ферментами. Аналогичные функции были
показаны
для
длинноцепочечных
5-н-алкилрезорцинов,
широко
присутствующих в растениях и бактериях [60].
1.9. Алкилрезорцины как пищевые биомаркеры
Эпидемиологические исследования убедительно свидетельствуют о том,
что использование цельнозерновых круп способствует уменьшению риска
таких заболеваний, как ожирение [61], сахарный диабет [62, 63],
ишемическая болезнь сердца [64, 65], инсульт [66] и некоторые виды рака
[67–70]. Тем не менее, польза для здоровья круп грубого помола не очень
40
хорошо изучена в связи с многофакторной природой заболеваний,
относительно низкой частотой заболеваемости, не позволяющей получить
статистически
продуктов
значимые
[71]
и
о
результаты
частоте
о
приема
потреблении
пищи
в
цельнозерновых
эпидемиологических
исследованиях [72].
Одним
из
способов
улучшения
результатов
исследования
рассматриваемой связи между потреблением зерновых грубого помола и
снижением заболеваемости является использование биомаркеров, т.е.
конкретных соединений, которые могут быть измерены в биологической
жидкости (например, плазме или моче). Также полезную информацию может
дать определение в пище веществ, которые обладают биологической
активностью и влияют на снижение рисков возникновения заболевания [73].
Согласно последним исследованиям, АР могут применяться в качестве
биомаркеров потребления цельнозерновой пшеницы и ржи [74–76]. В
настоящее время известно, что АР поступают в организм человека [77] и
присутствуют в плазме крови [78], форменных элементах крови [79] и в виде
метаболитов в моче [80]. Следует отметить, что в последнем случае в
качестве метаболитов АР с помощью ГХ-МС-анализов были обнаружены,
помимо небольших количеств неизмененных АР, два соединения – 3,5дигидроксибензойная
кислота
и
3-(3,5-дигидроксифенил)-1-пропановая
кислота, что указывает на метаболическую трансформацию АР в организме
человека путем β-окисления их алкильной цепи.
Длинноцепочечные АР представляют собой группу фенольных липидов,
обладающих свойствами маркеров присутствия цельнозерновой пшеницы и
ржи и/или фракций этих зерновых и в качестве биомаркеров их потребления
[74, 81]. AР, найденные в большом количестве в отрубях пшеницы и ржи
(0.03%–0.15% от общего веса ядра), содержат, помимо фенольного кольца с
двумя гидроксильными группами в мета-положении, алкильный заместитель
в положении 5. В алкильную цепь в зерновых AР входит от 15 до 25 атомов
41
углерода [1]. В пшенице и ржи также были найдены некоторые производные
АР, в том числе AР с ненасыщенными алкильными цепями [82],
кетогруппамми [83], с сочетанием кетогруппы и ненасыщенных алкильных
цепей [84, 85]. Рожь содержит 15%–30% этих незначительных производных
AР [86–88]. АР и их производные, как полагается, имеют широкий спектр
биологической активности, особенно связанной с их амфифильными
свойствами. Подробный химизм, диетологические эффекты и биологическая
активность АР детально описаны в обзорах [1] и [74].
1.10. Химические (абиотические) взаимодействия с участием
сигнальных молекул – внеклеточных ауторегуляторов
микроорганизмов
Количество
известных
химических
соединений,
выделяемых
микроорганизмами в окружающую среду и используемых в качестве
сигнальных молекул – «химического языка» – для «обмена информацией»
(причем не только между клетками популяции, но и с макроорганизмами –
например, во взаимодействии почвенных бактерий с растениями), с каждым
годом растет. Данное направление исследований процессов сигналинга
является в настоящее время интенсивно развивающимся [89–93]. Этот
интерес вызван тем, что эта область, кроме очевидного фундаментального
значения
информации
о
механизмах
«обмена
информацией»
у
микроорганизмов, имеет и важное прикладное значение. Например,
выяснилось, что воздействие на пути передачи и (или) приема сигналов
молекулярной природы может изменять коренным образом поведение всей
популяции.
Для
патогенных
бактерий,
таким
образом,
вместо
их
«подавления» антибиотиками достаточно любым доступным способом
перекрыть обмен сигналами (в системе QS). Этот путь обещает разработку
нового
поколения
«целенаправленных»
специальных
антимикробных
42
химических агентов и нового терапевтического подхода, в котором объектом
воздействия
является
не
собственно
рост
и
развитие
патогенной
микрофлоры, а лишь их пути обмена сигналами, способствующие развитию
(синтезу и выделению) факторов патогенности [91–93].
Помимо этого, в окружающей среде могут протекать процессы
комплексообразования, окисления-восстановления, гидролиза и проч. с
участием самых разнообразных биомолекул, в том числе – выделяемых
экстраклеточно и используемых микроорганизмами в качестве сигнальных.
Их абиотическая (т.е. химическая или фотохимическая) трансформация или
деградация является одним из путей влияния окружающей среды на рост и
развитие микрофлоры как «единого организма» [14].
В настоящее время литературы, посвященной этому вопросу, явно
недостаточно. В качестве примера можно привести полученные в течение
последнего десятилетия результаты по химическому окислению некоторых
сигнальных молекул микроорганизмов и их аналогов в умеренно кислых
водных средах [94–100], в том числе в присутствии железа(III), в которых
процессы восстановления последнего контролировались, в частности, с
помощью метода спектроскопии ядерного гамма-резонанса (ЯГР) [94, 96–99,
101].
Интересно отметить, что в присутствии железа(III) в аналогичных
условиях неалкилированный аналог АР – резорцин – не окислялся [95]. В то
же время для производных с двумя OH-группами в орто- и пара-положениях
(пирокатехин и гидрохинон), а также для 2-метоксифенола было отмечено
заметное восстановление железа(III) до железа(II).
В совокупности эти данные указывают на возможность химического
окисления многих биомолекул, используемых микроорганизмами в качестве
химических сигналов (включая алкилированные фенолы), в умеренно кислых
почвах в присутствии соединений железа(III) и, возможно, аналогичных
окислителей [94, 100, 101].
43
Ранее были также проведены отдельные исследования превращения
некоторых фенолов, включая 5-метилрезорцин, в водных аэрированных
растворах, которые происходят при химическом, фотохимическом и
радиационно-химическом
окислении
[100].
Было
показано,
что
в
определенных условиях, наряду с низкомолекулярными соединениями, могут
получаться также высокомолекулярные продукты окисления. В процессе
облучения
растворов
алкилрезорцинов
(ионизирующее
γ-излучение)
авторами работы [100] отмечалось, в частности, существенное увеличение
поглощения в УФ-области, что связывалось с образованием окисленных
продуктов, однако более подробных сведений об их составе в работе не
приводилось.
Таким образом, взаимодействие почвенных микроорганизмов и их
вторичных метаболитов, выделяемых клетками в окружающую среду, с ее
компонентами играет важную роль не только в геомикробиологии и
минералогии
[102,
жизнедеятельность
103],
самих
но
также
клеток.
может
В
оказывать
частности,
это
влияние
на
относится
к
абиотическому (химическому) разрушению (или трансформации) микробных
сигнальных молекул – ауторегуляторов («химического языка» как средства
межклеточной коммуникации), синтезируемых и выделяемых клетками,
которые при достижении пороговой концентрации «включают» экспрессию
нужных генов и оказывают влияние на поведение всего микробного
консорциума. Указанные абиотические (физико-химические) процессы,
снижающие
действующую
концентрацию
выделяемого
микробными
клетками молекулярного сигнала в среде, представляют особый интерес с
точки
зрения
микробной
экологии,
в
частности,
для
достаточно
распространенных кислых почв и имеющих повышенную кислотность
природных водоносных слоев [104–106].
Разрозненность и очевидная недостаточность сведений об абиотических
(физико-химических)
взаимодействиях
биологических
молекул,
44
используемых почвенными микроорганизмами в качестве «химических
сигналов», с компонентами внешней среды определяет актуальность
подобных исследований. В связи с этим в настоящей работе определены цель
и задачи для выяснения физико-химических закономерностей поведения
ряда АР – химических аналогов микробных ауторегуляторов – с различной
молекулярной структурой в присутствии железа(III) в слабокислых водных
средах.
45
Глава 2. Материалы и методы исследования
В соответствии с целью и задачами, поставленными в настоящей работе,
нами был использован ряд современных инструментальных методов,
позволяющих
с
разных
сторон
оценить
особенности
протекания
окислительно-восстановительных процессов с участием алкилрезорцинов и
железа(III).
2.1. Материалы и объекты исследования
Основные реактивы и растворители, использованные для выполнения
экспериментальных работ:
 вода специальной очистки (очищенная на системе “Milli-Q Academic”,
Millipore, США);
 5-метилрезорцин (орцин; 5-МР) моногидрат, C7H8O2·H2O (Fluka,
Швейцария; № 75420). Молярная масса М = 142.15 г/моль;
 5-н-пропилрезорцин (5-н-ПР), C9H12O2 (компания “Enamine”, Киев,
Украина). М = 152.19 г/моль;
 4-н-гексилрезорцин (4-н-ГР), C12H18O2. М = 194.27 г/моль (Sigma,
США; № 209465);
 Хлорид железа(III), FeCl3 (4.78 М водный сток-раствор), ч.д.а. ГОСТ
4147-74;
 железо металлическое (фольга), обогащенное стабильным изотопом
57
Fe (90%), для исследований с помощью метода мёссбауэровской (ЯГР)
спектроскопии (использовано для приготовления растворов солей [57Fe]железа(III) растворением навески фольги в конц. HCl на воздухе с
добавлением небольшого избытка пероксида водорода при длительном
нагревании, в том числе – после растворения для разложения остатка H2O2;
контроль отсутствия железа(II) в конечном сток-растворе проводили с
46
помощью
специальных
измерений
методом
ЯГР-спектроскопии;
см.
соответствующий раздел);
 гидроксид натрия, NaOH (1 М водный раствор), ч.д.а.;
 этанол, С2Н5ОН, ч.д.а.;
 хлороформ, CHCl3 (х.ч., для хроматографических анализов);
 бромид калия, KBr (х.ч., для спектроскопических анализов).
В ходе проводимой экспериментальной работы были получены
оптические спектры поглощения 5-метилрезорцина и 4-н-гексилрезорцина
(обозначение в тексте – 5-МР и 4-н-ГР соответственно) и их растворимых
продуктов взаимодействия c железом(III). Измерения проводили в водном
растворе (в случае 5-МР) и водно-этанольной среде (20 об.% этанола – для
увеличения растворимости 4-н-ГР) в ультрафиолетовой (УФ) области (230–
320 нм в случае 5-МР и 230-300 нм для 4-н-ГР).
В аналогичных условиях были получены мёссбауэровские спектры
водных
57
FeIII-содержащих растворов 5-МР и 4-н-ГР. Твердые образцы
готовили высушиванием смеси на воздухе (в закрытых от света емкостях для
предотвращения возможных фотохимических процессов) при комнатной
температуре в течение суток.
Подробности
методик
приготовления
растворов
и
особенности
использования методов приведены ниже.
2.2. Приготовление водного раствора 5-метилрезорцина в смеси с
хлоридом железа(III) и измерения электронных спектров поглощения
Для приготовления 1.5 мл исходного 0.06 М раствора 5-МР взвешивали
12.8 мг 5-МР, помещали в пластиковую пробирку (Эппендорф), добавляли
1.49 мл воды; закрывали и встряхивали до полного растворения (1–2 мин).
Получали бесцветный раствор.
47
Затем готовили раствор хлорида железа(III) (реактив без обогащения
изотопом
57
Fe) нужной молярной концентрации, для чего пикнометрически
определяли плотность концентрированного водного раствора FeCl3 и по
справочной таблице для данной температуры находили соответствующую
концентрацию (в наших экспериментах – 4.78 М). К 10 мл воды добавляли
0.209 мл FeCl3 (4.78 M), отбирали микропипеткой аликвоту в объёме 0.1 мл и
помещали в пробирку типа Эппендорф (объёмом 2.0 мл). После этого в неё
при перемешивании добавляли 0.5 мл 5-МР (исходного 0.06 М раствора).
Цвет получившегося раствора фиолетовый. Для понижения кислотности
раствора до нужной величины сразу же добавляли небольшими порциями 10
мкл раствора NaOH (1 M) при перемешивании; окончательное значение pH
полученной смеси ~3 (проверяли, поместив каплю раствора на индикаторную
бумагу). Цвет взвеси менялся от сине-фиолетового (сразу после добавления 5
мкл щёлочи) к жёлто-коричневому (после добавления ещё 5 мкл раствора
NaOH). Полученная смесь содержала 0.048 М 5-МР и 0.016 М Fe (молярное
соотношение Fe:C7=1:3). Все растворы хранили в темноте, обернув пробирки
фольгой,
для
исключения
возможности
протекания
фотохимических
процессов.
Через определенные промежутки времени после смешения реактивов
(через 10 мин, 3 и 5.5 ч) смесь в пробирке Эппендорф центрифугировали на
микроцентрифуге (MiniSpin, фирма Eppendorf, ФРГ) в течение 10 мин (13400
об/мин), отбирали аликвоту 100 мкл прозрачного супернатанта, разводили
водой в 400 раз, добавив 39.9 мл воды (для получения величины оптической
плотности, удобной для измерения с достаточной точностью), и измеряли
спектр поглощения (230–320 нм) в кварцевой кювете с длиной оптического
пути 1 см (подробности спектрофотометрических измерений приведены
ниже). Остаток в пробирке Эппендорф (сразу после отбора аликвоты в
определенный момент времени) перемешивали стеклянной палочкой,
эппендорф закрывали и оставляли до следующего отбора аликвоты.
48
После последнего отбора (через 3 ч) остаток оставляли в пробирке
открытым для высыхания на воздухе (на сутки). После этого экстрагировали
водорастворимую часть, добавив в пробирку 1.35 мл воды, хорошо
перемешивали, центрифугировали на микроцентрифуге и снова отбирали
аликвоту 100 мкл прозрачного супернатанта, разводили его водой в 20 раз
(т.е. в 20 раз меньше, чем в предыдущих опытах, для увеличения
поглощения), добавив 1.9 мл воды и измеряли спектр поглощения (230–320
нм) в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см.
2.3. Приготовление исходного водного раствора 5-метилрезорцина
и измерения электронных спектров поглощения
До проведения этих опытов получали электронный спектр поглощения
исходного водного раствора 5-МР, разведенного водой до концентрации,
эквивалентной
используемой
в
измерениях
спектров
оптического
поглощения продуктов окисления 5-МР железом(III) после разведения, т.е.
1.2×10–4 М. Для этого брали 80 мкл исходного 0.06 М раствора 5-МР,
помещали в кювету, разводили в 500 раз водой (добавив 39.92 мл воды),
перемешивали стеклянной палочкой и регистрировали спектр поглощения
полученного водного 1.2×10–4 М раствора 5-МР (230–320 нм). Другие
подробности спектрофотометрических измерений приведены ниже.
2.4.
Приготовление
водно-этанольного
раствора
4-н-
гексилрезорцина в смеси с хлоридом железа(III) и измерения
электронных спектров поглощения
Отметим, что использование водно-этанольной смеси в данной серии
экспериментов с 4-н-гексилрезорцином (4-н-ГР) было необходимо для
увеличения его растворимости, которая в чистой воде слишком низка (для
49
проведения
экспериментальных
измерений
методом
мёссбауэровской
спектроскопии в растворах, где имеются ограничения по наименьшей
концентрации
резонансного
57
Fe
для
достижения
поглощения
в
приемлемой
замороженных
интенсивности
растворах).
При
γ-
этом
концентрация этанола в воде для растворения 4-н-ГР была выбрана таким
образом, чтобы во всех конечных смесях после добавления раствора
железа(III) содержание этанола составляло ~20 об.%.
Для приготовления 5 мл исходного 0.06 М раствора 4-н-ГР взвешивали
0.058 г 4-н-ГР, помещали в пробирку Эппендорф, добавляли 5 мл 25%
водного раствора этанола; закрывали и встряхивали до полного растворения
(1–2 мин). Получали бесцветный раствор.
Затем, как отмечено выше, готовили раствор хлорида железа(III)
(реактив без обогащения изотопом
пикнометрически
определяли
57
Fe) нужной молярности, для чего
плотность
концентрированного
водного
раствора FeCl3 и по таблице плотностей для данной температуры находили
соответствующую концентрацию (в наших экспериментах – 4.78 М).
К 0.979 мл воды добавляли 0.021 мл FeCl3 (4.78 M), отбирали
микропипеткой аликвоту в объёме 0.1 мл и помещали в пробирку Эппендорф
(объёмом 2.0 мл), после этого в него при перемешивании добавляли 0.5 мл 4н-ГР (исходного 0.06 М раствора). Цвет получившегося раствора сероголубой. Для понижения кислотности раствора сразу же добавляли
небольшими порциями 10 мкл раствора NaOH (1 M) при перемешивании;
окончательное значение pH полученной смеси ~3 (проверяли, поместив
каплю
раствора
на
индикаторную
бумагу).
Полученная
смесь
(с
концентрацией этанола ок. 20 об.%) содержала 0.049 М 4-н-ГР и 0.0164 М Fe
(молярное соотношение Fe : 4-н-ГР = 1:3).
Все приготовленные растворы хранили в темноте, обернув пробирки
фольгой,
процессов.
для
исключения
возможности
протекания
фотохимических
50
Через определенные промежутки времени после смешения реактивов
(через 5, 10 и 30 мин) смесь в пробирке Эппендорф центрифугировали на
центрифуге (BR4i, Jouan, Франция) в течение 10 мин (18400 об/мин),
отбирали аликвоту 100 мкл прозрачного супернатанта, разводили 20%-ным
раствором этанола в 100 раз и сразу же измеряли спектр поглощения (230–
300 нм) в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см. Остаток в
пробирке сразу после отбора аликвоты перемешивали стеклянной палочкой,
закрывали (для предотвращения испарения растворителя) и оставляли в
темноте до следующего отбора аликвоты.
2.5. Приготовление исходного водно-этанольного раствора 4-нгексилрезорцина и измерения электронных спектров поглощения
До проведения указанных экспериментов получали электронные
спектры
поглощения
разведенного
эквивалентной
исходного
20%-ным
водно-спиртового
спиртовым
используемой
в
раствором
измерениях
раствора
до
спектров
4-н-ГР,
концентрации,
оптического
поглощения продуктов окисления 4-н-ГР железом(III) после разведения, т.е.
4.8×10–4 М. Для этого брали 80 мкл исходного 0.06 М раствора 4-н-ГР,
помещали в кювету, разводили в 25 раз (добавив 1.92 мл 20%-ного водного
раствора
этанола),
перемешивали
стеклянной
палочкой.
Затем
регистрировали три спектра после дальнейшего разведения исходного водноспиртового раствора 4-н-ГР в 5 раз – эквивалентно разведению для опытов в
присутствии железа(III), т.е. с исходной концентрацией [4-н-ГР] = 4.8×10–4
М), а также с разведением в 25 раз ([4-н-ГР] = 9.6×10–5 М) и 50 раз ([4-н-ГР] =
4.8×10–5 М) в диапазоне длин волн 230–300 нм относительно такого же 20%ного водно-спиртового раствора.
Указанные уровни разведения растворов выбраны для достижения
соответствующих величин оптической плотности А (для 1-сантиметровых
51
кварцевых кювет) в максимуме поглощения (около 280 нм), удобных для
регистрации с допустимой для экспериментальных исследований точностью,
т.е. не выше А ~1.2.
2.6.
Приготовление
смеси
алкилрезорцинов
с
Fe(III)
для
исследования методом спектроскопии ядерного гамма-резонанса
Для измерения мёссбауэровских спектров смесь готовили таким же
образом, как и для выделения продуктов окисления АР и их изучения
методом УФ-спектрофотометрии (см. выше, разделы 2.2 и 2.4). При этом
центрифугирование не использовали, поскольку спектроскопия ЯГР дает
информацию о всех [57Fe]-железосодержащих формах в исследуемом
образце. Для увеличения интенсивности спектральных линий использовали
препараты хлорида железа(III), обогащенные изотопом 57Fe (90%).
Растворы смешивали в круглой плоской политетрафторэтиленовой
чашечке, служившей держателем образца для ЯГР-спектрометра (толщина
водного слоя ~3 мм), которую после смешивания реагентов закрывали
фольгой для исключения испарения и воздействия света, выдерживали
заданное время при комнатной температуре и затем быстро замораживали в
жидком азоте. Твердые образцы готовили высушиванием аналогичной смеси
на воздухе (в темноте) при комнатной температуре в течение суток.
Описание особенностей метода и методики измерений спектров ЯГР
приведено ниже в разделе с описанием данного метода.
2.7. Спектроскопия в УФ-области
Полосы
в
УФ-спектрах
ароматических
соединений
связаны
с
переходами π-электронов ароматической системы. На вид спектра влияют
заместители: такие как алкил или галогены – незначительно, группы с
52
неподеленными парами электронов (–ОН, –OR, –NH2, –NF2) – сильно. Если
имеются
карбонильная,
нитро-
или
нитрозогруппа,
то
в
спектре
дополнительно наблюдаются полосы n-π*-перехода. В спектрах некоторых
замещенных бензола (например, нитробензола) удается выделить полосы с
внутримолекулярным переносом заряда (соответствующие переходам, при
которых происходит преимущественно уменьшение электронной плотности
на одном участке молекулы и ее увеличение на другом участке).
УФ-спектры ароматических соединений зависят не только от характера,
но и от взаимного расположения заместителей. Так, в спектрах орто- и
мета-нитроанилинов имеются три полосы, вызванные переносом заряда от
донора к акцептору, от кольца к акцептору и локальным возбуждением
бензольного кольца с вкладом переноса заряда от донора к кольцу. Параизомер имеет те же переходы, но из-за совпадения направления переноса
заряда во всех трех случаях в спектре появляется одна интенсивная полоса
поглощения (при 320 нм).
Наличие интенсивных характеристических полос в УФ спектрах многих
химических
соединений
используется
для
разработки
методов
их
идентификации и количественного определения. Последние основаны на
законе Бугера–Ламберта–Бера и отличаются селективностью и высокой
чувствительностью – до 10–7% по массе. Имеются химические сенсоры со
световодами, измеряющие поглощение определяемого вещества в УФ
области [107, 108].
В данной работе спектры оптического поглощения растворов 5метилрезорцина (5-МР), 4-н-гексилрезорцина (4-н-ГР), а также растворимых
продуктов их взаимодействия с железом(III) в УФ-области регистрировали
на UV-Vis-спектрофотометрах Specord M40, S250 или S300 (Carl Zeiss Jena,
Analytik Jena, ФРГ) относительно водного (в случае водных растворов 5-МР
53
и продуктов его окисления) или водно-спиртового раствора (в случае водноспиртовых (20 об.% этанола) растворов 4-н-ГР и продуктов его окисления).
Аликвоты растворов (в случае исследования продуктов окисления 5-МР
или 4-н-ГР) отбирали после центрифугирования (см. выше) через заданные
промежутки времени (с их последующим разведением соответствующим
растворителем для снижения УФ-поглощения до приемлемой величины).
Измерения
УФ-спектров
проводили
при
комнатной
температуре.
Использовали кварцевые кюветы с длиной оптического пути 1 см.
2.8. Мёссбауэровская (ядерная гамма-резонансная) спектроскопия
2.8.1. Особенности метода при количественных измерениях
Метод мёссбауэровской (ядерной γ-резонансной, ЯГР) спектроскопии
основан
на
эффекте
резонансного
поглощения
без
отдачи
монохроматического γ-излучения, испущенного ядром-источником при
ядерном
переходе,
атомным
ядром
того
же
стабильного
изотопа,
находящимся в исследуемом образце (эффект Мёссбауэра). Он широко
используется
для
конденсированных
исследования
сред
(главным
физических
образом,
и
химических
твердых
тел),
свойств
а
также
исследования микро- и наноразмерных объектов (ядер, ионов, химических и
биологических комплексов и т. д.) в твердых телах.
Для наблюдения эффекта Мёссбауэра необходимо наличие γ-квантов с
энергией, равной энергии мёссбауэровского перехода. Обычно для этого
используются радиоактивные изотопы, например, радиоактивный изотоп
57
Co (период полураспада 270 дней) в качестве источника, который в
результате ядерного распада (путем захвата электрона ядром) превращается в
стабильный изотоп
57
Fe с испусканием γ-кванта (при этом в исследуемом
образце – поглотителе – присутствуют соединения 57Fe).
54
Поскольку в источнике γ-излучения (например, 57Co, превращающемся в
57
Fe) и в его поглотителе (исследуемые соединения
57
Fe) чаще всего
присутствуют разные вещества, то ядра одного и того же изотопа в
источнике и поглотителе находятся в разном окружении, и вследствие этого
значения энергии ядерного перехода в источнике (Еγ-ист.) и в образце –
поглотителе (Еγ-поглотит.) не совпадают (Еγ-ист. ≠ Еγ-поглотит.). Хотя эти различия
чрезвычайно малы (порядка наноэлектронвольт), тем не менее, как
следствие, резонансного поглощения не происходит.
Для достижения ядерного γ-резонанса источник γ-квантов (например,
57
Co) двигают с меняющейся скоростью (v) относительно поглотителя (в
данном случае – образца, содержащего 57Fe), и, вследствие эффекта Доплера,
меняется энергия ядерного перехода у источника Еγ-ист.. При достижении
условия Еγ-ист. = Еγ-поглотит. (что достигается при определенной скорости v)
испускаемый источником γ-квант резонансно поглощается ядром (т.е.
происходит ядерный гамма-резонанс, фиксируемый в спектре ЯГР).
Наблюдаемые в мёссбауэровской спектроскопии разности энергии (в
исключительно
узком
диапазоне
–
порядка
нескольких
сотен
наноэлектронвольт) соответствуют величинам скорости движения источника
гамма-квантов относительно поглотителя (образца) v порядка нескольких
миллиметров в секунду (изменение скорости на ±1 мм/с соответствует
изменение энергии на ±48.1 нэВ, где знак скорости соответствует
направлению движения вдоль оси источник–поглотитель; “+” отвечает
движению “навстречу”), которые легко достигаются и надежно фиксируются
с помощью механической части ЯГР-спектрометра.
Мёссбауэровский
интенсивности
спектр
поглощения
представляет
γ-излучения
от
собой
зависимость
относительной
скорости
движения v. Количественной мерой интенсивности γ-излучения служит
регистрируемое детектором (с многоканальным анализатором на основе
компьютера) число электрических импульсов (в каждом из каналов для
55
гамма-квантов разных энергий, соответствующих разным скоростям v),
получающихся за строго задаваемый интервал времени. При этом для
достижения
хорошего
качества
спектра
(при
достаточно
высоком
соотношении сигнал/шум) и достаточно высокой интенсивности полос
резонансного
поглощения
требуется
определенное
время
измерения
(накопления) спектра – обычно от нескольких часов до нескольких дней (что
зависит как от содержания изотопа
фактора
Мёссбауэра–Лэмба
поглощения
без
отдачи).
–
57
Fe в исследуемом образце, так и от
величины
При
этом
вероятности
относительная
резонансного
интенсивность
резонансного поглощения пропорциональна количеству поглощающих ядер
и фактору Мёссбауэра–Лэмба.
Различают два вида мёссбауэровской спектроскопии – абсорбционную и
эмиссионную. В первом случае (что использовалось в настоящей работе)
исследуемый материал является поглотителем γ-квантов, и для получения
мёссбауэровского спектра необходимо, чтобы содержание мёссбауэровских
атомов в исследуемом образце составляло некоторый минимум от общего
числа атомов. Так, использование образцов, содержащих природное железо,
при достаточно высоком его содержании в образце зачастую является для
этого метода достаточным, поскольку содержание в природном железе
изотопа 57Fe составляет 2.19%. Однако в случае образцов, содержание железа
в которых невелико, а также для исследования замороженных растворов с
концентрациями железосодержащих соединений порядка 0.1 М и ниже, для
увеличения
интенсивности
линий
в
спектрах
ЯГР
используется
приготовление образцов из препаратов железа, обогащенного ЯГР-активным
стабильным изотопом 57Fe.
Отличие
эмиссионной
мёссбауэровской
спектроскопии
от
абсорбционной заключается в том, что объектом исследования являются
вещества или образцы, в которые введены радиоактивные ядра, образующие
в результате ядерных превращений и последующего каскада γ-переходов
56
возбужденное
ядро,
испускающее
резонансные
γ-кванты.
Анализ
энергетического спектра испускаемых γ-квантов проводится с помощью того
же мёссбауэровского спектрометра, в котором стандартный поглотитель
содержит резонансные ядра в основном состоянии, имеющие единичную
линию поглощения.
Метод мёссбауэровской спектроскопии является одним из основных
методов изучения структуры железосодержащих материалов [109, 110].
2.8.2. Измерения мёссбауэровских спектров
В настоящей работе спектры ЯГР исследуемых реакционных смесей (АР
+ железо(III) в растворах, быстро замороженных через определенные
промежутки времени, или в твердом состоянии после высушивания
реакционной смеси) измеряли в режиме пропускания, помещая образцы
(замороженные растворы или высушенные твердые фазы) в закрытой
пластиковой пленкой политетрафторэтиленовой чашечке (с толщиной слоя
замороженного раствора ~3 мм), служащей держателем образцов ЯГРспектрометра, в медный держатель криостата специальной конструкции
(типа “cold finger” – в котором внешняя массивная медная втулка для
держателя образцов, расположенная снизу, составляет единое целое с
медным корпусом криостата и, соответственно, сохраняет его температуру),
наполненного
жидким
азотом
(температура
образца
при
измерении
поддерживается на уровне 80 К).
Измерения проводили на спектрометре WissEl (ФРГ), работающем в
режиме постоянного ускорения, с источником гамма-излучения
(определенное количество металлического
57
57
Co(Rh)
Co в матрице из родия) с
интенсивностью 50 мКи. Полученные спектры ЯГР аппроксимировали
нелинейным методом наименьших квадратов с помощью специальной
компьютерной
программы
MossWinn
[111]
как
суперпозицию
квадрупольных дублетов, имеющих форму функции Лоренца (кроме спектра
57
ЯГР образца 4-н-ГР + 57FeIII при pH ~ 1.5, который содержал характерную для
мономерных гидролизованных форм железа(III) уширенную компоненту с
магнитной
сверхтонкой
структурой;
см.
соответствующий
раздел
экспериментальных данных).
Рассчитываемыми при аппроксимации экспериментальных данных
мёссбауэровскими параметрами являлись:
 изомерный
сдвиг
δ
(мм·с–1;
относительно
стандартного
поглотителя, используемого для калибровки ЯГР-спектрометра, в
качестве которого использовалась фольга α-Fe при комнатной
температуре);
 квадрупольное расщепление Δ (мм·с–1);
 экспериментально
измеряемая
ширина
линии
на
середине
интенсивности Γэксп (мм·с–1), а также
 площадь каждой выявленной при аппроксимации спектральной
компоненты (например, квадрупольного дублета) в процентах от
общей площади спектра Sr (%).
Следует отметить, что при условии равенства вероятности эффекта
Мёссбауэра (т.е. вероятности резонансного поглощения гамма-кванта ядром
без отдачи) для всех железосодержащих форм в образце (что приблизительно
соблюдается при низких температурах измерений и в случае однотипных в
химическом отношении и по физическому состоянию форм железа в
исследуемом образце) значение Sr для каждой формы отвечает содержанию
железа в данной форме (относительно общего содержания железа в образце),
что используется для количественного определения присутствующих в
веществе (образце) железосодержащих форм.
Все значения изомерного сдвига, рассчитанные из экспериментальных
данных (спектров ЯГР) в данной работе, приведены относительно α-Fe при
комнатной температуре.
58
2.9. Теоретическое исследование относительной химической
активности
алкилрезорцинов
в
реакциях
окисления
методом
квантовой химии
Для теоретического объяснения различий относительных химических
активностей ряда исследуемых в данной работе алкилированных резорцинов,
а также, для сравнения, – их неалкилированного аналога (резорцина), в
настоящей
работе
проведены
расчеты
адиабатических
потенциалов
ионизации указанных молекул.
Квантово-химические расчёты проводили гибридным методом теории
функционала плотности (DFT) [112–114] в варианте B3LYP [115–117] c
базисным набором 6-311++G(3d,3p) [118, 119] аналогично тому, как это было
реализовано в работах, цитируемых в главе [120]. Начальная геометрия
генерировалась по программам пакета HyperChem [HyperChem (TM),
Hypercube, Inc., Gainesville, Florida 32601, U.S.A.] и оптимизировалась
методом PM3 [121, 122].
Данное исследование проведено совместно с профессором, доктором
хим. наук А.Н. Панкратовым (кафедра аналитической и экологической химии
Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского),
которому автор выражает искреннюю признательность за помощь в
проведении расчетов и интерпретации полученных данных.
2.10.
Газовая
хроматография
с
масс-спектрометрическим
детектированием
Определение чистоты 4-н-гексилрезорцина, а также выделение и
исследование
растворимых
продуктов
его
окисления
железом(III)
59
осуществляли
с
помощью
метода
газовой
хроматографии
с
масс-
спектрометрическим детектированием (ГХ-МС).
Исследования проводили на газовом хроматографе Agilent 6890N
(Hewlett Packard, США) с масс-спектрометрическим детектором Agilent
5973N при следующих условиях:

детектор – масс-селективный в режиме электронного удара (70
эВ), сканирование масс-спектров по полному ионному току в диапазоне
m/z 25–550 а.е.м.;

колонка
капиллярная
метилсилоксановой
фазой
неполярная
(типа
HP-5MS)
с
5%-фенил-95%со
следующими
использованными параметрами:

газ-носитель – гелий;

температура инжектора – 280°С;

температура интерфейса детектора – 280°С;

программирование температуры колонки:
1) выдержка при 70°С в течение 1 минуты,
2) подъем температуры от 70°С до 295°С со скоростью 15°С/мин и
выдержкой при конечной температуре 20 мин с постоянным потоком газа – 1
мл/мин;

ввод пробы исследуемого вещества с делением потока 1:50;

объем пробы – 1 мкл.
Для полученных хроматограмм определяли индексы удерживания
компонентов, после чего регистрировали их масс-спектры. Регистрацию
масс-спектров проводили в режиме по полному ионному току.
Обработку хроматограммы осуществляли на химической станции MSD
ChemStation D.02.00.275 (“Agilent Technologies”) с помощью программы
Enhanced Data Analysis. Масс-спектры, снятые с вершин пиков на
хроматограммах, полученных в вышеуказанных условиях, сравнивали с
библиотечными масс-спектрами NIST/W9N08/EKBDRUGS (ver. 12.610).
60
2.11. Рентгенофлуоресцентный анализ
Исследование
продукта
взаимодействия
4-н-гексилрезорцина
с
хлоридом железа(III) (выделенного из реакционной смеси при помощи
экстракции хлороформом) после высушивания экстракта проводили методом
рентгенофлуоресцентного анализа (РФА). Данное исследование было
проведено с целью детектирования возможного присутствия следовых
количеств
железа(III),
предположительно
экстрагируемого
в
виде
координационных соединений из реакционной смеси в хлороформную фазу.
(Следует отметить, что с помощью РФА по характеристическим линиям
элемента
полуколичественно
детектируется
лишь
его
наличие,
безотносительно его степени окисления или химической формы; однако
известно, что в органическую фазу могут экстрагироваться лишь комплексы
железа(III); комплексы железа(II) органическими растворителями, как
правило, не экстрагируются).
Анализ проводили с помощью энергодисперсионного спектрометра
модели ED 2000 (“Oxford Instruments”, Великобритания).
Условия проведения РФА:
 рентгеновская трубка с серебряным анодом;
 напряжение на трубке 35 кВ;
 фильтр
первичного
рентгеновского
излучения
–
тонкий
серебряный;
 экспозиция 600 сек;
 среда – атмосфера воздуха.
2.12. Инфракрасная спектроскопия
Инфракрасные (ИК) спектры исходного реактива – 4-н-гексилрезорцина
– и высушенного хлороформного экстракта продуктов его взаимодействия с
61
железом(III) записывали на ИК-фурье-спектрометре фирмы «Симекс»,
модель
ФТ-801
(Новосибирск,
Россия),
управляемом
с
помощью
персонального компьютера.
Образцы для ИК-спектроскопического исследования готовили в виде
тонких таблеток, прессованных со спектроскопически чистым бромидом
калия,
предварительно
охлажденным
до
высушенным
комнатной
прокаливанием
температуры
в
при
герметически
105ºС
и
закрытой
стеклянной емкости (2% вещества в бромиде калия; смесь измельчали в
агатовой ступке вместе с KBr).
Таблетки из измельченной смеси вещества с KBr готовили с помощью
ручного пресса, входящего в комплект со спектрометром (комплект для
прессовки микротаблеток с микрофокусирующей приставкой). ИК-спектры
записывали в режиме пропускания в диапазоне частот 4000–400 см–1 при
комнатной температуре.
62
Глава 3. Экспериментальные исследования, результаты и
их обсуждение
3.1. Окислительно-восстановительные процессы с участием 5метилрезорцина
Для инициирования окислительных реакций в водных растворах 5метилрезорцина (орцина, 5-МР) использовали раствор хлорида железа(III)
определенной концентрации (при мольном соотношении Fe : 5-МР = 1:3) с
определенным значением кислотности (pH ~ 3). Все спектрофотометрические
измерения проводили в интервале длин волн в УФ-диапазоне спектра 230–
320 нм.
Изменение спектров оптического поглощения растворов 5-МР в
присутствии железа(III) и без него, в зависимости от времени проведения
измерений
после
смешения
реагентов,
и
зависимость
изменения
интенсивности в максимуме (при λmax = 279 нм) от времени представлены на
рис. 10 и рис. 11, соответственно.
Из сравнения исходного спектра оптического поглощения 5-МР,
имеющего дублетную структуру (λmax = 273 и 279 нм), и спектров,
измеренных через определенные промежутки времени (10 мин, 3 ч, 5.5 ч (см.
вставку на рис. 11), а также после высушивания в течение 24 ч и
последующей экстракции водорастворимой фракции продуктов реакции, см.
рис. 10) следует, что со временем происходит незначительное изменение
структуры спектра и изменение интенсивности поглощения во всем
исследованном диапазоне длин волн.
63
Рис. 10. Спектры оптического поглощения водных растворов орцина (5-МР,
исходный раствор) и водорастворимых продуктов его взаимодействия с
железом(III) при pH ~ 3 для разных времен выдержки (10 мин и 3 ч), а также
экстрагированного водного раствора после высушивания смеси 5-МР с
железом(III) (через 24 ч). Концентрация исходного раствора 5-МР (красный)
после разведения 1.2×10–4 М. (Разведение растворов продуктов
взаимодействия 5-МР с FeCl3 через 10 мин и 3 ч подобрано так, что
концентрации эквивалентны исходному раствору 5-МР после разведения; для
24 ч – разведение в 20 раз меньше для увеличения поглощения)
64
Рис. 11. Зависимость оптической плотности (A) в максимуме при длине
волны λmax = 279 нм от времени (t) на спектрах поглощения в УФ-области
(основная часть спектров в области 260–300 нм продублированы на вставке)
водного 0.12 мМ раствора 5-метилрезорцина (1) и растворимых продуктов
его окисления железом(III) при эквивалентном разведении после
центрифугирования смеси через 10 мин (2), 3 ч (3) и 5.5 ч (4)
Изменение
структуры
спектра
(небольшое
перераспределение
интенсивностей максимумов при 273 и 279 нм) становится заметным после
5.5. ч реакции (см. вставку на рис. 11) и на спектре водного экстракта после
24 ч (см. рис. 10), т.е., очевидно, после накопления продуктов окисления 5МР (см. ниже обсуждение данных ЯГР-спектроскопии).
65
Как видно из полученных спектров, с течением времени сначала
происходит увеличение интенсивности поглощения (по прошествии ~10 мин)
как в области пиков (273 и 279 нм), так и в области фонового поглощения
около 250 нм и 300–320 нм. Это согласуется с данными работы Ревиной с
соавт. [100], в которой было зарегистрировано закономерное существенное
увеличение поглощения в указанных областях после облучения водного
аэрированного раствора орцина увеличивающимися дозами гамма-излучения
(т.е. после радиационного окисления – радиолиза).
В нашем случае это может соответствовать образованию небольшого
количества сходных продуктов на начальных этапах окисления 5-МР
(отметим, что, по данным спектроскопии ЯГР, описанным ниже, в
аналогичной смеси 5-МР с железом(III) при pH ~ 3 через 10 мин около 7%
всего
Fe3+
восстанавливалось
орцином
до
Fe2+;
следовательно,
соответствующее относительно небольшое количество орцина подверглось
окислению).
При дальнейшем увеличении выдержки (3 ч, 5.5 ч) смеси водных
растворов 5-МР с железом(III), а также после высушивания смеси (через 24
ч) происходило уменьшение поглощения водорастворимых продуктов (см.
рис. 10 и 11; при этом следует отметить 20-кратную разницу в разведении
растворов после 10 мин, 3 ч или 5.5 ч и раствора после 24 ч на рис. 10).
Понижение интенсивности поглощения могло происходить либо из-за
полного окисления хромофорных групп (ароматический цикл), что в данном
случае маловероятно, либо по причине того, что с течением времени
образуются нерастворимые комплексы продуктов окисления орцина с
железом в различных степенях окисления (вероятнее всего, удаляемые в
процессе центрифугирования растворов перед спектрофотометрическими
измерениями). Более предпочтительным образование подобных комплексов
является для железа(III), но не исключается и возможность образования
комплексов с железом(II) (особенно при его значительном накоплении). Так,
66
в аналогично полученных высушенных продуктах после длительного
взаимодействия водного раствора 5-МР в смеси с хлоридом железа(III), по
данным ЯГР (см. ниже), обнаружены две различные формы комплексов
железа(II), причем суммарное количество железа(II) в них составляло около
75% от исходного.
Отметим, что в нашей работе при измерении УФ-спектра продуктов,
экстрагированных после высушивания смеси (через 24 ч), было использовано
разведение, в 20 раз меньшее, чем в случае смеси растворов, для увеличения
поглощения. Таким образом, при эквивалентном разведении оптическая
плотность в максимуме поглощения экстракта (после 24 ч) около 279 нм
составляла бы около 0.035 (на рис. 10 – около 0.7), т.е. значительно
(практически на порядок) меньше, чем в исходном растворе или через 3 или
5.5 ч.
Таким образом, с течением времени в исследуемой системе происходит
постепенное окисление орцина с соответствующим изменением соотношения
FeIII и FeII в растворе (см. ниже данные спектроскопии ЯГР). Изменения в
УФ-спектрах водорастворимых продуктов окисления, зафиксированные
через 10 мин, 3 ч, 5.5 ч и в спектре, измеренном через сутки (водный экстракт
высушенного остатка), указывают на то, что после прохождения процессов
окисления на воздухе в сухом остатке образуются малорастворимые
комплексные соединения железа (с продуктами окисления 5-МР), что также
зафиксировано с помощью ЯГР-спектроскопии (см. ниже).
3.2. Окислительно-восстановительные процессы с участием 4-нгексилрезорцина
Для
инициирования
окислительных
реакций
в
водно-спиртовых
растворах 4-н-ГР использовали раствор хлорида железа(III) определенной
концентрации (при мольном соотношении Fe : 4-н-ГР = 1:3). Все
67
спектрофотометрические измерения проводили в интервале длин волн в УФдиапазоне спектра 230–300 нм.
Следует отметить, что введение 20% этанола в состав водных растворов
4-н-ГР, использованных для исследований (в отличие от чистой воды при
исследовании 5-МР), вызвано необходимостью увеличения растворимости
более гидрофобного и, следовательно, менее водорастворимого 4-н-ГР (при
этом растворимость 5-МР в воде была достаточна для проведения опытов).
Для проверки выполнимости закона Бера в данной системе были
проведены спектрофотометрические измерения водно-спиртового раствора
4-н-ГР с различной концентрацией, в частности, с разведением в 125 раз от
исходной,
0.06
М
(концентрация,
эквивалентная
использованной
в
измерениях с FeIII), в 625 и в 1250 раз (рис. 12).
Рис. 12. УФ-спектры 4-н-гексилрезорцина в водно-этанольном (20% этанола)
растворе в различных концентрациях: 4.8×10–4 (1), 9.6×10–5 (2), 4.8×10–5 М (3)
68
Из данного рисунка видно, что с увеличением концентрации 4-н-ГР при
общем
увеличении
интенсивности
поглощения
форма
спектров
не
претерпевает заметных изменений.
Рассчитанная по полученным на рис. 12 данным зависимость
оптической плотности от концентрации представлена на рис. 13.
Рис. 13. Зависимость оптической плотности (А) в максимуме (λmax ~ 279 нм)
от концентрации 4-н-гексилрезорцина в водно-этанольном растворе (20%
этанола)
Из рис. 12 следует, что в образующемся растворе 4-н-ГР наблюдается
прямо
пропорциональная
зависимость
оптической
плотности
от
концентрации (выполняется закон Бера). При этом молярный коэффициент
погашения для 4-н-ГР в данном растворе в максимуме (λmax ~ 279 нм)
составляет ε279 = 2.42×103 М–1см–1. Выполнение закона Бера при аналогичной
форме спектров (рис. 13) указывает на образование в данной системе
69
истинных растворов 4-н-ГР с одной молекулярной формой во всем диапазоне
концентраций.
Изменение спектров оптического поглощения растворов 4-н-ГР в
присутствии железа(III) в зависимости от времени проведения измерений
после смешения реагентов представлено на рис. 14.
Из сравнения исходного спектра оптического поглощения 4-н-ГР (см.
рис. 12, спектр для концентрации 4-н-ГР 4.8×10–4 М), и спектров, измеренных
через определенные промежутки времени (5 мин, 10 мин, 30 мин; рис. 14)
следует, что со временем происходило изменение интенсивности поглощения
во всем исследованном диапазоне длин волн. Отметим, что меньшие (по
сравнению с 5-МР) промежутки времени для проведения реакции в случае 4н-ГР были взяты в связи с тем, что, как показали данные спектроскопии ЯГР
(см. ниже), скорость восстановления железа(III) в растворах 4-н-ГР (и,
следовательно, скорость окисления 4-н-ГР) была значительно выше.
Как видно из полученных спектров, с течением времени происходило
заметное уменьшение величины поглощения водорастворимых продуктов.
Необходимо заметить, что первоначального кратковременного увеличения
поглощения при окислении 4-н-ГР (отмечавшегося в случае 5-МР на рис. 10
и 11 и по данным работы [100]) не наблюдалось, однако оно могло
происходить в течение очень короткого начального периода в связи со
значительно более высокой скоростью окисления 4-н-ГР, и, следовательно,
его в этом случае было бы трудно зафиксировать.
Понижение интенсивности поглощения, наблюдаемое и в данном случае
(аналогично окислению 5-МР; см. выше), могло также происходить,
наиболее вероятно, по причине того, что с течением времени образуются
нерастворимые комплексы продуктов окисления 4-н-гексилрезорцина с
железом в различных степенях окисления. Более предпочтительно и в этом
случае образование подобных комплексов для железа(III), но не исключается
70
и возможность образования комплексов с двухвалентным железом (см. ниже
данные спектроскопии ЯГР).
Рис. 14. Спектры поглощения в УФ-области (а) и зависимость
оптической плотности A в максимуме от времени t при длине волны λmax =
279 нм (б) водно-этанольного (20 об.% этанола) FeIII-содержащего раствора
4-н-гексилрезорцина (исходное мольное соотношение 1:3, соответственно;
pH = 3.0; исходное содержание [FeIII] = 0.016 М) при 100-кратном разведении
после центрифугирования смеси через 5 (1), 10 (2) и 30 мин (3). Исходная
концентрация раствора 4-н-ГР в данных растворах после разведения (без
учета последующего окисления 4-н-ГР) составляла 4.8×10–4 М (см. рис. 12)
71
В аналогичным образом полученных высушенных продуктах после
взаимодействия водного раствора 4-н-ГР в смеси с хлоридом железа(III), по
данным ЯГР (см. ниже), обнаружены три различные формы комплексов
железа(II), причем общее количество железа в них составляло около 65% от
исходного. Таким образом, с течением времени в исследуемой системе
происходит окисление 4-н-гексилрезорцина с соответствующим изменением
соотношения FeIII и FeII.
Изменение на УФ-спектрах растворимых продуктов, которые были
сделаны через 5, 10 и 30 мин, наиболее вероятно, указывает на то, что после
прохождения
быстрого
процесса
окисления
4-н-ГР,
практически
завершающегося в течение получаса (см. рис. 14), в отличие от более
медленного окисления 5-МР, образуются малорастворимые комплексные
соединения железа.
3.3.
Исследование
восстановления
железа(III)
в
присутствии
алкилрезорцинов методом мёссбауэровской спектроскопии
Метод
мёссбауэровской
спектроскопии,
основанный
на
ядерного гамма-резонанса (ЯГР) на ядрах стабильного изотопа
содержание
в
природном
железе
составляет
около
2.2
явлении
57
Fe (его
мол.%),
чувствительный к химическому состоянию атомов Fe, был использован для
количественной оценки соотношения Fe(III) и Fe(II) как в водных растворах
(измерения в которых проводятся в замороженном виде), так и в твердых
фазах. Быстрое замораживание растворов (погружением аликвоты в жидкий
азот) в определенный момент времени после смешивания реагентов
позволяет «зафиксировать» химическое состояние системы с последующим
измерением спектров и определением параметров компонентов реакционной
72
смеси (в случае спектроскопии ЯГР – параметров железосодержащих
химических форм).
Мёссбауэровские спектры смесей АР с железом(III) в водных средах
(приготовленных точно таким же образом, как и в опытах по изучению
окисленных форм АР методом УФ-спектрофотометрии, но с использованием
соли FeIII, обогащенной изотопом 57Fe; см. главу 2), а также их высушенных
на воздухе остатков, измеренные при температуре 80 К, приведены на рис. 15
и 16. Мёссбауэровские параметры, рассчитанные из спектроскопических
данных, сведены в табл. 1.
Полученные
результаты
свидетельствуют
о
постепенном
восстановлении железа(III) в присутствии обоих АР (5-МР и 4-н-ГР) в
изученных слабокислых растворах.
При этом, если в растворе 5-метилрезорцина через 10 мин около 7%
Fe(III) было восстановлено до Fe(II), а по прошествии 5.5 ч – около 26% (см.
рис. 9а,б и табл. 1), то в случае 4-н-гексилрезорцина в аналогичных условиях
восстановление протекало намного быстрее: уже через 5 мин около трети
всего Fe(III) было восстановлено (см. рис. 16а и табл. 1). Отметим, что, по
результатам отдельных измерений (см. раздел по кинетике окислительновосстановительных реакций АР с железом(III)), присутствие 20 об.% этанола
в водных растворах при pH ≈ 3 практически не влияло на скорость
восстановления железа(III) 5-метилрезорцином. Следовательно, можно
полагать, что наблюдавшееся значительно более быстрое восстановление
FeIII в присутствии 4-н-гексилрезорцина по сравнению с 5-метилрезорцином
(практически более чем на порядок на начальных стадиях процесса в течение
первых
нескольких
минут;
см.
раздел
по
кинетике
окислительно-
восстановительных реакций) связано со структурой молекулы, а именно – с
длиной и/или положением алкильного заместителя в ароматическом цикле.
Следует также полагать, что в водных средах при pH ≈ 3 основная часть
железа(III) находится в гидролизованной форме (в виде полиядерных
73
гидроксокомплексов и, возможно, коллоидных частиц), что согласуется с
мёссбауэровскими параметрами соответствующих форм (δ ≈ 0.48 мм·с–1 и Δ
≈ 0.72–0.76 мм·с–1 при 80 К; табл. 1).
Мёссбауэровские параметры форм железа(II), образующихся в водных
средах при восстановлении (δ ≈ 1.4 мм·с–1 и Δ ≈ 3.2–3.4 мм·с–1 при 80 К;
табл. 1), показывают, что наиболее вероятное их состояние – в виде
аквокомплексов [Fe(H2O)6]2+. Тем не менее, после высушивания растворов на
спектрах отмечаются в случае 5-метилрезорцина две формы железа(II), а в
случае 4-н-гексилрезорцина – три формы железа(II) (рис. 15в и 16б
соответственно и табл. 1). Параметры данных форм указывают на
образование
в
твердой
фазе
различных
комплексов
железа(II)
с
органическими лигандами, в первую очередь, очевидно, с продуктами
окисления АР.
Отметим, что, если при окислении АР первой стадией является
дополнительное гидроксилирование ароматического цикла, то для 5метилрезорцина возможны лишь две такие изомерные окисленные формы
(1,2,4-триокси-6-метилбензол и 1,2,3-триокси-5-метилбензол), тогда как для
4-н-гексилрезорцина – уже три изомерные формы (1,2,3-триокси-4-нгексилбензол,
1,3,5-триокси-6-н-гексилбензол
и
1,2,4-триокси-5-н-
гексилбензол). Этим, предположительно, может объясняться большее число
форм комплексов железа(II) в высушенном образце в случае 4-нгексилрезорцина (рис. 16б и табл. 1).
В связи с этим важно отметить, что, сам резорцин – неалкилированный
м-дигидроксибензол – в кислых водных растворах, по данным работы [95],
не восстанавливал железо(III) (в отличие от его о- и п-дигидрокси-изомеров –
пирокатехина и гидрохинона).
74
Рис. 15. Мёссбауэровские спектры водных 57FeIII-содержащих растворов
5-метилрезорцина, быстро замороженных через 10 мин (а) и 5.5 ч (б) после
смешения реагентов (pH смеси ~3), а также твердого остатка (в), полученного
высушиванием смеси при комнатной температуре (измерения проведены при
температуре 80 К). Положение дублетов, соответствующих различным
химическим формам Fe, показано над спектрами (цифрами справа указана
соответствующая данной форме степень окисления железа). Штриховкой
выделены спектральные компоненты (квадрупольные дублеты), отвечающие
железу(III) (светлая штриховка) и железу(II) (более темные области), дающие
вклад в суммарный спектр (сплошная огибающая линия), полученный
аппроксимацией экспериментальных данных (точки) (см. также табл. 1)
75
Рис. 16. Мёссбауэровские спектры: а – водного 57FeIII-содержащего
раствора 4-н-гексилрезорцина (с 20 об.% этанола), быстро замороженного
через 5 мин после смешения реагентов (pH смеси ~3), б – твердого остатка,
полученного высушиванием смеси при комнатной температуре (измерения
проведены при температуре 80 К). Обозначения на спектрах и штриховка
расшифрованы в подписи к рис. 15 (см. также табл. 1)
76
Таблица 1. Параметры мёссбауэровских спектров смесей АР с железом(III) в
водных средах и их высушенных на воздухе остатков, измеренные при
температуре 80 К, рассчитанные из спектроскопических данных
Немаловажно также отметить тот факт, что в высушенных на воздухе
образцах железо(II), образовавшееся в процессе восстановления железа(III)
алкилрезорцинами, доминирует, в сумме составляя для 5-метилрезорцина и
4-н-гексилрезорцина соответственно 75.5 и 65.1 мол. % (табл. 1). Для
сравнения
заметим,
восстановления
что
железа(III)
в
аналогичных
до
железа(II)
условиях,
еще
после
одним
полного
важнейшим
представителем продуцируемых многими микроорганизмами внеклеточных
сигнальных молекул – индолил-3-уксусной кислотой (ИУК), – высушивание
слабокислого раствора ИУК в смеси с железом(III) (после полного его
восстановления, регистрируемого по данным спектроскопии ЯГР) на воздухе
приводило к полному обратному его окислению до FeIII (см. [123] и
77
цитированные работы). В связи с этим очевидно, что продукты окисления АР
(например, упомянутые выше алкилированные тригидроксибензолы и (или)
соответствующие им гидроксилированные алкилированные хиноны, если
они частично образуются при дальнейшем окислении первых) образуют
достаточно
прочные
хелатные
комплексы
с
железом(II),
которые
препятствуют его окислению на воздухе в процессе высушивания.
3.4.
Мёссбауэровское
исследование
влияния
кислотности
на
скорость редокс-взаимодействий железа(III) с 4-н-гексилрезорцином в
водных средах
В соответствии с описанными выше результатами, наиболее быстро
окисляющимся АР при pH ~ 3 из изученных в данной работе является 4-н-ГР
(4-н-гексилрезорцин). В связи с этим, для изучения диапазона кислотности
среды, в котором возможно протекание окислительно-восстановительного
процесса с участием 4-н-ГР и железа(III) с заметной скоростью, были
проведены исследования методом мёссбауэровской спектроскопии (в
замороженных растворах), позволяющей количественно идентифицировать
относительные количества железа(III) и железа(II), включая их различные
химические формы.
Исследования влияния кислотности среды (pH) на скорость редокспроцессов в реакции 4-н-ГР с железом(III) проведены в диапазоне pH 1.5–4.5
в водных средах (с содержанием этанола 20 об.%) в быстро замороженных
растворах).
При
подготовке
образцов
для
мёссбауэровской
использовали железо, обогащенное изотопом
спектроскопии
57
Fe до 90%. Реакционные
смеси содержали 0.50 мл исходного 0.06 М раствора 4-н-ГР (в воде с 25 об.%
абсолютного этанола для увеличения растворимости) и 0.10 мл 0.1 М водного
раствора FeCl3, что отвечало мольному соотношению Fe:АР = 1:3 (общая
78
концентрация Fe
в
конечной смеси
0.016
М).
Значение pH
при
необходимости доводили до нужных значений введением небольших
количеств 1 М KOH (или HCl при необходимости понижения pH) при
непрерывном перемешивании; конечная концентрация этанола во всех
образцах составляла 20 об.%).
Для измерения мёссбауэровских спектров смесь реагентов, закрытую
фольгой для исключения испарения и воздействия света, выдерживали
заданное время при комнатной температуре и затем быстро замораживали в
жидком азоте. Иные подробности методики измерений и аппаратуры
описаны в работах [97, 101].
Мёссбауэровские спектры приготовленных смесей 4-н-ГР с железом(III)
в водно-этанольных растворах при конечных значениях pH 1.5, 3.0
(заморожены через 1 мин после смешивания) и 3.7 (заморожен через 30 мин),
измеренные при температуре 80 К, приведены на рис. 17,а–в. Положение
квадрупольных дублетов, соответствующих различным химическим формам
железа, на рис. 17 показано над спектрами скобками (цифрами справа от
скобок указаны соответствующие данным формам степени окисления
железа).
На спектре (а) уширенная магнитная составляющая, отвечающая
мономерным гидролизованным формам железа(III), показана тонкой линией.
Штриховкой выделены спектральные компоненты (квадрупольные дублеты),
отвечающие железу(III) (светлая штриховка) и железу(II) (более темные
области), дающие вклад в суммарный спектр (сплошная огибающая линия),
полученный аппроксимацией экспериментальных данных (точки).
Параметры, рассчитанные из спектроскопических данных, сведены в
табл. 2.
79
Рис. 17. Мёссбауэровские спектры водно-этанольных (20 об.% этанола)
57
FeIII-содержащих растворов 4-н-гексилрезорцина (мольное соотношение 1:3
соответственно; [Fe]общ = 0.016 М) с конечными значениями pH = 1.5 (а), 3.0
(б) и 3.7 (в), быстро замороженных через 1 мин (а, б) и 30 мин (в) после
смешения реагентов (измерения проведены при температуре 80 К)
80
Таблица 2. Мёссбауэровские параметрыа водно-этанольных (20 об.% этанола)
57
FeIII-содержащих растворов 4-н-гексилрезорцина (мольное соотношение
1:3, соответственно; [Fe]общ = 0.016 М) с указанными значениями pH, быстро
замороженных до 80 К через указанные промежутки времени (измерения
проведены при температуре 80 К; см. также рис. 17 и 18)
Условия приготовления Степень
,
,
эксп,
S r,
(pH, время выдержки окисления
ммс–1
ммс–1
ммс–1
%
до замораживания)
Fe
pH=1.5 (1 мин)
+3 б
–
–
–
91.9
+2
1.38(2)
3.44(3)
0.44(3)
8.1
+3
0.4(1)
0.77(2)
0.51(2)
85.6
+2
1.31(2)
3.35(4)
0.27(5)
14.4
+3
0.46(1)
0.72(2)
0.52(2)
100
2 мин при pH=3.7 + +3
0.47(2)
0.72(3)
0.47(4)
87.7
70 мин при pH=2.3
+2
1.44(6)
3.4(1)
0.3(1)
12.3
pH=4.5 (60 мин)
+3
0.46(1)
0.71(2)
0.52(3)
100
pH=3.0 (1 мин)
pH=3.7 (30 мин)
Примечания.
а
 – изомерный сдвиг (относительно α-Fe при комнатной температуре);  –
квадрупольное расщепление; эксп – экспериментально измеряемая полная
ширина линии на середине интенсивности (в скобках приведены значения
расчетной ошибки в последнем знаке); Sr – площадь спектральной
компоненты (в % от общей площади спектра), отвечающая содержанию Fe в
данной форме относительно общего содержания Fe в образце (при условии
равенства вероятности эффекта Мёссбауэра для всех форм); относительная
ошибка величины Sr 4%.
б
Уширенная компонента с магнитной сверхтонкой структурой (значения Sr
оценены из спектра ориентировочно).
81
При pH~1.5 мёссбауэровский спектр образца, замороженного через 1
мин после смешивания реагентов, содержал уширенную компоненту с
магнитной сверхтонкой структурой (см. рис. 17,а), характерной для
мономерных гидратированных ионов Fe3+, которые в данных условиях,
очевидно, частично гидролизованы [124].
Тем не менее, на спектре уже через 1 мин отчетливо выделяется
квадрупольный
дублет,
соответствующий
железу(II),
с
параметрами,
типичными для аквокомплексов [Fe(H2O)6]2+ [97, 105], что указывает на
достаточно быстрое восстановление железа(III) в данных условиях (см. табл.
2; оценка дает около 8% FeII, хотя точность определения относительной
площади компонент в этом случае невелика).
Скорость восстановления железа остается достаточно высокой и при
pH~3 (см. рис. 17,б и табл. 2): уже через 1 мин после смешения фиксируется
~14% железа(II). Тем не менее, уже при pH ~ 3.7 наличия железа(II) не было
выявлено даже через 30 мин (см. рис. 17,в и табл. 2; аналогичные данные
получены для смеси, выдерживавшейся при pH ~ 4.5 в течение часа; спектр
не показан; см. табл. 2).
Для проверки возможности возобновления протекания редокс-процесса
при последующем понижении pH смесь
57
FeCl3 и 4-н-гексилрезорцина,
выдерживавшаяся 2 мин при pH ~ 3.7 при комнатной температуре, была
подкислена
(медленным
добавлением
малых
порций
HCl
при
перемешивании) до pH ~ 2.3 и далее выдержана в течение 70 мин при
комнатной температуре.
В мёссбауэровском спектре быстро замороженной после этого смеси
(рис. 18) наблюдалось появление квадрупольного дублета, соответствующего
железу(II) (с относительным содержанием ~12%), наряду с соответствующим
дублетом железа(III).
82
Рис. 18. Мёссбауэровский спектр водно-этанольного (20 об.% этанола)
57
FeIII-содержащего раствора 4-н-гексилрезорцина (мольное соотношение 1:3,
соответственно; [Fe]общ = 0.016 М), выдержанного при pH~3.7 в течение 2
мин, в котором затем pH был доведен до 2.3, и через 70 мин быстро
замороженного (измерение спектра проведено при температуре 80 К).
Обозначения на спектре и штриховка расшифрованы в подписи к рис. 17 (см.
также табл. 2)
Полученный результат указывает на возобновление процесса окисления
4-н-гексилрезорцина, хотя и значительно более медленного, железом(III).
Последнее, очевидно, находится в данной системе в форме полиядерных
гидроксосоединений и коллоидных форм (параметры квадрупольного
дублета, соответствующего железу(III), в данном случае практически
совпадают с таковыми для смесей, выдерживавшихся при pH 3.7 и 4.5; см.
83
табл. 2) [97, 105]. Этим, в частности, может объясняться более медленное
протекание редокс-процесса в данном случае (см. рис. 18) по сравнению с
условиями при исходных значениях pH~1.5 и ~3 (см. рис. 17,а–б). В случае
полиядерных и коллоидных форм окислительно-восстановительный процесс
протекает, очевидно, на поверхности коллоидных частиц, что существенно
замедляет реакцию по сравнению с мономерными или олигомерными
формами.
Таким образом, в данном разделе работы методом мёссбауэровской
спектроскопии изучено взаимодействие железа(III) с 4-н-гексилрезорцином в
диапазоне pH 1.5–4.5 в водных средах (замороженные растворы). Протекание
сопряженного процесса окисления 4-н-гексилрезорцина железом(III) при
pH~3 прослежено методом УФ-спектрофотометрии. Показано, что редокспроцесс протекает с высокой скоростью при pH 1.5–3.0, однако резко
замедляется при pH > 3 и практически не идет при pH около 4 и выше (тем не
менее, возобновляясь, хотя и со сравнительно невысокой скоростью, при
повторном подкислении среды до pH < 3).
Следует отметить, что в реальных системах (кислые почвы, водоносные
слои [104, 105]) подобные процессы, приводящие к окислительной
деградации
наиболее
определенной
реакционноспособных
структурой,
микроорганизмов,
могут
участвующих
существенным
в
алкилрезорцинов
процессах
образом
с
ауторегуляции
влиять
на
обмен
микробными молекулярными сигналами, снижая их концентрацию в среде, в
частности, в зависимости от кислотности среды.
3.5.
Анализ
кинетических
закономерностей
процессов
взаимодействия алкилрезорцинов с железом(III)
В соответствии с некоторыми имеющимися литературными данными
(см., например, [1, 52, 125] и цитируемые в них работы), первый этап
84
окисления АР может представлять собой дополнительное гидроксилирование
бензольного кольца с образованием тригидроксилированных алкилбензолов.
Этот путь был показан для 5-метилрезорцина (орцина) в ферментативной
реакции для бактерий [125], а также предполагался в некоторых других
случаях в биологических системах [52]. Формально это эквивалентно
“введению” атома кислорода в С–Н-связь ароматического кольца с
образованием соответствующей связи С–О–Н в соответствии со следующей
схемой:
AlkC6H3(OH)2 + [O] = AlkC6H2(OH)3,
(1)
где «Alk» – алкильная группа.
При выбранных экспериментальных условиях (рН ~ 3), как было
отмечено выше, железо(III) в отсутствие сильных комплексообразующих
агентов находится в коллоидной (полиядерной) гидролизованной форме.
Таким образом, учитывая, что первый этап окисления АР (с эквивалентом
“формирования” и введением атома кислорода в С–Н-связь) является
двухэлектронной реакцией (т.е. при этом соответственно два иона Fe3+
переходят в 2Fe2+), можно полагать, что реакция между гидролизованными
формами железа(III) и АР при этих условиях будет протекать между парой
соседних ионов гидроксилированного Fe3+ (в полиядерной форме) и
молекулами АР в соответствии со следующей общей схемой:
[FeIII2(OH)2]4+ + AlkC6H3(OH)2 = 2Fe2+ + H2O + AlkC6H2(OH)3.
(2)
Более общая схема с участием многоядерных молекул гидроксилированных
форм железа(III) выглядит следующим образом:
85
[FeIIIx(OH)y]3x–y + AlkC6H3(OH)2 = 2Fe2+ + [FeIIIx–2(OH)y–2]3x–y–4 + H2O +
AlkC6H2(OH)3
(3)
Согласно этой схеме следует ожидать, что скорость реакции должна
быть пропорциональна общей концентрации железа(III) и концентрации АР.
В наших экспериментах начальное молярное соотношение [Fe3+] и [AР] было
принято
во
всех
случаях
равным
1:3,
а
общая
доля
железа(III),
восстановленного до железа(II), была в пределах 6.7–31.2% (табл. 3).
Поскольку
два
моля
железа(III),
восстановленного
до
железа(II),
соответствуют одному молю окисленного АР (см. уравнения 2 и 3), можно
ожидать, что общая доля окисленного AР в наших кинетических
экспериментах (с учетом исходного соотношения [Fe3+]:[AР] = 1:3)
находилась в пределах ~1.1–5.2% от исходной концентрации (т.е. не
превышала величину ок. 5%). В этом случае для кинетических расчетов
концентрацию AР можно приблизительно считать постоянной.
Таким образом, кинетическое уравнение при постоянном значении рН (и
концентрации АР, принимаемой постоянной) можно упростить следующим
образом:
–dC(t)/dt = kC(t),
(4)
где C(t) – текущая концентрация железа(III) в реакционной среде в момент
времени t (где начальное условие t = 0 соответствует моменту смешения
реагентов), а k – эффективная константа скорости псевдо-первого порядка
относительно
концентрации
железа(III)
(знак
минус
соответствует
уменьшению концентрации железа(III) в ходе реакции).
Надо обратить внимание на то, что в уравнении (4) концентрация может
быть выражена в различных единицах. Для простоты мы использовали
величину C(t) как отношение текущей концентрации железа(III) к его
86
начальной концентрации (что эквивалентно общей концентрации железа в
реакционной среде), так что при t = 0 значение C(t) = 1; таким образом,
формально, 1 ≥ C(t) ≥ 0.
Интегрируя уравнение (4) с граничными условиями от C(t) = 1 до C(t) и,
соответственно, от t = 0 до t, получим следующее простое выражение:
ln[C(t)] = –kt .
(5)
В соответствии с выражением (5), логарифм концентрации железа(III)
(которая уменьшается со временем в ходе окислительно-восстановительного
процесса) должен быть прямо пропорционален времени реакции.
Для проверки выполнимости вышеуказанной кинетической схемы и
расчета констант скорости окислительно-восстановительных процессов нами
были использованы экспериментальные данные, полученные методом
мёссбауэровской спектроскопии в водных растворах (включая водноспиртовые растворы для 4-н-ГР), быстро замороженных в жидком азоте (при
T = 80 К) через определенные промежутки времени после смешивания
реагентов (при pH ~3). Для удобства данные параметры сведены в табл. 3
(часть из них обсуждалась выше).
Прежде всего, для проверки отсутствия железа(II) в исходном растворе,
было проведено отдельное измерение спектра ЯГР исходного раствора
железа(III) (рис. 19). Данный спектр содержит одну типичную сильно
уширенную линию (из-за медленной спиновой релаксации моноядерных
ионов Fe3+), соответствующую гидролизованным формам железа(III) в
кислой среде. Из данного спектра следует, что в исходном растворе не
содержалось железа(II), которое дает квадрупольный дублет с заметно
отличающимися параметрами [124].
87
Рис. 19. Мёссбауэровский спектр замороженного образца исходного
водного раствора 57FeCl3 (0.056 М), используемый для экспериментов по
окислению алкилрезорцинов (измерен при Т = 80 К)
Далее, при измерениях в присутствии 5-метилрезорцина в водных
растворах в присутствии железа(III) при pH ~3, помимо измерений в воде
(после 10 мин, 3 ч и 5.5 ч), для сравнения было проведено измерение спектра
ЯГР для 5-метилрезорцина в водно-спиртовом растворе (20 об.% этанола)
также через 3 ч после смешивания реагентов (рис. 20,с). Это измерение было
проведено специально для уточнения степени влияния 20 об.% этанола на
скорость окислительно-восстановительного процесса при pH ~3 (поскольку в
случае 4-н-гексилрезорцина необходимо было использовать только водноэтанольный раствор с 20 об.% этанола для увеличения растворимости 4-нГР), а также для оценки возможности сравнения данных в водной и водноспиртовой среде.
88
Полученные результаты показывают, что в случае 5-МР реакция
протекает однотипно как в водном, так и в водно-спиртовом (20 об.%
этанола) растворе (см. табл. 3): в частности, параметры полученных спектров
как для компоненты, соответствующей железу(III), так и для компоненты,
соответствующей
железу(II),
принципиально
не
отличаются.
Наблюдающиеся незначительные различия мёссбауэровских параметров
вполне можно отнести за счет частичного участия молекул этанола в
сольватной оболочке ионов (наиболее вероятно, во второй координационной
сфере). Подтверждением этого может служить тот факт, что для компонент,
соответствующих железу(II), во всех водных растворах (для 5-МР и 5-н-ПР,
см. табл. 3) при близких значениях изомерного сдвига (около 1.4 мм/с)
значения квадрупольного расщепления находятся в диапазоне 3.17–3.26 мм/с,
тогда как в случае водно-этанольных растворов данные значения (для 5-МР в
водно-этанольном растворе после 3 ч, а также для 4-н-ГР) находятся в
диапазоне 3.34–3.39 мм/с, что указывает на несколько большее искажение
симметрии сольватной оболочки (координационного полиэдра) ионов 57Fe3+ в
последнем случае.
Помимо этого, в соответствии с полученными данными количество
железа(II), образовавшегося после 3 ч реакции, в случае водного раствора
составило около 18% (от общего его содержания), в то время как в водноэтанольном растворе – около 14%. Это незначительное различие могло быть
обусловлено, помимо некоторой расчетной ошибки при аппроксимации
спектров (±4 относительных % для расчетной величины относительной
площади спектральных компонент – квадрупольных дублетов), также
некоторой
экспериментальной
ошибкой
(небольшой
разницей
в
экспериментально устанавливаемых значениях pH данных растворов) при
одинаковом содержании железа(III).
Таким образом, можно полагать, что присутствие 20 об.% этанола не
сказывается существенным образом на механизме (продуктах) и кинетике
89
(скорости) окислительно-восстановительного процесса при pH ~3 между АР
и железом(III). Следовательно, можно считать вполне правомерным
сравнение кинетических данных, с одной стороны, для 5-метилрезорцина и 5н-пропилрезорцина (в водной среде) и, с другой стороны, для 4-нгексилрезорцина (в водно-этанольном растворе с 20 об.% этанола).
Следует также отметить, что проведенное исследование продуктов
взаимодействия 5-н-пропилрезорцина (5-н-ПР) с железом(III) при pH~3 в
аналогичных условиях (водный раствор, быстро замороженный через 2 ч 20
мин после смешивания реагентов) с помощью спектроскопии ЯГР показало
значительно более медленное протекание данного процесса даже по
сравнению с 5-метилрезорцином (см. табл. 3). По прошествии более 2 ч в
реакционной смеси обнаружено 8% железа(II) от общего его количества (в
случае 5-метилрезорцина близкое количество железа(II) образовывалось уже
через 10 мин). Мёссбауэровские параметры полученных для 5-н-ПР
продуктов как для железа(III), так и для железа(II) принципиально не
отличались от данных, полученных для 5-МР и 4-н-ГР (см. табл. 3).
Возвращаясь
к
кинетической
схеме,
отметим,
что
наши
экспериментальные данные (полученные из мёссбауэровских измерений; см.
табл. 3) для 5-метилрезорцина, представленные в полулогарифмических
координатах lg[C(t)] – t, действительно показывают очень хорошую
линейную корреляцию (R2 = 0.9993). Однако следует заметить, что
полученная аппроксимацией (методом наименьших квадратов) прямая линия
не выходит из начала координат (рис. 21а; время t на рисунке дано в
минутах). Этот факт можно с логической точки зрения объяснить тем, что в
самые начальные моменты реакции (в относительно короткий начальный
период) для только что образованных (при смешивании реагентов)
гидроксилированных форм железа(III) может происходить достаточно
быстрый процесс «старения» (что очень характерно для свежеобразованных
гидроксидов многих металлов, включая железо). В этом случае скорость
90
реакции
в
начальный
период
(до
завершения
процесса
старения
гидроксилированных форм железа(III) в системе) будет значительно выше в
связи
с
существенно
более
высокой
химической
активностью
свежеобразованных гидроксилированных форм.
Таким образом, кинетическая схема (4) в действительности может
выполняться, начиная не с t = 0, а с некоторого t = t1 (где t1 > 0), и поэтому
отношение (4) вступает в силу с C(t1) = C1.
Соответственно, интегрирование уравнения (4) (после разделения
переменных) должно быть выполнено для граничных условий от C1 до C(t),
где C(t) < C1, и от t1 до t (где t > t1), что в конечном итоге приводит к
следующему выражению (в десятичных логарифмах):
lg[C(t)] = (lgC1 + 0.4343kt1) – 0.4343kt .
Уравнение
(6)
отражает
существование
(6)
небольшого
отрезка,
отсекаемого на оси ординат при t = 0, равного (lgC1 + 0.4343kt1) = const, на
линейной зависимости (см. рис. 21а). (Очевидно, что значение k может быть
вычислено по наклону линейной регрессии, тогда как C1 и t1 не могут быть
одновременно вычислены из отрезка, отсекаемого на оси ординат при t = 0.)
Можно также полагать, что, в то время как значение lgC1 является
отрицательным (поскольку C1 < 1), а 0.4343kt1 является очевидно
положительным (поскольку t1 > 0; см. выше), общее значение отрезка,
отсекаемого на оси ординат при t = 0 (который является отрицательным в
обоих случаях; см. рис. 21а,б), может определяться доминирующим
значением lgC1, особенно для небольших значений k (см. ниже), например, на
рис. 21а, где значение t1 может составлять порядка ~1 мин.
Тем не менее, значения C1 и t1 для водного раствора (рис. 21,а) и в
присутствии 20 об.% этанола (рис. 21,б) могут немного отличаться, что,
наряду с различными значениями k (см. ниже), может объяснить небольшое
91
различие в величинах отрезков, отсекаемых на оси ординат при t = 0,
рассчитываемых в соответствии с уравнением (6), а именно: расчетные
значения lg[C(t = 0)] составляют –0.028 (рис. 21,а)
и –0.044 (рис. 21,б),
соответственно.
Для системы с участием 5-метилрезорцина, в соответствии с уравнением
(6), расчет по данным рис. 21а дает следующее значение для константы
скорости окислительно-восстановительного процесса при рН ~ 3:
k = (1.20 ± 0.02)×10–5 с–1.
Наша оценка для 4-н-гексилрезорцина (по данным рис. 21,б) дает
величину соответствующей константы скорости k = 9.1×10–4 с–1 (то есть,
практически на 2 порядка больше, чем для 5-метилрезорцина). Учитывая
одинаковое ожидаемое значение отрезка, отсекаемого на оси ординат при t =
0 (в котором преобладает значение lgC1, особенно для небольших значений k;
см.
выше
и
уравнение
(6)),
для
подобных
водных
растворов 5-
метилрезорцина (см. рис. 21а) и 5-н-пропилрезорцина (поскольку величина
этого отрезка в первую очередь определяется растворителем – в данном
случае это вода – и однотипным составом раствора, влияющими на скорость
старения гидроксо-форм железа(III)), константу скорости окислительновосстановительного процесса для 5-н-пропилрезорцина (см. данные по рис.
20,е и в табл. 3) можно оценить как k = 2.3×10–6 s–1, то есть в 5 раз ниже, чем
для 5-метилрезорцина.
Таким образом, кинетическая последовательность значений скорости
реакции
по
полученным
экспериментальным
данным
(в
условиях,
применяемых в настоящем исследовании) такова:
4-н-гексилрезорцин (k = 9.1×10–4 с–1) >> 5-метилрезорцин (k = 1.2×10–5 с–1) >
5-н-пропилрезорцин (k = 2.3×10–6 с–1).
92
Таблица 3. Мёссбауэровские параметрыа для
57
FeIII-содержащих водных
растворов 5-метилрезорцина (5-MР; орцина), 5-н-пропилрезорцина (5-н-ПР) и
4-н-гексилрезорцина (4-н-ГР) при рН ~ 3 (общая концентрация [Fe] = 0,016 ±
0.001 М; молярное соотношение Fe:АР = 1:3), быстро замороженных после
указанных периодов времени (все спектры измерены при Т = 80 К)
АР с 57FeIII в
растворе
Степень
б
Время
3h
5-МР
3hж
5.5 h
4-н-ГР
, г
эксп, д
S r, е
ммс–1
ммс–1
ммс–1
%
+3
0.48(1)
0.74(1)
0.52(1)
93.3
+2
1.41(1)
3.22(1)
0.34(1)
6.7
+3
0.478(3)
0.70(1)
0.75(1)
82.1
+2
1.39(1)
3.17(1)
0.56(2)
17.9
+3
0.475(4)
0.72(1)
0.64(1)
86.2
+2
1.42(1)
3.34(2)
0.44(3)
13.8
+3
0.48(1)
0.72(1)
0.50(1)
74.1
+2
1.38(1)
3.23(1)
0.42(1)
25.9
+3
0.47(1)
0.80(2)
0.25(2)
92.0
+2
1.35(1)
3.26(1)
0.40(2)
8.0
+3
0.4(1)
0.77(3)
0.51(3)
85.6
+2
1.31(1)
3.35(1)
0.27(2)
14.4
+3
0.475(3)
0.757(4)
0.49(1)
68.8
+2
1.402(3)
3.388(5)
0.34(1)
31.2
окисления
железа
10 min
5-н-ПР
, в
140 min
1 min ж
5 min ж
Примечания:
а
) Ошибки вычислений (стандартное отклонение; для последней значащей
цифры) приведены в скобках. б) Период со смешения реагентов до быстрого
замораживания раствора. в) Изомерный сдвиг (по отношению к α-Fe при
комнатной температуре). г) Квадрупольное расщепление. д) Полная ширина
линии на половине высоты. е) Площадь спектральной компоненты (в % от
общей площади спектра), отвечающая содержанию Fe в данной форме
относительно общего содержания Fe в образце (при условии равенства
вероятности эффекта Мёссбауэра для всех форм; для Sr относительная
погрешность составляет около 4% из указанных значений). ж) В водном
растворе с содержанием этанола 20 об.%
93
Рис. 20. Мёссбауэровские спектры продуктов взаимодействия [57Fe]железа(III) с 5-метилрезорцином (5-MР; a, b, c, d), 5-н-пропилрезорцином (5н-ПР; e) и 4-н-гексилрезорцином (4-н-ГР; f, g) в водных растворах (a, b, d, e)
или в присутствии 20 об.% этанола (c, f, g) при рН ~ 3, быстро замороженных
в жидком азоте через 10 мин (a), 3 ч (b, c), 5,5 ч (d), 140 мин (e), 1 мин (f) и 5
мин (g) после смешения реагентов (все спектры измерены при Т = 80 К).
Штриховкой выделены спектральные компоненты (квадрупольные дублеты),
отвечающие железу(III) (светлая штриховка) и железу(II) (более темные
области), дающие вклад в суммарный спектр (сплошная огибающая линия),
полученный аппроксимацией экспериментальных данных (точки)
94
Рис. 21. Кинетика восстановления железа(III) при рН ~3 (а) 5метилрезорцином и (б) 4-н-гексилрезорцином. C(t) представляет собой
текущую концентрацию железа(III) (в долях единицы относительно общего
содержания железа в растворе), рассчитанную из мёссбауэровских
спектроскопических данных (см. табл. 3)
95
3.6.
Результаты
квантово-химического
исследования
и
их
обсуждение в сравнении с экспериментальными данными
В экспериментальной части данной работы были получены существенно
(на несколько порядков) различающиеся между собой значения скорости
окисления молекул АР различной структуры железом(III) в однотипных
условиях (при pH ~ 3). Для того, чтобы получить теоретические объяснения
возможности
существенных
различий
относительной
активности
в
окислительно-восстановительных процессах для данных соединений, в
настоящей
работе
проведены
расчеты
адиабатических
потенциалов
ионизации для ряда исследуемых в данной работе алкилированных
резорцинов, а также их неалкилированного аналога (резорцина).
Термодинамической мерой способности молекулы отдавать электрон
(т.е. способности окисляться) является энергия ионизации, или (чаще
употребляемый термин) потенциал ионизации (IP).
Формально
потенциалов
U,
потенциал
которую
ионизации
должен
–
пройти
это
минимальная
электрон
в
разность
ускоряющем
электрическом поле, чтобы приобрести кинетическую энергию, достаточную
для ионизации частицы. Синонимом является энергия ионизации Е, т.е.
минимальная энергия, необходимая для удаления электрона из частицы на
бесконечность.
Адиабатический потенциал ионизации (IPadiabat) определяется разностью
между минимумами потенциальных поверхностей для катион-радикала
(продукта ионизации молекулы, отдающей электрон) и для исходной
молекулы [126].
В настоящей работе значения IPadiabat для неалкилированного мдигидроксибензола (резорцина) и исследуемых трех его алкилированных
производных (5-МР, 5-н-ПР и 4-н-ГР) были рассчитаны из разности значений
96
полной энергии без учета нулевой колебательной энергии (IPid) и с учетом
нулевой колебательной энергии (IPzero); с учетом нулевой колебательной
энергии и термических поправок (IPtherm), а также из разности значений
свободной энергии Гиббса с учетом нулевой колебательной энергии и
термической энергии (IPGibbs). Полученные результаты приведены в табл. 4.
Как следует из табл. 4, максимальные различия между расчетными
значениями IPid, IPzero, IPtherm и значением IPGibbs для каждого вещества
находятся в пределах 0.02-0.05 эВ. Для сравнения, значение IPadiabat,
экспериментально измеренное с помощью метода фотоионизации для
структурно сходной молекулы гидрохинона (п-дигидроксибензола), по
данным работы [127] составляло 7.950.03 эВ, что близко к полученным
нами величинам. Наши рассчитанные результаты также хорошо согласуются
с данными, представленными в недавней работе [128], где значения IPadiabat
для изолированного (в вакууме) гидрохинона (7.96 эВ), пирокатехина (одигидроксибензола; 8.19 эВ) и резорцина (м-дигидроксибензола; 8.23 эВ)
были рассчитаны с использованием теории G3 (программы Gaussian 03) с
помощью методики, аналогичной использованной в данной работе, а именно
как разность между свободной энергии Гиббса для значений катионрадикалов и исходной молекулы. Таким образом, уровень B3LYP/6311++G(3d,3p), очевидно, достаточен для сравнительной оценки значений
IPadiabat в ряду производных резорцина.
Согласно полученным данным, в соответствии с любым из полученных
критериев (IPid, IPzero, IPtherm или IPGibbs; см. табл. 4), способность подвергаться
окислению должна уменьшаться в следующем ряду:
4-н-гексилрезорцин >> 5-н-пропилрезорцин > 5-метилрезорцин >> резорцин.
Таким
образом,
рассмотрение
термодинамических
параметров
показывает, что алкилирование резорцина и дальнейшее увеличение длины
алкильного заместителя должно приводить к повышению восстановительной
способности алкилированных резорцинов.
97
Учитывая наши экспериментальные данные (см. рис. 20 и табл. 3), а
также данные о невозможности неалкилированного аналога (резорцина)
окисляться
в
аналогичных
условиях
[95],
соответствующая
экспериментальная серия выглядит как:
4-н-гексилрезорцин >> 5-метилрезорцин > 5-н-пропилрезорцин >> резорцин.
Таким образом, квантово-химические оценки IPadiabat для серии этих
производных резорцина, в соответствии с экспериментальными данными,
подтверждают наиболее высокую способность 4-н-гексилрезорцина в
окислительно-восстановительных
процессах
отдавать
электрон,
и
подтверждает самую низкую способность к окислению в отношении
резорцина [95].
Однако термодинамические расчеты (IPadiabat) предсказывают более
высокую способность к окислению для 5-н-пропилрезорцина по сравнению с
5-метилрезорцином, в то время как эксперимент показывает обратное. Это,
наиболее вероятно, может быть связано с воздействием кинетических
параметров (существенных для водной среды), связанных, например, с более
высокой гидрофобностью 5-н-пропилрезорцина и/или его предполагаемым
более низким коэффициентом диффузии (по сравнению с 5-метилпроизводным).
Что касается наибольшей скорости окислительно-восстановительного
процесса, то экспериментальным и расчетным путем показано, что она
существенно
выше
у
4-н-гексил-производного.
Следовательно,
из
совокупности полученных данных можно сделать вывод, что алкилирование
резорцина (1,3-дигидроксибензола) в положении 4 ароматического кольца
может быть дополнительным благоприятным условием для окисления
полученных 4-алкирезорцинов, по сравнению с 5-алкилрезорцином, даже с
учетом более длинного 4-н-алкильного заместителя (что, как следует из
сравнения данных об относительных скоростях окисления 5-метил- и 5-н-
98
пропилрезорцина, может в целом понижать скорость окисления из-за
предполагаемого влияния кинетических факторов).
Таким образом, возможность АР окисляться железом(III) в слабокислых
средах с различной скоростью в зависимости от структуры молекулы АР
наблюдалась нами экспериментально и в целом подтверждена с помощью
квантово-химических
расчетов
термодинамических
величин
–
адиабатических потенциалов ионизации. Полученные результаты могут
иметь важное экологическое значение для процессов микробного сигналинга
в реальных условиях (в кислых почвах и водоносных слоях).
Таблица 4. Расчетные значения адиабатического потенциала ионизации (эВ) а
для резорцина (1,3-дигидроксибензола) и некоторых его алкилированных
производных
Вещество
IPid
IPzero
IPtherm
IPGibbs
резорцин
7.98
7.99
7.98
7.97
5-метилрезорцин
7.83
7.84
7.83
7.82
5-н-пропилрезорцин
7.73
7.74
7.74
7.75
4-н-гексилрезорцин
7.52
7.55
7.54
7.57
Примечания.
а
Расчет производился из разности значений полной энергии без учета (IPid) и
с учетом нулевой колебательной энергии (IPzero); с учетом нулевой
колебательной энергии и термических поправок (IPtherm), а также из разности
значений свободной энергии Гиббса с учетом нулевой колебательной
энергии и термической энергии (IPGibbs).
99
3.7. Исследование продуктов взаимодействия 4-н-гексилрезорцина с
железом(III)
методом
газовой
хроматографии
с
масс-
спектрометрическим детектированием
Для
изучения
реакции
взаимодействия
4-н-гексилрезорцина
с
железом(III) и с целью идентификации полученных соединений был выбран
хлорид железа(Ш), водный раствор которого смешивался с водно-спиртовым
(20 об.% этанола) раствором 4-н-гексилрезорцина. Реакцию проводили таким
же образом, как и в случае исследования продуктов взаимодействия методом
мёссбауэровской спектроскопии, однако в данном случае не использовали
обогащенные изотопом 57Fe препараты железа(III).
С целью исключения наличия продуктов окисления (образование
которых возможно при хранении реактива) в выбранном для проведения
эксперимента
4-н-гексилрезорцине,
данный
реактив
перед
началом
исследований проверяли на чистоту методом газовой хроматографии с массспектрометрическим детектированием.
В результате для исследуемого на чистоту 4-н-гексилрезорцина
получена хроматограмма (рис. 22), единственным компонентом на которой
было вещество, идентифицированное как 4-н-гексилрезорцин (см. массспектры компонента, выявленного на хроматограмме, рис. 23).
100
Abundance
TIC: 25-1.D\data.ms
380000
360000
340000
320000
300000
280000
260000
240000
220000
200000
180000
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
35.00
40.00
Tim
e-->
Рис. 22. Хроматограмма исследуемого реактива (4-н-гексилрезорцин)
101
123
100
50
194
27 32
0
41
55
77 82
67
20
30
40
50
60
70
80
(Text File) Scan 1483 (11.462 min): 25-1.D\ data.ms
89 95
90
103 110
100
110
119
131 137
120
130
147
140
150
160
170
180
190
200
210
200
210
200
210
123
100
50
26 32
0
41
40
50 55
51 55
40
50
62 67
67
77 82 89 94
77 84
95
103 109 115
107
131 137
135
194
147
149
194
50
100
123
20
30
60
70
80
90
Scan 1483 (11.462 min): 25-1.D\ data.ms
100
110
120
130
140
150
160
Head to Tail MF=947 RMF=952
170
180
190
Hexylresorcinol
123
100
OH
OH
50
194
41
0
20
30
40
(nist) Hexylresorcinol
67
55
50
60
77
70
80
95
84
90
110
100
110
135
120
130
140
149
150
160
170
180
190
Рис. 23. Масс-спектр вещества, выявленного на хроматограмме (см. рис. 22)
В
результате
взаимодействия
хлорида
железа(III)
с
4-н-
гексилрезорцином получена реакционная смесь, которая для дальнейшего
исследования экстрагировалась хлороформом (продукт А). В дальнейшем
полученный хлороформный экстракт реакционной смеси исследовали
методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием в
102
условиях, приведенных выше в разделе, посвященном описанию методов
исследования.
В процессе анализа установлено, что на хроматограмме хлороформного
экстракта продукта А (рис. 24), наряду с основным компонентом – 4-нгексилрезорцином (непрореагировавший остаток), присутствуют сигналы
компонентов, отсутствовавших в исходном образце 4-н-гексилрезорцина (см.
рис. 22).
300000
280000
260000
240000
220000
200000
180000
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
35.00
Рис. 24. Хроматограмма хлороформного экстракта продукта А
Изучение
проводилось
обнаруженных
с
компонента,
на
хроматограмме
детектируемого
при
сигналов
12.163
веществ
мин
на
хроматограмме (на рис. 25 показана её левая часть в увеличенном масштабе),
количество которого является преобладающим (остаточный преобладающий
4-н-гексилрезорцин при этом в расчет не принимали).
В результате анализа масс-спектра (рис. 26) вещества, детектируемого
при 12.163 мин на хроматограмме (см. рис. 25), а также изучения возможных
путей его фрагментации (рис. 27) ему можно приписать структуру
алкилированного гидроксилированного пара-хинона.
103
Забегая
вперед,
следует
отметить,
что
образование
данного
алкилированного гидроксилированного пара-хинона объясняется окислением
образующегося в процессе реакции 4-н-гексилрезорцина с железом(III) при
pH~3 н-гексил-тригидроксибензола (см. схему на рис. 27) в процессе массспектрометрического детектирования последнего в присутствии железа(III) в
хлороформном экстракте; см. ниже.
A
bundance
TIC
: 25-2.D\ data.m
s
OH
160000
O
150000
140000
130000
O
120000
110000
100000
90000
80000
70000
60000
50000
40000
30000
20000
9.00
10.00
11.00
12.00
13.00
14.00
15.00
16.00
Tim
e-->
Рис. 25. Фрагмент хроматограммы продукта А
123
100
50
28
32
0
20
30
208
44
40
55
50
67
60
70
77
80
95 103 110
90
100
110
136
120
130
140
194
147
150
160
170
180
190
200
Рис. 26. Масс-спектр вещества, детектируемого на 12.163 мин
210
220
104
Рис. 27. Наиболее вероятная схема фрагментации гидроксилированного пхинона (III), детектируемого на хроматограмме при 12.163 мин (см. рис. 25),
образующегося из исходного 4-н-гексилрезорцина (I) после его
гидроксилирования в растворе в присутствии железа(III) (с образованием II и
последующим окислением до III)
Наиболее вероятную схему фрагментации при масс-спектрометрическом
определении можно описать следующим образом.
Образующийся из 4-н-гексилрезорцина (М = 194) алкилированный
гидроксилированный пара-хинон имеет сигнал молекулярного иона с
105
величиной m/z 208, который легко идентифицируется на полученном массспектре.
В результате деструкции н-гексильного фрагмента вышеуказанного
пара-хинона, выраженной в потере им метильной группы, образуется слабо
устойчивый осколок с величиной m/z 194 (см. схему фрагментации).
Фрагментация
данного
осколка
идет
с
дальнейшим
отщеплением
метиленовых групп (от уже деструктированного н-гексильного фрагмента)
вплоть до фрагмента с m/z 124 (см. рис. 26 и 27), который стабилизируется
потерей протона с образованием наиболее устойчивого фрагмента с
величиной m/z 123, который наблюдается как самый интенсивный на массспектре.
(Дальнейшая
разрушением
кольца
фрагментация
с
хинонового
образованием
фрагмента
низкомолекулярных
идет
с
продуктов
деструкции.)
3.8. Исследование состава хлороформного экстракта продуктов
взаимодействия
4-н-гексилрезорцина
с
железом(III)
методом
рентгенофлуоресцентного анализа
Помимо хромато-масс-спектрометрического исследования продукта
взаимодействия 4-н-гексилрезорцина с хлоридом железа(Ш) (выделенного из
реакционной
смеси
при
помощи
экстракции
хлороформом),
нами
производилось его исследование методом рентгенофлуоресцентного анализа
(РФА; для идентификации возможного присутствия железа(III) в экстракте)
после высушивания. Данное исследование интересно тем,
что помимо
сложных процессов окисления 4-н-гексилрезорцина ионами железа Fe+3 в
результате
реакции
возможны
процессы
комплексообразования
с
образованием металлорганических соединений (комплексов) железа(III),
которые могут частично экстрагироваться в хлороформную фазу и давать
последующее
окисление
н-гексил-тригидроксобензола
(основного
106
предполагаемого
продукта
взаимодействия
железа(III)
с
4-н-
гексилрезорцином) непосредственно в процессе масс-спектрометрического
детектирования. (Следует отметить, что образование экстрагируемых в
органическую фазу комплексов для железа(II) не характерно.)
В результате анализа было установлено, что в продукте взаимодействия
присутствуют ионы железа (основные линии при 6.40 кэВ, Kα1, и 7.06 кэВ,
Kβ), характерные сигналы которого присутствуют на представленной ниже
рентгенофлуорограмме (рис. 28). (Присутствующий в спектре сигнал хлора
ок. 2.6 кэВ принадлежит хлороформу, которым производилась экстракция
органического компонента из реакционной смеси.)
Рис. 28. Спектр рентгеновской флуоресценции высушенного хлороформного
экстракта реакционной смеси продуктов взаимодействия 4-нгексилрезорцина и железа(III) при pH~3 в водно-этанольном (20% этанола)
растворе
107
3.9. Исследование продуктов взаимодействия 4-н-гексилрезорцина с
железом(III) методом ИК-спектроскопии
Для выявления особенностей структуры продуктов взаимодействия 4-нгексилрезорцина с железом(III) хлороформный экстракт реакционной массы
после высушивания был исследован с помощью метода ИК-фурьеспектроскопии (в матрице KBr).
На рис. 29 для сравнения приведен ИК-спектр 4-н-гексилрезорцина, а
также
для
высушенного
хлороформного
экстракта
продуктов
его
взаимодействия с железом(III) в водной среде (при pH ~3).
Рис. 29. ИК-фурье-спектры (1) 4-н-гексилрезорцина и (2) высушенного
хлороформного экстракта продуктов его окисления в присутствии железа(III)
при pH~3 в водно-этанольном (20 об.% этанола) растворе
108
В
спектре
характерных
исходного
полос
продукта
поглощения,
(4-н-гексилрезорцин)
в
частности,
виден
ряд
соответствующих
водородосвязанным (в конденсированной фазе) OH-группам (широкая
структурированная полоса с максимумом около 3426 см–1; отметим, что
некоторая неэквивалентность двух OH-групп по отношению к н-гексильному
заместителю в молекуле 4-н-гексилрезорцина вызывает наблюдаемую
“структурированность” данной полосы). В области 2850–2960 см–1 находятся
полосы различных валентных колебаний (C–H) групп –СН2– и –СН3
(соответствующие деформационные колебания проявляются в виде сложной
полосы с максимумом около 1466 см–1). Основная интенсивная полоса,
соответствующая ароматическому кольцу в 4-н-гексилрезорцине, находится
около 1620 см–1 [129].
При переходе к ИК-спектру экстракта продуктов взаимодействия 4-нгексилрезорцина с железом(III) наблюдается заметное изменение ряда
областей. Так, в первую очередь обращает на себя внимание наиболее
заметное расщепление сложной полосы в области валентных колебаний ОНгрупп с появлением двух максимумов около 3501 и 3377 см–1 (помимо
широкого
интенсивного
плеча
в
области
3200–3300
см–1).
Данное
расщепление указывает на появление дополнительных гидроксо-групп в
продуктах окисления 4-н-гексилрезорцина (что с большой вероятностью
предполагает
образование
результате
дополнительного
окисления).
Остальные
тригидроксо-ароматического
гидроксилирования
области
спектра
4-н-ГР
претерпевают
фрагмента
в
в
процессе
менее
явные
изменения, что подтверждает сохранность основных функциональных групп
4-н-гексилрезорцина в продуктах его окисления.
Отметим отсутствие в ИК-спектре высушенного хлороформного
экстракта отдельных интенсивных полос в области 1650–1700 см–1 (см. рис.
29, спектр 2, в сравнении со спектром 1 для исходного 4-н-гексилрезорцина),
характерных для структуры хинона (которые для п-бензохинона проявляются
109
при 1669 и 1656 см–1 по данным Беллами [129] или при 1654 см–1 по данным
[130]), наличие которого подтверждено в процессе исследования экстракта
методом хромато-масс-спектрометрии (см. раздел 3.7). Данное кажущееся
“разногласие” может быть объяснено следующим.
При высокой температуре проведения ГХ-МС-анализа вполне возможно
протекание процесса дальнейшего окисления тригидроксоароматического
фрагмента в присутствии небольших количеств совместно экстрагируемых
комплексов железа(III), детектируемых методом РФА, до хиноновой
структуры, которая и детектируется в виде доминирующего продукта
окисления (помимо интенсивного пика исходного 4-н-гексилрезорцина) на
хроматограмме (при 12.163 мин, см. рис. 25 и рис. 27) и в масс-спектре (см.
рис. 26).
Таким образом, данные ИК-спектроскопии указывают на то, что продукт
окисления 4-н-гексилрезорцина железом(III) содержит дополнительную OHгруппу (при незначительных изменениях других функциональных групп).
Это в целом хорошо согласуется с данными, полученными методом ГХ-МС и
РФА, об образовании при первичном окислении молекулы 4-н-ГР
тригидроксилированного н-гексилбензола (см. раздел 3.7).
110
Заключение
Как отмечено во введении и при анализе имеющихся литературных
данных, вопросам абиотических (химических) превращений биологических
молекул фенольного ряда, в том числе алкилрезорцинов, – в отличие от
исследований биологических процессов (включая ферментативные) с их
участием, подробно изучавшихся в течение последних лет, – незаслуженно
уделялось относительно мало внимания. Тем не менее, эти превращения
имеют существенное значение не только для химии данных фенольных
производных, но и в целом для реальных биологических, экологических и
биогеохимических систем (межклеточные процессы сигналинга в микробных
консорциумах с участием молекулярных сигналов химической природы;
растительно-микробные взаимодействия в ризосфере с участием почвенных
микроорганизмов; процессы, протекающие в почве и водоносных слоях с
участием ионов металлов).
Важность
указанных
распространенной
выше
способностью
процессов
многих
определяется
почвенных
широко
микроорганизмов
синтезировать и выделять данные соединения в окружающую среду. В связи
с этим задачами настоящей работы предусматривалось выяснение ряда
физико-химических и структурных аспектов химических (абиотических и
неферментативных) окислительно-восстановительных процессов с участием
алкилрезорцинов различной структуры и соединений одного из самых
распространенных в природе и биологически важных металлов – железа в его
наиболее устойчивой степени окисления (FeIII).
Одним из вопросов, интересных как в фундаментальном отношении – с
точки зрения химии алкилрезорцинов, – так и в плане участия различных по
структуре алкилрезорцинов в молекулярном сигналинге микроорганизмов и
в качестве микробных адаптогенов, является роль их молекулярной
структуры в кинетике окислительно-восстановительных процессов с их
111
участием. В данном исследовании проведена серия экспериментальных
работ, а также квантово-химические расчеты, показавшие существенное
значение длины и положения алкильного заместителя в молекулах
алкилрезорцинов для скорости процессов их окисления железом(III) в
слабокислых водных средах.
Для наиболее склонного к окислению из изученных соединений, 4-нгексилрезорцина,
экспериментально
определены
границы
кислотности
среды, в котором его окисление протекает с заметной скоростью. Несмотря
на то, что этот диапазон кислотности оказался достаточно узким (процесс
резко замедляется уже при значениях pH около 4), следует отметить, что
среди реальных почвенных и водных систем кислые среды с pH порядка 3
встречаются достаточно часто. Кроме того, следует учитывать возможность
протекания данных процессов при локальном подкислении почвы или
водной фазы в результате метаболической активности как корневой системы
растений, так и микроорганизмов (выделение органических кислот; антипорт
протонов, например, при ассимиляции аммония, и т.д.).
С помощью комплекса инструментальных методов в данной работе
впервые показано, что первой стадией окисления 4-н-гексилрезорцина в
указанных условиях (pH~3) является дополнительное гидроксилирование
ароматического цикла. Этот путь описан в литературе для некоторых
алкилрезорцинов в процессах ферментативных превращений в клетках
микроорганизмов в нейтральной физиологической среде. Отметим, однако,
что совпадение ферментативного и химического (абиотического) путей
окисления
определенного
класса
соединений
(в
данном
случае
–
алкилрезорцинов) вовсе неочевидно, тем более – с учетом различий в
условиях реакций (кислотности).
Следует отметить, что данное диссертационное исследование основано
на физико-химической методологии, в котором ведущую роль играют
современные инструментальные методы. Естественным было использование
112
такого мощного информативного метода, как ядерная гамма-резонансная
(ЯГР;
мёссбауэровская)
спектроскопия
(на
ядрах
57
Fe),
дающая
количественную информацию о превращениях соединений железа и его
химических формах в растворах (замороженных для получения эффекта
Мёссбауэра, характерного в основном для тведрых фаз) и для твердых
соединений – продуктов его взаимодействия с алкилрезорцинами. Помимо
ЯГР-спектроскопии,
ряд
спектрофотометрии
в
спектрометрическим
результатов
УФ-области,
получен
газовой
детектированием,
с
помощью
хроматографии
методов
с
ИК-фурье-спектроскопии
масси
рентгенофлуоресцентного анализа.
Совокупность
полученных
данных,
наряду
с
фундаментальным
интересом с точки зрения химии алкилрезорцинов, имеет значение в плане
более полного понимания влияния ряда абиотических (химических) факторов
на процессы сигналинга микроорганизмов и их адаптации с участием данных
биомолекул.
113
Выводы
1.
Экспериментально
доказано,
что
5-метилрезорцин,
5-н-
пропилрезорцин и 4-н-гексилрезорцин окисляются железом(III) в водной
среде при pH~3 с его восстановлением до железа(II). Высушивание
реакционных
смесей
(с
исходным
мольным
соотношением
FeIII:алкилрезорцин = 1:3) для 5-метилрезорцина и 4-н-гексилрезорцина на
воздухе сопровождается образованием смеси соединений с преобладанием
комплексов железа(II).
2. Показано, что скорость окисления алкилрезорцинов (АР) в водных
средах при pH~3 существенно зависит от структуры молекулы (длины и
положения
алкильного
заместителя).
Предложена
и
апробирована
кинетическая модель, в соответствии с которой экспериментально найденная
последовательность констант скорости реакции в данных условиях (при
pH~3)
такова:
4-н-гексилрезорцин
>>
5-метилрезорцин
>
5-н-
пропилрезорцин.
3. Методом спектроскопии ЯГР показано, что редокс-процесс между 4н-гексилрезорцином, наиболее быстро окисляющимся в ряду изученных АР,
и железом(III) протекает с высокой скоростью при pH 1.5–3.0, однако резко
замедляется при pH > 3 и практически не идет при pH около 4 и выше (тем не
менее, возобновляясь, хотя и со сравнительно невысокой скоростью, при
повторном подкислении среды до pH < 3).
4. Из проведенных квантово-химических расчетов адиабатических
потенциалов ионизации для молекул исследованных алкилрезорцинов и их
неалкилированного аналога (резорцина) следует, что наиболее склонным к
окислению является 4-н-гексилрезорцин, а наименее – резорцин, что
114
согласуется с полученными экспериментальными и литературными (для
резорцина, не окисляющегося в указанных условиях) данными.
5. По совокупности данных ряда инструментальных методов показано,
что основным процессом окисления 4-н-гексилрезорцина, наиболее быстро
окисляющегося в ряду изученных АР, в присутствии железа(III) при pH~3
является дополнительное гидроксилирование ароматического кольца.
115
Список использованных источников
1. Kozubek A., Tyman J.H.P. Resorcinolic lipids, the natural non-isoprenoid
phenolic amphiphiles and their biological activity // Chem. Rev. 1999. V. 99, N
1. P. 1-25.
2. Harborne J.B. General procedures and measurement of total phenolics //
Methods in Plant Biochemistry (Series Ed.: Day P.M., Harborne J.B.). Vol. 1.
Plant Phenolics / Harborne J.B., Ed. – San Diego, CA: Academic Press, 1989.
P. 1-28.
3. Posmyk M.M., Janas K.M. Phenolic compounds // Plant Biochemistry / Eds.
Narwal S.S., Bogatek, R., Zagdańska B.M., Sampietro D.A., Vattuone. M.A. –
Houston: Studium Press, 2009. P. 217-238.
4. Stasiuk M., Kozubek A. Biological activity of phenolic lipids // Cell. Mol. Life
Sci. 2010. V. 67, N 6. P. 841-860.
5. Dey E.S., Ahmadi-Afzadi M., Nybom H., Tahir I. Alkylresorcinols isolated
from rye bran by supercritical fluid of carbon dioxide and suspended in a foodgrade emulsion show activity against Penicillium expansum on apples // Arch.
Phytopathol. Plant Protect. 2013. V. 46, N 1. P. 105-119.
6. Sampietro D.A., Belizan M.M.E., Apud G.R., Juarez J.H., Vattuone M.A.,
Catalan C.A.N. Alkylresorcinols: chemical properties, methods of analysis and
potential uses in food, industry and plant protection // In: Natural Antioxidants
and Biocides from Wild Medicinal Plants / Eds. Céspedes C.L., Sampietro
D.A., Seigler D.S., Rai M.K. – Wallingford: CAB International, 2013. P. 148166.
7. Yu D., Xu F., Zeng J., Zhan J. Type III polyketide synthases in natural product
biosynthesis // IUBMB Life. 2012. V. 64, N 4. P. 285-295.
116
8. Tyman J.H.P. Non-isoprenoid long chain phenols // Chem. Soc. Rev. 1979. V. 8,
N 4. P. 499-537.
9. Tyman J.H.P. The chemistry of non-isoprenoid phenolic lipids // Studies in
Natural Products Chemistry / Ed. Tyman J.H.P. – Amsterdam: Elsevier, 1991.
P. 313-381.
10. Devon T.K., Scott A.I. Handbook of Naturally Occurring Compounds. – New
York: Academic Press, 1975. – 644 p.
11. Manitto P., Sammes P.G. Biosynthesis of Natural Products. – New York:
Wiley, 1981. – 548 p.
12. Van Sumere C.F. Phenols and phenolic acids // Methods in Plant Biochemistry
(Series Ed.: Day P.M., Harborne J.B.). Vol. 1. Plant Phenolics / Harborne J.B.,
Ed. – San Diego, CA: Academic Press, 1989. P. 29-73.
13. Терней А. Современная органическая химия / Пер. с англ. под ред.
Суворова Н.Н. – М.: Мир, 1981. Т. 2. – 303 с.
14. Kamnev A.A. Metals in soil versus plant-microbe interactions: Biotic and
chemical interferences // Plant-Microbe Interactions. / Eds. Barka E.A.,
Clément C. – Trivandrum (Kerala): Research Signpost, 2008. P. 291-318.
15. Феофилова Е.П. Торможение жизненной активности как универсальный
биохимических механизм адаптации микроорганизмов к стрессовым
воздействиям // Прикл. биохим. микробиол. 2003. Т. 39, № 1. С. 5-24.
16. Aaronson S. Chemical Communication at the Microbial Level. – Boca Raton:
CRC Press Inc., 1981. V. 1. – 189 p., V. 2. – 203 p.
17. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К., Бондарь И.А., Круговых
Н.Ф.,
Труфакин
В.А.
Окислительный
стресс.
Прооксиданты
и
антиоксиданты. – М.: Фирма «Слово», 2006. – 556 с.
18. Korycińska M., Czelna K., Jaromin A., Kozubek A. Antioxidant activity of rye
bran alkylresorcinols and extracts from whole-grain cereal products // Food
Chem. 2009. V. 116, N 4. P. 1013-1018.
117
19. Struski D.G.J., Kozubek A. Cereal grain alk(en)ylresorcinols protect lipids
against ferrous ions-induced peroxidation // Z. Naturforsch. C. 1992. Bd. 47c.
S. 47-50.
20. Nienartowicz B., Kozubek A. Antioxidant activity of cereal bran resorcinolic
lipids // Pol. J. Food Nutr. Sci. 1993. V. 2. P. 51-60
21. Winata A., Lorenz K. Antioxidant potential of 5-n-pentadecylresorcinol // J.
Food Process. Preserv. 1996. V. 20, N 5. P. 417-429.
22. Ерин А.И., Давиташвили Н.Г., Прилипко Л.Л., Болдырев А.А., Лущак
В.И., Батраков С.Г., Придачина Н.Н., Сербинова А.Е., Каган В.Е.
Влияние алкилрезорцина на биологические мембраны при активации
перекисного окисления липидов // Биохимия. 1987. Т. 52, № 7. С. 11801185.
23. Zubik L., Hladyszowski J., Czucha B., Kozubek A. The effect of resorcinolic
lipids on peroxidation of liposomal phospholipids. Experimental and molecular
modeling studies // W. Mejbaum-Katzenellenbogen's Seminars in Molecular
Biology. 3. Liposomes in Biology and Medicine. – Wroclaw, 1996. P. P24.
24. Kozubek A., Nienartowicz B. Cereal grain resorcinolic lipids inhibit H2O2induced peroxidation of biological membranes // Acta Biochim. Polon. 1995.
V. 42, N 3. P. 309-315.
25. Dupré S., Bohlmann F., Knox E. Prenylated p-hydroxyacetophenone
derivatives from the giant Senecio johnstonii // Biochem. Syst. Ecol. 1990. V.
18, N 2-3. P. 149-150.
26. Fate G.D., Lynn D.G. Xenognosin methylation is critical in defining the
chemical potential gradient that regulates the spatial distribution in Striga
pathogenesis // J. Am. Chem. Soc. 1996. V. 118, N 46. P. 11369-11376.
27. Kamal-Eldin A., Pouru A., Eliasson C., Åman P. Alkylresorcinols as
antioxidants: hydrogen donation and peroxyl radical-scavenging effects // J.
Sci. Food Agric. 2001. V. 81, N 3. P. 353-356.
118
28. Tyl C.E., Bunzel M. Antioxidant activity-guided fractionation of blue wheat
(UC66049 Triticum aestivum L.) // J. Agric. Food Chem. 2012. V. 60, N 3. P.
731-739.
29. Gliwa J., Gunenc A., Ames N., Willmore W.G., Hosseinian F.S. Antioxidant
activity of alkylresorcinols from rye bran and their protective effects on cell
viability of PC-12 AC cells // J. Agric. Food Chem. 2011. V. 59. P. 1147311482.
30. Parikka K., Rowland I.R., Welch R.W., Wähälä K. In vitro antioxidant activity
and antigenotoxicity of 5-n-alkylresorcinols // J. Agric. Food Chem. 2006. V.
54. P. 1646-1650.
31. Рогинский В.А. Фенольные антиоксиданты: реакционная способность и
эффективность. – М.: Наука, 1988. – 247 с.
32. Kong C., Xu X., Hu F., Chen. X., Ling B., Tan Z. Using specific secondary
metabolites as markers to evaluate allelopathic potentials of rice varieties and
individual plants // Chin. Sci. Bull. 2002. V. 47. P. 839-843.
33. Yamashita Y., Matsunami K., Otsuka H., Shinzato T., Takeda Y. Grevillosides
A-F: glucosides of 5-alkylresorcinol derivatives from leaves of Grevillea
robusta // Phytochemistry. 2008. V. 69. P. 2749-2752.
34. Zarnowska E.D., Zarnowski R., Kozubek A. Alkylresorcinols in fruit pulp and
leaves of Ginkgo biloba L. // Z. Naturforsch. C. 2000. Bd. 55. S. 881-885.
35. Ward J.L., Poutanen K., Gebruers K., Piironen V., Lampi A.-M., Nystrom L.,
Andersson A.A.M., Aman P., Boros D., Rakszegi M., Bedo Z., Shewry P. The
healthgrain cereal diversity screen: concept, results and prospects // J. Agric.
Food Chem. 2008. V. 56. P. 9699-9709.
36. Светличный В.А., Эль-Регистан Г.И. Характеристики ауторегуляторного
фактора d2, вызывающего автолиз клеток Pseudomonas carboxydoflava и
Bacillus cereus // Микробиология. 1983. Т. 52. С. 33-38.
119
37. Fuqua С., Winans S.C., Greenberg Е.Р. Census and consensus in bacterial
ecosystems: the LuxR-LuxI family of quorum-sensing transcriptional
regulators // Annu. Rev. Microbiol. 1996. V. 50. P. 727-751.
38. Эль-Регистан Г.И., Цышнатий Г.В.. Дужа М.В., Пронин С.В., Матюшина
Л.Л., Савельева Н.Д., Капрелъянц А.С., Соколов Ю.М. Регуляция роста и
развития Pseudomonas carboxydoflava специфическими эндогенными
факторами // Микробиология. 1980. Т. 49. С. 561-565.
39. Светличный В.А., Романова А.К., Эль-Регистан Г.И. Изучение
количественного содержания мембраноактивных ауторегуляторов при
литоавтотрофном росте Pseudomonas carboxydoflava // Микробиология.
1986. Т. 55. С. 55-59.
40. Эль-Регистан Г.И., Дуда В.И., Козлова А.Н., Матюшина Л.Л., Поплаухина
О.Г. Изменение конструктивного метаболизма и ультраструктурной
организации клеток Bacillus cereus под влиянием специфического
ауторегуляторного фактора // Микробиология. 1979. Т. 48. С. 240-244.
41. Эль-Регистан Г.И. Обнаружение и изучение динамики накопления
ауторегуляторного фактора в культуральной жидкости и клетках
Micrococcus luteus // Микробиология. 1996. Т. 65. С. 20-25.
42. Батраков С.Т., Эль-Регистан Г.И., Придачина Н.И., Ненашева В.А.,
Козлова
А.П.,
Грязнова
М.Н.,
Золотарева
И.Н.
Тирозол
–
ауторегуляторный фактор Sacсharоmусes cerevisiae // Микробиология.
1993. Т. 62. С. 633-638.
43. Su C.J., Sadoff H.L. Unique lipids in Azotobacter vinelandii cysts: synthesis,
distribution and rate during germination // J. Bacteriol. 1981. V. 147. P. 91-96.
44. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И.
Механизмы выживания бактерий. – М.: Медицина, 2005. – 367 с.
45. Ntiwak-Thompson В., Hammer P.E., Hill D.S., Stafford J., Torkewit N.,
Gaffney Т.D., Lam S.T., Molnar I., Ligon J.M. 2,5-dialkylresorcinol
120
biosynthesis in Pseudomonas aurantiaca: novel head-to-head condensation of
two fatty acid derived precursors // J. Bacteriol. 2003. V. 185. P. 860-869.
46. Волошин С.А., Капрельянц А.С Межклеточные взаимодействия в
бактериальных популяциях // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 1555-1564.
47. Капрельянц А.С., Сулейменова М.М., Сорокина А.Д., Деборин Г.А., ЭльРегистан Г.И., Стоянович Ф.М., Лилле Ю.Э., Островский Д.Н.
Структурно-функциональные изменения в бактериальных и модельных
мембранах под действием фенольных липидов // Биол. мембраны. 1987. Т
4. С. 254-261.
48. Колпаков А.И., Ильинская О.Н., Беспалов М.М., Куприянова-Ашина Ф.Г.,
Гальчeнко В.Ф., Курганов Б.И., Эль-Регистан Г.И. Стабилизация
ферментов
аутоиндукторами
анабиоза
как
один
из
механизмов
устойчивости покоящихся форм микроорганизмов // Микробиология.
2000. Т. 69. С. 224-230.
49. Вострокнутова Г.А., Капрельянц А.С., Эль-Регистан Г.И., Скрыпин В.И.,
Козлова А.Н., Островский Д.Н., Дуда В.И. Изменение структурного
состояния мембраны Micrococcus lysodeikticus под влиянием препаратов
ауторегуляторных бактериальных факторов // Прикл. биохимия и
микробиол. 1985. Т. 21. С. 378-381.
50. Giannetti B.M., Steglich W., Quack W., Anke T., Oberwinkler F. Antibiotics
from basidiomycetes. VI. Merulinic acids A, B and C, new antibiotics from
Merulius tremellosus and Phlebia radiata // Z. Naturforsch. C. 1978. Bd. 33.
S. 807-816.
51. Scannell R.T., Barr I.R., Murty V.S., Reddy K.S., Hecht. S.M. DNA strand
scission by naturally occurring 5-alkylresorcinols // J. Am. Chem. Soc. 1988.
V. 110. P. 3650-3651.
52. Singh U.S., Scannell R.T., An H., Carter B.I., Hecht S.M. DNA cleavage by diand trihydroxyalkylbenzenes. Characterization of products and the roles of O2,
Cu(II) and alkali // J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117, N 51. P. 12691-12699.
121
53. Starck S.R., Deng J.Z., Hecht S.M. Naturally occurring alkylresorcinols that
mediate DNA damage and inhibit its repair // Biochemistry. 2000. V. 39. P.
2413-2419.
54. He S. Kinetic study of inhibition of reverse transcriptase of polyhydroxy
benzene derivatives // Chin. J. Biochem. Mol. Biol. 1990. V. 6. P. 428-431.
55. Rejman J., Kozubek A. Inhibitory effect of natural phenolic lipids upon NADdependent dehydrogenases and on triglyceride accumulation in 3T3-L1 cells in
culture // J. Agric. Food Chem. 2004. V. 52. P. 246-250.
56. Andersson U., Dey E.S., Holm C., Degerman E. Rye bran alkylresorcinols
suppress adipocyte lipolysis and hormone-sensitive lipase activity // Mol. Nutr.
Food Res. 2011. V. 55 P. S290-S293.
57. Sikorski A.F., Michalak K., Bobrowska M., Kozubek A. Interaction of spectrin
with some amphipatic compounds // Stud. Biophys. 1987. V. 121. P. 183-191.
58. Gasiorowski K., Brokos B., Kulma A., Ogorzałek A., Skórkowska K. Impact
of four antimutagens on apoptosis in genotoxically damaged lymphocytes in
vitro // Cell Mol. Biol. Lett. 2001. V. 6. P. 649-675.
59. Давыдова О.К., Дерябин Д.Г., Эль-Регистан Г.И. Длительное сохранение
ДНК в водных растворах в присутствии химических аналогов микробных
ауторегуляторов // Микробиология. 2006. Т. 75. С. 662-669.
60. Мартиросова Е.И., Карпекина Т.А., Эль-Регистан Г.И. Модификация
ферментов естественными химическими шаперонами микроорганизмов //
Микробиология. 2004. Т. 73. С. 708-715.
61. Koh-Banerjee P., Rimm E.B. Whole grain consumption and weight gain: a
review of the epidemiological evidence, potential mechanisms and
opportunities for future research // Proc. Nutr. Soc. 2003. V. 62. P. 25-29.
62. Hallfrisch J., Behall K.M. Mechanisms of the effects of grains on insulin and
glucose responses // J. Am. Coll. Nutr. 2000. V. 19 (Suppl. 3). P. 320S -325S.
122
63. Murtaugh M.A., Jacobs D.R., Jacob B., Steffen L.M., Marquart L.
Epidemiological support for the protection of whole grains against diabetes //
Proc. Nutr. Soc. 2003. V. 62. P. 143-149.
64. Liu S., Stampfer M.J., Hu F.B., Giovannucci E., Rimm E., Manson J.E.,
Hennekens C.H., Willett W.C. Whole-grain consumption and risk of coronary
heart disease: results from the Nurses' Health Study // Am. J. Clin. Nutr. 1999.
V. 70. P. 412-419.
65. Truswell A.S. Cereal grains and coronary heart disease // Eur. J. Clin. Nutr.
2002. V. 56. P. 1-14.
66. Hallmans G., Zhang J.-X., Lundin E., Stattin P., Johansson A., Johansson I.,
Hultén K., Winkvist A., Lenner P., Åman P., Adlercreutz H. Rye, lignans and
human health // Proc. Nutr. Soc. 2003. V. 62. P. 193-199.
67. Levi F., Pasche C., Lucchini F., Chatenoud L., Jacobs D.R., La Vecchia C.
Refined and whole grain cereals and the risk of oral, oesophageal and
laryngeal cancer // Eur. J. Clin. Nutr. 2000. V. 54. P. 487-489.
68. Slavin J.L., Am J. Dietary fibre, whole grains, and risk of colorectal cancer:
systematic review and dose-response meta-analysis of prospective studies //
Coll. Nutr. 2000. V. 19. P. 300-307.
69. La Vecchia C., Chatenoud L., Negri E., Franceschi S. Whole cereal grains,
fibre and human cancer. Wholegrain cereals and cancer in Italy // Proc. Nutr.
Soc. 2003. V. 62. P. 45-49.
70. Zhu Y., Soroka D.N., Sang S. Synthesis and inhibitory activities against colon
cancer cell growth and proteasome of alkylresorcinols // J. Agric. Food Chem.
2012. V. 60. P. 8624-8631.
71. Lang R., Jebb S.A. Who consumes whole grains, and how much? // Proc. Nutr.
Soc. 2003. V. 62. P. 123-127.
72. Bingham S.A., Luben R., Welch A., Wareham N., Khaw K.-T., Day N. Are
imprecise methods obscuring a relation between fat and breast cancer? //
Lancet. 2003. V. 362. P. 212-214.
123
73. Kulawinek M., Kozubek A. Quantitative determination of alkylresorcinols in
cereal grains: independence of the length of the aliphatic side chain // J. Food
Lipids. 2008. V. 15. P. 251-262.
74. Ross A.B., Åman P., Kamal-Eldin A. Dietary alkylresorcinols: absorption,
bioactivities, and possible use as biomarkers of whole-grain wheat- and ryerich foods // Nutr. Rev. 2004. V. 62. P. 81-95.
75. Ross A.B., Åman P, Andersson R., Kamal-Eldin A. Chromatographic analysis
of alkylresorcinols and their metabolites // J. Chromatogr. A. 2004. V. 1054. P.
157-164.
76. Landberg R., Kamal-Eldin A., Andersson A., Vessby B., Åman P.
Alkylresorcinols as biomarkers of whole-grain wheat and rye intake: plasma
concentration and intake estimated from dietary records // Am. J. Clin. Nutr.
2008. V. 87. P. 832-838.
77. Ross A.B., Kamal-Eldin A., Lundin E.A., Zhang J.-X., Hallmans G., Åman P.
Cereal alkylresorcinols are absorbed by humans // J. Nutr. 2003. V. 133. P.
2222-2224.
78. Linko A.-M., Parikka K., Wähälä K., Adlercreutz H. Gas chromatographicmass spectrometric method for the determination of alkylresorcinols in human
plasma // Anal. Biochem. 2002. V. 308. P. 307-113.
79. Linko A.-M., Adlercreutz H. Whole-grain rye and wheat alkylresorcinols are
incorporated into human erythrocyte membranes // Br. J. Nutr. 2005. V. 93. P.
11-13.
80. Ross A.B., Åman P., Kamal-Eldin A. Identification of cereal alkylresorcinol
metabolites in human urine – potential biomarkers of wholegrain wheat and
rye intake // J. Chromatogr. B. 2004. V. 809, N 1. P. 125-130.
81. Ross A.B. Analysis of alkylresorcinols in cereal grains and products using
ultrahigh-pressure liquid chromatography with fluorescence, ultraviolet, and
CoulArray electrochemical detection // J. Agric. Food Chem. 2012. V. 60, N
36. P. 8954-8962.
124
82. Suzuki Y., Esumi Y., Uramoto M., Kono Y.A. Structural analyses of carbon
chains in 5-alk(en)ylrecorcinols of rye and wheat whole flour by tandem mass
spectrometry // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1997. V. 61. P. 480-486.
83. Seitz L.M. Identification of 5-(2-oxoalkyl) resorcinols and 5-(2-oxoalkenyl)
resorcinols in wheat and rye grains // J. Agric. Food Chem. 1992. V. 40. P.
1541-1546.
84. Iwatsuki K., Akihisa T., Tokuda H., Ukiya M., Higashihara H., Mukainaka T.,
Iizuka M., Hayashi Y., Kimura Y., Nishino H. Sterol ferulates, sterols, and 5alk(en)ylresorcinols from wheat, rye, and corn bran oils and their inhibitory
effects on Epstein-Barr virus activation // J. Agric. Food Chem. 2003. V. 51. P.
6683-6688.
85. Suzuki Y., Esumi Y., Yamaguchi I. Structures of 5-alkylresorcinol-related
analogues in rye // Phytochemistry. 1999. V. 52. P. 281-289.
86. Kaczmarek J., Tluscik, F. Variability of alkylresorcinol content in rye (Secale
cereale L.) grains. A comparative analysis with several species of the genus
Triticum // Genet. Pol. 1984. V. 25. P. 349-358.
87. Ross A.B., Kamal-Eldin A., Jung C., Shepherd M.J., Åman P. Gas
chromatographic analysis of alkylresorcinols in rye (Secale cereale L.) grain //
J. Sci. Food Agric. 2001. V. 81. P. 1405-1411.
88. Ross A.B., Shepherd M.J., Schüpphaus M., Sinclair V., Alfaro B., Kamal-Eldin
A., Åman P. Alkylresorcinols in cereals and cereal products // J. Agric. Food
Chem. 2003. V. 51. P. 4111-4118.
89. Беспалов М.М., Колпаков А.И., Лойко Н.Г., Дорошенко Е.В., Мулюкин
А.Л., Козлова А.И.. Варламова Е.А., Колпаков А.И., Курганов Б.И., ЭльРегистан Г.И. Функции аутоиндукторов анабиоза микроорганизмов при
создании метаболического блока в клетке // Микробиология. 2000. Т. 69.
С. 217-223.
90. Sperandio V., Torres A.G., Kaper J.B. Quorum sensing Escherichia coli
regulators B and C (QseBC): A novel two-component regulatory system
125
involved in the regulation of flagella and motility by quorum sensing in E. coli
// Mol. Microbiol. 2002. V. 43. P. 809-821.
91. Suga H., Smith K.M. Molecular mechanisms of bacterial quorum sensing as a
new drug target // Curr. Opin. Chem. Biol. 2003. V. 7. P. 586-591.
92. Juhas M., Eberl L., Tummler B. Quorum sensing: the power of cooperation in
the world of Pseudomonas // Environ. Microbiol. 2005. V. 7. P. 459-471.
93. Dong Y.-H., Wang L.-H., Zhang L.-H. Quorum-quenching microbial
infections: mechanisms and implications // Phil. Trans. Royal Soc. B: Biol.
Sci. 2007. V. 362. P. 1201-1211.
94. Kamnev A.A., Kóvacs K., Kuzmann E., Kulikov L.A., Perfiliev Yu.D., Biró
B., Vértes A. Iron(III) reduction by microbial autoinducer molecules:
Oxidative degradation of a signal as a chemical interference in remote cell-cell
communication // Metal Ions in Biology and Medicine / Eds. Collery P.,
Maymard I., Thephanides T., Khassanova L., Collery T. – Paris: John Libbey
Eurotext, 2008. Р. 191-196.
95. Pracht J., Boenigk J., Isenbeck-Schröter M., Keppler F., Schöler H.F. Abiotic
Fe(III) induced mineralization of phenolic substances // Chemosphere. 2001.
V. 44, N 4. P. 613-619.
96. Kovács K., Sharma V.K., Kamnev A.A., Kuzmann E., Homonnay Z., Vértes
A. Water and time dependent interaction of iron(III) with indole-3-acetic acid
// Struct. Chem. 2008. V. 19, N 1. P. 109-114.
97. Kovács K., Kamnev A.A., Mink J., Németh Cs., Kuzmann E., Megyes T.,
Grósz T., Medzihradszky-Schweiger H., Vértes A. Mössbauer, vibrational
spectroscopic and solution X-ray diffraction studies of the structure of iron(III)
complexes formed with indole-3-alkanoic acids in acidic aqueous solutions //
Struct. Chem. 2006. V. 17, N 1. P. 105-120.
98. Kovács K., Kamnev A.A., Kuzmann E., Homonnay Z., Szilágyi P.Á., Sharma
V.K., Vértes A. Mössbauer studies of iron(III)–(indole-3-alkanoic acids)
126
systems in frozen aqueous solutions // J. Radioanal. Nucl. Chem. 2005. V. 266,
N 3. P. 513-517.
99. Kovács K., Kamnev A.A., Shchelochkov A.G., Kuzmann E., MedzihradszkySchweiger H., Mink J., Vértes A. Mössbauer spectroscopic evidence for
iron(III) complexation and reduction in acidic aqueous solutions of indole-3butyric acid // J. Radioanal. Nucl. Chem. 2004. V. 262, N 1. P. 151-156.
100. Ревина А.А., Ларионов О.Г, Кочетова М.В., Луцик Т.К., Эль-Регистан
Г.И. // Спектрофотометрическое и хроматографическое исследование
продуктов радиолиза аэрированных водных растворов алкилрезорционов
// Изв. АН. Сер. хим. 2003. № 11. С. 2257-2263.
101. Kamnev A.A., Kovács K., Kuzmann E., Vértes A. Application of Mössbauer
spectroscopy for studying chemical effects of environmental factors on
microbial signalling: Redox processes involving iron(III) and some microbial
autoinducer molecules // J. Mol. Struct. 2009. V. 924-926. P. 131-137.
102. Emerson D., Roden E., Twining B.S. The microbial ferrous wheel: iron
cycling in terrestrial, freshwater, and marine environments // Front.
Microbiol. 2012. V. 3. Article 383. DOI: 10.3389/fmicb.2012.00383.
103. Lentini C.J., Wankel S.D., Hansel C.M. Enriched iron(III)-reducing bacterial
communities are shaped by carbon substrate and iron oxide mineralogy //
Front. Microbiol. 2012. V. 3. Article 404. DOI: 10.3389/fmicb.2012.00404.
104. Von Uexküll H.R., Mutert E. Global extent, development and economic
impact of acid soils // Plant Soil. 1995. V. 171, N 1. P. 1-15.
105. Johnson D.B., Kanao T., Hedrich S. Redox transformations of iron at
extremely low pH: fundamental and applied aspects // Front. Microbiol. 2012.
V. 3. Article 96. DOI: 10.3389/fmicb.2012.00096.
106. Dopson M., Ossandon F.J., Lövgren L., Holmes D.S. Metal resistance or
tolerance? Acidophiles confront high metal loads via both abiotic and biotic
mechanisms // Front. Microbiol. 2014. V. 5. Article 157. DOI:
10.3389/fmicb.2014.00157.
127
107. Столяров К.П. Химический анализ в ультрафиолетовых лучах. –M:
Химия, 1965. – 176 с.
108. Зайдель А.Н., Островская Г.В., Островский Ю.И. Техника и практика
спектроскопии. – M: Наука, 1976. – 392 с.
109. Мёссбауэровская спектроскопия // Физический энциклопедический
словарь. – М.: Большая Российская энциклопедия, 1995. – 928 с.
110. Kuzmann E., Homonnay Z., Nagy S., Nomura K. Mössbauer spectroscopy //
Handbook of Nuclear Chemistry / Eds. Vértes A., Nagy S., Klencsár Z. – Vol.
2. Elements and Isotopes: Formation, Transformation, Distribution. –
Dordrecht: Springer, 2010. P. 3-65.
111. MossWinn 4.0 series // http://www.mosswinn.com/english/index.html
(см. также публикацию автора программы MossWinn и цитируемые в
ней работы: Klencsár Z. MossWinn – methodological advances in the field
of Mössbauer data analysis // Hyperfine Interact. 2013. V. 217, N 1-3. P. 117126.)
112. Кон В. Электронная структура вещества – волновые функции и
функционалы плотности // Успехи физ. наук. 2002. Т. 172, № 3. С. 336348.
113. Koch W., Holthausen M.C. A Chemist’s Guide to Density Functional Theory.
– Toronto: Willey-VCH, 2001. – 293 p.
114. Sousa S.F., Fernandes P.A., Ramos M.J. General performance of density
functionals // J. Phys. Chem. A. 2007. V. 111. P. 10439-10452.
115. Becke A.D. Density-functional exchange-energy approximation with correct
asymptotic behavior // Phys. Rev. A. 1988. V. 38, N 6. P. 3098-3100.
116. Becke A.D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact
exchange // J. Chem. Phys. 1993. V. 98, N 7. P. 5648-5652.
117. Lee C., Yang W., Parr R.G. Development of the Colle-Salvetti correlationenergy formula into a functional of the electron density // Phys. Rev. B. 1988.
V. 37, N 2. P. 785-789.
128
118. Krishnan R., Binkley J.S., Seeger R., Pople J.A. Self-consistent molecular
orbital methods. XX. A basis set for correlated wave functions // J. Chem.
Phys. 1980. V. 72, N 1. P. 650-654.
119. McLean A.D., Chandler G.S. Contracted Gaussian basis sets for molecular
calculations. I. Second row atoms, Z = 11-18 // J. Chem. Phys. 1980. V. 72, N
10. P. 5639-5648.
120. Pankratov A.N. Electronic structure and reactivity of inorganic, organic,
organoelement and coordination compounds: An experience in the area of
applied quantum chemistry // Quantum Chemistry Research Trends / Ed. by
Kaisas M.P. – New York: Nova Science Publishers, Inc., 2007. P. 57-125.
121. Stewart J.J.P. Optimization of parameters for semiempirical methods. I.
Method // J. Comput. Chem. 1989. V. 10, N 2. P. 209-220.
122. Stewart J.J.P. Optimization of parameters for semiempirical methods. II.
Applications // J. Comput. Chem. 1989. V. 10, N 2. P. 221-264.
123. Kamnev A.A., Shchelochkov A.G., Perfiliev Yu.D., Tarantilis P.A., Polissiou
M.G. Spectroscopic investigation of indole-3-acetic acid interaction with
iron(III) // J. Mol. Struct. 2001. V. 563-564. P. 565-572.
124. Мёссбауэровская спектроскопия замороженных растворов / Под ред.
Вертеша А., Надя Д. (ред. рус. перевода Перфильев Ю.Д.). М.: Мир,
1998. 398 c.
125. Chapman P.J., Ribbons D.W. Metabolism of resorcinylic compounds by
bacteria: orcinol pathway in Pseudomonas putida // J. Bacteriol. 1976. V.
125, N 3. P. 975-984.
126. Dykstra C.E., Frenking G., Kim K.S., Scuseria G.E. Theory and Applications
of Computational Chemistry: the First Forty Years. Amsterdam: Elsevier,
2011. 1308 p.
127. Гурвич Л.В., Карачевцев Г.В., Кондратьев В.Н. Энергии разрыва
химических связей. Потенциалы ионизации и сродство к электрону. М.:
Наука, 1974. 351 с.
129
128. Canevari T.C., Arenas L.T., Landers R., Custodio R., Gushikem Y.
Simultaneous electroanalytical determination of hydroquinone and catechol in
the presence of resorcinol at an SiO2/C electrode spin-coated with a thin film
of Nb2O5 // Analyst. 2013. V. 138. P. 315-324.
129. Беллами Л. Инфракрасные спектры сложных молекул. М.: ИНЛИТ,
1963. 591 с.
130.
Чукичева
И.Ю.,
Кучин
А.В.,
Спирихин
Л.В.,
Ипатова
Е.У.
Алкилирование гидрохинона камфеном // Химия и компьют. моделир.
Бутлеров. сообщ. 2003. № 1. С. 16-19.