ԳԱԿ ՊՈԱԿ Մարգարյան Արմինե Արմենի Գ.00.07

ՀՀ ԳԱԱ «ՀԱՅԿԵՆՍԱՏԵԽՆՈԼՈԳԻԱ» ԳԱԿ ՊՈԱԿ
Մարգարյան Արմինե Արմենի
ՀԱՅԱՍՏԱՆԻ ՀԱՆՐԱՊԵՏՈՒԹՅԱՆ ՊՂՆՁԻ և ՈՍԿՈՒ ՀԱՆՔԱՊԱՐՆԵՐԻ
ՄԻԿՐՈԲԻՈՏԱՆ, ՄԵՏԱՂԱԿԱՅՈՒՆ ԲԱՑԻԼՆԵՐԻ ՄԵԿՈՒՍԱՑՈՒՄԸ,
ՆՈՒՅՆԱԿԱՆԱՑՈՒՄԸ ԵՎ ՄԵՏԱՂԱԿԱՅՈՒՆՈՒԹՅԱՆ
ՄԵԽԱՆԻԶՄՆԵՐԸ
Գ.00.07 – «Միկրոբիոլոգիա» մասնագիտությամբ
կենսաբանական գիտությունների թեկնածուի գիտական
աստիճանի հայցման ատենախոսության
ՍԵՂՄԱԳԻՐ
ԵՐԵՎԱՆ – 2014
НПЦ «АРМБИОТЕХНОЛОГИЯ» НАН РА ГНКО
Маргарян Армине Арменовна
МИКРОБИОТА РУДНЫХ ПОРОД МЕДИ И ЗОЛОТА РЕСПУБЛИКИ
АРМЕНИИ, ВЫДЕЛЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ
МЕТАЛЛОУСТОЙЧИВЫХ БАЦИЛЛ И МЕХАНИЗМЫ
МЕТАЛЛОУСТОЙЧИВОСТИ
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук по специальности
03.00.07 – «Микробиология»
ЕРЕВАН – 2014
Ատենախոսության թեման հաստատվել է ԵՊՀ կենսաբանության ֆակուլտետում:
Գիտական ղեկավար՝
կ.գ.թ., դոցենտ Հ. Հ. Փանոսյան
Պաշտոնական ընդդիմախոսներ՝
ՀՀ ԳԱԱ ակադեմիկոս, կ.գ.դ,
պրոֆեսոր Է. Գ. Աֆրիկյան
կ.գ.դ. Ն. Ս. Վարդանյան
Առաջատար կազմակերպություն՝
ՀՀ ԳԱԱ Մոլեկուլային
կենսաբանության ինստիտուտ
Պաշտպանությունը կայանալու է 2014 թ. հուլիսի 15-ին, ժամը 14:00 -ին ՀՀ ԳԱԱ
«Հայկենսատեխնոլոգիա» ԳԱԿ-ում գործող ԲՈՀ-ի Կենսատեխնոլոգիայի 018
մասնագիտական խորհրդի նիստում:
Հասցե` 0056, ՀՀ, ք. Երևան, Գյուրջյան փողոց, 14, հեռ/ֆաքս (374 10) 65 41 83:
Ատենախոսությանը կարելի է ծանոթանալ ՀՀ ԳԱԱ «Հայկենսատեխնոլոգիա»
ԳԱԿ-ի գրադարանում:
Սեղմագիրը առաքված է 2014 թ. հունիսի 14-ին:
Մասնագիտական խորհրդի գիտական քարտուղար,
կ.գ.թ.
Գ. Ե. Ավետիսովա
Тема диссертации утверждена в биологическом факультете ЕГУ.
Научный руководитель:
к.б.н., доцент О. А. Паносян
Официальные оппоненты:
академик НАН РА, д.б.н.,
профессор Э. Г. Африкян
д.б.н. Н. С. Варданян
Ведущая организация:
Институт молекулярной биологии НАН РА
Защита диссертации состоится 15 июля 2014 г. в 14:00 часов на заседании
Специализированного совета ВАК 018 Биотехнологии при НПЦ «Армбиотехнология»
НАН РА.
Адрес: 0056, РА, г. Ереван, ул. Гюрджяна, 14, тел/факс (374 10) 65 41 83.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НПЦ «Армбиотехнология» НАН
РА.
Автореферат разослан 14 июня 2014 г.
Ученый секретарь Специализированного совета,
к.б.н.
2
Г. Е. Аветисова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность
исследования.
Исследование
микробиот
естественных
местообитаний с повышенными концентрациями тяжелых металлов, таких как
полиметаллические руды, является одной из важнейших задач современной
экологической микробиологии [Nies and Silver, 2007; Altimira et. al., 2012; Besaury et al.,
2013]. Это обусловлено, с одной стороны, выявлением роли и механизмов адаптации
микроорганизмов в данных экстремальных местах обитания, а с другой стороны открытием новых “инструментов” для биотехнологии [Spain and Alm, 2003; Нетрусов,
2004; Ozdemir еt al., 2012].
Использование методов молекулярной биологии позволило значительно расширить
представление о разнообразии культивируемых и некультивируемых микроорганизмов
различных местообитаний, в том числе территорий с повышенным содержанием
тяжелых металлов [Rastogi and Sani, 2011]. С разработкой и внедрением в
молекулярную
экологию
методов
секвенирования
нового
поколения
высокопроизводительного параллельного секвенирования (пиросеквенирования),
появилась реальная возможность масштабного изучения сложных гетерогенных
экосистем [Mardis, 2008; Golebiewski et al., 2013].
Благодаря гибкому метаболизму микроорганизмы способны быстро адаптироваться
к высоким концентрациям тяжелых металлов [Satyanarayana et al., 2013].
Металлоустойчивые микроорганизмы способны аккумулировать, детоксифицировать,
окислять или восстанавливать ионы тяжелых металлов, тем самым участвовать в
биогеохимическом круговороте металлов и способствовать процессам биоремедиации
[Nies, 2003; Nies and Silver, 2007].
Большое разнообразие физиологических свойств и высокая устойчивости к
неблагоприятным
условиям
обуславливает
широкое
распространение
эндоспорoобразующих бактерий в биотопах с повышенными концентрациями
токсичных металлов [Logan and De Vos, 2011; Moreno et al., 2012]. Однако,
биоразнообразие бацилл в таких биотопах и механизмы, обеспечивающие их
металлоустойчивость, недостаточно изучены.
Республика Армения (РА) богата месторождениями различных металлов, но
распространенность металлоустойчивых микроорганизмов в этих экотопов мало
изучена. Изучение микробиот месторождений меди и золота РА с использованием
современных молекулярно-биологических методов позволит расширить представление
о металлотолерантных микроорганизмах, выявить новые виды микроорганизмов и их
роль в данных экстремальных местах обитания. Выделение и изучение особенностей
индивидуального отклика металлоустойчивых штаммов бацилл позволит выявить
возможные механизмы устойчивости к металлам, что имеет фундаментальное значение
для ряда естественных наук. В то же время оценка их металл-аккумулирующих
способностей имеет практическое значение для поиска штаммов, перспективных для
биоремедиации.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось исследование
микробиоты рудных пород меди и золота РА, выделение металлоустойчивых
бациллярных культур и изучение механизмов металлоустойчивости выделенных
микроорганизмов.
Для достижения заданной цели были поставлены следующие задачи:
 определить состав бактериального сообщества в образцах почв с гравием
рудных пород с Зангезурского медно-молибденового комбината (Каджаран),
Капанского медного рудника, Соткского месторождения золота, а также в
3
образцах шлама хвостохранилища Ахталинского горнообогатительного
комбината (ГОК);
 выделить и идентифицировать металлоустойчивые аэробные и анаэробные
бациллы;
 изучить влияние, как отдельных ионов Cu2+, Ni2+, Zn2+ и Cd2+, так и их
комплексов на рост выделенных металлоустойчивых бацилл;
 выявить
способность
выделенных
металлоустойчивых
бацилл
аккумулировать тяжелые металлы;
 исследовать экспрессию генов металлоустойчивости - nikA, copA и czcD
выделенных бацилл при комплексном воздействии ионов Cu2+, Ni2+, Zn2+ и
Cd2+ в различных концентрациях.
Научная новизна. Впервые с использованием метода ПЦР-ДГГЭ анализа и
высокопроизводительного секвенирования (454-пиросеквенирования) фрагментов гена
16S рРНК (рДНК) проведена комплексная оценка разнообразия бактериального
сообщества рудных пород меди и золота РА. ПЦР-ДГГЭ анализом установлено, что в
образцах шлама хвостохранилища Ахталинского ГОК и почв с гравием рудных пород
Капанского медного рудника доминировали бактерии филы Alphaproteobacteria, в
образцах почв с гравием рудных пород Зангезурского медно-молибденового комбината
- бактерии филы Actinobacteria, а в Соткском месторождении золота - бактерии филы
Actinobacteria и Alphaproteobacteria. Методом 454-пиросеквенирования показано
доминирование фил протеобактерий (24%), Bacteroidetes (20%) и субдоминирование
цианобактерий (17%) и неклассифицированных бактерий (19%) в образцах шлама
хвостохранилища Ахталинского ГОК.
Изолированы и идентифицированы металлоустойчивые аэробные и анаэробные
бациллы. Изучен уровень металлоустойчивости бацилл, изолированных из рудных
пород меди и золота РА. Впервые показан высокий уровень металлоустойчивости
выделенных бацилл как к отдельным ионам металлов Ni2+, Cu2+, Cd2+ и Zn2+, так и к их
комплексному влиянию.
Установлена способность выделенных металлоустойчивых бацилл аккумулировать
ионы Cu2+, Zn2+ и Cd2+. Впервые показано наличие генов nikA и copA, обеспечивающих
металлоустойчивость выделенных бацилл.
Практическая ценность работы. Полученные результаты расширяют
представление о разнообразии культивируемого и некультивируемого бактериального
сообщества полиметаллических руд. Данные по составу бактериального разнообразия
могут быть использованы для корректирования путей метаболизма в сообществе и
целенаправленного выделения организмов или генов металлоустойчивости,
используемых в разработках новых биологических технологий.
Создана коллекция металлоустойчивых бацилл, которая послужит источником
банком микроорганизмов для проведения целенаправленного поиска ценных штаммов
для нужд биотехнологии.
Биоаккумулирующая спасобность выделенных бацилл имеет ценное значение для
последующего применения этих штаммов в биоремедиации.
Гены nikA и copA, обеспечивающие металлоустойчивость выделленых бацилл,
могут использоваться в генетической инженерии для конструирования новых
металлоустойчивых микроорганизмов.
Основные положения, выносимые на защиту.
 Наличие бактерий филотипа Alphaproteobacteria, характерного для рудных
пород меди и золота РА, и обилие протеобактерий (24%), Bacteroidetes
4
(20%) и неклассифицированных бактерий (19%) в образцах шлама
хвостохранилища Ахталинского ГОК.
 Присутствие представителей родов Bacillus, Brevibacillus, Geobacillus,
Clostridium и Tepidimicrobium как наиболее часто встречающихся
металлоустойчивых эндоспорообразующих бактерий в рудных породах
меди и золота.
 Металлоустойчивость к ионам Cu2+, Ni2+, Zn2+ и Cd2+ выделенных бацилл и
перспектива применения Bacillus subtilis AG4 и B.megaterium AA1 как
биоаккумуляторов ионов Cu2+, Zn2+ и Cd2+.
 Хромосомные гены nikA и copA обеспечивают металлоустойчивость бацилл.
Связь работы с научными программами. Работа проводилась в рамках базового
(10-3/I-9) и тематичекого (№ 470) финансирования Министерствa образования и науки
РА, а также в рамках гранта CPEA-2011/10081 (Norwegian Cooperation Programme in
Higher Education with Eurasia).
Личный вклад автора. Личный вклад автора включает отбор проб,
экспериментальную реализацию сформулированных задач, поиск и анализ научной
литературы по теме, обобщение результатов исследований, оформление научных
статей и диссертационной работы. Постановка основных задач и разработка методов, а
также результаты исследований обсуждались и обрабатывались под руководством
научного руководителя.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на XIV
Конференции «Вклад молодых ученых в области биотехнологии» (Ереван, Армения,
2010); Международной конференции «Second Balkan Conference on Biology: 50 Years
university of Plovdiv» (Пловдив, Болгария, 2010); 15-ой Международной Школеконференции "Биология - наука 21 века" (Пущино, Россия, 2011); Международной
конференции «5th International Symposium on Biosorption and Bioremediation» (Прага,
Чехия, 2012); Международном конгрессе «4 th Congress of European Microbiologists»
(Лейпциг, Германия, 2013); Международном конгрессе «38th Congress of FEBS
“Mechanisms in Biology”» (Санкт-Петербург, Россия, 2013), а также на семинарах
кафедры микробиологии и биотехнологии микроорганизмов и растений,
биологического факультета ЕГУ (Ереван, Армения) и на кафедре биологии
Университета Бергена (Берген, Норвегия).
Место выполнения работы. Основная работа проводилась на кафедре
микробиологии и биотехнологии микроорганизмов и растений биологического
факультета ЕГУ (Ереван, Армения) и частично на кафедре биологии Университета
Бергена (Берген, Норвегия).
Публикации. Материалы диссертации представлены в 7 публикациях, включая 3
статьи и 4 тезиса конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 133 страницах и
включает 29 рисунков и 16 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора
литературы и экспериментальной части, содержащей «Объекты и методы
исследования», «Результаты исследований и их обсуждение», «Заключение»,
«Выводы» и «Список литературы», включающий 1 отечественное и 198 зарубежных
наименований.
КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
В литературном обзоре, состоящем из 4 частей, описаны распространение и
филогенетическое разнообразие металлоустойчивых микроорганизмов, основные
5
механизмы их металлоустойчивости и рассмотрены практическое применение и
возможные перспективы использования металлоустойчивых бактерий.
ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Обекты исследования. Объектами исследований служили образцы почв с гравием
рудных пород с территорий Зангезурского медно-молибденового комбината
(Каджаран), Капанского медного рудника, Соткского месторождения золота, образцы
из шлама хвостохранилища Ахталинского ГОК, а также металлоустойчивые культуры
микроорганизмов, выделенные из указанных территорий. С целью определения состава
бактериального сообщества образцы, отобранные из вышеупомянутых участков,
использованы для выделения метагеномной ДНК. Из образцов, отобранных из
вышеуказанных
территорий,
выделены
около
29
металлоустойчивых
эндоспорообразующих бактериальных штаммов, включая аэробные и анаэробные,
мезофильные, термофильные и термотолерантные формы, которые и являлись
основными объектами исследований.
Материалы исследований. Все питательные среды, реактивы и растворы
приготовлены согласно описанным методам [Gordon, 1973; Нетрусов, 2005; Bergey,
2009; Брюханов, 2012].
Изучение биоразнообразия бактерий в образцах молекулярно-биологическими
методами. Для изучения микробного сообщества из 0.5 г образцов почвы с гравием
рудных пород или шлама выделена тотальная геномная ДНК с использованием наборов
реактивов Fast DNA SPIN Kit for Soil (MP Biomedicals, USA) соответственно указаниям,
представленным в инструкции. Анализ ПЦР-ДГГЭ осуществлен по Муйзер и др.
[Muyzer et al., 1993]. 454-пиросеквенирование тотальной ДНК осуществлено согласно
методике компании “Roche Diagnostics Corporation”. Данные были обработаны согласно
методическим рекомендациям в приложении Ribosomal Database Project (RDP) Pipeline
(https://pyro.cme.msu.edu/index.jsp) [Cole et al., 2009].
Изолирование культур микроорганизмов. Выделение металлоустойчивых
мезофильных и термофильных аэробных и анаэробных эндоспорообразующих
микроорганизмов проводили методом накопительных культур и прямого высева
разведений навесок образцов на питательные среды (схема 1).
Методы изучения культуральных, морфологических и биохимических
особенностей металлоустойчивых бактерий. Морфологические, культуральные и
физиолого-биохимические
особенности
выделенных
культур
изучены
по
общепринятым методам [Нетрусов, 2005; Bergey, 2009] с корректировкой условий в
зависимости от потребностей изучаемой культуры.
Идентификация культур. Идентификация культур осуществлена методом анализа
16S рДНК.
Изучение влияния ионов металлов Cu2+, Ni2+, Zn2+ и Cd2+ на рост
микроорганизмов. МИК ионов ТМ определяли посевом культур на чашки Петри,
содержащие питательную среду и ионы металлов Cu2+, Ni2+, Zn2+ и Cd2+ с конечной
концентрацией в диапазоне от 10 до 500 мкМ. Влияние комплекса ионов тяжелых
металлов на рост бактерий определяли культивируя металлотолерантные бациллы в
соответствующей среде с различными комбинациями ионов Cu2+, Ni2+, Zn2+ и Cd2+ (от
10 до 500 мкМ для каждого металла).
6
Исследуемый субстрат (1г/мл)
Пастеризация при 80°C, 10 мин.
Посев в аэробных условиях
Посев в анаэробных условиях
Культивирование
при 37oC
Культивирование
при 55oC
Изолирование
аэробных,
мезофильных бацилл
Изолирование
аэробных,
термофильных бацилл
Культивирование
при 37oC
Культивирование
при 55oC
Изолирование
Изолирование
анаэробных,
анаэробных,
мезофильных бацилл термофильных бацилл
Скрининг металлоустойчивых микроорганизмов
Схема 1. Изолирование культур микроорганизмов.
Изучение механизмов металлоустойчивости культур. Для выявления
способности культур аккумулировать ионы металлов Cu 2+, Ni2+, Zn2+ и Cd2+
бациллярные культуры инкубировали в соответствующей питательной среде,
содержащей 32 мкМ, 34 мкМ, 30 мкМ и 20 мкМ ионов металлов. Концентрацию ионов
ТМ в бактериальной биомассе измеряли масс-спектрометром Elan 9000 ICP с индием и
аргоновой плазмой в качестве внутреннего стандарта [Clesceri et al., 1998].
Наличие генов copA, nikA и czcD определяли ПЦР амплификацией и
секвенированием полученных ампликонов. Выделение тотальной РНК и синтез ДНК
проводили с использованием наборов RNasе plus mini kit (Qiagen, USA) и Script VIOLc
DNA synthesis kit (Invitrogen, USA), по инструкции. ПЦР в реальном времени
проводили, используя набор EXPRESS SYBR Green Two-Step qPCR Super Mix Kit
(Invitrogen, USA), по инструкции. Уровень экспрессии генов определяли абсолютным
количественным методом с использованием стандартной кривой [Whelan et al., 2003;
Pfaffl, 2003].
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫМИ МЕТОДАМИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ
СООБЩЕСТВ УЧАСТКОВ РЕСПУБЛИКИ АРМЕНИЯ С ПОВЫЩЕННЫМ
СОДЕРЖАНИЕМ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ
Республика Армения (РА) богаты различными полиметалическими рудами, однако
микробиота таких экстремальных экотопах РА изучена мало.
Для оценки биоразнообразия микроорганизмов в отобранных образцах почв и
шлама использованы анализ ПЦР-ДГГЭ и 454-пиросеквенирования последовательностей 16S рДНК. Для амплификации 16S рДНК в качестве матрикса,
использована тотальная ДНК, выделенная из отобранных образцов. Расположение и количество полученных полос ампликонов 16S рДНК в градиентном геле указывает на
различия между бактериальными сообшествами разных образцов (рис. 1).
Наименьшее количество полос и, тем самым, меньшее количество микроорганизмов
обнаружено в образце Капанского медного рудника, а наибольшее количество - в
образце шлама хвостохранилища Ахталинского ГОК. По расположению полос
указанные изучаемые участки похожи, что свидетельствует о схожести микробиоты на
7
данных участках. Капанское и Ахталинское месторождения по природе являются
медно-колчеданными, что и может объяснить сходство микробиоты на данных
участках.
Анализ последовательностей ДНК,
1
2
3
4
экстрагированных из соответствующих
полос в денатурирующем геле, выявил
не менее 95% сходства с последова40%
А1
тельностями близкородственных видов,
Кп1
зарегистрированных в Банке Генов
А2
NCBI. В основном последовательности
Кп2
А3
С1
А4
совпадали с некультивируемыми бакС2
К1
А5
С3
А6
териальными видами. В образцах показано наличие фил Alphaproteobacteria,
А7
А8
Кп3
Actinobacteria и Bacteroidetes (табл. 1).
К2
С4
В Соткском месторождении золота
бактерии
фил
Actinobacteria
и
К3
К4
Alphaproteobacteria
присутствуют
в
К5
одинаковом
количестве.
Альтерна70%
тивные результаты получены американскими учеными, изучившими разРис. 1. ПЦР-ДГГЭ анализ фрагмента гена 16S рРНК,
нообразие микроорганизмов в образцах
полученного из тотальной ДНК, выделенной из
хвостохранилища золотого рудника,
образцов: 1. Соткского месторождения золота, 2.
расположенного
около
поселка
хвостохранилища Ахталинского
горнообогатительного комбината, 3. Капанского
Нидерланд (Колорадо, США). Показано
медного рудника, 4. Зангезурского меднодоминирование представителей фил
молибденового комбината. Полосы, обозначенные от
Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria,
С-1 до К-5, были вырезаны и использованы для
Bacteroidetes и Acidobacteria, а также
экстракции ДНК.
присутствие
в
малом
количестве
представителей фил Actinobacteria, Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria, TM7
(средний слой торфa). В образцах, взятых из различных глубин трех золотых рудников
Южной Африки, показано наличие фил Gammaproteobacteria, Betaproteobacteria,
Firmicutes и Planctomycetes, а представители филы Actinobacteria, а также различные
протеобактерии идентифицированы в образцах Хомстейского золотого рудника
(Южная Дакота, США). Доминирование филы Actinobacteria в образце почв Соткского
месторождения золота и малое количество Alphaproteobacteria указывает на различие
структуры микробиоты по сравнению с ранее изученными территориями
месторождений золота.
В образцах шлама хвостохранилища Ахталинского ГОК доминировали бактерии
филы Alphaproteobacteria (62%), а 25 и 13% составляли представители фил
Gammaproteobacteria и Bacteroidetes соответственно. В образцах Капанского медного
рудника обнаружены представители Alphaproteobacteria и Bacteroidetes, а в образцах
Зангезурского медно-молибденового комбината выявлены различные бактерии филы
Actinobacteria (до 90%) и лишь 10% составляли бактерии филы Bacteroidetes.
Распространенность различных протеобактерий, а также бактерий фил
Actinobacteria, Bacteroidetes и Firmicutes показаны в образцах хвостохранилища
Яунанского медного завода (Китай) и медного рудника Чили. В хвостохранилище
около медного рудника Аризоны (США), помимо бактерий указанных фил,
присутствовали также представители филы Acidobacteria.
8
9
Таблица 1. Таксономическая принадлежность последовательностей, экстрагированных из ДГГЭ полос,
основанная на сравнении с данными банка генов NCBI с применением BLAST анализа.
Как методом ПЦР-ДГГЭ, так и методом клонирования, на различных территориях с
высокими концентрациями меди, обнаружены представители филы Firmicutes. Данный
филотип не обнаружен ПЦР-ДГГЭ анализом ампликонов гена 16S рРНК в исследованных нами образцах. Так как анализ ПЦР-ДГГЭ выявляет сообщество выше 1%, можно
предположить, что представители филы Firmicutes в образцах присутствуют в малом
количестве. Данное предположение подтвердил анализ 454-пиросеквенирования тотальной ДНК, выделенной из образцов отложений хвостохранилища Ахталинского
ГОК. В образце представители филы Firmicutes составляют 0.9% (рис. 2).
Присутствие
филы
Alphaproteobacteria в
образцах указывает на
высокую
приспосабливаемость представителей этой филы
к высоким концентрациям ТМ. Литературные данные также
свидетельствуют о доминировании представителей филы Alphaproteobacteria в похожих экотопах. Из культивируемых бактерий
в образцах выявлены
роды Propionibacterium, Nocardia, Sphingomonas, Erythrobacter,
Erythrobacteraceae, Tenacibaculum и Pseudomonas.
Все указанные микроорганизмы
ранее
были описаны и выделены из различных
участков с высоким
содержанием ТМ, а
Рис 2. Филогенетическое древо
гены
металлоустойблизкородственных видов последовательностей фрагментов 16S
чивости выявлены у
рДНК, построенное методом “Neighbor-Joining” с использованием
Propionibacterium, Pseпрограммы Mega 6.06. Масштаб (0.02) соответствует
udomonas и Sphingo2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами
monas. На основании
показана статистическая достоверность порядка ветвления,
анализа последовательопределенная с помощью “bootstrap”- анализа 1000
ностей фрагментов 16S
альтернативных деревьев (приведены значения выше 50%).
рДНК,
экстрагированных из соответствуюших полос, построено филогенетическое древо близкородственных видов (рис. 2).
Последовательности ДНК, экстрагированные из полос К1, К3, К4 и К5, включены в
один кластер и представляют различные актинобактерии. Последовательности ДНК,
экстрагированные из полос С3 и С4, также представляют актинобактерии, но включены
10
в отдельный кластер, что свидетельстует о разнообразии представителей филотипа на
разных территориях РА.
Представители филы Bacteroidetes, выявленные в образцах почв Зангезурского
медно-молибденого комбината и шлама хвостохранилища Ахталинского ГОК,
включены в отдельные кластеры, что также свидетельстует о разнообразии
представителей филотипа на разных территориях.
Несмотря на то, что последовательности ДНК, экстрагированные из полос А2, А7 и
Кп1, согласно BLAST анализу, сходны с представителем Gammaproteobacteria
Pseudomonas fluorescens (менее 95%), “bootstrap”-анализ выявил принадлежность
указанных последовательностей к Alphaproteobacteria (рис. 2). Последовательности,
представляющие Alphaproteobacteria, включены в отдельный кластер, что
свидетельствует о присутствии уникальных популяций протеобактерий, и, возможно,
новых бактериальных видов, характерных для изученных территорий РА.
Полученные результаты анализа ПЦР-ДГГЭ указывают на большое бактериальное
разнообразие в образце хвостохранилища Ахталинского ГОК. Для более глубокого
изучения микробного разнообразия хвостохранилища, т.е. выявления не только
доминирующих микроорганизмов, но и минорных компонентов, которые могут играть
важную экологическую роль, использован метод 454-пиросеквенирования. С помощью
интернет-пакета программ RDP установлено наличие 140000 последовательностей
ампликонов
16S
pДНК,
полученных
после
454-пиросеквенирования.
Последовательности обработаны с целью удаления адаптора, исключения
последовательностей менее 200 п.о. и последовательностей плохого качества. В
результате отобраны 21954 последовательности, которые проанализированы для
выявления
оперативных
таксономических
единиц
(ОТЕ)
ииндексов
распространенности микроорганизмов Chao1 и Шеннона.
Показано присутствие 3 111, 1 279 и 931 ОТЕ при 99, 97 и 95% сходстве (similarity
cutoffs), соответственно. Видовое богатство (при 97% кластерном сходстве), оцененное
с помощью непараметрического критерия Chao1, составляло 2345, а видовое
разнообразие по индексу Шеннона было 4.5 (табл. 2).
Таблица 2. Определение разнообразия микроорганизмов в образце хвостохранилища
Ахталинского ГОК при 99, 97 и 95% кластерном сходстве.
Степень
сходства, %
99
97
95
Количество
Последовательностей
ОТЕ
Chao1
21 954
3 111
1 279
931
7 680
2 345
1 600
Шеннон
(H')
5.4
4.5
4.2
Числа ОТЕ, индексы Chao1 и Шеннона указывают на высокое разнообразие
микробиоты. Значения индекса Chao1 свидетельствуют о том, что даже анализ 21954
последовательностей недостаточен для полного описания имеющегося уровня
микробного биоразнообразия. Значение Chao1 при 99 и 95% сходстве, соответственно,
в три и два раза превышает общее количество ОТЕ. Похожая закономерность выявлена
и при изучении микробного биоразнообразия хвостохранилища медного рудника
Аризоны (США) и загрязненных ТМ почв южной Польши.
Вопреки распространенному мнению о том, что экстремальные местообитания
характеризуются низким уровнем биоразнообразия, мы получили высокие показатели
индекса Шеннона, которые подтверждаются анализом таксономической структуры
исследуемых сообществ.
11
Бактериальные филы, представляющие
>0,05% пиротагов
n=21954
Рис. 3. Относительная численность филогенетических групп в наборе данных
“универсальных” пиротагов; n - число, отражающее качество фильтраций пиротагов.
Численность каждой филы определена инструментом Classifier программы RDP с 80%
сходством (confidencecut-off).
Анализ полной кластеризации выравниваний последовательностей показал
преобладание протеобактерий (24%) (Alphaproteobacteria 42%, Betaproteobacteria 34%,
Gammaproteobacteria 15%, Deltaproteobacteria 6%, Epsilonproteobacteria 0.2%) и
Bacteroidetes (20%) (рис. 3). Анализ выявил также доминирование цианобактерий (17%)
и неклассифицированных бактерий (19%). В образце в малом количестве
присутствовали и Chlorobi, Chloroflexi, Gemmatimonadetes, Flavobacteria, Acidobacteria,
Firmicutes,
Actinobacteria,
Sphingobacteria,
Verrucomicrobia,
Planctomycetes,
Armatimonodetes, Spirochaetae, Lentisphaerae, Nitrospirae, Dinococcus-Thermus.
Обнаружены также представители предлагаемых фил SR1 (серная река), TM7 (средний
слой торфa), OP11 (гидротермы Йеллоустонского национального парка), OD1
(отделенный от OP11) и BRC1 (рисовые поля) (рис. 3).
Преобладающими по количеству последовательностей были протеобактерии
Alphaproteobacteria, которые включали 28 родов. Эти роды представлены как
неклассифицированными, так и классифицированными бактериальными видами.
Представители Alphaproteobacteria обнаруживаются почти во всех экосистемах.
Альфапротеобактерии включают большое количество родов, которые толерантны к
различным экстремальным факторам и способны расти олиготрофно, что обеспечивает
их жизнеспособность в экстремальных средах обитания. В образце хвостохранилища
Ахталинского ГОК из родов Alphaproteobacteria преобладали Novosphingobium,
Roseomonas и Sphingomonas, которые ранее были изолированы из похожих территорий
и были предложены для биоремедиации загрязненных почв.
Вторыми по количеству последовательностей из протеобактерий являлись
представители Betaproteobacteria, включающие 15 родов, из которых преобладали
Tepidimonas, Tepidicella, Thiobacillus и Sulfuritalea. Представители этих родов
хемолитогетеротрофные
или
хемолитоавтотрофные
бактерии,
окисляющие
12
тиосульфаты до сульфитов или окисляющие соединения железа. T. ferrooxidans и T.
thiooxidans отличаются необычной устойчивостью к довольно высоким концентрациям
ионов Cu2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ и ионов других ТМ.
Представители Beta- и Alphaproteobacteria доминировали также в образцах,
отобранных из разных участков хвостохранилища Аризонского медного рудника
(США). В данных образцах Beta-, Alph-, Gamma- и Deltaproteobacteria составляли 59%,
21%, 16% и 1%, соответственно. Берг и соавторы при изучении влияния
биодоступности меди на загрязненных территориях Хюгум (Дания) установили, что
различные концентрации меди на территории не влияют на численный состав
Alphaproteobacteria, тогда как количество Beta-, Gamma- и Deltaproteobacteria
снижалось с увеличением концентрации ионов меди. Вероятно, Alphaproteobacteria
наиболее адаптированы к экстремальным условиям окружающей среды по сравнению с
другими протеобактериями.
Фила Bacteroidetes представлена 15 родами, из которых преобладающими являлись
роды Flavobacterium и Sphingobacteria. Представители рода Flavobacterium и
Sphingobacteria физиологически разнообразны, распространены в аналогичных
местообитаниях и характеризуются высокой металлотолерантностью.
Интересно, что цианобактерии или не обнаруживались, или присутствовали в
малом количестве в образцах из различных территорий с повышенными
концентрациями ТМ. Цианобактерии играют важную роль в экосистеме не только как
первичные продуценты, но и как биосорбенты металлов, способные аккумулировать
Zn2+ и Cd2+. Субдоминирование цианобактерий (17%) в изученном образце, вероятно,
свидетельствует об участии последних в биогеохимичеком круговороте ТМ.
Присутствие представителей предлагаемой филы TM7 было показано также в
образцах Хомстейского золотоносного рудника, а представителей фил SR1, OD1, OP11
и BRC1 - в образцах шлаков сточных вод, содержащих высокую концентрацию Ag, и в
отложениях реки, содержащих высокие концентрации Zn, Sr, Mn, Al, U, Fe и Hg.
Наличие неклассифицированных бактерий в образце хвостохранилища
Ахталинского ГОК указывает на присутствие уникального микробного сообщества и,
возможно, метаболически новых бактериальных групп.
Итак, впервые молекулярными методами охарактеризованы бактериальные
сообщества различных месторождений цветных металлов РА. Показана уникальность
структуры бактериальной популяции различных территорий РА с повышенными
концентрациями ТМ.
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ МЕТАЛЛОУСТОЙЧИВЫХ БАЦИЛЛ
Эндоспорoобразующие хемоорганотрофные аэробные и анаэробные бактерии,
благодаря большому разнообразию физиологических свойств и высокой устойчивости
к неблагоприятным условиям, широко распространены в экстремальных экосистемах.
Ранее показана распространенность бацилл в биотопах с повышенными
концентрациями ТМ, однако физиологическое значение металлоустойчивых бацилл в
таких биотопах и механизмы, обеспечивающие металлоустойчивость бацилл,
малоизучены.
Из образцов почв территории Зангезурского медно-молибденового комбината
(Каджаран), Капанского медного рудника, Соткского месторождения золота, а также
образцов шлама хвостохранилища Ахталинского ГОК выделены 29 металлоустойчивых
аэробных и анаэробных, термофильных и мезофильных эндоспорообразующих
культур.
13
На основании морфолого-культуральных, физиологических, биохимических
признаков и генетического анализа охарактеризованы и идентифицированы все
изоляты.
Аэробные культуры на поверхности твердой питательной среды образовывали
округлые, гладкие, влажные, однородные, плоские колонии с ровным краем и
диаметром 2-5 мм. Культура AK4 образовывала круглые колонии с неровными краями,
культуры АK1, АK2 и АА1 на среде 1 с добавлением ионов Cu2+ образовывали темнокоричневые колонии, а культуры AK8 и AK10 на питательной среде - слизистые
колонии с неровными краями.
Все культуры были представлены подвижными эндоспорообразующими прямыми
палочками, окрашивающимися по Граму положительно. Они образовывали, в
основном, овальные или эллипсоидальные споры с центральным, терминальным или
субтерминальным расположением.
Некоторые аэробные культуры были способны к анаэробному росту (табл. 3). Все
изоляты являлись хемоорганотрофными, каталазо-положительными бактериями.
Культуры не образовывали ни газ на среде с глюкозой, ни индол из триптофана, а
также не расщепляли тирозин и фенилаланин и не были способны к росту в
присутствии 0.01% лизоцима. Некоторые культуры образовывали гидроксиацетон, а
другие восстанавливали нитрат до нитрита. В качестве источника углерода способны
они использовать цитрат. Некоторые физиологические и биохимические признаки
выделенных металлоустойчивых бацилл представлены в таблице 3.
Изоляты различались по способности к росту в средах с разными концентрациями
NaCl, разными источниками углерода, имели разные интервалы pH и температуры
роста. Для мезофильных культур AA1, AA2, AK1, AK2, AK3, AK4, AK5, AK7, AG5,
AG6 и EK1 оптимум температурного роста лежит в пределах 30-37°C. Культуры AK4,
EK2, AG3 и AG4 оказались термотолерантными с оптимумом температурного роста от
45 до 50°C, а остальные культуры не способны расти при температуре ниже 50°C
(оптимум температурного роста термофилов колебался от 55 до 60°C).
Для культур AG1, AG2, AD1, AD2, AD3, AD4 и AA4 оптимальная концентрация
NaCl лежит в пределах от 2 до 3%, а для остальных - от 5 до 7 %. Однако все культуры,
исключая AG1, AG2, AD1-AD7, способны расти в присутствии до 7% NaCl, а культура
AA4 – до 10% NaCl.
Почти все культуры способны расти в интервале pH от 5 до 9, однако оптимальным
является значение pH 7, а для культур AD1, AD2, AD3, AD6 и АК3 - pH 8.
Изучение биохимической активности культур выявило наличие значительной
гидролазной активности. Среди выделенных культур амилолитически активны 14, из
которых наибольшей амилолитической активностью обладали культуры AG1, AG3,
AG4, AA1, AK1 и АK2. Около 16 культур обладали также протеолитической
активностью. Культуры AD1, AD3-AD7, AА4, AG2, AG3 и AK6 не обладали или
проявляли слабую гидролазную активность по отношению к казеину.
Липолитическая активность наблюдалась почти у всех культур, особенно по
отношению к твину 40. Только культуры AD3, AD4, AD5, AD7 и AA4 не обладали
липолитической активностью, а культуры AG1, AG2 и AG3 отличались ярко
выраженной липолитической активностью.
14
15
+ присутствие признака, - отсутствие признака.
Таблица 3. Некоторые морфологические, физиологические и биохимические особенности выделенных
металлоустойчивых бацилл.
Методом анализа ДГГЭ фрагментов V3 региона 16S рДНК культур и при помощи
компьютерной программы Gel2K (http://folk.uib.no/nimsn/gel2k/) все аэробные бациллы
были сгруппированы в кластеры. 20 культур, представляющие отдельные кластеры и
выделенные из различных рудных пород РА, а также анаэробные бактерии
идентифицированы с использованием анализа последовательностей 16S рДНК (табл. 4).
Таблица 4. Таксономическая принадлежность металлоустойчивых культур на основании сравнения последовательности 16S рДНК с данными банка генов с применением BLAST анализа.
Территория
выделения
Сотк
Ахтала
Каджаран
Капан
Культура
AG1
AG2
AG3
AG4
AG5
AG6
AD1
AD2
AD3
AD5
AD6
AA1
AA2
AA3
AA4
AK1
AK3
AK4
AK6
AK8
AK10
EK2
Длина
последовательности (п.о.)
1286
1478
1459
1469
1466
1462
998
994
1476
1480
1459
948
1424
1437
912
1459
1468
1466
1467
1465
719
1468
Ближайшая филогенетически сходная
последовательность микроорганизма
|Номер депонирования|
Brevibacillus thermoruber 423 |KF192950|
Geobacillus thermodenitrificans PB1511 |FJ491391|
Bacillus licheniformis OKF02 |KC969075|
Bacillus subtilis ZM06 |JF932296|
Bacillus simplex N25 |GU086427|
Bacillus pumilus MCCC 1A08154 |JX680132|
Brevibacillus thermoruber LII |AB757752|
Geobacillus thermodenitrificans WJ-5 |JX673945|
Geobacillus pallidus B1 |HM030740|
Geobacillus toebii BGSC 99A1 |AY608982|
Bacillus licheniformis OKF02 |KC969075|
Bacillus megaterium IHB B 4625 |KF475802|
Clostridium butyricum CB TO-A |AB687551|
Tepidimicrobium sp. SC-1 |AB748937|
Geobacillus pallidus B1 |HM030740|
Bacillus megaterium GC61 |KF158230|
Bacillus subtilis DYU1 |EF442670|
Bacillus licheniformis CICC 10037 |AY871102|
Bacillus pumilus MCCC 1A08154 |JX680132|
Bacillus licheniformis CA81b |KF040981|
Bacillus pumilus Pa1 |KF111692|
Bacillus subtilis W-3 |EF656456|
Сходство,
%
99
98
99
99
99
99
97
99
98
99
99
100
99
97
99
99
99
99
99
99
93
99
Наличие Bacillus subtilis и B. licheniformis наблюдается почти во всех образцах, что
свидетельстует о высокой приспосабливаемости данных бактерий в экстремальных
биотопах. Распространенность термофильных бацилл наблюдается в образце шлама
хвостохранилища Ахталинского ГОК. Все представители рода Bacillus ранее выделены
из аналогичных экосистем. В литературе отсутствуют данные о разнообразия
анаэробных бактерий рода Tepidimicrobium в экотопах с повышенными
концентрациями ТМ. Совпадение нуклеотидных последовательностей 16S рДНК
культуры AA3 с Tepidimicrobium sp. SC-1 на 97%, что указывает на возможность
присутствия нового вида. BLAST анализ и филогенетическое древо (рис. 4) показали,
что последовательность 16S рДНК культуры АK10 сходна с B. pumilus Pa1 на 93%, а на
филогенетическом древе культура расположена достаточно далеко от других культур,
сходных с B. pumilus.
Основываясь на филогенетическом анализе, можно предполжить, что культура
АK10 является новым видом или подвидом. Как видно из полученных результатов,
выделенные культуры принадлежали к родам Bacillus, Geobacillus, Brevibacillus,
Clostridium и Tepidimicrobium, относящимся к филе Firmicutes.
16
Однако распространенность данной филы на изученных территориях не была
выявлена методом ПЦР-ДГГЭ, а анализ 454-пиросеквенирования показал наличие
представителей
филы
Firmicutes в количестве
около 0.9% от всей
популяции.
Малое
количество
эндоспорообразующих
бактерий в изучаемых
образцах можно объяснить
трудностью
выделения
ДНК
из
эндоспорообразующих
бактерий,
наличие
которых подтверждается
методом
культивирования.
Все
выделенные штаммы сохраняются на кафедре
микробиологии и биотехнологии растений и
микроорганизмов ЕГУ.
Они
послужат
объектами дальнейших исследований с целью изучения возможностей их
использования в биотехнологических производствах.
Рис. 4. Филогенетическое древо близкородственных видов бацилл, построенное методом
“Neighbor-Joining” с использованием программы Mega 6.06. Масштаб (0.01) соответствует
одной нуклеотидной замене на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая
достоверность порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap”-анализа 1000
альтернативных деревьев (приведены значения выше 50%).
ВЛИЯНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ НА БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ
БАЦИЛЛ
Для выявления биотехнологического потенциала металлоустойчивых бацилл и
механизмов их металлотолерантности установлены минимальные ингибирующие
концентрации (МИК) ионов Cu2+, Ni2+, Zn2+ и Cd2+, воздействующие на выделенные
штаммы родов Bacillus, Geobacillus и Brevibacillus. Все штаммы проявляли
устойчивость к ионам Ni2+ и Cu2+ (до 4.5 и 3.5 мМ, соответственно) (табл. 5). Степень
возрастания токсичности ионов металлов можно представить следующим образом
Ni2+<Cu2+<Zn2+<Cd2+.
По сравнению с литературными данными, выделенные металлоустойчивые
бациллы проявляли высокую толерантность к ионам Ni2+ и Cu2+. Так, B. thuringiensis
B7, выделенный из загрязненных почв горы Лофти, проявлял толерантность к ионам
Zn2+ (2.98 мг/л) и чувствительность к ионам Cu2+ (0.82 мг/л). B. circulans EB1 устойчив
17
к ионам Zn2+ и Ni2+ (МИК - 22 и 10 мМ, соответственно) и чувствителен к ионам Cu 2+
(МИК - 2.5 мМ).
Таблица 5. МИК ионов Ni2+, Cu2+, Zn2+ и Cd2+ (мМ) для выделенных бацилл.
.
Штамм
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Cd2+
Brevibacillus thermoruber AG1, AD1
Geobacillus thermodenitrificans AG2, AD2
G. pallidus AD3
G. toebii AD5
G. pallidusAA4
Bacillus licheniformis AG3
B. licheniformis AD6
B. licheniformis AK4
B. licheniformis AK8
B. subtilis AG4
B. subtilis AK3
B. simplex AG5
B. pumilus AG6
B. pumilus AK6
B. pumilus AK10
B. megateriumАА1
B. megaterium AK1
4.5
4.5
4.5
2.5
4.5
4.5
3.0
4.5
4.0
4.5
4.5
4.5
4.5
4.0
4.0
4.5
4.5
3.5
3.5
2.5
1.5
3.5
3.5
2.0
2.5
0.5
3.5
2.5
3.0
3.0
1.6
1.3
3.0
4.0
0.5
0.5
0.8
0.8
0.8
1.0
0.8
0.8
0.4
1.0
0.8
1.0
1.0
0.8
0.45
1.0
0.8
0.1
0.1
0.45
0.45
0.45
0.5
0.45
0.45
0.1
0.5
0.45
0.8
0.8
0.1
0.1
0.5
0.1
Различные штаммы B. circulans и B. subtilis проявляли устойчивы к ионам Pb2+ (5.0
мМ) и к ионам Cu2+ (МИК - 3.0 мМ). По сравнению с ранее выделенными штаммами B.
subtilis и B. licheniformis, штаммы B. subtilis AG4 и B. licheniformis AG3 проявляли
почти в два раза высокую толерантность к ионам Cu2+, Ni2+, Zn2+ и Cd2+, в то время как
штаммы B. thermoruber AD1 и AG1, по сравнению с B. brevis, оказались намного
чувствительнее к ионам Zn2+. У выделенных термофильных бацилл значения МИК
ионов Cu2+, Ni2+, Zn2+ и Cd2+ намного превышают значения МИК ранее изученных
термофильных бацилл. Так, для Geobacullus thermolevorans subsp. stromboliensis и G.
toebii subsp. decanicus МИК ионов Cu2+, Ni2+, Zn2+ и Cd2+ составляли до 1.9, 3.6, 1.47 и
0.27 мМ, соответственно. Интересно, что степень возрастания токсичности металлов,
как для изученных термофильных бацилл, так и для Geobacullus thermolevorans subsp.
stromboliensis и G. toebii subsp. decanicus была Ni2+<Cu2+<Zn2+<Cd2+. Гетцер и др.,
изучая влияние ионов Cd на различные термотолерантные и термофильные бациллы,
установили значения МИК иона Cd2+ 0.08 мМ для Bacillus sp., B. smithii, B. licheniformis,
G. thermodenitrificans и 0.2 мМ для B. sphaericus, B. caldovelax и G. stearothermophilus.
Поскольку в образцах изучаемых территорий показано высокое содержание ионов
Cu2+, Ni2+, Zn2+ и Cd2+, предстовляло интерес изучить рост культур при комплексном
влиянии ионов металлов. Для выявления МИК одновременно воздейсвующих всех
четырех металлов, выбраны различные соотношения, учитывая степень возрастания
токсичности металлов (Ni2+<Cu2+<Zn2+<Cd2+). Результаты опытов на примере
мезофильного штамма B. megaterium АА1, термотолерантного штамма B. subtilis AG4 и
термофильного штамма G. pallidus AA4 приведены на рисунке 5.
B. subtilis AG4 рос, как при наличии в среде металлов в концентрациях 16 мкМ
Cu2+, 17 мкM Ni2+, 10 мкM Cd2+ и 15 мкM Zn2+, так и при их отсутствии. Рост бактерий
индифферентен к данным концентрациям металлов в питательной среде. При
указанных концентрациях металлов наблюдается активный рост культуры B.
megaterium AA1 по сравнению с контролем, где не были добавлены указанные
металлы. При четырехкратном повышении концентрации металлов наблюдается
18
угнетение роста культур. Стационарная фаза роста B. subtilis AG4 при отсутствии или
наличии указанных металлов в незначительных концентрациях начиналась после
четырех часов культивирования, а у B. megaterium AA1 – после восьми часов.
а)
б)
Рис. 5. Комплексное влияние тяжелых
металлов на рост штаммов AG4 (а), AA1
(б) и АА4 (в). 1) – контроль; 2) 16 мкМ
Cu2+, 17 мкM Ni2+, 10 мкM Cd2+ и 15 мкM
Zn2+; 3) 32 мк MCu2+, 34 мкM Ni2+, 20
мкM Cd2+ и 30 мкM Zn2+; 4) 64 мкM Cu2+,
68 мкM Ni2+, 40 мкM Cd2+ и 60 мкM Zn2+.
в)
Повышение концентарации металлов вызывало задержку экспоненциальной фазы
роста штамма на два часа, а рост G. pallidus AA4 угнетался даже при незначительных
концентрациях всех металлов. Стационарная фаза роста G. pallidus AA4 при отсутствии
металлов начиналась после 8 часов инкубации, а наличие металлов в питательном
бульоне вызывало задержку экспоненциальной фазы роста штамма.
Нами показано, что все изученные бацилярные штаммы становились примерно в
10-60 раз чувствительнее к металлам в питательном бульоне, чем на питательном агаре.
В твердой среде диффузия металлов усложняется, а растворимость металлов в жидкой
среде выше, следовательно действие металлов на бактерии больше в жидкой среде.
Похожие результаты были получены Оздемиром и соавторами. Ими показано, что
токсичность отдельных металлов в жидкой среде увеличивается примерно в 20-450 раз
по сравнению с токсичностью в твердой среде. Гассен и др. показали, что токсичность
металлов в жидкой среде увеличивается примерно в 10-1000 раз.
Чувстеительность выделенных бацилл повышается и при одновременном влиянии
ионов Ni2+, Cu2+, Zn2+ и Cd2+. Способность штаммов расти в среде с наличием ионов
Cu2+, Ni2+, Cd2+ и Zn2+ имеет важное значение для выживаемости бактерий в экотипах с
повышенными уровнями ионов ТМ.
Для выявления механизмов металлотолерантности важно изучение способности
штаммов аккумулировать металлы. Эта часть работы важна и для выявления
потенциала штаммов, с целью их применения в биоремедиации. Способности B.
thermoruber AG1, B. licheniformis AG3, B. subtilis AG4 и B. megaterium AA1 штаммов
бацилл аккумулировать ТМ была изучена при культивировании в среде, содержащей 32
мкM Cu2+, 34 мкM Ni2+, 20 мкM Cd2+ и 30 мкM Zn2+ до 0.6 ОП. Результат приведен на
рис. 6.
19
Штаммы B. thermoruber
AG1, B. licheniformis AG3 и B.
subtilis AG4 наиболее активно
аккумулируют ионы Cu2+, а
ионы Ni2+ и Cd2+ почти не
аккумулировались. Ярко выраженной
биоаккумулирующей
способностью
отличались
штаммы B. subtilis AG4 и B.
megaterium AA1. Бактерия B.
subtilis AG4 аккумулировала
Cu2+ и Zn2+ до 6.8 и 3.0 мг/г
Рис. 6. Биоаккумулирующая способность штаммов
сырого бактериального веса,
B. thermoruber AG1, B. licheniformis AG3, B. subtilis AG4
соответственно. B. megaterium
и B. megaterium AA1. Концентрации ионов металлов
AA1 почти не аккумулировал
даны в мг на г сырого веса бактериальных клеток.
Ni2+, Cu2+ и Zn2+, а биоакку2+
муляция Cd составляла 9.0 мг/г сырого бактериального веса. По сравнению с
биоаккумулируюшей способностью различных бактерий штаммы B. subtilis AG4 и B.
megaterium AA1 проявили высокую способность аккумулировать ионы Cu 2+ и Cd2+,
соответственно. Биоаккумуляция или биосорбция метaллов микроорганизмами
является одним из самых практичных и широко используемых подходов для
биоремедиации. Биоаккумулирующая способность штаммов B. subtilis AG4 и B.
megaterium AA1 может иметь практическое значение для биотехнологии.
Поскольку основной механизм устойчивости к ТМ связан с транспортными
системами соответствующих металлов, локализованных в мембране, изучено
присутствие генов, кодирующих компоненты соответственных транспортных систем в
геноме. Для выявления металлоустойчивости бактерии B. subtilis AG4 сконструированы
праймеры генов nikA, copA и czcD. Ген czcD не обнаружен при ПЦР амплификации, a
секвенирование полученных продуктов ПЦР генов nikA и copA подтвердило
присутствие последних в геноме B. subtilis AG4 (табл. 6.). Отсутствие гена czcD в
геномной ДНК указывает на наличие альтернативного механизма устойчивости к
ионам Zn2+ и Cd2+.
Чтобы оценить экспрессию генов в условиях стресса, B. subtilis AG4 был
культивирован в присутствии различных концентраций ионов металлов. Экспрессия
генов nikA и copA проанализирована с помощью ОТ-количественной ПЦР.
Таблица 6. BLAST анализ последовательностей ампликонов генов nikA и copA.
Ген
Длина последовательностей
(п.о.)
nikA
155
copA
210
Ближайшая филогенетически сходная
последовательность
|Номер депонирования|
Ген кодирующий Ni связивающий белок
NikA транспортера ABC |CP001983|
Ген кодирующий ABC транспортер оттока
(ATФ-связанный белок) |CP002468|
Сходство,
%
97
95
Экспрессия гена nikA в три раза выше при 16 мкМ Cu2+, 17 мкM Ni2+, 10 мкM Cd2+ и
15 мкM Zn2+ концентрациях ТМ по сравнению с контролем. Экспрессия гена не
наблюдается при более высоких концентрациях металлов (варианты 3 и 4,
соответственно) (рис. 7). Экспрессия гена copA снижается в 3 и 7 раз в вариантах 3 и 4,
соответственно, по сравнению с контролем (рис. 7). Хотя высокие концентрации
20
металлов снижали экспрессию гена copA, он конститутивно экспрессировался в
отсутствие или присутствии различных концентраций ионов металлов.
а)
б)
Рис. 7. Уровни экспрессии генов copA (а) и nikA (б) при различных концетрациях ионов металлов:
1) – контроль; 2) 16 мкМ Cu2+, 17 мкM Ni2+, 10 мкM Cd2+ и 15 мкM Zn2+; 3) 32 мкM Cu2+, 34 мкM
Ni2+, 20 мкM Cd2+ и 30 мкM Zn2+; 4) 64 мкM Cu2+, 68 мкM Ni2+, 40 мкM Cd2+ и 60 мкM Zn2+.
Стимуляцию поглощения ионов тяжелых металлов при их низких концентрациях
можно объяснить эффектом Арндта-Шульца, состоящего в интенсификации
метаболизма бактерий. Высокие уровни поглощения ионов металлов включают
защитные механизмы устойчивости к ТМ. Было выявлено очень низкое накопление
ионов Ni2+ у B. subtilis AG4 при высоких концентрациях металлов (рис. 6). Можно
предположить, что поглощение ионов Ni2+ клеткой предотвращается снижением
синтеза мембранного белка NikA, связывающего ионы Ni2+ (рис. 7), что ранее было
показанно у E. coli.
Исследования металлоустойчивости бацилл выявили их толерантность к ионам Ni2+
и Cu2+, а также показали способность бацилл к выживанию при комплексном влиянии
ионов Ni2+, Cu2+, Zn2+ и Cd2+.
Впервые
оценена
металл-аккумулирующая
способность
некоторых
металлоустойчивых штаммов, выделенных из различных рудных месторождениий РА.
Выявлена способность Bacillus subtilis AG4 и B. megaterium AA1 аккумулировать ионы
Cu2+ и Cd2+, соответственно. Указанные штаммы могут иметь большое практическое
значение для биоремедиации загрязненных экосистем.
На примере штамма B. subtilis AG4 показано хромосомное расположение генов
металлоустойчивости nikA и copA, а также отсутствие гена czcD.
ВЫВОДЫ
1. ПЦР-ДГГЭ анализом выявлено наличие фил Alphaproteobacteria, Actinobacteria и
Bacteroidetes в образцах рудных пород меди и золота РА. Установлено, что в
образцах шлама хвостохранилища Ахталинского ГОК и почв с гравием рудных
пород Капанского медного рудника доминировали бактерий филы
Alphaproteobacteria, в образцах почв с Зангезурского медно-молибденового
комбината - бактери филы Actinobacteria, а в Соткском месторождении золота бактерии фил Actinobacteria и Alphaproteobacteria.
2. Методом пиросеквенирования показано доминирование фил протеобактерий
(24%), Bacteroidetes (20%) и субдоминирование цианобактерий (17%) и
*усл.Е – условная единица
21
3.
4.
5.
6.
неклассифицированных бактерий (19%) в шламе хвостохранилища Ахталинского
ГОК.
Выделены и на основе фенотипичных признаков и филогенетического анализа
идентифицированы 29 металлоустойчивых эндоспоробразующих аэробных и
анаэробных изолятов родов Bacillus (B. subtilis, B. licheniformis, B. pumilus, B.
simplex, B. megaterium), Geobacillus (G. thermodenitrificans, G. pallidus, G. toebii),
Brevibacillus (B. termoruber), Clostridium (C. butyricum) и Tepidimicrobia
(Tepidimicrobia sp.).
Показана металлотолерантность всех выделенных штаммов бацилл к ионам Ni2+,
Cu2+, Cd2+ и Zn2+, возрастающая степень токсичности которых представляется
Ni2+<Cu2+<Zn2+<Cd2+. Все штаммы проявляли устойчивость к ионам Ni2+ (2.5-4.5
мМ) и Cu2+ (1.5-3.5 мМ). Показана способность бацилл к выживанию при
комплексном влиянии ионов Ni2+, Cu2+, Zn2+ и Cd2+ с наилучшим ростом при
концентрациях 17, 16, 15 и 10 мкM, соответственно.
Выявлена способность Bacillus subtilis AG4 аккумулировать ионы Cu2+ и Zn2+ (6.8
и 3.0 мг/г сырого бактериального веса соответственно) и B. megaterium AA1
аккумулировать ионы Cd2+ (9.0 мг/г сырого бактериального веса).
Методом количественного ПЦР установлено, что высокая толерантность штамма
B. subtilis AG4 к ионам Ni2+ и Cu2+ детерминирована хромосомальными генами
nikA и copA. Показан максимальный уровень экспрессии генов в среде с
содержанием 16 мкМ Cu2+, 17 мкM Ni2+, 10 мкM Cd2+ и 15 мкM Zn2+.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Margaryan A. A., Panosyan H. H., Birkeland N.-K., Trchounian A. (2013) Heavy
metal accumulation and the expression of the copA and nikA genes in Bacillus subtilis
AG4 isolated from the Sotk Gold Mine in Armenia, Biological Journal of Armenia,
Vol. 65, Issue 3, Yereva, Armenia, pp. 51-57.
2. Margaryan A., Birkeland N.-K., Panosyan H., Popov Y., Trchounian A. (2013) The
effect of combined heavy metal ions on copA, nikA and czcD genes expression of metalresistant bacilli, FEBS Journal 280 (Suppl. 1), St. Petersburg, Russia, p. 231.
3. Margaryan A., Birkeland N.-K., Panosyan H., Popov Y., Trchounian A. (2013)
Bacterial diversity in the Alaverdi copper smelter (Armenia), 4th Congress of European
Microbiologists (FEMS 2013), Leipzing, Germany, p. 217.
4. Margaryan A. (2012) New metal-tolerant bacilli strains as a prospective tool for
bioremediation, Book of Proceedings «5th International Symposium on Biosorption and
Bioremediation», Prague, Czech Republic, p. 17-23.
5. Margaryan A. (2012) New metal-tolerant bacilli strains as a prospective tool for
bioremediation, Abstract Book of «5th International Symposium on Biosorption and
Bioremediation», Prague, Czech Republic, p. 83.
6. Маргарян А. А., Паносян О. А. (2011) Новые металлоустойчивые штаммы
бацилл, Сборник тезисов “Биология наука XXI века” XV международная
Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино, Россия, с. 351.
7. Margaryan A., Panosyan H., Popov Yu. (2010) Isolation and characterization of new
metallotolerant bacilli strains, Second Balkan Conference on Biology: 50 Years
university of Plovdiv. Biotechnol & Biotechnol. Eq., Special edition, Vol. 24, N 2,
Plovdiv, Bulgaria, p. 450-454.
22
ՄԱՐԳԱՐՅԱՆ ԱՐՄԻՆԵ ԱՐՄԵՆԻ
Հայաստանի Հանրապետության պղնձի և ոսկու հանքապարների
միկրոբիոտան, մետաղակայուն բացիլների մեկուսացումը, նույնականացումը
և մետաղակայունության մեխանիզմները
ԱՄՓՈՓԱԳԻՐ
Հանգուցային բառեր`ԴԳԺԷ, 454-պիրոսեքվենավորում, ծանր մետաղներ,
մետաղակայուն բացիլներ, կենսակուտակում, քՊՇՌ, nikA և copA գեներ:
Ծանր մետաղներով հարուստ բնական էկոտոպերը, ինչպես, օրինակ՝
մետաղահանքերը, կենսամիջավայրեր են յուրահատուկ մետաղակայուն
մանրէային համակեցությունների ձևավորման համար: Մետաղակայուն
մանրէները օժտված են մետաղակայունության մի շարք մեխանիզմներով:
Ուստի, մետաղակայուն մանրէների տարածվածության և դրանց մետաղներ
կենսակուտակելու և դետոքսիկացնելու ունակության ուսումնասիրությունը
հեռանկարային է կենսատեխնոլոգիայում կիրառման առումով:
Հայաստանի Հանրապետությունը հարուստ է ծանր մետաղների
հանքավայրերով, սակայն մետաղակայուն մանրէների տարածվածությունը
այդ էկոտոպերում բավարար ուսումնասիրված չէ:
Ներկայացված
աշխատանքի
նպատակն
է
եղել
Հայաստանի
Հանրապետության պղնձի և ոսկու հանքապարներում մանրէային
համակեցությունների ուսումնասիրությունը, մետաղակայուն բացիլների
մեկուսացումը
և
դրանց
մետաղակայունության
մեխանիզմների
բացահայտումը:
Դենատուրացնող գրադիենտային ժել էլեկտրաֆորեզի (ԴԳԺԷ) մեթոդով
բակտերիաների համակեցության ուսումնասիրությունները բացահայտել են,
որ Ախթալայի լեռնահարստացման կոմբինատի պոչամբարի շլամի և
Կապանի պղնձի մանրախճային հանքապարի հողային նմուշներում
գերակշռում են Alphaproteobacteria, Զանգեզուրի պղնձամոլիբդենային
մանրախճային հանքապարի հողային նմուշներում` Actinobacteria, իսկ
Սոտքի ոսկու հանքապարներում` Actinobacteria և Alphaproteobacteria
ֆիլումներին պատկանող բակտերիաները:
454-պիրոսեքվենավորման
մեթոդով
ցույց
է
տրվել
Ախթալայի
լեռնահարստացման կոմբինատի պոչամբարում Proteobacteria (24%),
Bacteroidetes (20%), Cyanobacteria (17%) և չդասակարգված բակտերիաների
23
(19%)
գերակշռությունը:
Նմուշում
չդասակարգված
բակտերիաների
առկայությունը վկայում է պոչամբարի բակտերիական համակեցության
յուրահատկության մասին: Նմուշում բացահայտվել է նաև Chlorobi, Chloroflexi,
Gemmatimonadetes, Flavobacteria, Acidobacteria, Firmicutes, Actinobacteria,
Sphingobacteria, Verrucomicrobia, Planctomycetes, Armatimonodetes, Spirochaetae,
Lentisphaerae, Nitrospirae և Deinococcus-Thermus ֆիլումներին պատկանող
բակտերիաների առկայությունը:
Նմուշներից մեկուսացվել է Bacillus, Brevibacillus, Geobacillus, Clostridium և
Tepidimicrobium ցեղերին պատկանող մետաղակայուն բացիլների քսանինը
շտամներ: Ցույց է տրվել մեկուսացված բացիլների կայունությունը
սննդամիջավայրում Cu2+, Ni2+, Zn2+ և Cd2+ իոնների ինչպես առանձին, այնպես
էլ համակցված ազդեցության պայմաններում: Ցույց է տրվել, որ մետաղների
իոնների տոքսիկությունը աճում է
հետևյալ հաջորդականությամբ`
2+
2+
2+
2+
Ni <Cu <Zn <Cd : Շտամները առավել կայուն են Ni2+ և Cu2+ իոնների
նկատմաբ 2.5-4.5 և 1.5-3.5 մՄ կոնցենտրացիաների տիրույթում, իսկ Zn2+ և Cd2+
իոնների նվազագույն արգելակող կոնցենտրացիաները տատանվում են
համապատասխանաբար 0.4-1.0 և 0.1-0.8 մՄ կոնցենտրացիաների տիրույթում:
Ni2+, Cu2+, Zn2+ և Cd2+ իոնների համալիր ազդեցության պայմաններում
մեկուսացված
բացիլների
առավելագույ
աճը
դրսևորվում
է
համապատասխանաբար 17, 16, 15 և 10 մկՄ կոնցենտրացիաների դեպքում:
Բացահայտվել է մեկուսացված շտամների կողմից մետաղների իոններ
կենսակուտակելու ունակությունը: Ցույց է տրվել, որ Bacillus subtilis AG4
շտամը ունակ է կուտակելու Cu2+ և Zn2+ իոնները մինչև 6.8 և 3.0 մգ/գ
բակտերիական թաց կշռում համապատասխանաբար, մինչդեռ B. megaterium
AA1 շտամը կուտակում է Cd2+ իոնները մինչև 9 մգ/գ բակտերիական թաց
կշռում:
Ցույց է տրվել, որ B. subtilis AG4 շտամի կայունությունը Ni2+ և Cu2+ իոնների
պայմանավորված է nickA և copA քրոմոսոմային գեներով: Քանակական
պոլիմերազային շղթայակցված ռեակցիայի (քՊՇՌ) մեթոդով հաստատվել է
Cu2+, Ni2+, Cd2+ և Zn2+ մետաղների իոնների մակածմամբ դրանց բարձր
էքսպրեսիայի մակարդակը 16 մկՄ, 17 մկՄ, 10 մկՄ և 15 մկՄ
կոնցենտրացիաներում, համապատասխանաբար:
Մեկուսացված մետաղակայուն բացիլները պահպանվում են ԵՊՀ
մանրէաբանության, բույսերի և մանրէների կենսատեխնոլոգիայի ամբիոնում
և հեռանկարային են կենսատեխնոլոգիայում ծանր մետաղներով աղտոտված
տարածքների կենսավերականգնման համար:
24
MARGARYAN ARMINE
Microbiota of ore rock of Armenian copper and gold mines, isolation,
identification and metal resistance mechanisms of heavy metal resistant bacilli
SUMMARY
Key words: DGGE, 454-pyrosequencing, heavy metals, metal-resistant bacilli,
bioaccumulation, qRT-PCR, nikA and copA genes.
Metal-rich natural habitats such as ores and mines of different metals represent
environments for development and evolution of unique metal-tolerant microbial
communities. Heavy metal resistant microorganisms evolved a variety of adaptation
strategies. Thus, the study of metal-resistant microbes’ diversity, their ability to
accumulate and detoxify toxic metals has a strong potential for establishment of novel
tools in biotechnology.
Respublic of Armenia is rich in various deposits of heavy metals, but the distribution
of metal-tolerant microbes in this ecotopes, scantily known.
This work is amied to determine the structure of microbial community in copper and
gold mines distributed on the territory of Republic of Armenia, to isolate metal-tolerant
bacilli and study the metal-resistance mechanisms of isolated microbes.
Analysis of the bacterial community structure, using by denaturing gradient gel
electrophoresis (DGGE) fingerprinting, revealed domination of Alphaproteobacteria in
sludge samples of Akhtala copper mine tailing and soil samples with gravel ore rock of
Kapan copper mine, Actinobacteria in soil samples with gravel ore rock of Zangezur
copper-molybdenum mine, and Alphaproteobacteria and Actinobacteria in ore rock of
Sotk gold mine
454-pyrosequencing analysis revealed the domination of Proteobacteria (24%),
Bacteroidetes (20%), unclassified bacteria (19%) and Cyanobacteria (17%) in the tailing
of the Akhtala copper mine. The presence of unclassified bacterial species in the sample
indicates the uniqueness of the tailing bacterial community. The presence of phyla
Chlorobi, Chloroflexi, Gemmatimonadetes, Flavobacteria, Acidobacteria, Firmicutes,
Actinobacteria, Sphingobacteria, Verrucomicrobia, Planctomycetes, Armatimonodetes,
Spirochaetae, Lentisphaerae, Nitrospirae and Deinococcus-Thermus also was revealed.
Twenty-nine metal-resistant bacterial strains belonging to the genera Bacillus,
Brevibacillus, Geobacillus, Clostridium and Tepidimicrobium were isolated from studied
25
samples. The isolated strains display resistance to the Ni 2+, Cu2+, Zn2+ and Cd2+ ions
employed separate, as well as to their mix in the growth medium. It was shown that the
toxic levels of metal ions present as follows: Ni2+<Cu2+<Zn2+<Cd2+. All strains showed
the high resistance to the ions Ni2+ and Cu2+ (minimal inhibitory concentration (MIC) for
different strains ranged 2.5-4.5 and 1.5-3.5, respectively), while MIC of Zn2+ and Cd2+
ions for different strains ranged 0.4-1.0 and 0.1-0.8 mM, respectively. High rate of
bacterial growth in the presence of mix ions Ni 2+, Cu2+, Zn2+ and Cd2+ was observed at
concentrations of 17, 16, 15 and 10 µM, respectively.
The isolated strains manifested bioaccumulation of heavy metal ions. The strain B.
subtilis AG4 showed a strong ability to accumulate Cu2+ and Zn2+ (up to 6.8 and 3.0
mg/g of wet weight), while B. megaterium AA1 accumulated Cd2+ (up to 9 mg/g of wet
weight).
It was found that resistance of strain B. subtilis AG4 to Ni2+ and Cu2+ ions was harbor
the nikA and copA chromosomal genes. The highest level of nikA and copA genes
expression, assessed by quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR),
was observed at 16 µM Cu2+, 17 µM Ni2+, 10 µM Cd2+ and 15 µM Zn2+.
The isolated metal-resistant bacilli strains maintained in the department of
microbiology and biotechnology of plants and microorganism of YSU and have potential
in biotechnology for bioremediation of polluted area.
26