Автореферат

На правах рукописи
ГЕРАСИМОВ ДМИТРИЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ
ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
НИМЕСУЛИДА И БЛИЗКИХ ПО СТРУКТУРЕ СОЕДИНЕНИЙ
14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Курск– 2014
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении
высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский
университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Научные руководители:
доктор фармацевтических наук, профессор, Шорманов Владимир Камбулатович
доктор биологических наук, профессор, Сипливая Любовь Евгеньевна
Официальные оппоненты:
Саломатин Евгений Михайлович - доктор фармацевтических наук, профессор,
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский центр судебномедицинской экспертизы» Минздрава России, лаборатория судебно-химических и
химико-токсикологических научных и экспертных исследований, судебный
эксперт (химик) высшей квалификационной категории
Сливкин Алексей Иванович - доктор фармацевтических наук, профессор,
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего
профессионального образования «Воронежский государственный университет»,
фармацевтический факультет, заведующий кафедрой фармацевтической химии и
фармацевтической технологии
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное
учреждение высшего профессионального образования «Российский университет
дружбы народов» (РУДН)
Защита состоится «10» октября 2014 г. В 12-00 часов на заседании
диссертационного совета Д 208.039.03 при Государственном бюджетном
образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский
государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения
Российской Федерации (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, д.3).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ГБОУ ВПО КГМУ
Минздрава России, www.kurskmed.com/diss2/load/uploads/cbc97e8.pdf
Автореферат разослан «
Ученый секретарь
диссертационного совета
2
»
2014 г.
Овод Алла Ивановна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность
темы.
Нимесулид
(N-(4-нитро-2-феноксифенил)метансульфонанилид) применяется в медицине как нестероидное противовоспалительное лекарственное средство. Близкими по структуре к нимесулиду являются 4нитроанилин
(базовая
структура),
N-(4-амино-2-феноксифенил)метансульфонанилид и N-(4-метансульфониламино-3-феноксифенил)-ацетамид
(метаболиты нимесулида), 4-нитро-2-феноксианилин (фармакопейная примесь
нимесулида),
N-(4-гидрокси-2-феноксифенил)-метансульфонанилид
(вновь
синтезированное вещество).
Рассматриваемые соединения токсичны для теплокровных и человека. LD50
нимесулида для крыс при внутрижелудочном введении, например, составляет 200
мг/кг, LD100 4-нитроанилина – 600 мг/кг. Токсичность данной группы веществ чаще
всего сопряжена с нарушением функций печени и почек.
Зарегистрированы частые случаи летального отравления человека
нимесулидом и 4-нитроанилином. Отравления ими могут происходить в процессе
производства веществ, при попадании их в атмосферу и сточные воды
предприятий, при приёме завышенных доз или суицидальных попытках.
Широкое применение нимесулида и 4-нитроанилина, их токсические
свойства, наличие случаев отравлений с летальным исходом обуславливают
необходимость изучения этих соединений в химико-токсикологическом
отношении. Для более надежного доказательства отравлений нимесулидом
необходимо изучение его близких структур, в том числе и его метаболитов, как
потенциальных объектов химико-токсикологического анализа.
Степень разработанности темы исследования. До настоящего времени
недостаточно разработаны вопросы изолирования рассматриваемых веществ из
биоматериала, их очистки, обнаружения, идентификации и количественного
определения. Недостаточно изучены закономерности их распределения в
теплокровных организмах. В доступной литературе отсутствуют данные по
сохраняемости рассматриваемых веществ в трупном материале.
Исходя
из
вышеизложенного,
разработка
методик
химикотоксикологического исследования нимесулида и близких по структуре соединений
является актуальной.
Цель исследования. Целью настоящего исследования является разработка
методик химико-токсикологического анализа нимесулида и близких по структуре
соединений.
Задачи исследования. Для достижения поставленной цели необходимо
было решить следующие задачи:
 провести подбор условий синтеза из нимесулида рабочих стандартных
образцов 4-Н-2-ФА, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА и
определить условия их очистки;
 установить структуру и содержание основного вещества в полученных
субстанциях;
 изучить особенности электронных, колебательных и ЯМР 1Н спектров объектов
исследования;
 определить характер хроматографической активности исследуемых веществ в
тонких слоях и колонках различных сорбентов при использовании методов
ТСХ, макроколоночной хроматографии низкого давления, ВЭЖХ и ГХ-МС;
3
 изучить распределение исследуемых веществ в системах из несмешивающихся
жидкостей;
 исследовать особенности изолирования объектов изучения из биологического
материала настаиванием с изолирующими агентами различной химической
природы и различного состава, разработать схемы очистки извлечений;
 изучить распределение исследуемых веществ в органах и биожидкостях
теплокровных животных;
 определить сроки сохранения рассматриваемых веществ в гнилостноразлагающемся трупном материале.
Научная новизна. Определены оптимальные условия синтеза из
нимесулида рабочих стандартных образцов 4-Н-2-ФА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2ФФМСА и предложены схемы их очистки. Изучены особенности поглощения
анализируемыми веществами УФ-, видимого и ИК-излучения. Исследованы ЯМР
1
Н-спектры данных структур.
Изучены особенности масс-спектров изучаемых веществ, полученных
методом электронного удара. Показана возможность селективного и
высокочувствительного определения данных соединений по совокупности
характеристических сигналов осколков молекулы в масс-спектре и времени
удерживания в капиллярной колонке при идентификации методом ГХ-МС.
Определены
оптимальные
условия
и
рассчитаны
параметры
хроматографирования исследуемых веществ методами ТСХ, ВЭЖХ и
макроколоночной хроматографии низкого давления в условиях применения
нормальнофазовых и обращеннофазовых сорбентов.
Разработаны методики идентификации и количественного определения
объектов исследования спектральными и хроматографическими методами.
Выявлены основные параметры и условия очистки нимесулида и близких по
структуре соединений от соэкстрактивных веществ биоматериала методами
жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии.
Впервые обосновано применение ацетона в качестве универсального
изолирующего агента для извлечения нимесулида и близких по структуре
соединений из биоматериала. На основе использования ацетона как изолирующего
агента и очистки методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии в
тонких слоях и колонках сорбентов разработаны оригинальные методики
определения рассматриваемых соединений в ткани трупных органов и
биожидкостях, приемлемые как для исследования свежего, так и гнилостноизмененного трупного материала.
В эксперименте на животных (крысы) исследованы особенности
распределения рассматриваемых веществ в организме теплокровных.
Изучена сохраняемость рассматриваемых отравляющих агентов и их
трансформация в гнилостно-разлагающемся трупном материале в зависимости от
температурного режима и продолжительности сохранения.
Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты химикотоксикологического исследования нимесулида и близких по структуре соединений
позволяют расширить знания о химических и физико-химических свойствах
анализируемых веществ. Полученные данные составляют основу для разработки и
внедрения в практику методик химико-токсикологического анализа изучаемых
веществ.
4
На основании проведенных исследований разработаны два варианта
практических
рекомендаций
к
проведению
химико-токсикологических
исследований при отравлении отдельными производными 4-нитроанилина и
нимесулидом.
Внедрены и апробированы результаты работы:
методика идентификации нимесулида и его метаболитов (4-амино-2феноксифенилметансульфонамида
и
4-ацетиламино-2-феноксифенилметансульфонамида) методами ТСХ и УФ-спектрофотометрии внедрена в учебную и
научную работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии
Белгородского государственного национального исследовательского университета
(акт внедрения № 32 от 21.09.12 г.); методика очистки нимесулида и его
метаболитов (4-амино-2-феноксифенилметансульфонамида и 4-ацетиламино-2феноксифенилметан-сульфонамида) методами жидкость-жидкостной экстракции и
нормальнофазовой колоночной хроматографии внедрена в учебную и научную
работу кафедры фармацевтической химии и фармакогнозии Белгородского
государственного национального исследовательского университета (акт внедрения
№ 31 от 21.09.12 г.); методика изолирования 4-нитроанилина и нимесулида из
ткани печени и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрией внедрена в
учебную и научную работу кафедры фармацевтической химии и фармацевтической
технологии Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н.
Бурденко (акт внедрения № 62 от 17.04.12 г.); методика изолирования 4нитроанилина и нимесулида из крови, плазмы крови и определения методами ТСХ
и УФ-спектрофотометрией внедрена в учебную и научную работу кафедры
фармацевтической химии и фармацевтической технологии Воронежской
государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко (акт внедрения № 63 от
17.04.12 г.); методика концентрирования и выделения в чистом виде нимесулида и
4-нитро-2-феноксианилина из растворов методом колоночной хроматографии
низкого давления внедрена в учебную и научную работу кафедры биологической и
химической технологии Курского государственного медицинского университета
(акт внедрения № 48 от 25.05.12 г.); методика концентрирования и
количественного определения нимесулида и 4-нитро-2-феноксианилина методом
хроматоспектрофотометрии внедрена в учебную и научную работу кафедры
биологической и
химической технологии
Курского государственного
медицинского университета (акт внедрения № 49 от 25.05.12 г.); методика
изолирования нимесулида, 4-нитроанилина и 4-нитро-2-феноксианилина из ткани
печени и определения методами ТСХ и УФ-спектрофотометрией апробирована в
экспертно-криминалистическом центре УМВД по Орловской области (акт
апробации № 3 от 01.06.12 г.); методика изолирования нимесулида, 4нитроанилина и 4-нитро-2-феноксианилина из мочи и определения методами ТСХ
и УФ-спектрофотометрией апробирована в экспертно-криминалистическом центре
УМВД по Орловской области (акт апробации № 4 от 01.06.12 г.).
Методология и методы исследования. Методологической составляющей
диссертационного исследования стали фармакопейные статьи предприятия, а также
труды отечественных ученых [В.К. Шорманова, 2004; А.С. Зайцевой, 2012].
В диссертационной работе использованы химические (титриметрия),
физико-химические (ядерно-магнитный резонанс 1Н, спектрофотометрия,
высокоэффективная жидкостная хроматография и газовая хроматография,
5
жидкостная колоночная хроматография низкого давления, жидкость-жидкостная
экстракция).
Основные положения, выносимые на защиту:
 условия синтеза из нимесулида 4-Н-2-ФА, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г2-ФФМСА и особенности очистки указанных соединений;
 особенности поглощения анализируемыми веществами электромагнитного
излучения в УФ-, видимой, ИК-областях спектра и резонансного поглощения
радиочастотной электромагнитной энергии (ЯМР 1Н);
 результаты исследования хроматографического поведения рассматриваемых
соединений в тонких слоях и колонках сорбентов с гидроксилированной и
привитой поверхностями;
 методики идентификации и количественного определения рассматриваемых
веществ методами хроматографии, фотометрии и хромато-масс-спектрометрии;
 результаты исследования особенностей очистки исследуемых веществ
методами жидкость-жидкостной экстракции и хроматографии;
 методики изолирования объектов исследования из тканей органов и
биожидкостей на основе настаивания с ацетоном и очистки от соэкстрактивных
веществ биоматериала;
 распределение анализируемых соединений в организме теплокровных
животных и сохраняемость исследуемых соединений в трупном материале.
Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность
полученных результатов обусловлена использованием современных и
высокотехнологичных методов исследования. Значительный объем проведенных
исследований отражен в виде таблиц, графиков и рисунков. Достоверность
разработанных методик количественного определения изучаемых веществ
подтверждается путем их валидации и статистической обработки по требованиям
ГФ XI с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel 2013».
Основные положения работы представлены и доложены на Всероссийской
научно-практической конференции с международным участием «Традиции и
инновации фармацевтической науки и практики» (Курск, 2011 г.), на Итоговых
научных конференциях сотрудников КГМУ «Университетская наука: Взгляд в
будущее» (Курск, 2011 г., 2013 г.), на IV, V и VI Всероссийских научнопрактических конференциях с международным участием: «Биомедицинская
инженерия и биотехнология» (Курск, 2011 г., 2012 г., 2013 г.), на Четвертой
международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине»
(Курск, 2011 г.), на Всероссийской научно-практической интернет-конференции с
международным
участием
«Современные
аспекты
разработки
и
совершенствования состава и технологии лекарственных форм» (Курск, 2011 г.), на
XVIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2011
г.), на Научно-практической конференции с международным участием
«Актуальные проблемы судебно-медицинской экспертизы» (Москва, 2012 г.), на
77-ой Всероссийской научной конференции с международным участием
«Молодежная наука и современность» (Курск, 2012 г.), на V Международной
научно-методической конференции «Пути и формы совершенствования
фармацевтического образования. Создание новых физиологически активных
веществ» (Воронеж, 2013 г.), на IX Всероссийской конференции «Химия и
медицина» с Молодежной научной школой (Уфа-Абзаково, 2013 г.).
6
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических
наук. Диссертационная работа выполнена по плану научно-исследовательских
работ кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии
Курского государственного медицинского университета и соответствует проблеме
«Фармация» межведомственного научного совета № 36 РАМН и научной проблеме
35.04 «Научные проблемы судебно-медицинской токсикологии, токсикологической
и судебной химии» по специальности «Судебная медицина» при РАМН. Номер
госрегистрации 01201157804.
Публикации. Содержание работы отражено в 36 публикациях, 6 из них в
журналах, рекомендуемых ВАК к опубликованию материалов диссертационных
исследований. Имеется 1 положительное решение о выдаче патента.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора
литературы (глава 1), экспериментальной части (главы 2, 3, 4, 5 и 6), выводов,
списка литературы, приложения, изложенного на 154 страницах. Диссертационная
работа изложена на 144 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу и
17 рисунков. Библиографический список состоит из 246 источников, в том числе
151 – на иностранном языке.
В автореферате используются следующие сокращения: 4-А-2-ФФМСА –
N-(4-амино-2-феноксифенил)-метансульфонанилид; 4-Г-2-ФФМСА – N-(4гидрокси-2-феноксифенил)-метансульфонанилид; 4-НА – 4-нитроанилин; 4-Н-2ФА – 4-нитро-2-феноксианилин; 4-МСА-3-ФФА – N-(4-метансульфониламино-3феноксифенил)-ацетамид;
ВЭЖХ
–
высокоэффективная
жидкостная
хроматография; ГХ-МС – газовая хроматография с масс-спектрометрическим
детектированием; ДМСО – диметилсульфоксид; ДМФА – диметилформамид; ИК –
инфракрасный; НД – нормативный документ; НФ-ВЭЖХ – нормальнофазовая
высокоэффективная жидкостная хроматография; НФ-Кл – нормальнофазовая
жидкостная колоночная хроматография; НФ-ТСХ – нормальнофазовая
тонкослойная хроматография; ОФ-ВЭЖХ – обращеннофазовая высокоэффективная
жидкостная хроматография; ОФ-Кл – обращеннофазовая жидкостная колоночная
хроматография; ОФ-ТСХ – обращеннофазовая тонкослойная хроматография; ТСХ
– тонкослойная хроматография; УФ – ультрафиолетовый; ФСП – фармакопейная
статья предприятия; ЯМР – ядерно-магнитный резонанс; LD50 – полулетальная доза
вещества; LD100 – смертельная доза вещества.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использованы: нимесулид (НМС), субстанция, НД N 012824/03040411, дополнительно очищенный перекристаллизацией (tпл=148-149 °С); 4нитроанилин (4-НА) ч.д.а. ТУ-6-09-258-87; синтезированные и очищенные образцы
4-нитро-2-феноксианилина (4-Н-2-ФА); 4-амино-2-феноксифенилметансульфонанилида (4-А-2-ФФМСА); N-(4-метансульфониламино-3-феноксифенил)-ацетамида (4-МСА-3-ФФА); N-(4-гидрокси-2-феноксифенил)-метансульфонанилида (4Г-2-ФФМСА); нитразепам (НТЗ), субстанция, ФСП-0034632105 (дополнительный
объект исследования). Применены методы ТСХ, макроколоночной хроматографии
низкого давления, ВЭЖХ, электронной и ИК-спектрофотометрии, ГХ-МС, ЯМР 1Н.
Методики определения разработаны на модельных смесях с известным
содержанием определяемого вещества. Результаты обрабатывались в соответствии
7
с установленными требованиями с использованием пакета прикладных программ
«Miсrosoft Excel».
Синтез рабочих стандартных образцов. На основе нимесулида, по
методикам разработанным в нашей лаборатории, были синтезированы 4-Н-2-ФА,
4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА (рисунок 1).
4-Н-2-ФА (2) получен в результате кислотного гидролиза нимесулида (1).
Наиболее приемлемым оказалось использование серной кислоты, как наиболее
сильного гидролизующего агента. Во избежание образования побочных продуктов
окисления и перегрева реакционной смеси использована серная кислота 60%,
обладающая температурой кипения близкой к температуре плавления (148-149 °С)
гидролизуемого нимесулида, что обуславливает малое время синтеза 4-Н-2-ФА (35 минут). Продукт очищен перекристаллизацией и колоночной хроматографией,
кристаллизован из ацетона, представляет собой желто-зеленый кристаллический
порошок, tпл=114-116 °С. УФ (этанол) λmax/нм 209,8 (lg ε 4,33), 262,4 (lg ε 3,80),
376,1 (lg ε 4,13); ИК (KBr) νmax/см-1 1025, 1155, 1263, 1336, 1516, 1587, 3198, 3236,
3350, 3473; ЯМР 1Н (300 MГц, ДМСО-d6) δ 6,26 (с, 1Н), 6,82 (д, 1Н), 7,46 (т, 2Н),
7,52 (с, 1Н); Масс-спектр (m/z) 230 (М+, 99,9%), 77 (23,3%), 52 (22,4%), 51 (22,1%),
200 (19,4%).
4-А-2-ФФМСА (3) получен в результате восстановления ароматической
нитрогруппы нимесулида (1). Оптимальным восстановителем явилось
металлическое олово в среде хлороводородной кислоты концентрированной с
добавлением этанола. Восстановление нимесулида возможно в указанных условиях
при кипении реакционной смеси в течение 2-2,5 часов. Продукт очищен
перекристаллизацией и колоночной хроматографией, кристаллизован из ацетона,
представляет собой бесцветные игольчатые кристаллы или белый с сероватым
оттенком кристаллический порошок. Возможно окисление на свету. tпл=164-166 °С.
УФ (этанол) λmax/нм 219,5 (lg ε 4,53), 249,7 (lg ε 4,14), 298,4 (lg ε 3,48); ИК (KBr)
νmax/см-1 985, 1105, 1463, 1583, 3037, 3329, 3398; ЯМР 1Н (300 MГц, ДМСО-d6) δ
2,78 (с, 3Н), 4,88 (с, 2Н), 6,29 (д, J 7,2 Гц, 1Н), 6,95-7,12 (м, 1Н+3Н), 8,48 (с, 1Н);
Масс-спектр (m/z) 199 (99,9%), 171 (69,8%), 77 (19,7%), 51 (16,8%), 278 (М+,
14,5%).
4-МСА-3-ФФА (4) получен ацетилированием ароматической аминогруппы
4-А-2-ФФМСА (3). Оптимальные условия синтеза целевого продукта достигаются
при использовании избытка ацетилирующего агента – ангидрида уксусной кислоты
и температуры 20-25 °С. Процесс ацетилирования завершается после полного
растворения 4-А-2-ФФМСА в ацетилирующем агенте и отгоне последнего в токе
воздуха при комнатной температуре. Продукт очищен колоночной
хроматографией, кристаллизован из ацетона, представляет собой белый или белый
с телесным оттенком кристаллический порошок, tпл=104-106 °С. УФ (этанол)
λmax/нм 220,8 (lg ε 4,48), 254,3 (lg ε 4,27), 287,6 (lg ε 3,53); ИК (KBr) νmax/см-1
1024, 1147, 1209, 1589, 1672, 3072, 3269, 3354, 3574; ЯМР 1Н (300 MГц, ДМСО-d6)
δ 1,96 (с, 3Н), 2,85 (с, 3Н), 7,03 (д, J 7,2 Гц, 2Н), 7,20-7,42 (м, 2Н+3Н), 8,90 (уш. с,
1Н), 9,76 (с, 1Н); Масс-спектр (m/z) 199 (99,9%), 43 (89,8%), 171 (68,9%), 241
(64,7%), 320 (М+, 24,2%).
4-Г-2-ФФМСА (5б) получен разложением сернокислой соли диазония 4-А-2ФФМСА (5а) из предварительно диазотированного 4-А-2-ФФМСА (3). Синтез
проходит в две стадии. На первой стадии синтеза диазотирование 4-А-2-ФФМСА
8
(3) проводят натрия нитритом в сернокислой среде при оптимальной температуре
0-5 °С. Ввиду последующего нагрева, а также с целью стабилизации
образующегося диазосоединения выбран анион сильной кислоты (сульфат-анион).
Для снижения мешающего влияния нитрозирующей частицы NO+ и снижения
числа побочных продуктов реакции при разложении диазосоединения (5а)
использован избыток карбамида. Также для снижения количества побочных
продуктов и облегчения нуклеофильной атаки (SN1) диазосоединения (5а)
гидроксил-ионами воды был применен катализатор состава CuSO4•5H2O
(39%)+Cu2O. На второй стадии синтеза после удаления нитрозирующей частицы
избытком карбамида диазосоединение (5а) в присутствии указанного катализатора
при 95-100 °С и максимально быстром нагреве реакционной смеси разлагается с
выделением азота до 4-Г-2-ФФМСА (5б). Продукт реакции очищен колоночной
хроматографией (в два этапа), кристаллизован из ацетона о.с.ч. и представляет
собой белый с кремоватым оттенком кристаллический порошок, tпл=153-156 °С.
УФ (этанол) λmax/нм 219,3 (lg ε 4,45), 280,6 (lg ε 3,44); ИК (KBr) νmax/см-1 1109, 1253,
1388, 1618, 2939, 3034, 3271, 3363; ЯМР 1Н (300 MГц, ДМСО-d6) δ 2,83 (с, 3Н), 6,48
(д, J 7,2 Гц, 1Н), 7,00-7,19 (м, 1Н+3Н), 7,36 (т, 2Н), 8,65 (с, 1Н), 9,24 (с, 1Н); Массспектр (m/z) 201 (99,9%), 96 (42,5%), 124 (27,3%), 51 (21,0%), 77 (18,8%).
Количественное содержание основного вещества нимесулида и
синтезированных соединений установлено титриметрическими методами.1
Н2SO4 60%,
t = 145-155 0C
2 (95%)
4 (99%)
1
НCl конц, Sn0
t = 95-100 0C
(CH3CO)2O,
t = 20-25 0C
(NH2)2CO изб.,
t = 95-100 0C
kat. Cu2O+Cu2SO4
5б (20,4%)
2н. Н2SO4,
1,5 моль NaNO2
t = 0-5 0C
3 (94%)
5а
Рисунок 1 – Синтез из нимесулида (1) его метаболитов – 4-А-2-ФФМСА (3),
4-МСА-3-ФФА (4), и близких к нему по структуре соединений – 4-Н-2-ФА (2), 4-Г2-ФФМСА (5б)
1
Автор приносит отдельные благодарности Филипповой О.Э. за предоставление фармакопейного образца
основного объекта исследования (нимесулида) и Безъязычной А.А. за ценные рекомендации при обработке
экспериментальных результатов.
9
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
В качестве спектральных методов использовали УФ-, ИК-, видимую
спектрофотометрию, ЯМР 1Н.
Изучено поглощение исследуемыми соединениями электромагнитного
излучения в УФ- и видимом диапазоне. Спектры регистрировались в ацетоне,
ацетонитриле, бензоле, воде, н-гексане, 1,4-диоксане, диэтиловом эфире, N,Nдиметилформамиде (ДМФА), хлороформе, этаноле, этилацетате, 0,1 М растворах
хлороводородной кислоты и гидроксида натрия. Изучено поглощение
исследуемыми соединениями электромагнитного излучения в ИК-диапазоне (4000400 см-1). Установлено присутствие достаточного количества характеристических
полос колебаний различных фрагментов молекул анализируемых веществ.
Показана возможность их идентификации по электронным и колебательным
спектрам.
Изучены спектры ЯМР 1Н анализируемых веществ и определены величины
сдвигов милионных долей, соответствующие сигналам протонам определенных
функциональных групп в молекуле. Показана возможность установления
структуры исследуемых веществ по ЯМР 1Н спектрам.
По данным изучения электронных спектров разработаны методики
количественного анализа исследуемых веществ по поглощению в ацетонитриле
этаноле, ДМФА (табл. 1).
Таблица 1 – Результаты определения нимесулида и близких по структуре
соединений методом электронной спектрофотометрии (n=6; Р=0,95)
Анализируемое
вещество
4-НА
4-Н-2-ФА
Нимесулид
4-А-2-ФФМСА
4-МСА-3-ФФА
4-Г-2-ФФМСА
Среда анализа
(длина волны λ, нм)
ДМФА (384,9)
Ацетонитрил (366,5)
ДМФА (391,4)
Ацетонитрил (375,1)
ДМФА (439,4)
Ацетонитрил (298,8)
Этанол (249,7)
Этанол (298,4)
Ацетонитрил (302,9)
Этанол (254,3)
Этанол (287,6)
Ацетонитрил (290,5)
Этанол (241,5)
Этанол (280,6)
Ацетонитрил (287,2)

99,76
100,04
100,06
100,04
100,04
99,96
99,97
99,92
99,96
100,02
99,95
99,95
100,02
100,04
100,08
S
0,99
0,79
0,79
0,74
0,66
0,86
0,98
0,91
0,86
0,90
0,84
0,76
0,81
0,76
0,88
Найдено, %
S
0,40
0,32
0,32
0,30
0,27
0,35
0,40
0,37
0,35
0,37
0,34
0,31
0,33
0,31
0,36
Δ
1,04
0,83
0,82
0,78
0,69
0,91
1,03
0,96
0,91
0,94
0,88
0,79
0,85
0,80
0,92

1,04
0,83
0,82
0,77
0,69
0,91
1,03
0,96
0,91
0,94
0,88
0,79
0,85
0,80
0,92
Как свидетельствуют полученные данные, разработанные методики
достаточно воспроизводимы и правильны. Относительная ошибка среднего
результата не более 1,04%.
В качестве хроматографических методов применяли нормальнофазовую и
обращеннофазовую хроматографию в тонком слое сорбента (НФ-ТСХ и ОФ-ТСХ),
нормальнофазовую и обращеннофазовую высокоэффективную жидкостную
10
хроматографию (НФ-ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ), газовую капиллярную колоночную
хроматографию
с
масс-селективным
детектированием
(ГХ-МС),
нормальнофазовую и обращеннофазовую жидкостную макроколоночную
хроматографию низкого давления (НФ-Кл и ОФ-Кл).
Хроматографирование методом НФ-ТСХ проводили на пластинах «Сорбфил
УФ-254» (сорбент – СТХ-1ВЭ), «Silufol UV-254» (сорбент – широкопористый
силикагель по Питри), ОФ-ТСХ (модель привитой алкильной фазы С14-С15 на
силикагеле СТХ-1ВЭ). Использованы моно-, би- и многокомпонентные подвижные
фазы. Установлены зависимости абсолютной хроматографической подвижности
исследуемых веществ от диэлектрической проницаемости элюента (метод НФТСХ).
Для всех подвижных фаз рассчитаны показатели хроматографической
подвижности. Оптимальные условия хроматографирования методом ТСХ
представлены в таблице 2. Как видно из таблицы 2, предлагаемые
хроматографические системы позволяют разделить и идентифицировать
анализируемые вещества.
Таблица 2 – Абсолютная хроматографическая подвижность (Rf) нимесулида
(НМС) и близких по структуре соединений в оптимальных элюентах
4-Н- 4-А-2- 4-МСА- 4-Г-22-ФАФФМСА 3-ФФА ФФМСА
НФ-ТСХ «Сорбфил УФ-254» (сорбент – СТХ-1ВЭ)
Толуол-ацетонитрил (7:3)
0,32 0,72 0,74 0,77 0,55
0,38
0,61
Тетрахлорметан-этилацетат (5,58:4,42) 0,35 0,66 0,76 0,86 0,63
0,25
0,78
Тетрахлорметан-диэтиловый эфир
0,22 0,72 0,74 0,88 0,60
0,13
0,78
(3,47:6,53)
ОФ-ТСХ (искусственно привитая алкильная фаза С14-С15 на силикагеле СТХ-1ВЭ)
Буферный р-р с рН 8,95-метанол (7:4) 0,09 0,53 0,21 0,05 0,44
0,30
0,37
Вода-пропанол-2 (8:2)
0,22 0,45 0,58 0,06 0,18
0,54
0,49
НФ-ТСХ «Silufol UV-254» (сорбент – широкопористый силикагель по Питри)
Гексан-тетрахлорметан-диоксан- 0,37 0,52 0,49 0,29
0,17
0,40
пропанол-2 (10:5:5:2)
Элюент (объемные доли)
НТЗ 4-НА НМС
Оптимальные условия хроматографирования методом НФ-ВЭЖХ (колонка
100×2 мм, сорбент «Silasorb-600») для нимесулида, 4-НА, 4-Н-2-ФА достигаются в
элюенте гексан-ацетон-тетрахлорметан (7:3:7), для нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА – в элюенте гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1).
Результаты представлены на рисунке 2.
Оптимальные результаты хроматографирования методом ОФ-ВЭЖХ
(колонка 250×4,6 мм, сорбент «Luna C18 5 мкм 100Å Phenomenex®») для аналитов
достигаются при использовании подвижной фазы состава: В,% - С,%; В – 20 мМ
фосфатный буфер KH2PO4 с рН 3,05; С – ацетонитрил; градиентный режим:
0,01…12,2 мин – В 65%; 12,2…13,0 мин – В 65…55%; 13,0…22,0 мин – В 55%;
22,0…23,0 мин – В 55-65%; 23,0…25,0 мин – В 65% (рисунок 3).
Как видно из таблицы 3, разработанные методики количественного анализа
исследуемых соединений методом ВЭЖХ достаточно воспроизводимы и
правильны. Относительная ошибка среднего результата не более 1,41%.
11
А
А
360 нм
330 нм
1 2
3
1 2
Б
3
Б
250 нм
250 нм
2
4
5
6
4
5
Рисунок 2 – Хроматограммы смесей аналитов 4-Н-2-ФА (1), нимесулида (2), 4-НА
(3), 4-А-2-ФФМСА (4), 4-МСА-3-ФФА (5), 4-Г-2-ФФМСА(6) в элюентах гексанацетон-тетрахлорметан (7:3:7) (А), гексан-диоксан-тетрахлорметан (1:1:1) (Б)
НТЗ
mV (x10)
Д ет ект ор A Ch1:230nm
10.0
5
9.0
8.0
4-НА
7.0
6.0
1
5.0
7
ОН-НМС
4Н2ФА
НМС
Ас-НМС
NH2-НМС
3
3.0
2.0
1.0
6
2
4.0
4
230 нм
0.0
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
мин
Рисунок 3 – Хроматограмма смеси 4-НА (1), 4-МСА-3-ФФА (2), 4-А-2-ФФМСА
(3), 4-Г-2-ФФМСА (4), НТЗ (5), нимесулида (6), 4-Н-2-ФА (7). Подвижная фаза: 20
мМ фосфатный буфер KH2PO4 с рН 3,05 – ацетонитрил (градиентный режим)
По результатам хроматографирования исследуемых соединений методами
НФ-Кл в системах гексан-ацетон, толуол-ацетонитрил и ОФ-Кл в системах водаацетон, вода-ацетонитрил определен ряд оптимальных подвижных фаз,
применимых для очистки извлечений из биологического материала. В
вышеуказанных системах установлены зависимости объемов удерживания
аналитов от количества слабого элюирующего компонента в составе элюента.
ГХ-МС исследуемых соединений проводили с использованием капиллярной
колонки DB-5 MS EVIDEX (25м×0,2мм). Характерные времена удерживания
исследуемых веществ и сигналы осколков в масс-спектрах позволяют
идентифицировать анализируемые вещества с высокой селективностью.
12
При исследовании аналитов методами НФ-ВЭЖХ, ОФ-ВЭЖХ, НФ-Кл, ОФКл определены и рассчитаны параметры хроматографирования: объем
удерживания (VR); объём удерживания неудерживаемого компонента (V0); время
удерживания (tR); время удерживания неудерживаемого компонента (t0); ширина
пика у основания (ω); скорость истечения элюента (υ); коэффициент асимметрии
пика (AS); число теоретических тарелок (N); высота, эквивалентная теоретической
тарелке (Н); приведенная высота, эквивалентная теоретической тарелке (H');
абсолютный и относительный коэффициенты емкости (k') и (k'st) (для 4-Н-2-ФА и
нимесулида относительно 4-нитроанилина, для 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА –
относительно 4-Г-2-ФФМСА); относительный фактор емкости (Fk'); относительное
изменение свободной энергии при адсорбции (∆(∆G)). Дополнительно для
смежных пиков в методах НФ-ВЭЖХ и ОФ-ВЭЖХ рассчитаны степень разделения
(iвэжх) и разрешение пиков (Rs).
Таблица 3 – Результаты определения нимесулида и близких по структуре
соединений нормальнофазовой НФ-, обращеннофазовой ОФ-ВЭЖХ (n=6; Р=0,95)
ОФ- или НФ-ВЭЖХ, cостав
элюента, режим элюирования
НФ-ВЭЖХ; гексан-ацетонтетрахлорметан (7:3:7),
изократическое
НФ-ВЭЖХ; гексан-диоксантетрахлорметан (1:1:1),
изократическое
ОФ-ВЭЖХ; В,% - С,%;
В – 20 мМ фосфатный буфер
KH2PO4 с рН 3,05; С –
ацетонитрил; градиентное:
0,01…12,2 мин – В 65%;
12,2…13,0 мин – В 65…55%;
13,0…22,0 мин – В 55%;
22,0…23,0 мин – В 55…65%;
23,0…25,0 мин – В 65%.
Объект исследования
(детекция)
4-НА (360 нм)
4-Н-2-ФА (360 нм)
Нимесулид (330 нм)
Нимесулид (250 нм)
4-А-2-ФФМСА (250 нм)
4-МСА-3-ФФА(250 нм)
4-Г-2-ФФМСА(250 нм)
4-НА (230 нм)
4-Н-2-ФА (230 нм)
Нимесулид (230 нм)
4-А-2-ФФМСА (230 нм)
4-МСА-3-ФФА(230 нм)
4-Г-2-ФФМСА(230 нм)
4-НА (370 нм)
4-Н-2-ФА (370 нм)
Нимесулид (370 нм)

99,94
100,51
99,97
100,35
100,63
100,68
99,87
100,76
100,46
100,62
99,88
100,03
100,30
100,35
100,17
100,03
Найдено, %
S
S Δ 
1,22 0,50 1,28
1,10 0,45 1,15
1,15 0,47 1,20
1,17 0,48 1,22
1,30 0,53 1,37
1,06 0,43 1,12
1,34 0,55 1,41
1,13 0,46 1,19
1,16 0,47 1,22
1,10 0,45 1,15
1,19 0,49 1,25
1,00 0,41 1,05
1,17 0,48 1,23
1,08 0,44 1,13
0,98 0,40 1,02
0,79 0,32 0,83

1,28
1,14
1,20
1,22
1,36
1,11
1,41
1,18
1,21
1,15
1,25
1,05
1,23
1,13
1,02
0,83
Оптимальной при хроматографировании в колонке нормальнофазового
сорбента (Silicagel L 40/100 мкм) нимесулида, 4-нитроанилина, 4-Н-2-ФА является
подвижная фаза гексан-ацетон (8:2), при хроматографировании 4-А-2-ФФМСА, 4МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА – подвижная фаза гексан-ацетон (6:4).
Оптимальной при хроматографировании в колонке обращеннофазового
сорбента (Silasorb C18 30 мкм) 4-нитроанилина является подвижная фаза водаацетон (9,5:0,5), 4-Г-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА – вода-ацетон (8,5:1,5), 4-А-2ФФМСА – вода-ацетон (8:2), 4-Н-2-ФА – вода-ацетон (5:5), нимесулида – водаацетон (5,5:4,5).
Рассмотрена возможность использования хроматографии в тонких слоях и
макроколонках сорбентов, а также жидкость-жидкостной экстракции для очистки
исследуемых веществ в извлечениях из биоматериала.
13
Изучены зависимости экстрагирования аналитов из водных растворов
гидрофобными органическими растворителями. Определены оптимальные условия
максимального извлечения аналитов из равновесных водной и органических фаз
(экстрагенты – этилацетат, этилацетат насыщенный водой, бензол; электролиты –
аммония сульфат, аммония бромид, натрия бромид). Определены условия
селективного экстрагирования нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА при
совместном присутствии в анализируемой пробе. Рассчитана необходимая
кратность экстрагирования заданных количеств исследуемых соединений из
водных растворов.
По результатам изучения хроматографической подвижности и характера
экстрагируемости аналитов предложено 7 различных вариантов схем очистки
извлечений из биоматериала. Потери изучаемых веществ при моделировании
очистки хроматографическими методами не превышают 0,42%. На контрольных
образцах извлечений из биоматериала экспериментально установлена наилучшая
эффективность очистки методами, сочетающими экстракцию и жидкостную
колоночную хроматографию (нормальная или обращенная фаза).
Определен характер извлечения аналитов из биоматериала 32
изолирующими агентами различных химических групп, в т. ч. их смесями. Ряд
лучших изолирующих агентов представлен на рисунке 4 (n=5; Р=0,95).
Алифатические спирты, сложные эфиры карбоновых кислот и ацетон
R, %
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Мет
Эт
Пр-1
Пр-2
Бут-1
изо-Бут МетАц
ЭтАц
ПропАц БутАц
Ацетон
Галогеналканы, арены и смеси индивидуальных изолирующих агентов
R, %
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
ДХМ
4-нитроанилин
ТХМ
4-Н-2-ФА
ТетрХМ 1,2ДХЭ
Нимесулид
Бенз
Тол
о-Кс
4-А-2-ФФМ СА
Смесь1
Смесь2
Смесь3
4-М СА-3-ФФА
Смесь4
4-Г-2-ФФМ СА
Обозначения: Мет – метанол, Эт – этанол, Пр-1 – пропанол-1, Пр-2 – пропанол-2, Бут-1 –
бутанол-1, изо-Бут – изо-бутанол, МетАц – метилацетат, ЭтАц – этилацетат, ПропАц –
пропилацетат, БутАц – бутилацетат, ДХМ – дихлорметан, ТХМ – трихлорметан, ТетрХМ
– тетрахлорметан, 1,2ДХЭ – 1,2-дихлорэтан, Бенз – бензол, Тол – толуол, о-Кс – о-ксилол,
Смесь1 – 1,4-диоксан-ацетон (мас. 1:1), Смесь2 – ацетонитрил-ацетон (мас. 1:1), Смесь3 –
1,4-диоксан-ацетонитрил (мас. 1:1), Смесь4 – 1,4-диоксан-ацетон-ацетонитрил (мас. 1:1:1)
Рисунок 4 – Сравнительное изолирование аналитов из биоматериала
Для всех исследуемых соединений оптимальным изолирующим агентом
выбран ацетон. Исследована зависимость степени извлечения аналитов из
биоматериала ацетоном от объема ацетона, продолжительности и кратности
настаивания. Оптимальные условия изолирования: двукратное настаивание не
менее 45 минут, массовое соотношение «ацетон-биоматериал» – не менее 2:1.
14
Установлено, что рост концентраций аналитов от 2,0 до 50,0 мг в 100 г
биоматериала изменяет степень извлечения не более чем на 3,59 %. Значения
степени извлечения  исследуемых веществ при этом находятся в интервале
48,73-99,90%.
Значения доверительного интервала – ∆  1,56-6,95 (n=5; Р=0,95). В
результате проведенных исследований разработаны методики определения
рассматриваемых веществ в ткани трупных органов, крови, плазме крови, моче на
основе изолирования ацетоном и очистки полученных извлечений комбинацей
методов жидкость-жидкостной экстракции и нормальнофазовой (НФ-Кл) или
обращеннофазовой
(ОФ-Кл)
жидкостной
колоночной
хроматографией.
Разработаны две методики экспресс-анализа образцов мочи на присутствие в них
нимесулида и двух его метаболитов – 4-А-2-ФФМСА и 4-МСА-3-ФФА (n=5;
Р=0,95). Общее время анализа каждой методикой не превышает 1,5 часа.
Результаты определения минимальных концентраций разработанными методиками
представлены на рисунке 5 (n=5; Р=0,95).
Изучено распределение исследуемых веществ в организме теплокровных
животных. Крысам массой 150-265 г (5 групп по 5 особей в каждой)
внутрижелудочно вводили летальные дозы анализируемых соединений: 800 мг/кг
4-нитроанилина, 600 мг/кг нимесулида или 4-Г-2-ФФМСА, 1000 мг/кг 4-А-2ФФМСА, 6000 мг/кг 4-МСА-3-ФФА, 1200 мг/кг 4-Н-2-ФА (в виде водной
суспензии). После гибели животных одинаковые органы и биожидкости
объединяли внутри каждой группы и определяли в них анализируемые вещества.
Результаты определения представлены в таблице 4.
Очистка жидкость-жидкостной экстракцией и ПФ-Кл
R, %
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Печень
Кровь
Плазма
Моча
Печень
Спектрофотометрия
Кровь
Плазма
Моча
Обращеннофазовая ВЭЖХ
(концентрация аналита 40-400 мкг в 100 г б/м)
(концентрация аналита 1,6-120 мкг в 100 г б/м)
Очистка жидкость-жидкостной экстракцией и ОФ-Кл
R, %
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Печень
Кровь
Плазма
Моча
Печень
Спектрофотометрия
(концентрация аналита 40-600 мкг в 100 г б/м)
4-нитроанилин
4-Н-2-ФА
Нимесулид
Кровь
Плазма
Моча
Нормальнофазовая ВЭЖХ
(концентрация аналита 3,2-600 мкг в 100 г б/м)
4-А-2-ФФМСА
4-М СА-3-ФФА
4-Г-2-ФФМ СА
Рисунок 5 – Результаты определения минимальных концентраций
анализируемых веществ в биоматериале с использованием комбинированных
способов очистки
15
Как видно из таблицы 4, исследуемые соединения в значительных
количествах присутствуют в верхних отделах желудочно-кишечного тракта, а
также в крови, почках с надпочечниками и легких (4-нитроанилин), в мозге и
тимусе (4-Н-2-ФА), в почках с надпочечниками и легких (нимесулид), в глазах и
тимусе (4-А-2-ФФМСА), в тимусе и селезенке (4-Г-2-ФФМСА), в селезенке, крови,
сердце и почках с надпочечниками (4-МСА-3-ФФА как индивидуальное вещество),
в глазах, селезенке, сердце и почках с надпочечниками (4-МСА-3-ФФА как
метаболит 4-А-2-ФФМСА).
Таблица 4 – Результаты распределения изучаемых веществ в организме
теплокровных животных (крысы) (n=5; Р=0,95)
Вещество
4-НА
(индивидуальное
вещество)
НМС
(индивидуальное
вещество)
4-Н-2-ФА
(индивидуальное
вещество)
4-А-2-ФФМСА
(индивидуальное
вещество)
4-МСА-3-ФФА
(как метаболит
4-А-2-ФФМСА)
4-МСА-3-ФФА
(индивидуальное
вещество)
4-Г-2-ФФМСА
(индивидуальное
вещество)
16
Орган или биожидкость
Желудок с содержимым
Тонкий кишечник с содержимым
Кровь
Почки с надпочечниками
Легкие
Желудок с содержимым
Тонкий кишечник с содержимым
Толстый кишечник с содержимым
Почки с надпочечниками
Легкие
Желудок с содержимым
Тонкий кишечник с содержимым
Толстый кишечник с содержимым
Мозг
Тимус
Желудок с содержимым
Тонкий кишечник с содержимым
Толстый кишечник с содержимым
Глаза
Тимус
Глаза
Тонкий кишечник с содержимым
Селезенка
Сердце
Почки с надпочечниками
Желудок с содержимым
Селезенка
Кровь
Почки с надпочечниками
Сердце
Желудок с содержимым
Тонкий кишечник с содержимым
Толстый кишечник с содержимым
Тимус
Селезенка
Найдено, мг/100 г биоматериала
Sх
х
S
х
1441,55 214,55 95,95 266,74
11,70
0,84
0,38
1,05
10,35
0,88
0,39
1,10
9,01
0,98
0,44
1,22
6,83
0,49
0,22
0,61
104,94 15,19
6,79
18,89
124,13 9,77
4,37
12,15
77,71
8,10
3,62
10,06
6,63
0,72
0,32
0,90
9,36
0,72
0,32
0,89
193,85 28,23 12,62 35,09
18,70
1,25
0,52
1,56
3,21
0,29
0,13
0,36
1,05
0,11
0,05
0,13
2,89
0,21
0,09
0,26
1235,10 93,91 42,00 116,75
137,56 10,94
4,89
13,61
316,02 37,16 16,62 46,20
76,49
5,72
2,56
7,10
60,88
5,17
2,31
6,43
24,09
2,26
1,01
2,81
11,06
0,67
0,30
0,84
8,37
0,62
0,28
0,77
8,30
0,62
0,28
0,77
8,30
0,72
0,32
0,89
2169,26 242,81 108,59 301,87
37,66
2,16
0,96
2,68
26,39
2,62
1,17
3,25
18,16
1,70
0,76
2,11
6,56
0,31
0,14
0,39
379,64 44,19 19,76 54,94
42,72
3,77
1,68
4,68
23,16
2,38
1,06
2,96
11,64
1,06
0,47
1,32
9,19
0,58
0,26
0,72
В соответствии с полученными данными доказано наличие процессов
восстановления нимесулида в гнилостно-разлагающемся трупном материале до 4А-2-ФФМСА и ацетилирования образовавшегося 4-А-2-ФФМСА до 4-МСА-3ФФА. Установлено, что трансформация 4-А-2-ФФМСА в трупном материале при
достаточно низких температурах возможна по двум направлениям –
ацетилирование до 4-МСА-3-ФФА или окисление до нимесулида.
В рассмотренных условиях сроки сохранения анализируемых веществ
составили: нимесулида и 4-НА – 34-590 суток, 4-А-2-ФФМСА – 270-540 суток, 4МСА-3-ФФА – 240-540 суток, 4-Н-2-ФА и 4-Г-2-ФФМСА – как минимум 240
суток. В процессе трансформации нимесулида в трупном материале на 4-130 сутки
образуется 4-А-2-ФФМСА, а на 18-130 сутки – МСА-3-ФФА, которые затем можно
обнаружить в модельных смесях в течение 320-590 и 230-590 суток
соответственно. В процессе трансформации 4-А-2-ФФМСА в трупном материале
на 24-34 сутки образуется 4-МСА-3-ФФА, который затем обнаруживается в
модельных смесях до 540 суток.
36 °С
Нимесулид (НМС)
4-А-2-ФФМСА из НМС
4-МСА-3-ФФА из НМС
17-22 °С
Б
А
8 °С
Нимесулид (НМС)
4-А-2-ФФМСА из НМС
4-МСА-3-ФФА из НМС
1,5-2,0 °С
Нимесулид (НМС)
4-А-2-ФФМСА из НМС
4-МСА-3-ФФА из НМС
Д
Нимесулид (НМС)
4-А-2-ФФМСА из НМС
4-МСА-3-ФФА из НМС
Г
В
-12 °С
Нимесулид (НМС)
4-А-2-ФФМСА из НМС
4-МСА-3-ФФА из НМС
-12 °С
4-А-2-ФФМСА
4-МСА-3-ФФА из 4-А-2-ФФМСА
НМС из 4-А-2-ФФМСА
Е
Рисунок 6 – Результаты изучения сохраняемости нимесулида при различных
температурах (А, Б, В, Г, Д) и 4-А-2-ФФМСА при -12 °С (Е).
17
ВЫВОДЫ
1. Проведен подбор условий синтеза и очистки 4-Н-2-ФА и 4-А-2-ФФМСА
из нимесулида, а также 4-МСА-3-ФФА и 4-Г-2-ФФМСА из 4-А-2-ФФМСА.
Доказана индивидуальность синтезированных соединений методами ТСХ и ГХМС, установлена их химическая структура с использованием методов ЯМР 1Н и
ИК-спектрофотометрии. Количественное содержание основных веществ в
синтезированных и очищенных образцах определялось титриметрическими
методами. Определены величины химических сдвигов протонов в ЯМР 1Н
спектрах исследуемых соединений. Рассчитан ряд оптических характеристик
электронных спектров анализируемых соединений. Показана возможность
идентификации данных веществ по их электронным, ИК-, масс-спектрам (ГХ-МС).
2. Исследовано хроматографическое поведение анализируемых веществ в
тонких слоях и колонках неподвижных фаз с гидроксилированной и привитой
поверхностями с применением элюентов различной полярности. Рассчитаны
параметры хроматографирования анализируемых соединений. Установлено, что
оптимальной для определения нимесулида и близких по структуре соединений в
тонких слоях силикагеля (пластины «Сорбфил» УФ-254) является подвижная фаза
толуол-ацетонитрил (7:3). При определении в тонких слоях обращённофазового
сорбента (модель привитой фазы С14 – С15) оптимальной является подвижная фаза
буферный раствор с рН 8,95 - метанол (7:4).
Показано, что оптимальной для определения нимесулида, 4-нитроанилина, 4Н-2-ФА методом нормальнофазовой ВЭЖХ является подвижная фаза гексанацетон-тетрахлорметан (7:3:7), для определения нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4МСА-3-ФФА, 4-Г-2-ФФМСА – подвижная фаза гексан-диоксан-тетрахлорметан
(1:1:1). Установлено, что для определения исследуемых соединений методом
обращеннофазовой ВЭЖХ универсальным является градиентный режим
элюирования с компонентами подвижной фазы ацетонитрилом и 20 мМ
фосфатным буфером KH2PO4 с рН 3,05.
3. Разработаны методики количественного спектрофотометрического
определения аналитов по поглощению в средах ацетонитрила, ДМФА и этанола.
Относительная ошибка среднего результата (n=6; Р=0,95) методик не превышает
1,04 %. Разработаны методики количественного определения аналитов методами
нормальнофазовой и обращеннофазовой ВЭЖХ. Относительная ошибка среднего
результата (n=6; Р=0,95) – не более 1,41 %.
4. Установлены оптимальные условия максимального извлечения аналитов
из равновесных водной и органических фаз (экстрагенты – этилацетат, этилацетат
насыщенный водой, бензол; электролиты – аммония сульфат, аммония бромид,
натрия бромид). Определена необходимая кратность экстрагирования для
извлечения заданных количеств аналитов из водных растворов. Предложены
селективные условия экстрагирования нимесулида, 4-А-2-ФФМСА, 4-МСА-3-ФФА
при их возможном совместном присутствии.
5. Исследована зависимость удерживания аналитов в макроколонках
нормальнофазового (Silicagel L 40/100 мкм) и обращеннофазового (Silasorb C18 30
мкм) сорбентов от состава и соотношения компонентов подвижных фаз.
Установлены
оптимальные
условия
хроматографирования
исследуемых
соединений с использованием подвижных фаз состава: гексан-ацетон
(нормальнофазовый сорбент) и вода-ацетон (обращеннофазовый сорбент).
18
Определён уровень потерь аналитов при хроматографировании в тонких
слоях и колонках сорбентов. Показана эффективность разработанных способов
очистки анализируемых соединений от соэкстрактивных веществ биоматериала
жидкость-жидкостной экстракцией и хроматографией.
6. Изучено сравнительное изолирование аналитов из биоматериала 32
изолирующими агентами различной химической природы в режиме настаивания.
Установлены зависимости степени изолирования анализируемых соединений от
длины углеводородного радикала в ряду алифатических спиртов и сложных эфиров
карбоновых кислот, от числа атомов хлора в ряду галогеналканов, от молекулярной
массы аренов.
Установлено, что извлечение анализируемых веществ из биоматериала
целесообразно проводить ацетоном. Оптимальные условия изолирования
достигаются при двукратном настаивании в течение как минимум 45 минут при
массовом соотношении «ацетон-биоматериал» – не менее 2:1.
7. Разработаны методики определения анализируемых соединений в тканях
трупных органов и биожидкостях (крови, плазме крови и моче) на основе
изолирования ацетоном и последующей очистки жидкость-жидкостной
экстракцией и хроматографией.
Установлено, что при росте содержания аналитов от 2,0 до 50,0 мг в 100 г
биоматериала изменение степени извлечения не превышает 3,59 %. Значения
степени извлечения при этом находятся в интервале 48,73-99,90%, а значения
доверительного интервала – 1,56-6,95 (n=5; Р=0,95). Для разработанных методик
установлены значения определяемого минимума исследуемых веществ.
8. Исследовано распределение рассматриваемых соединений в организме
теплокровных (на примере крыс). Установлено, что в значительных количествах
исследуемые соединения присутствуют в верхних отделах желудочно-кишечного
тракта, а также в крови, почках с надпочечниками и легких (4-нитроанилин), в
мозге и тимусе (4-Н-2-ФА), почках с надпочечниками и легких (нимесулид), глазах
и тимусе (4-А-2-ФФМСА), селезенке, крови, сердце, почках с надпочечниками (4МСА-3-ФФА), тимусе и селезенке (4-Г-2-ФФМСА).
Исследованы особенности сохранения нимесулида, продуктов его
трансформации и близких по структуре соединений в модельных смесях с трупным
материалом в пяти температурных режимах (от -12 до 36 °С). Доказана
возможность трансформации в трупном материале нимесулида до 4-А-2-ФФМСА и
4-МСА-3-ФФА, а 4-А-2-ФФМСА до 4-МСА-3-ФФА.
19
Список работ, опубликованных автором по теме диссертации
1. Шорманов, В. К. Определение изомеров нитроанилина в тонком слое
нормальнофазового сорбента / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, А. С. Шилова //
Биотехнология. Биомедицинская инженерия и технология современных
социальных практик : сб. тр. Всерос. науч.-практ. конф. – Курск : Изд-во КГМУ,
2009. – С. 171-174.
2. Шорманов, В. К. Изучение особенностей определения изомеров
нитроанилина методом нормальнофазовой ТСХ после переведения их в
соответствующие полинитропроизводные / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, А. С.
Шилова // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов III Всерос.
науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. 75-летию Курск. гос. мед. ун-та.
– Курск : Изд-во КГМУ, 2010. – С. 323-325.
3. Возможности применения электронной спектрофотометрии для
идентификации нимесулида в биологических жидкостях / В. К. Шорманов,
Д. А. Герасимов, О. И. Гришечко, С. Г. Галушкин // Биотехнология и
биомедицинская инженерия : сб. материалов IV Всерос. науч.-практ. конф. с
междунар. участием. – Курск : Изд-во КГМУ, 2011. – С. 213-215.
4.
Идентификация
4-нитроанилина
методом
электронной
спектрофотометрии / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, Л. Е. Сипливая,
О. И. Гришечко // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов IV
Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. – Курск : Изд-во КГМУ, 2011. –
С. 215-217.
5. Количественное определение 4-нитроанилина на основе поглощения в
среде ацетонитрила / В. К. Шорманов, Л. Е. Сипливая, Д. А. Герасимов,
О. И. Гришечко // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов IV
Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. – Курск : Изд-во КГМУ, 2011. –
С. 220-223.
6. Количественное определение 4-нитроанилина на основе поглощения
электромагнитного излучения в среде ДМФА / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов,
О. И. Гришечко, С. Г. Галушкин // Биотехнология и биомедицинская инженерия :
сб. материалов IV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. – Курск : Издво КГМУ, 2011. – С. 211-213.
7. Количественное определение нимесулида методом спектрофотометрии в
УФ-области / В. К. Шорманов, Л. Е. Сипливая, Д. А. Герасимов, С. Г. Галушкин //
Университетская наука: Взгляд в будущее : материалы итоговой науч. конф.
сотрудников КГМУ (2-3 февр. 2011 г.) : в 3 т. – Курск : Изд-во КГМУ, 2011. – Т. 2.
– С. 292-294.
8. Определение нимесулида методом электронной спектрофотометрии / В. К.
Шорманов, Л. Е. Сипливая, Д. А. Герасимов, О. И. Гришечко // Университетская
наука: Взгляд в будущее : материалы итоговой науч. конф. сотрудников КГМУ (2-3
февр. 2011 г.) : в 3 т. – Курск : Изд-во КГМУ, 2011. – Т. 2. – С. 294-297.
9. Особенности определения отдельных нитропроизводных анилина в
биологический объектах в тонком слое обращеннофазового сорбента /
В. К. Шорманов, А. С. Шилова, Ю. А. Сухомлинов, Д. А. Герасимов //
Сорбционные и хроматографические процессы. – 2011. – Т. 11, вып. 3. – С. 407414.
20
10. Получение ацетильных производных анилина и ряда близких структур
для дальнейшего химико-токсикологического анализа / В. К. Шорманов,
Д. А. Герасимов, А. С. Шилова, О. И Гришечко // Биотехнология и биомедицинская
инженерия : сб. материалов IV Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. –
Курск : Изд-во КГМУ, 2011. – С. 209-211.
11. Прямофазная тонкослойная хроматография нимесулида и близких по
структуре соединений в индивидуальных подвижных фазах / В. К. Шорманов,
Д. А. Герасимов, С. Г. Галушкин, О. И. Гришечко // Материалы Четвертой
междунар. дистанц. науч. конф. «Инновация в медицине» – Курск : Изд-во КГМУ,
2011. – С. 132-136.
12. Фотометрическое определение нимесулида в гранулах для приготовления
суспензий / В. К. Шорманов, Л. Е. Сипливая, Д. А. Герасимов, О. И. Гришечко //
Современные аспекты разработки и совершенствования состава и технологии
лекарственных форм : материалы Всерос. науч.-практ. интернет-конф. с междунар.
участием (27 апр. 2011 г.). – Курск : Изд-во КГМУ, 2011. – С. 397-399.
13. Фотометрическое определение нимесулида в моче человека /
В. К. Шорманов, Л. Е. Сипливая, Д. А. Герасимов, О. И. Гришечко // Материалы
XVIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство». – М., 2011. –
С. 655.
14.
Бабина,
С. В.
Экстракция
4-нитроанилина
органическими
растворителями / С. В. Бабина, Д. А. Герасимов // Молодежная наука и
современность: материалы 77-й Всерос. науч. конф. студентов и молодых ученых
(18-19 апр. 2012 г.) : в 3 ч. – Курск : Изд-во КГМУ, 2012. – Ч. 2. – С. 294-297.
15. Идентификация метаболита № 1 нимесулида методом электронной
спектрофотометрии / Д. А. Герасимов, В. К. Шорманов, Ю. О. Усова,
Л. Е. Сипливая // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов V
Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. – Курск : Изд-во КГМУ, 2012. –
С. 66-69.
16. Идентификация метаболита № 2 нимесулида методом электронной
спектрофотометрии / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, С. Г. Галушкин,
В. В. Чупак // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов V
Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. – Курск : Изд-во КГМУ, 2012. –
С. 108-111.
17. Определение метаболита № 1 нимесулида на основе поглощения
электромагнитного излучения в среде ацетонитрила / Д. А. Герасимов,
В. К. Шорманов, С. Г. Галушкин, Л. Е. Сипливая // Биотехнология и
биомедицинская инженерия : сб. материалов V Всерос. науч.-практ. конф. с
междунар. участием. – Курск : Изд-во КГМУ, 2012. – С. 69-72.
18. Определение метаболита № 2 нимесулида на основе поглощения
электромагнитного излучения в ацетонитриле / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов,
С. Г. Галушкин, В. В. Чупак // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб.
материалов V Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. – Курск : Изд-во
КГМУ, 2012. – С. 111-114.
19. Определение метаболита № 2 нимесулида на основе поглощения
электромагнитного излучения в этаноле / Д. А. Герасимов, В. К. Шорманов,
В. В. Чупак, С. Г. Галушкин // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб.
21
материалов V Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. – Курск : Изд-во
КГМУ, 2012. – С. 63-66.
20. Определение нового соединения из группы метансульфонамидов на
основе поглощения УФ-излучения в среде ацетонитрила / Л. Е. Сипливая,
В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, С. Г. Галушкин // Биотехнология и
биомедицинская инженерия : сб. материалов V Всерос. науч.-практ. конф. с
междунар. участием. – Курск : Изд-во КГМУ, 2012. – С. 86-89.
21. Определение нового соединения из группы метансульфонамидов на
основе поглощения УФ-излучения в среде этанола / Д. А. Герасимов,
В. К. Шорманов, Л. Е. Сипливая, С. Г. Галушкин // Биотехнология и
биомедицинская инженерия : сб. материалов V Всерос. науч.-практ. конф. с
междунар. участием. – Курск : Изд-во КГМУ, 2012. – С. 72-76.
22. Сохраняемость нимесулида и его основных метаболитов в гнилостноразлагающемся трупном материале / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов,
С. Г. Галушкин, Л. Е. Сипливая // Актуальные проблемы судебно-медицинской
экспертизы : сб. тез. науч.-практ. конф. с междунар. участием (Москва, 17-18 мая
2012 г.). – М., 2012. – С. 271-273.
23. Спектрофотометрическое определение примеси «D» нимесулида в средах
ацетонитрила и диметилформамида / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов,
О. И. Гришечко, Л. Е. Сипливая // Биотехнология и биомедицинская инженерия :
сб. материалов V Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. – Курск : Издво КГМУ, 2012. – С. 99-102.
24. Шорманов, В. К. Идентификация 4-нитро-2-феноксианилина методом
электронной спектрофотометрии / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, Ю. О. Усова //
Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов V Всерос. науч.практ. конф. с междунар. участием. – Курск : Изд-во КГМУ, 2012. – С. 96-99.
25. Шорманов, В. К. Идентификация нового соединения из группы
замещенных метансульфонамидов методом электронной спектрофотометрии /
В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, О. И. Гришечко // Биотехнология и
биомедицинская инженерия : сб. материалов V Всерос. науч.-практ. конф. с
междунар. участием. – Курск : Изд-во КГМУ, 2012. – С. 93-96.
26. Шорманов, В. К. Изолирование нимесулида из биологического
материала / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, С. Г. Галушкин // Научные
ведомости Белгородского государственного университета. Сер. Медицина.
Фармация. – 2012. – № 22 (141), вып. 20/1. – С. 124-129.
27. Шорманов, В. К. Сохраняемость нимесулида в трупном материале /
В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, Л. Е. Сипливая // Курский научнопрактический вестник «Человек и его здоровье». – 2012. – № 3. – С. 102-107.
28. Идентификация некоторых соединений группы 4-нитроанилинов
методом колебательной спектрофотометрии / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов,
Ю. В. Андреева, В. А. Омельченко // Университетская наука: Взгляд в будущее :
материалы итоговой науч. конф. сотрудников КГМУ (7 февр. 2013 г.) : в 2 т. –
Курск : Изд-во КГМУ, 2013. – Т. II. – С. 168-171.
29. Определение метаболита № 1 нимесулида на основе поглощения
электромагнитного излучения в среде этанола / В. К. Шорманов, О. С. Дукова,
О. Д. Герасимова, Д. А. Герасимов // Биотехнология и биомедицинская инженерия :
22
сб. материалов VI Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. – Курск : Издво КГМУ, 2013. – С. 72-76.
30. Определение нимесулида на основе поглощения электромагнитного
излучения в среде ДМФА / В. К. Шорманов, Д. Ю. Кондаурова, А. И. Янченко,
Д. А. Герасимов // Биотехнология и биомедицинская инженерия : сб. материалов VI
Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. – Курск : Изд-во КГМУ, 2013. –
С. 76-79.
31. Определение примеси 4-нитро-2-феноксианилина в нимесулиде методом
производной спектрофотометрии / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов,
О. Д. Герасимова, О. С. Дукова // Химия и медицина : тез. докл. IX Всерос. конф. с
молодеж. науч. шк. по органич. химии. – Уфа-Абзаково : ИОХ УНЦ РАН, 2013. –
С. 123-124.
32. Применение производной спектрофотометрии для определения
нимесулида в лекарственных формах / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов,
М. К. Елизарова, Д. Ю. Кондаурова, А. И. Янченко // Пути и формы
совершенствования
фармацевтического
образования.
Создание
новых
физиологически активных веществ : материалы 5-й Междунар. науч.-метод. конф.
«Фармобразование-2013». – Воронеж : Изд-во ВГУ, 2013. – С. 626-630.
33. Шорманов, В. К. Идентификация некоторых 4-производных 2феноксифенилметансульфонамида по поглощению электромагнитного излучения в
ИК-области спектра / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, Н. Б. Мельникова //
Университетская наука: Взгляд в будущее : материалы итоговой науч. конф.
сотрудников КГМУ (7 февр. 2013 г.) : в 2 т. – Курск : Изд-во КГМУ, 2013. – Т. II. –
С. 162-165.
34. Распределение 4-нитроанилина в организме теплокровных
животных / В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, В. А. Омельченко, О. И.
Гришечко, М. А. Останин // Судебно-медицинская экспертиза. – 2013. – Т. 56,
№ 1. – С. 42-46.
35. Шорманов, В. К. Распределение 4-амино-2-феноксифенилметансульфонамида в организме теплокровных животных / В. К. Шорманов, Д. А.
Герасимов // Судебно-медицинская экспертиза. – 2013. – Т. 56, № 6. – С. 25-30.
36. Распределение нимесулида в организме теплокровных животных /
В. К. Шорманов, Д. А. Герасимов, Л. Е. Сипливая, С. Г. Галушкин, Р. Ю.
Симонов // Фармация. – 2013. – Т. 62, № 1. – С. 39-42.
Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г.
Сдано в набор 02.07.2014 г. Подписано в печать 03.07.2014.г.
Формат 30×421/8. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom.
Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0.
Тираж 100 экз. Заказ № 273«А».
Издательство Курского государственного медицинского университета
305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.
23
24