Az ərba ycan Respubli kası Mərkə zi Ban kı;pdf

Федеральное государственное бюджетное учреждение
“Научно-исследовательский институт ревматологии имени В.А. Насоновой”
Российской академии медицинских наук
Современные стандарты лабораторной
диагностики системных аутоиммунных
ревматических заболеваний
Е.Н. Александрова
Алматы
2 апреля 2014 г.
Иммуновоспалительные заболевания
(immune-mediated inflammatory diseases – IMID)
Гетерогенная группа клинически разнородных заболеваний с общими
механизмами патогенеза, характеризующимися сочетанием процессов
аутовоспаления и аутоиммунитета, связанных с генетически
детерминированными и индуцированными факторами внешней среды
дефектами активации врожденного и приобретенного иммунного ответа.
Гены
Иммуновоспалительные
болезни
Тригерные
факторы
Иммунные
нарушения
•Этиология не известна
•Общие триггерные факторы (курение, инфекции и
др.)
•Общие факторы генетической предрасположенности,
семейная агрегация
•Частое развития нескольких иммуновоспалительных
заболеваний у одного больного
•Высокая коморбидность (атеросклероз, инфекция,
остеопороз, лимфопролиферативные заболевания)
•Эффективность глюкокортикоидов
Частота в популяции 5-7%
(более 100 нозологических форм)
Е.Л.Насонов, 2012 г.
Иммуновоспалительные заболевания:
механизмы
Аутоиммунитет –
патологический процесс, связанный с активацией
приобретенного иммунитета.
Основан на аберрантном ответе дендритных
клеток, В- и Т-лимфоцитов в первичных и
вторичных иммунных органах, ведущему к
нарушению толерантности и развитию иммунных
реакций против нативных белков (аутантигенов)
собственных тканей. Характеризуется
образованием аутоантител и
сенсибилизированных Т-лимфоцитов.
Пауль Эрлих
«Horror autotoxicus»
D McGonagle и MF McDermott. A proposed classification of the Immunological Diseases. PLos Medicine 2006; 3:1242-1248
Иммуновоспалительные заболевания:
механизмы
Аутовоспаление –
патологический процесс, связанный с
локальными тканевыми факторами,
ведущий к активации врожденного
иммунитета (макрофагов, нейтрофилов)
и развитию тканевого повреждения.
В основе этого открытия лежат работы
Мечникова о способности фагоцитирующих
клеток вызывать воспалительные реакции
в тканях в ответ на чужеродный антиген в
отсутствие сывороточных факторов
(аутоантител).
Илья Мечников
D McGonagle и MF McDermott. A proposed classification of the Immunological Diseases. PLos Medicine 2006; 3:1242-1248
Континуум иммуновоспалительных болезней
Аутовоспалительно-аутоиммунный
континиум
Редкие моногенные
аутовоспалительные
заболевания
•Семейная средиземноморская лихорадка (FMF)
•Периодический синдром, ассоциированный с ФНО- рецептором (TRAPS)
•Гипер IgD синдром (HIDS)
•Пиогенный стерильный артрит (PAPA)
•Хронический мультифокальный рецидивирующий остеомиелит (CMRO)
•Синдром Blau (увеит)
Полигенные
аутовоспалительные
заболевания
•Болезнь Крона, язвенный колит
•Остеоартроз
•Подагра/псевдоподагра/другие кристаллические артриты
•Некоторый формы реактивного и псориатического артритов
•Гигантоклеточный артериит, болезнь Такаясу
•Идиопатический увеит
•Угри и заболевания, ассоциированные с угрями
•Некоторые неврологические заболевания: энцефаломиелит и др.
•Узловатая эритема, саркоидоз
Аутовоспалительноаутоиммунные
заболевания
•Анкилозирующий спондилит
•Псориаз/псориатический артрит
•Болезнь Бехчета
•Системный ювенильный идиопатический артрит (болезнь Стилла)
•Увеит (HLA-B27)
•Рассеянный склероз
(связанные с классом I ГКГ)
•Целиакия
•Первичный биллиарный цирроз
•ХАГ
•Аутоиммунный гастрит/
•пернициозная анемия
Аутоиммунные заболевания
щитовидной железы
•Болезнь Аддисона
•Синдром Гудпасчера
•Миастения гравис
•Диабет типа I
•Пузырчатка;Витилиго
•Аутоиммунные цитопении
Классические
полигенные
аутоиммунные
заболевания
(органонеспецифические и
органоспецифические)
•Ревматоидный артрит
•Системная красная волчанка
•Синдром Шегрена
•АНЦА – васкулиты
•Дерматомиозит
Полимиозит
•Системная склеродермия
•Аутоиммунный увеит
Редкие моногенные
аутоиммунные
заболевания
Аутоиммунный пимфопролиферативный синдром (ALPS)
Связанная с Х хромосомой иммунная дисрегуляция, полиэндокринопатия,
энтеропатия (IPEX)
Синдром аутоимунной полиэндокринопатии-кандидоза-эктодермальной
дистрофии (APCED)
D. McGonagle и M.F. McDermott, 2006
Аутоиммунитет
Иммунный ответ против небольшого
числа аутоантигенов, присутствующих в
определенных тканях, приводит к
локальному (органоспецифическому)
воспалению, особенно характерному для
аутоиммунных эндокринопатий и
заболеваний нервной системы
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Целиакия
Первичный биллиарный цирроз
ХАГ
Аутоиммунный гастрит/
пернициозная анемия
Аутоиммунные заболевания
щитовидной железы
Болезнь Аддисона
Синдром Гудпасчера
Миастения гравис
Диабет типа I
Пузырчатка;Витилиго
Иммунный ответ против множества
аутоантигенов, присутствующих во всех
тканях (нуклеиновые кислоты,
нуклеопротеиды, белки плазмы и др.),
приводит к развитию генерализованного
(системного) воспаления
•
•
•
•
•
•
•
•
Ревматоидный артрит
Системная красная волчанка
Синдром Шегрена
АНЦА – васкулиты
Дерматомиозит
Полимиозит
Системная склеродермия
Аутоиммунный увеит
Е.Л.Насонов, 2001 г.
СИСТЕМНЫЕ АУТОИММУННЫЕ РЕВМАТИЧЕСКИЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ
РЕВМАТОИДНЫЙ АРТРИТ
CИСТЕМНАЯ КРАСНАЯ ВОЛЧАНКА
CИСТЕМНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ
СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ
СИСТЕМНЫЕ ВАСКУЛИТЫ
АНТИФОСФОЛИПИДНЫЙ СИНДРОМ
Лабораторные биомаркеры системных аутоиммунных
ревматических заболеваний (САРЗ)
АУТОАНТИТЕЛА
РФ, АЦЦП, АНА, АФЛ, АНЦА и др.
СОЭ, СРБ, SAA, ФЕРРИТИН, КАЛЬПРОТЕКТИН,
ПРОКАЛЬЦИТОНИН
МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ
ЦИТОКИНЫ
ФНО-α, рФНОРI, ИЛ-1, ИЛ1-ра, ИЛ-2, ИЛ-2Р, ИЛ-6, ИЛ-4,
ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-15, ИЛ-17, ИЛ-18, ИЛ-23, ИФНγ, VEGF,
pCD40L, ХЕМОКИНЫ, АДИПОКИНЫ
СD3+, СD4+, CD8+, HLA-DR+, CD19+, CD56+,
CD4+25+Foxp3+, CD69+
СУБПОПУЛЯЦИИ ЛИМФОЦИТОВ
ИММУНОГЛОБУЛИНЫ: IgG, IgG4, IgM, IgA
КРИОГЛОБУЛИНЫ
КОМПОНЕНТЫ КОМПЛЕМЕНТА
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ
С1q, C3, C4 С1-ингибитор, С5b-9, C3b, C4d
HLA (B27, DR4 и др.)
МАРКЕРЫ МЕТАБОЛИЗМА КОСТНОЙ
И ХРЯЩЕВОЙ ТКАНИ
CROSS LAPS, ОСТЕОКАЛЬЦИН, CARTILAPS,
OPG, RANKL, BAP, COMP, PINP
СТАНДАРТНЫЕ МЕТОДЫ ИММУНОДИАГНОСТИКИ
АГГЛЮТИНАЦИЯ
www.essum.se
РЕАКЦИЯ ФИКСАЦИИ КОМПЛЕМЕНТА
www.dshs.state.tx.us
ИММУНОПРЕЦИПИТАЦИЯ
www.gbiosciences.com
ДВОЙНАЯ ИММУНОДИФФУЗИЯ
www.medschool.lsuhsc.edu
КОНТРИММУНОЭЛЕКТОРОФОРЕЗ
www.scielo.br
РАДИОИММУНОАНАЛИЗ
users.rcn.com
Непрямая реакция иммунофлюоресценции (НРИФ)
АНФ, антитела к дсДНК (с Crithidia Luciliae), АНЦА, ASMA,
антикардиальные антитела и др.
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Аутоантитела
Цитокины, хемокины,
факторы роста
Маркеры дисфункции
эндотелия
Маркеры хрящевого и
костного метаболизма
Другие биомаркеры
ИММУНОДОТ
Аутоантитела
ИММУНОБЛОТ
Аутоантитела
Y.Shoenfield, M.E. Gershvin, P.L. Meroni; Autoantibodies,
2nd Edition, Elsevier, 2007.
www.teagasc.ie
Лазерная нефелометрия
СРБ, SAA
Иммуноглобулины
Компоненты комплемента
Ревматоидный фактор
Антистрептолизин-О
Иммунохемилюминисценция
Цитокины
Прокальцитониновый тест
АЦЦП
Маркеры хрящевого и костного
метаболизма
Витамин D
Гормоны
Гомоцистеин
NT-proBNP
Проточная цитометрия
Субпопуляции лимфоцитов
периферической крови
www.sciencemag.org
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ
www.gene-quantification.de
ПЛАНАРНЫЕ МИКРОЧИПЫ
Мультиплексные аналитические системы с упорядоченным размещением молекул ДНК и
белка на твердой подложке (методы детекции: флюоресценция, хемилюминисценция,
масс-спектрометрия)
Иммобилизация молекул ДНК и белков
в виде микропятен
на слайдах
на полистиреновых
микроплатах
На нитроцеллюлозной
мембране
Линейный иммуноблот на
нитроцеллюлозной мембране
СУСПЕНЗИОННЫЕ МИКРОЧИПЫ (ТЕХНОЛОГИЯ Х-MAP) В ДИАГНОСТИКЕ САРЗ
Острофазовые белки
Цитокины хемокины и факторы роста
Аутоантитела
•ANA Screen*
•dsDNA•Chromatin
•Ribosomal Protein Р
•SS-A (52 and 60)
•SS-B•Sm•Sm/RNP
•RNP (A and 68)
•Scl-70
•Jo-1
•Centromere B
•ANCA
•aCL, aβ2-GPI
Коммерческие мультиплексные тест-системы для определения
профилей аутоантител в сыворотке крови
Производитель
Система
Профили аутоантител
Innogenetics, Belgium
Mikrogen, Germany
Imtec, Germany
BMD, France
IL (INOVA), Spain
ZEUS, USA
BIO-RAD, USA
INNO-LIA1
RecomLine1
ANA-LIA1
FIDIS2
QuantaPlex2
AtheNA Multi-Lyte2
BioPlex 22002
АНА(15)
АНА (13)
АНА (11)
АНА (9), РА (2), васкулиты (2), целиакия (3), тиреоидит (2)
АНА (8), васкулиты (2), целиакия (3), поражение печени (5)
АНА (10), васкулиты (3), целиакия (2), тиреоидит (2)
АНА (13), васкулиты (3), АЦЦП, АФС (2), целиакия (3)
Примечания: 1планарные микрочипы, линейный иммуноблот
2 суспензионные микрочипы, технология хMAP
Blue Diver Quantrix ANA – стрипы в формате микрочипов для
количественного мультиплексного определения 25 антинуклеарных антител
методом иммунодота
Аутоантитела
Лабораторная экспресс-диагностика ревматоидного артрита
IgM РФ, АМЦВ
АЦЦП
45 мин.
СОЭ
СРБ
Основные проблемы стандартизации методов определения аутоантител















Преаналитический этап лабораторного исследования
Идентификация пациента
Сбор образцов биоматериала
Обработка и хранение образцов биоматериала
Условия транспортировки
Состояние пациента (физиологические факторы и особенности заболевания)
Аналитический этап лабораторного исследования
Вариабельность лабораторного теста
Особенности антигена
Иммобилизация антигена на твердой фазе
Калибровка и стандартизация аналитической системы
Способы детекции
Постаналитический этап лабораторного исследования
Выдача результатов исследования
Единицы измерения
Определение верхней границы нормы («cut off») для аутоантител относительно их
уровней у здоровых лиц и у пациентов с инфекционными заболеваниями,
парапротеинемией и гипергаммаглобулинемией
Интерпретация результатов теста по категориям: «негативные», «пограничные»,
«позитивные», «высоко позитивные»
Сравнение клинической информативности (диагностической чувствительности и
специфичности, отношения правдоподобия положительных и отрицательных
результатов теста, площади под ROC-кривой) новых и использовавшихся ранее
методов определения аутоантител (ИФА и КИЭФ, хемилюминисценции и ИФА,
ИФА и НРИФ, мультиплексных технологий и НРИФ, мультиплексных технологий
и ИФА и др. )
Важное направление гармонизации методов выявления аутоантител - разработка
международных референтных материалов для калибровки и внешней оценки
качества иммунологических тестов
Критерии оценки клинической информативности
лабораторных тестов
•
•
•
•
•
•
Диагностическая чувствительность (ДЧ)
Диагностическая специфичность (ДС)
Предсказательная ценность положительного результата (ПЦПР)
Предсказательная ценность отрицательного результата (ПЦОР)
Отношение правдоподобия положительного результата (ОППР)
Отношение правдоподобия отрицательного результата (ОПОР)
Характеристика лабораторных тестов
СКРИНИНГОВЫЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ
ТЕСТЫ
ДОЛЖНЫ ОБЛАДАТЬ ВЫСОКОЙ
ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ
ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ
ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ЛАБОРАТОРНЫЕ
ТЕСТЫ
ДОЛЖНЫ ОБЛАДАТЬ ВЫСОКОЙ
ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ
СПЕЦИФИЧНОСТЬЮ
Рекомендации американской коллегии ревматологов для оценки клинической
информативности лабораторных тестов
ОП+ = чувствительность/1-специфичность
ОП- = 1-чувствительность/специфичность
КЛИНИЧЕСКОЕ
ЗНАЧЕНИЕ
НАИБОЛЕЕ
ПОЛЕЗНЫЕ
ТЕСТЫ
ПОЛЕЗНЫЕ
ТЕСТЫ
НЕ ИМЕЮЩИЕ
ПОЛЬЗЫ
ТЕСТЫ
ОТНОШЕНИЕ
ПРАВДОПОДОБИЯ
ПОЛОЖИТЕЛЬНОГО
РЕЗУЛЬТАТА ТЕСТА
ОТНОШЕНИЕ
ПРАВДОПОДОБИЯ
ОТРИЦАТЕЛЬНОГО
РЕЗУЛЬТАТА ТЕСТА
>5,0
<0,2
>2,0 и ≤5,0
>0,2 и ≤0,5
≤2,0
>0,5
ROC-анализ
1.
2.
Характеристическая кривая (ROC-curve)
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОПТИМАЛЬНОГО ЗНАЧЕНИЯ
“CUT OFF”
ОЦЕНКА ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ
ТЕСТА ПО ПЛОЩАДИ ПОД КРИВОЙ (AUC)
Методы определения оптимальной точки разделения между
нормой и патологией (“cut-off”)
1. Согласно рекомендациям фирмы-изготовителя
коммерческих тест-систем
2. По данным лаборатории:
а) М±3SD (5SD)
б) по 95 процентилю
в) по значениям ОППР/ОПОР
г) по данным ROC-анализа
У 95% здоровых доноров должны определяться
нормальные уровни исследуемого показателя.
Уровни позитивности лабораторных показателей при РЗ
Рекомендуется выделение:
-негативных
-низкопозитивных
-умереннопозитивных
-высокопозитивных
уровней анализируемых показателей
Цель:
- улучшение внутри- и межлабораторной сопоставимости результатов
анализов при использовании различных тест-систем
- применение лабораторных показателей в качестве диагностических
критериев РЗ
- использование лабораторных биомаркеров для оценки активности,
прогноза болезни, выбора метода лечения и мониторинга эффективности
терапии при РЗ
Факторы, влияющие на кратность определения аутоантител и
других лабораторных биомаркеров
•
•
•
•
•
•
•
Стадия заболевания
Связь лабораторных биомаркеров с активностью заболевания
Прогнозирование обострения, тяжести течения, прогрессирования
заболевания
Лабораторный мониторинг проводимой терапии
Прогнозирование эффективности терапии
Вероятность сероконверсии на фоне проводимой терапии
Уровни позитивности аутоантител
Клинические рекомендации по использованию иммунологических
лабораторных тестов в ревматологии
2006
2008
2010
ПРОЕКТ
НАЦИОНАЛЬНЫХ
РЕКОМЕНДАЦИЙ ПО
ДИАГНОСТИКЕ И
ЛЕЧЕНИЮ
РЕВМАТИЧЕСКИХ
ЗАБОЛЕВАНИЙ
ПО ПОРУЧЕНИЮ
ГРУППЫ ЭКСПЕРТОВ АРР
2012
2013
2010
ПРИМЕНЕНИЕ ЛАБОРАТОРНЫХ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ТЕСТОВ
В РЕВМАТОЛОГИИ
● ИЗУЧЕНИЕ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ БОЛЕЗНИ
● ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ДИАГНОЗА
● МОНИТОРИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ БОЛЕЗНИ
● ОЦЕНКА ПРОГНОЗА
● ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ
АУТОАНТИТЕЛА – ОСНОВНОЙ
АУТОИММУННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЛАБОРАТОРНЫЙ МАРКЕР
•Антинуклеарные (ядерные) антитела
•Антитела при ревматических заболеваниях
•Антинейтрофильные антитела
•Антитела к биологическим факторам и структурам
•Сердечные антитела
•Эндокринные антитела
•Желудочно-кишечные и печеночные антитела
•Гематологические антитела
•Почечные антитела
•Неврологические антитела
•Антитела при заболеваниях кожи
3rd Edition
2014
•Антитела при аллергических заболеваниях
В настоящее время идентифицировано
более 100 видов аутоантител
АУТОАНТИТЕЛА, ВКЛЮЧЕННЫЕ В ДИАГНОСТИЧЕСКИЕ И/ИЛИ КЛАССИФИКАЦИОННЫЕ
КРИТЕРИИ САРЗ
Аутоантитела
Диагностические и/или
классификационные
критерии САРЗ
РА
Ревматоидный фактор (РФ)
Антитела к цитруллинированным белкам
(АЦБ)
Классификационные критерии
ACR/EULAR 2010 г.
СКВ
Антинуклеарные антитела (АНА):
Анти-дсДНК
Анти-Sm
Анти-SSA/Ro
Анти-SSB/La
Антифосфолипидные антитела:
-Антитела к кардиолипину (АКЛ)
-Антитела к β2-гликопротеину I
(aβ2-ГП I)
-Волчаночный антикоагулянт (ВА)
-Ложноположительная реакция
Вассермана
Прямая проба Кумбса (в отсутствии
гемолитической анемии)
Классификационные критерии
SLICC 2012 г.
ССД
АНА
Антитела к топоизомеразе I (анти- Scl-70)
Классификационные критерии
ACR/EULAR 2013 г.
Заболевание
Антицетромерные антитела
Антитела к РНК-полимеразе III
СШ
Анти-SSA/Ro
Анти-SSB/La
РФ
АНА
Классификационные критерии
ACR 2012 г.
СЗСТ
Анти- U1RNP
Диагностические критерии
1996 г.
АФС
ВА
АКЛ
aβ2-ГПI
Классификационные критерии
(консенсус) 2006 г.
АНЦА-СВ
Антинейтрофильные
цитоплазматические антитела (АНЦА)
Антитела к протеиназе 3
Антитела к миелопероксидазе
Классификационные критерии
(консенсус) 2007 г.
ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АУТОАНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ БОЛЬНЫХ
СИСТЕМНЫМИ АУТОИММУННЫМИ РЕВМАТИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ (I)
● При аутоиммунных ревматических заболеваниях тестирование
аутоантител в первую очередь проводится с целью
подтверждения диагноза у пациентов с недостаточным числом
клинических проявлений.
● Обнаружение аутоантител при отсутствии клинических
признаков не является достаточным для постановки диагноза
аутоиммунного заболевания.
● Отмечено нарастание частоты выявления аутоантител у лиц
пожилого и старческого возраста, на фоне приема лекарственных
препаратов, при вирусных и бактериальных инфекциях,
злокачественных новообразованиях, у здоровых родственников
больных аутоиммунными заболеваниями.
ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АУТОАНТИТЕЛ В СЫВОРОТКАХ БОЛЬНЫХ
СИСТЕМНЫМИ АУТОИММУННЫМИ РЕВМАТИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ (II)
● При оценке клинического значения аутоантител необходимо
учитывать стойкость и выраженность их гиперпродукции.
● При инфекциях наблюдается умеренное транзиторное
образование аутоантител, а при аутоиммунных заболеваниях –
стойкая выраженная гиперпродукция.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АУТОАНТИТЕЛ
• Аутоантитела, которые выявляются только при одном
заболевании (disease-specific), встречаются крайне редко
•
Для аутоиммунных заболеваний характерно одномоментное
присутствие нескольких типов аутоантител в одной сыворотке, так
называемый «профиль аутоантител»
•
Оценка профиля аутоантител существенно увеличивает
диагностическую ценность определения аутоантител
• Неспецифические нарушения иммунитета
(гипериммуноглобулинемия, снижение концентрации комплемента
и др.), лимфопения, ускорение СОЭ могут косвенно указывать на
развитие системного ревматического заболевания (показания для
определения аутоантител)
Основные диагностические лабораторные тесты в
ревматологии
АНТИНУКЛЕАРНЫЕ АНТИТЕЛА (АНА)
РЕВМАТОИДНЫЙ ФАКТОР (РФ)
АНТИТЕЛА К ЦИТРУЛЛИНИРОВАННЫМ
БЕЛКАМ (АЦБ)
АНТИНЕЙТРОФИЛЬНЫЕ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ
АНТИТЕЛА (АНЦА)
АНТИФОСФОЛИПИДНЫЕ АНТИТЕЛА (АФЛ)
Антинуклеарные антитела (АНА) – гетерогенная группа аутоантител,
реагирующих с различными компонентами ядра
Международные рекомендации по методам
клиническому значению антинуклеарных антител
определения
и
Антинуклеарный фактор (АНФ)
1. «Золотым стандартом» и первичным скрининговым методом определения АНА в
сыворотке крови является непрямая реакция иммунофлюоресценции (НРИФ) с
использованием в качестве субстрата криостатных срезов мышиной или крысиной печени
(почек), либо клеток линии HЕp-2 (эпителиальные клетки рака гортани человека).
2. Применение стандартизованных HEp-2 клеток предпочтительнее, так как позволяет
существенно повысить чувствительность метода и достоверно описать различные типы
свечения ядра. При тестировании АНА методом НРИФ их традиционно обозначают как
антинуклеарный фактор (АНФ).
3. Оценка результатов НРИФ проводится с указанием максимального титра обнаружения
АНФ в исследуемых сыворотках, а также интенсивности и типа иммунофлюоресценции.
4. Характер свечения отражает присутствие различных типов АНА, в определенной степени
специфичных для ряда аутоиммунных РЗ.
Титры АНФ в норме и патологии
Норма < 1:40 при использовании
криостатных срезов печени или почек
лабораторных животных
Норма <1:160 при использовании
HЕp-2 клеток человека
Идентификация 95% больных аутоиммунными
ревматическими заболеваниями и здоровых лиц
АНФ-HЕp-2 в титре 1:40 выявляется у 25-30%,
1:80 у 10 – 15%,1:160 и выше у 5% здоровых людей.
Частота обнаружения АНФ повышается с возрастом, особенно у женщин.
Родственники больных аутоиммунными ревматическими заболеваниями
имеют титры АНФ ≥1:40 в 25-30% случаев.
Уровни позитивности АНФ-HЕp-2:
Низко позитивные титры:1:160
Умеренно позитивные титры: 1:320-1:640
Высоко позитивные титры: 1:1280 и более
E.M.Tan и соавт., Arthritis Rheum 1997;
40: 1 601-1611
Характеристика ядерных/цитоплазматических типов свечения
при определении АНА методом НРИФ-HЕp-2 (I)
Тип свечения
Аутоантигены
Заболевания
Частые типы свечения
Ядерное свечение
Гомогенное
Двухспиральная (дс) ДНК, гистоны,
хроматин/нуклеосомы, HMG (high mobility
group)
Системная красная волчанка (СКВ),
лекарственная волчанка/васкулиты, ювенильный
идиопати-ческий артрит
Крупное крапчатое
Sm, U1 – рибонуклео-протеин (РНП), ядерный
матрикс
Мелкое крапчатое
SS-A/Ro, SS-B/La, Scl-70, многие ядерные
антигены
СКВ, смешанное заболевание соединительной
ткани (СЗСТ), синдром Рейно, системная
склеродермия (ССД), синдром Шегрена (СШ),
недифференцированное заболевание
соединительной ткани
СКВ, СШ, ССД, воспалительные миопатии, СЗСТ
Центромерное
Кинетохор: CENP-A, B, C, F
ССД (лимитированная форма), синдром Рейно
Нуклеолярное
PM/Scl, РНК-полимераза, UРНП, U3-РНП, To/Th,
B23 фосфопротеин/нуматрин
ССД, синдром Рейно, воспалительные миопатии,
перекрестный синдром
Диффузное
Рибосомальный белок Р (RibP), Jo-1, другие
синтетазы трансферной (т) – РНК, частицы
сигнального распознавания (SRP)
СКВ, воспалительные миопатии
Мелкое крапчатое
Jo-1, SRP, пируватдегидрогеназа (PDH)
(митохондрии)
Воспалительные миопатии, дерматомиозит (ДМ),
первичный билиарный цирроз (ПБЦ),
интерстициальное поражение легких
Цитоплазматическое свечение
Agmon-Levin N. et al. Ann Rheum Dis 2013; doi:10.1136/annrheumdis-2013-03863
Характеристика ядерных/цитоплазматических типов свечения при определении АНА методом НРИФ-HЕp-2 (II)
Тип свечения
Плотное мелкое крапчатое
Плейоморфное крапчатое
клеточного цикла (PCNA)
Заболевания
СКВ, ревматоидный артрит (РА), ПБЦ,
воспалительные миопатии,
аутоиммунные заболевания печени
Здоровые лица, воспали-тельные
заболевания
Нуклеолярное (глыбчатое)
Вспомогательный белок ядерного
СКВ, лимфопролиферативные
антигена клеточной пролиферации: заболевания, СШ
фактор элонгации ДНК-полимеразы
дельта
U3-РНП (фибриллярин)
ССД
Множественное/редкое точечное
Sp100, PML-тельца, p80 -coilin
ПБЦ, хронический аутоиммунный
гепатит (ХАГ), СШ
Центросомы/центриоли (ранее:
аппарат веретена )
Митотическое веретено
Энолаза, нинеин, перицентрин
ССД, синдром Рейно, воспалительные
заболевания
РА, воспалительные заболевания,
микоплазменная пневмония
Дискретное крапчатое
Комплекс Гольджи
Цитоплазматические волокна
NuMa/центрофилин
Цитоплазматическое свечение
Эндосома (ранний эндосомальный
антиген -1), глицин-триптофан
(GW)/процессирующие тельца,
мультивезикулярные
тельца/лизосомы
Белки Гольджи/гольджины:
гиантин, гольджин 245, гольджин
110, гольджин 97, гольджин 95 и др.
Актин, цитокератин, топомиозин,
виментин
Неврологические заболевания, СШ,
СКВ, РА, ПБЦ, недифференциро-ванные
заболевания соединительной ткани
СКВ, СШ, РА, перекрестный синдром,
мозжечковая атаксия
ХАГ, ДМ, инфекционные и
воспалительные заболевания
Agmon-Levin N. et al. Ann Rheum Dis 2013; doi:10.1136/annrheumdis-2013-203863
Периферическое/краевое или
оболочки ядра
Аутоантигены
Редкие типы свечения
Ядерное свечение
Ламинины, LAP1/2gp210,
нуклеопорин р62, комплексные
антигены ядерной оболочки и
ядерных пор
DFS70/LEDGF-P75
Позиция
ACR
и
EULAR
в
отношении определения АНФ

Тестирование АНФ с помощью НРИФ при использовании в качестве субстрата HEp-2
клеток человека (содержащих 100-150 различных аутоантигенов)- «золотой стандарт»
и первичный скрининговый метод определения АНА в сыворотке крови

Другие скрининговые методы определения АНА (ИФА, мультиплексные технологии,
устанавливающие наличие в сыворотках антител к смеси ядерных антигенов,
увеличивают процент ложноотрицательных результатов и не могут заменить
тестирование АНФ с помощью НРИФ

Лаборатории, проводящие скрининговое определение АНА с использованием
различных методов твердофазного анализа ( ИФА, мультиплексные
диагностические платформы) должны предоставить данные о такой же или более
высокой чувствительности и специфичности этих техник по сравнению с АНФ-НРИФ,
а при расхождении результатов измерения АНА с клиническими данными
обязательно провести повторное исследование АНА с помощью НРИФ-HЕp-2

У пациентов с положительными результатами определения АНФ рекомендуется
проведение подтверждающих тестов на специфические АНА к отдельным ядерным
антигенам (нДНК, Sm, SSA/Ro, SSB/La, Scl-70, РНП), используя методы ИФА,
иммуноблота (ИБ), двойной иммунодиффузии (ДИД), контриммуноэлектрофореза
(КИЭФ) и др.

Некоторые типы АНА (антицентромерные, PCNA, антитела к митотическому аппарату
клетки-NUMA) обнаруживаются только методом НРИФ на HEp-2 клетках, что
исключает необходимость их дальнейшего исследования с помощью
подтверждающих тестов.

Методы определения АНА, анти-ДНК, анти-Sm и др. должны быть валидированы
согласно национальным (CDC) или международным ( WHO) стандартам.

В бланках выдачи результатов анализа следует указывать метод определения АНА.
Недостатки непрямой реакции иммунофлюоресценции - основного скринингового
метода определения антинуклеарных антител
» СУБЪЕКТИВНАЯ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ ТЕСТА
» НЕОБХОДИМОСТЬ ИНТЕНСИВНОГО ОБУЧЕНИЯ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ
ТИПОВ СВЕЧЕНИЯ
» ОТСУТСТВИЕ КВАЛИФИЦИРОВАННОЙ ЭКСПЕРТНОЙ ОЦЕНКИ
» ПОЛУКОЛИЧЕСТВЕННАЯ ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ СВЕЧЕНИЯ В ТИТРАХ
» ОТСУТСТВИЕ СТАНДАРТИЗАЦИИ СУБСТРАТОВ, РЕАГЕНТОВ, МИКРОСКОПА
Скрининг положительных и отрицательных результатов
НРИФ-HЕp-2
Helios (Aesku Diagnostics, Germany)
Image Navigator (Immuno Concept, USA)
Cytospot (Autoimmun Diagnostika, Germany)
http://www.aklides.com/
http://www.immcodiagnostics.com
http://www.aesku.com
Скриниг + классифиция основных типов свечения
клеточных структур
AKLIDES (Medipan, Germany)
Nova View (Inova, USA)
Zenit G Sight (A. Menarini Diagnostics, Italy)
Europattern (Euroimmun,Germany)
http://www.euroimmun.us
Автоматизированные системы интерпретации
клеточных флюоресцентных тестов – новый подход к
стандартизации и улучшению воспроизводимости
определения АНА и других аутоантител методом НРИФ
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ АНФ
ОЧЕНЬ ПОЛЕЗНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ:
СКВ (ДЧ:93%, ДС:57%, ОППР:2,2, ОПОР:0,11) (диагностический критерий СКВ)
ССД (ДЧ:85%, ДС:54%, ОППР:1,86, ОПОР:0,27)
ПОЛЕЗНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ:
СШ в сочетании с СКВ (ДЧ:48%, ДС:52%, ОППР:0,99, ОПОР:1,01)
МЕНЕЕ ПОЛЕЗНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ:
ПМ/ДМ (ДЧ:61%, ДС:63%, ОППР:1,67, ОПОР:0,61)
ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ КРИТЕРИЙ:
ЛЕКАРСТВЕННОЙВОЛЧАНКИ, СЗСТ, АУТОИМУННОГО ГЕПАТИТА
ОЧЕНЬ ПОЛЕЗНЫЙ ТЕСТ ДЛЯ ОЦЕНКИ ПРОГНОЗА И МОНИТОРИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ:
ЮВЕНИЛЬНОГО ХРОНИЧЕСКОГО АРТРИТА, ассоциирующегося с увеитом
ФЕНОМЕНА РЕЙНО, ассоциирующегося с системными РЗ
НЕ ИМЕЕТ ДОКАЗАННОГО ДИАГНОСТИЧЕСКОГО И ПРОГНОСТИЧЕСКОГО
ЗНАЧЕНИЯ ПРИ:
РА, РАССЕЯННОМ СКЛЕРОЗЕ, ЗАБОЛЕВАНИЯХ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ,
ИНФЕКЦИЯХ, ИДИОПАТИЧЕСКОЙ ТРОМБОЦИТОПЕНИЧЕСКОЙ ПУРПУРЕ
и ФИБРОМИАЛГИИ
Кратность определения АНФ
Согласно международным рекомендациям определение АНФ в
НРИФ нецелесообразно использовать для мониторирования
активности патологического процесса (отсутствие корреляции
большинства типов свечения, кроме гомогенного, с активностью
заболевания; измерение в титрах) и может проводиться с частотой
1 раз в 6 месяцев – 1 год
АНТИТЕЛА К ДВУХСПИРАЛЬНОЙ (НАТИВНОЙ) ДНК - СЕРОЛОГИЧЕСКИЙ МАРКЕР СКВ
Методы определения:
1. ИФА-первичный скрининговый тест.
2. Непрямая иммунофлюоресценция с Crithidia Luciliae
3. РИА (тест-Farr)
Crithidia Luciliae
подтверждающие
тесты
•
Норма.
ИФА < 10-20 МЕ/мл,
НИФ с Crithidia luciliae - < 1:10
РИА Farr < 7 МЕ/мл.
Клиническое значение
Полезный тест для диагностики СКВ у пациентов с положительными результатами
определения АНФ (ДЧ - 57,3%, ДС - 97,4%, ОППР – 44,6, ОПОР – 0, 49).
Обязательный диагностический критерий СКВ
Полезный тест для оценки активности патологического процесса (ДЧ - 66,0%, ДС - 66,0%,
ОППР – 4,14, ОПОР – 0, 51) и поражения почек (ДЧ - 86,0%, ДС - 45,0%, ОППР – 1,7, ОПОР – 0, 3)
Положительные результаты обнаружения антител к дсДНК позволяют достоверно
прогнозировать обострение нефрита при СКВ
При других ревматических заболеваниях тестирование антител к дсДНК не полезно, так как они
выявляются очень редко (≤5% случаев) и в низких титрах.
Кратность определения антител к дсДНК
Рекомендуемая частота определения антител к дсДНК
составляет 1 раз в 1-3 месяца при высокой активности,
1раз в 3-6 месяцев при низкой активности
Антитела к Sm (Smith) антигену
Sm антиген состоит из 5 малых ядерных (мя) РНК (U1, U2, U4, U5, U6),
связанных с 11 и более полипептидами (70 kd, A, B/B′, C, C′, D, E, F, G). При
СКВ антитела к Sm реагируют с B/B′ и D полипептидами, общими для U1,
U2, U4/U6 мяРНП, участвующих в сплайсинге пре-мРНК.
• Методы определения: ИФА, ИБ, ДИД и КИЭФ.
• Норма: ≤ 25 ЕД /мл при использовании ИФА (зависит от
рекомендаций фирмы-изготовителя коммерческих наборов
реагентов).
• Клиническое значение:
1. Специфичный серологический маркер и диагностический критерий
СКВ (ДЧ: 8-20%, ДС: 99%).
2. Не имеют пользы для оценки активности и характеристики
субтипов СКВ.
•
Кратность определения:
Рекомендуется однократное определение антител к Sm.
Антитела к SS-A/Ro
SS-A/Ro антиген – полипептиды 60 kDa и 52 kDa, образующие комплекс с RoРНК (hY1, hY3
и hY5).
•
Методы определения: ИФА, ИБ, ДИД и КИЭФ.
•
Норма: ≤ 25 ЕД /мл при использовании ИФА (зависит от рекомендаций фирмыизготовителя коммерческих наборов реагентов).
•
Клиническое значение:
1. Положительные результаты обнаружения антител к SS-A/Ro являются диагностическими
критериями первичного и вторичного СШ.
2. При беременности исследование сывороточного уровня антител к SS-A/Ro-52 kDa
полезно для прогнозирования риска развития полной поперечной блокады сердца у плода,
антител к SS-A/Ro – для прогнозирования риска развития неонатального
волчаночноподобного синдрома у новорожденных.
3. У больных СКВ положительные результаты тестирования антител к SS-A/Ro
ассоциируются с фотосенсибилизацией, поражением кожи, СШ, гиперпродукцией РФ.
•
Кратность определения:
Рекомендуемая частота определения антител к SS-A/Ro составляет 1 раз в 3 месяца.
Антитела к SS-B/La
•
•
•
SS-B/La антиген–нуклеоцитоплазматический комплекс 48 kDa фосфопротеина с Ro РНК
(hY1-hY5), являющийся терминальным транскрипционным фактором для РНК полимеразы
III.
Методы определения: ИФА, ИБ, ДИД и КИЭФ
Норма: ≤ 25 ЕД /мл при использовании ИФА (зависит от рекомендаций фирмыизготовителя коммерческих наборов реагентов)
Клиническое значение:
1. Положительные результаты обнаружения антител к SS-B/La являются диагностическими
критериями первичного и вторичного СШ
2. При беременности исследование сывороточного уровня антител к SS-B/La -48 kDa
полезно для прогнозирования риска развития полной поперечной блокады сердца у плода.
3. При СШ обнаружение антител к SS-B/La ассоциируется с выраженной лимфоидной
инфильтрацией слюнных желез и развитием экстрагландулярных проявлений (пурпура,
васкулит, лимфаденопатия)
4. При СКВ выявление SS-B/La ассоциируется с низкой частотой поражения почек
•
Кратность определения:
Рекомендуемая частота определения антител к SS-B/La составляет 1 раз в 3 месяца.
Антитела к U1РНП
Реагируют с белковыми компонентами (70 kDa, A и C) U1 малого ядерного
рибонуклеопротеина (U1 мяРНП).
•
Методы определения: ИФА, ИБ, ДИД и КИЭФ.
•
Норма: ≤ 25 ЕД /мл при использовании ИФА (зависит от рекомендаций фирмыизготовителя коммерческих наборов реагентов).
•
Клиническое значение:
1. Выявление антител к U1РНП в высоких титрах полезно для диагностики СЗСТ
(ДЧ: 95-100%, ДС- 98%).
2. Менее полезный маркер для диагностики СКВ (ДЧ - 30%, ДС - низкая).
3. Полезный маркер для прогнозирования неблагоприятного течения СКВ с развитием
тяжелого поражения внутренних органов.
•
Кратность определения:
Рекомендуемая частота определения антител к U1РНП составляет 1 раз в 3 месяца .
СКЛЕРОДЕРМИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА
Тип антител
Метод
определения
НРИФ
Антицентромерные
антитела
ВГН<1:160
КИЭФ, ДИД,
ИФА, ИБ
Антитела к SCL-70
ВГН≤25 ЕД /мл
Антинуклеолярные к:
PM-Scl
U3-РНП
РНК-полимеразе III
ДИД, ИП, ИБ
ИФА
ВГН зависит от
метода
определения
Клиническое значение
Диагностика ССД (ДЧ: 19-33%; ДС: 90-99,9%; ОППР 2,332,7; ОПОР 0,7-0,8), CREST синдрома (ДЧ: 60-65%; ДС: 8399,9%; ОППР 3,5-650; ОПОР 0,2-0,5); прогнозирование
лимитированного поражения кожи (ДЧ: 44%; ДС: 79-93%;
ОППР 2,1-6,1; ОПОР 0,6-0,7) и низкой вероятности
развития рентгенологических признаков легочного
фиброза (ДЧ: 12%; ДС: 71%; ОППР 0,41; ОПОР 1,2)
Диагностика ССД (ДЧ: 20-40%; ДС: 90-100%; ОППР 10-83;
ОПОР 0,6 - 1,5); прогнозирование диффузного
поражения кожи (ДЧ: 37-46%; ДС 81-85%; ОППР 2,0-2,7;
ОПОР
0,7-0,8),
высокой
вероятности
развития
рентгенологических признаков легочного фиброза (ДЧ:
43-45%; ДС: 81-83%; ОППР 2,3-2,5; ОПОР 0,7) и
нарушения функциональных легочных проб.
Ограниченное значение для диагностики и
прогнозирования течения ССД (чувствительность 1250%; специфичность 94-98%; ОППР 4-31; ОПОР 0,5-0,9)
Тяжелый почечный криз, «синдром трения сухожилий»,
тяжелое диффузное поражение кожи
Рекомендуется однократное определение склеродермических антител в сыворотке крови
МИОЗИТ-СПЕЦИФИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА
Высокая специфичность, но низкая чувствительность для диагностики ПМ/ДМ.
Частота обнаружения при ДМ/ПМ составляет 40%.
Тип антител
Метод
определения
Клиническое значение
Jo-1
ДИД, ИП,
ИФА, ИБ
Диагностический
критерий
ПМ/ДМ
с
антисинтетазным
синдромом
(острый
миозит,
интерстициальное поражение легких, лихорадка,
артрит, синдром Рейно, “рука механика” )
SRP
ДИД, ИП, ИБ,
ИФА
Диагностика ПМ, ассоциирующегося с острым
началом заболевания, тяжелым течением миозита,
кардиомиопатией
и
плохим
ответом
на
глюкокортикоидную терапию
Mi-2
ДИД, ИП,
ИФА, ИБ
Диагностика классического стероидчувствительного
ДМ с благоприятным прогнозом и редким развитием
опухолевого миозита
PM-Scl
ДИД, ИП,
ИФА, ИБ
Диагностика субтипа ДБСТ, включающего признаки
ССД, ПМ и поражение почек.
KJ
ДИД, ИП, ИБ
Диагностика миозита с синдромом Рейно и
интерстициальным поражением легких
Рекомендуется однократное определение
Ревматоидные факторы (РФ) - аутоантитела IgM, IgA и IgG классов,
реагирующие с Fc-фрагментом IgG
Наибольшее значение в клинической практике имеет определение
IgM РФ
Методы определения: реакция агглютинации сенсибилизированных IgG
частиц латекса (латекс-тест) или эритроцитов барана (реакция ВаалерРозе), иммунонефелометрия и ИФА
В
качестве
скринингового
теста
может
использоваться
полуколичественный
иммунохроматографический
экспресс-метод
измерения IgM РФ в цельной крови с помощью сухих тест-полосок
Рекомендуются количественные методы измерения IgM РФ в
международных
единицах
(МЕ/мл)
в
сыворотке
крови
(иммунонефелометрия, ИФА). Положительные результаты определения
IgM РФ полуколичественными методами (латекс-агглютинация), даже в
высоких титрах, всегда должны рассматриваться как низко
положительные
Нормальный уровень IgM РФ при тестировании сывороток с помощью
латекс-агглютинации составляет ≤1:40, нефелометрии ≤ 15 МЕ/мл, ИФА
≤20 МЕ/мл. Рекомендуется выделение негативных (меньших или равных
верхней границе нормы – ВГН); низко позитивных (≤3 ВГН) и высоко
позитивных (>3 ВГН) уровней IgM РФ
Клиническое значение IgM РФ
 Положительные результаты обнаружения IgM РФ в сыворотке крови
служат диагностическим критерием РА . При использовании
общепринятой ВГН (15-20 МЕ/мл) ДЧ составляет 50-90%, ДС: 80-93%,
ОППР: 4,86, ОПОР: 0,38. IgM РФ – чувствительный, но недостаточно
специфичный маркер для диагностики РА, так как обнаруживается в
сыворотках при других РЗ, хронических инфекциях, злокачественных
новообразованиях и в пожилом возрасте. Применение высоко
позитивных уровней IgМ РФ (>3 ВГН, т.е. ≥40-50 МЕ/мл)
сопровождается значительным увеличением его ДС (91-98%) и ОППР
(22,7) при РА
 IgM РФ в высокой концентрации является полезным маркером для
прогнозирования быстропрогрессирующего деструктивного
поражения суставов и системных проявлений при РА
 Тестирование IgM РФ позволяет прогнозировать эффективность
терапии ГИБП у больных РА. Серопозитивность по IgM РФ и высокий
уровень этого маркера в крови до начала лечения рассматривается в
качестве предиктора хорошего ответа на анти-В-клеточную терапию
ритуксимабом при РА
Кратность определения РФ при РА
У серонегативных по IgM РФ пациентов на ранней стадии РА
рекомендуемая кратность определения
данного показателя
составляет 1 раз в 3 - 6 месяцев, на развернутой стадии – 1 раз в
год, на поздней стадии – повторный анализ IgM РФ проводить
нецелесообразно. У низко/высоко позитивных больных по IgM РФ
кратность его определения должна составлять на ранней стадии
1 раз в 3 месяца, на развернутой стадии – 1 раз в 3-6 месяцев, на
поздней стадии – 1 раз в год
Антитела к цитруллинированным белкам (АЦБ)
Гетерогенная группа аутоантител, которые распознают антигенные
детерминанты филлагрина и других белков, содержащих атипичную
аминокислоту цитруллин, образующуюся в результате посттрансляционной
модификации остатков аргинина под действием фермента
пептидиларгининдеиминазы
Семейство АЦБ включает :
антитела к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП)
антиперинуклеарный фактор
антикератиновые антитела
антифиллагриновые антитела
антитела к цитруллинированному фибриногену
антитела к модифицированному цитруллинированному виментину (АМЦВ)
АЦБ обладают высокой ДС при РА. Среди АЦБ наиболее
стандартизованным маркером для ранней диагностики и оценки прогноза
РА являются АЦЦП
Методы определения АЦЦП
Стандартные методы определения АЦЦП в сыворотке крови:
• ИФА с использованием в качестве антигена синтетических циклических
цитруллинированных пептидов второго и третьего поколения (АЦЦП2 и
АЦЦП3)
• хемилюминисцентный и электрохемилюминисцентный анализ
• полуколичественный иммунохроматографический экспресс-метод в
качестве скринингового теста
ВГН при определении АЦЦП в сыворотке крови составляет
5-25
ЕД /мл в зависимости от фирмы-изготовителя коммерческих наборов
реагентов. Рекомендуется выделение негативных (≤ВГН); низко
позитивных (≤3 ВГН) и высоко позитивных (>3 ВГН) уровней АЦЦП
Клиническое значение определения АЦЦП (I)
 Положительные результаты обнаружения АЦЦП в сыворотке крови
служат диагностическим критерием РА
 АЦЦП – более высокоспецифичный диагностический маркер РА
(ДЧ: 49-91%, ДС: 73-99%, ОППР: 12,46-17,3, ОПОР: 0,36-0,2),
особенно, на ранней стадии болезни (ДЧ: 39-71%, ДС: 93-99%,
ОППР: 6,04, ОПОР: 0,74) по сравнению с IgМ РФ
 Определение АЦЦП имеет важное значение для диагностики
серонегативного по IgМ РФ РА (частота обнаружения АЦЦП у
IgМ РФ-отрицательных больных РА составляет 20-40%),
дифференциальной диагностики РА с другими РЗ
 Серопозитивность по АЦЦП является прогностическим маркером
тяжелого эрозивного поражения суставов при РА
 Прогностическая ценность АЦЦП в отношении развития
выраженной суставной деструкции у больных РА значительно
возрастает при совместном определении данного маркера c
“shared epitope” (SE) HLA DRB1*0101, 0104, 0404
Клиническое значение определения АЦЦП(II)
 Обнаружение АЦЦП в сыворотке крови служит предиктором
развития РА у здоровых лиц (ОР:15,9) и у пациентов с ранним
недифференцированным артритом (ОР: 25-37,8)
 Тестирование АЦЦП позволяет прогнозировать эффективность
терапии у больных РА. Серопозитивность по АЦЦП и высокий
уровень этого маркера в крови до начала лечения
рассматривается в качестве предиктора хорошего ответа на
терапию анти-В-клеточным препаратом ритуксимабом при РА
Кратность определения АЦЦП при РА
На поздней стадии РА исследование АЦЦП нецелесообразно.
У серонегативных по АЦЦП пациентов рекомендуемая кратность
определения АЦЦП на ранней стадии РА составляет 1 раз в 6
месяцев, на развернутой стадии – однократно. У АЦЦП-низко
позитивных больных исследование АЦЦП на ранней стадии РА
следует проводить 1 раз в 3-6 месяцев, на развернутой стадии –
1 раз в год. При высокой позитивности по АЦЦП на ранней и
развернутой
стадиях
РА
рекомендуется
однократное
исследование АЦЦП
Методы определения АМЦВ
Стандартным методом определения АМЦВ в сыворотке крови
является ИФА. В качестве скринингового теста применяется
полуколичественный иммунохроматографический экспресс-метод
на сухих тест-полосках для измерения АМЦВ в цельной крови
Верхняя граница нормы при определении АМЦВ с помощью
ИФА составляет 20 ЕД /мл . Рекомендуется выделение
негативных (≤ВГН); низко позитивных (≤3 ВГН) и высоко
позитивных (>3 ВГН) уровней АМЦВ
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ АМЦВ
 Положительные результаты определения АМЦВ в сыворотке
крови могут служить дополнительным диагностическим
маркером РА при отрицательных результатах определения
IgM РФ и АЦЦП в сыворотке крови. АМЦВ обладают более
высокой или сходной ДЧ, но меньшей ДС для диагностики
РА (ДЧ: 77%, ДС: 89%, ОППР: 7,24, ОПОР: 0,28) по
сравнению с АЦЦП
 Полезный маркер для прогнозирования тяжелого эрозивного
поражения суставов у больных РА (ОР: 7,3)
 Повышение
уровня
АМЦВ
в
большей
степени
ассоциируется с клинико-лабораторными показателями
воспалительной активности РА, чем АЦЦП
Кратность определения АМЦВ при РА
На поздней стадии РА исследование АМЦВ нецелесообразно.
у серонегативных по АЦЦП пациентов рекомендуемая кратность
определения АМЦВ на ранней стадии РА составляет 1 раз в 6
месяцев, на развернутой стадии – однократно. У низко/высоко
позитивных больных по АМЦВ исследование АМЦВ на ранней
стадии РА следует проводить 1 раз в 3-6 месяцев, на развернутой
стадии – 1 раз в 6 месяцев – 1 год
АНТИНЕЙТРОФИЛЬНЫЕ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА (АНЦА)
ГЕТЕРОГЕННАЯ ПОПУЛЯЦИЯ АУТОАНТИТЕЛ, РЕАГИРУЮЩИХ С ФЕРМЕНТАМИ ЦИТОПЛАЗМЫ НЕЙТРОФИЛОВ
цАНЦА РЕАГИРУЮТ С ПРОТЕИНАЗОЙ 3
пАНЦА РЕАГИРУЮТ С МИЕЛОПЕРОКСИДАЗОЙ
ПЕРВИЧНЫЙ СКРИНИНГОВЫЙ ТЕСТ
НРИФ с использованием фиксированных этанолом
нейтрофилов
норма < 1:16 – 1:20
цAНЦА
диффузный цитоплазматический
гранулярный тип свечения с большей
интенсивностью по направлению к ядру
нейтрофилов, чем к периферии
пАНЦА
Перинуклеарный цитоплазматический
тип свечения
aАНЦА
гомогенный диффузный цитоплазматический
тип свечения с окрашиванием
перинуклеарной зоны
нейтрофилов и моноцитов
ПОДТВЕРЖДАЮЩИЙ ТЕСТ
Определение антител к ПР3 и МПО с помощью ИФА. Нормальный
уровень цАНЦА и пАНЦА в сыворотке крови при использовании ИФА
составляет
менее 5,0-20,0 ЕД/мл (в зависимости от фирмыизготовителя коммерческих наборов реагентов).
Клиническое значение АНЦА
 Обнаружение цАНЦА методом НРИФ является высокоспецифичным
диагностическим маркером ГВ (ДЧ: 63-91%, ДС: 95-99%); менее
полезно для диагностики МПА и синдрома Черджа – Строс
 Положительные результаты определения пАНЦА методом НРИФ в
сочетании с ИФА МПО-АНЦА служат полезным диагностическим
маркером МПА (ДЧ: 50-75%, ДС: 80-98%), синдрома Черджа –
Строс, а также быстропрогрессирующего гломерулонефрита и
идиопатического альвеолярного геморрагического синдрома
 ДЧ АНЦА варьирует от 34% до 92% в зависимости от активности,
формы, стадии заболевания, распространенности патологического
процесса и проводимой терапии
 Отсутствие АНЦА при узелковом полиартериите
дифференцировать данную форму васкулита от МПА
Рекомендуемая частота определения цАНЦА/ПР3-АНЦА и
пАНЦА/МПО-АНЦА составляет 1 раз в 3 -6 месяцев
позволяет
АНТИФОСФОЛИПИДНЫЕ АНТИТЕЛА (АФЛ)
ГЕТЕРОГЕННАЯ ПОПУЛЯЦИЯ АУТОАНТИТЕЛ, РАСПОЗНАЮЩИХ АНТИГЕННЫЕ
ДЕТЕРМИНАНТЫ АНИОННЫХ И НЕЙТРАЛЬНЫХ ФОСФОЛИПИДОВ, И КОМПЛЕКСНЫЕ
ЭПИТОПЫ, ОБРАЗУЮЩИЕСЯ В ПРОЦЕССЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФОСФОЛИПИДОВ И
ФОСФОЛИПИДСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ
● АФЛ - серологический маркер антифосфолипидного синдрома
(АФС) и фактор риска развития тромботических осложнений и
акушерской патологии при данном заболевании.
● Лабораторные классификационные критерии АФС
- антитела к кардиолипину (АКЛ) классов IgG/IgM
- антитела к β2-гликопротеину I (аβ2-ГП I) классов IgG /IgM
- волчаночный антикоагулянт (ВА)
Методы определения антифосфолипидных антител
IgG/IgM АКЛ должны определяться в сыворотке в титрах, превышающих
40 GPL/MPL (или 99-ый процентиль у здоровых доноров), в 2 и более
исследованиях с интервалом не менее 12 недель с помощью
стандартного ИФА, позволяющего выявлять β2 – ГП I-зависимые АКЛ.
IgG/IgM аβ2-ГП I должны определяться в сыворотке с помощью
стандартного ИФА в диагностических титрах, превышающих 99-ый
процентиль у здоровых доноров, в 2 и более исследованиях с
интервалом не менее 12 недель.
ВА должен определяться в плазме в 2 или более исследованиях с
интервалом
не
менее
12
недель
в
фосфолипидзависимых
коагуляционных тестах стандартным методом, включающим несколько
этапов:
(а) Удлинение фосфолипидзависимого свертывания крови при
использовании скрининговых коагуляционных тестов (АЧТВ, каолиновый
тест, тест с ядом гадюки Рассела);
(б) Отсутствие нормализации времени свертывания по данным
скрининговых тестов при смешивании с нормальной, лишенной
тромбоцитов плазмой;
(в) Нормализация удлиненного времени свертывания крови при
добавлении избытка фосфолипидов;
(г) Исключение других коагулопатий (наличия в крови ингибиторов
фактора VIII или гепарина).
Верхние границы нормы при определении АФЛ
ВГН при определении IgG/IgM AКЛ и IgG/IgM аβ2 - ГП I значительно варьирует в
зависимости от фирмы-изготовителя коммерческих наборов реагентов.
Рекомендуемая ВГН для АФЛ соответствует 95-ому процентилю 1
На !3 международном конгрессе по АФЛ 2010 г. рекомендовано выделение негативных
(≤ВГН), низко позитивных (95 - 99 процентили), умеренно позитивных (99-ый
процентиль – 80 GPL/MPL) и высоко позитивных (>80 GPL/MPL) уровней IgG/IgM АКЛ 1;
негативных (≤ВГН) и позитивных (>ВГН) уровней IgG/IgM аβ2 - ГП I 1
Наши данные:
Уровни IgG/IgM АКЛ
ВГН - 20 GPL/ MPL
- Негативные ≤20 GPL/ MPL
- низко позитивные 20-35 GPL/ MPL
- умеренно позитивные 35-65 GPL/ MPL
- высоко позитивные >65 GPL/ MPL
Уровни IgG/IgM аβ2 - ГП I
ВГН -12 ЕД/мл
- негативные ≤12 ЕД/мл
- позитивные > 12 ЕД/мл
1. Lakos G. et al. Arthritis Rheum 2012;64:1-10, DOI 10.1002/art.3349
Клиническое значение АФЛ
 IgG аКЛ (ДЧ: 45-68%; ДС: 71-75%) и IgM аКЛ (ДЧ: 35-69%; ДС:
72-81%) имеют умеренную чувствительность, но низкую
специфичность для диагностики АФС.
 ВА (ДЧ: 29-59%; ДС: 81-86%) и IgG/IgM аβ2 - ГП I (ДЧ: 23-60%;
ДС: 83-97%) являются более специфичными, но менее
чувствительными диагностическими маркерами АФС по
сравнению с IgG/IgM аКЛ.
Рекомендуемая кратность определения ВА, IgG/IgM АКЛ, IgG/IgM
аβ2-ГП I при АФС составляет 1 раз в 3-6 месяцев.
Стандартные профили аутоантител для диагностики РЗ
1
СИСТЕМНАЯ
СКЛЕРОДЕРМИЯ
1
СМЕШАННЫЕ
ЗАБОЛЕВАНИЯ
СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ
ТКАНИ
1
ПОЛИМИОЗИТ/
ДЕРМАТОМИОЗИТ
1
АНТИФОСФОЛИПИДНЫЙ
СИНДРОМ
1
2
3
3
2
▲
2
▲
2
3
3
2
2
2
3
2
3
3
3
2
▲
▲
2
2
1
▲
2
РЕВМАТОИДНЫЙ
АРТРИТ
1
ВАСКУЛИТЫ С
ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫМ
ПОРАЖЕНИЕМ СОСУДОВ
МЕЛКОГО КАЛИБРА
ЗАБОЛЕВАНИЯ
СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ
ТКАНИ
1
1
3
3
3
АЦЦП
3
3
2
▲
▲ ▲доказательности
▲ A
уровень
2
аКЛ
PR3-АНЦА
MPO-AНЦА
АНЦА-НИФ
ariboРНП
aJo-1
aScl-70
aSSA/SSB
▲
▲
▲ ▲
3
IgM РФ
2
aU1РНП
aSm
▲▲
▲ ▲
2
3
2
1
▲▲
2
3
2
1
▲
2
1
1
A.S.Wiik et al., Arthritis Rheum.,2004,51,291-298
СИНДРОМ ШЕГРЕНА
1
aβ2-ГПI
СИСТЕМНАЯ КРАСНАЯ
ВОЛЧАНКА
анДНК
ДИАГНОЗ
АНА-НИФ
АЛГОРИТМ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ САРЗ
«Alegria» - автоматический иммуноферментный анализатор для
лабораторной диагностики САРЗ (I)
ANA Detect (антиядерные АТ к 26 антигенам)
ANA Screen (антиядерные антитела скрининг)
ENAscreen (экстрагируемые ядерные антитела)
Антитела к SS-A (Ro)
Антитела к SS-A-52
Антитела к SS-A-60
Антитела к SS-B (La)
Антитела к Sm
Антитела к RNP/Sm
Антитела к RNP-70
Антитела к Scl-70
Антитела к Jo-1
Антитела к B
Антитела к нуклеосоме
Антитела к гистону
Антитела к Rib-P
Антитела к дс ДНК (IgG)
Ревматоидный фактор (IgA)
Ревматоидный фактор (IgG)
Ревматоидный фактор (IgM)
Антитела к модифицированному цитруллинированному виментину (Anti-MCV)
Антитела к циклическому цитруллинированному
Пептиду (Anti-CCP)
Антитела к C1q-компоненту комплемента
Антитела к базальной мембране клубочков (AntiGBM)
ANCA скрининг (антигены PR3, MPO)
Антитела к протеиназе 3 (Anti-PR3)
Антитела к миелопероксидазе (Anti-MPO)
Антитела к BPI
Антитела к эластазе
Антитела к катепсину G
Антитела к лизоциму
Антитела к лактоферрину
Антитела к митохондриям (AMA-M2)
Антитела к кардиолипину (IgA)
Антитела к кардиолипину (IgG)
Антитела к кардиолипину (IgM)
Антитела к кардиолипину (скрининг)
Антитела к s2-гликопротеину (IgA)
Антитела к s2-гликопротеину (IgG)
Антитела к s2-гликопротеину (IgM)
Антитела к s2-гликопротеину (скрининг)
Антитела к протромбину (IgA)
Антитела к протромбину (IgG)
Антитела к протромбину (IgM)
Антитела к протромбину (скрининг)
Анти-фосфолипид (скрининг) (IgG)
Анти-фосфолипид (скрининг) (IgM)
Антитела к фосфатидилсерину (IgG)
Антитела к фосфатидилсерину (IgM)
Антитела к фосфатидилинозитолу (IgG)
Антитела к фосфатидилинозитолу (IgM)
Антитела к фосфатидиловой кислоте (IgG)
Антитела к фосфатидиловой кислоте (IgM)
Антитела к аннексину V (IgG)
Антитела к аннексину V (IgM)
«Alegria» - автоматический иммуноферментный анализатор
для лабораторной диагностики САРЗ (II)









Процесс определения аутоантител полностью автоматизирован
Высокая аналитическая чувствительность и воспроизводимость
Встроенная калибровка и контроль качества в каждом стрипе
Свободный и гибкий выбор тестов для диагностики
аутоиммунных заболеваний
Возможность индивидуальной панели тестов для каждого
пациента
Возможность одновременного исследования от 1 до 30
образцов
Время выполнения анализа всего 90 минут
Два формата тест-систем – 12 и 24 исследования
Отпадает необходимость накапливать образцы днями и
неделями
Лабораторные маркеры воспаления
СОЭ
СРБ
SAA
Гаптоглобин
Ферритин
Фибриноген
Прокальцитонин
Кальпротектин
СОЭ
● Высокочувствительный, но неспецифичный и нестабильный
маркер системного воспаления. На результаты определения СОЭ
влияют
возраст,
пол,
уровень
фибриногена,
РФ,
гипергаммаглобулинемия, анемия и др. факторы.
●
Рекомендуется международный метод определения СОЭ по
Вестергрену как наиболее чувствительный при повышении СОЭ.
●
Верхняя граница СОЭ в норме по Вестергрену зависит от
возраста и пола, рассчитывается по формуле: для женщин СОЭ
(мм/час)=(возраст в годах+10)/2; для мужчин СОЭ (мм/час) =
(возраст в годах)/2.
Клиническое значение СОЭ
● Увеличение СОЭ служит лабораторным классификационным
критерием РА
● Повышение СОЭ>50 мм/час является классификационным
критерием гигантоклеточного артериита (ДЧ: 95%)
● Повышение СОЭ>35 мм/час является диагностическим
признаком ревматической полимиалгии (ДЧ: 95%)
● Определение СОЭ может быть полезным для оценки
активности воспаления при гигантоклеточном артериите,
ревматической полимиалгии (используется при подсчете индекса
SDAI PMR) и РА (используется при подсчете индекса DAS)
СРБ
Классический острофазовый белок плазмы крови, который
рассматривается как наиболее чувствительный лабораторный маркер
инфекции, воспаления и тканевого повреждения
В зависимости от цели исследования определение концентрации СРБ
проводится классическими и высокочувствительными методами
● Классические методы количественного анализа СРБ в сыворотке
крови, включая радиальную иммунодиффузию, иммунотурбидиметрию
и иммунонефелометрию, предназначены для выявления повышенного
уровня СРБ при остром воспалении и тканевом повреждении в
пределах диапазона концентраций 5-500 мг/л
●
Высокочувствительный анализ СРБ (вчСРБ), основанный на
усилении аналитической чувствительности иммунохимических методов
(иммуноферментного, иммунотурбидиметрического и
иммунонефелометрического) в 10 и более раз с помощью специальных
реагентов, позволяет измерять концентрации СРБ ниже 5 мг/л и
используется для оценки базального уровня вчСРБ и связанного с ним
кардиоваскулярного риска
Верхние границы нормы при определении СРБ
● В норме у 50% здоровых доноров концентрация СРБ в
сыворотке крови составляет 0,8 мг/л, у 90% -3,0 мг/л, у 99% - 10
мг/л
● Нормальный уровень СРБ составляет менее 5 мг/л (значения,
превышающие 3 мг/л, могут указывать на высокий риск развития
кардиоваскулярной патологии)
● Индивидуальная базальная концентрация СРБ достаточно
стабильна и не подвержена циркадным изменениям
Клиническое значение СРБ
● Оценка активности патологического процесса у больных САРЗ (при
подсчете индексов активности DAS 28-СРБ и SDAI)
●
Мониторирование
и
контроль
эффективности
терапии
интеркуррентных инфекций при СКВ, ССД, ДМ и др. САРЗ с
незначительным повышением или нормальным уровнем СРБ
● Дифференциальная диагностика САРЗ (СКВ и РА)
● Лабораторный классификационный критерий РА
● Увеличение базальной концентрации СРБ является предиктором
развития рентгенологических изменений, свидетельствующих о
тяжелом деструктивном поражении суставов при раннем РА
● Базальный уровень вчСРБ позволяет стратифицировать больных РЗ
по степени кардиоваскулярного риска
Причины несовпадения результатов определения СОЭ и СРБ
1. На результаты определения СОЭ влияет множество факторов.
СРБ – более стабильный, валидированый и воспроизводимый маркер воспаления.
2.
СОЭ - непрямой метод измерения уровня острофазовых белков плазмы крови.
СРБ - более специфичный маркер воспаления, т.к. его синтез в гепатоцитах стимулируется
провоспалительными цитокинами (ИЛ-1, ФНО-α и ИЛ-6)
3.
Изменения СОЭ (через 10 дней) развиваются медленнее, чем СРБ (через 1-2 дня)
4.
У СРБ диапазон изменений концентраций в крови больше, чем у СОЭ
5. Основные факторы несовпадения СОЭ и СРБ – инфекции, почечная
недостаточность, гипоальбуминемия
Clinical and Experimental Rheumatology 2007; 25; 746-749
Кратность определения СОЭ и СРБ при РЗ
активность
высокая
1-2 раза в месяц
умеренная
1 раз в 3 месяца
низкая
1 раз в 3 мес/6 мес
Гиперферритинемия
(концентрация ферритина >500-1000 нг/мл)
 Увеличение сывороточной концентрации ферритина >10000 нг/мл является
чувствительным (90%) и специфичным (96%) маркером для диагностики
синдрома активации макрофагов (MAS) (формы гемофагоцитарного
лимфогистиоцитозе - HLH)
 Увеличение сывороточной концентрации ферритина в 5 раз >5000 нг/мл) в
сочетании со снижением уровня его гликолизированной формы по
сравнению с нормой (20% vs 50-80%) является полезным маркером для
диагностики болезни Стилла у взрослых (специфичность 93%)
 Синдром системного воспалительного ответа (SIRS), тяжелый сепсис
 Катастрофический антифосфолипидный синдром (CAPS)
Agarval M., Sawhney S. Indian J Pediatr. 2010; 77:1011-16
Breda L., Nozzi M., De Sanctis S., Chiarelli F. doi:10.1016/j.semarthrit.2008.12.001
Mehta J. Pediatr Clin N Am. 2012; 59: 263-84
►
SAA (сывороточный амилоидный белок А) - полезный
серологический маркер для прогнозирования выживаемости
больных с вторичным амилоидозом (более, чем 6-летняя
выживаемость отмечена у 95% больных с концентрацией
SAA в сыворотке <10 мг/л и только у 40% больных с
концентрацией SAA в сыворотке >10 мг/л)
►
Прокальцитонин – (в концентрации >1 нг/мл) полезный
серологический маркер для диагностики сепсиса и
бактериальной инфекции, дифференциальной диагностики
сепсиса с обострением аутоиммунных ревматических
заболеваний
►
ЛАБОРАТОРНЫЕ МАРКЕРЫ ВОСПАЛЕНИЯ: НОВЫЕ ДАННЫЕ
Кальпротектин – независимый
поражения суставов при РА
предиктор
эрозивного
Заключение
 Стандарты лабораторной диагностики системных аутоиммунных
ревматических заболеваний (САРЗ), основанные на принципах
доказательной медицины, обеспечивают оптимальное использование
лабораторных тестов для ранней диагностики, оценки активности, тяжести
течения, прогноза болезни и эффективности терапии
 Среди лабораторных биомаркеров САРЗ наибольшее клиническое значение
имеют аутоантитела и острофазовые показатели
 Поскольку большинство иммунологических лабораторных тестов имеет
недостаточную специфичность, назначение и оценка результатов
лабораторных исследований должна проводиться в строгом соответствии с
предполагаемым диагнозом и данными тщательного клинического
обследования больных
БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ