close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

...Ð°Ð½Ñ Ð¸Ñ ÐµÐ»Ð° к. Ð´Ð¸Ñ Ñ ÐµÑ ÐµÐ½Ñ Ð¸Ñ Ð¾Ð²Ð¾Ñ Ð½Ñ Ð¼ Ð»Ð½Ñ Ð¸Ð³ÐµÐ½Ð»Ð³/» Ð»ÐµÐ¹ÐºÐ¾Ð·Ð¿Ñ Ñ ÐºÐ»ÐµÑ Ð¾Ðº

код для вставкиСкачать
•''
L
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР
ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА
II ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНА1МЕНИ
ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР
На правах рукописи
НОВИКОВА Наталья Николаевна
УДК G15,373.()3:616.155.3'J2-078.333
ГИБРНДОДШГ, ПРОДУЦИРУЮЩИЕ
МОИОКЛОИАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К.
ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫМ ЛНТИГЕНЛГ/»
ЛЕЙКОЗПЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
11.00.29 — Гематология и перелнвапие иропи
А в т о р е ф е р а т
диссертации па соискание ученой степени
кандидата медицннсгснх паук
Москва — 1990
'^/
/
/
/
У
Работа выполнена по Всесоюзполг ордена Ленина и ор­
дена Трудового Красного Знамени гематологическом науч­
ном центре Министерства здравоохранения СССР.
Н а у ч н ы й
р у к о в о д и т е л ь
доктор медицинских наук Т. И. Булычева
О ф и ц и а л ь н ы е
о п п о н е н т ы :
доктор медицинских наук А. 10. Барышников
доктор медицинских наук, профессор Л. Г. Румянцев
Ведущая организация — 2-й Московский ордена Ленина
государственный медицинский институт им. Н. И. Пирогова.
Защита диссертации состоится « i . •л'^-^^^^о^
1990 г.
в .'f^."". час. на заседании специализированного сове
К 074.08.01 во Всесоюзном ордена Ленина и ордена
Трудового Красного Знамени гематологическом научном
центре МЗ СССР (Москва, 125167, Новозыковский проезд,
Д. 4а).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Все­
союзного гематологического научного центра.
Автореферат разослан « - * ! »
Ученый секретарь
специализированного совета
кандидат биологических наук
^^.^^fb^.
. 19с0От.
В. Д. Реук
- ! ,^. ^^ ,
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Иммунологическое исследоване клеток крови человека с определением их специфичеспх антигенных CTpyjcTyp является одним из вазкных иаравлений в изучении гематологических заболеваний. В ре)Глътате Taicnx работ в последние десятилетия полу^гены
овые характеристики клеточных поверхностных молекул,
эторые экспрессированы па лимфоидных и штелоргдгтых
летках. Применение этих маркеров способствовало тгакопению данных и расширению' представлений о природе
роисхождения гемсбластозов (Абелев Г. И., 1982; БарышtiKOB А. Ю., 1984; Булычева Т. И., 1979; Foori К., et. nl.,,
982; McCuIIoch Е., 1983; Rlh J., Grlf[ln J., 1983). .
Открытие принципов и разработок технологии слияния
поток с получением длительношивущих гибридных штамов{КбЫегО,, С Milstelr), 1975), продуцирующих монокло1льнБ1е антитела (ЛЖА) против поверхностных антигеных детермина1гг, предоставили возможности для решения
погих проблем по созданию высокоэффективных реагензв, пригодных для иммунологических исследований в лейэзологии на качественно новом уровне. Использование
[КЛ лозволяст устаяовить связь опухолевых клеток о их
эрмальными партнерами и, следовательно, выявить урознь блока дифференцировк]! и степень зрелости бластов,
) есть идентифицировать антигенные структуры клеток
юкачественного клопа в пределах морфологически одноэдных лс!1козов и лимфосаркои при однотипной к.пинпмест картине заболевания (Барышников Л. Ю., 1984; Булызва Т. И., и соавт., 1989; Ветрова Е. П. и соавт., 1987;
адагидзе 3. Г. и соавт., 1987; Митерев Г. ГО., 1987;
гехГег Н., ct. а[, 1983; F,)o;i К., Toll R, [<JV3; Kmpp \V.
. a[, 1989).
Следовательно, внедрение MKA в. практику гематологии
юсобствует проведению ранней диагности, определяет
^фференцированный подход, к лечению больного, тает-ику
о ведения и прогноз течения болезни.
Более того, в силу высокой специфичности, аффинности
цитотоксичности некоторые МКА начали применять в
!чебных целях для экстракорпоральной обработки опухо;ЕЫХ клеток (чаще всего коетного мозга при аутотрансгантации), при введении свободных МКА в организм- че)века или же соединений: МКА с химиопрепаратамя, токшами и другими агентами, избирательно дейстующими
на бластные клетки in vitro или in vlvo|BalI, Е., et. al
1986; Kaufmann V. et., al., 1981; Lowder J., et. al., 198
de Rie M., et. a!.. 1988).
Ha сегодняшний день в мире известно около тыея
гибридных клеточных штаммов, секретирующих МКА
дифферёнцировочным антигенам гемопоэтических
клет
человека (Кпарр \^., е1, а!., -1989). В нашей стране с ь
чала восьмидесятых годов начато получение МКА к с
дельным антигенам клеток лимфо- и миелопоэза (Барьи
ников А. Ю., 1988; Ветрова Е. П. и соавт., 1987; К р ы »
нов М. А., 1986; Филатов А. Б. и соавт., 1986). Однако п
всем разнообразии имеюш,ихся МКА спектр их реагирон
ния не позволяет в полной мере оценить характеристи
всех антигенов клеток крови при различных формах ле
козов и лимфосарком.
. Таким образом, следует, что получение новых гибриде
продуцирующих МКА к дифферёнцировочным антиген;
различных типов клеток на разных стадиях гемопоэза, пр
должает оставаться чрезвычайно актуальной проблемой
Диссертационная работа выполнена в рамках задан:
Государственного комитета по науке и технике при С
вете Министров СССР «Разработать получение биотехь
логическими методами моноклоиальных антител к ант
генам лейкозных клеток человека и получить опытные па
тии препаратов» № Гос. регистрации 01.85.0075.343 и я
ляется частью
Государственной
целевой
програмл
0.69.05.02,01
«Лейкозы
человека
и
животных»,
0.69.07.03.02.04.НЗ и 0.69.07,03.02.02.Н1, Н6, Н7 — «Иммун
логин и медицинская генетика», 0.Ц.043 — «Биотехнологи;
а т а к ж е выполнялась по заданию НТС СЭВ — 3.5.3.
Целью работы явилось получение штаммов мышинг
гибридных клеток, продуцирующих МКА оригинальн'
специфичности, направленных к дифферёнцировочным а
тигенам клеток крови здоровых и больных лейкозами л)
дей.
Задачи работы:
1. Получить методами гибридомной биотехнологии
системе мышь х мышь штаммы перевиваемых гибридна
клеток, секретирующих МКА к поверхностным антигена
л и м ф о и д н ы х клеток крови здоровых лиц и больнь
острыми лимфобластиыми лейкозами.
2. Получить методами гибрхедомной биотехнологии в
;теме мышь х мышь штаммы перевиваемых
гибридных
еток, секретирующих МКА к поверхностному антигену
еток крови больных о с т р ы м
миеломонобластг м лейкозом.
3. Изучить характеристики полученных
гибридных
аммов, их морфологические свойства, особенности роста
:ультуро и в организме животных.
4. Оценить специфичность полученных МКА и опредогь их пригодность для иммунодиагностики гематологн;ких заболеваний человека.
Научная новизна. Получены два новых штамма мышиX гибридных клеток 1ЬМ2 и 2 G 3 . Изучены морфологичесг, культуральные свойства этих Г11бридом, особенности
роста в организме животных.
Исследована специфичность МКА ВСА-16, секретируеIX гибридомой 1F12, и МКА ВСА-09, продуцируемых гиб!^ными клетками 2Q3. Установлено, что полученные МКА
А-16 выявляют поверхностный антиген, присутствую1Й на Т-лимфоцитах, ФГА-стимулированных лимфоцитах
риферической крови и тимоцитах здоровых людей, а
еже на бластных клетках больных Т-лимфоидными неоазиями (острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) пре-Т- и
гипов, хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) Т-типа, л и м ф о жома Т-типа) и на лейкозных клетках больных ХЛЛ
типа (Авторское свидетельство на изобретение № 1483946).
ределено, что полученные МКА ВСА-09 выявляют антиI бластных клеток крови больных острым миеломоноастным лейкозом (ОММЛ).
Доказана практическая ценность МКА ВСА-16 и, ВСА-09
я уточненной иммунологической диагностики гемобласюв.
Теоретическое и практическое значение. Научные рельтаты, представленные в работе, имеют важное теорети:кое и практическое значение — получены новые штамI гибридных клеток 1F12 и 2U3, являющиеся пригодны: для создания препаратов МКА ВСА-16 и ВСА-09 в л а эаторном и промышленном производстве, которые могут
ть рекомендованы в кач.естве реагентов, используемых
диагностической панели при
иммунофенотипировании
1СТНЫХ клеток больных лейкозами и лимфосаркомами.
-
4 -
Полученные штаммы гибридом 1F12 и 2 0 3 зарегистр!
рованы и хранятся во Всесоюзноом банке клеточных кул1
тур Института цитологии АН СССР под NiA"?. В С К К / Ш - П
и 130.
МКА ВСА-16 внедрены и применяются в Рижском мс
дицинском институте, институте клинической иммунологи
СО АМН СССР, детском краевом гематологическом отделе
НИИ ГДЕ № 1 г. Краснодара, в клинико-радиоиммунолоп:
ческой лаборатории ВОНЦ АМН СССР, в МОНИКИ т
М. Ф. Владимирского. МКА BCA-1G и ВСЛ-09 включены
диагностическую панель в лаборатории клинической имму
нологии ВГНЦ МЗ СССР.
Апробация работы состоялась на заседании проблемно
комиссии «Экспериментальная гематология, физиология
патофизиология системы крови, биотехнология» Всесоюз
ного гематологического научного центра М З СССР 30 июн
1989 г. Основные положения работы были доложены н
Всесоюзной научной конференции «Иммунология и иммуно
терапия человека и животных» в г. Самарканде в 1984 г
на научной конференции ЦНИИГПК М З СССР «Новые ме
тоды лабораторной диагностики в гематологии и транс
фузиологии» в г. Москве в 1986 г., на 58 научной сесси.
ЦНИИГПК МЗ. СССР в г. Москве в 1986 г., на Всесоюзно:
конференции «Актуальные вопросы диагностики заболева
НИИ системы крови» в г. Сухуми в 1988 г.
Публикации. Материалы диссертации изложены в ав
торском свидетельстве на изобретение и в 5 научных ра
ботах.
Структура и объем работы. Диссертация изложена н;
страницах машинописного текста, состоит из введения, об'
зора литературы, описания материалов и методов исследо­
ваний, изложения собственных данных, заключения, выво­
дов и библиографического указателя, включающего
ис
точника литературы, в том числе
отечественных и
иностранных. Работа иллюстрирована
таблицами и
рисунками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В основу работы был положен принцип
гибридизации Kohler и Mijstein 1975J.
соматическое
Опыты проводились на м ы ш а х линии ВА1В/с.
Для получения гибридом, продуцирующих МКА антилимфоцитарной направленности, животных четырехкратнс
муппзировали лезхкоциталт больной Т-л11!М(])осарко1\1ой
и наличии в анализе тгрови 1!]-',0х 1()'''л jieiucounTon, П2'''
мфоцптоБ, 11,5™) пролимфоиитов и ?."'< лп1мфобласто15.
Для получения гибридом, cci:pcTnpyioijpix МКА против
зерхпостпых аптигспов^тслоидпых 1СЛсто1С, гилшей ruiTii1ТПО иммунизировали бластпХ'Пли клсткамтг ис!>иг})еричес4. крови больной ОММЛ, в гемограмме ijoTopofi оиределсс'ь В9,0х10' л лсГвчопитов и Oa'^i бластиых клеток.
илунисацию проводили в дозе 10x10''. клсток'м1лииз, i^eмупиоацию — по 5 х 10'' клеток/мт.тшь повторяли млогоатпо с различти.!мп !П1тсрЕалами. Послодшою реиммупицио вьи1о.Л1И7ли за ?> дил до слияния.
Спленоциты иммунных мышей сливали с клетками м ы 1Н0Й .МИС.ЛО.МЫ ¥'3 X 63.Ал8.053 в соотиошепиях 1:1,25 при
пучс.'ши МКА к а}1тигепам лнмфоидных клеток и 1:1,8
при получепш! Г\11чЛ к антигенам ителоидных клеток
Э13И больных гемобластозами (мислом1нлс клетк;!: селезеЧ1НЛС 1:летки).
Сливающим агентам являлся 45% раствор полиотиленпсоля 1550 с молекулярной массой 1300—1600 ( „Serva"),
После процедуры слияния ооьеднненпые клетки помс1ли в ?.и{кролу£П<и 3—1-х 96-лупочных плоскодонных
ат и выращивали в селективной среде при температуре
"С п атмос1.])ере 5% СОг и абсол10т,(юй злаясности.
Гибридомь-!, продуц!1рук:1ии1е антитела, дпал^'ды клонивали дтетодом лит.титируюншх разведений. Растундпе гибдог.пл. стабильно секрстзирути1не ?.1КА, выводили в масзую культуру 25—ЗО-кратпым .nacCiipoBani'ieM ill vitro.
Для получеинл высохсих концентраций RIKA, секретиющие их штамгьы гибридных клеток, вырандивали в ф о р асцитной опухоли в брюннюй полости мышей с предватольпым введением впутрибрютнинно 0,5 мл пристана.
Иммунологическое тестирование полученных МКА к ангенам мембран различных типов клеток, выделехшых от
оровых и больных геиатологич£с;и1ми заболеваниями л ю л, проводили в 1,н1кролукоч1;ой "юдификации реакц1Н1
прямой И1\н,1унофлюоресценции (РНИФ) с оценкой рельтатос па флюоресцентггом ми::роскопе и на лазерном
оточнои цитофлюориметре (EPIC^—С, «Coultronics"
НА), (под руководством с.н.с, K.JNLH. г. Ю. Митерева, при
-
6—
участии м.н.с. М. С. Новиковой и инженера Л. PL Корш
нова).
Для определения класса иммуноглобулинов (К] ) мыг
полученных МКА использовали иммуносорбентный метэнзим-меченых антител ( E l l S A ) с использованием антит
к 1 q мышей и пероксидазмеченых козьих антител к 1
кроликов (набор фирмы « Calbioche.ii », 1Ивейцария),
выполненный совместно со с.н.с, к.ы.н, Г. Ю. Митеревы
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
ГИБРИДОМЫ, ПРОДУЦИРУЮЩИЕ МКА
АНТИЛИМФОЦИТАРНОЙ НАПРАВЛЕННОСТИ
В результате гибридизации по получению МКА ант
лимфоцитарной направленности в 4-х платах выросло CBI
ше 300 гибридных клонов. Первичному скринингу
Р Н И Ф было подвергнуто 212 образцов культуральных ж и
костей на присутствие антител к поверхностному антиге]
клеток-мишеней больной Т-лимфосаркомой, используемь
в качестве иммуногена. При этом было выявлено 68 ант)
телсекретирующих гибридом, из которых для дальнейше
реклонирования был отобран *31 гибридный штамм с ai
тивной секрецией. В результате клонирования 6 гибриде
роста не дали, у 9 гибридом продукция антител прекрат)
лась. По мере многократного пассирования в культуре ей
четыре и з 16-ти утратили способность секретировать 1
Две гибридомы продуцировали панлейкоцитарные антит
ла. МКА еш,е двух гибридных клонов реагировали толы
с клетками-мишенями. У остальных 10 гибридных штаг
мов во время изучения сг1ецифич1шсти их МКА диагност]
ческая значимость не была установлена.
При детальном изучении характеристик
нолученнь
гибридных клонов было опреде.лехю. что наибольший и:
терес среди них по спектру реагирования супернатант<
представляет штамм мышиных гибридных клеток i F l ,
продуцируюш;ий МКА оригинальной специфичности, на
ванные ВСА-16 (Blast cells antigens).
Гибридома U'^IS, продуцирующая МКА ВСА-16, бьи
выявлена на 12-е сутки после гибридизации, дважды рекл'
нирована и культивирована в течение 40 пассажей с ти'
ром антител 1:100. Пассирование гибридоыы 1РГ2 в орг;
низме животных вначале проходило через стадию соли/
_ 7 -
IX опухолей и только спустя 3'—4' пассажа происходило
|рмирование асцита с титром антител 1:1000' — 1:5000'.
Штамм клеток 1F12 имеет вид стандартной суспензии-с
рактерной для аитителпродуцирующих к у л ь т у р морфо-гией, сохраняет после криоконсервиропания и размораinnmin способность расти в культуре и в организме м ы ni со. стапилыюй секрецией МКА ВСА-16 1 (|(i] изотипа.
В результате- изучения, спектра! реагирования полунснIX TVIKA BCA-1G с рааличными! плетками-мипшнями здоi3f>ix людей и некоторыми перепиваемыми линиями челока было установлено, что МКА ВСА-16 реагируют с мемапным антигеном, находягцимся на большей части Т-лим1ЦИТ0В, ФГА-стимулированных лимфоцитах периферигкой крови и на тимоцитах> МКА BGA—16^ практичеаси
взаимодействуют с не-Т-клеточной фракцией, нейтроглами, моноцитами, а т а к ж е не дают положительных реций с В-клеточными линиями Raji, DaudiMi миеидной линхтей К-562 (табл. 1).
Таблица 1
Реактивность МКА ВСА-16 к различным клеткам
нормального гемопоэза и перевиваемым нлеточным;
линиям
Т]||1 клеток
имфоциты крови
-лимфоциты —«е-Т-лимфоциты -—«—
юноциты —«—
ейтрофилы —«—
имоциты
1эГА-активированные
ные
ямфоциты —«—
летки В-линий:
летки миелоидн< й линии
-562
Содержание (ii7o) ВСЛ-16-пол()жите.чьпых iviCTOK' 11 популяцки
70,6 ±5,6*70,7±3,2
6,7±2,5"
0
7,6±2,3
6б,5±бЛ
т,0±1,9
0
0
0
данные, полученные при обследовании- 10 доноров
ииг.
Исследование специфичности ЫКА ВСА-16
показал
что данные антитела связывают поверхностный антиген i
клетках крови больнглх пре-Т-ОЛЛ и реагируют с леЙ1Со;
ными клетками всех тестированных больных Т-ОЛЛ, пр
этом пра1;тически но дают п о л о л а и с л ь п ы х реакций с ле:
козиыыи клетками крови больных пре-В-ОЛЛ (табл. 2).
Таблица 2
Гсактпвпость МКА ВСА-16 i: ленкозным
1;леткам больных
ЛеЛкозпыо
клетки больных
Частота реагпроипиня
Д\КА*
Острый лимфобластный лейкоз:
пре-В-тип
пре-Т-Т1ш
Т-тип
1/14
10/12
0/6
Хронический лимфолейкоз:
В-тип
Т-тип
15/20
5/7
Лимфосаркома:
В-тип
Т-тип
Острьн! миелобластный лейкоз
0/7
7/Р.
0/7
Острый миеломонобластный
лейкоз
0/9
Острый монобластный лейкоз
0/5
Хронический миелолейкоз
бластный криз
0/4
Хронический моноцитарный
лейкоз
О/Я
- .— в числителе —- число положительньтх случаев.
знаменателе — общее число больных.
Установлено также, что у больных хроническими лим
фопролиферативными заболеваниями антиген, выявляемы:
МКА ВСА-16, представлен в большинстве случаев тестиро
ваний клеток крови (табл. 2).
~ 9 —
Кроме того, определено, что МКЛ BCA-1G выявляют
эмбранный антиген клетогс крови Т-клеточной лимфосарDMOM и не спязываттсп с поверхностью клеток болытых
-клеточио)"! Л1П\;(]юсГ1]-)Кпмой по пс(»х бе;', иск'лючснн!) слу1ЯХ.
П;}и тесч'11],'онап!1н гслстор; кропи 6o.m,iir,ix острыми тт
коническими иелимфоидными лейкозами бьгло коистати)папо огез'тетвне ;)кспрессип лкттиепл ЕСЛ-IG пл бллстиьгх
тетка^'.
Ti'.inui обра:!ом, полу.'снт.ю МТ.'Л ЛСЛ-lfi, сскрс'Г1Г1)ус,1с 1'иП):)Пдомным н1таммом ic.iieToic II'12, выл1!ЛЛ10'1' с paniHiioii частотой гюрд^рхпостпьп'т антиген мембран лейкоз.Н'с клеток крогш болынлх нре-Т-ОЛЛ, Т-ОЛЛ, Т- и
-ХЛЛ, Т-лимфосаркомой, а такл:е Т-лимфоцитов, ФГАхшз^лиронанных лимфоцитов и тимоцитов здоровых л ю 'й, по при этом не реапфугот с не-Т-лимфоцитами, ией)офилами, моноцитамк! здоровых лиц, В-клеточными л и (лми R ^ j i , Daudb миелоидной клеточной лини: К-562 и с лейкозпыми клетками больных пре-В-ОЛЛ,
-лимфосаркомой, острыми и хроническими нелимфоидиыт лейкозами.
Согласно полученным данным по изучению снецифич1СТИ МКА ВСА-16 можно считать, что они имеют направниость к поверхностному Т-клеточному антигену и обруживают сходство с коммерческими МКА Leu - 1 , OKTl ,
ii;oTl (выпусггаемые соответственно фирмами «Becton
CKinson, „Orlho Diagnostic", CLJJA и ,Оако" , Дания),
правленных к антигену питого кластера дифференциров: (CD5), который экспрессирова}! на тимощхтах, Т-клетX перис}№рической крови, большипстве Т-клеточных опуле11, а т а к ж е на опухолевых клетках больных хроничес:м В-лимфолейкозом л на небольшой части нормальных
клеток лимфатических узлов (Кinig Р . , 1987).
При Сравнении спектра реагирования полученных МКА
1А-16 С а н т и - С 0 5 антителами было установлено, что МКА
; А - 1 6 связывают несколько меньше Т-лимфоцитов, тимоITOB здоровых людей, чем МКА Leu! ii ГЗако Т1, но
)а.чд() болыпо, чслг ()К'1Л. II|)0)IIUHIIOT П ОТИ<)ИКЧ{1Г|| .!Г(Ч'Гзных клеток больных Т-ОЛЛ. Т- и В-ХЛЛ, а т а к ж е
клеточной лимфосаркомы подобную Len 1. специфичсть. Главное отличие МКА БСА-16 от вышеперечисленIX состоит в том, что они выявляют в большинстве слуев и поверхностный антиген мембран лейкозных клеток
юви больных пре-Т-ОЛЛ.
- 10 Таким образом, на основании представленных данны:
следует заключить,, что полученные МКА ВСА-16 могу
быть рекомендованы, для практического применения в це
л я х иммунофенотипирования клеток крови указанным]
с))ормами лейкозов и лимфосарком, а таклсе для опреде
лсния содержагшя в крови Т-лиадфоцитов при различны:
патологических, состояниях, для, изучения Т-лнмфоцитов i
тканях и для выделения чистой популяции Т-лимс})ОЦИТО]
методами иммуноадсорбции, а в перспективе могут быт:
исполАЗрван?)! для. соединения с (11ерромагпстиками при об
работке костного, мозга больных.
ГМ.БРИДрМЫ. ПРОДУЦИЛ^УЮЦДЦЕ МКА.
А1Д,ТИММ-БД0МОНОЦИТАРНОЙ НАПРАВЛЕННОСТИ
В результате гибридизации по получению МКА анти
миелрмоноцит^рной направленности в. трех, платах вырос
ло 185 гибридрмных клонов. Первичному тестированию. ]
Р Н И Ф было подвергнуто 179 гибридом,, в том числе 6!
повторно. Y 4Q гибридных штаммов была обнаружена сек
реция антител к иммуногенным клеткам-мишеням больно!
ОММЛ. К дальнейшему реклонированию было отобран!
15. клонов, облада^ющих наибольшей- секреторной
актив
ностью. Среди, решюнированных гибридом- 5 роста не дали
У. остальных 10 клонирование оказалось эффективным, ;
иду.чаегдая специфичность их, антител характеризовалас!
способностью реагировать-с-клетками крови-больных раз
личнь.ши формами лейкозов.
Наибольшее практическое знанение имел штамм- мы
щиных гибридрмны^с. клеток- 2 и З ; секретирующи11: MKi
ВСА-Х)9< оригинальной, специфичности, отвечающей постав
ленной, задаче.
Гибридома 2G3 была выявлена при тестировании i
РИ1>1Ф на. 1:7,-е су.тки-. от- момента слияния, трижды рекло
нированэ. (0.ффективнос:гь. клонирования при этом состави
ла. 1D0%)( ввднедена- в массовую культуру с третьего- пас
сажа с хорошими ростовыми качествами, имела вид стан
дартной,суспензии-с характерной для.антител продуцирую
щ и х к у л ь т у р морфологией, с титром антител в-культуральной жидкости, определяемым, как 1;1.00.- Гибридомньн
штамм-2 G3-выращен на протяжении-46 пассажей-In vitro
и культивирован в организме мышей-в виде асцитной опу­
холи с титром антител 1:1000 и принадлежит 1 Q G 2а суб.классу.
— 11 -
Изучение специфичности полученных МКА ВСА-09 поазало, что они проявляют в большей части случаев наравленность к лейкозным клеткам больных ОММЛ (имея
ри этом высокую степень флюоресценции антигенпозиивных клеток), при практическом отсутствии взаимодейгвия с лейкозными клетками крови больных ОМЛ (1,'20).
•пределено, что МКА ВСА-09 не дают положительных рекций с лейкоз1Нлми клетками других форм и вариантов
ейкозов и лимфосарком, а также с тимоцитами, ФГА-стиулированными лимфоцитами, с некоторыми клеточными
опуляциями периферической крови здоровых людей и
1-клеточными линиями человека Raji, D.iuili, по при этом
дентифицируют антиген, находягцийся на мембране клеэк иеревиваедюй миелоидной линии К-562 (табл. 3).
В последние годы в ряде лабораторий были получены
IKA, распознающие различные антигены нормальных и
пухолевых клеток ыиеломоноцитарного
происхождение^!.
оеди них наиболее близкими по спектру реагирования с
СА-1;!) яв.'гяются М1гА .MV9 (С 0:53), а rauvKu Л1о2 ц MV4
"DwM), (все — фирмы Xoiiltronlcs" , США).
Анти-С1)33 МКА MV9 (Grlfffln V.. et. al., 1984)
ыявляют поверхностный антиген клеток, экспрессированый на мембране костно-мозговых клеток-предшественниов миелоидного ряда ге1Мопоэза, а также на зрелых моноитах периферическо!^ крови^ лейкозных клетках боль1инства больных ОМЛ и ХМЛ БК, но отсутствующий па
ритроцитах, тромбоцитах и на лейкозных клетках больых .лимфолейкозами.
A H T I < ! - C I ) \ V 1 4 МКА Mo:i (Todd !?., ot. ;il,, 1981) и MV4
Jriifin Л., ct. al, 1981) связывают гюверхностный анти2п, находящийся на моноцитах, макрофагах, а также на
ластных клетках больных ОММЛ, ОМоЛ и в части слуаев на клетках больных другими лимфоидными и миеоидными лейкозами и лимфосаркомами.
Таким образом, на основании представленных данных
педует, что полученные RIKA ВСА-09, обладая аитимиеомоноцитарной направленностью, имеют характерные отичия от известных МКА, распознающих антигены норальных и опухолевых клеток миеломоноцитарного происождения, которые зак.лючаются в способности выявлять
ластные клетки больных ОММЛ. Эти свойства позволяют
екомендовать МКА ВСА-09 для применения в целях д и ф )еренциональной диагностгпси ОММЛ с другими формами
ейкозов.
12 Таблица 3
Геактнвность МКА ВСА-0!) с различными к-леткашн
нормального и патологического гемопоэза
Источник получе­
ния клеток
Больные гемобластозами
Тип клеток
Лейкозные клетки:
Острый миелобластный
лейкоз
Острый миеломонобластиый
лейкоз
Острый молобласт1Н-.1Й
лейкоз
Острый лимфобластный
лейкоз:
пре-В-Т1И1
пре-Т-тип
Хронический миелолейкоз
бластный криз
Хронический моноцитарный
лейкоз
Хронический лиыфолейкоз;
В-тип
Т-тип
Лимфосаркома:
В-тип
Т-тип
Здоровые люди
Лимфоциты
Моноциты
Нейтрофилы
ФГА-активированные л и м ­
фоциты
Тимоциты
Raji
Клеточные л и ­
Daudi
нии
К-562
Печень
Эмбриональная
ткань
^____ Ксстный мозг
* — в числителе — количество положительных случа­
ев, в знаменателе — обш,ее количество тестированных слу­
чаев.
-
13 —
выводы
1. Получен штамм м ы ш и н ы х гибридомных клеток, абозченный 1F12, способный к стабильному росту в к у л ь т у и R организме мышей в виде астщтпых опухолей.
тамм клетоок 11" 12 имеет вид стандартной суспензии с
рактерной для аптителпродуциру1он;их культур морфогией, стерилен и сохраняет после криокопсерпировання
разморлисиванил присущие ему свойства с секрецией
КЛ ВС А-16 lq<"n субкласса. Гибридные клетки l F l 2 загистрмрованы и хранятся во Всесоюзном банке клеточIX
культур
Института цитологии
АН СССР под
ВСКК П/-129 (Авторское свидетельство № 148394G).
2. Выявлено, что продуцируемые штаммом 1F12 МКА
'А-16 идентифицируют поверхностный антиген мембран,
ходятщийся на леикозных клетках больных острыми
клеточными лейкозами и Т-хроническими лимфопролиративными заболеваниями, а также больных В-лимфойкозом. МКА ВСА-16 выявляют антиген, экспрессиронный на Т-лимфоцитах, ФГА-активированных лимфоциX периферической крови и тимоцитах здоровых людей и
реагируют с не-Т-лимфоцитами, моноцитами, нейтрофими, перевиваемыми клеточными линиями человека (миеидной и В-клеточной природы) и с поверхностным анти10M леикозных клеток больных нелимфоидными лейкоVI и .
3. Получен штамм м ы ш и н ы х гибридных клеток, обозченный 2Q3, способный к стабильному росту в культуре
в организме мышей в виде асцитяых опухолей. Штамм
еток 2Q3 имеет вид стандартной суспензии с характерй д л я антителпродуцируюш;их культур
морфологией,
;рилен и сохраняет после кртюконсервирования и разможивания присущие ему свойства с секрецией МКА
ЗА-09 l G 2 a субкласса. Ш т а м м гибридных клеток 2Qi
эегистрирован и хранится во Всесоюзном банке клеточ:х культур Института цитологии АН СССР под номером
1КК/П/-130Д.
4. Продуцируемые гибридным штаммом 2G3 МКА
; А - 0 9 направлены против антигена, эгсспрессированного
леикозных клетках больных ОММЛ и не реагируют с
JiKOSHbiMH клетками больных другими формами л е й к о 3 и лимфосарком, а т а к ж е с моноцитами, нейтрофилами,
мфоцитами периферической крови и тимоцитами здороX людей и В-клеточными перевиваемыми культурами
товека.
- 14 5. Полученные моноклональные антитела ВСА-16 i
ВрА-09 могут быть рекомендованы в качестве реагенто!
для включения в панель МКА, используемых для имму
нодиагнстики различных форм и вариантов лейкозов ]
лимфосарком.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО
ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Изучение композиции дифференцировочных антиге
нов на нормальных и лейкозных лейкоцитах с ломощьи
моноклональных антител. Митерев Г. Ю.- Бурова Г. Ф.
Новикова Н. Н. и соавт. Тезисы II Всесоюзного съезда ге
матологов и трансфузиологов, Москва, 1985, с. 176.
2. Иммунологические варианты острого лимфобластногс
лейкоза взрослых в сопоставлении с цитохимическими i
некоторыми клиническими параметрами. Булычева Т. И.
Новикова М. С , Митерев Г. Ю., Шахбазян Г. П., Новико
ва Н. Н. и соавг. Гематология и трансфузиология, 1989
№ 5, с. 13—19.
3. Моноклональные антитела БСА-16 к поверхностномл
Т-клеточному антигену здоровых людей и больных лейко­
зами. Булычева Т. И., Новикова Н. Н., Митерев Г. Ю.
Новикова М. С. Гематология и трансфузиология, 1988
№ 12, с. 45—47.
4. Получение гибридом, секретирующих моноклональные
антитела к диффеиенцировочным антигенам лейкоците!
человека. Митерев Г. Ю.. Бурова Г. Ф., Новикова Н. Н. iсоавт. Тезисы 57 научной сессии ЦНИИ гематологии и пе­
реливания крови, Москва,'1985, с. 112—113.
5. Штамм гибридных культивируемых клеток живот­
н ы х Mus (iiusculus -продуцент моноклональных антител к
лимфоидным лейкозам Т-клеточного ряда и Т-лимфоцитак
человека. Новикова И. Н., Митерев Г. Ю., Новикова М. С
и соавт. Авторское свидетельство № 1483946, положитель­
ное решение от 23,03.88 г.
Типография ПО «Боткинский завод», тираж 100 экз.
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа