Анна Тойменцева - (Приволжский) федеральный университет

Сравнительный анализ секретома двух штаммов бактерий
Bacillus pumilus
Междисциплинарный центр протеомных исследований
Институт Фундаментальной Медицины и Биологии
Казанский (Приволжский) Федеральный Университет
Анна Тойменцева
Руководитель проекта - проф., д.б.н. М.Р. Шарипова
1
Методы используемые в работе:
Экстракция белков, трипсинолиз
1D + 2D гель электрофорезы
• Изоэлектрофокусировка с применением трубочек
• Окрашивание белков красителями: Coomassie, серебром, Цианины (Cy3 (зеленая
флуоресценция) и Cy5 (красная флуоресценция))
Денситометрический анализ
• PDQuest
MALDI-TOF-MS
(матричная лазерная десорбционная
ионизационая времяпролетная масс-спектрометрия)
Поиск по базам данных
• MASCOT, NCBI, Uniprot и т.д.
Биоинформационный анализ
2
Объекты исследования:
Стрептомицин устойчивый штамм - Bacillus pumilus 3-19
Стрептомицин чувствительный штамм - Bacillus pumilus 7Р
Историческая справка:
1.
Сотрудники лаборатории Биосинтеза и Биоинженерии Ферментов КФУ
(КГУ) занимаясь поиском продуцента рибонуклеаз, выделили из почвы
Татарстана штамм бактерий Bacillus pumilus 7Р. Активность штамма в
отношении продукции РНКазы составляет 2000-2500 единиц.
2.
Получение штамма-суперпродуцента РНКазы. Скрининг на среде
содержащей антибиотик стрептомицин позволил получить штамм с
активностью РНКазы 170 000 – 200 000 единиц.
3.
Изучая стрептомицин устойчивый штамм Bacillus intermedius 3-19
оказалось, что он значительно эффективнее выделяет в среду комплекс
протеолитических ферментов – субтилизиноподобную протеиназу,
глутамилэндопептидазу, фосфатазу, металлоэндопептидазу.
3
Val
Glu
OH
C
NH2
(-Asp-)
- NH
CH2
C
O
C
CH2
O
α
CH
α
C
NH
O
Part of polypeptide/protein
CH
CH3
CH3
Mature glutamylendopeptidase
translocase
complex
preprotein
C
4
Рибонуклеаза и протеазы применяют в:
• биоорганической химии и молекулярной биологии в
качестве реактива для изучения структуры и функции
белков;
• генной инженерии при выделении плазмид, генов,
белков;
• медицине как противовирусный и противоопухолевый
препарат (РНКаза), как тромболитический,
антикоагулянтный препарат (протеазы), как
пробиотический препарат (р. Bacillus).
5
Секретом стрептомицин устойчивого штамма бактерий
Bacillus pumilus 3-19
1
9
18 27 36 45
Время, ч
РНКаза
0,1
1
9
18 27 36 45
Время, ч
0,5
0,4
0,3
1
0,2
0,1
0,1
0
1
9
18
27
36
А, мкМ/мл*мин
10
OD590
900
750
600
450
300
150
0
1
Время, ч
Фосфатаза
А, оп.ед/мл*ч
OD590
10
ПА, мкМ/мин*мл
0,1
OD590
1
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
Активность
глутамилэндопептидазы
10
0,12
0,1
0,08
1
0,06
0,04
0,02
0,1
0
1 9 18 27 36 45
А, мкМ/мин*мл
Активность
субтилизиноподобной
протеиназы
OD590
10
А, ед/мл
OD590
Общая протеолитическая
активность на азоказеине
10
2
1,7
1,4
1,1
1
0,8
0,5
0,2
0,1
-0,1
1 9 18 27 36 45
Время, ч
Рост/Активность
/ B. pumilus 3-19
45
Время, ч
6
Цели настоящего исследования:
1. Понять чем определяется приобретение устойчивости к антибиотику
стрептомицину на примере бактерий Bacillus pumilus
2. Связано ли приобретение устойчивости с к антибиотику стрептомицину с
повышенной секрецией протеолитический ферментов.
Кому могут быть интересны результаты такого исследования:
Исследователям
Медикам
Фармкомпаниям
7
Сравнительный анализ секретома внеклеточных экстрактов двух штаммов
Bacillus pumilus с помощью 1Д электрофореза
12 ч
24 ч
3-19 7Р 3-19 7Р
116
66.2
45
35
25
18.4
14.4
Стрептомицин устойчивый штамм - Bacillus pumilus 3-19
Стрептомицин чувствительный штамм - Bacillus pumilus 7Р
8
Анализ белкового профиля культуральной жидкости двух штаммов
Bacillus pumilus (12 час)
Стрептомицин устойчивый штамм - Bacillus pumilus 3-19
Стрептомицин чувствительный штамм - Bacillus pumilus 7Р
pH 2.5
pI
pH 10 pH 2.5
pI
pH 10 pH 2.5
1
116
pI
1
2
3
66.2
7
6
35
2
3
4
4
5
45
pH 10
8 9
7
8 9
25
18.4
10 11
10
11
12
14.4
13
Сy 3 – Bacillus pumilus 7p
Сy 5 – Bacillus pumilus 3-19
9
Результаты анализа белкового профиля культуральной жидкости двух штаммов Bacillus
pumilus (12 час)
Внеклеточные
белки
Мембранносвязанные белки
Внутриклеточные
белки
10
Анализ белкового профиля культуральной жидкости двух штаммов
Bacillus pumilus (24 час)
Стрептомицин устойчивый штамм - Bacillus pumilus 3-19
Стрептомицин чувствительный штамм - Bacillus pumilus 7Р
pH 2.5
pI
pH 10
pH 2.5
pI
pH 10 pH 2.5
pI
pH 10
116
66.2
45
1
1
35
2 3
25
18.4
4
4
5
5
14.4
Сy 3 – Bacillus pumilus 7p
Сy 5 – Bacillus pumilus 3-19
11
Результаты анализа белкового профиля культуральной жидкости двух штаммов Bacillus
pumilus (24 час)
Внутриклеточные
белки
12
Протеомный анализ секретомов двух штаммов Bacillus pumilus показал:
•высокую степень сходства секретомов стрептомицин чувствительного и
стрептомицин устойчивого штаммов;
•значительное различие в уровне экспрессии некоторых белков:
секреторных
протеолитических
ферментов
(субтилизиноподобной
протеиназы и фосфодиэстеразы), мембранно-связанных и секреторных
глутамилтрансфераз;
•в секретоме стрептомицин чувствительного штамма обнаружено
значительное количество структурных белков жгутикового аппарата, тогда
как в стрептомицин устойчивом штамме их не наблюдали;
•к 24 часу культивирования протеомный профиль секретома стрептомицин
чувствительного штамма дополняется белками внутриклеточной фракции –
липоил-дегидрогеназы и супероксиддисмутазы.
13
pH 2.5
pI
pH 10
Анализ белкового профиля клеток двух
штаммов Bacillus pumilus (12 час)
Стрептомицин устойчивый штамм - Bacillus
pumilus 3-19
Стрептомицин чувствительный штамм Bacillus pumilus 7Р
pH 2.5
pI
pH 10
pH 2.5
pI
pH 10
116
66.2
45
35
25
18.4
14.4
Сy 5 – Bacillus pumilus 7p
Сy 3 – Bacillus pumilus 3-19
14
pH 2.5
pI
pH 10
Анализ белкового профиля клеток двух
штаммов Bacillus pumilus (24 час)
Стрептомицин устойчивый штамм - Bacillus
pumilus 3-19
Стрептомицин чувствительный штамм - Bacillus
pumilus 7Р
pH 2.5
pI
pH 10
pH 2.5
pI
pH 10
116
66.2
45
35
25
18.4
14.4
Сy 5 – Bacillus pumilus 7p
Сy 3 – Bacillus pumilus 3-19
15