close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Разработка серийного оформления В. Матвеевой;pdf

код для вставкиСкачать
m
•
—
і
О.И.
БЕРШОВа
ементы
U
почвенные
м икре
шоганизмы
.
АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНСКОЙ
ИНСТИТУТ
МИКРОБИОЛОГИИ
И
им. Д. К. ЗАБОЛОТНОГО
ССР
ВИРУСОЛОГИИ
О. И. БЕРШОВА
МИКРОЭЛЕМЕНТЫ
И ПОЧВЕННЫЕ
МИКРООРГАНИЗМЫ
631.4
Б52
Монография посвящена выяснению действия
микроэлементов на почвенные
микроорганизмы
(бактерии, актиномицеты, грибы), изменению их
количества в почве, а также морфолого-функциональным особенностям и влиянию этих изменении
на высшие растения. Показано действие микроэлементов на образование биологически активных
веществ — витаминов группы В, гетероауксина.
Рассчитана на микробиологов, химиксЬ, агрохимиков.
О т в е т с т в е н н ы й р е д а к т о р Л. И.
Рубенчик
/
2—10—3
!_136—67М '
КИЕВСКАЯ КНИЖНАЯ ТИПОГРАФИЯ № 5
ВВЕДЕНИЕ
Одним из интересных, и важных разделов современно^^^вЯЬгии является изучение особой роли физиологически
веществ, действующих в биологических процессах в
ничтожно малых количествах и необходимых для возникновения
определенных процессов в клетках живых организмов.
К этой категории вещестц можно отнести и микроэлементы,
основываясь на их способности активизировать сложные биопроцессы растительного и животного мира.
' Обычно микроэлементы (Мп, В, Си, Мо, 2п, Со, Ре, Л) входят в состав клеток живьус существ в очень малых количествах
и необходимы им для определенной функциональной деятельности, а в некоторых случаям — и для существования. Большинство
из них 'находится в составе ферментативных систем организмов,
играя важную роль в жизнедеятельности растений и животных.
Проявление положительного действия микроэлементов на рост
и продуктивность сельскохозяйственных растений послужило основанием для использования их в сельском хозяйстве в качестве
микроудобрений. Применение таких микроудобрений, в состав
которых входят металлы Мо, Мп, В, Си, 2п, имеет практически
важное значение в народном хозяйстве страны и способствует
повышению урожайности многих сельскохозяйственных растений
и улучшению качественного состава продукции растениеводства.
Применение микроэлементов в животноводстве и птицеводстве
обеспечивает устранение ряда заболеваний животных и повышает продуктивность этой отрасли сельского хозяйства.
Широкий размах химизации земледелия в СССР требует расширения производства и применения микроудобрений, которые,
не заменяя минеральных удобрений, характеризуются особой
специфичностью действия — повышением биохимической активности организмов (Пейве, 1963).
Значительная роль микроэлементов в сельском хозяйстве и
все растущие масштабы их применения выдвигают вопрос всестороннего изучения механизма их действия для рационального
использования.
/
Значение микроэлементов в жизни растений, животных и человека выяснилось в должной степени только в последние десятилетия. Еще недавно считали, что для нормального существова-
ния организмов достаточно основных четырех элементов: углерода, водорода, кислорода, азота — так называемых органогенов, а
также некоторых зольных элементов — Са, К, Mg, Р, S, Fe. Все
ж е остальные элементы, находимые при анализах в составе клеток, считались случайными, поступившими в организм с потребляемой водой.
Однако усовершенствование метода анализа малых количеств
различных элементов, методов очистки солей и сред для искусственного выращивания растений и микроорганизмов, а также применение радиоактивных изотопов привело к критике установившихся взглядов и накоплению данных, показывающих необходимость для Нормального функционирования организмов еще
многих, кроме перечисленных, элементов. К числу таких в первую очередь были отнесены Мп, В, Zn, Си, а затем р я ^ д р у г и х
(Мо, Со и другие).
Работы В. И. Вернадского (1940) и А. П. Виноградова (1952)
показали, что в составе клеток живых существ содержится большинство известных химических элементов, связанных непосредственно с жизнедеятельностью клетки. Позже работы ряда ученых многих стран подтвердили, что каждый из этих элементов
выполняет ту или иную функцию в жизни организма. Особое
действие микроэлементов на обмен веществ организмов отмечено буквально во всех областях биологии: у высших растений и
микроорганизмов, животных и человека.
Существует огромное, все увеличивающееся количество работ
как советских, так и зарубежных авторов, посвященнйЬцмикроэлементам. Однако значительная часть этой литературы содержит главным образом констатацию их действия, значения для
разных организмов и указывает на практически полезные результаты, полученные от их применения во многих областях народного хозяйства. Что ж е касается раскрытия роли микроэлементов в различных биопроцессах, механизма их влияния на
клетку, то данный вопрос не вполне выяснен. Только в последние
годы исследователи начали интересоваться теоретической основой действия микроэлементов, поскольку современное состояние
уровня наук (биологии, биохимии, физики, физико-химии), в аспекте ко'торых проходит изучение микроэлементов, таково, что
позволяет проводить более углубленное, комплексное исследование и разработку теоретических основ данного вопроса. Знание
же путей действия микроэлементов даст возможность сознательно управлять ими в обмене веществ живых организмов.
В литературе разных стран эти элементы, необходимые для
живых организмов в ничтожно малых количествах, называют
различно: микроэлементы, trace elements, oligoelement, micronutrient, microelement, rare element, minor element. Употребляемая
терминология отражает их свойства действовать в низких концентрациях и быть необходимыми в питании организмов.
4
Однако в последнее время в связи с открытием их роли в
важных биологических процессах нанинает исчезать первоначальное значение данного термина и возникает его новый смысл. Так,
этим термином подчеркивается не столько количественное содержание химического элемента, сколько его эргический характер,
поскольку особенности действия микроэлементов в физико-биологических процессах проявляются в том, что они своим участием
существенно влияют на течение этих процессов как биохимические активаторы. Поэтому, по мнению некоторых авторов, «микроэлемент» по существу своему является понятием биологическим или физиолого-биохимическим (Троицкий, 1960).
Действие микроэлементов служит интересным примером того,
как'*%Ч|^ьные минеральные элементы уподобляются или несут
фун1шиист!1к(ных органических соединений с высоко специализированным действие^ в живой клетке.
Повышение урожая при применении микроэлементов обычно
связывают с их влиянием на растения. Мйогочисленные работы
физиологов растений подтверждают это положение. Однако при
оценке такого действия не принимается во внимание другой важнейший фактор среды, в которой произрастают растения,— микроорганизмы. Не учитывается взаимосвязь их и изучаемого организма, несмотря на то, что в данное время взаимное влияние
низших и высших растений показано многими исследователями.
Таким образом, в данном случае не принимается во внимание
один из важнейших факторов, влияющих на рост и развитие растений.
Плодородие почвы в определенной мере зависит от обитающей в ней микрофлоры. Еще основоположники научного почвоведения Докучаев и Костычев, а затем и многие другие придавали особое значение биологическим факторам (растениям и
микроорганизмам) в процессах почвообразования. Исследования
последних десятилетий в области почвенной микробиологии
показали не только правильность положений этих ученых,
но значительно расширили и углубили первоначальное представление о роли микроорганизмов в создании почвенного
плодородия. •
Как известно, в почве широко распространены многочисленные и разнообразные группы микроорганизмов: бактерий, актипомицетов, грибов, водорослей, дрожжей, простейших и других.
Псе эти группы в проявлениях своей жизнедеятельности активно
участвуют в почвенных процессах. Количество их велико: в 1 г
некоторых почв находятся миллиарды клеток. Эта огромная, населяющая почву биомасса обладает высокой биохимической активностью. Непрерывно синтезируя и разлагая большие количеп н л разнообразных органических и минеральных веществ, эти
микроорганизмы обогащают почву продуктами метаболизма.
5
Изучению взаимоотношений высших растений и микроорганизмов посвящены многочисленные работы, в той или иной мере
касающиеся отдельных вопросов этой проблемы (Lochhead
a. Burton, 1953; Березова, 1953, 1953а; Доросинский, 1953; Мишустин, 1954, 1956; Красильников, 1958; Смалий, 1963).
В ризосфере растений отмечено большое количество микроорганизмов. Скопление их в зоне корней объясняется определенными взаимоотношениями с высшими растениями. Как установлено, в процессах роста корни выделяют различные органические
и минеральные соединения (сахара, органические кислоты, спирты, альдегиды, витамины, аминокислоты, фосфатные и азотные
соединения). Эти вещества могут служить источниками питания
почвенных микроорганизмов, способствуя их активному развитию вокруг корней. Кроме того, микроорганизмы используют
отмершие ткани растений (корневые волоски, клетки эпидермиса
и др.). В свою очередь микроорганизмы играют важную роль в
питании растений, подготавливая и снабжая их основными и дополнительными продуктами.
Микрофлора, осуществляя распад и синтез многочисленных
органических и минеральных веществ в почве, обусловливает
круговорот основных биогенных элементов (N, С, Р, S, Fe). Эти
процессы, возникающие в результате деятельности различных
групп микроорганизмов со специфическими (нитрифицирующие,
азотфиксирующие), а также неспецифическими функциями, широко распространены в почве.
Во всех этих процессах промежуточные и конечные формы
некоторых образующихся веществ служат как непосредственными продуктами питания растений, так и переходными формами
к последующим, также нужным для растений соединениям.
Непосредственно Действующим на растения началом в почве
является группа биотических веществ, в большинстве своем образуемых микроорганизмами. К таким относятся ферменты, витамины, ауксины, гормоны, аминокислоты, пуриновые осноьлния,
пигменты и другие вещества. О наличии этих веществ в почве,
их усвоении и определенном действии на растения свидетельствуют работы Локхеда (Lochhead a. Burton, 1953), Красильникова (1958), Смалия (1963). Микрофлора, образующая биотические
вещества, разнообразна, и почти каждый вид ее синтезирует то
или иное из этих веществ. Развиваясь и продуцируя эти соединения, микроорганизмы активируют рост и другие жизненные
процессы растений. В почве происходит непрерывный обмен этих
веществ, разрушаемых и заново синтезируемых различными микроорганизмами.
Из сказанного видно, какую огромную роль играют микроорганизмы в плодородии почвы и какие сложные взаимоотношения
существуют между ними и растениями.
6
Микроорганизмы, как и высшие растения, реагируют на внесение в почву удобрений, органических и минеральных. Увеличивается их число — усиливается активность. Внесение микроудобрений, являющихся биостимуляторами, не может не действовать непосредственно на микрофлору почвы, усиливая ее
размножение и биологическую активность. Интенсификация же
разнообразнейших биопроцессов в; свою очередь положительно
отражается на произрастании высшего растения.
Таким образом, положительное действие микроэлементов на
растение может возникать как результат косвенного их действия,
изменяющего активность микрофлоры.
Не исключая возможного прямого действия микроэлементов
ка растения, Мы останавливаем внимание на этой, мало известной взаимосвязи, проявляющейся между микроэлементами, микроорганизмами и растениями.
Данная работа посвящена вопросу действия микроэлементов
на микроорганизмы, в частности на микроорганизмы ризосферы
сельскохозяйственных растений. В ней уделено особое внимание
изучению взаимосвязи между микроэлементами, микроорганизмами и высшими растениями.
ЧАСТЬ
I
РОЛЬ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ В МЕТАБОЛИЗМЕ
МИКРООРГАНИЗМОВ
Разнообразие сфер действия микроэлементов, их
многогранное влияние на физиологические функции растительных и животных организмов объясняется многими исследователями их участием в тонких реакциях клеточного обмена, главным
образом в ферментативных процессах.
Поэтому в последние годы работа над объяснением действия
микроэлементов переходит в область биохимии и физической химии. Новейшие приемы исследований металлоферментов, применяемые в последнее время (спектрофотометрия, спектрография,
полярография, диализ, электронная оптика, изотопы и др.), дали
убедительные доказательства каталитического действия металлов в ферментах.
В этих исследованиях приводятся различные объяснения действия металлов, причем авторы используют в качестве тестобъектов для наблюдения ферментных реакций наравне с растительными тканями микробные популяции. Эти наблюдения
производятся как с клеточным материалом, так и с внеклеточными суспензиями. Как следствие многочисленных исследований
в этой области появились в печати не только статьи, но и большие работы обзорного порядка, касающиеся роли металлов в
отдельных ферментных системах и в группах ферментов. На основании этих работ становится ясной роль металлов в жизни
клетки, тесно связанная с их каталитическим действием в ферментах.
К таким обзорам, посвященным общим вопросам катализа
ферментов металлами и рассмотрению их действия в различных
реакциях, относятся 1)360™ Неджера (Najjar, 1951), Макэльрои
и Незона (McElroy a. Nason, 1954), Незона (Nason, 1958). Другие авторы изучают действие отдельных металлов в.определенных группах ферментов. Так, Велли (Vallee, 1955, 1960) рассматривает возможности вхождения цинка в металлофермент)э1. Николас (Nicholas, 1957, 1957а) делает обзор функций металлов в
флавопротеинах и метаболизме азота у растений. Работа Л а р д и
(Lardy, 1951) посвящена вопросу действия металлов в реакциях
с фосфатами, Зингера и Кирнея (Singer a. Kearney, 1954) — в
8
окислительных металлоферментах. Гард и Вилькокс в большом
обзоре (Gurd a. Wilcox, 1956) сообщают об особых комплексных
образованиях между металлопротеинами, пептидами и аминокислотами.
Некоторые авторы сосредоточивают свое внимание на вопросах действия металлоферментов в области биохимии растенийК таким относятся работы Власюка (1952, 1962), Власюка и его
сотрудников (1960, 1961, 1964), Школьника (1960, 1963, 1964),
Хьюитта (Hewitt, 1951), Шаррера (Scharrer, 1955).
Действию микроэлементов на микроорганизмы посвящены обзоры Левалли, Старки (Lavollay, 1955; Starkey, 1955).
Заслуживают должного внимания интересные работы Пейве
(1960, 1961, 1961а, 1963, 1965), где автор систематизировал данные о микроэлементах, участвующих в ферментах, а также данные об участии микроэлементов в изменениях органических и
минеральных веществ почв.
Сведения о практическом значении микроэлементов в жизни
растений и животных обобщены в монографии Стайлса (1949).
Многочисленные литературные данные и широкий размах
работ по микроэлементам как в СССР, так и за рубежом убеждают в том, что изучение металлоферментов и других органических комплексных соединений с металлами является в настоящее время одной из интереснейших проблем биохимии и физиологии низших и высших растений.
РОЛЬ МЕТАЛЛА В ФЕРМЕНТНЫХ СИСТЕМАХ
Изучение роли металла в ферментных системах
шло в двух направлениях. Представители первого направления—
Варбург и Кристиан (Warburg a. Christian, 1943) и другие — старались познать действие металла, применяя в исследовании ряд
веществ-ингибиторов, тормозящих его влияние в системе ферментов. Степень этого торможения, а также природа ингибитора
давали возможность судить о роли металла. Однако выводы из
этих исследований делались на основании логических рассуждений и априорных заключений, что является недостатком данного
метода.
Другим направлением является исследование в области химии
белков. Благодаря новым методам стала возможной изоляция
высокоочищенных протеинов, однородных по физиологическим
критериям, что в свою очередь дало возможность исследовать
также и металл, тесно соединенный с ними и содержащийся
обычно в определенных количествах на единицу протеина.
В табл. 1 приведены примеры количественного содержания металла, связанного с протеином. Наиболее хорошо изучены по
отношению к определенным ферментным системам железо, медь,
марганец и в последнее время цинк, молибден и кобальт.
Таблица 1
Количество металла в протеине (по Vallee,
1955)
>
Протеины
Металл
В мкг на
1 г поотеиНя
Гемоцианин
Цитохром С
Альдегидоксидаза
Ксантиноксидаза
Аргининтрансфосфорилаза
Адкогольдегидрогеназа
Си
Fe
Mo
Mo
Mn
Zn
2450
4300
160
300
2670
180
Положение о металлах как катализаторах ферментных реакций исходит из ранней концепции металлических катализаторов
в химических реакциях. Однако когда металл соединяется непосредственно с белковой частью фермента (с молекулой или
частью молекулы), что определяет специфичность катализа, тот
же процесс идет несравненно активнее. Таким примером может
служить окисление аскорбиновой кислоты, катализируемое
медью. Этот же процесс значительно, примерно в 1000 раз, ускоряется при соединении меди с оксидазой аскорбиновой кислоты.
При этом не образуется перекиси водорода, что показывает изменения в самом ходе процесса (Николаев, 1959; Nason, 1958).
Другим примером может служить разложение солями железа
перекиси водорода. Более активно этот процесс протекает под
действием железосодержащего фермента (Lenhinger, 1950). Активность железа возрастает в 1010 раз, когда оно входит в геминовый комплекс.
Декарбоксилирование оксалоацетата катализируется многими
металлами, в том числе и марганцем. При наличии же комплексных соединений с марганцем этот процесс идет гораздо быстрее
(Najjar, 1951). Таких примеров можно привести очень много.
Объясняется это тем, что тоны металла, связанные с протеином,
действуют эффективнее в переносе электронов. Активность микроэлементов возрастает при этом в сотни тысяч, а иногда даже
в миллион раз по сравнению с их ионным состоянием.
Важными вопросами в области биохимии являются: каким
образом при комбинации со специфическим протеином возникает
эта способность металлов катализировать ферментные реакции;
природа связей, позволяющих специфически присоединять металлы, а также переносить электроны в определенном направлении от системы протеинов к другим органическим группам.
Согласно данным Неджера (Najjar, 1951), все ферменты по
содержанию в них металлов можно классифицировать на следующие группы:
г
1 ) действительные металлоферменты, в которых имеется опре10
деленная абсолютная специфичность металла, где он свяаан и
неотделим от белка;
2) металлоферменты, где нет определенной специфичности в
связях металла и белка и первый может более или менее диссоциировать;
3) ферменты, не активируемые металлоионами и не содержащие металлов.
К первой группе относятся окислительные ферменты, каталитическая активность которых усиливается с валентным изменением иона меди, цитохромы с железом, подвергающимся
обратимым валентным изменениям, карбоангц&разы с цинком и
некоторые другие ферменты.
Свойства металла в этих ферментах определяются его положением как катализирующего центра металло-протеинового комплекса. Эти соединения отличаются стабильностью. Действие металла тут специфично.
Вторая группа металлофермеНтов характеризуется слабой
специфичностью металла: большинство ферментов этой группы
активируется более чем одним металлом, например, фосфоглюкомутазу активируют магний, марганец, кобальт и никель, энолазу — магний, марганец, цинк, лецитиназу Clostridium
welchii—
кобальт, цинк, марганец (Zamecnik et al., 1947). Стабильность
соединений этой группы ферментов с разными металлами различна. Металл может быть связан с различными молекулами
фермента, которые благодаря этому получают возможность перемещения. От перемещения этих групп и связей с металлом
зависит активность фермента. Так, в аргиназе а-аминогруппа
или карбоксильная группа или они обе могут быть вовлечены
в металлокомплекс.
На основании изучения пептидных ферментов этой группы
Смитом (5mith, 1949) выдвинуты три положения, определяющие
активность ферментов:
1) активные ферментно-субстратные комплексы образуются
с определенными химическими связями;
2) связь между молекулой субстрата и фермента образуется
через металл;3) две связи, образуемые металлом и ферментом, должны
быть в противоположных сторонах пептидного соединения.
Разные авторы относят действие металла в ферментах к изменению рН среды, благоприятном в определенных значениях
для действия отдельных металлов.
К иной группе органометаллосоединений, по Неджеру (Najjar, 1951), относятся так называемые «металлосубстраты», в
которых металл соединен с субстратом, подверженным действию фермента.
Местом прикрепления металла в таких соединениях является
поверхность субстрата, и действует он таким образом, какполяр11
ная группа последнего. Одной из форм металлосубстратов являются хелатные комплексы. Показано, что в соединениях такого
рода может изменяться электрополярный момент, причем увеличивается их сродство к ферменту. Также возможно изменение
полярных групп субстрата в другую конфигурацию, при э?ом они
должны находиться в пределах орбиты притяжения определенных группировок на поверхности фермента. Может также происходить то и другое вместе. В таких положениях могут функционировать несколько металлов, заменяя один другого. Эти металлы должны мало отличаться своими атомными свойствами
(весом, ионной зарядкой, радиусом, потенциалом и другими
свойствами).
Металлы могут образовывать сходные хелатные комплексы с
субстратом. Таким хелатам не обязательно иметь подобные
конфигурации, но все же необходимо, чтобы их полярные группы
могли помещаться в пределах орбиты притяжения на поверхности фермента. Хорошим примером этих соединений может быть
аргиназа. Этот фермент активируется Мп, Ее, Со, №. Эти
элементы, являясь членами последовательного ряда, схожи ПУ
атомным свойствам. И хотя их комплексы с субстратом несколько разнятся в электронной конфигурации и типом связи, они все
катализируют аргиназу. Примеров подобного рода много: (3-кетокислоты, Е-лейцин и др.
Активность металлосубстратных комплексов различна в зависимости от металла. Так, в аргиназе более активен комплекс с
Со, чем с Ее, Мп, N1, в карбоксилазе — с Мп, чем с другими
металлами.
Велли (Уа11ее, 1955) считает главным критерием измерения
физиологической значимости определенных металлионов степень
увеличения ферментной активности при их добавлении. Он делит
органометаллические соединения на-две группы: металлопротеины и металлопротеиновые комплексы. В первых металл может
быть естественно и неотделимо связан с белком. К ним относятся
металлоферменты. Во вторых металл может быть замещен Другим элементом и отделим от белка. К последним относятся металлоферментные комплексы, проявляющие ферментную активность соответственно свойствам различных входящих в них металлов.
Автор уделяет большое внимание характеристике этих
ферментных соединений, определяя их свойства и различия. В основном металлоферменты имеют постоянное соотношение металла к белку, являющееся интегральным числом с постоянным стехиометри^еским положением специфически действующего металла. Отделение металла сильно действующими средствами ведет
к потере активности фермента или к коренному изменению соединения.
Металлоферментные комплекс^ характеризуются свободным
12
соединением с металлом, стехиометрические соединения являются менее жесткими, чем в металлоферментах. Отсутствует строгая пропорциональность в содержании металла, который легко
удаляется при диализе, не приводя к потере активности фермента.
Собственные экспериментальные исследования Велли посвящены изучению роли цинка в металлопротеинах.
Обсуждая свойства металлопротеинов, Незон (Nason, 1958)
уподобляет функции металлов действию витаминов. Он указывает также, что не все комбинации металлионов с субстратом и
ферментом достаточны для получения биологически активных
соединений. Необходимы связи со специфическими металлами.
Так, некоторые металлы, образуя комплексы с ферментами, тормозят их активность, как это происходит в случае энолазы при
соединении с Ni, Be, Са. Активация же этого фермента получается при соединении с Mn, Mg, Zn, дающими крепкие связи с
ферментом. К металлам-активаторам многих ферментов автор
относит Mn, Fe, Си, Zn, Со, Мо и указывает на их роль в процессах цикла Кребса и многих других.
Хьюитт (Hewitt, 1958), Арнон (Arnon, 1952) обсуждали возможность активирования одного фермента несколькими металлами, в том числе и не необходимыми для его действия. Они
приходят к выводу, что наличие металла в среде изменяет ее,
что отражается на активности фермента. Отдельные металлы
действуют на среду по-разному, что также влияет в большей
или меньшей мере на катализ процессов.
Незон (Nason, 1958) выдвигает рабочую гипотезу, объясняющую случаи, когда действие отдельных ферментов происходит в
отсутствие металлов (как это наблюдалось в экспериментах с
некоторыми плесневыми грибами при удалении из их среды отдельных микроэлементов); по его мнению, имеются протеины
относительно простой структуры, синтез которых может протекать даже в отсутствие некоторых основных реакций, необходимых для построения более сложных протеиновых молекул. Основные же реакции невозможны без наличия определенных металлов. В этих случаях наблюдается усиление функций одних
ферментов и полное угнетение других.
Обобщая функции металлов в ферментных системах, Незон
указывает на свойства металлов:
1. Fe, Си, Мо — металлы, тесно связанные с электронопереносящей системой. Они имеют способность усиливать действие
промежуточных передатчиков электронов в окислительно-восстановительных реакциях и действуют как «электронные передатч и к » от протеинов к другим системам. Чем объясняется способность именно этих металлов усиливать катализ окислительновосстановительных реакций в комбинации со специфическим
13
протеином, какая природа связи этих металлов с протеинами
и многое другое, является в данное время еще мало
известным.
2. Mn, Mg функционируют главным образом в группах передаточных ферментных реакций, обычно с участием фосфатов.
Образуя хелатные структуры, они содействуют образованиям
ферментно-субстратного комплекса и результирующих промежуточных реакций.
3. Мп и Zn функционируют в общих ферментных декарболазных и гидролитических реакциях. Механизм их действия
мало изучен. Вероятно, они образуют необходимые структуры с
субстратом, то есть соединяют субстрат с протеином. Другим
применением являются комбинации металла с ферментом, ускоряющие действие последнего.
ХЕЛАТНЫЕ ОБРАЗОВАНИЯ
В развитии изучения металлоферментов большую
роль сыграл метод моделей. Непосредственное наблюдение таких моделей некоторых ферментов делало более понятным их
термодинамические свойства, абсорбционную способность, структурные особенности и др. Указанный метод был использован
многими исследователями и применен также при цзучении так
называемых хелатов. Открытие этих соединений сделало большой сдвиг в исследованиях действия металлов в ферментных
реакциях. Хелаты имеют особую двухстороннюю форму связи
металла с органическим веществом. Эта форма ( c h e l a t e — к л е ш невидная) послужила поводом для их названия. В таких комплексных соединениях металл (в большинстве случаев Fe, Си,
Мп, Mo, Со, Zn и др.) соединен с атомами и группами атомов
молекулы органического вещества. Хелаты бывают относительно
простые и более сложные с двойными и большими хелатными
связями. Впервые хелаты описаны в 1938—1940 гг. после чего
появились более детальные исследования этих соединений, проведенные Кальвиным, Мертэллом, Николаевым и многими другими (Calvin, 1954; Николаев, 1959). Полный обзор свойств хелатов сделан Мертэллом и Кальвиным (Martell a. Calvin, 1952).
Интересными свойствами этих соединений, привлекающими
внимание исследователей, являются их устойчивость и каталитическая способность в биологических реакциях.
Факторами, влияющими на стабильность хелат, являются
свойства связующего металла (его радиус, энергия орбиты и
т. д.). Изучение металлокомплексов и особенно хелатов дало
новые экспериментальные подтверждения и новые теоретические
обоснования толкованию действия металлов в ферментах, металлосубстратах и металлопромежуточных соединениях, как и
в металлоферментных ингибиторах.
14
Группируют хелаты по их способности переноса ионов и другим физико-химическим факторам.
О значении хелат в биологии можно судить по их участию
в таких чрезвычайно важных реакциях, как реакции гемина, хлорофилла, и многих других процессах.
Каталитические функции хелат Кальвин (Calvin, 1954) дели^г
на два типа: 1) реакции, идущие в направлении изменения, переноса, чередования и вибрации энергетических систем (то есть
изменения эффекта энтропии); 2) электронные изменения.
Примером может служить фосфатаза, содержащая марганец
или магний, соединенные с ферментом хелатными связями. Медь
в соединении с пиридоксалем хелатными связями участвует в
реакциях переаминирования. Этот элемент образует стабильные
хелаты с Ог и N2. Известны хелатные соединения, активирующие
молекулярный водород. Марганец, вступая в подобные связи с
аденозинди- и трифосфатом, меняет константу диссоциации
соединения (Cohn, 1954). Некоторые ферментные реакции не
могут идти без хелатных связей.
Активность хелатных соединений в значительной степени
зависит от их структурных связей. Так, удлинение цепи связанных атомных групп ведет к возрастанию активности, так же,
как и образование циклических конфигураций, включающих
ион-комплексообразовател^. Незначительные изменения состава
соединения отражаются на активности комплекса. Связь между
структурой и активностью доказана в физхимии; это положение распространяется на все металлы — как сильные, так и слабые активаторы.
Каталитическое действие комплексных соединений существенно отличается от действия простых ионов и так же, как и действие ферментов, основано на образовании в ходе реакций промежуточных соединений, что, однако, не исключает возможности
в некоторых случаях им быть только инициаторами в цепной
реакции (Calvin, 1954; Николаев, 1959).
Большую ясность в строение металлоорганических комплексов и зависимость их действия от стехиометрических положений
внес Клотц (Klotz, 1954; Клотц, 1956), дополнивший своими
исследованиями имеющиеся уже материалы по данному вопросу.
Он указывает на определенные типы связей металла с молекулой протеина при образовании различных комплексов. Металл
связывается с различными группами и отдельными атомами, составляющими боковые цепи белковой молекулы. При обозрении
свойств полярных концов этих цепей выяснилось, что такими /
являются карбоксильные, имидозольные, фосфорные, а- и
е-аммонийные, фенольные, сульфгидрильные и другие группы. Металл может быть связан с любой из боковых цепей
белка.
Клотц останавливается на трех положениях, определяющих
15
значение металла в комбинации с протеином или простетической
группой, действующего как катализатор.
1. Каталитические свойства металла зависят от специфичности протеина. Примером м,огут служить окислительно-восстановительные ферменты, содержащие медь и железо как необходимый металл. Тут протеин способствует стабильности низких валентностей и переносу электронов в реакциях.
2. Металл изменяет свойство белка путем изменения заряда
протеина, то есть при электростатическом действии. Такое действие подтверждено Клотцем при титровании протеина, связанного с различными металлами. Седезивен (Sadasivan, 1952)
также подтвердил такое положение, продемонстрировав влияние
изменений соотношения цинка и магния для фосфатазной активности. В данном случае имело место изменение рН в щелочных и кислых пределах, оптимальных для действия фермента.
Таким образом, наличие отдельных металлов, ломимо их прямого действия, может изменять условия внешней среды, влияющие на фермент.
3. При взаимодействии металла и протеина действие металла на протеин отмечается в многочисленных положениях,
которые могут резко меняться при изменении связей в конфигурации молекулы, меняющей электростатический
эффект.
Возможные блокировки групп боковых цепей протеина (например, сульфгидрильных) действуют на связь с металлом, отражаясь на активности фермента.
Большой интерес вызывает то, что добавление металла может
оказать глубокий эффект на ферментативную активность даже
тогда, когда металл не входит непосредственно в состав фермента, но будет находиться на поверхности молекулы. В таком
случае металл действует как «мостик» между ферментом и субстратом. Такова его роль в большинстве реакций декарбоксилирования и гидролиза.
Куртней и др. (Courtney et al., 1957), изучавшие активность
металлокомплексов и зависимость от строения, пришли к выводу, что большую роль в этих реакциях играет образование
циклических металлоорганических соединений.
Мессеи (Massey, 1953) показал, что такие анионы, как сульфаты, бораты, селенаты, эффективны в активации свободной от
солей кристаллической фумаразы. В этом случае электростатическое действие металлов на протеины может возникать и от
анионов.
В очень обстоятельном обзоре Гарда и Вилькокса (Gurd а.
Wilcox, 1956), посвященном вопросу образования комплексных
соединений металла и различных, органических соединений
(протеинов, пептидов и аминокислот), даются интересные структурные формулы возможных связей. В качестве примера приводим связь Си++ в глицинкомплексе:
16
сн2—coo
/
I
N
\
/
H2
N
\
ОС
\
/
CH2
I
Си
I
H2C
/ /
\
CO
V /
\
/
N
N
H2
I
CH 2 —COO"
Связи металлов в реакциях гидролиза описаны Геллерманом
и Стоком (Hellerman a. Stock, 1938) для аргиназной активности
и в системах пептидаз для различных пептидов. В последнем
случае имеет место образование хелатных комплексов между
металлом и субстратом. Причиной ускорения гидролиза под
влиянием металла могут служить стабилизация благодаря образовавшемуся комплексу переходных групп в реакциях и увеличение благодаря катионам локализованных концентраций ОН.
Действие металлов на ферменты может осуществляться многообразно: единичными и групповыми реакциями.
Изучая образование каталитически активных групп ферментов, Торчинский (1961) полагает, что SH-группы, содержащиеся
в белке, могут вступать во взаимодействие с различными катионами, особенно с цинком. Эти связи имеют значение для поддержания структуры фермента (например, алкогольдегидрогеназы). Ион металла, соединенный с серой меркаптидной связью,
обладает способностью образовывать дополнительные соединения с различными функциональными группами (карбоксильными, азотистыми и другими) боковых цепей белка. В результате
этого возникают свободные клешневидные комплексы, соединяющие различные участки белковой молекулы, что обеспечивает активную конфигурацию ферментов.
В работах, доложенных на V Международном биохимическом конгрессе в 1961 г., много внимания уделялось функциональному взаимодействию между металлами и ферментами.
Шведские ученые Мальмстрем, Розенберг, Линдског (1961),
исследуя активные центры некоторых ферментов, указывают на
роль определенных металлов в этих центрах. Приводя уже известную из работ Неджера (Najjar, 1951) и др. классификацию
металлоферментов, данные авторы приводят тонкие особенности, неизвестные до сих пор, в различии действия металлов и
природы их соединений с белками. Эти данные показывают,
что нет прочно установленных границ в отношениях металл—
белок, но имеются многочисленные отступления от ранее установленных соотношений. Так, исследования энолазы показали,
2—388
17
что этот фермент активируется в соотнбшении 1 : 1 иона металла к ферменту в специфическом центре. Принадлежа к типичным металлофермент'ам, энолаза имеет свои особенности, отличаясь от них силой взаимодействия металла с этим центром.
Иной фермент — карнизоназа — стабилизируется по отношению
к тепловой денатурации ионами Мп++, Са++,
С(1++,
Стабилизация и активация осуществляется тут присоединением
металлов к различным участкам фермента. Для карнизоназы
необходимы ионы двух различных металлов. Ионы одного из
них функционируют в процессах в качестве кофермента, а ионы
другого принимают участие в создании третичной структуры
белка. По-видимому, активация, стабилизация и торможение
этого фермента могут осуществляться различными лигандными
группами, участвующими в различных типах взаимодействия.
Так, Са++ связывается с кислородом, и наиболее существенными
лигандами для него являются СОО-группы. Для присоединения
Мп++ показан хелатный комплекс с присоединением лигандного
атома азота.
Об этих же свойствах карнизоназы говорится и в докладе на
V Международном конгрессе биохимиков Вильямса (1961), работавшего в Оксфорде. Автор устанавливает зависимость химических свойств катионов и их влияние на структуру белка с
определенными группами белковых цепей белка и их характерными связями. Например, цинк связывается обычно с серусодержащими группами, что обусловливает его активность. Ионы
металла влияют на свойства белковой молекулы, воздействуя
на окружающие группы белка химическими связями или посредством возникающих по соседству с ионом электростатических
полей. Он изменяет конфигурацию белковой молекулы, а также
химическое поведение групп, находящихся на расстоянии от
катиона.
В свою очередь белок изменяет свойства иона металла, снабж а я его добавочными группами, образующими координационные комплексы. Эти группы связываются с различной силой и
располагаются в окружающем ион пространстве в различных
симметричных или асимметричных сочетаниях.
В позднейших исследованиях ионы металла используются
как металлометки при изучении действия ферментов.
Автор приводит данные поляризуемости катионов. Так, металлы переходной группы поляризуются преимущественно в октаэдрических комплексах. Интересны сопоставления того ж е
автора распространения ионов металлов в биологических системах и в земной коре, сходные с результатами исследований в
СССР биогеохимических провинций, проводимых Ковальским
(1959, 1963).
Обширное обозрение, посвященное также, механизму действия микроэлементов в ферментах, принадлежит Макэльрою и
18
Незону (McElroy a. Nason, 1954). Авторы рассматривают природу металлопротеиновых взаимоотношений и влияние различных факторов среды на этот комплекс. Они считают, что основной чертой металлоорганических комплексов является количественное интегральное отношение металла к белку, также
диссоциирующее или недиссоциирующее соединение металла
в ферменте. В первом случае металл является неспецифическим
активатором. Приводя известные уже нам данные Клотца и
других авторов, Макэльрой и Незон объясняют влияние металла на фермент его электростатическим действием. Металлы
могут также действовать, устраняя тормозящие фермент вещества. Интересный пример такого косвенного действия приводит
Смит (Smith, 1953) на лейцинаминопептидазе.
Заслугой Макэльроя и Незона является попытка систематизировать ферменты, в состав которых входят определенные
металлы. Так, они приводят ферменты по группам (табл. 2, 3, 5).
Как видно из табл. 2, большинство ферментов этой группы связано с Мп и Mg, альдолаза дрожжей и Clostridium активируется
Со, Fe, и Zn. Последний активирует также энолазу.
Ферменты, активирующие
Таблица 2
метаболизм углеводов (по McElroy а.
Nason, 1954)
Ферменты
Г люкокиназа
Гексокиназа
Фосфоглюкокиназа
Фосфоглюкомутаза
Дрожжевая и Clostridium альдолаза
Фосфоглицеринкиназа
Энолаза
Киназа янтарной кислоты і
Металлы, входящие в состав
ферментов
Mg++,
Mg++,
Mg++,
Mg++,
Fe++,
Мп++
Мп++
Мп++
М п + + , Со++, С г + +
Со++, Z n + +
Mg++, M n + +
Mg++, Mn++,
Mg++, Rb+
Zn++
Однако в последние годы список названий этой и других
групп дополнен большим количеством ферментов, в составе которых найдены металлы; дополнен также состав металлов, катализирующих ферментные реакции.
О роли ионов металлов в переносе фосфатов в ферментных
реакциях сообщают также Ларди (Lardy, 1951), Малер (1957)
н др. Металл принимает непосредственное участие в окислипльном фосфорилировании. Одна из основных теорий, объясняющая это явление, состоит в том, что в части циклического
процесса при восстановлении аденозинтрифосфата (АТФ) имеет
19
~
Таблица
З
Действие металлов в реакциях фосфорилирования (по McElroy а.
Nason, 1954)
Ферменты
Металлы, соединенные с ферментом
Мп++
С а + + , Мп4--*"
Мі++, Мп++
Мп++ '
Мп++
Мп++
М§++, М п + +
Аденозинкиназа
Аргининкиназа
ДФП-киназа
Люцифераза
Дрожжевая апираза
Глютаминотрансфераза
Киназа дифосфо-СоА
Таблица
Ферменты, в реакциях которых участвуют металлы и АТФ (по Lardy,
Фермент
Гексокиназа дрожжей
Акцептор фосфора
Глюкоза
Фруктоза
Манноза
Фосфоглюкокиназа
Глюкозо-1 - фосфат
Р0 4 -глицеринфосфофераза с1-3-Р0 4 -глицерат
Пируватфосфофераза
Пируват
Аденозинкиназа (дрожже- Аденозин
вая)
Аргинин
Арги нин-фосфофераза
ДФН- фосфофераза
ДФН
4
1951)
Активирующий металл
Мп++, М і + +
Мп++,
Мп++, М§++
Мп++
Мп++
Мп++
Мп++
место связывание фосфата. При дальнейшем окислении фермента при наличии акцепторной системы происходит фосфоролиз
аниона, связанного с металлом. Одновременно с этим происходит перенос фосфата на акцептор с образованием пирофосфатной
связи, то есть окислительное фосфорилирование.
В табл. 4 приведены ферменты, в реакциях которых участвует металл и АТФ, являющаяся донатором простых фосфорных
групп. Тут, как и в предыдущих группах, ферменты связаны
главным образом с А ^ и Мп. Меньшее их количество содержит
2х\, Со, Сг, А1, Са.
В литературе имеются указания на необходимость Мп, Ь^g
для активности пирофосфатазы и апиразы дрожжей. Гидролиз
эфиров фосфорной и пирофосфорной кислот также протекает с
20
Металлы,
Таблица 5
активирующие ферменты цикла лимонной кислоты
(по McElroy а. Nason,
1954)
Ферменты
Пиру ви ккарбоксилаза
Пирувикоксидаза
Оксилацетикдекарбоксилаза
Изоцитрикодегидрогеназа
Оксаллосукциникдекарбоксилаза
а-кетоглютаратоксидаза
Сукциникдегидрогеназа
Маликфермент
Металлы, соединенные с ферментом
Mg++,
Mg++,
Mg++,
Mg++,
Мп++
Мп++
Со++, Zn++, М п + +
Мп++
Mg+, М п + +
Са++, А1++, С г + +
Мп++, Со++
участием ионов металлов. Ca и Мп активируют аденозинтрифосфатазу, являясь частью простетической группы данного фермента. Лента и Ринл (Lenta a. Rienl, 1960), работавшие с
ферментными препаратами ДФПН-окислительной системы митохондрий, установили необходимость железа для усиления
катализа. Изучению металлсодержащих фосфатидов посвящены
работы Бойченко с сотрудниками (1963, 1964). Можно было бы
привести еще много примеров подобного рода, свидетельствующих об участии металлов в важнейших ферментных реакциях
переноса фосфора. Как видно из сказанного, в данных реакциях
главная роль принадлежит Mg и Мп.
Другие исследователи подтверждают каталитическое действие Мо на гидролиз особых органофосфатных соединений, ведущих к образованию комплексов с субстратом как первому шагу
в разрыве фосфатных связей.
Краус и Спект (Krauss а. Specht, 1959) успешно применяли
при массовом выращивании водорослей некоторые микроэлементы. Они объясняют полученное положительное действие необходимым участием последних в ферментативных реакциях
клетки. Авторы приводят сводку ферментов, в действии которых
принимают участие металлы. Таких ферментов указано около
40, некоторые из них уже упоминались в сводке Макэльроя.
Этот список значительно полнее, чем приведенный Макэльроем,
однако не отражает всего количества металлоферментов, открытых к тому времени. Так, в обстоятельном изложении особенностей ферментов Диксона и Уэббса (1961) приведено название
659 ферментов, из которых 220 отмечены как имеющие в своем
составе металлы в активных группах или в другом положении
связи. Большая часть новонайденных ферментов еще не достаточно изучена в отношении наличия в них металлов.
21
В настоящее время известно уже более тысячи ферментов.
С открытием новых ширятся знания об участии металлов в их
. реакциях.
ФЕРМЕНТЫ, ИМЕЮЩИЕ В СВОЕМ СОСТАВЕ МЕТАЛЛ
Окислительно-восстановительные ферменты
Согласно Михлину (1956), Пейве (1960) и др.,
к данным ферментам относятся сравнительно хорошо известные:
железопорфириновые — каталаза, пероксидаза, цитохромы и
цитохромоксидаза, железо в которых находится в простетической группе, тесно связано с ферментом и принимает участие в
переносе электронов, и медьсодержащие ферменты. Изменение
валентности меди в них связано т а к ж е с переносом электронов.
Атом меди рыхло связан с ферментом и удаляется при диализе
с цианидами.
Обычно роль меди в окислительных ферментах строго специфична. Однако в некоторых случаях она может быть заменена
другими металлами. Так, Кертес (Kertes, 1952) замещал медь в
тирозиназе кобальтом, никелем и ванадием, которые, однако,
были менее активны. Автор объясняет это явление комплексной
системой тирозиназы, действие которой при окислении моногидрофенолов проходит в несколько этапов. В отдельные процессы
при этом включаются свободные катионы. Данное явление может служить примером возможного действия разных металлов в
одном типе реакций, а т а к ж е действия металлов в одном какомлибо звене реакции.
ФЛАВОПРОТЕИНЫ
Перечисленные ферменты и их связь с металлами были известны давно. Новое в познании другой группы окислительно-восстановительных ферментов принесло открытке участия металлов во флавопротеиновом катализе. Альбертом
(Albert, 1953) и другими было показано, что некоторые металлы
являются специфическими составными частями флавопротеиновых ферментов, которые впоследствии на этом основании начали
называться металлофлавопротеинами. Эти ферменты осуществляют ряд окислительно-восстановительных реакций путем
переноса электронов. В аэробных условиях первым восстановителем в цепи реакций обычно является субстрат, а конечным —
кислород. Эта цепь в большинстве случаев состоит из нескольких звеньев'. Центральным звеном в ней являются флавопротеины, то есть ферменты, содержащие в качестве простетической
группы нуклеотидные производные рибофлавина. Вследствие
22
особенной структуры флавопротеины чрезвычайно легко окисляются и восстанавливаются веществами, окислительно-восстановительный потенциал которых лежит в соответствующем пределе. Существует ряд флавопротеинов с металлом в простетической группе.
Изучение флавопротеинов облегчается получением «искусственных» металлопротеинов, обладающих некоторыми свойствами естественных аналогов (Malher, 1953; Малер, 1957).
Флавопротеины катализируют важнейшие реакции клетки, например окислительное дезаминировгание аминокислот, окисление
восстановленных форм ди- и трифосфопиридиннуклеотидов, дегидрирование оксикислот и многое другое (Nason, 1958). Малер
(1957) считает, что изучение металлофлавопротеинов является
преддверием к познанию сложной системы «истинного» переноса электронов. Николасом (Nicholas, 1957) и другими было показано, что металл данных ферментов находится в определенных соотношениях с рибофлавиновой частью простетической
группы. Опыты с удалением его путем диализа и применения
цианида с последующим испытанием свойств полученного препарата показали, что последний теряет активность, которая
могла быть восстановлена путем предварительного введения соответствующего металла.
Впоследствии было обнаружено большое число металлофлавопротеинов, в составе которых находятся железо, молибден,
медь и марганец.
Участие железа в флавиновых ферментах, восстанавливающих цитохром с с использованием Д Ф П Н как донатора электронов, показали Малер и Елоу (Mahler a. Elow, 1954). В отсутствие железа восстановление цитохрома с сильно задерживается.
По их наблюдениям, железо необходимо для осуществления
массового переноса электронов от флавинового компонента к
цитохрому.
Тоттер с сотрудниками (Totter et al., 1953), де Ренцо и др.
(de Renzo et al., 1954), Маклер и др. (Mackler et al., 1954) показали, что молибден является существенной частью флавопротеина — ксантиноксидазы.
Незон и Ивенс (Nason a. Evans, 1953), Николас и др. (Nicholas et al., 1954) нашли, что тот же металл служит для образования редуктазы нитратов у Neurospora
crassa.
Металлопротеины являются главными ферментами в метаболизме азота высших и низших растений. Кроме того, всевозможные изменения форм соединений азота в почве, связанные
с ее плодородием, также зависят от этих ферментов. Поэтому
рассмотрим некоторые ферменты этого типа.
Ассимиляция нитратного азота растениями является результатом восстановительных реакций, изменяющих валентность
азотного атома от 5 до 3. Металлофлавопротеины катализируют
•
этот процесс до получения нитрита, гидроксиламина и свободного азота.
Н и т р а т р е д у к т а з а . Конституентом этого фермента, осуществляющего редукцию N 0 3 в NQ2, является молибден, изменяющийся в этой реакции следующим образом: Мо6+—>-Mo5+-v
->Мо 3 +. Простетическая группа данного фермента — флавинадениндинуклеотид. В ферментативном процессе происходит восстановление этого соединения как специфического донатора
электронов. Ряд опытов с применением диализа и металлосвязующих веществ подтвердил вхождение молибдена в нитратредуктазу. Последняя обнаружена также в бесклеточных экстрактах Neurospora crassa и Aspergillus tiiger. В отсутствие молибдена в клетках накапливается N 0 3 и свободные аминокислоты
(Mulder, 1948; Nicholas, 1950).
у
Нитратредуктаза высших растений отличается от фермента
В. coli некоторыми особенностями восстановления краски, употребляемой как донатор электронов (Nicholas a. Nason, 1954).
В опытах Николаса и Незона (1954) с различными фракциями протеина В. coli и Neurospora было показано, что специфическая активность фермента увеличивается параллельно с
содержанием в нем молибдена. Это также было подтверждено
Ивенсом (Evens, 1956), который показал, что М о " (радиоактивный) аккумулируется в нитратредуктазе. Механизм действия
металла исследователи относят к его участию в переносе электронов от восстанавливаемого флавина к нитратам. .
Дальнейшие исследования показали, что восстановление нитратов (бесклеточных экстрактов Е. coli) является промежуточным процессом с участием цитохрома Ъ, показывающим наличие
геминного железа. В спектрофотометре наблюдалось окисление
цитохрома Ъ при ферментном восстановлении нитратов. Следовательно, железо также принимает участие в молибдофлавопротеиновых системах в восстановлении нитратов. По механизму
действия нитратредуктазы различных организмов мало различаются между собой. Как указывает Николас (Nicholas, 1959),
изменения наблюдаются только в ходе восстановления пиридиннуклеотидов.
Н и т р и т р е д у к т а з а впервые была обнаружена в бесклеточных экстрактах Bart, руосуапеит
и Вас. pumilis. Было
показано, что N 0 2 восстанавливается ферментом до NH 3 . Она
также найдена у Neurospora и некоторых других растений. Установлено, что для восстановления 1 моль нитритов до NH3
используется 3 моль DPNH или TPNH.
Д л я максимальной активности данного фермента, как и
приведенной ниже гипонитритредуктазы, требуется кроме Мо
также Fe и Си в соединении с флавином, а также марганец.
При этих реакциях имеет место фосфорилирование (Medina а.
Nicholas, 1957).
24
Г и п о н и т р и т р е д у к т а з а — флавопротеин, восстанавливающий гипонитрит до гидррксиламина. В состав его входит
ОРЫН как электронный донатор. Для максимальной активности
также требует Си и Fe Фермент обнаружен у Neurospora crassa Мединой и Никола ом (Medina a. Nicholas, 1957а).
Г и д р о к с и л а м и н р е д у к т а з а восстанавливает гидроксиламин до NH 3 . Д л я активного действия требуется марганец,
Обнаружен впервые у бактерий, затем у Neurospora crassa и
высших растений.
АмониумдегидЬогеназа
является как бы следующим ферментом по nj ги восстановления азотных соединений.
Ход денитрификациошых процессов, осуществляемых микроорганизмами, исследов яся на культурах почвенных денитрификаторов Николасом (Is cholas, 1957а). Бесклеточные экстракты
бактерий могли редущ ровать N 0 2 до окислов азота и свободного азота. Обнаружь ;ные катализирующие ферменты оказались флавопротеинам! ведущими реакции с восстановлением
ди- и трифосфатпири; шнуклеотида и активируемые Си и Fe.
Те же авторы исслед вали процессы нитрификации, осуществляемые Nitrosomonas и Nitrobacter. Работа проводилась с накопительными культу{ ми (очевидно, не очищенных) этих организмов. Специфически ш реакциями показано, что медь является конституентной частью окислительного фермента этих
бактери-й.
,
Ферменты, обуслс ливающие азотфиксацию, также относят
к флавопротеинам. 1спользуя меченый азот (N 15 ), Берис и
Вильсон (Burris a. yilson, 1956) и др. обнаружили ряд последовательных ферменртивных превращений азотных соединений
в процессах ассимляции свободного азота азотобактером,
клубеньковыми баюриями, Clostridium pasteurianum,
водорослями и другими мкроорганизмами. По мнению авторов, при
этих процессах трауется молибден, который может быть частично заменен W V (Bortels, 1930; Horner et al., 1942).
На участие молбдена в системе фиксации азота указывают
многие авторы, в /ом числе Бортельс (Bortels, 1930), Иенсен
(Jencen, 1948), Витанен (Virtanen, 1952). Однако этот вопрос,
несмотря на MHOIС годы исследований, все еще не ясен.
Интересную т/рию относительно этого процесса выдвигает
Роберте (Robertsl959), работающий по выяснению механизма
азотфиксации аз/обактера. Он пришел к убеждению, что нитрогеназа — фермт, катализирующий фиксацию азота, имеет в
своем составе м/алл, на поверхности которого связывается газообразный a3o/(N 2 ). Таким образом, первым этапом в фиксации азота явится процесс адсорбции его металлом, который
может быть Мали Fe, имеющими на орбите свободный атом d,
с которым осгествляется связь N2. Поскольку азотобактер
нуждается в ушбдене, очевидно, этот металл связывает N2.
25
За такую же возможность высказывается и Винфильд (Winfield, 1955), полагая, что в первой стадии фиксации участвует
металл в системе азот — ферментный комплекс. В последующих
стадиях метаболизма азота участвует ги фогеназа, содержащая
железо.
С азотфиксирующей системой связы ают фермент гидрогеназу. Клетки фиксирующих азот ба$т( рий обычно обладают
значительно большей гидрогеназной акт шностью. Гидрогеназа,
по мнению некоторых авторов, участвует в дальнейшем метаболизме фиксированного азота. Молибде показан как конституент гидрогеназы азотобактера и других азотфиксаторов. Однако дефицит железа изменяет это положение. Некоторые
гидрогеназы, кроме Мо, содержат такжа Fe й Мп. Есть указания, что гидрогеназа Clostridium pastelrianum — молибдофлавопротеин и что требуемый им Мо необюдим для восстановления цитохрома с. Все же Николас не находит прямой связи
этих двух систем — азотфиксирующей и Уегидрогеназной.
Картрайт и Кеин (Cartwright a. Cah, 1959) сообщаЪт о
восстановлении ряда нитробензойных шслот бесклеточными
экстрактами бактерий (видов Pseudomonas) в соответствующие
аминосоединения. Предполагается, что вастановление обусловлено ферментом нитроредуктазой, стимулруемой Mn++, Mg++,
Fe++.
Кроме упомянутых, металлофлавопро^ины обусловливают
ряд других реакций.
Ксантиноксидаза
имеет в сво составе молибден,
который содержится в ферменте в таком эотношении: 1 атом
Мо — 2 молекулы флавина. Металл не отдерется диализом.
В состав металлофлавопротеинов Николе (1957) включает
также много других ферментов, таких, к альдегидоксидаза,
ацилкоэнзимдегидрогеназа, цитохром-с-ре, газа, дифосфопиридиннуклеотидоксидаза и др.
Интересно отметить, что такие различий реакции, как редуктаза нитратов, окисление жирных кислот,Ькисление пуринов
и восстановление дикарбоксилов, в которьт, частвует металл,
по мнению многих исследователей, проходят Исходных ферментативных процессах. Направление этих р е а к т как бы определяет вхождение в фермент ионов металла, Од И е свойства этих
реакций заключаются в системе переноса элеронов, в котором
особо важную роль играют медь, молибден икелезо.
Таким образом, в состав рассмотренных |рментов входят
четыре металла: молибден, железо, медь и|арганец. Чаще
всего находят два первых металла, во многи&лучаях некоторые ферменты содержат одновременно молибд« и железо.
Рассматривая данные ферменты, нельзя не|:тановиться на
исследованиях последних лет, посвященных у»тию металлов
в переносе электронов. Грин (1961), Грин и ^иффикс и др.
26
(1961), докладывая на V Международном биохимическом конгрессе о структуре* и функциях субклеточных частиц, дают уже
вполне-определенную схему цепи переноса электронов в окислительно-восстановительйых реакциях клетки от субстрата к
Д Н П и дальше на молекулярный кислород. В этой цепи компонентами служат FeNH (ie геминное) и Си, связанные с флавопротеинами и цитйхромо> а.
До недавнего времена изучение способности комплексов металлов к переносу элект{ энов ограничивалось главным образом
исследованием цитохром >в. В данных наблюдениях показано
разнообразие типов и ш фокий диапазон окислительно-восстановительных потенциало] хелат переходной группы. Новейшие
методы изучения — выде ение очищенных фрагментов цепочки
транспорта электронов, пектроскопическое наблюдение за изменением валентности » баллов, изучение спектров электронного парамагнитного ре онанса (ЭПР) — сделали возможным
оценку роли не входящи в гем железа и меди в переносе электронов.
Баррон (1954), Ма ер (1957), Николас (Nicholas, 1957)
приходят к следующем заключению о многосторонней роли
металла в упомянутых сярментных реакциях:
а) он стабилизируетЬромежуточные соединения при восстановлении илихжислениифлавопротеинов и, таким образом, увеличивает время и устойчивость этого промежуточного вещества,
благодаря чему возможен более эффективный перенос последующих электронов на/молекулы акцептора, а также стабилизирует свободные радиолы флавинов;
б) металлы связькиот простетическую часть с флавином
путем образования хелтных структур;
в) металлы могут/связывать флавин с двумя молекулами
акцептора, благодарящему создается возможность внутримолекулярного п е р е м е щ е н электронов, в пределах одной молекулы;
г) благодаря нал!1ию металла сходные структуры с неспаренными электронам могут вступать во взаимодействие, причем осуществляется рренос электронов между двумя системами
(субстрат — акцепте 1
д) металлы обрзуют «мостики» в электронных взаимоотношениях между разллными частями молекулы;
е) изменяя вал!тность, обусловливают восстановительные
реакции каталитич*кой системы;
ж) изменяют ркислительно-восстановительный
потенциал
системы;
з) наличие иоф металла сообщает особую гибкость системе, о с у щ е с т в л я ю т перенос электронов с Д П Н - Н на цитохромную систему|)беспечивая разнообразные добавочные пути
переноса электрор при ферментативных процессах.
27
Гидролитические ферменты
Особое внимание исследователей,
изучавших
металлоферменты, было уделено изучению пептидаз, взятых в
качестве моделей. Особенно ин'тересн^ в этом отношении работы Смита и Девиса (Smith а. Davis, 1954) и др. по изучению
кинетики энзимных' реакций металлопрптидаз. Авторы исходят
из положения, что металл в данных случаях действует как связь
между ферментом и субстратом. Работы проводили с очищенными препаратами пролидазы и лейшнаминопептидазы, полученными в кристаллическом виде. 1ыла показана специфическая роль марганца в этом первой ферменте: добавление
марганца действовало в сильной ступени- как стабилизатор
в реакциях. Опыты показали, что марганец специфически
связан хелатной связью с сульфгидшльными группами субстрата.
1
При изучении свойств другого феряента — лейцинаминопептидазы, гидролизующего амиды аминошслот и пептидов, была
показана сильная активация марганцф и магнием. Этот фермент находится в животных и раститекных клетках.
Изучение карбоксипептидаз выявилоиштересные особенности
их свойств. Белли, Раплеи и др. (Val|e, Rupley et al., 1960)
изучали роль металлов в этом фермент. Ими было показано,
что фермент, содержащий Zn++, не теряЬ своей активности призамещении цинка кобальтом. Добавлени! Со++ в избытке, сверх
определенного стехиометрического колич|ртва, приводит к дальнейшему повышению активности фермент!
В подтверждение этого Фольк и Глекер (Folk a. Giadner,
1960) показали, что n-карбоксипептидаз! может быть активирована добавлением Со++ без замещения Ы цинка. Возможным
объяснением указанного явления могло \ыть создание новых
активных центров при соединении Со++\ белком, возможно,
функционирующих по иному механизму. 1акже вероятно, что
молекулы карбоксипептидазы существуют \ различных конфигурационных состояниях, среди которых ed, часть неактивных,
переходящих в активную форму при д о б а в л я й Со.
Интересные данные о карбоксипептидаз1;ообщают Колеман
и Белли (Coleman a. Vallee, 1960). Удален! цинка, входящего
в апофермент, целиком инактивировало (Йзмент. Активность
была восстановлена добавлением металлов » е л а т н ы х комплексах, прежде всего цинка. Однако кобальт, Ьрганец, никель и
железо могли т а к ж е заменить цинк, причемЬбальт был д а ж е
эффективнее последнего. Данное явление пашсывается изменению pH среды, различному при каждом ка\оне. Цинк в апоферменте имеет двухсторонние связи, но т о к о одна сторона
связи обусловливает активность фермента. К1альт и цинк помещаются на определенной стороне поверхнД-и фермента, но
28
могут менять места прикрепления, что также отражается на
активности фермента.
О результатах своих последних работ в изучении карбоксипептидазы А Велли (.1961) докладывал н а - V Международном
конгрессе биохимиков. Новейшими достижениями в области
изучения ферментов является установление активного центра
различных ферментов. Автор нашел, что в активный центр этого
фермента входит один атрм цинка, атом азота (принадлежащий
а-амино), атом се£Ы из остатка цистеина. Заменяя цинк ионами
других металлов, он получал различные металлокарбоксипептидазы, специфичность ферментативного действия которых зависела от природы замещфного иона металла. Например, карбоксипептидазы, содержащие ионы различных металлов первого
ряда, проявляют различ|я в скорости реакции ( C o > N i > Z n >
> M n > F e ) при воздействии на разные пептидазы. Ферменты
же, содержащие металл« второй подгруппы ( C d > H g > P b ) , не
обладают пептидазной активностью, но обнаруживают эстеразную активность. Это, павидимому, является результатом соединения металла с другим! группировками молекулы.
Некоторые веские ссрбражения о структуре и функциях протеолитических^ фермент/в на том ж е V Международном биохимическом конгрессе в ь р а з ы в а е т Нейрат (1961). При изучении
«активного центра фешентов» (что является новой актуальной
проблемой в изучении|тих соединений) показана функциональная связь каталитичеки активных групп и групп, определяющих специфичность фгмента. В активную группу прокарбоксипептидазы А включенцинк или иной элемент первого переходного ряда. Цинк связж с сульфгидрильной группой апофермента
и рассматривается ка1 часть активного центра.
Из доклада на V/онгрессе Мальстрома, Розенберга и Линдскога (1961) можнс/заключить, что карбоангидраза является
т а к ж е металлофермртом. В последнее время удалось отделить
Zn++ от этого фермята и заменить его Со++, Fe++, Ni++, но не
другими металлам/ Прочность связывания этих металлов с
ферментом различая. Одной из лигандных групп соединения
металла является №.
Кроме упомяндах ферментов, свойства которых подлежали
тщательному изуч*ию, в литературе имеется много интересных
сведений о металдаерментах иного направления.
Так, Ганзалес/Gunsalus, 1954) сообщает о реакциях гидролитического типа£ которых марганец является кофактором для
нитратного десм/иза. Эта реакция может служить примером
действия хелатн£> соединения марганца с группами фермента.
Данные исследсуния производились с бесклеточными экстрактами Streptococls faecalis и Е. coli, имеющими ферменты, расщепляющие цитаты в ацетат и оксалацетат.
Такие работ показывают на возможность глубокого изуче29
ния роли металла в ферментных процессах, что в конечной цели
приведет к полному познанию действия металлоферментов.
Существующая в данное время литература по исследованию
металлоферментов указывает на следующие возможные пути
их активации ионами металла:
|
1) металл входит в активный центр фермента;
2) металл может функционировать как связующий мостик
между ферментом и субстратом, находтсь в соединении с обоими и удерживая, таким образом, с)5страт около активного
центра фермента. В этом случае мож;т быть два положения:
металл активирует субстрат, образуя I э многих случаях хелатные связи, и действует как связь;
3) металлы могут изменять конста)ты равновесия ферментативных реакций в сторону, благопрт ггную для е£ осуществления. Это может быть:
а) когда металл соединяется с субстЬатом, уже являющимся
металлосубстратом. Концентрация металта при этом возрастает,
что изменяет равновесие системы;
б) металл может образовывать ком^ 1екс с промежуточном
продуктом реакции, что также изменяет авновесие;
4) поливалентные катионы вызывают! изменение поверхностного заряда белковой части молекулы, | г о влияет на ход реакции;
5) ионы металла могут удалять ингибАор;
6) могут вытеснять неактивные ионы вЬерментах;
7) металлы, сами по себе неспособнее активировать фермент, могут вытеснять истинный активат\р из соединений, не
входящих в состав активных группировомфермента, и тем самым приблизить его к активному центру последнего.
Все сказанное не исчерпывает возможах влияний металла.
Что же касается активации ферментных »акций, то она сводится в основном к ускорению ферментныадеакций и стабилизации устанавливающегося в ходе процессов равновесия.
МЕТАЛЛЫ В НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛТАХ
Действие микроэлементов не Счерпывается участием в ферментных реакциях. Как выяснирсь, они играют
также роль в таких важнейших соединениях к^тки, как нуклеиновые кислоты.
Нуклеиновые кислоты клеточных структуркмеют огромное
значение для жизни клетки, являясь неотъеыемой составной
частью клетки растений, животных и микроорга\змов.
Известно, что металлы взаимодействуют с Уклеокислотами
и нуклеотидами. В литературе имеются указана что нуклеиновые кислоты, выделенные из различных источщов, содержали
30
один или несколько металлов (Zittle,' 1946; Stern a. Steinberg,
1958).
Сообщалось т а к ж е о том, что некоторые металлы действуют
на структурные и функциональные изменения хромосом. На способность металлов образовывать связи с Р Н К , а т а к ж е с рибо•нуклеазой указывают Фриден (Frieden, 1958) и другие (Desreux
et al., 1962).
Кирби (Kirbi, 1957, 958) нашел, что диоксирибонуклеиновые
кислоты связаны с прот'инами регулирующими металлосвязями.
На это ж е указывает ?аген (Hagen, 1960), применявший Х-иррадиацию для обрабо- ки диоксирибонуклеиновых кислот. Он
т а к ж е нашел металлы, связывающие Д Н К и протеин.
Работы Уоррена, Ускера и Велли (Warren, Wacker, Vallee,
1959) говорят в польз} участия микроэлементов в структуре и
функциях нуклеиновых кислот. Упомянутые авторы проводили
исследования, придерж ваясь строгой методики тщательной очистки сред и препарате»! от микроэлементов. Систематическое исследование нуклеинов IX кислот, изолированных из разных
растительных и ж и в о т ы х тканей, показало значительные содержания крепко связанн] х с ними металлов — Fe, Со, Си, Zn, Ca,
Cr. Их тут было б о л ь и ч е м в естественных материалах, откуда
были получены Р Н К . Гак, в 1 г Р Н К Euglena gracilis были
найдены металлы (в лг): Cr — 76, Мп — 73, Ni — 60, AI — 32,
Ca —920, F e — 1 8 0 , < 1—190, Zn — 650, M g — 400. Такие ж е
и несколько большие оличества их были найдены и в различных тканях животных Из всех выделенных поражают особенно
большие количества Q, Mg, Fe, Си и Zn.
Тесная связь метала с молекулой Р Н К доказана диализом,
не удалившим его и/препаратов. Металлы были найдены такж е и в Д Н К , однако/онцентрации их были намного меньше, чем
в РНК.
I
Сопоставляя колчество металла с величинами фосфатных
групп Р Н К разных/сточников, авторы отметили относительное
постоянство их со/ношений, равное 1 : 50. Все это дает им
основание утвержлгь специфичность взаимоотношений между
найденным металл^ и Р Н К . Они считают, что металлы входят
в неизвестные в д/ное время группировки элементов в составе
Р Н К И при опреЛенных условиях, вероятно, будет возможно
достигнуть функдонирования Р Н К при одном специфическом
металле.
Новым в выяании потенциальных возможностей Р Н К является то, что мета/ы могут обслуживать связи этих нуклеиновых
кислот с протеирыми частями (остатками) молекулы.
Авторы выд^ают гипотезу о координационных хелатных
комплексах в срЬве Р Н К между металлом и пуринами и пиримидиновыми осраниями Р Н К через азот азотных оснований.
Они высказывав предположение, что металл в Р Н К стабили-
зирует конфигурацию молекулы, связывая пурины или основные пиримидины или те и другие через ковалентные связи. Это
означает, что металлы могут принимать участие в функциональном отношении в синтезе протеина и даже передаче генетиче-.
ских свойств клетки.
В подтверждение вышеприведенных данных Виндер и Деннени (Winder a. Denneny, 1-959) сообщают о результатах культивирования Mycobacterium
smegmatis
в среде с недостаточным
количеством цинка и железа. Кроме пл< хого роста авторы констатировали относительно малое содержание
РНК, что ,-»
в свою
TT т г г
очередь вызывало задержку синтеза Д1 К и протеинам При доб г в л е н и и к у ж е в ы р о с ш е й к у л ь т у р е н е д ф т а ю щ и х ' м е т а л л о в прои с х о д и т р е з к о е у в е л и ч е н и е Д Н К , ПОВЫШ^ ние фракции неоргани-
ческих фосфатов, что свидетельствует о Ьрможении использования богатых энергией фосфорных соедигений. В этих культурах
замедлено также использование кислот|растворимой фракции,
содержащей нуклеотиды и флавины.
1
Некоторые авторы указывают на заксимость передачи наследственных свойств микроорганизмов сг микроэлементов. Так,
Сарачек (Sarachek, 1959) сообщает о кействии марганца на
передачу дыхательной недостаточности а неделящихся популяций дрожжей. Под действием маргани возникало большое
число мутационных вариантов с изменаным типом дыхания.
Автор считает, что с помощью марганцгшроисходит индукция
наследственной черты и что мутагенное дйствие марганца связано с изменением нормального синтеза ы к а в клетке.
На другой тип индукции указывают М*ем и Смит (Mrkham
a. Smith, 1954), работавшие с бактерисАагом. Определялось
поступление продуктов бактериофага в изогенные культуры
бактерий, обусловливавшее дальнейшие свбства бактериофаголизиса. На передачу этих свойств влияли\екоторые факторы:
облучение ультрафиолетовыми лучами, не№орые восстанавливающие вещества и микроэлементы. О к а з а т ь , что переключение от пробактериофага к образованию баквриофага тесно связано с балансом определенных катионов — Q Со, Мп, которые
могут быть причиной индукции продуктов ба-ериофага в лизогенные культуры.
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННС
ДЕЙСТВИЯ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ
Основой всех биохимических гАцессов является
трансформирование химической энергии в б^нергию живого
вещества. Этот процесс протекает в определены направлении,
и конечным результатом трансформирования яЬется снижение
энергии активации биохимических реакций. Ш е д н е е необходимо ДЛЯ осуществления ОСНОВНЫХ биохимичких превраще32
ний — процессов большой сложности и больших скоростей
(Брей, Уайт, 1958).
Ъиоорганохимические системы клеток живых организмов по
природе своих химических связей слабо активны. Обычные условия внешней среды (температура, атмосферное давление, кислотность и др.) также не благоприятствуют течению в них синтеза
и распада сложных органических веществ. Д л я активирования
процессов необходимо вмешательство ферментов, в активных
центрах которых в большинстве случаев содержится металл.
(Это, например, наблюдается в случае биологического окисления). Таким образом, такие металлы являются биохимактиваторами, принимающими участие в снижении величины энергии активации системы.
Ионы металла имеют большой запас энергии и большую величину электроотрицательности, что необходимо для деформирования электронных' оболочек, комплексорбразования и сгущения
электронной плотности, обусловливающих их действие. Снижение энергии а к т и в а м и биологических систем происходит при
смещении (или сгущении) их электронной плотности посредством
индукционного эффекта. При этом реагирующие молекулы
приходят в возбужденное состояние. Такую роль играют микроэлементы 4-го периода Менделеевской системы. Наиболее изученные из них — Мп, Ре, Со, N1, Си, Ъп. Энергетические возможности этих микроэлементов имеют ряд особенностей, обусловливающих их активное участие в физиолого-биохимических
процессах, особенно в процессах биологического окисления. Они
обладают большой потенциальной валентностью в возбужденном
состоянии, проявляют большой индукционный эффект, особенно
в системах с бидентальными связями. Большинство этих элементов обладает парамагнитными свойствами, что также играет
роль в действии микроэлементов. Эти элементы имеют незаполненные валентные оболочки с большими побочными квантовыми числами, способствующими их участию в свободных радикальных реакциях в * качестве инициаторов. Электроны
указанных микроэлементов способны при возбуждении диспергировать (разобщаться) и переходить на другие энергетические
уровни, то есть другие электронные орбиты. Вследствие сближенного расположения энергетических уровней, то есть вследствие близости их свойств, электроны легко могут размещаться
по ним даже при слабом возбуждении. Поэтому потенциальная
валентность в возбужденном состоянии может значительно увеличиваться, что отражается на активности микроэлементов.
В комплексных соединениях с микроэлементами возникает
индукционный эффект, передающийся по всей цепи сопряженных связей, что увеличивает потенциал системы, создавая равномерное возбуждение всех звеньев сложных органоминеральных соединений.
3—388
33
Что касается других микроэлементов, особенно бора, то возможно, что механизм его активации основан на замещении его
вакантных слоев парой электронов соседнего элемента с образованием эффективных связей, увеличивающих валентные возможности микроэлементов.
Суммируя все вышеизложенное, можно сказать, что основное физико-химическое действие ионов металла как катализаторов в биоорганокомплексах заключается в том, что они приводят в возбужденное состояние Электроны внутрикомплексной
биоорганической системы благодаря сгущению вокруг себя
электронной плотности. Последняя возникает в результате отрицательного индукционного эффекта. Эти физико-химические реакции снижают энергию активации всей взятой системы, что
дает возможность протекать в естественных условиях исключительно сложным биопроцессам при большой скорости.
Что касается действия малых концентраций микроэлементов,
так не соответствующих сложным реакциям, в которых они
участвуют, то имеется основание полагать, что микроэлементы
в форме внутренних комплексов инициируют (дают первый толчок) цепному процессу последовательных реакций. В этом процессе участвует цепь возникающих свободных радикалов, из
которых только первый возникает под воздействием микроэлементов, а в дальнейших стадиях реакции микроэлементы не
принимают участия, так как начавшаяся цепная реакция сама
создает условия, необходимые для возникновения одного звена
за другим без того, чтрбы при каждом из них участвовал специальный микроэлемент. Надо полагать, что при начальной
передаче энергии субстрату микроэлемент разрушается (или
изменяется), а затем вновь восстанавливается (по примеру
цистеината железа в окислительной системе). Таким образом,
получается «пульсирующее» состояние, обусловливающее трансформирование малыми дозами микроэлементов большого запаса
химической энергии в энергию живого вещества (Бартон, 1959).
ЧАСТЬ
II
ДЕЙСТВИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ
НА МИКРООРГАНИЗМЫ
Влияние микроэлементов на растительные организмы до последних десятилетий изучали главным образом на
высших растениях, и только в незначительном количестве работ
были использованы микроорганизмы. По мнению некоторых исследователей, действие микроэлементов легче проследить на
высших растениях, чем на микроорганизмах, поскольку прирост
биомассы у первых более заметен. Однако скорость роста микробных популяций дает возможность более быстро получать
ответы на поставленные вопросы. Это делает микробные тесты,
использованные в опытах, более простыми и удобными. Видимо,
поэтому изучение влияния микроэлементов в начальной своей
стадии наряду с высшими растениями проводилось т а к ж е и на
микроорганизмах.
Начатые в конце XIX и начале XX ст. исследования, сначала
очень разрозненные, носящие характер случайных открытий,
все ж е показали, что основными микроэлементами, необходимыми для микроорганизмов, являются Fe, Си, Mn, Mo, Zn, В, Со.
Их количественное потребление обычно зависит от особенностей
испытуемого организма.
Кроме воздействия на увеличение общей массы клеток микроэлементы действуют и на другие функции организма, на его
морфолого-культуральные свойства, количество и качество образуемых им веществ, на ферментативные процессы. Часто
микроэлементы нужны для функционального действия отдельных
ферментов и для других процессов, от которых во многих случаях может зависеть проявление основных функций организма.
Так, Мульдер (Mulder, 1939, 1948) не отмечал действия меди
на рост азотобактера, но культуральные свойства этой бактерии
изменялись в среде без данного элемента. Фостер и Ваксман
(Foster Эр W a k s m a n , 1939, 1939а) нашли, что отсутствие цинка
послужило причиной потери способности Rizophus
nigricans
усваивать углеводы, но наряду с этим отмечалось усиление образования йм фумаровой кислоты. Согласно Фостеру (Foster,
1949), отсутствие цинка, железа, меди и марганца в среде при3*
35
водило не только к уменьшению роста плесневых грибов, но и
к накоплению таких промежуточных продуктов метаболизм^,
как фумаровая и лимонная кислоты.
Первыми микроорганизмами, использованными в качестве
тест-объектов в опытах с микроэлементами, были плесневые грибы Aspergillus niger, Rhizopus nigricans. Такой выбор объектов,
видимо, был обусловлен их отзывчивостью на микроэлементы,
при применении которых заметно усиливались не только рост,
но и .физиологические функции этих микроорганизмов. Почти
вся литература первых лет исследований относится к этим
объектам и только в последние десятилетия начинают поступать сведения о действии микроэлементов на бактерии, актиномицеты и микроскопические водоросли.
Существенной особенностью в действии микроэлементов являются их относительно малые дозы, необходимые для культивирования бактерий. Такие малые количества микроэлементов
во многих случаях находятся в среде как загрязнения, поступающие с минеральными солями, органическими соединениями
и даже стеклом посуды, в которой ведут опыты. Эти случайные
поступления микроэлементов в среду в некоторых случаях могут не только мешать постановке опыта, но и искажать получаемые данные, давая разноречивые результаты. Понадобилось
немало времени, чтобы понять необходимость особых предосторожностей в технике исследований микроэлементов, исключающих возможность загрязнения сред для роста микроорганизмов.
Особенно это относится к опытам, в которых исключают тот-,
или иной элемент из среды для выяснения его необходимости в
питании микробов.
Если обратиться к истории развития данного вопроса, то
одним из первых исследователей в этой области можно считать
Пастера, показавшего важность минерального питания микроорганизмов добавлением золы в среду для их выращивания. Затем
Ролан (Raulin, 1869), работая с Aspergillus niger, вносил в сре-ду железо и цинк. Недостаток этих элементов заметно воздействовал на рост и продуктивность гриба. Многочисленные
работы Жавилье и Бертрана (Javillier, 1914; Bertrand, Javillier,
1911, 1912; Bertrand, 1912, 1913) подтвердили выводы предыдущего автора, установив, что кроме названных элементов марганец и медь также необходимы для нормального развития и
образования конидий этого гриба. Необходимость цинка в дальнейшем была подтверждена Стейнбергом (Steinberg, 1919, 1935).
Этот же автор показал участие молибдена в редукции нитратов
у бактерий (Steinberg, 1936).
В конце XIX ст. теория благоприятного действия малых количеств минеральных элементов нашла свое признание. Но вопрос о специфичности действия отдельных элементов еще не
поднимался. Действие микроэлементов объяснялось их необхо-
димостью в реакциях организма, борющегося с неблагоприятными факторами существования. Только после работ Ролана,
Бертрана и Жавилье действие микроэлементов было признано,
и они стали рассматриваться как физиологические катализаторы
в организмах.
Успех работ указанных авторов в значительной мере исходил
от впервые примененной ими очистки сред от микроэлементов.
Методы же очистки в те годы были весьма несовершенны.
Интересна возникшая в то время дискуссия о действии цинка и железа. Одни приписывали это действие косвенному влиянию данных элементов на сре!цу; другая же сторона стремилась
показать, что. цинк непосредственно действует на
Aspergillus
niger, активируя его ферменты и усиливая использование углеводов. Последнее положение удалось подтвердить классическими
опытами Жавилье, разделившего очищенную среду на две части.
В одну из них он добавил цинк. Aspergillus
niger развился в
среде с цинком и не рос без него. В этих же опытах было показано, что цинк не мог быть заменен другим металлом.
Доказательство необходимости микроэлементов для грибов
усложнилось тем, что количество необходимых элементов для
различных особей не всегда одно и то же не только для различных видов, но даже в пределах штаммов одного и того же
вида. Все же Стейнберг (Steinberg, 1935, 1936) пытался установить относительные количества металла, требуемые для оптимального роста Aspergillus
niger. Эти дозы, по его мнению,
были следующими: ££.—0,2, Zn—0,18. Си—0,04, Мп—0,02, Мо—
0,02 мг/л. В дальнейшем Фостером (Foster, 1У4У) ЬЫЛО подтверждено, что железо, цинк, медь и марганец необходимы для
роста всех плесневых грибов. Однако оптимальные дозы, рекомендованные им, были сильно изменены впоследствии другими
. авторами.
Лавали (Lavallay, 1955), работая с Aspergillus
niger, пытался экспериментально установить соотношение между дозировками микроэлементов в среде и получаемой эффективностью
роста, микроорганизмов. Он предложил формулу, выражающую математическое отношение между ростом и дозой микроэлемента. Однако такого рода выражение отношений микроорганизма к среде нам кажется неправильным, поскольку при
росте может играть роль множество неучтенных в формуле
факторов.
В обширных обозрениях, касающихся влияния микроэлементов на грибы (Foster, 1939, 1949; Perlman, 1949; Лилли и
Барнет,' 1953), отмечается многогранность этого действия. Микроэлементы действуют на интенсивность и характер роста,
пигментацию, продукцию различных веществ: витаминов, антибиотиков, ферментов.
В исследованиях последних лет начинают фигурировать иные
36
37
микроэлементы, причем их действие сказывалось не только на
росте, но и на многочисленных функциях разных микроорканизмов.
ВЛИЯНИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ
НА РОСТ МИКРООРГАНИЗМОВ
Г р и б ы . Как уже было сказано, исследования,
проведенные в последние десятилетия, показали, что ионы металлов играют важную роль в росте и жизнедеятельности микроорганизмов. Были также до£тигнуты некоторые успехи в понимании действия ионов на обмен их веществ.
В своих работах Стейнберг (Steinberg, 1945) утверждал, что
минеральное питание плесневых грибов схоже с таковым у зеленых растений, что они, как и последние, нуждаются в микроэлементах. Действительно, многими авторами отмечалось влияние микроэлементов на рост грибов. Существующие относительно этого данные очень разнообразны, так как они обычно
относятся к опытам с различными видами и штаммами, различными дозами микроэлементов, средами и условиями опыта.
Первые опыты, показавшие необходимость микроэлементов
для роста и прибавки веса мицелия Aspergillus
niger, принадлежали уже упомянутым Ролану, Жавилье, Бертрану. Первый из
них пишет о «замечательном факте действия малых количеств
цинка, способных образовывать большие количества органического вещества мицелия» (Raulin, 1869). По мнению Ролана, действие цинка и железа на гриб очень схоже, хотя каждый из них
отправляет свою специальную функцию и замена одного другим
недопустима. Он придерживался взгляда на эти элементы как
на необходимые питательные вещества (компоненты среды), а
не биологические стимуляторы.
Рихард (Richard, 1897), работавший с различными дозами
цинка, железа, кобальта, никеля, алюминия, марганца, пришел
к заключению, что малые дозы некоторых из них увеличивают
сухой вес гриба в 2—4 раза. Работая с очищенными от микроэлементов средами, Стейнберг (Steinberg, 1919) также подтвердил необходимость цинка для Aspergillus niger, почти не росшего
без этого элемента и усиливавшего рост в 2000 раз при его внесении.
Подобные данные были получены в отношении того же микроорганизма Бортельсом, Робергом и Гольмиком (Bortels, 1927;
Roberg, 1931; Golmick, 1936). Усиление роста Aspergillus
niger
от применения марганца, цинка и отчасти бора наблюдали также Горбах с сотрудниками (Gorbach et al., 1957, 1957а).
Изменение формы углеводного питания в синтетических средах не влияло на потребность этого же гриба в микродозах
железа, меди, цинка, марганца, молибдена (Steinberg, 1919,
38
1939, 1942). По данным того же автора, особенно заметно на
рост гриба действие цинка, который не мог быть заменен другими микроэлементами. На споруляцию гриба больше действовала медь. Фишер (Fischer, 1942) говорит о необходимости для
роста гриба цинка, меди, железа, марганца в среде, источником
углерода которой является крахмал. В среде же с арабогалактозой необходим молибден.
Кроме влияния упомянутых микроэлементов, наблюдалось
также олигодинамическое действие на данный гриб ванадия, заметно усиливающее его рост даже при наличии в среде других
элементов (Bertrand, 1941, 194^).
Большие исследования в области действия микроэлементов
принадлежат Мульдеру (Mulder, 1939, 1954, 1957). Им была
подтверждена, с применением современных методов очистки
сред, необходимость Fe, Zn, Си, Mo для роста и спорообразования Aspergillus niger и других видов аспергиллов — Aspergillus flavus и Aspergillus glavcus, а также Rhizopus
nigricans.
Изучая специфическое действие цинка и других тяжелых
металлов (Fe, Mo, Мп, Си) на рост и физиологические особенности Rhizopus nigricans в очищенной от микроэлементов среде,
Фостер и Ваксман (Foster a. Waksman, 1939) пришли к выводу, что данные элементы необходимы грибу, особенно цинк,
наличие которого в среде заметно изменяло физиологические
особенности этого микроорганизма и без которого он не рос.
Говоря об элементах пластических и функциональных, авторы
относят цинк как к одной, так и другой категории, то есть рчитают, что этот элемент, служит пластическим веществом, а такж е сильным и необходимым катализатором ферментативных
реакций.
Действие цинка на различные виды Rhizopus отмечено многими исследователями. Этот элемент, ускоряя рост и образование спор, увеличивал вес мицелия в синтетической среде с глюкозой (Waksman a. Foster, 1938; Lockwood, 1940; Albert et al.,
1947).
Сравнивая действие смесей микроэлементов, в которые входили Zn, Мп, Си, на рост гриба, Нильсен (Nielsen, 1940) находит подобие с действием на него ростовых веществ. Усиление
роста грибов из рода Fusarium при действии цинка отмечает
Центмаер (Zentmeyer, 1944).
Грибы других семейств также положительно реагировали на
микроэлементы. Mucor ramannianus мог расти на среде с определенными источниками азота только при наличии в среде Си,
Mo, Li, V.
Мойер и Коджил (Moyer a. Coghille, 1946) отмечают необходимость микроэлементов при росте Penicillium
notatum и Реnicillium chrysogenum в синтетических очищенных средах. Особенно заметно было действие цинка. Гораздо позднее, при
39
усовершенствовании технологии получения пенициллина, изучалось действие марганца на Pénicillium
chrisogenum,
значительно повышавшего рост этого гриба и использование им Сахаров.
Оптимальной дозой являлись 0,004% сернокислого марганца
(Наместникова, 1960). При добавлении цинка к очищенной среде, содержащей витамины и аминокислоты, рост
Phycomyces
blacesleanus
увеличивался вдвое (Leonian a. Lilly, 1940), в то
время как другие микроэлементы не действовали.
Опыты Бланка, Езекиля (Blank, 1941; Ezekiel, 1945) с Phymatotrichum
omnivorum,
изучавших действие отдельных микроэлементов в синтетической очищенной среде, показали, что только цинк, марганец и железо увеличивали образование мицелия;
кобальт, никель, медь, кадмий и алюминий угнетали его рост.
Рост Neurospora
crassa усиливался при добавлении следов Zn,
В, Mo, Mn, Fe, Си (Ryan, 1943).
Б О Л Ь Ш И М вкладом в изучение действия молибдена были работы Николаса (Nicholas, 1957). Культивируя Neurospora
crassa
на среде без Mo, автор наблюдал значительное снижение роста
мицелия; добавление молибдена к такой плохо растущей культуре уже через 2 дня восстанавливало вес мицелия до 95% веса
контроля. Однако добавление молибдена к гомогенату мицелия
не имело действия.
В России первые работы по исследованию действия микроэлементов принадлежали Буромскому (Буромский, 1912; Buromsky, 1913). Р а б о т а я с очищенными средами, он испытывал влияние солей Zn, Mg, Са, К, Na на развитие Aspergillus
niger. Им
т а к ж е отмечено значительное увеличение роста мицелия гриба
и необходимость для этого цинка.
Дальнейшие исследования Васильева (Васильев, 1930; Wassilliew, 1935) показали, что действие цинка как стимулятора
можно обнаружить у ж е в первые дни роста гриба. В этом случае лучшие результаты были получены при наличии в среде
глюкозы, янтарной или лимонной кислот.
Подобное действие цинка, увеличивающее в два раза вес
мицелия, наблюдали т а к ж е Буткевич (1957), Буткевич и Баринова (1932). Полученные ими данные были настолько убедительны, что авторы рекомендовали применение определенных
доз этого элемента для промышленного производства лимонной
кислоты.
Большая работа в отношении действия цинка и других микроэлементов, о которых речь будет ниже, проведена в - двадцатых годах Костычевым, работавшим т а к ж е с Aspergillus
niger.
Все эти данные относительно необходимости меди, цинка и
железа для роста Aspergillus
niger подтверждены позднейшими
исследованиями (Упитис, 1961), проведенными при тщательной
очистке сред от металлов. В этих условиях гриб совершенно не
рос. Внесение их способствовало активному росту и спорообра40
зованию гриба. Взятые элементы, по мнению автора, специфичны, и ни один из них не может быть заменен другим.
Применение радиоактивного цинка расширило наши представления о его действии. Так, Гезер (Geser, 1962) проследил
поглощение этого элемента клетками упомянутого гриба в ходе
его развития. Поглощение цинка начиналось с прорастания конидий. Усиливая рост гриба, он накапливался в организме пропорционально сухому весу. Он был найден в органических и
неорганических фракциях экстрагированного мицелия.
Интересно, что такое же влияние микроэлементов Mo, Zn, В
и Мп наблюдалось в исследованиях последних лет микоризных
грибов, которые более интенсивно росли в средах и развивались
в древесных растениях при применении этих элементов, особенно
марганца (Шемаханова, 1959; Мишустин и Пушкинская, 1961).
А к т и н о м и ц е т ы . После первых исследований влияния
микроэлементов на рост грибов в литературе появляются работы, подтверждающие это действие на других объектах. Наблюдения производили на микроорганизмах, обитателях различных
экологических зон, поскольку исследования проводились в раз- >
личных странах мира, особенно Европы и Америки. Полученные разными методическими приемами, результаты носят иногда
разноречивый характер, но большинство из них подтверждает
благоприятное действие некоторых металлов на рост и развитие
микроорганизмов. В большинстве исследований авторы не пользовались очищенной от металлов средой, а наблюдали их влияние по естественному для данных условий фону.
При изучении минерального питания актиномицетов, продуцентов антибиотиков, и оптимальных условий их культивирования было выяснено действие многих металлов на рост этих микроорганизмов.
Обычно положительное действие на рост сказывалось и на
усилении продукции антибиотика, но в некоторых случаях различные металлы действовали только на рост, другие же — на
образование антибиотических веществ. Большинство работ,этого
направления относится к продуценту стрептомицина — Streptomyces griseus. В ранних исследованиях Темпла (Temple, 1948)
усиление роста мицелия этого гриба наблюдалось при воздействии магния и калия. Железо же действовало только на выход
антибиотика. В дальнейшем такие же данные были получены в
отношении цинка и меди (Chester a. Rolinson, 1951, 1951а).
Исследования Чалюпки говорят о таком же действии К, Na,
Mg, Са, Fe, Zn, значительно увеличивающих вес мицелия (Challupka,1957j.
Рост другого актиномицета — Streptomyces
fradii — на синтетической среде с глютаминовой кислотой и глюкозой также усиливался под влиянием К, Mg, Fe, Zn (Dulmage, 1953). Некоторые сведения говорят о том, что при наличии в среде меди в
41
дозе 0,01%, а также кусочка медной пластины они производят
задерживающее действие.
Как сообщают Хикей и др. (Hickey a. Tresner, 1952), кобальт
оказывал положительное влияние на рост и споруляцию Streptomyces fradii и других актиномицетов.
Спилсбери (Spilsbury, 1948), употребляя мясопептонную
среду, испытал действие многих микроэлементов, в том числе
редких металлов и анионов. Он сообщает о повышении роста
актиномицетов при добавлении молибдена.
Некоторые литературные данные говорят об увеличении роста актиномицетов при добавлении к среде почвенных экстрактов или их золы. Увеличение это было пропорционально внесенной в среду золе и объясняется наличием в ней микроэлементов. Это толкование основывается на данных опытов с
очищенными средами с последующим добавлением отдельных
металлов, благоприятно влияющих на культуры актиномицетов.
Лучшими дозами металлов оказались: Fe — 0,05 мг%, Мп —
0,0005, Zn, Си, Mo —0,005 мг%. Комбинации металлов в некоторых случаях были эффективнее, чем поодиночное внесение
микроэлементов в среду. Лучшими сочетаниями были: Fe—Zn,
Fe—Mn—Zn, Fe—Zn—Mo—Mn.
Изучение эффективных комбинаций микроэлементов проводилось на 8 видах Streptomyces.
Металлы — Fe, Zn, Mn, Си,
Mo — ВНОСИЛИ отдельно и в различных сочетаниях. Критерием
эффективности служил рост, который усиливался от железа И
ц и н к а ' у всех культур. Марганец был эффективен только для
Streptomyces
caelicolor, медь не действовала на три вида и
уменьшала рост Streptomyces
fradii на 55% (Lechevalier, 1951;
Heim, 1956).
Д р о ж ж и . О действии микроэлементов на рост и различные функции дрожжевых культур говорится в обозрении Нейберга (Neuberg, 1946). Более специальным сообщением, непосредственно рассматривающим минеральное питание дрожжей,
является работа йослиня (Joslyn, 1941).
Следует отметить чрезвычайно обстоятельную, безукоризненно выполненную работу с дрожжами Кнюзеля (Knusel, 1957).
Автор изучал влияние микроэлементов, ib особенности цинка и
железа, на рост и образование витаминов 10 видов Candide
Guilliermondii
и 9 близких к ним видов дрожжей. Рост всех
этих микроорганизмов усиливался в сильной степени от железа '
и цинка, меньше действовали медь, марганец, молибден, ванадий.
Хорошо влияли также комбинации железа и цинка.
В о д о р о с л и . Потребность в микроэлементах при росте
водорослей подтверждена рядом работ. Так, Пирсон (Pirson,
1958) обнаружил необходимость марганца для роста Ankistrodesmus. Действие молибдена на сине-зеленую водоросль Cylindrospermum наблюдал Венкатарамон (Venkataraman, 1959). Эта
42
водоросль, выделенная из почвы, в питательной среде без молибдена не развивалась. По мнению автора, причиной этого
является молибден, который способствует усвоению нитратов.
Тот же микроэлемент, по данным Арнона и др. (Arnon et al.,
1955), усиливает рост Scenedesmus.
Оба автора объясняют действие молибдена восстановлением нитратов, благодаря чему последние лучше используются водорослями.
При массовом выращивании Chlorella Уолкер (Walker, 1953,
1954) убедился в необходимости для роста этой водоросли не
только кальция, но и железа, марганца, молибдена и цинка.
Доза бора в количестве 0,1 мг/л давала прирост биомассы
Nostoc muscorum на 39% (Eyster, 1952).
В литературе также есть указания на возрастающие потребности в микроэлементах у микроорганизмов и простейших с
повышением температуры (Hutner, 1958).
Б а к т е р и и . Зависимость роста бактерий от наличия в среде микроэлементов в большинстве случаев изучалась при использовании почвенных микроорганизмов. Большинство работ такого
рода относилось к наблюдению действия молибдена, бора, ванадия и вольфрама на рост и азотфиксацию азотобактера и
клубеньковых бактерий.
Многочисленные исследования в этом направлении принадлеж а т Бортельсу (Bortels, 1930, 1936, 1937, 1939), одному из первых показавшему, что при наличии молибдена усиливается
размножение азотобактера. Работая с малогумусными почвами,
Бортельс наблюдал резкое увеличение в них количества азотобактера при внесении молибдена и ванадия. Автор все ж е выражает сомнение относительно необходимости этих элементов
для роста азотобактера, однако отсутствие этой бактерии в
некоторых почвах он объясняет отсутствием в них молибдена.
Того же мнения придерживается и Ван-Ниль (Van-Niel, 1935),
который не мог выделить азотобактер из почв с низким содержанием Мо. Данные Бортельса о стимулирующем действии
молибдена на азотобактер были подтверждены Клюйвером и
Ван-Рененом (Kluyver a. Van-Reenen, 1933), а также Бэрком
и Хернером (Burk а. Horner, 1935). Зависимость между содержанием молибдена в почвах и распространением и активностью
азотобактера подчеркивает Беляков (1950), констатировавший
отсутствие азотобактера в целинных почвах, бедных молибденом, и нашедший его в засушливой зоне Северного Прибалхашья,
почвы'которого содержали молибден.
В условиях орошаемого земледелия Узбекистана внесение
молибдена стимулировало рост азотобактера и других бактерий
в почве и в ризосфере хлопчатника, где количество этой .бактерии увеличилось в 4—4,5 раза (Кузнецов, 1952). Усиление развития азотобактера при действии молибдена наблюдалось также
и в условиях ризосферы озимой пшеницы. Так, Савельева (1954)
4.3
отмечает увеличение числа клеток этой бактерии при применении суперфосфата с молибденом и бором.
Лабораторные и вегетационные опыты Матуашвили (1947)
показали резкое ускорение развития азотобактера под действием
молибдена, что привело автора к убеждению о необходимости
этого элемента для данной бактерии.
Действие молибдена и вольфрама на два вида азотобактера
подтверждено также позднейшими работами Килера и Варнера
(1962), проведенными с радиоактивными элементами и тщательной очисткой сред от загрязнений. В этих условиях авторы
наблюдали явную необходимость молибдена для роста обоих
видов.
Меньше исследований проведено в отношении действия бора. По мнению Герретсена и Хупа (Gerretsen a. Hoop, 1954),
бор является необходимым элементом для азотобактера, так же,
как и молибден, ускдряющим его рост и размножение. С другой стороны, Андерсон и Джордан (Anderson a. Jordan, 1961) не
нашли жизненно необходимым для азотобактера наличие в питательной среде бора. О необходимости цинка для роста этой
бактерии говорят исследования Метца (Metz, 1930).
Мало сведений в литературе о действии на азотобактер марганца. Но, по данным Стейнберга (Steinberg, 1938), скорость
размножения этой бактерии в среде без марганца замедляется.
Разноречивы данные литературы относительно действия меди.
О ее необходимости говорит Шредер (Schröder, 1952), в то время
как Гриве (Greaves, 1933) сообщает о ее токсичности для развития и усвоения азота азотобактером. В данном случае авторы
использовали разные дозы меди, давшие им противоречивые
результаты.
В почвенных условиях (Eisswein u. Schwartz, 1939) медь
угнетала азотобактер в первые дни, в последующий же период
наблюдалось восстановление первоначального количества клеток. Радлер (Radler, 1955) отмечает благоприятное влияние
кобальта на размножение азотобактера.
Параллельно опытам с азотобактером Бортельс (Bortels,
1936, 1937а) проводил наблюдения над клубеньковыми бактериями клевера, сои, гороха и др., показавшие, что молибден
и ванадий повышают приживаемость и развитие этих бактерий
на корнях растения-хозяинДж-Это обычно выражалось в увеличении количества и величины клубеньков. Повышение азотфиксации и развитие клубеньков на вике под действием бора отмечали Бренчли и Торнтон и др. (Brenchley a. Thornton, 1925).
Подобные же результаты получил Мульдер (Mulder, 1939,
1948а). на клевере и люцерне при испытании клубеньковых бактерий этих растений.
О положительном действии молибдена и бора на развитие
клубеньковых бактерий в почве сообщают также Клинцаре и
44
Креслиня (1961). Комбинированное применение этих микроэлементов на дерново-среднеподзолистой почве Латвии увеличило
количество клубеньковых бактерий клевера в 4, люцерны — в
6 раз.
Некоторые сведения о действии кобальта на данные бактерии
сообщают Риче с сотрудниками, Лоу и др. (Richie et al., 1960;
Lowe a. Evans, 1962). Первые установили резкое ускорение роста клубеньковых бактерий сои на среде с кобальтом и усиление
приживаемости данных бактерий на корнях; вторые, проводя
тщательно поставленные опыты с клубеньковыми бактериями,
установили значительное усиление развития различных видов
этих бактерий, особенно клубеньковых люцерны, от действия
данного элемента.
Кроме того, изучали отзывчивость ряда других бактерий на
микроэлементы. В исследованиях с целлюлозными бактериями
Штапп и Бортельс (Stapp u. Bortels, 1934) убедились в том, что
для развития и активности этих бактерий требуются, кроме
кальция, также марганец и железо. Однако эти требования в
большой мере зависят от типа почв и их pH. Бортельс (Bortels,
1956) также сообщает, что Cellvibrio и Cytophaga нуждаются в
марганце и железе и частично в меди в слабокислых почвах, а в
щелочных эти элементы нужны только для Cellvibrio.
Многочисленные литературные данные свидетельствуют о действии микроэлементов на почвенную микрофлору в полевых
условиях при внесении их в качестве удобрений. Так, в многолетних и обширных полевых опытах с марганцевыми и другими
микроудобрениями, проведенными в Институте физиологии растений АН УССР, изменялись состав и количество микрофлоры
(Власюк, 1952, 1956; Гродзинская, 1959). В ризосфере сахарной
свеклы, кукурузы, льна и др. растений наблюдалось увеличение
нитрифицирующих, маслянокислых и других бактерий. Данные
лаборатории микробиологии ВИУА, приводимые Кедровым-Зихманом (1952), говорят о значительном действии бора на количество почвенной микрофлоры. В подзолистых почвах изменяется
количественное соотношение бактерий к грибам. Особенно это
заметно при действии бора по фону извести. Без бора это соотношение равно 4,7, при внесении этого-элемента — 13,4. При
этом число бактерий увеличивается с 800 до 2010 тыс. на 1 г
почвы, а число плесеней уменьшается с 170 тыс. до 150, при
этом усиливается рост клубеньковых и нитрификаторов. Подобные данные получены Рубенчиком и Бершовой (1959). Применение микроэлементов значительно повышало биологическую активность микрофлоры почвы.
Усиление микробной деятельности с внесением микроэлементов в почвы Восточной Сибири отмечает Ламбин (1950). Благоприятное действие бора на микрофлору почв констатируют
также Челядинова и Судакова (1952). По их мнению, этот
45
элемент стимулирует развитие бактерий д а ж е в том случае,
когда он применяется в дозах, токсичных для высших растений.
Бор изменяет распределение микроорганизмов на корнях растений, увеличивая количество требующих органическое вещество. Размножение группы гнилостных бактерий при воздействии
В в торфяно-болотных почвах Латвии отмечает также Озолиня
(1958). В ризосфере кукурузы и трав количество микроорганизмов увеличивается в несколько раз при внесении этого элемента.
Увеличение численности ризосферной микрофлоры бобовых и
злаковых культур при внесении микроэлементов отмечено и другими авторами (Креслинь, 1963, 1963а; Клинцаре, 1963). Данное явление в значительной мере зависит также от сопряженности происходящих в почве процессов. Усиление азотфиксации
и связанное с этим повышение азотного баланса почвы влекут
за собой повышенную активность аммонифицирующих и нитрифицирующих бактерий.
Такое же действие на микрофлору почвы оказывали бор,
марганец, цинк, медь и в иных условиях. Внесенные с поливными водами и внекорневой подкормкой на тяжелосуглинистых
черноземах Приазовского края, они стимулировали развитие микрофлоры ризосферы некоторых сельскохозяйственных растений.
Усиливалось развитие Вас. mycoides и увеличивались показатели биологической активности почвы (Щепкина, 1961).
Широко поставленные опыты в Азербайджанской ССР также подтверждают эти данные. Микроудобрения, полученные на
базе отходов нефтяной промышленности, значительно повышали развитие почвенных микроорганизмов, в том числе и азотобактера, в условиях суглинистых почв этой республики (Касимова, 1961). Там же в условиях Бардинского и Адамского районов наблюдалось активирующее действие марганца, бора и меди
на азотобактер и азотфиксирующую микрофлору почвы (Абуталыбов, 1961); меньший эффект был получен от цинка и кобальта (Абуталыбов, Газиева, 1961).
Действие бора и в меньшей мере других микроэлементов
на почвенную микрофлору констатировали и в условиях суглинистых почв Западной Европы (Günther u. Meschkat, 1955).
Об усилении роста под влиянием марганца ряда распространенных в почве бактерий (Вас. subtilis, Flavobact.
lutescens)
сообщает Бауэрнфельд и др. (Bauernfelld et al., 1960). Автор
считает, что эти микроорганизмы являются конкурентами высших растений в области использования этого элемента. Он также полагает, что болезни растений вследствие недостатка марганца происходят из-за развития особой манганофильной микрофлоры, активно накапливающей и переводящей его в труднорастворимые формы.
Нельзя не остановиться на данных, касающихся других групп
бактерий, распространенных в почве. Так, необходимость мар46
ганда для некоторых видов молочнокислых бактерий доказана
работами Маклеода и Снеля (MacLeod a. Snell, 1947). Работая
с Lactobacillus
delbrueckii, Петере и Снель (Peters a. Snell,
1954) убедились в необходимости для развития этой бактерии
кроме некоторых аминокислот еще и магния, который может
быть заменен марганцем. Тот же марганец в количестве 110 мг/л
стимулировал размножение Lactobacillus
pentoaceticum,
влияя
таким образом на выход продуктов брожения и меняя их соотношение в сторону увеличения выхода спирта (Гречушкин, 1961).
О полезности применения марганца в молочной промышленности свидетельствуют работы Мана и Гелеслуфа (Man a. Galesloof, 1962). Добавление марганца к молоку стимулировало развитие R-кокков, входящих в состав микрофлоры закваски, что
устраняет наблюдающееся весной ослабление активности заквасок. Усиливается лимоннокислое брожение, оказывающее влияние на показания креатиновой пробы. Размножение R - K O K K O B
увеличивает содержание диацетила в масле.
Действие микроэлементов на рост бактерий кишечной группы
проверялось Бернасовской (1960). В очищенною от металлов
синтетическую среду с добавлением различных концентраций
Fe, Си, Zn, Мп, Мо, Со высевались брюшнотифозные, дизентерийные и другие бактерии. Все они в той или иной мере усиливали рост под действием этих элементов; больше стимулировало
рост железо. Токсичность и антигенные свойства культур не
менялись. Фаге и Гудо (Faguet et Goudot, 1961) наблюдали положительное действие железа и марганца на развитие (ускорение лаг-фазы) и рост четырех штаммов Е. coli; кобальт и никель
в данном опыте не оказывали действия. Однако эти элементы
проявили положительное влияние в опытах с Clostridium
sporogenes в анаэробных условиях. Авторы связывают действие ионов
с окислительно-восстановительным потенциалом среды, поскольку с разложением клеток увеличивается рН последней. По их
мнению, ион металла катализировал реакцию окисления, вступая в связь с группами ОН и SN. В работе приводятся схемы
возможных реакций.
Маклеод (McLeod, 1951) установил необходимость марганца
и магния для роста Streptococcus
faecalis. Его исследования
показали, что эти элементы нельзя заменить другими. При недостаточном их количестве наблюдался автолиз культур, который мог быть прекращен внесением данных элементов.
Усиление рвета Clostridium perfringens
под действием молибдена в условиях роста на казеино-гидролизатной среде наблюдал Диневич (1961). Автор указывает на угнетающее действие меди (в дозе 5 мг/л) на рост этой бактерии. Однако добавление молибдена нейтрализовало действие меди, и кривая
роста бактерий была равна контрольной (без металлов).
По данным Петерсон (Patterson, 1960), кобальт, цинк и
47
медь, примененные совместно, усиливали рост
Mycobacterium
tuberculosis avies на среде Дорсе примерно в три раза. Изучение же роста культур Б Ц Ж на средах с микроэлементами
показало значительное влияние цинка. С внесением последнего
происходило усиленное образование пленки, которая употреблялась для изготовления вакцины. Железо, свинец и медь не имели
такого значения для роста этих культур (Will'iston et al., 1,958,
1962).
В опытах Горбаха и др. (Gorbach et al., 1955) добавление
кобальта и бора усиливало рост Вас. asterosporus, чего не получалось при применении цинка и меди. Авторы показали адсорбцию кобальта клетками этой культуры, причем она теряла
способность образовывать газ.
Представляет интерес то, что галофильные бактерии, имеющие в своих клетках сравнительно большие количества минеральных элементов, также реагируют на некоторые микроэлементы. Так, Сегаль и Гиббоне (Sehgal a. Gibbons, 1960)
установили стимулирующее влияние на развитие
Halobacterium
salinarium,
Halobacterium
cutirubrum, Halobacterium
halobium
железа в концентрации до 50 мг/л. В его отсутствие данные
бактерии не росли, железо понижало потребность этих бактерий
в NaCl. Сернокислый марганец в концентрации 0,05 г/л также
увеличивал скорость роста и конечное количество клеток бактерий. Увеличение же доз _ марганца задерживало рост, удлиняло лаг-фазу, но не уменьшало общего выхода клеток.
В литературе имеются указания относительно морских бактерий, проявляющих сульфатредуцирующую способность (Hata,
1960) и нуждающихся для своего роста в железе. Другие микроэлементы — Ni, Zn, Си и Cd — частично подавляли их рост.
О биологической роли Mn, Си, Zn сообщает также Беренштейн
(1948, -1949, 1950).
С п о р ы б а к т е р и й . Ряд литературных источников свидетельствует о действии микроэлементов на споры бактерий —
их образование и прорастание. Усиление прорастания спор Вас.
megaterium под действием марганца наблюдали Левинсон и Хитт
(Levinson a. Hyatt, 1955, 1959). Они объясняют это действие
активацией протеолитических ферментов. При расщеплении протеина одним из продуктов реакции образуется 1-аланин, известный стимулятор прорастания спор. Таким образом, получается
косвенное действие марганца на данный процесс. Но то, что
увеличение дозы марганца усиливает процесс дыхания взятой
бактерии и прорастание спор при наличии внесенного 1-аланина,
заставляет предположить особую, еще неясную и не связанную
только с 1-аланином роль марганца. С другой стороны, тот ж е
марганец не ускорял спорулирования у Вас. coagulans, о чем
свидетельствуют Амага и Ордал (Amaha a. Ordal, 1957). Усиление споруляции у ряда почвенных спорообразующих видов
48
бактерий под влиянием марганца и до некоторой степени железа
наблюдали другие авторы (Curran a. Evans, 1954), причем не
все взятые виды и даже штаммы одного и того же вида реагировали на металл.
" Глубокие изменения происходят в спорах бактерий под действием некоторых микроэлементов. Так, кальций и марганец
усиливали резистентность спор Вас. coagulans к нагреванию.
Такими свойствами не обладал магний (Amaha a. Ordal, 1957).
Таким образом, приведенные данные свидетельствуют о стимулирующем действии некоторых микроэлементов на рост самых разнообразных микроорганизмов. Это говорит об участии
этих элементов в каких-то, возможно, общих для микроорганизмов процессах обмена веществ. В то же время один и тот же
элемейт может по-разному действовать на представителей разных родов микроорганизмов, что говорит о специфическом действии отдельных элементов. Имеется больше данных о положительном действии цинка, железа, меньше — марганца и бора.
Действие молибдена относится главным образом ^ а з о т ф и к с а торам. Неоднородность полученных данных свидетельствует о
специфике действия определенных элементов и зависит от особенностей обмена веществ отдельных организмов.
ИЗМЕНЕНИЕ МОРФОЛОГО-КУЛЬТУРАЛЬНЫХ
ПРИЗНАКОВ МИКРООРГАНИЗМОВ
Морфологические изменения грибов и бактерий
под действием микроэлементов отмечены некоторыми авторами.
У Aspergillus
oryzae наблюдалось изменение формы клеток и
ускорение конидиеобразования под влиянием высоких доз марганца и меди (Yoshimura, 1939). В свою очередь, недостаток
марганца и цинка вызывал ветвление нитей, образование булавовидных утолщений клеток, появление ленточных форм Nocardia ораса (Webley, 1960; Webley et al., 1962). Авторы объясняют
это явление уменьшением синтеза ^нуклеиновых кислот, ведущим к ненормальному росту и делению клеток.
Изменения морфологических признаков клеток в обогащенных микроэлементами культурах Saccharomyces
cerevisiae наблюдал Басс-Шадхан (1962). От кобальта ^оболочка клетки
делалась утолщенной, резко выраженной. Медь же уменьшала
размеры клетки. Влияние марганца не отмечено.
Применение молибдена и бора изменяло морфологию клеток
разных видов азотобактера (Матуашвили, 1947; Бершова, 1951;
Рубенчик, Бершова и др., 1955). При больших дозах металла
клетки уменьшались, при малых наблюдалась обратная зависимость. Изменялась зернистость клетки, протоплазма делалась
более гомогенной.
Дефицит железа и цинка в среде, где росла
Mycobacterium
4—388
49
smegmatis,
приводил к изменению клеток этой бактерии, которые непомерно удлинялись, приобретая несвойственные им формы. Данное явление объясняется, по-видимому, задержкой клеточного деления, аналогичной описанному для грибов (Winder
а. О'Нага, 1962).
Культуральные особенности
Н а р я д у с действием микроэлементов на рост и
морфологию известны многочисленные случаи изменения культуральных особенностей микроорганизмов. Особое значение в
этих процессах принадлежит цинку. Так, по данным Менцеля
(Menzel et al., 1944), при применении этого элемента усиливалось образование красной пигментации у Aspergillus
fumigatus.
Действие цинка сказалось и в усилении желтого пигмента грибов рода Fusarium graminearum,
выращиваемых на синтетической среде (Mull et al., 1944).
С другой стороны, Куртин и др. (Curtin et al., 1940) наблюдали уменьшение пигментации Penicillium
phoeniceum
при добавлении этого элемента к среде.
Применение меди, цинка и железа в очищенной от микроэлементов среде способствовало спорообразованию и пигментации спор Aspergillus
tiiger (Упитис, 1961).
Усиление пигментации Aspergillus
wentii достигалось т а к ж е
внесением марганца (Karow a. Waksman, 1947; Karow, 1947),
который действовал на склероции Sclerotium delphinii
(Perlman,
1948).
Действие цинка изменяло характер опушения у актиномицетов. Он способствовал образованию воздушного мицелия Streptomyces griseus (Woodruff, 1947).
Добавление металла к среде изменяло пигментацию актиномицетов. Так, цинк усиливал окраску красно-желтых видов и
не действовал на пигментацию Streptomyces
fraidise
(Cnain
et al., 1955).
Действие микроэлементов на пигментацию бактерий особенно
видно на примере азотобактера. Все виды этой бактерии образуют пигмент, цвет и оттенки которого в значительной степени
зависят от особенностей вида и условий его выращивания. Известно, что пигменты азотобактера относятся к группе меланинов и образуются ферментативным путем при действии тирозиназы на тирозин. В состав тирозиназы входит медь, наличие
которой считают необходимым для образования пигмента (Mulder, 1939а). По Бортельсу (Bortels, 1939), пигменты
Asotobacter
agile зависят от соотношения железа и молибдена в среде.
Сравнительно увеличенное количество железа ведет к коричнево-фиолетовым, а увеличение доз молибдена — к желтым
оттенкам. В опытах Джонстона и Фишбейна (Johnstone a. Fish50
bein, 1956) железо ослабляло, а молибден усиливал образование
пигмента Azotobacter vinelandii. При значительном содержании
в среде солей железа пигменты азотобактера приобретали коричневый оттенок. Резкую стимуляцию пигментирования у азотобактера наблюдал Андерсен и др. (Andersen et al., 1961).
При ферментативном синтезе бактериального фитоена (пигмента каротинового типа) у Staphylococcus
aureus положительное действие оказывал марганец. При помощи меченого углерода (С 14 ) было показано, что в превращениях мевалоновой
кислоты, используемой для синтеза этого пигмента, кофактором
фермента, ведущего эту реакцию, являлись А Т Ф + M n (Ginzaburo, 1960). Под влиянием того же марганца наблюдалось усиление окраски стафилококков, то есть образование пигментов
каротинового типа (Spampinato, 1961).
Добавление к среде Дорсе Со, Zn, Си повышало накопление
свободного порфирина у Mycobacterium
tuberculosis avium. Применение этих элементов каждого в отдельности ослабляло результаты, и усиление пигментообразования наступало только от
цинка и меди (Patterson, 1960). Считают также, что продукция
продигиозина, красного пигмента, вырабатываемого Вас. prodigiosus, связана с образованием комплексных соединений солей
цинка с дериватами пиррола.
Дефицит цинка и железа отражался на образовании пигмента (копропорфирина) у Mycobacterium
smegmatis,
количество
которого варьировало в разные моменты роста и не соответствовало количеству в нормальных культурах (Winder а. О'Нага,
1962). У того же микроорганизма при недостатке цинка в среде
не образовывались вещества, входящие в состав флюоресцирующего пигмента (Rathledge et al., 1962). Имеются указания на
необходимость меди для образования красящего вещества Cellvibrio и Cytophaga.
Известно участие микроэлементов в биогенезе растительных
пигментов высших растений — антоциана, флавонов, порфиринов и др. Оно в большинстве случаев выражается в создании
хелатных структур с белковыми веществами, необходимых при
синтезе пигментов. Медь и молибден участвуют в этих процессах.
Особое значение придается бору в синтезе флавонов. По-видимому, изменение пигментации микроорганизмов под действием
микроэлементов наступало также в реакциях подобного типа.
Наши наблюдения над изменениями культуральных свойств
под влиянием внесенных в среду микроэлементов производились
в опытах с актиномицетами и азотобактером. Первым микроор-.
ганизмам, как известно, присуще легко изменять указанные
признаки под влиянием различных факторов внешней среды.
Изменения же культур азотобактера достигаются обычно не так
легко.
Актиномицеты, выделенные из почвы хозяйства Института
4*
51
микробиологии АН УССР «Феофания», идентифицировались, а
затем выращивались с пересевами на среде № 1 Красильникова
с добавлением различных микроэлементов (Мо, В, Мп, Си, 2 п ) .
Наблюдения проводились Над изменениями пигментации,
формы и характера опушения колоний, способностью отщеплять
различные варианты, отличные от основного штамма. В отдельных схемах опыта соблюдались строго одинаковые условия
(толщина агара, размер чашки Петри, количество среды и т. д.).
Таблица
6
Изменение культуральных свойств актиномицетов под действием
микроэлементов
Действующие микроэлементы
Актиномицеты
Контроль
(без микроэлементов)
Мо
в
М.
гозеиэ
2п
Си
Со
Мо
В
Расщепление
Пигментирование
среды
Округлая
средней величины
Нет
Нет
Неполное
Фестончатая
СегментироОкруглая
ванное
Опушенный
Выпуклая
Сильное
Нет
»
»
»
»
Сильное
Слабо опушенный
Сегментами
Мелкие
Без изменения
То же
Среднее
Сильное
»
»
Ас1
геЫш
Ьгипею
Бурая
Слабое
Округлая'
Нет
Темно-бурая
Черная
Сильное
Сильное
»
»
Слабое
»
Опушение
Светло-розо- Опушенный
вая
То же
Темно-красная
Темно-розовая
Розовая
Светло-розовая
То же
Мп
Контроль
Форма
колоний
Пигментация
Мп
1п
Си
Темно-бурая
Бурая
Темно-бурая
г
Слабое
Нет
»
»
Со
Светло-бурая
Слабое
»
Контроль АЫ. ию1а- Фиолетовая Опушенный
Темно-фиоле»
сеиз
Мо
товая
»
Буро-фиолеВ
товая
»
Темно-фиолеМп
товая
»
Светло-фио2п
летовая
»
То же
Со
52
*
»
»
Очень
сильное
Слабое
»
Слабо-бурое
Сильное
Очень
сильное
То ж е
Среднее
Сильное
Нет
Округлая
Нет
Слабое
Слабое
Сильное
»
Сильное
»
»
Нет
»
»
Сильное
Нет
»
»
Исследования разных видов актиномицетов производились с
первых дней их роста и продолжались в течение 20-дневного
периода. Примеры полученных изменений приведены в табл. 6.
Из многих испытанных видов большему действию были подвержены культуры с темной пигментацией мицелия, особенно
розовые и красные. Под действием молибдена, марганца и особенно бора их пигментация усиливалась или принимала разные
оттенки. Изменялось в разной степени опушение, некоторые виды
совсем его теряли. Изменялись формы колоний. В некоторых
случаях наблюдалось сильное расщепление признаков. На чашке Петри можно было видеть многие варианты — колонии с разной окраской и опушением, разной величиной, доходящей иногда
до точечного размера. Менее чувствительны к микроэлементам
виды с желтой пигментацией и еще меньше — с белой. Таким
образом, актиномицеты в сильной степени способны изменять
свои культуральные признаки под действием микроэлементов.
Такого рода явление должно быть учтено при видовом определении этих микроорганизмов.
Что Касается Аго1оЬас1ег скйоососсит, то изменения под
влиянием микроэлементов в основном наблюдались в отношении
его роста, пигментации, формы клеток и консистенции слизи
(в данном случае мы не останавливаемся на изменениях биохимических свойств). Мо усиливал, а В ослаблял пигментацию
азотобактера. Консистенция слизи при внесении молибдена была
более жидкой. Оба микроэлемента вызывали диссоциацию культур. Все это проявлялось в различной мере в зависимости от
штаммовых различий.
Подобные, менее или более выраженные изменения наблюдались также при культивировании разных видов бактерий. Изменялась консистенция слизи, клетки удлинялись. В некоторых
случаях изменялось окрашивание по Граму. Культуры, заведомо
грамположительные, после роста на среде с микроэлементами
окрашивались гораздо светлее.
Из перечисленного видно, чт,о наблюдения над изменением
морфолого-культуральных особенностей микроорганизмов под
влиянием микроэлементов шли главным образом по линии изменения фор&гы клетки и пигментации. Можно отметить, что не
только визуальные'наблюдения, но и исследования биохимического характера с применением изотопов подтвердили участие
металлов в биологическом образовании ряда пигментов бактерий. В данном случае мы говорим об участии металлов в биологических процессах образования пигментов, еще очень мало
изученных. Однако известна важная роль металлов в создании
красящих веществ, образующих большую отрасль химической
промышленности в народном хозяйстве. Интересны возможные
аналогии в этих двух направлениях использования металлов.
53
ЧАСТЬ
III
ДЕЙСТВИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ
НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ
МИКРООРГАНИЗМОВ
\
Как известно, влияние микроэлементов на организмы главным образом обусловлено их участием в ферментных
реакциях. Физиологическая роль их постепенно раскрывается
при исследовании этих процессов. Поэтому, изучая действие
микроэлементов, мы, естественно, обратились к исследованию их
влияния на ферментативную активность микроорганизмов.
Г р и б ы . Заметные изменения физиологических особенностей
Rhizopus nigricans под действием цинка и других микроэлементов наблюдали Фостер и Ваксман (Foster a. Waksman, 1939).
В отсутствие цинка в среде ими отмечено неполное окисление
глюкозы и превращение ее в фумаровую кислоту. При добавлении ж е этого элемента, вызывавшего обильный и быстрый рост,
в фумаровую кислоту переходила только незначительная часть
глюкозы. Действие железа и марганца было значительно менее
выраженным. Авторы приходят к заключению, что цинк необходим для гриба и служит не только пластическим веществом,
но и катализатором при расщеплении глюкозы и получении большего количества энергии.
Значительно позже Горбах с сотрудниками (Gorbach et al.,
1956, 1957) пришли к тому ж е выводу, работая с Aspergillus
niger. Образование сахарозы у этого гриба значительно повышалось при наличии цинка и зависело от состава среды. С другой
стороны, отсутствие цинка в среде при выращивании Nocardia
ораса вело к потере им способности использовать сахара (Webley et al., 1962).
Д л я образования протеиназы у Aspergillus
niger при росте
его на минеральной среде требовалось добавление цинка и железа, в то время как медь и марганец действовали только как
стимуляторы (Gorbach a. Koch, 1955). Усиление синтеза амилазы
у Aspergillus
oryzae происходит т а к ж е при действии малых доз
цинка, меди и железа. У того ж е микроорганизма отмечена необходимость в железе и цинке для действия протеолитических
ферментов (Steiner, 1961).
Действие цинка отмечено и при образовании других фермен54
тов. Установлено, что недостаток его содержания в среде приводит к резкому снижению роста Aspergillus niger и активности
фосфофруктокиназы и дегидразы фосфоглицеринальдегида в его
мицелии. Добавление этого элемента восстанавливает активность данных процессов (Bertrand a. Wolf, 1958). Вероятно, с
наличием цинка связан синтез любых белков вообще, в том числе и ферментных у этого микроорганизма.
Интересны исследования индийских ученых с гексокиназой
данного гриба. Прибавление к питательной среде, очищенной
от микроэлементов, цинка повышало активность этого фермента.
Еще больше усиливалась активность при одновременном прибавлении марганца и железа. Однако эти же ионы, прибавленные к
экстракту из такого гриба, выращенного на среде, лишенной
микроэлементов или с оптимальным содержанием магния, не
активировали фермент.
В свою очередь потребление лимонной кислоты этим грибом
стимулировалось марганцем. Бертран и Вольф (Bertrand а.
Wolf, 1955) говорят о прямой связи между потреблением этой
кислоты и концентрацией марганца в среде. Предполагают, что
марганец является составной частью фермента аконитазы либо
принимает непосредственное участие в его формировании. Действие марганца в данном случае специфично и не может быть
заменено другим элементом.
По данным других авторов (Ratajak a. Owens, 1942), гидролиз арабогалактозы у этого гриба усиливался при добавлении
Си, Zn, Mn, Mo, Fe. Эти же микроэлементы повышали каталитическую активность Aspergillus
oryzae (Yoshimura, 1939).
Недостаточное содержание цинка в среде вызывало значительные изменения в ферментативных реакциях
Neurospora
crassa (Nason et al., 1951). Исчезала активность дегидрогеназы
спирта, прекращался синтез триптофана. В то же время увеличивалась активность других ферментов, в том числе дифосфопиридиннуклеотидазы. Инактивировалась фумараза, гексокиназа, альдолаза и другие ферменты. Таким образом, радикально
перестраивался обмен веществ микроорганизмов.
О таких л^е изменениях ферментативных систем говорит Буромский (1912). При наличии цинка окисление углеводов идет
до конечной стадии, а без цинка — до промежуточных.
Изучая химизм брожейия и дыхания Aspergillus
niger, Костычев (1956) привел доказательства того, что уксусный альдегид является промежуточным продуктом в этом процессе. Д л я
его накопления автор применял ионы цинка и кадмия, которые
способствовали этому. Механизм данного явления заключался
в инактивации фермента редуктазы, что затрудняло нормальное
протекание восстановительных реакций, лежащих в основе бродильного процесса. Действие этих двух элементов в данном
процессе весьма специфично, поскольку на другие ферменты,
55
находящиеся в бродильной среде, они не влияют. Проведенные
специальные исследования показали также усиление расщепления белков под действием цинка.
Широкие и очень доказательные работы Николаса с Neuro- .
spora crassa указывают на роль молибдена в различных ферментативных процессах. Так, при недостатке молибдена в среде
происходит уменьшение активности нитратредуктазы, что характеризует этот элемент как необходимый компонент данного
фермента (Nicholas et al., 1954, 1954а). Дальнейшие наблюдения
показали также, что от этого элемента зависит образование
каталазы и пероксидазы (Nicholas, 1957). Так, при недостатке
молибдена содержание указанных ферментов снижалось, при
добавлении его к растущей культуре — восстанавливалось. На
основании этого можно сделать вывод, что отсутствие или недостаток Мо сказывается на активности молибдозависимых флавопротеинов, реагирующих с Ог с образованием Н 2 0 2 ; понижение количества этого соединения в отсутствие молибдена влияет
на индуцированный синтез каталазы и пероксидазы.
Дальнейшие работы того же автора с сотрудниками (Nicholas a. Commissiong, 1957; Nicholas a. Goodman, 1958), проведенные на том же объекте, показали стимулирование активности
других ферментов. Железо в оптимальной дозе повышало активность железосодержащих ферментов — диафораз ,(ДПН-Н 2 и
ТПН-Нг), а также нитратредуктазу., Медь стимулировала окси- ,
дазу цитохрома с, которую угнетал молибден. В свою очередь
молибден стимулировал нитратредуктазу, которую угнетала
медь; обе диафоразы угнетались медью и молибденом. Ванадий,
вольфрам и молибден угнетали активность кислой фосфатазы,
недостаточное содержание цинка снижало активность дегидразы глютаминовой кислоты.
Все это демонстрирует сложность взаимоотношений, в которых проявляются антагонизм металлов, а также их важность
в отношении действия на ферменты клетки.
Работы последних лет с радиоактивным цинком подтвердили
изменяемость активности ряда ферментов, в том числе цикла
лимонной и глиоксиловых кислот. В данном процессе недостаток
цинка (Zn 65 ) усиливает активность аконитазы и подавляет изоцитрикодегидрогеназу и фумаразу; затрудняется расщепление
глюкозы по схеме Эмбден—Мейергофа благодаря подавлению
альдолазы фруктозо-1,6-дифосфата.
Водоросли.
Фотосинтез.
Поскольку
микроэлементы участвуют в различных реакциях обмена веществ у микроорганизмов, можно было ожидать, что они оказывают влияние и на фотосинтез соответственной микрофлоры.
Это можно предполагать по аналогии с высшими растениями.
Однако в этой области литературные данные относятся в основном к водорослям.
56
Так, Кесслер (Kessler et al., 1957) отметил влияние марганца на фотосинтез зеленой водоросли Ankistrodesmus.
Отсутствие
этого микроэлемента в среде действует на выделение Ог культуры подобно таким ингибиторам, как гидроксиламин и др.
Отсюда автор делает вывод о необходимости марганца для фотосинтеза водоросли. Некоторым подтверждением этих данных
служат наблюдения Аллена (1962), получившего при исследовании Chlorella pyrenoidosa методом электронного парамагнитного резонанса в спектре 6 полос, обусловленных марганцем.
По-видимому, этот ион связан с реакциями выделения Ог при
фотосинтезе.
Следует упомянуть также об особой роли некоторых микроэлементов, участвующих в реакциях фиксации углекислоты фотосинтезирующими и гетеротрофными бактериями. Бенг, Миода
и др. (Bangh, Myoda et al., 1959; Myoda, Werkman, 1960) работали с радиоактивным углеродом при наличии фосфоэнолпировиноградной кислоты. При этой реакции требуется Мп 2 + с возможной заменой его Mg 2 + . Реакция катализируется оксалатацетаткарбоксилазой с участием марганца.
Бактерии.
Указаний на изменение
ферментативной
активности бактерий под влиянием микроэлементов в литературе
немало. Все они носят несколько разрозненный характер и относятся к изучению различных видов бактерий и различным сторонам их ферментативной деятельности.
Опыты с Вас. subtilis показали, что для нормального расщепления полисахаридов а-амилазой требовался цинк (Stein,
Fischer, 1960).
С' другой стороны, максимальная продукция общей амилазы
той же бактерии получалась при наличии железа и марганца в
среде (Lulla, 1951). Испытание действия микроэлементов (Мо,
В, Си, Mn, Zn) на протеолитическую, амилолитическую и дегидрогеназную активность ряда ризосферных бактерий и акт^номицетов показало значительный эффект, выразившийся в повышении актив«ости этих ферментных процессов. Большое влияние
оказывали цинк, марганец и молибден. Угнетающее действие
наблюдалось при применении меди (Бершова, 1960а, 19606,
1961, 1961а).
Образование сахарозы , усиливалось при росте
Aerobacter
aerogenes на среде с мелассой при добавлении небольших доз
никеля и цинка; при этом увеличивался выход 2,3-бутанола.
Внесение же меди или Ni + Zn подавляло образование этого
вещества (Ranganayake et al., 1958). Лецитиназа
Clostridium
welchii активировалась Ca, Mg, Co, Zn, Mn (Zamecnik et al.,
1947).
Изменение характера брожения Lactobacterium
pentoaceticum
в полноценной питательной среде происходило под влиянием
марганца (Гречушкин, 1961). В анаэробных условиях увеличи57
вался выход продуктов брожения и менялось их соотношение:
усиливалось образоваЛие спирта. При аэрации марганец усиливал процессы окисления, что вело к уменьшению выхода
спирта.
Особое место в литературе занимают работы, посвященные
ферментам, имеющим прямое или косвенное значение в процессах окисления и восстановления в клетках. При изучении бесклеточных гомогенатов азотобактера Плаут и Лярди (Plaut а.
Lardy, 1949) показали активирование дикарбоксилазы щавелевоуксусной кислоты марганцем, кобальтом и цинком. При
добавлении яблочной кислоты это явление не проявляется. При
наличии марганца орто- и пирофосфат и АТФ действовали как
ингибиторы.
Выводы других исследователей говорят о возможном участии молибдена в ряде других ферментов этой бактерии. Так,
подтверждено наличие молибдена в ксантиноксидазе (Richert
et al., 1953), в ал ьде гид о ке ид а з е (Mahler et al., 1954) и гидрогеназе (Shug et al., 1954). Килер и Варнер (1962) на основании
своих исследований связи молибдена с определенными фракциями протеинов пришли к заключению о возможном участии
этого элемента в терминальной системе переноса электронов.
Они также считают, что у азотобактера имеются ферменты, где
молибден мог бы использоваться как кофактор молибденопротеинов ферментных систем.
Согласно данным Спенсера и др. (Spencer et al., 1957), марганец является специфическим активатором редуктазы гидроксиламина у Azotobacter
agile. О других ферментах азотобактера сказано в разделе азотфиксации.
Для активности оксидазы пировиноградной кислоты Clostridium butyricum требовалось железо (О'Капе, 1954).
Минагава (Minagawa, 1958) сообщает о полученных путем
адаптации дрожжах, устойчивых к действию меди и содержащих цитохромы с и b и корпопорфирин. Скорость окисления
глюкозы у таких штаммов резко колебалась. О необходимости
железа для восстановления цитохрома с в бесклеточных экстрактах азотобактера говорят Николас и Фишер (Nicholas а.
Fischer et al., 1960).
Некоторое внимание уделялось изучению адаптированного
фермента пенициллиназы. Железо и кобальт стимулировали его
образование у стафилококка. Меньшее влияние оказывали марганец и никель (Leitner а. Cohen, 1962).
В литературе имеются данные об активирующем действии
микроэлементов на ряд ферментативных процессов в почвах.
Прд действием Мо, В, Мп и других элементов увеличивалось
количество общего азота, нитратов, растворимых форм органического вещества. Однако только в некоторых из работ учитывалось также состояние микрофлоры почвы.
58
Большое значение микроэлементов в активизации фосфатаз,
продуцируемых почвенными микроорганизмами и корнями растений в почве, показано Котелевым с сотрудниками (1963,
1965). При внекорневой подкормке кукурузы особое влияние
на активность этих ферментов оказали цинк и бор. В чистых
культурах почвенных бактерий, разлагающих органофосфаты
(Вас. те§а1ег1ит и др.), микроэлементы также действовали.
В этом случае активными стимуляторами оказались бор и магний, менее активными — цинк и кобальт.
Об активизации фосфатаз, образуемых Вас. теда1ег1ит, свидетельствуют данные, полученные Мальцевой (1961). При использовании в среде марганца и молибдена разложение органофосфатов усиливалось с 5 до 53% в зависимости от взятого
субстрата. Более активно действовал марганец. Влияние этих
элементов сказывалось больше при разложении фитина, чем
РНК.
Особое место занимают исследования Заварзина (1957, 1958),
посвященные участию молибдена, вольфрама и железа в процессе окисления нитритов нитрифицирующими бактериями. В ряде лабораторных опытов эти элементы испытывались совместно
с рибофлавином и культурой нитрифицирующих бактерий.
Предполагалось, что молибден действует в форме молибдофлавопротеинов, поэтому был взят рибофлавин. Взятые микроэлементы усиливали процесс нитрификации. Стимулирующее действие усиливалось при наличии железа и в значительной мере
зависело от рН среды, оптимальная градация которого была
разной для молибдена и вольфрама. Испытание других микроэлементов дало возможность автору разделить их по силе действия на группы: стимулирующих (Мо, \У), не всегда стимулирующих (В, 51), не действующих (А1, Со, V), подавляющих
(Си, Мп, 7,п).
Вместе с тем Деева (1955) наблюдала положительное действие бора й -марганца на процессы нитрификации в полевых
условиях. По-видимому, в определенных условиях почвы данные
микроэлементы стимулируют этот процесс.
\
Разложение целлюлозы в почве видами Се1ШЬпо и Су1орНада также активировалось под влиянием марганца, железа и
меди (ВойеЬ, 1956).
Из сказанного видна многообразная роль микроэлементов в
ферментативной деятельности клетки. Отрицательное действие
при недостаточном содержании определенного микроэлемента
можно объяснить необходимостью его в структуре фермента или
в других побочных реакциях клетки. Кажущиеся разногласия
в некоторых приведенных данных объясняются спецификой действия отдельных элементов и проявлением антагонизма ионов
металла.
59
ДЫХАНИЕ
Изучению дыхания микроорганизмов в последнее время уделялось много внимания, поскольку данный процесс определяет в основном обмен веществ живой клетки. Этому
также способствовало усовершенствование методики манометрических измерений газового обмена.
Многочисленные работы по дыханию патогенных микроорганизмов, В. coli и других проводились главным образом для
определения их способности окислять различные органические
вещества.
Большое количество исследований посвящено также дыханию
азотобактера, показавших высокую его интенсивность, способность бактерий к использованию различных субстратов, приспособление к окислению различных органических веществ. Однако
кроме азотобактера, почти все почвенные бактерии в этом отношении изучены недостаточно.
Некоторые литературные данные указывают на влияние
микроэлементов (Zn, Со, Ni, Fe, Мп) на дыхание микроорганизмов. Металлы, включаясь в ферменты, активируют окислительновосстановительные реакции организма, в том числе процессы
цикла Кребса. Первые наблюдения в этом направлении свидетельствуют о стимуляции цинком дыхания плесневых грибов'
(Aspergillus
niger, Rhizopus и др.) (Буромский, 1912; Foster,
1938). Обычно это выражалось в увеличении дыхательного коэффициента. В некоторых случаях это не было благоприятным
для накопления молочной кислоты (Waksman a. Foster, 1938).
По мнению Фостера (Foster, 1949), цинк, играя важную роль
в метаболизме углеводов, влияет также и на цикл трикарбоновых кислот у грибов. Однако прямых доказательств этого в t o
время еще не было. Значительно позже опыты с гомогенатами
клеток показали включение кобальта в цикл трикарбоновых
кислот, результатом чего было изменение образования промежуточных продуктов цикла: в метаболизме малата происходила
аккумуляция кетокислот и др. Действие кобальта было обусловлено образованием комплексов между ионами и некоторыми
формами липоидов (Dingle et al., 1962).
Изучая метаболизм культуры Nacardia ораса при недостатке
в среде железа, цинка, марганца, Веблей с сотрудниками (Webley et al., 1962) наблюдал значительные изменения в дыхании
этого организма, особенно с некоторыми субстратами (пируватом, фенилацетатом и др.). Сравнительно с нормальными культурами Fe-дефицитные теряли образование каталазы и накопляли пировиноградную кислоту, что подтверждает необходимость железа для действия оксидазы этой кислоты.
Применение относительно высоких доз цинка, никеля и
кобальта (122 мкг/мл) угнетало процессы метаболизма приве60
денных выше грибов. Добавление органических кислот снимало
это угнетение, а в некоторых случаях усиливало обмен. На основании серии опытов с добавлением органических веществ Сиварама и др. (Sivarama et al., 1962) пришли к выводу, что токсичность металлов заключается в образовании органических
комплексов, блокирующих процессы Кребса, и образовании промежуточных веществ, особенно пирувата и малата.
На особом материале—спорах гриба Ustylago
sphaerogenes—
Гримм и Аллен (Grimm а. Allen, 1954) также показали влияние
микроэлементов на ферменты дыхания. Параллельно определению интенсивности дыхания бесклеточных препаратов этих спор
производились спектрофотометрические исследования металлов
в цитохромах. Усиление образования цитохрома a, b и особенно с обусловливалось действием цинка. Его не могли заменить
железо, медь и 'марганец. Увеличивалась также активность цитохромоксидазы.
Наряду с этим авторы испытывали действие витаминов, из
которых только Bi увеличивал образование цитохрома с и притом только при наличии цинка и аммонийного источника азота
в среде. Такая связь действия витамина и цинка очень интересна, но мало доказательна. Можно думать, что в данном случае
действовал только цинк.
В литературе есть указания, что дрожжи, выросшие при наличии цинка, энергичнее потребляли Ог, чем дрожжи, выросшие
без его добавления. Влияние же меди на дыхательные ферменты
дрожжей сказалось в изменении культуры и появлении вариантов, имеющих дыхательную недостаточность
(Vanagishime,
1960).
Данные, полученные в отношении грибных организмов, в
значительной мере можно отнести и к бактериям, однако
наблюдения над дыханием последних сравнительно немногочисленны.
Левинсон и Хитт (Levinson a. Hyatt, 1955, 1956) изучали
дыхание прорастающих спор Вас. megaterium.
Наряду с ускорением прорастания при добавлении марганца повышалось и
поглощение 0 2 . Еще большее потребление Ог наблюдалось при
применении /-аланина и марганца. По мнению авторов, последний необходим при прорастании спор и играет особую роль, не
связанную с I-аланином, в процессах дыхания.
По некоторым данным, Pb, Си, Hg, Ag угнетали дыхание
Streptococcus
faecalis, что происходило от задержки окисления
пировиноградной кислоты. Это ингибирование снималось при
пнесении а-липоевой кислоты (Grunert et al., 1960). По другим
сведениям, Со, Ni, Zn подавляли потребление 0 2 у дизентерийных культур, причем это действие было неодинаково у разных
видов. Авторы считают, что данные металлы блокировали степень окисления пирувата, так как эти ионы могут конкуриро61
вать с Fe, Мп и Mg, необходимыми для осуществления этой
ферментативной реакции.
Изменение ферментных систем покоящихся клеток Proteus
vulgaris, Escherichia со/i под действием меди наблюдали Ворац
и др. (Woratz et al., 1957). При выдерживании отмытых клеток
этих культур в течение часа в растворе сернокислой меди действие последней проявилось в изменении активности гликолитических и дыхательных ферментов бактерий. Изменился гликолиз, окислительное использование лактата, сукцината и других веществ. В сложных питательных средах бактерицидность
меди уменьшается благодаря образованию комплексов с веществами среды. С другой стороны, связанное с дыханием окислительное фосфорилирование Bad. alcaligenes
и Е. coli может
протекать очень активно, если культуры предварительно инкубировались при наличии марганца, кобальта или магния (Shibko a. Pinchot, 1961). В отношении азотобактера Гуше и Кохолати (Goucher a. Kocholaty, 1954) сообщают о необходимости
магния или марганца для окисления некоторых органических
соединений бескл'еточными экстрактами этой бактерии. В этих
же опытах наблюдалось положительное действие железа и молибдена на окисление сукцината.
Своеобразные реакции возникают между металлами и сложными органическими веществами типа антибиотиков в клетках
бактерий. Известно, что дыхание азотобактера подавляется некоторыми антибиотиками. Магний и отчасти марганец снимают
это действие. Такой факт подтверждает гипотезу о подавлении
дыхания бактерий антибиотиками за счет их способности образовывать внутрикомплексные соединения с неорганическими
ионами, в частности с названными выше (Johnson, Colmer,
1957).
Таким образом, в процессе дыхания микроорганизмов активно участвуют некоторые микроэлементы (Mn, Zn, Fe, Си),
активируя этот процесс и усиливая обменные реакции. Однако
другие металлы — Pb, Hg, Ar, Ni, Со — угнетают дыхание. В
отношении цинка и меди литературные данные разноречивы.
Можно думать, что в данном случае решающую роль играют
дозы этих элементов.
Задачей нашей работы (Бершова, 1960, 1962) являлось изучение дыхания почвенных ризосферных микроорганизмов, представителей распространенных в ризосфере групп. При этом
изучалось влияние микроэлементов (Мо, В, Mn, Zn, Си) на
дыхание этих микроорганизмов.
Применяя различные методы исследования (описание которых приводится в соответствующих главах), мы учитывали
специфику работы с микроэлементами и первые опыты с чистыми культурами проводили с очисткой сред от изучаемых элементов. Однако этот прием отпадал при работе с органическими
62
или почвенными средами, где микроэлементы связаны в комплексные органические соединения и их извлечение применением
соответствующих реактивов вело к нарушению естественной
структуры среды.
При проведении опытов с чистыми культурами бактерий,
которые выращивались на синтетических средах, мы испытали
несколько рекомендованных приемов удаления металлов. Наиболее приемлемым оказался метод очистки дитизоном, которым
и пользовались в некоторых случаях. Очистка среды дитизоном
(Dyphenylthiocarbazon) производилась по методу, описанному
Стоу и Арноном (Stout a. Arnon, 1939), основанному на принципе образования и выделения комплексных соединений дитизона с металлами, загрязняющими среду.
Однако на бактериологических средах, обработанных этим
и другими способами, например 8-оксихинолином, рост микроорганизмов был угнетен настолько, что не могло получаться
достаточного количества нужной для опытов биомассы клеток,
не говоря уже о возможном угнетении ферментативной активности этих ослабленных культур.
Такое явление происходило, по-видимому, за счет изъятых
из среды микроэлементов, полный состав которых мы не могли
вернуть, а также, возможно, за счет оставшихся в среде примененных соединений. Торможение роста исследуемых культур
в этом случае могло быть объяснено блокированием дитизоном
обменных процессов клеток посевного материала (как и молодых, растущих клеток), в катализе которых участвуют ионы
определенных металлов.
При проведении предварительных опытов был получен достаточный эффект от внесения микроэлементов в обычную употребляемую нами бактериальную среду. Это побудило нас в
дальнейшем отказаться от детальной очистки сред от металлов, ограничившись лишь анализом применяемых сред на наличие и количество в них микроэлементов. Эти количества были
приняты за «фон», по которому проводились исследования. Но
наряду с этим всегда производились предупредительные меры
от возможного добавочного загрязнения металлами опытных
материалов. Так, посуда тщательно промывалась хромовой
смесью. При изготовлении сред пользовались перекристаллизованными солями, длительно промытым агаром и бидистиллированной-водой. Кроме того, была принята для выращивания микроорганизмов одна синтетическая минеральная среда'— Красильникова № 1. Только в некоторых особых случаях, при отсутствии роста сапрофитов на этой среде, к ней добавляли пептон в количестве 0,1 %.
Количество металлов, найденное в синтетической среде, то
есть «фон» среды для выращивания микроорганизмов, приведено в табл. 7. Методика определения микроэлементов в среде бы•63
ла та же, что и при определении их в почве (приводимая ниже).
Как видно из приведенных цифр, в ср^еде почти отсутствовали молибден и марганец, бор также был в следовых количеТаблица 7
Валовое количество микроэлементов (в мкг на 1 л
среды)
Металлы
В воде водопроводной
Марганец
Бор
Цинк
Молибден
Медь
Нет
0,175
71,0
Следы
4,8
В солях
Нет
»
70,0
Нет
1,25
В сахарозе
Следы
Нет
350,0
Следы
1,4
Всего
Следы
0,175
491,0
Следы
7,45
ствах. Во всех трех компонентах среды найдены медь и относительно много цинка. Однако эти количества были значительно
меньше доз вносимых микроэлементов при изготовлении среды
и, по-вйдимому, были недостаточны для удовлетворения потребностей микроорганизмов, поскольку у последних увеличивался
рост при их добавлении.
Изучение дыхания микроорганизмов проводилось с испытанием Мо, В, Мп, 2п, Си в дозах от 0,2 до 20 мг/л в зависимости от микроэлемента и способа его внесения. Действие микроэлементов изучалось при внесении их в среду, на которой росли
микроорганизмы, и в суспензии отмытых покоящихся клеток.
Большие дозы брали при внесении их в среду и меньшие — в
опытах с суспензией клеток.
В опыты были взяты чистые культуры бактерий и актиномицетов, выделенные из ризосферы кукурузы, а также азотобактер и клубеньковые бактерии. Исследование проводилось в
аппарате Варбурга с клетками односуточных культур (актиномицеты — 10-суточные), выращенных на синтетической среде с
сахаром. В качестве субстрата была взята сахароза.
Все испытуемые бактерии выращивались на агаризованной
среде № 1 Красильникова (актиномицеты — в жидкой среде).
Клетки снимали шпателем или отцентрифугировали, трижды
промывали в буферном растворе с последующим центрифугированием и помещали в основном отделении сосудика, присоединяемого к манометру. В боковые резервуары сосудиков помещали растворы субстрата и микроэлементов. Количество клеток
для опыта определяли соответствующим каждой культуре стандартом. Определялся также азот, входящий в состав взятого
•64
количества клеток (название культур приведено в таблицах).
Опыт с каждой культурой проводился не менее трех раз и
больше.
Полученные данные относительно поглощения кислорода
разными видами микроорганизмов выражены в мкл Ог в 1 час
на 1 мг азота клеток, а также на 10 млрд. клеток.
Результаты опытов приведены в нижеследующих таблицах.
Как видно из табл. 8, интенсивность поглощения кислорода
разными видами взятых микроорганизмов очень различна.
Наиболее интенсивное дыхание обнаружено у азотобактера.
Почти вдвое меньше кислорода, чем азотобактер, поглощает
Р«. аигапИаса (в пересчете на азот клеток).
Таблица
8
Интенсивность дыхания различных видов
Количество 0 2 , мкл/час
Микроорганизмы
Дыхание с субстратом Эндогенное
дыхание
На 1 мг На 10 млрд. На 1 мг
азота клеазота клеклеток
ток
ток
Azotobacter chroococcum
Ps. aurantiaca
Rhizobium
meliloti
Вас.
megaterium
Вас.
oligonitrophilus
Actinomyces
griseus
Actinomyces
chromogenes
1200
650
500
450
400
180
270
260
110
70
175
130
—
120
120
40
50
50
60
90
Следующими по активности идут Rhizobium и спороносные
палочки, у которых величина QO2 разнится мало. Меньше всех
поглощают кислорода актиномицеты, однако интенсивность дыхания обоих взятых видов существенно различна:
Actinomyces
chromogenes поглощает в 1,5 раза больше кислорода, чем Actinomyces
griseus.
Нас интересовало.также поглощение кислорода определенным количествам клеток. Оказалось, что эти величины не соответствуют относительным количествам кислорода, приходящимся на 1 мг азота. Первое место по потреблению кислорода
на 10 млрд. клеток также занимает азотобактер, за ним идут
Вас. megaterium
и Вас. oligonitrophilus,
а лишь затем Ps.
aurantiaca. Меньше всех 0 2 на 10 мЛрд. клеток потребляет Rhizobium meliloti.
В проведенных опытах обращает на себя внимание повышенное эндогенное дыхание Ps. aurantiaca
и актиномицетов,
что может быть связано с имеющимися в клетках и мицелии за5—388
65
пасными веществами. Действие микроэлементов на дыхание
взятых культур выразилось в следующих величинах С^Ог, приведенных в табл. 9, 10, 11.
Потребление кислорода контрольной суспензией клеток азотобактера выразилось в 1150 мкл/час. Применение же микроэлементов в среду роста этой культуры повысило интенсивность дыхания азотобактера. Величина этого повышения различна для р,азных микроэлементов и колеблется от 100 до
400 мкл/час. Больше всего повышение дыхания наблюдалось
при внесении цинка и марганца, затем — в порядке последовательности — меди, бора и молибдена.
Внесение микроэлементов в суспензию покоящихся клеток
дает иную картину их действия. При наличии цинка и меди
тут наблюдалось торможение дыхания. Действие остальных
микроэлементов оставалось также стимулирующим, но в меньшей степени, чем в первых опытах. Большое значение имеет в
этом случае применение соответствующих дозировок. Повышение дозы в два раза приводило к резкому торможению дыхания
клеток при действии всех микроэлементов, кроме марганца.
Эндогенное дыхание в данных опытах определялось величиной
100—130 мкл/час Ог. Оно также несколько повышалось от применения микроэлементов.
Таблица
9
Действие микроэлементов на дыхание неспоровых бактерий *
Азотобактер
Внесенные
микроэлементы
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
Дыхание с
субстратом
I
Н
1150
1360
1390
1480
1550
1410
1200
1340
1300
1420
1040
1120
ЦЫгоЫит
Эндогенное
140
130
110
120
140
110
Дыхание с
субстратом
I
II
500
700
560
750
500
700
380
450
320
470
360
380
Рэ аигапііаса
теїііоіі
Эндогенное
40
60
80
90
60
50
Дыхание с
субстратом
I
11
500
625
530
660
680
550
650
880
795
790
710
740
Эндогенное
60
70
75
70
75
80
* В этой и последующих таблицах I — микроэлементы внесены в питательную среду для роста культуры, II—микроэлементы внесены в суспензию клеток.
ЯЫгоЫит потребляет кислорода гораздо меньше, чем азотобактер. Микроэлементы, внесенные в среду, на которой росла эта бактерия, усиливали ее дыхание. Повышение количества
поглощенного кислорода от внесения молибдена равно таково•66
му у азотобактера. В такой же мере выразилось и действие
меди. Внесение цинка не сказалось. Больше всего усиливалось
дыхание при наличии марганца. Влияние микроэлементов значительно снижалось при внесении их в суспензию клеток. В
этом случае дыхание незначительно активировалось от молибдена и марганца. Угнетающе действовали бор и цинк. Перестала действовать медь.
Ps. aurantiaca, один из активных потребителей кислорода,
также реагирует на микроэлементы, которые увеличивают потребление его на 125—180 мкл/час. Такое же влияние наблюдалось почти в равной степени от добавления Мо, Мп и Zn. Менее значительно действие б о р а ' и меди. Эндогенное дыхание
этой бактерии относительно высоко, оно достигает 60—
80 мкл/час и также отражает действие микроэлементов.
На дыхание споровых бактерий (табл. 10) действуют В, Мп ?
Си и Мо. Последний в значительной степени повышает дыхание Вас. oligonitrophilus.
Повышение потребления кислорода
при этом доходит до 220 мкл/час. Цинк почти не влияет на дыхание Вас. megaterium
и в незначительной степени усиливает
потребление кислорода Вас.
oligvnitrophilus.
Т а б л и ц а
Действие микроэлементов
Вас. megaterium
и Вас.
Вас.
Внесенные
микроэлементы
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
megaterium
Дыхание с
субстратом
І
II
460
540
590
630
480
670
415
450
530
490
480
590
10
на д ы х а н и е
oligonitrophilus
Вас. oligonitrophilus
Дыхание
с субЭндо- стратом Эндогенное
генное
I
80
100
90
100
80
100
400
620
510
480
460
530
40
60
60
50
50
70
При внесении микроэлементов в суспензию клеток Вас. тед а 1 е п и т заметное усиление дыхания наблюдалось только от
бора и меди. Вместе с тем не отмечено торможения этого процесса некоторыми микроэлементами, наблюдаемого у других
культур.
Микроэлементы, внесенные в среду, активируют также дыхание актиномицетов (табл. 11). В большей степени это влия5*
67
4
Действие
Т а б л и ц а 21
м и к р о э л е м е н т о в на
актиномицетов
Actinomyces
griseus
Микроэлементы
Actinomyces
с hromogenes
Эндогенное
дыхание
Дыхание с субстратом
I
I
Усиление
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
дыхание
180
470
415
280
160
+290
+235
+ 100
—
Усиление
270
345
310
340
240
+75
+40
+70
—
64
45
30
40
50
ние проявилось на Actinomyces
griseus, который вообще меньше потребляет Ог, чем Actinomyces
chromogenes.
При внесении молибдена и бора наблюдалось усиление поглощения СЬ
более чем в два раза. Несколько слабее действует марганец.
Все эти микроэлементы действуют также на Act.
chromogenes,
но в меньшей мере. Цинк угнетает дыхание обоих актиномицетов. Что касается меди, то эти микроорганизмы не росли при
наличии самых минимальных из взятых ее доз. Дыхание их
значительно слабее, чем у бактерий.
Полученные данные показывают, что интенсивность дыхания различных почвенных микроорганизмов не одинакова. Обычно считают, что активность дыхания одноклеточных микроорганизмов зависит от отношения поверхности клетки к ее объему,
то есть мелкоклеточные микроорганизмы потребляют кислорода
больше, чем крупноклеточные. Однако это, по-видимому, не всегда является обязательным и зависит также от мощности и набора ферментных окислительных систем клетки.
Наличие в среде незначительных количеств микроэлементов (Мо, В, Mn, Zn, Си), усиливает процессы дыхания в клетках микроорганизмов. Это действие очень различно и зависит
от микроорганизма и вида микроэлемента. В большинстве случаев положительно действовали молибден, марганец, цинк,
меньше — медь и бор. В некоторых случаях микроэлемент, действующий положительно на одни микроорганизмы, вызывает
угнетение дыхания других. Кроме того, незначительные повышения доз микроэлементов могут угнетать дыхание клетки. Эта
неоднородность действия наблюдается и в пределах одного
рода у разных видов и обусловливается, очевидно, различием
в наборе ферментных систем.
68
ДЕГИДРОГЕНАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ
В процессах биологического окисления в живом
организме дегидрирование является одной из основных реакций. Как известно, сущность его заключается в переносе
атомов водорода от окисляемого органического субстрата на
соответствующий акцептор, содержащийся в клетке. Дегидрогеназные ферменты катализируют эту реакцию, в результате
которой освобождается определенное количество энергии, используемое организмом.
Наличие дегидрогеназных ферментных систем у бактерий
показано работами многих авторов, изучавших эти ферменты
с разных точек зрения и при разных условиях (различные субстраты, действие антибиотиков и др.). Больше других микроорганизмов изучены дегидрогеназы азотобактера.
Однако в литературе ограничено количество указаний относительно действия микроэлементов на процессы дегидрирования в бактериальной клетке. Дегидрогеназа альдегидов, выделенная из бесклеточных экстрактов Асе1оЬас1ег эр. и инактивированная после диализа, полностью реактивировалась при
добавлении
Мп, Со (Ыакауаша, 1960). Дегидрогеназа маннит-1-фосфата, выделенная из экстрактов клеток молочнокислых бактерий, активировалась цинком, кобальтом, магнием и
не реагировала на марганец (Н1(1ю е1: а1., 1960). Большинство
авторов, изучая действие металлов, обычно оперировало со сравнительно высокими их дозами, что приводило к искажению
данных. Нет в литературе также сведений о действии микроэлементов «а дегидрогеназные системы ризосферных микроорганизмов.
Наши исследования (Бершова, 19606, 1961а) проводились
с чистыми культурами бактерий и актиномицетов, выделенных
из ризосферы кукурузы и картофеля, а также с азотобактером
(штамм К) и клубеньковыми бактериями.
>
Названия испытанных микроорганизмов и схемы опытов
приведены в таблицах. Действие микроэлементов испытывалось
при внесении их в среду, на которой росли испытуемые микроорганизмы, и во взвесь отмытых неразмножающихся клеток
культуры. Первое обеспечивало их влияние на растущую
клетку при формировании в ней ферментных систем, второе
определяло их действие при непосредственном контакте с
клеткой.
Микроэлементы брали в дозах от 0,4 мг (для меди) до
20 мг]л (для марганца), большие при действии на размножающиеся клетки, меньшие — в опытах с покоящимися д у ш а м и .
В работе применялся метод Тунберга, модифицированный в
отделе анаэробных микроорганизмов Института микробиологии
АН УССР. Влияние микроэлементов испытывалось на фоне
•69
трех субстратов: глюкозы, сахарозы и маннита, которые употреблялись в концентрации М/10 по 0,5 мл на пробирку. В качестве акцептора водорода была взята метиленовая синька в разведении 1 : 2000. Испытываемые культуры (кроме актиномицетов) выращивали на агаризованных средах, преимущественно
синтетических. Клетки снимали шпателем, отмывали от среды
в физиологическом растворе с последующим центрифугированием.
В опытах с разными культурами были использованы неодинаковые количества их клеток в связи с различной способностью к дегидрированию культур. Это давало возможность проводить опыты в определенные отрезки времени.
Результаты исследований активности дегидрирования разных микроорганизмов, приведенные в табл. 12, 13, 14, 15, 16,
выражены в минутах.
Как показали опыты, азотобактер дегидрировал все три
субстрата, но с разной интенсивностью. Наиболее быстро проходило дегидрирование глюкозы, затем сахарозы. Значительно
медленнее шел процесс с маннитом. Внесение микроэлементов в
среду, где росла культура, в большинстве случаев способствовало ускорению дегидрирования. Особенно это относится к Мо,
затем к Мп и 2п. Все микроэлементы действовали по-разному.
Усиление процесса наблюдалось при наличии всех субстратов,
,но в различной степени по сравнению с дегидрированием в контрольном варианте опыта. Так, внесение молибдена ускоряло
обесцвечивание синьки при наличии глюкозного субстрата от
45 до 18 мин, с сахарозой — от 50 до 22, с маннитом — от 75
до 35 мин. При внесении во взвесь клеток микроэлементы действовали значительно слабее, а в некоторых вариантах опыта
действие цинка и меди становилось тормозящим. Благоприятное влияние молибдена в этом случае заметно уменьшается; перестают действовать марганец и бор, сильно тормозит реакцию
цинк и определенно угнетает медь.
Действие микроэлементов на ЯЫгоЫит (табл. 12) аналогично действию на азотобактер. Оно выражено сильнее при
внесении их в среду и слабее — при добавлении во взвесь клеток. В первом случае наиболее активно действует молибден,
который ускоряет дегидрирование почти в два раза на всех трех
субстратах. Так, с глюкозой обесцвечивание синьки происходит
за 14 мин при контроле в 25 мин, на са!харозе — за 18 мин при
контроле 35 мин, на манните — за 24 мин при контроле в 32 мин.
Следующими по силе воздействия были марганец, бор и цинк.
Медь во всех вариантах задерживала реакцию. Как и в предыдущих опытах, дегидрирование скорее протекало при окислении глюкозы. Однако для данной бактерии субстраты сахароза и маннит оказались равноценными. Действие микроэлементов более выражено при наличии глюкозы и маннита. Сла•70
Таблица
Активность дегидрирования АгоЬЬасіег
сНгоососсит и ЯЫгоЫит
12
теІіШі
(количество клеток—цМгоЫит (количество клеток—
2 млрд.)
3,5 млрд.)
АгоЮЬааег
Вариант опыта
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
Сахароза
Глюкоза
Маннит
Глюкоза
Сахароза
Маннит
50
22
43
40
30
40
45
18
45
40
35
75
35
65
60
55
50
25
15
22
20
22
30
35
18
30
35
32
38
32
24
36
30
28
30
—
П р и м е ч а н и е . В этой и последующих таблицах приведены данные опытов, где микроэлементы внесены в среду, на которой росла
культура.
бее их влияние при внесении во взвесь клеток. В этом случае
можно отметить положительное действие молибдена и марганца, тормозящее — меди и в некоторых случаях — бора.
Несколько иное действие микроэлементов наблюдается в
отношении Вас. теда1егшт (табл. 13). Клетки этой бактерии
дегидрируют в равной степени глюкозу и сахарозу. Значительно замедлена эта реакция с маннитом. Соответственно и действие микроэлементов почти равно по первым двум субстратам.
Почти в одинаковой степени действуют молибден и марганец,
в большинстве случаев не проявляют действия цинк и медь. При
использовании маннита относительное действие микроэлементов увеличивается. Испытание культуры, выращенной без них,
показало усиление дегидрогеназной активности, проявляемой в
случае молибдена и марганца на глюкозе; на два другие субстрата, кроме упомянутых, действует также и бор. Но в этих
Таблица
Скорость дегидрирования Вас. оИ§опНгорИИи5 и Вас.
Вас. oligonitrophilus (количество
клеток—3,5 млрд.)
13
теда1егшт
Вас. теЁа1ег1ит (количество клеток—4,5 млрд.)
Вариант опыта
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
Глюкоза
Сахароза
Маннит
Глюкоза
Сахароза
Маннит
40
20
45
30
35
42
39
23
53
34
36
45
80
60
75
60
75
80
21
13
18
17
20
20
20
50
34
42
25
50
30
18
17
22
20
-
•71
ог/ытвх можно отметить резко тормозящее действие цинка и
меди.
Обилие слизи при культивировании Вас.
oligonitrophilus
затрудняло дозировку клеток и осаждение их при центрифугировании. Как и у предыдущей культуры, активность дегидрирования глюкозы и сахарозы Вас. oligonitrophilus
почти одинакова, но вдвое замедлено дегидрирование маннита. Действие
микроэлементов сказывается в значительной мере при воздействии их на растущую культуру и в меньшей мере — при внесении в отмытые клетки. В первом случае выделяется действие
молибдена, меньше влияет марганец, незначительно активирует дегидрогеназы цинк. Медь тормозит реакцию при использовании сахарозы. Внесение молибдена, марганца и бора в отмытые клетки не дает заметных изменений. Цинк и медь действуют тормозяще.
Из широко распространенного в почве рода
Pseudomonas
были испытаны четыре вида: Ps. sinuosa заинтересовал нас как
микроорганизм, положительно влияющий на рост сельскохозяйственных растений, Ps. denitrificans — как активный денитрификатор, Ps. fluorescens и Ps. rubigenosa, отличающиеся интенсивной пигментацией — зеленой и ярко-красной,— как пигментированные культуры, поскольку наличие пигментов могло
в той или иной мере сказаться при действии микроэлементов.
Таблица
Скорость дегидрирования видов рода
Вариант опыта
Глюкоза
Ps. sinuosa—4,5
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
40
20
32
37
31
35
Ps. denitrificans—2,5
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
35
28
36
26
30
33
Сахароза
Маннит
млрд. клеток
40
28
31
28
38
50
Маннит
Сахароза
Ps. fjuorescens—2,5 млрд. клеток
60
43
48
56
30
53
млрд. клеток
53
50
55
36
48
53
Глюкоза
14
Pseudomonas
62
45
60
55
65
50
40
21
37
25
55
38
75
45
55
60
80
85
Ps. rubigenosa—1
24
26
25
22
26
18
31
25
30
35
35
33
85
50
70
70
80
87
млрд. клеток
'
46
48
48
40
52
37
Как видно из табл. 14, бактерии дегидрируют все три субстрата, однако дегидрогеназная активность у них неодинакова.
В то время как у Рз. denitrificans этот процесс идет с разной
•72
активностью на различных субстратах, у Рх. э т и о з а глюкоза и
сахароза дегидрируются почти с одинаковой скоростью, значительно медленнее дегидрируется маннит. Действие микроэлементов выражено отчетливо, обесцвечивание синьки Ря. з т и о з а ,
выросшей на среде с молибденом, происходит почти в два раза
быстрее на всех субстратах. Так же действует на нее и цинк в
отношении маннита и глюкозы. Действие марганца выразилось только на сахарозе. Бор активировал дегидрогеназу, окисляющую маннит, и в меньшей мере дегидрогеназы, окисляющие
два других субстрата. Внесение молибдена, марганца и бора
в отмытую культуру активирует дегидрирование сахарозы и
почти не сказывается при наличии других субстратов.
Клетки Рз. йепИг111сат реагируют на микроэлементы в отношении молибдена и марганца при дегидрировании глюкозы
и одного молибдена — при дегидрировании маннита. Эта бактерия меньше всех ранее рассмотренных подвержена действию
микроэлементов. Внесение их в отмытые клетки также мало
эффективно.
Приведенные данные свидетельствуют о чрезвычайной активности дегидрогеназных систем Ря. rubigenosa принимая во
внимание сравнительно малое количество (1 млрд.) клеток в
опыте. У нее, как и у большинства взятых бактерий, легче дегидрировалась глюкоза и сахароза и труднее — маннит. Действие микроэлементов в данном случае незначительно. Можно
только отметить некоторое ускорение дегидрирования сахарозы и маннита при внесении молибдена « маннита при внесении
марганца и бора.
Активность Рз. ЦиогеБсепз значительно слабее. Д а ж е дегидрирование глюкозы проходит в течение 40 мин., почти вдвое
медленнее дегидрируются сахароза и маннит. Микроэлементы
активируют дегидрогеназы клеток данной культуры. Очень сильно действие молибдена, марганца и бора на растущую культуру, проявление которого наблюдается при наличии всех трех
субстратов. Медь инактивировала окисление сахарозы и маннита. В отмытых клетках культуры микроэлементы действовали с меньшей силой, однако молибден и марганец ускоряли
действие всех трех дегидрогеназ.
Оба вида микобактерий были взяты в равных количествах
клеток (5 млрд.). Это количество почти в одно время дегидрирует глюкозу. Что же касается двух других субстратов, то МусоЬ. сопуо1Шит дегидрирует сахарозу и маннит гора:
активнее, чем МусоЬ. globiformi. Действие на нее микроэлементов ~
выражено слабее. Влияние микроэлементов на МусоЬ. globiforт(-выразилось
в ускорении дегидрирования сахарозы и маннита. При дегидрировании последнего не действовали только
цинк и медь. Слабое действие микроэлементов наблюдалось
при использовании глюкозного субстрата. Интересно отметить,
•73
4
Скорость дегидрирования Mycobacterium
Mycobacterium
Вариант опыта
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
globiformi
Т а б л и ц а 21
(количество клеток—5 млрд.)
Mycobacterium
convo'.utum
Глюкоза
Сахароза
Маннит
Глюкоза
Сахароза
Маннит
22
18
19
20
20
24
45
34
41
33
40
40
67
48
61
57
70
73
20
16
18
18
18
18
28
21
29
20
22
30
50
45
48
45
52
51
что эта культура реагировала на них не только в процессе роста, но и при внесении их в отмытые клетки. Таким образом,
влияние микроэлементов можно наблюдать и на видах данной
филогенетической обособленной группы бактерий.
В опыте с актиномидетами было взято четыре штамма раз- ,
ных видов. В табл. 16 приведены данные относительно двух видов, поскольку в остальных двух культурах дегидрогеназная
активность менялась в тех же направлениях. Испытывалось
25 мг растертого в ступке мицелия актиномицетов, выращенных в жидкой среде № 1 Красильникова. Предварительные
опыты с целым мицелием показали более медленное дегидрирование по сравнению с растертым.
Таблица
Дегидрогеназная активность актиномицетов
Actinomyces
Вариант опыта
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
griseus
Actinomyces
16
coelicolor
Глюкоза
Сахароза
Маннит
Глюкоза
Сахароза
Маннит
185
110
195
170
250
210
200
220
180
220
300
230
400
300
300
80
65
82
62
85
120
110
180
105
130
180
170
175
160
185
—
—
—
.
—
—
—
Как видно из табл. 16, процесс дегидрирования у-актиномицетов проходит значительно медленнее, чем у бактерий, если
брать сравнительно равные по весу биомассы этих микроорганизмов. Проведенные опыты показали наличие у актиномицетов дегидрогеназных ферментов ко всем трем субстратам.
Так же, как и у бактерий, дегидрирование сахарозы и ман^нита было более затруднено. Действие микроэлементов выражено при внесении их в среду в процессе роста обоих актиноми74
цетов, однако оно не так значительно и касается только молибдена и марганца. Бор и цинк в большинстве случаев задерживали дегидрирование. МеДь задерживала рост актиномицетов,
которые даже при минимальных ее дозах не росли. Результаты
применения микроэлементов аналогичны у обоих актиномицетов, несмотря на то, что они отличались друг от друга не только в отношении морфолого-культуральных признаков, но и активностью дегидрирования.
Все испытанные культуры обладали различной скоростью
дегидрирования и различной активностью в отношении разных
субстратов. Если принять во внимание количество клеток, находящихся в опыте, и время реакции, то наиболее активно проходил этот процесс у Р«. ruЫgenosa, затем у азотобактера и
НЫгоЫит. Действие микроэлементов на эту пигментную бактерию было незначительным, чего нельзя сказать о двух других микроорганизмах. Весьма возможно, что малая активность
микроэлементов зависела от наличия пигментных веществ у
данной бактерии.
Сравнительно малой дегидрогеназной активностью- отличались актиномицеты. Молибден и марганец ускоряли дегидрирование субстратов этими организмами.
При внесении в среду, на которой росли микроорганизмы,
микроэлементы оказывали более сильное влияние, чем при внесении в отмытые клетки. Весьма возможно, что в этом случае
происходили изменения в дегидрогеназных системах с введением металлоиона в группу фермента, что было осложнено в
случае покоящихся клеток.
Таким образом, установлено положительное влияние микроэлементов на дегидрогеназную активность микроорганизмов
(бактерий и актиномицетов), выделенных из ризосферы сельскохозяйственных растений.
Микроэлементы молибден и марганец у с к а ; я ли процесс дегидрирования всех 14 видов микроорганизме^ на трех разных
органических субстратах. Цинк и бор не всегда активировали
данную реакцию, медь в большинстве случаев тормозила дегидрирование.
Действие микроэлементов проявлялось в различной степени
в зависимости от взятого микроэлемента и, вида микроорганизмов. Сильнее оно было выражено при внесении микроэлементов в среду, на которой росли микроорганизмы, чем при внесении во взвеси отмытых неразмножающихся клеток.
Дегидрирование органического субстрата актиномицетами
протекало значительно медленнее, чем бактериями. Микроэлементы молибден и марганец ускоряли дегидрирование субстрата у четырех видов взятых актиномицетов, однако их влияние
на данные микроорганизмы проявлялось в меньшей мере, чем
на бактерии.
'
•75
КАТАЛАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ
Определение каталазной активности микроорганизмов производилось на 10 культурах, выделенных из ризосферы пшеницы и кукурузы. Названия видов указаны в приведенных ниже таблицах.
Д л я определения каталазы пользовались методом Баха и
Опарина с соответствующими изменениями применительно к
работе с бактериальными культурами. В качестве микроэлементов были взяты Мо, Мп, В, Си в виде Ыа 2 Мо04, Ма 2 В 4 07, М п 5 0 4 ,
СиЭ04.
Количество клеток бактерий, кроме азотобактера, в вариантах опытов было равно 20—30 млрд., а азотобактера — б и
8 млрд. Контролем служили убитые прогревом культуры.
В табл. 17 приведены результаты, полученные при применении молибдена. Культуры 24-часовые. Приведенные в таблицах
данные представляют количество (в мл) 0,1-н. раствора перманганата, ушедшего на титрование Н2О2, не разложенного каталазой бактерий.
Т а б л и ц а 17
Влияние молибдена на каталазную активность бактерий
Количество перманганата, мл
Номер
штамма
34в
16
3
6
84в
21
5
7
31
13
Вид
Вас. danicus
Chromobact. chloriпит
Ps. longa
Bac. adhearens
Bact. agile
Bac. glutinosum
Ps. eisenbergii
Ps. striata
Chromobact. [lavescens
Ps. [luorescens
Прогретые
культуры
Непрогретые культуры
Контроль
Mo
Контроль
Mo
Разница
4,0
4,1
4,0
4,0
3,8
2,5
1,3
0,9
2,5
1,6
4,0
4,1
4,0
4,0
4,0
4,1
4,1
4,0
4,1
4,0
4,0
4,0
4,1
4,1
2,6
3,1
3,0
3,0
1,0
1,3
3,9
1,1
2,0
2,1
2,6
0,7
1 ,2
4,1
1,5
1,1
0,9
0,4
0,3
0,1
-0,2
3,9
3,9
1,3
1,8
-0,5
Приведенные данные указывают на способность молибдена
повышать каталазную активность бактериальных культур. Внесение молибдена повысило способность разлагать перекись водорода у семи из десяти взятых видов. Повышение это выразилось очень сильно у пяти видов (№ 34, 16, 6, 84, 3). На три
вида (№ 7, 31, 13) влияние Мо не доказано, так как получен•76
ные при титровании данные могут быть отнесены за счет отклонения в пределах ошибки.
Следующие опыты проводили с большим количеством микроэлементов (табл. 18). Контроль среды каждого варианта
опыта при титровании не дал отклонений, и потому, их не приводим. Молибден повысил действие каталазы всех девяти культур, взятых в опыт, бор — только у пяти, и не в такой степени,
как молибден. В большей мере выразилось действие марганца,
обнаруженное на семи культурах. Медь подавляла деятельность каталазы у всех девяти видов. Надо отметить, что примененная доза меди в большинстве случаев угнетала рост микроорганизмов, особенно азотобактера.
Таблица
18
Сравнительное действие микроэлементов на каталазную активность
бактерий
Количество перманганата, мл
Номер
штамма
3
5
6
7
16
19
21
34в
1в
Вид
Рв.
/ол£а
Рв. еіьепЬегціі
Вас. айкеагепв
Ря. йгіаіа
СНготоЬасі. сіогіпит
Вас. mycoid.es
Вас. цІиИпоьит
Вас. (Папіст
Рэ. gracilis
Прогретые
клетки
4,2
4,2
4,1
4,2
4,0
4,9
5,0
5,1
5,1
Живые культуры, выросшие
на среде с
Контроль
2,3
1,0
3,1
1,8
3,9
4,4
2,6
3,2
2,5
Мо
В
Мп
Си
1,8
0,6
2,6
1,3
2,9
3,9
2,0"
2,0
1,3
2,7
0,6
3,3
1,5
4,0
3,5
2,0
3,1
1,7
1,0
1,0
3,2
1,2
3,2
3,5
1,9
2,8
1,3
4,0
2,9
3,5
3,2
3,8
4,3
4,5
5,3
3,2
Отдельно проводили опыты с азотобактере-.. Отличие их
от у&е приведенных заключалось в том, что наряду с испытанием культуры, выросшей на среде с микроэлементами, определяли каталазу при добавлении микроэлементов непосредственно в суспензии культуры, выросшей без микроэлементов. В этих
определениях контакт культуры с микроэлементами был только в течение получаса — времени проведения анализа. Результаты опытов приведены в табл. 19.
Азотобактер обладает сильно выраженной каталазной активностью. Усиление каталазной активности тканей высших
растений под действием микроэлементов наблюдалось многими авторами. Особенно заметно в этом отношении влияние
марганца и цинка (Пейве, Крауя, 1957; Власюк, 1962). Такое
же действие микроэлементов показано и в наших исследова•77
Таблица
Влияние микроэлементов на каталазную активность азотобактера
Вариант
опыта
Внесение в среду,
на которой росла культура
Внесение в среду,
на которой росла культура
Внесение в суспензию клеток
Внесение в суспензию клеток
Количество перманганата,
Количество клеток,
Прогремлрд.
Мо
в
тые клетки Контроль
19
мг
МП
Си
9
4,7
1,0
0,3
0,8
0,3
Нет роста
6
4,7
3,4
2,2
3,9
3,1
>
9
4,7
2,2
2,2
3,3
2,1
3,1
5
4,7
3,0
4,2
3,6
4,2
4,1
ниях с микроорганизмами, каталазная активность которых повышалась от действия разных микроэлементов в 2—5 раз.
Влияние микроэлементов на каталазную активность бактерий в большей степени сказывается на растущих культурах и
менее выражено на выросших.
Молибден и марганец, примененные как микроэлементы,
сильно активируют каталазу бактерий, в том числе и азотобактера. Влияние бора проявляется реже и слабее, чем молибдена
и марганца. Медь, примененная в дозе 10—20 м.г, инактивирует каталазу бактерий. В этом отношении большую роль играют
дозы микроэлементов и- относительная плотность суспензий
культур.
Действие микроэлементов проявляется как на спороносные,
так и на неспороносные виды бактерий. Молодые (14-часовые)
культуры реагировали на микроэлементы так же, как и более
старые (24-часовые).
Как литературные, так и полученные нами данные свидетельствуют об определенном физиологическом значении и участии некоторых микроэлементов в окислительно-восстановим
тельных реакциях клетки и ее энергетическом обмене. Однако
действие микроэлементов, по-видимому, не ограничивается
этим, но заключается также в их влиянии на образование различных промежуточных органических соединений, возникающих в процессах дыхания. К таким, например, относятся некоторые органические кислоты и другие соединения, используемые клеткой для последующего синтеза различных веществ.
Известно, что участием в окислительно-восстановительных
и других важнейших реакциях клетки микроэлементы влияют
на белковый обмен высших растений. О непосредственном уча[
С
•78
стии марганца, железа, цинка, молибдена в этом процессе свидетельствует их способность повышать активность ряда ферментов белкового обмена (аминопептидаз, ди- и полипептидаз,
аргиназ и др.). Повышение содержания белкового азота у многих бобовых кормовых трав под действием упомянутых микроэлементов подтверждает на практике это положение (Жизневская, Пейве и др., 1946).
ПРОТЕОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ
Сведения о протеазах почвенных микроорганизмов немногочисленны. Изучение их шло в основном в направлении поисков активных штаммов грибов и бактерий для ферментной промышленности и в редких случаях для углубленного исследования и классификации бактериальных протеаз
(Maschmann, 1943).
В данное время больше изучены как наиболее активные
протеазы споровых бактерий. Вместе с тем известно, что многие
почвенные бактерии, грибы и актиномицеты обладают активными протеазами.
Как уже было сказано, нас интересовало влияние микроэлементов на протеолитические ферменты почвенных микроорганизмов, а также протеолитическая активность отдельных видов широко распространенных в ризосфере микроорганизмов
для выяснения, в какой мере эти виды могут принимать участие
в процессах разложения белковых веществ в почве.
Некоторые литературные источники (Johnson, 1941; Гейл,
1954; Грин и Нейрат, 1959) указывают на активирующее действие Со, Mn, Zn на бактериальные пептидазы. Имеются сведения о действии марганца на протеазы спор (Levinson а.
4
Hyatt, 1954).
'
В наших опытах (Бершова, 1960а) были взяты на испытания
Мо< В, Mn, Zn, Си в предварительно испытанных дозах от 20
до 0,2 мг на 1 л среды — в зависимости от микроэлемента. Исследовали культуры бактерий и актиномицетов — представителей наиболее распространенных в ризосфере родов, с в ^ е в ы деленных из ризосферы кукурузы и картофеля. Протеолитическую активность культур определяли по разжижению желатины
и измеряли методом вискозометрии Освальда.
Действие микроэлементов испытывали на культуральных
жидкостях взятых в опыты микроорганизмов, а также на их
клетках, так как интересно было учесть изменения под влиянием микроэлементов способности культур выделять данный
фермент в среду. Полученные данные выражены в единицах относительной вязкости желатины в пересчете на 100% ее концентрации в среде."Для сравнения свойств культур, приобретенных при выращивании на различных средах, их предвари•79
4
Т а б л и ц а 21
Протеолитическая активность микрофлоры (выраженная в единицах относительной вязкости желатины)
Синтетическая среда № 1
МПБ
Микроорганизмы
Pseudomonas
rubigenosa
Ps. caudatus
Ps. liquefaciens
Ps. fluorescens
Bacterium liquefaciens
Bact. nitrificans
Pseudobacterium
groningensis
Pseudobact. vulgatus
Mycobacterium
hyalinum
Mycobact. globiforme
Proactinomyces albus
Actinomyces griseus
Act. chromogenes
Bacillus cereus
Вас. idosus
Вас. oligonitrophilus
Вас. mesentericus
Вас. mycoides
Вас. megaterium
Вас. glutinosus
Клетки
Культуральная
жидкость
Клетки
Культура льная
жидкость
I
II
III
IV
140
155
225
320
600
880
920
900
58
61
60
90
160
190
265
505
122
230
88
—
—
70
74
80
100
170
185
325
78
94
70
92
120
287
160
130
85
140
78
—
—
170
150
180
470
121
260
730
—
1010
940
730
222
230
305
240
190
330
220
208
—
1485
1170
980
1057
848
630
300
200
1600
730
695
—
—
—
950
—
—
1075
П р и м е ч а н и е . В графе III и IV отсутствие роста микроорганизма на среде № 1 обозначено (—).
тельно культивировали параллельно на МПА и синтетической
среде с сахарозой.
Из данных табл. 20 видно, что представители различных
видов почвенной микрофлоры обладают различной протеолитической активностью. Они различаются также и способностью
выделять и накапливать в среде протеолитические ферменты.
Наиболее протеолитически активными в данном случае были
виды Pseudomonas.
Они разжижали желатину до 58—90 единиц относительной вязкости, а их культуральные жидкости —
до 70—94. Следующими по активности идут виды рода Bacterium с разжижением желатины, в 3—4 раза меньшим, чем у
Pseudomonas. Однако их культуральные жидкости менее активны (только в 2—3 раза), чем у Pseudomonas.
Почти равной
активностью с видами Bacterium обладают Mycobacterium,
но
активность экзоферментов в среде у последних более значительна.
80
Одинаковой активностью с Mycobacterium
обладают актиномицеты, при росте которых относительная вязкость равна
240—300. Накопление в среде ферментов у этих микроорганизмов значительно больше. В этом отношении актиномицеты превосходят большинство бактерий. Семь видов рода
Bacillus
показали заметные различия в действии протеаз. Некоторые
из них достигают активности Pseudomonas.
Что же касается
Вас. megaterium и Вас. glutinosus, то их активность значительно ниже. Соответственно активности клеток получено и действие их культуральных жидкостей. У первых двух видов разжижение желатины при внесении центрифугатов достигает высокой степени (170—150 единиц относительной вязкости), у других ж е оно значительно ниже.
При выращивании же видов, растущих на синтетических
средах, на синтетической среде Красильникова № 1 с минеральным азотом наблюдалось интересное явление частичной
потери протеолитической активности. После трех пассажей на
этой среде был применен такой же прием засева в желатину,
как и культур, выращенных в МПА. Разжижение желатины такими культурами показано в III и IV графах табл. 20. Оно
было гораздо слабее, чем у тех же культур, выращенных на
МПБ. Протеолитическая активность клеток уменьшилась приблизительно в 3—4 раза. Разница между активными и менее
активными видами в этом случае сглаживалась.
Ослабление протеолитической активности особенно заметно
на действии культуральных жидкостей, активность которых
сильно уменьшилась, а в некоторых случаях совсем не проявлялась. Такое явление свидетельствует о замедлении выделений
культурой ферментов в среду. Однако способность образовывать протеолитические ферменты сохраняется в клетке и проявляется в соответствующих условиях.
>
Действие микроэлементов испытывали при посеве культур
в 2,5%-ную желатину. Все испытуемые виды предварительно
пассировали на среде с микроэлементами. При последующих
высевах таких микроорганизмов в желатину наблюдалось увеличение их протеолитической активности. В табл. 21 приведены
показатели относительной вязкости желатины при ц^севе четырех видов
Pseudomonas.
Действие микроэлементов наблюдалось на всех четырех
культурах (табл. 21), но в разной степени. Более заметно влияние молибдена и марганца, менее — бора. Цинк — в одном,
медь — в двух случаях тормозили действие протеаз.
Активация протеаз проявилась и при накоплении этих ферментов в среде, на которой росли культуры. Испытание культу*
ральных жидкостей, полученных при росте бактерий на среде
с микроэлементами, в большинстве случаев показало более
сильное действий, чем у контрольных вариантов. Так, у Ps. саиб—Ж
81
4
Таблица
Действие микроэлементов на протеолитическую активность видов
(относительная вязкость желатины)
Ps.
Микроэлементы
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
rubigenosa
Ps. caudatus
Ps.
liquefaciens
21
Pseudomonas
Ps. fluorescens
Клетки
Культуральная
жидкость
Клетки
Культуральная
жидкость
Клетки
Культуральная
жидкость
Клетки
Культуральная
жидкость
80
62
65
67
62
75
335
304
360
280
370
430
122
69
115
90
100
191
885
535
735
690
785
600
91
76
73
85
92
62
102
71
173
113
120
129
225
210
205
180
450
250
920
710
850
860
930
830
datus контрольные варианты р а з ж и ж а л и желатину до 885 единиц относительной вязкости, опытные же культуры, выращиваемые на среде с молибденом, были значительно активнее и
р а з ж и ж а л и желатину до 535, соответственно на среде с марганцем — до 690, на среде с медью — до 600 единиц относительной вязкости. Наблюдалось также явление, когда клетки
культуры проявляли заметное усиление активности, выделение
ж е ферментов задерживалось. Такая картина обнаружена у
Ps. rubigenosa и Ps. liquefaciens.
В других случаях при действии меди культуральные жидкости были активнее контрольных,
а клетки — нет (Ps. caudatus, Ps.
fluorescens).
Действие микроэлементов на виды Bacterium
и Pseudobacterium иллюстрирует табл. 22, из которой видно, что оно проявляется в тех ж е направлениях, что и действие их на Pseudomonas. Бактериальные клетки были протеолитически активнее
под влиянием Mo, Mn, Zn. Эти микроэлементы также стимулировали выделение протеаз в среду, что видно из повышенной
активности культуральных жидкостей микроорганизмов.
Бор в трех случаях действовал инактивирующе, в двух ж ^
других получено незначительное стимулирование. По-видимому,
сыграла роль дозировка бора, одинаковое количество которого
было оптимально для оДних микроорганизмов и незначительно
угнетало другие.. Однако у всех культур, приведенных в табл. 22,
бор тормозил выделение ферментов в среду, а у JВас/, liquefaciens — в значительной степени. Только Bact. liquefaciens
положительно реагировала на внесение меди.
В табл. 23 приведены данные относительно действия микроэлементов на взятые микобактерии, проактиномицеты и актиномицеты, показывающие, что наиболее четко влияние микроэлементов сказалось на Actynomyces
griseus, у которого усиление
активности протеаз доходило до двух и более раз. Активно
действовал и марганец, следующим по силе действия был мо82
Т а б л и ц а
22
Д е й с т в и е м и к р о э л е м е н т о в на п р о т е о л и т и ч е с к у ю активность видов Bacterium
Pseudobacterium
( о т н о с и т е л ь н а я вязкость ж е л а т и н ы )
Микроэлементы
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
Pseudobact. groningensis
и
Pseudobact.
vulgatus
Bad.
liquefaciens
Клетки
Культура льная
жидкость
Клетки
Культура льная
жидкость
Клетки
Культуральная
жидкость
Клетки
Культура льная
жидкость
250
197
229
202
200
198
197
181
416
160
109
130
300
280
290
190
230
295
280
213
390
186
216
240
740
660
765
700
600
865
870
805
900
890
820
880
750
640
800
650
600
790
785
615
745
579
720
685
Bact. nitrif icons
Таблица
23
Д е й с т в и е м и к р о э л е м е н т о в на активность п р о т е а з р а з л и ч н ы х в и д о в из к л а с с а
л у ч и с т ы х г р и б о в ( о т н о с и т е л ь н а я вязкость ж е л а т и н ы )
Микроэлементы
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
Mycobacterium
hyalinum
Mycobacterium
giobiforme
Proactinomyces
albus
Клетки
Культуральная
жидкость
Клетки
Культуральная
жидкость
Клетки
Культура льная
жидкость
220
205
225
230
150
240
185
141
195
190
120
220
290
271
294
225
210
300
145
125
134
130
130
162
140
125
148
95
76
125
98
86
98
84
90
90
Actinomyces
griseus
Клетки
Культура льная
жидкость
245
136
185
88
66
515
211
465
92
70
либден. Д а ж е бор усиливал протеолитическую активность, однако не в такой степени, как первые три микроэлемента. Медь
в дозе 0,2 мг/л среды угнетала рост актиномицетов.
В остальных трех культурах сказалось действие марганца
и цинка как Ъа клетки, так и на культуральные жидкости. Медь
не оказывала стимулирующего действия. Вообще же микь^актерии оказались мало отзывчивыми на действие микроэлементов, сравнительно с другими организмами.
*
В табл. 24 приведено изменение протеолитической активности споровых бактерий. Повышение протеолитической активности у Вас. сегеиэ наблюдалось только под влиянием цинка.
Однако усиление действия культуральной жидкости этого микроорганизма отмечается во всех вариантах опыта. На Вас. туcoid.es заметное влияние оказали молибден и цинк. Тормозила
протеолиз медь. Что же карается выделения ферментов в куль6*
83
туральную жидкость, то в этом случае оказывали действие молибден, марганец и цинк. Вас. glutinosus, отличающийся медленным действием протеаз, реагировал только на марганец и
цинк. Медь же в значительной степени тормозила его протеолитическую активность. В опытах же с фильтратами культур обнаружено влияние также молибдена и бора. •
Т а б л и ц а 24
Действие микроэлементов на протеолитическую активность споровых бактерий
(относительная вязкость желатины)
Вас. cereus
Микроэлементы
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
Клетки
300
290
300
280
155
250
Вас. obligonitrophilus
Культу- ' Клетральная
ки
жидкость
215
185
210
190
190
210
200
212
222
245
227
231
Вас.
mycoides
Вас.
glutinosus
Культуральная
жидкость
Клетки
Культуральная
жидкость
Клетки
Культуральная
жидкость
690
606
740
833
485
810
270
200
275
265
245
360
101
68
98
77
88
92
425
423
415
306
310
695
975
800
785
760
880
1125
Полное отсутствие активирующего влияния микроэлементов
в опытах с клетками наблюдалось у Вас. oligonitrophilus,
но
культуральные жидкости его при действии молибдена и цинка
обладали большей активностью. Таким образом, каждая из
споровых культур по-разному реагирует на микроэлементы.
Проведенные в одинаковых условиях опыты с 20 видами
почвенных микроорганизмов имели целью сравнение их протеолитической активности. Испытания показали, что не только
роды, но и разные виды одного рода обладают различной способностью разжижать желатину. По этому признаку данные
микроорганизмы можно условно отнести к более или менее
протеолитически активным группам. Большая активность протеаз проявилась у видов Pseudomonas.
Менее активны виды
Mycobacterium
и Pseudobacterium.
Некоторые виды споровых
бактерий (Вас. cereus, Вас. idosus) обладают очень активными
протеолитическими ферментами. У таких ж е видов, как Вас.
glutinosus
и Вас. mycoides, протеолиз проходит гораздо медленнее.
Данные, полученные на одном белке, относительны. Не подлежит сомнению, что протеолитическая активность к другим
белковым соединениям может измениться. Она изменяется
также в зависимости от условий опыта. При выращивании культур на синтетической среде с минеральным источником азота
у микроорганизмов значительно снижалась протеолитическая
•84
активность, что было отмечено при последующих пересевах на
желатину.
Влияние микроэлементов на протеолитическую активность
проявлялось в разной степени в зависимости от микроэлемента,
его дозы и вида микроорганизма. В большинстве случаев можно было отметить стимулирующее действие молибдена, цинка,
марганца на активность клеток и усиление протеолитического
действия культуральных жидкостей. Что касается последних,
то это влияние могло происходить благодаря усилению выделений ферментов клетками, а также, возможно, за счет активирования са,мих ферментов в среде.
АМИЛОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ
Процессы биологического превращения углерода в почве ризосферы растений очень сложны и многочисленны.
О них в известной мере можно судить по амилолитической активности микрофлоры.
Расщепление крахмала в почве осуществляется различными
микроорганизмами. Как указывают Пошон и де Б а р ж а к (1960),
микроорганизмы, осуществляющие этот процесс, можно разделить на две группы: мало специализированную бактериальную
и грибную микрофлору, расщепляющую крахмал до декстринов, и меньшую количественно, но более специализированную,
расщепляющую этот углевод до органических кислот и других
конечных продуктов.
Несмотря на многочисленные исследования этого процесса,
состав микрофлоры, разлагающей крахмал, степень участия в
этом отдельных видов микроорганизмов и факторы, активирующие это разложение, полностью еще не известны.
Обычно изучение данного вопроса шло~в двух направлени-.
ях: а) исследование амилолитической активности различных
групп и отдельных видов почвенных микроорганизмов; б) поиски активных штаммов почвенных бактерий и грибов для получения ферментных препаратов и выяснения оптимальных условий культивирования этих штаммов.
Что* касается действия микроэлементов на ам^дрлитическую
активность почвенных микроорганизмов, то л и т е р а ^ р а по этому вопросу весьма ограничена. Кроме упомянутых на страницах литературного обзора работ (Lulla, 1951; Stein, Fischer,
1960), об активирующем влиянии металлов, сравнительно незначительном, на амилолитическую активность термофильных
бактерий сообщают Имшенецкий и Солнцева (1944). О влиянии
цинка и других микроэлементов на амилазу Вас. subtilis говорят работы Велли, Стейна и др. (Velles, Stein et al., 1959; Jamamoto, Fukimoto, 1959). „
Наши исследования (Бершова, 1961) были направлены на
•85
изучение амилолитической способности представителей различных видов ризосферных микроорганизмов и влияния на этот
процесс микроэлементов. Амилолитическая активность испытуемых культур определялась по их способности расщеплять крахмал в определенный промежуток времени до полного исчезновения окрашивания йодом, а- и ß-амилазы определяли суммарно.
Кроме актиномицетов, которых выращивали в жидких средах,
испытуемые бактерии культивировали на агаризованных средах, снимали шпателем с чашек, промывали в буферном ацетатном растворе с последующим центрифугированием. Суспензии таки!х клеток доводили до определенной концентрации с помощью соответствующих стандартов. Поскольку нас интересовала также амилаза, выделяемая культурой в процессе роста
в среду, из агара делали вытяжки из расчета: агар + буферный
раствор 1 : 1 . Такие вытяжки, или культуральные жидкости (в
случае жидких культур), испытывали в количестве 1 мл. Культуры испытывали в 2- и 10-дневном возрасте. Данные, приведенные в таблицах, выражены в условных единицах амилолитической активности, полученных на 25 мл среды (суммарно
из клеток и среды, на которой росла культура). З а единицу
амилолитической активности было принято количество крахмала (в мг), разложенного в течение одного часа 1 млрд. клеток.
Влияние микроэлементов испытывалось путем добавления в
среду, на которой росли микроорганизмы, что обеспечивало их
действие на растущую клетку, и добавлением в пробирки с
суспензией клеток, выросших без микроэлементов. В последнем случае достигалось действие на неразмножающуюся культуру. Применяли такие дозы микроэлементов, предварительно
изученные: Мо—-10, В — 8, Мп — 15, Zn — 3, Си —0,6 мг!л.
На амилолитическую способность были испытаны 123 штамма ризосферных бактерий, принадлежащих к 62 видам, и 246
штаммов, относящихся к 34 видам актиномицетов. Эти культуры были выделены из ризосферы пшеницы и кукурузы. Кроме
того, испытывали музейные штаммы азотобактера и клубеньковых бактерий. Результаты представлены в табл.. 25. Они указывают на наиболее широко выраженную способность разлагать
крахмал у видов рода Bacillus* Из 25 видов только два не проявили амилолитической способности. Все взятые виды актиномицетов и проактиномицетов также очень интенсивно разлйгали
крахмал. Однако тут наблюдались штаммовые различия. Из
246 штаммов 20, относящихся к разным видам, были не активны. У остальных только 57% видов показали способность расщеплять этот углевод. Все же у некоторых видов
Pseudomonas
и Bacterium она проявлялась очень интенсивно.
Влияние микроэлементов на данный процесс изучалось на
нескольких видах микроорганизмов, относящихся к различным
наиболее распространенным в ризосфере группам почвенной
•86
4
Т а б л и ц а 21
Амилолитическая
активность ризосфер'ных
низмов
микроорга-
Количество видов
эмилолитически
Состав микрофлоры
взято
в опыт
Споровые бактерии из рода Bacillus
Неспоровые бактерии из
родов Bacterium и Pseudomonas
Азотобактер
Клубеньковые бактерии
Мусо- и Pseudobacterium
Актиномицеты и проактиномицеты
активных
неактивных
25
23
2
18
3
2
14
8
3
1
9
34
34
10
—
1
5
микрофлоры. Их названия и результаты исследований в единицах амилолитической активности, полученных на 25 мл среды,
приведены в табл. 26, 27, 28.
Амилолитическая активность азотобактера, приведенная в
табл. 26, в двух суточных культурах равнялась 195 единицам,
активность ЯЫгоЫит теШой — 70—76 единицам. Значительно больше накоплено амилазы в 10-суточных культурах, у клубеньковых она увеличивалась до трех раз, у азотобактера — в
гораздо большей мере, доходя до 2074—3000 единиц. Это увеТ а б л и ц а 26
Действие микроэлементов на амилолитическую активность
неспоровых бактерий
Rhizobium
met Ilot і
Azotobacter
chroococcum
Вариант
опыта
Ps.
Й '
rubigenosa
caudatus
I
I
Возраст культур (в сутках)
2
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
10
195
2074
930
3502
168
863
292
2572
160
1440
190- 1020
2
.0
2
10
2
10
76
126
78
181
110
220
283
300
343
342
240
429
176
156
231
406
177
142
450
152
114
233
190
65
94
50
120
93
50
80
120
90
140
109
87
личение в большой мере обусловлено накоплением амилолитического фермента в среде.
При внесении молибдена и марганца в среду и суспензию
клеток амилолитическая активность молодых культур азотобактера усиливается. Это усиление более заметно при внесении
в культуру, выросшую с микроэлементами, чем при внесении в
суспензию клеток. Некоторое замедление амилолитического расщепления наблюдалось в случае внесения бора и меди. На старые 10-суточные культуры положительно влияет, кроме двух
упомянутых микроэлементов, еще и цинк.
Эти же три элемента также активируют расщепление крахмала Rhizobium meliloti. При внесении их в среду, на которой
росла эта бактерия, в молодых культурах более эффективен
марганец, затем молибден. При внесении же их в суспензию
неразмножающихся клеток первое место по эффективности занимает молибден. Что касается цинка, то он оказывает влияние на амилолитическую активность только при внесении в
среду, где росла культура. При продолжении роста до 10 суток сказывается действие бора, влияние которого на молодые
культуры не отмечено.
Амилолитическая активность у Rhizobium от внесения микроэлементов больше усиливается в молодых культурах, чем в
старых. Однако на последние действовали все взятые микроэлементы, чего не наблюдалось у молодых культур.
Из неспоронооных бактерий в испытание были взяты два
вида Pseudomonas.
Амилолитическая активность этих видов
значительно меньше, чем азотобактера. Действие микроэлементов выражено более отчетливо у Ps. rubigenosa. Расщепление крахмала контрольными вариантами этой бактерии выражается 129 единицами, вариантом, выросшим на среде с молибденом,— 176, на среде с марганцем — 231, с цинком — 406
единицами. Как видно из этих данных, наиболее сильное воздействие на эту культуру оказали цинк и марганец.
Влияние микроэлементов проявилось и в 10-суточной культуре, но в этом случае больше действовал молибден. При внесении микроэлементов в суспензию клеток дали эффект только
у 10-суточных культур молибден и цинк.
Такая же картина влияния микроэлементов наблюдалась и
у Ps. caudatus, однако с относительно меньшим результатом.
Тут также были эффективны марганец, цинк и молибден.
Обе споровые культуры (табл. 27) обладали высокой амилолитической активностью, особенно Вас. glutinosus.
Некоторые различия в их ферментных системах выражались в способе
накопления амилазы в среде: у Вас. megaterium, как и у всех
предыдущих культур, с удлинением срока культивирования наблюдалось накопление амилазы; у Вас. glutinosus это накопление было только в первые дни. При продолжении культивиро•88
4
Т а б л и ц а 21
Действие микроэлементов на амилолитическую активность споровых
бактерий
1
Вас. те%а1ег1ит
Вариант
опыта
I
И
gШinosus
II
I
Возраст культур (в сутках)
1
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
Вас.
290
780
258
550
350
355
788
461
662
467
—
2
12
2
12
470
750
590
600
707
335
366
441
810
384
351
904
1224
838
1114
880
610
515
620
1025
1042
1018
—ч
—
'
—
вания до 12 суток количество амилазы у большинства вариантов опыта уменьшалось.
Действие микроэлементов на Вас. megaterium
проявилось
при внесении как в среду, так и в суспензию культуры. Первое
место по эффективности действия занимает молибден, затем
марганец и цинк. Расщепление крахмала усиливалось в 1,5—
2 раза. При внесении микроэлементов в суспензию клеток действует и бор. Вас. цШтозт
также реагирует на микроэлементы. Амилолитическая активность этой бактерии значительно (в
некоторых случаях в два и больше раза) усиливается. В относительных количествах это усиление одинаково в вариантах как
с молодыми, так и со старыми культурами. Первое место по
силе действия на данную культуру занимают цинк и молибден.
Отмечено некоторое действие бора. Медь угнетала активность
амилазы.
Т а б л и ц а 28
Действие микроэлементов на амилолитическую активность
актиномицетов
М. ёГ1БвиБ
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
II
I
Вариант
опыта
Ас1. Ё1оЫврогиз
1
I
"
Возраст (в сутках)
,0
20
.0
20
.0
20
492
965
341
696
817
340
553
216
475
455
432
525
261
515
517
250
359
409
315
464
432
369
320
650
300
610
410
375
610
320
415
480
350
—
—
—
89
Данные о амилолитической активности актиномицетов приведены в табл. 28. Амилолитическая активность актиномицетов
выше, чем испытанных культур бактерий, если брать сравнительно одинаковые биомассы этих микроорганизмов. Действие
микроэлементов на расщепление крахмала обоими видами актиномицетов очень значительно. Активность Act. griseus равна
432—492 единицам, Act. globisporus — 320—375. Интересно отметить особенность стареющей культуры (20-суточной)
Act.
griseus
снижать расщепление крахмала, что при испытании
бактериальных культур констатировано только в одном случае.
Кроме того, из суммарного количества единиц, представленных
в табл. 28, большее количество относится к действию мицелия.
Культуральные жидкости актиномицетов мало активны, чего
также не наблюдалось у бактерий. Соотношение единиц амилолитической активности действия культуральных жидкостей
и клеток у испытанных бактерий колебалось в пределах 1 : 2 —
1 : 3, в то время как у актиномицетов оно равнялось 1 : 5—1 : 10.
Действие микроэлементов особенно сильно при внесении их
в среду, где росли актиномицеты. Больше всего при этом сказалось влияние молибдена, который активировал процесс в два
раза. Почти в равной степени сказалось влияние марганца и
цинка. Тормозил процесс бор.
Многочисленные исследования физиологов' растений показали участие микроэлементов (Мп, Zn, Mo, Си) в синтезе и превращениях углеводов высших растений. Входя в состав соответствующих ферментов (карбоксилазы, энолазы,. альдегидоксидазы и многих других), эти микроэлементы активируют
процессы углеводного обмена. Так, Мп и Zn повышают количество Сахаров в сахарной свекле и винограде. Марганец способствует гидролизу крахмала при прорастании семян. Бор, соз д а в а я комплексные соединения с сахарами и другими углеводами, улучшает их передвижение в растениях. Той ж е способностью обладают и другие соединения. .
Действие микроэлементов на некоторые особенности углеводного обмена проявилось и в наших опытах с амилазой почвенных микроорганизмов.
Примененные в опытах микроэлементы большей частью повышали амилолитическую активность большинства взятых микроорганизмов. Особенно это касается марганца, цинка, молибдена. Такое действие, по-видимому, осуществляется благодаря
связи данных металлов с ферментной системой клеток. Это
представляет интерес, если принять во внимание, что в отношении бактериальных амилаз такие сведения в литературе до
сих пор были единичными.
Т а к ж е интересно проявившееся действие бора на некоторые
культуры. Считают, что этот микроэлемент, обычно имеющийся
в клетках растений, не нужен для действия ферментов. Воз•90
можно, что в данном случае влияние его на амилолитические
функции клеток было косвенным. Действие меди было в большинстве случаев инактивирующим.
Влияние микроэлементов проявлялось главным образом на
клетки и на выделение ими амилазы в среду. При действии же
микроэлементов на культуральные жидкости или фильтраты
вытяжек среды, на которой росли культуры, мы не получали
заметного эффекта. Это говорит также о непосредственной связи микроэлементов с жизнедеятельностью клетки бактерий и
актиномицетов. Микроэлементы действовали главным образом
при внесении в среду, на которой росли микроорганизмы, меньше — при внесении в суспензию клеток.
Таким образом, изучение действия микроэлементов на некоторые ферментативные системы микроорганизмов показало
определенное активирующее влияние их на процессы окислительно-восстановительные, протеолитические и амилолитические.
Можно полагать, что при внесении микроэлементов в почву
осуществляется подобное влияние, являясь определенным фак- .
тором в повышении биологической активности процессов почвы
и действия их на развитие и продуктивность сельскохозяйственных растений.
,
ФИКСАЦИЯ АТМОСФЕРНОГО АЗОТА
Большинство исследований азотфиксации азотобактера, клубеньковых и других микроорганизмов в той или
иной мере связано с изучением действия на этот процесс микроэлементов. Усиление развития бактерий и активности азотфиксации при применении последних отмечалось многими ав- .
торами. Первое место по силе действия на азотфиксирующую ' j
способность микроорганизмов занимал Мо, затем шли V, W и
Fe. Эти микроэлементы увеличивали биологическое связывание '
азота в два и больше раз.
Первые наблюдения в этой области относились к эффективному действию почвенных вытяжек (Greaves, 1916; Bortels,
1927, 1930), изучение которых привело к выводу, что стимулирующим началом их были соли Мо и некоторых других металлов. Дальнейшие опыты с применением этих солей показали
неодинаковое отношение к ним различных видов и даже штаммов азотобактера (Kluyver a. van Reenen, 1933; Burk, 1934;
Horner et al., 1942), а также значение определенных дозировок
микроэлементов (Esposito, 1954; Esposito a. Wilson, 1956).
По данному вопросу опубликовано много работ, однако до
сих пор предметом споров служит вопрос, является ли микроэлемент для азотфиксации необходимым или только стимулирующим фактором.
Углубленные исследования в этом направлении произведе•91
ны Бортельсом, отметившим усиленйе азотфиксации не только
в лабораторных, но и в полевых опытах. Автор считает, что наличие молибдена и ванадия в почве необходимо для развития"
в, ней азотобактера и клубеньковых бактерий и является показателем плодородия почвы. Стимулирование азотфиксации и
размножения азотфиксаторов в почве отмечено также Ван-Нилем (Van-Niel, 1935), Мульдером и др. (Mulder, 1939; Mulder
et al., 1959), Абуталыбовым (1961) и др. Последний нашел, что
повышение азотфиксирующей способности почвы при внесении
молибдена и бора зависит от активации этими элементами не
только азотобактера, но и других микроорганизмов почвы, фиксирующих азот (Абуталыбов, Газиева, 1961). Данные Бортельса были подтверждены Клюйвером и Ван-Рененом (Kluyver а.
Van-Reenen, 1933), а также Берком и Хернером (Burk а. Horner, 1940). Последние наблюдали стимуляцию азотфиксации
молибденом даже на средах со связанным азотом в нитратной
или аммонийной форме. Согласно Мульдеру (Mulder, 1948), в.
последнем случае стимулирующая доза молибдена значительно
меньше, чем при усвоении азотобактером молекулярного азота.
Огромное усиление азотфиксации азотобактера от применения Мо (на 600%) отмечает Матуашвили (1947). Использование
фосфорно-молибденовой кислоты в опытах Федорова (1952)
повысило азотфиксацию на 95%.
На дерново-среднеподзолистой почве Латвии применение
молибдена и бора перед посевом повышало азотфиксацию местного штамма (№ 48) азотобактера в полевых условиях на 22—
35% (Клинцаре, Креслиня, 1961).
Как видно из приведенных данных, степень стимулирующего действия молибдена на азотфиксацию у разных авторов получалась разной, однако это действие было несомненным.
Несмотря на большое количество исследований азотфиксации, этого важнейшего процесса в земледелии, химизм его до
сих пор недостаточно изучен. Имеются только гипотетические
высказывания относительно этапов и ферментов азотфиксации.
По мнению Виноградского (1928, 1952), азотфиксация происходит с участием фермента нитрогеназы, активирующей молекулярный азот. Берк (Burk, 1934) назвал ферментный Комплекс, участвующий в азотфиксации, азотазой, а его главный
компонент, активирующий молекулярный азот,— нитрогеназой.
По мнению Кастля (Castle, 1958), активной группой нитро;
геназы может быть хелатное_ соединение с металлическим ионом
с м е н но й в а л ен тности. Та к и м и могут"Т5ыть Fe, Mo, Mn.
По данным Гапона (1947) и Блома (Blom, 1928), молекулярный азот активируется геминным ферментом, в составе"
пути этого процесса в представлейтпгэтих авторов разные.
Было высказано предположение, оспариваемое в дальней•92
шем некоторыми исследователями, что найденная у азотобактера гидрогеназа активно участвует в процессе азотфиксации
и что все бактерии, имеющие такую шдрогеназу, могут фиксировать атмосферный азот. Согласно Эспозито и Вильсону (Esposito a. Wilson, 1956), повышенное содержание железа стимулирует гидрогеназную активность азотобактера.
Действие молибдена на азотфиксацию связывают с наличием
его в клетках азотобактера. Однако данные отдельных авторов
в этом отношении расходятся. Тер Мулен (Ter Meulen, 1931),
Кониш и Тцуге (Konishi a. Tzuge, 1934) нашли относительно
большие количества этого элемента в клетках азотобактера,
тогда как по данным Берка (Burk, 1934), его содержание незначительно. Такие расхождения можно объяснить разным поглощением молибдена при различных условиях выращивания
культур, что, по-видимому, не принято во внимание упомянутыми исследователями.
Использование метода изотопов позволило изучить поступление молибдена в клетки азотобактера. Пользуясь Мо", мы
(1956, 1958) показали поступление его, а также отдачу клетками этой бактерии, большее использование молодой культурой
и различия в поглощении разными штаммами азотобактера.
Форма связи его с другими соединениями в клетке изменилась,
так как новые, выделенные в среду соединения Мо, были более
доступны растениям.
Работая с тем же М о " и W 85 , другие исследователи определили, что эти микроэлементы сосредоточены в плазме клетки
и входят в состав фракции металлофлавопротёииов (Keeler а.
Clark, 1958; Киллер и Варнер, 1962).
Несмотря на многочисленные исследования, до сих пор не
решен вопрос, является ли участие молибдена в азотфиксации
специфичным. Ряд опытов показал, что Мо и отчасти V необходимы для роста микроорганизмов, причем' это наблюдалось
и на средах со связанными формами азота в виде нитратов и
аммиака. Ж е л а я исключить возможность ошибки, Берк (Burk,
1934) культивировал азотобактер на средах со связанным азотом в смеси газов (водорода и кислорода) и на средах без
азота — в обычных условиях. В первом случае стимуляция была
незначительной, в то время как во втором случае азотфиксация
повышалась на 100—500%. Более убедительно подтверждена
специфичность действия Мо и Fe в реакции азотфиксации опытами Пенгры и Вильсона (Pengra a. Wilson, 1959), которые
показали стимулирующее действие этих элементов при выращивании Aerobacter aerogenes в атмосфере азота и отсутствие
этого действия при росте н^ средах со связанным азотом.
Казалось бы, такие данные решают вопрос в сторону специфичности Мо. Однако другйе исследования того же Берка, а
также Федорова (1949) и других показали возможность фик•93
садии азота без внесения молибдена в среду. В последнем случае все же надо учесть возможное наличие в среде молибдена
за счет загрязнений и принять во внимание, что все указанные
авторы работали без специальной очистки среды. Кроме того,
современные методы очистки все же не дают полной гарантии
отсутствия этого элемента (Хьюитт, 1960).
Испытание действия молибдена на азотфиксирующую способность азотобактера и других почвенных бактерий проводилось нами параллельно с наблюдением за их ростом (Бершова,
1951). Кроме азотобактера было взято несколько видов олигонитрофилов. Наличие в среде молибдена значительно усиливало
азотфиксирующую способность бактерий (табл. 29). Заметное
усиление роста в некоторых случаях было относительно меньшим, чем азотфиксации.
Т а б л и ц а 29
Влияние молибдена на рост и азотфиксацию азотфиксирующих
бактерий
Количество клеток (в
млн. на 1 мл среды)
Количество фиксированного азота на 1 е
сахара (в мг)
Вид
Pseudomonas
rubigenosa
Bact. liquefaciens
Bact. radiobacter
В act. agile
Bact. herbicola
Azotobacter chroococcum
Mycobact. vadosum
My cob act. mibicum
Вас. brevis
Вас. potimyxa
Вас. glutinosus
Без Mo
с Mo
Без Mo
45
60
50
69
120
52
67
75
63
151
—
—
2,2
3,3
5,7
6,3
7,1
7,5
3,7
4,1
3,8
4,8
5,8
30
52
—
90
16
41
75
—
115
14
С
Mo
3,3
3,7
6,4
7,5
7,6
15,1
4,5
6,1
5,2
6,7
5,9
Следует отметить, что физиологическая роль молибдена выходит за рамки азотфиксации, так как он участвует в восстановлении нитратного азота, питании микроорганизмов и высших
растений. При наличии в среде источников азота в форме NH3
необходимость в Мо отпадает (Esposito a. Wilson, 1956).
Было также отмечено действие на азотфиксацию ванадия
и вольфрама (Burk, 1934; Bortels, 1936; Davies а. Stockdill,
1956). Однако их стимулирующее влияние было значительно
меньше, чем молибдена (Burk а. Horner, 1935; Kovats, 1938;
Horner a. al., 1942), и в определенной мере зависело от их валентности (Nicholas, 1958). Так, ванадий не влиял на процесс
азотфиксации.
•94
Некоторые работы показали антагонизм W и Мо. Наличие
первого конкретно подавляло функции Mo (Takahasi a. Nason,
1957). В опытах Ишваран и Роу (Iswaran a. Rao, 1960) наряду
с влиянием молибдена наблюдалось стимулирующее действие
и железа, кобальта, никеля. При совместном внесении Mo, Ni,
Со действие Мо ослабевало, что дало право авторам считать
Ni и Со антагонистами Мо в данных процессах.
Наряду с молиоденом значительную роль в азотфиксации
играет также железо. В одних случаях отмечено действие одного этого элемента, в других — стимуляцию им молибдена.
Некоторые авторы считают, что железо^ необходимо для нормального развития и фиксации азотобактера (Bassalik u. Neubauer, 1934), объясняя это действие его коллоидной струкхурой,
благоприятствующей поглощению азота из воздуха (Москеridge, 1917; Rippel, 1936; Steinberg, 1938).
Положительное влияние марганца на азотфиксацию отмечено многими исследователями (Olaru, 1920; Миротворский и
Григорян, 1945; Грибанов, 1954). По данным Грибанова, различные штаммы азотобактера по-разному реагировали на марганец, но наличие последнего непременно усиливало азотфиксацию на 32, 48, 56%.
Изучение действия бора шло почти во всех случаях наряду
с молибденом. Влияние этого микроэлемента изучалось в лабораторных опытах с чистыми культурами аэробных азотфиксаторов, а также в полевых условиях при внесении их под растение. Усиление азотфиксации азотобактером наблюдали многие
авторы (Greaves, 1933; Herzinger, 1940; Миротворский и Григорян, 1945; Jordan а. Anderson, 1950; Mulder, 1957а). Большую
стимуляцию данного процесса под влиянием бора получили
Геретсен и Хуп (Gerretsen a. Hoop, 1954). В почве на делянках
с бором азотфиксация увеличивалась в 10—15 раз сравнительно с контрольной делянкой. Об усилении развития азотобактера
и азотфиксации в почве ризосферы озимой пшеницы при применении суперфосфата совместно с бором и молибденом сообщает Савельева (1954). В других опытах бор, не влияя на развитие, резко стимулировал азотфиксацию азотобактера (Anderson et al., 1961). В то же время исследования Матуашвили (1947) не подтвердили благоприятного действия этого
элемента.
Много есть также литературных данных о действии микроэлементов на клубеньковые бактерии. Бортельсом впервые было
показано, что рост разных бобовых и связывание азота повышались от внесения молибдена и меньше — ванадия. Доказательством действия считалось высокое содержание Мо в клубеньках на корнях бобовых, обнаруженное многими авторами
(Ter Meulen, 1931; Jensen а. Betty, 1943; Jensen, 1946), что, по
их мнению, является подтверждением важной роли молибдена
•95
в азотфиксации. Как доказательства этого приводятся наблюдения о лучшем развитии клубеньков, увеличении содержания
азота в них и во всем растении (Образцова, 1937; Mulder, 1954,
1957; Неклюдов, 1959). То же подтверждено исследованиями
Федорова (1952). Автор считает, что роль молибдена в клубеньках аналогична таковой в клетках азотобактера. Особое мнение на этот счет высказывает Турчин (1.958, 1960, 1963), работавший с меченым азотом (N 15 ). Последний обнаружен в
клеточном соке клубенька. По мнению автора, фиксация азота
осуществляется не клубеньковыми бактериями, а тканями клубенька, то есть, по сути, тканями высшего растения. В этом
процессе участвуют как ткани растения, так и бактерии, связанные цепью переноса электронов. Роль же клубеньковых
бактерий заключается в индуцировании образования специфической клубеньковой ткани. Этот же автор также сообщил о
наличии фермента азотфиксации в неактивном состоянии в
тканях небобовых растений (1963).
Действие брра на клубеньковые бактерии в основном оценивалось по 'развитию клубеньков на корнях растений. Так»
Образцова (1937) отмечает в два раза большее образование
их на вике_при его внесении. О том же сообщает Калантырь
(1937) в отношении _CQHa наблюдавший не только увеличение
количества клубеньков, но и активности клубеньковых бактерий. Исаин (1958) сообщает о гистологических изменениях
клубеньков в среде без бора, об изменении соотношения углеводов в тканях и развитии бактерий за счет клеточного вещества клубеньков. Усиление азотфиксации и хороший рост бобовых при применении бора получил также Федоров (1952).
Действие бора, внесенного в почву, в условиях Англии отмечали Бренчли и Торнтон (Brenchley a. Thornton, 1925). Оно
проявлялось в усилении азотфиксации и накоплении азота в
почве под викой. В три раза увеличивалось количество азота
под клевером и люцерной при внесении бора в почву в вегетативных опытах Мульдерa (Mulder, 1948).
Одиночными работами представлены в литературе исследования о действии кобальта. Опытами Риче и др. (Richie et al.,
1960) установлена способность этого элемента резко усиливать
азотфиксацию клубеньковых бактерий сои.
Усиление азотфиксации Azotobacter
indicum под действием
цинка и меди наблюдал Бекинг (Becking, 1961).
Влияние молибдена сказывалось на азотфиксации и других
микроорганизмов. Способность связывать атмосферный азот у
Clostridium pasteurianum
и Clostridium butyricum усиливалась
в шесть и больше раз под воздействием молибдена (Jensen а.
Spenser, 1946, 1947). Как и азотобактер, различные штаммы
этих бактерий не одинаково реагировали на Мо и V. Действие
последнего было слабее. Другие металлы не дали эффекта.
•96
По данным Федорова (1952), тот же микроорганизм при добавлении малых концентраций фосфорномолибденовой кислоты
усиливал азотфиксацию на 163%, при добавлении 0,001% борной кислоты — на 139%. Благоприятное влияние железа на,
этот процесс у Clostridium pasteurianum
отметили Карнаган и
Кестл (Carnahan a. Castle, 1958). По сведениям других авторов, молибден и ванадий стимулировали азотфиксацию бактерий из рода Beijerincka (Becking, 1961) и нескольких штаммов
Achromobacter
sp. (Proctor et al., 1959). Молибден был необходим для азотфиксации Aerobacter aerogenes (Pengra a. Wilson,
1959) и Mycobacterium
flavum (Крылова, 1963, 1964). В наших
опытах (1958) 12 видов олигонитрофильных бактерий повышали азотфиксацию от внесенного М о " до 20 %.
Используя меченый азот (N 15 ), Грев и Вильсон (Grav а.
Wilson, 1962) изучали процесс азотфиксации Вас. poly ту ха и
других спорообразующих бактерий. Авторы убедились в том,
что без железа и молибдена в среде азотфиксация снижалась
до 50%. При выращивании же культур на аммонийных солях
действие молибдена не сказывалось^
Отмечено также действие микроэлементов на фиксацию азота сине-зелеными водорослями Anabaena и Nostoc (Bortels,
1940). Действие молибдена сказывалось значительно сильнее,
чем ванадия. По данным Истера (Eyster, 1952), на Nostoc также влиял бор в концентрации 0,1 мг/мл. Тага и Эльрефаль
(Taha a. Elrefal, 1962) сообщают, что для оптимальной фиксации азота этими водорослями необходим Мо и Со. Прибавка
фиксированного азота в этом случае была равна 51 и 58%.
, Все эти работы показывают стимулирующее действие определенных микроэлементов на биологическую фиксацию азота.
Механизм действия металла понятен из хода этого процесса.
Предложено несколько априорных схем фиксации азота с участием металлов. Авторы некоторых из них — Федоров (1949) и
Винфильд (Winfield, 1955). В схеме, предложенной Бахом
(Bach, 1957),указано место металла в реакции азотфиксации.
Обзор современных данных о возможных путях фиксации азота,
а также некоторый критический анализ этих схем подробно
представлены в работах Рубенчика (1960), Крыловой (1962).
Участие микроэлементов в азотфиксации заключается в том^
что металл, взаимодействуя с ферментом, обусловливающим"
этот процёсс, "влияет на физико-химическое состояние последнего, делая его более активным в восстановлении атмосферного
азота. Спорным является такой вопрос: по мнению Федорова и др., молибден, бор и другие стимулирующие вещества действуют на фермент, не являясь его составной частью.
Другие же исследователи считают, что молибден и железо входят непосредственно в состав фермента, обусловливающего
процесс фиксации. Действие его связывают с ферментом гид7—388
97
рогеназой, которая восстанавливает азот, адсорбированный
ферментом азотфиксации (Shug a. Wilson, 1954). Поводом к
таким представлениям послужило то, что гидрогеназа является
металлофлавопротеином с простетической группой, содержащей
Мо. Содержание Мо в гидрогеназе подтверждено рядом исследователей (Keeler, 1957; Bergel, Bray, 1958). Последние, обнаруживая молибден в определенной фракции белковых веществ
независимо от условий культивирования, полагают, что найденный элемент находится в молибдопротеине. Шаг и др. (Chug
et al-, 1954) получили очищенный препарат гидрогеназы из
разрушенных ультразвуком клеток клостридиума. Этот препарат восстанавливал свою активность только при добавление
молибдена и неорганического фосфата. Другие микроэлементы
не оказывали такого действия.
Однако против этого предположения говорит то, что при
получении бесклеточных препаратов из бактерий гидрогеназа
всегда находится в разных фракциях центрифугатов с активным началом азотфиксации; 1 последнее содержится в центрифугате, а гидрогеназа — в осадке. С другой стороны, некоторые
исследования говорят в пользу участия железа в азотфиксации.
Виртанен (Virtanen, 1954) пришел к выводу, что фермент, катализирующий этот процесс, содержит молибден и железо. ЭтО|
положение подтвердили также другие авторы (Esposito а. Wilson, 1956). Роль железа заключается в том, что оно входит в
активную группу нитрогеназы и хемосорбция N 2 происходит
на нем (Carnahan а. Castle, 1958).
На основании углубленных исследований Николас (Nicholas, 1958) также придает значение этим двум элементам. Его
наблюдения показали, что как железо, так и молибден тесно
связаны с белками и трудно удалимы диализом. Автор полагает, что существует два вида гидрогеназы: один — с включением железа, другой, более специфический,— с молибденом. С
этой точки зрения он допускает возможность взаимозависимости процессов азотфиксации с гидрогеназной активностью.
Таким образом, наряду с доказанным действием молибдена
не исключено также действие железа. В некоторых случаях
действие молибдена обусловлено наличием в среде железа. Несколько слабее влияние ванадия и вольфрама, которые только
частично могут заменить молибден. При совместном использовании молибдена с ванадием и вольфрамом первый может быть
конкурентно подавлен ими. Некоторые данные говорят о положительном действии на азотфиксацию марганца и бора.
Дозы молибдена, необходимые для роста микроорганизмов,
значительно меньше, чем для азотфиксации.
Отзывчивость различых микроорганизмов на микроэлементы при азотфиксации не одинакова. Это относится не только
•к видам, но и к штаммам бактерий.
•98
ЧАСТЬ
IV
ВЛИЯНИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ
НА ОБРАЗОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ
БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ
И ДРУГИХ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
ВИТАМИНЫ ГРУППЫ в
Исследования последних лет показали, что действие микроэлементов на живые организмы очень сходно с действием витаминов. Параллельно с утверждением о необходимости для ауксогетеротрофов (бактерий и грибов) витаминов,
влияющих на их обмен веществ, показана такая ж е необходимость и в определенных микроэлементах, участвующих в сходных реакциях клетки.
С усовершенствованием методик исследования и развития
знаний о витаминах и микроэлементах невольно поражает
сходство их функций в живой клетке. Большинство витаминов
участвует в системе ферментов как коферменты; то ж е можно
сказать и о микроэлементах, являющихся составной частью
ферментных систем или органических соединений, так или иначе участвующих в ферментативных процессах (Мо — в флавопротеинах, Ре — в цитохромах, Со — в В12 и др.).
Но наряду с этим имеется ряд данных, указывающих на
определенное влияние микроэлементов на синтез витаминов в
клетке, причем определенные металлы связывают с синтезом
определенных витаминов (2п — с В1 и рибофлавином, Со — с
В12). Много данных такого рода находим в отношении высших
растений, гораздо меньше имеется сведений о влиянии микро-1
элементов на образование витаминов у микроорганизмов.
Витамин В12 имеет в своем составе кобальт. Это обстоятельство может, как будто, определять действие последнего в
синтезе В12. Однако это не всегда так. В12 синтезируется мно-ч
гими бактериями и актиномицетами и необходим также д л я
многих других микроорганизмов — ауксогетеротрофов. Изучен
нию его свойств и получению уделяется много внимания в связи с важностью его функций в животном и растительном организмах. Образование данного витамина почвенными микроорганизмами (грибами, азотобактером, Вас. megaterium
и др.)!
7*
99
установлено многими исследованиями (Lochhead, 1952; Lochhead a. Burton, 1955; Красильников, 1958; Ушакова, 1958; Смалий, 1963), показавшими влияние среды и других экологических факторов на синтез этого витамина микроорганизмами.
Изучение влияния металлов в большинстве ограничивалось
кобальтом и в редких случаях другими элементами. Витамин
Bi2 получают обычно при культивировании актиномицетов, выращиваемых для получения антибиотиков. Параллельно с этим
велись исследования в отношении действия металла.
Мейтра и Рои (Maitra а. Roy, 1966) установили необходимость цинка и частично железа для биосинтеза В12 Streptomyces olivaceus, выращиваемого на синтетической среде, по возможности освобожденной от микроэлементов. Другие металлы
(Mo, Cr, Мп) усиливали рост актиномицета, но не образование
витамина. Отмечено также интересное действие бора, задерживающее рост, но не синтез В !2 . О такой же диспропорции
между выходом витамина и ростом клеток сообщают и другие
авторы (Kurz а. Nielsen, 1957).
Действие кобальта на синтез упомянутого витамина у различных микроорганизмов освещено в статье-обзоре Даркена
(Darken, 1953). Мы же остановимся только на некоторых работах, вышедших позже или не упомянутых в этом обзоре.
Хендлин и Рюгер (Hendlin a. Ruger, 1950) нашли, что
кобальт необходим для Streptomyces
griseus. Добавление его
в комплексную среду увеличивало образование В ] 2 в три раза.
То же было показано и для Streptomyces
olivaceus и других
актиномицетов (Hall et al., 1953). Определенное стимулирующее влияние СоС12 на биосинтез хлортетрациклина и витамина
В12 Actinomyces
aureofaciens показали Круссер с сотрудниками (1960).
Использование кобальта актиномицетами было подтверждено применением радиоактивного Со60, который вошел в молекулу образованного актиномицетом витамина В12 (Chariet et
al., 1950).
Интересно, что актиномицеты могут использовать не только
неорганические формы кобальта, но и кобальт, входящий в состав клеток других организмов. Так, показано, что источником
этого элемента в среде для Streptomyces
griseus при биосинтезе
Bi2 служили клетки дрожжей (Perlman a. O'Brien, 1954).
Интересны данные Миамото (1957), отметившего прямую
связь между синтезом В12 у Streptomyces
griseus и нуклеиновыми кислотами. При добавлении к питательной среде кобальта усиливается рост актиномицета, увеличивалось значительно
количество Р Н К и Д Н К , а также усилилось образование витамина Ві2 в 30 раз.
Выращивание прошюновокислых бактерий — продуцентов
витамина В12— на синтетической среде с некоторыми микроэле^
аоо
ментами показало различия в их действии на эти бактерии. Так,
марганец не влиял на рост бактерий, но уменьшал выход истинного витамина Bi 2 . Магний и железо усиливали образование
витамина на 40—60%. Особые результаты получены при внесении кобальта в дозе 0,25 мг на 100 мл— выход витамина усилился на 3200%. Цинк же, примененный по фону других микроэлементов, угнетал рост и продукцию витамина. Подщелачивание среды усиливало это действие, а добавление гипосульфита
снимало угнетение (Воробьева, 1961, 1962). В данных опытах
нам кажется чрезмерным усиление выхода витамина под влиянием кобальта, а также неправильным использование цинка в
относительно высоких дозах (10—60 мг/л).
Положительное влияние кобальта на образование витамина
В12 различными почвенными микроорганизмами наблюдала Jle j
тунова (1959, 1959а). Она изучала действие кобальта на различные экотипы бактерий, применив для этого концентрации
Со, приближающиеся к таковым в естественной среде обитания
изучаемых микроорганизмов. Оказалось, что
оптимальные
концентрации этого элемента для усиления синтеза В12 соответ-,
ствуют таковым в природных условиях. Штаммы, выделенные
из обогащенных кобальтом илов, требовали больших его концентраций по сравнению со штаммами, выделенными из обед-^
ненных илов. Добавление кобальта в среду для выращивания
Aspergillus
niger усилило образование витамина этим грибом
в 10 раз (Nicholas, 1952).
Изучение обмена кобальта у микроорганизмов с применением Со 60 помогло установить интересные данные-, относящиеся
к синтезу В12. Опыты с Aspergillus
oryzae и Вас. natto показали накопление Со 60 в максимальном количестве в начале логарифмической фазы роста, причем количество этого элемента в
клетках было пропорционально скорости их размножения и не
соответствовало синтезу В12. Авторы полагают, что действие Со
было направлено на усиление азотного обмена активированием
некоторых ферментов (полипептидаз, аргиназы и др.). TaKHivf
образом, действие кобальта на биосинтез В12 было косвенным
(Савада и др., 1955).
Интересно взаимодействие между В12 и медью. Наличие
0,001 % меди задерживало рост мутанта Bad. coli. Добавление
в среду В12 снимало это торможение полностью (Hine et al.j
1957). По-видимому, токсичность меди являлась результатом
ее определенных соединений в клетке, образование которых измерялось присоединением В12.
Такое ж е явление отметили другие исследователи, работавшие с 9 штаммами дрожжей Candida sp. (Басс-Шадхан и др.,
1962). Усиление синтеза витамина В12 при внесении кобальта
в среду наблюдалось только при оптимальном содержании в
ней азотных и питательных веществ.
•101
Р и б о ф л а в и н . Действие кобальта отмечено и в образовании другого витамина из группы В — рибофлавина. Так, Энари (Enari, 1955, .1958), изучая действие микроэлементов на образование упомянутого витамина у Candida Guilliermondii, установил стимуляцию этого процесса кобальтом, в меньшей мере—
цинком и угнетение — железом. Автор считает, что кобальт
задерживает поступление железа во внутреннюю область клетки, где локализуются процессы образования рибофлавина; он
также отмечает способность железа катализировать процесс,
разложения рибофлавина при помощи Н2О2, что не свойственно
кобальту. Возможно, что все указанное служит объяснением
положительного влияния кобальта. Однако малые дозы железа
не угнетали, а стимулировали образование витамина В2. Угнетающее действие относительно высоких доз железа известно из
других работ, авторы которых объясняют это явление задерживающим влиянием его на деятельность ферментов, участвующих в синтезе рибофлавина.
Несколько иной точки зрения придерживается Шавловский
(1959). Работая с комплексообразователями, связывающими
железо и другие металлы среды при выращивании Candida Guilliermondii,
автор наблюдал стимулирующее действие малых
доз кобальта и железа на синтез данного витамина. Он считает, что недостаточное содержание металла нарушает обмен
веществ клеток, в результате чего в среде накапливается рибофлавин. Действие стимулирующих веществ проявляется при
размножении клеток в условиях формирования новой протоплазмы.
Дальнейшее изучение действия железа на синтез рибофлавина (Шавловский, 1959) установило зависимость между этим
элементом и содержанием нуклеотидных форм витамина в
клетках дрожжей, а именно флавиномононуклеотидов (ФМН).
Это указывает также на увеличение роли флавиновых ферментов в дыхательных системах дрожжей при нарушении обмена
железом.
Углубленные исследования биосинтеза рибофлавина у Candida Guilliermondii
и близких к ним видов, а также действия
на этот процесс цинка и железа принадлежат Кнюзелю (Knusel, 1957). Упомянутые культуры синтезировали витамин Bi 2 ,
который выделялся в свободном виде в культуральную жидкость. Синтез его был стимулирован цинком. Железо не действовало на образование этого витамина, но, внесенное совместно
с цинком, усиливало рост клеток, использование глюкозы и
синтез витамина В12. Витамин, по мнению автора, был конечным продуктом в обмене веществ при участии цинка и выделялся как запасное вещество.
В исследованиях Басс-Шадхана (I960) с культурой Saccharomyces cerevisiae применение кобальта, меди и марганца вело
•102
к увеличению в их клетках рибофлавина на 46% и снижению
витамина Bi на 19%.
Взаимодействие данного витамина и бора наблюдалось на
культурах Lactobacillus
arabinosus и Lactobacillus
casei. Добавление борной кислоты в количестве 22 мг на 10 мл среды,
на которой выращивались эти бактерии, полностью подавляло
их рост. При дополнительном внесении рибофлавина в количестве 0,05—3 мг на 100 мл среды наблюдалось все усиливающееся развитие бактерий, достигавшее нормальной величины.
Другие витамины — тиамин, биотин, р-аминобензойная кислот а — не оказывали такого действия (Adrian, 1956). Недостаток
цинка в среде уменьшал образование витамина Вг и у плесневых грибов (Nicholas, 1952). В свою очередь отмечено, что
оранжево-желтые варианты гриба Ashbya gossypii
повышали
образование рибофлавина в среде с железом.
Другие
витамины
группы
В. Сведений относительно действия микроэлементов на другие витамины группы В очень мало. Некоторые данные относительно их влияния
на физиологические функции грибов и о действии на синтез
биотина Phycomyces blakesleeanus
находим в работах Шопфера (Schopfer, 1943). Продукция этого витамина увеличивалась
при добавлении смеси солей Си, Fe, Mn, Zn, Ga, Mo. В опытах
же Николаса (Nicholas, 1952) недостаток цинка уменьшал
образование биотина, никотиновой и пантотеновой кислот Ляpergillus niger.
Широкое изучение действия недостатка металла на различные ферменты привело к интересным выводам относительно их
функций в питании растительных организмов. Так, изучая влияние недостатка цинка в питании Neurospora
crassa, Незон
(Nason et al., 1951) приходит к выводу о схоЛности действия
этого элемента и биотина. Отсутствие как одного, так и другого вело к уменьшению роста гриба и к изменению процессов
его метаболизма. Исчезала активность некоторых ферментов,
таких, как алкогольдегидрогеназа, участвующих в образовании
триптофана, но усиливалась активность других ферментов, на-1
пример, усилилось в 10—20 раз действие Д Ф П нуклеотвдазы
(фермент, расщепляющий связи Д Ф Н и никотинамида рибози->
д а ) . С другой стороны, не функционировали фумараза, гексокиназа, альдолаза, трифосфат-дегидрогеназа и другие ферменты.
_ В сообщении Вулли (Woolley, 1941) говорится о положи- .
тельном действии марганца на культуру Lactobacillus
casei,
употребляемую для получение пантотеновой кислоты. Что же
касается тиамина, то образование его связывают с действием
цинка.
По данным опытов с Neurospora и высшими растениями (Nason, 1950; Nason et al., 1951), возможное действие цинка на
•103
синтез никотиновой кислоты объясняется тем, что она является дериватом триптофана. Синтез ж е последнего отсутствует
при дефиците цинка.
Рамакришнан (Ramakrishnan, 1956) сообщает о повышении
биосинтеза витамина С у гриба Aspergillus
tumarii К i f а от
внесения марганца и кобальта.
Из всех приведенных литературных данных можно отметить
положительное влияние микроэлементов (Zn, Fe, Мп, Mo, В, Со)
на биосинтез витаминов у различных микроорганизмов. Более
доказанным специфичным действием можно считать действие
цинка в образовании Bj и рибофлавина и кобальта в синтезе
Bi2- По-видимому, различные группы микроорганизмов в разной степени отзывчивы при образовании витаминов на действие
микроэлементов. Можно думать, что эти микроэлементы участвуют в сходных процессах обмена веществ клетки и прямо или
косвенно влияют на них. Большое значение в данных исследованиях имеют условия проведения опытов.
В последние годы рядом исследований установлено наличие
в почве различных витаминов и ауксинов. Продуцентами их
являются в основном почвенные микроорганизмы, а также высшие растения — их корневые выделения (Иерусалимский, 1949;
Смалий, 1962). Количество указанных биологически активных
веществ, главным образом витаминов группы В и гетероауксина, обычно соответствует численности микроорганизмов в почве. В ризосфере растений этих веществ обнаружено больше,
чем в почве без растений. Уже упомянутыми авторами и другими показано участие микрофлоры почвы в снабжении растений не только основными элементами питания, но и физиологически активными веществами типа ауксинов и витаминов. В
этом отношении деятельность микроорганизмов чрезвычайно
многообразна и в большей мере зависит от влияния внешних
факторов. Можно предположить, что в условиях почвы в ризосфере растений одним из таких факторов является применение
удобрений, в том числе и микроэлементов.
В наших исследованиях (Бершова, Козлова, 1961, 1962,
1962а, 19626; Бершова, 1963) изучалось действие микроэлементов на образование ризосферными микроорганизмами витаминов группы В и гетероауксина.
Образование витаминов группы В
почвенными микроорганизмами
Изучалось действие микроэлементов Мо, В, Мп,
Zn, Си, Со на витаминообразование у микроорганизмов, выделенных из ризосферы кукурузы и картофеля. Работали с 12
видами бактерий и актиномицетов.
Определения велись при помощи биологических методов со
•104
специфическими штаммами микроорганизмов, нуждающимися
в соответствующем витамине. Микроэлементы вносили в среды, на которых выращивали исследуемые организмы.
На рис. 1, 2, 3, 4 и 5 представлены количества витаминов,
образуемых отдельными видами некоторых бактерий и актиноК
///
100
80
BQ 60
ва:
а
S;
4-0
<3
S
з
48
61 5*
100 16 22 12
m
si иге
' V
I | Контроль
| Вариант cZn
ЁЦ Вариант сМо
[
-и — сВ
и
с Си
•сСо
•//—сМп
"/„^-Увеличение образования витаминов
Рис. 1. Влияние микроэлементов на образование
витамина Bi микроорганизмами (в мкг):
I — Mycobacterium
tumescens,
II —
Pseudomonas
radiobacter,
III —Bacillus
oligonitrophilus,
IV —
Actinomyces
griseus, V — Mycobacterium
mucosum,
VI — Bacterium agile, VII — Rhizobium
meliloti.
,•
мицетов, взятых нами из общего количества испытанных микроорганизмов. Количество найденных витаминов ( В ь Bi 2 , пантотеновой и никотиновой кислот) приведено в мкг на 1 г сухих
клеток бактерий, биотина — на 100 г. Величина столбиков на
рисунках указывает на количество образованного витамина и
•105
изменение этого количества под влиянием разных микроэлементов. Каждый столбик соответствует количеству витамина у
отдельных вариантов культуры, подвергшихся действию микроэлементов.
Витамин
Вь На рис. 1 показаны количества этого витамина. Взятые микроорганизмы образуют различные количе-
S L L E L ™
'/.4001 I
30 <t0 25
mumm
1001891Н2 т
106 105
НШИКА
100\ 1139
3*t 30
Рис. 2. Влияние микроэлементов на образование витамина В ] 2 (в мкг):
I — Mycobacterium
tumescens, II — Bacillus megaterium, III—Mycobacterium
mucosum, IV —
Bacterium
agile, V — Bacillus
oligonitrophilus,
VI — Pseudomonas
aurantiaca.
Условные обозначения те же, что на рис. 1.
ства витамина Bi—от 32 до 112 мкг на 1 г сухих клеток. Больше всего образовывали этот витамин азотобактер и клубенько-»
вые бактерии, меньше его было найдено в культурах актмномицетов. Из всех микроэлементов молибден, цинк и марганец
проявили большее действие, активируя образование витамина
Bi почти у всех взятых видов бактерий. Действие бора не всегда проявлялось. Так, азотобактер и Вас. megaterium не реагировали на добавление его к среде. Действие кобальта проявилось в четырех случаях, а меди — в трех и было незначительным.
Усиление образования витамина Bi под действием микроэлементов в большинстве случаев было очень заметным и доходи•106
ло до 60—70%. Актиномицеты также усиливали образование
витамина при внесении молибдена, марганца и цинка и отрицательно реагировали на добавление кобальта и меди.
Интересные данные получены при испытании Ps. aurantiaca.
Этот вид, свежевыделенный, образовывал Bi. После первых
же пересевов обнаружить у него Bi уже не удавалось даже
при применении микроэлементов.
Витамин
Bi2. Данные по витамину В12 приведены на,
рис. 2. Наиболее продуктивными в отношении синтеза витамина В12 оказались культуры Rhizobium meliloti, Ps.
aurantiaca,
Bad. agile, Вас.
oligonitrophilus.
Все эти микроорганизмы относятся к различным группам
бактерий, что не дает возможности сделать заключение о продуцировании В 12 преимущественно какой-либо одной группой.
Микроэлементы оказывали в той или иной степени влияние
почти на все взятые микроорганизмы. Усиление витаминообразования у некоторых бактерий доходило до 100%.
Под действием микроэлементов большая часть видов более
интенсивно образовывала В12: при применении цинка из 12
культур 9 усиливали синтез В12, в том числе азотобактер, клубеньковые и Вас. megaterium,
при применении молибдена — 7,
марганца — 8, бора — 5 культур. Медь у 5 видов, усилила и у
5 тормозила синтез В]2. В данном опыте был применен кобальт,
поскольку он входит в состав В12. Наличие его в среде увеличило образование В12 у всех 5 культур, где он. был применен.
Увеличение образования В12 при внесении кобальта доходило
до 1,5—2—3 раз для различных видов.
Взятые актиномицеты образовывали витамин В12 в гораздо
меньшем количестве, чем бактерии. В их контрольных вариантах он не был найден. Однако применение микроэлементов усилило образование В[2 и дало возможность обнаружить его у
всех трех видов. Так, у Actinomyces
griseus Bi 2 обнаружен в
вариантах с марганцем, цинком и медью, у Ad. globosus —
с марганцем, молибденом и бором. Таким образом, влияние
марганца сказалось на всех трех видах актиномицетов.
Никотиновая
кислота.
Данные об образовании
этого витамина приведены на рис. 3. Синтез никотиновой кислоты осуществляется микроорганизмами значительно интенсивнее, чем всех других испытанных витаминов. Взятые микроорганизмы образовывали это соединение в количестве от 86 до
432 мкг на 1 г сухих клеток. Наиболее активными в этом отношении оказались азотобактер, радиобактер, Mycobad.
mucosum
и Вас. megaterium.
Сравнительно большие,количества никотиновой кислоты, доходящие до 99—178 мкг, образовывали также
взятые актиномицеты.
Действие микроэлементов проявилось следующим образом:
внесение молибдена усиливало образование данного витамина
•107
у всех видов микроорганизмов и особенно у азотобактера, клубеньковых и Вас. megaterium. Марганец, цинк и бор действовав
ли также положительно на образование никотиновой кислоты
большинством взятых микроорганизмов. Однако это стимулирующее действие проявлялось по-разному, в различной степени
I
300
I
Рис. 3. Действие микроэлементов на образование никотиновой кислоты (в мкг):
1 — Actinomyces
globosus,
II — Rhizobium
meliloti,
III —
Actinomyces
griseus, IV — Actinomyces albus, V — Bacterium
agile, VI — Pseudomonas
aurantiaca,
VII — Bacillus
oligonitrophilus,
VIII_ — Azotobacter
chroococcum.
Условные обозначения те же, что на рис. 1.
усиливая витаминообразование. У одних микроорганизмов оно
было очень значительно, у других только немного превышало
контрольные цифры. Активно действовали молибден, цинк
и бор.
Б и о т и н. Данные опытов по определению биотина приведены на рис. 4. Взятые микроорганизмы образуют различные
количества биотина: от 26 до 93 мкг на 100 г сухих клеток испытуемых культур. Более активными продуцентами этого вита•108
мина из всех испытанных микроорганизмов являются Вас. oligotiitrophilus, Вас. megaterium, Az. chroococcum. У них найдено
78—93 мкг биотина. Значительно меньше витамина образуют
Bad. agile и Ps. radiobacter, в клетках которых его обнаружено
26—30 мкг.
Микроэлементы Мо, В, Mn, Zn, Си активировали образование биотина у большинства испытанных микроорганизмов. Это
ml 9> т
wo% 31 15 16
1007. 13 а в
Рис. 4. Действие микроэлементов на образование
биотина (в мкг):
/ — Bacterium
agile, II — Pseudomonas
radiobacter, III — Rhizobium
meliloti,
IV — Actinomyces
griseus, V — Mycobacterium
mucosum, VI — Mycobacterium
tumescens.
Услсвные обозначения те же, что на рис. 1.
усиление в отдельных случаях было очень значительным и доходило до 43-—59% прибавки количества биотина.
Отдельные микроэлементы по-разному действовали на микроорганизмы. Больше случаев положительного влияния наблюдалось при внесении цинка, марганца и бора. Микроэлементы
усиливали витаминообразование у 7—8 видов из 10, взятых
в опыт. Это усиление было порядка 18—59%.
На меньшее количество видов и менее эффективно действовал молибден, внесение которого усилило образование витамин
на только в пяти случаях, из которых только в двух увеличение
было значительным (32—43%).
Что касается меди, то ее положительное действие было от•109
мечено в двух случаях, когда последовало увеличение количества биотина на 32—38%.
Только одна культура — Rhizobium — усилила образование
биотина на 49% при действии кобальта, эта же культура реагировала и на цинк.
Отзывчивость отдельных видов микроорганизмов на внесение
микроэлементов весьма различна. Так, некоторые из них усиливали образование биотина при действии каждого из взятых мик->
роэлементов. Усиление достигало значительных размеров. Другие же реагировали только на один или два элемента. У некоторых усиление образования биотина достигало 50% и больше,
у других — только 6—15%.
Представляет интерес тот факт, что очень отзывчивые на
микроэлементы культуры относятся к организмам, меньше всего продуцирующим биотин. В противоположность этому на
группу бактерий, активно образующих этот витамин, микроэле-'
менты действовали слабее. Вас. oligonitrophilus
усилил образование витамина на 10—11% под действием марганца и цинка. Вас. megaterium реагировал только на марганец.
Особенно сильно влияли микроэлементы на культуру актиномицета. Под влиянием марганца количество биотина у него
увеличилось на 149%, цинка — на 138, бора — 95, молибдена —
на 13%,
Пантотеновая
к и с л о т а . На рис. 5 приведены изменения количеств образования пантотеновой кислоты. Найденные количества пантотеновой кислоты колебались у разных
видов от 36 до 150 мкг на 1 г сухих клеток. Все микроорганизмы разнились по способности образовывать этот витамин. Микобактерии и актиномицеты синтезировали пантотеновой кислоты мало. Большие количества витамина обнаружено у азотобактера, споровых и клубеньковых бактерий. Больше всего
пантотеновой кислоты было найдено у Rhizobium meliloti и Ps.
auratitiaca (до 150 мкг).
Влияние микроэлементов выразилось в усилении в той или
иной степени образования пантотеновой кислоты. Так, из 10
взятых микроорганизмов 7 видов повышали в значительной
мере синтез витамина при действии бора, марганца и меди.
То же наблюдалось у пяти видов при действии молибдена и
цинка. Меньше положительных случаев получено при внесении
кобальта. Повышение количества витамина было порядка 20—
80%. В большинстве остальных вариантов опыта также наблюдалось стимулирующее действие микроэлементов, выраженное
в увеличении количества витамина на 5—15%.
Таким образом, на образование пантотеновой кислоты боль, ше действовали марганец, бор, медь, затем молибден, цинк,
меньше — кобальт.
Интересно отметить в этих опытах стимулирующее действие
•110
меди, которое обычно в опытах с другими витаминами не наблюдалось. В этом опыте почти все взятые виды положительно
реагировали на большинство примененных микроэлементов.
Так, у Вас. теда1егшт образование пантотеновой кислоты от
применения молибдена усилилось на 35%, бора — на 20, марганца — на 35, цинка — на 25, меди — на 48, кобальта — на
I
Г
III
ио
i
I
10017?
3/6
100 31
25
52
31
100 70
25
81
100
30
25
25
42
I
I m
<§
WO
I.
uo
WO m&V
5?
'fO
Ю0„ 35.Л8
35
25
100
100 5or
21
25
Рис. 5. Действие микроэлементов на образование
пантотеновой кислоты:
/ — Mycobacterium
mucosum,
II — Pseuddmonas
radiobacter, III — Actinomyces
griseus, IV — Bacterium
agile,
V — Mycobacterium
tumescens,
VI — Bacillus
megaterium,
VII — Rhizobium meliloti, VIII — Pseudomonas
aurantiaca.
Условные обозначения те же, что на рис. 1.
11 % • Подобная картина наблюдалась и у большинства других
видов. Исключение составляли только азотобактер, клубеньковые и Вас. oligonitrophilus.
Весьма возможно, что такое сходное отношение данных культур к микроэлементам вытекает из
их общих физиологических особенностей фиксации свободного,
азота.
Что касается актиномицета, то этот микроорганизм в значительной степени усиливал образование данного витамина от
внесения микроэлементов. На нем больше всего сказалось действие марганца, давшее прибавку витамина на 81%, и бора —на 70%.
Представляло интерес сравнить действия микроэлементов
•111
на биосинтез разных витаминов в пределах одной культуры
микроорганизмов. Д л я этого были взяты случаи относительно
высокого действия микроэлементов, где их стимуляция выразилась в прибавке выхода витаминов больше чем на 20%.
При анализе данных оказалось, что влияние микроэлементов в сильной степени разнится в отношении образования различных витаминов. Их стимулирующее действие относилось в
большинстве случаев к синтезу никотиновой и пантотеновой
кислот. В опытах получено больше всего положительных данных, показывающих усиление образования этих двух витаминов. Особой разницы в действии отдельных микроэлементов
(кроме Си и Со) на синтез этих двух витаминов не наблюдалось. Чаще всего микроорганизмы реагировали на большинство
примененных микроэлементов. Такое явление свидетельствует о малой, специфичности отдельных микроэлементов в
данных реакциях образования пантотеновой и никотиновой
кислот.
Иначе обстояло дело с витамином В12. Почти во всех случаях при его образовании стимулирующее действие (кроме Со,
входящего в состав молекулы витамина) оказывал и цинк. Возможно, что цинк является специфическим элементом, участвующим, может быть, косвенно, в биосинтезе В12 у микроорганизмов. Многочисленны случаи положительного влияния микроэлементов на образование Вь
Из всех определяемых витаминов меньше случаев положительного действия было получено в отношении биотина. Образование этого витамина усиливалось главным образом под действием марганца и бора.
Таким образом, все микроорганизмы по их способности реа ;
гировать на микроэлементы можно разделить на три группы:
1) слабо реагирующие (меньшинство бактерий; примером
может быть азотобактер);
2) реагирующие в одной или двух реакциях образования витаминов на большинство микроэлементов (большинство бактерий) ;
3) реагирующие на большинство микроэлементов при образовании различных витаминов (исследованные микобактерии,
актиномицеты и некоторые бактерии).
В табл. 30 приведены данные о трех бактериях, представителях этих трех групп. Знаком ( + ) обозначено усиление образования указанных витаминов при действии определенных микроэлементов.
Трудно связать отзывчивость отдельных видов на микроэлементы с их генетическим положением, поскольку микроорганизмы, принадлежащие к близким филогенетическим группам
(Pseudomonas
и др.), по-разному реагировали на микроэлементы. Исключение представляют микобактерии и актиномице•112
Действие микроэлементов на образование витаминов
микроорганизмами
Микроорганизмы
в»
в,
Никотиновая
кислота
в12
:
Вас. oligonitrophillus
II группа
+
+
+
+
+
+
+
+
agile
III группа
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
'
+
+
+
++
+
+
Микоэлементы
Мо
в
Мп
Zn
Си
Со
Мо
в
Мп
Zn
Си
Со
+
+
'
Bact.
Биотин
+
+
+
Azotobacter
chrooсоссит
I группа
Пантотеновая
кислота
Т а б л и ц а 22
некоторыми
+
+
+
+ '
+
+
+
+
+
+
Мо
В
Мп
Zn
Си
Со
ты, в сильной степени активируемые при образовании витаминов.
Полученные данные свидетельствуют о влиянии микроэлементов на образование витаминов у почвенных бактерий и актиномицетов. Однако механизм участия микроэлементов в этих
реакциях остается неясным. Усиливая витаминообразование,
они, по-видимому, участвуют в тонких процессах обмена веществ клетки. Действие микроэлементов на биосинтез витаминов может не являться непосредственным. Так, есть указания
на их влияние на гидролиз фосфатов в реакциях с АТФ, а отсюда — и на дыхательный цикл и белковый обмен клетки, сказывающийся в образовании биологически активных веществ,
Известна тесная связь витаминов с ферментами, где они во
многих случаях выполняют коферментные функции.
Возможно, что такая взаимосвязь металла с витаминами
через ферментные системы осуществляется и в данном случае.
Не исключается также косвенное влияние микроэлементов, уси-»
ливающих некоторые обменные процессы клетки, предшествующие образованию витаминов.
8—388
113
ГЕТЕРОАУКСИН
Способность большинства микроорганизмов образовывать биологически активные вещества, в том числе гетероауксин, изучалась многими исследователями. Биосинтез
гетероауксина бактериями известен из работ Бойсен-Иенсена
(1938), Холодного (1939) и др. В работах последних лет при
обосновании действия бактериальных удобрений, а также при
изучении взаимоотношений между почвенными микроорганизмами и высшим растением этому свойству микроорганизмов
придается большое значение.
н
Однако не все микроорганизмы могут синтезировать это вещество. Роберте и др. (Roberts J. et al., 1939), Красильников
(1944, 1958), Смалий (1958), Бершова (1959) приходят к заключению, что только 40—60% из исследуемых микроорганизмов образовывают гетероауксин. Работы в этом направлении
велись главным образом в отношении азотобактера и клубеньковых бактерий (Thiman, 1936; Chen, 1938; Березова с сотр.
1938; Разницына, 1938; Kandier, 1951; Bukatsch u. Heitzer,
1952). Несмотря на большую литературу по этому вопросу,
есть еще мало данных о действии металлов на этот биосинтез.
Смалий и Бершова (1948, 1948а, 1957) показали положительное действие молибдена, бора и марганца на образование
гетероауксина у трех штаммов азотобактера. Больший эффект
наблюдался в молодых культурах, когда количество этого вещества увеличилось в 2—4 раза при действии бора и в 3—4 —
молибдена. В 5- и 10-суточных культурах это действие сглаживалось. Не все штаммы одинаково реагировали на микроэлементы. Положительное влияние молибдена и железа на ту же
бактерию отмечали Бергер и Букач (Burger u. Bukatsch, 1958).
Кроме азотобактера, ряд ризосферных споровых и бесспоровых
бактерий увеличивал количество гетероауксина при добавлении Mo, В, Mn, Zn (Бершова, 1959). Действие их было неодинаково и зависело как от микроэлемента, так и от вида бактерий.
Представляет также интерес зависимость биосинтеза гетероауксина от триптофана и действие на этот процесс микроэлементов. Положительное влияние триптофана на активность
образования гетероауксина у микроорганизмов уже доказана.
Известно, что триптофан и его производные (серин, антраниловая кислота) являются веществами, при ферментативном расщеплении которых образуется гетероауксин.
В свою очередь, на образование триптофана действуют некоторые микроэлементы. По данным Бертрана и Вольфа (Bertrand et Wolf, 1959, 1961), наличие в среде цинка (250 мкг)
резко увеличивает содержание этого вещества в белках мицелия Aspergillus niger. В этом случае цинк может быть заменен
•114
кадмием. Сведения о синтезе триптофана представлены в обзорной статье Доя (Doy, 1960).
На косвенное действие цинка в образовании триптофана
указывал Незон (Nason, 1950), который нашел, что нехватка
цинка у Neurospora задерживала превращение серина и индола
в триптофан, что может вести, в свою очередь, к задержке образования гетероауксина.
В наших работах (Бершова, 1959) представлены данные,
свидетельствующие о большом влиянии микроэлементов на образование гетероауксина у микроорганизмов при наличии триптофана. В данном случае металлы могут усиливать синтез триптофана и гетероауксина. Нашей задачей было выяснить способность
микроорганизмов,
широко
распространенных
в
ризосфере растений, образовывать гетероауксин, и действие
микроэлементов на этот процесс. Д л я определения ростовой
реакции была использована методика Холодного (1939) с изолированными колеоптилями овса.
Представляло также интерес изучить влияние микроэлементов на культуры в случае наличия в среде триптофана. Положительное влияние триптофана на активность образования гетероауксина у микроорганизмов отмечено в работах Тимана
(Thimann, 1936), Стове (Stove, 1955), Смалия (1958) и др. Эти
авторы указывают на то, что триптофан и его производные являются веществами, при ферментативном расщеплении которых образуется гетероауксин. В наших опытах триптофан применяли в дозе 0,005%.
В опытах испытывали 98 штаммов, относящихся к 83 видам
ризосферных бактерий, и их способность образовывать гетероауксин. Д л я дальнейшей работы из них отбирали виды, обладающие этой способностью и хорошо растущие на синтетической среде, так как все культуры в дальнейших опытах (кроме
Rhizobium)
выращивали на упомянутой агариэованной среде.
Таблица
31
Образование гетероауксина различными группами
ризосферных бактерий (в %)
Количество штаммов
Группы
Споровые
Неспоровые
Олигонитро• филы
8*
всего
28
45
25
образовавших гетероауксин
10
18
11
35
40
44
образовавших гетероауксин в относительно
больших количествах
4
9
5
15
20
20
115
Результаты испытаний приведены в табл. 31, из данных которой видно, что 35—44% всех штаммов образуют гетероауксин.
Можно отметить некоторую тенденцию к большему синтезу этого вещества у неспоровых бактерий и олигонитрофилов.
В табл. 32 представлены данные образования гетероауксина
в культурах ЯЫгоЬшт под влиянием микроэлементов. Из семи
предварительно испытанных видов только три образовывали
гетероауксин. При добавлении в среду триптофана все семь видов проявили способность образовывать это соединение.
Таблица
32
Образование гетероауксина культурами клубеньковых бактерий
Rh.
Микроэлементы
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
trifolii
Rh. phaseoli
Rh.
meliloti
Без триптофана
С триптофаном
Без триптофана
С триптофаном
Без триптофана
С триптофаном
42
140
70
56
42
58
85
151
146
138
96
82
22
45
60
69
39
45
70
195
180
86
96
120
50
82
66
63
54
42
126
248
192
176
175
96
Во всех последующих таблицах количество гетероауксина
выражено суммарно (в слизи и агаре) в мкг на 25 мл среды.
Все пять внесенных микроэлементов положительно влияют на
синтез гетероауксина взятыми бактериями. В опытах без триптофана выделяется действие молибдена, увеличившее количество гетероауксина культуры Як. М$рШ почти в четыре, Як.
ркаэеоИ — в два раза и Як. теШоЫ — больше, чем все остальные микроэлементы. Вторым микроэлементом по эффективности действия является бор, особенно для культур Як. ркаэеоИ.
Внесение в среду триптофана значительно усилило образование гетероауксина у всех трех видов ЯЫгоЫит. По фону
триптофана увеличивается относительное влияние микроэлементов. Это относится к молибдену, бору, марганцу и в некоторых случаях — к цинку. Под влиянием меди наблюдалось увеличение количества гетероауксина только в культуре Як. ркавеоИ. Действие микроэлементов различно для всех 'трех видов.
Все же можно отметить наиболее сильное их влияние на культуру Як. теШоИ, которая выделяется перед остальными по
•способности образовывать гетероауксин. На рис. 6 видны особенности действия каждого микроэлемента на колеоптили.
Образование этого соединения и влияние на этот процесс
микроэлементов в значительной мере зависит от применяемой
среды. Як. рказеоН выращивали параллельно 'на двух средах—
•116
Мазе и Эшби с триптофаном. Количество обнаруженного гетероауксина резко увеличивается на среде Эшби, хотя культура
и росла хуже на этой среде (табл. 33).
Как видно из табл. 33, на среде Эшби гетероауксина образовалось почти в четыре раза больше, чем на среде Мазе. ПерТаблица
33
Образование гетероауксина
Рк.
ркаэеоН
на двух разных средах
с триптофаном
Микроэлементы
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
Среда
Мазе
Среда
Эшби
70
195
180
86
96
120
261
567
420
278
336
303
Рис. 6. Изгибы колеоптилей (сверху
вниз) при нанесении бактериальных
культур:
первый ряд — контроль (без триптофана), второй ряд — контроль+триптофан, третий ряд — действие бора с
триптофаном, четвертый ряд — действие молибдена с триптофаном, пятый іряд — действие цинка с триптофаном.
вое место по положительному влиянию в этих опытах, как и в
предыдущих, занимает молибден, затем — бор. Повысилась чувствительность культуры к цинку. Можно отметить большее количество образуемого гетероауксина на среде Эшби, в контроле
превышающее количество этого вещества в вариантах с молибденом на среде Мазе. Можно предположить, что образование
гетероауксина в данном случае увеличивается как результат
неблагоприятных условий роста испытанной- культуры, так как
среда Эшби значительно уступает по пригодности культивирования ЦЫгоЫит среде Мазе.
В опытах с азотобактером были взяты три его штамма — К,
Бг, 53. Результаты опытов приведены в табл. 34
Примененные микроэлементы различно действуют на интенсивность об1
Опыты с азотобактером проводились совместно с В. Т. Смалием.
•117
Т а б л и ц а
Образование гетероауксина
Штамм К
Штамм Бг
Возраст
культуры
(в сутках)
Контроль
В
Мо
Мп
Контроль
2
5
10
5
150
173
22
171
209
17
250
165
6
160
158
5
142
168
34
азотобактером
Штамм 53
Mo
Мп
Контроль
в
Мо
Мп
12
26
185 2 3 3
178 231
28
161
140
4
129
155
3
139
127
6
140
176
2
100
125
в
,разования гетероауксина азотобактером. Наиболее выразительные данные получены при применении молибдена. Под его
влиянием штаммы К и Бг увеличивали количество образованiного гетероауксина почти вдвое. Кроме того, у этих штаммов
молибден как бы ускорял образование гетероауксина, накопление которого в максимальном количестве наблюдалось на пятые
сутки, в то время как в других вариантах опыта максимальное
количество этого вещества было обнаружено на десятые сутки.
Влияние молибдена на штамм 53 сказалось в меньшей ме' ре, чем на двух других; отличался этот штамм и тем, что большее количество гетероауксина у него обнаружено в 10-суточной культуре. Бор дал значительное усиление образования гетероауксина у штамма К, меньшее — у штамма Бг и незначительное— у штамма 53. Марганец действовал гораздо слабее.
Его положительное влияние сказалось только на одном штамме
Бг в 5-суточном возрасте.
Таким образом, не все штаммы азотобактера в одинаковой
^степени реагируют на действие микроэлементов. Штаммовые
'[различия сказываются и в отношении времени максимального
накопления гетероауксина. Из взятых микроэлементов наиболее эффективно действовал молибден.
Примером особого действия микроэлементов могут служить
опыты с культурами Pseudomonas
rosea и Bact. rugosum, результаты которых приведены в табл. 35. Обе эти культуры продуцируют гетероауксин примерно в равных количествах — 48—
64 мкг и мало нуждаются в триптофане для его образования.
Однако «а культуру Bact. rugosum без триптофана микроэлементы не действуют (кроме повышения количества гетероауксина при внесении меди). При совместном действии с триптофаном все взятые микроэлементы в значительной степени
увеличивают выход гетероауксина. Наибольшее влияние в этом
случае оказывали цинк и бор, которые обычно действуют слабо. Что же касается культуры Pseudomonas rosea, то все микроэлементы, кроме меди, без триптофана увеличивали образование гетероауксина в 2—4 раза. Внесение в среду триптофана
•118
д
Т а б л и ц а 35
Образование гетероауксина культурами
Bact. rugosum и Pseudomonas
rosea
Bad.
Микроэлементы
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
rugosum
Pseudomonas
rosea
Без триптофана
С триптофаном
Без триптофана
С триптофаном
48
52
45
46
24
96
51
84
138
106
260
86
64
203
309
217
145
60
68
237
142
156
305
171
сказалось только на влиянии цинка и меди, которые увеличили
образование гетероауксина в 2—3 раза. В вариантах с бором
и марганцем наблюдалось некоторое уменьшение количества
этого соединения.
Несколько иное влияние микроэлементов наблюдалось в
спорообразующих культурах Вас. granulatus,
Вас. virgatus и
Вас. megaterium
(табл. 36). Без триптофана микроэлементы не
оказывают на них заметного влияния. Первые две культуры образуют гетероауксин в почти одинаковом количестве —
41—48 мкг. Можно отметить токсическое действие меди на первую культуру, не давшую роста при внесении меди. Внесение
в среду триптофана резко изменило картину: культуры начали
продуцировать 125—139 мкг Гетероауксина. На образование
последнего в этом случае большое влияние оказывают микроэлементы и в первую очередь молибден. При внесении последнего количество гетероауксина повысилось до 190—316 мкг.
Следующими по силе действия были бор, цинк и марганец. В
первой культуре внесение триптофана снимало токсическое
действие меди, культура росла и образовывала гетероауксин,
правда, в значительно меньшем количестве, чем в контроле.
Таблица
36
Образование гетероауксина культурами споровых бактерий
Вас.
Микроэлементы *
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
granuiatus
Вас. megater um
Вас.
Без триптофана
С триптофаном
Без триптофана
С триптофаном
Без триптофана
С триптофаном
43
42
58
52
48
125
316
156
161
142
70
48
46
25
49
41
37
139
190
187
144
168
155
41
60
49
55
42
33
60
79
68
63
80
58
—
г
•119
Сравнительно мало гетероауксина образует Вас.
megateriит — 41 мкг. Добавление триптофана увеличивает это количество до 60 мкг. На эту культуру влияли только молибден, цинк и
марганец, но в меньшей степени, чем на другие микроорганизмы.
В число испытанных культур были включены две, обладающие резко выраженными свойствами олигонитрофилов: обе хорошо росли на среде Эшби. Данные по образованию гетероауксина этими бактериями (Pseudomonas caudatus,
Pseudomonas
radiobacter)
приведены в табл. 37. В среде роста и в слизи
первой культуры гетероауксин не был обнаружен, вторая образовывала его в малых количествах. На первую культуру
микроэлементы не оказывали влияния, на вторую влияли в
сравнительно малой степени. Только молибден и цинк удвоили
количество гетероауксина. При внесении триптофана в первой
культуре найдено 44 мкг, во второй—105 мкг гетероауксина. По
фону триптофана образование гетероауксина первой культурой
увеличилось почти в три раза от внесения молибдена и бора и
несколько меньше — от марганца и цинка. Д а ж е медь действовала в этом случае. На вторую культуру микроэлементы влияли относительно слабее, однако абсолютные цифры количества
гетероауксина в вариантах опыта с молибденом, бором и цинком больше, чем в первой культуре. В этом случае не оказывали влияния марганец и медь.
Таблица
Образование гетероауксина культурами Pseudomonas
caudatus,
Pseudomonas radiobacter, Pseudobacterium
subluteum
Ps.
Микроэлементы
Контроль
Молибден
Бор
Марганец
Цинк
Медь
caudatus
Ps.
radiobacter
Pseudobacterium
37
subluteum
Без триптофана
С триптофаном
Без триптофана
С триптофаном
Без триптофана
С триптофаном
0
0
0
0
0
0
44
147
130
111
107
59
35
85
39
58
63
24
105
180
133
71
145
77
40
64
98
63
86
62
58
105
122
76
94
61
Испытание культуры Pseudobacterium зиЫШеит дало следующие результаты. Культура образовывала гетероауксин в
количестве 40 мкг. Добавление одних микроэлементов увеличило это количество в 1,5—2 раза, причем все микроэлементы
действовали положительно. Выделялось действие бора и цинка.
Триптофан увеличил образование гетероауксина до 58 мкг. По
его фону также отмечено положительное действие всех микроэлементов, особенно бора. Цинк же уступал место молибдену.
Влияние микроэлементов на эту культуру было сильнее без
•120
триптофана. На культуру Вас. tenuissimus
влияние микроэлементов было незначительным.
Было также испытано 12 резко разнящихся видов актиномицетов. Однако заметных количеств гетероауксина у большинства из них не было получено, несмотря на то, что применялось
выращивание культур на жидких и агаризованных средах, испытывались как растертый мицелий, так и фильтраты культуральной жидкости разного возраста. Поддающиеся учету количества гетероауксина образовывали только четыре вида в
старых культурах (табл. 38). Несколько иные результаты по-,
лучены при добавлении триптофана. Так, Actinomyces
griseus
начал образовывать на синтетической среде № 1 гетероауксин
в количестве 85 мкг. Действие микроэлементов на данную культуру было значительным. Так, молибден, бор и цинк способствовали образованию гетероауксина в три и больше раза, чем
в контроле. Заметное увеличение наблюдалось и в случае вне-сения меди. Таким образом, можно отметить усиление в образовании гетероауксина Act. griseus при внесении в среду триптофана и микроэлементов.
Таблица
Образование гетероауксина
38
актиномицетами
С триптофаном
Актиномицеты
Act.
Act.
Act.
Act.
griseus
coeticolor
chromogenes
viotaceus
Без триптофана
40
39
41
24
Контроль
Mo
В
Мп
Zn
Си
85
187
157
95
208
113
—
Было обращено внимание на необычные изгибы колеоптилей, наблюдавшиеся в некоторых культурах (Рзеис1оЬас1. зиЬ1Меит), а также при внесении цинка в среду роста Я.ЫгоЫит.
Колеоптили имели двойной изгиб (рис. 7), что указывало на
возможность действия двух факторов. Трудно сказать, было
ли это действие какого-либо иного вещества, кроме гетероауксина, или образование добавочных точек роста с другой стороны колеоптиля происходило благодаря особой диффузии гетероауксина в тканях растения.
В результате проведенных опытов можно сказать, что влияние микроэлементов на образование микроорганизмами гетероауксина неоднородно и варьирует в зависимости от вида бактерий и актиномицетов, а также от взятых микроэлементов. Из
12 видов бактерий положительно реагировали на внесение микроэлементов 10, увеличивая в большей или меньшей степени
•121
выход гетероауксина. При добавлении к среде триптофана положительно реагировали все микроорганизмы. Прибавки количества гетероауксина колебались в зависимости от вида микроэлемента в большинстве случаев от 100 до 200%.
Положительное влияние триптофана на образование гетероауксина объясняется его химической близостью к последнему, благодаря чему он в
процессе
метаболизма
клетки
является непосредственным предшественником гетероауксина.
Возникает вопрос, почему действие микроэлементов выражено в больРис. 7. Двойные изгибы колеоптилей.
шей степени при наличии
триптофана.
Известно,
что микроэлементы, образуя металлопротеиновые комплексы,
входят в ферментативные системы клетки. Образование гетероауксина связано с ферментативным расщеплением аминокислот,
в частности триптофана и его производных. Микроэлементы, усиливая превращение этой аминокислоты, усиливают образование
гетероауксина. Отсюда вытекает непосредственное влияние
микроэлементов на активность данных реакций. То, что процесс
образования гетероауксина является, по-видимому, общим для
многих микроорганизмов, говорит о его значении в их обмене
веществ.
Из всех взятых микроэлементов более активными оказались
молибден, бор и цинк, но действие их своеобразно: на некоторые виды бактерий они влияли почти одинаково, на другие—
по-разному. Марганец действовал слабее. Медь в редких случаях оказывала слабо положительное, и в большинстве — отрицательное влияние. Разное влияние отдельных микроэлементов
зависит, по-видимому, от характера их связи с ферментами
клетки.
Рассматривая полученные данные в связи с физиологическими отличиями различных групп микроорганизмов, можно
отметить, что интенсивность образования гетероауксина мало
отличалась у всех использованных групп. Без триптофана актиномицеты образуют гетероауксин в меньших количествах, чем
бактерии. Так же ц^-ало отличались различные группы микроорганизмов степенью использования внесенного триптофана.
Возможно, что испытание всех 98 штаммов бактерий и актиномицетов, в том числе и не образующих этого ростового вещества, на среде с триптофаном выявило бы у всех способность
образовывать гетероауксин.
Образование гетероауксина почвенной микрофлорой играет
важную роль в ее взаимоотношениях с высшими растениями,
•122
являясь одним из факторов, влияющих на их рост. Усиление
образования гетероауксина под влиянием триптофана дает
право предположить, что подобного рода явление может происходить в относительно заметных размерах при внесении в
почву органических удобрений (навоза, компостов, зеленых
удобрений и др.), в результате разложения которых образуются различные аминокислоты, в том числе и триптофан.
Значение микроэлементов в образовании ауксинов высшими
растениями отмечено многими авторами. Особая роль в этих
работах отводилась цинку. Растения, выращенные в условиях
цинковой недостаточности, не образовывали ауксинов. Показана также прямая связь наличия этого элемента и биосинтеза
ауксинов. Выдвинутое положение впоследствии было подтверждено исследованиями, объясняющими это действием цинка на
синтез триптофана. Последний является предшественником в
образовании гетероауксина. Имеются указания, что такое действие цинка связано с уменьшением триптофансинтетазы — фермента, необходимого для синтеза этой аминокислоты.
Определенную роль бора в синтезе ауксинов и ауксиноксидазы у растений отмечает Школьник с сотрудниками (1963).
Органические соединения бора — арилборные кислоты, имеющие структуру, сходную со структурами бензойных кислот, оказывают подобное ауксинам влияние на рост клеток растений.
Возможно, что такого рода влияние наблюдалось в опытах с
этим элементом.
Интересна возможная взаимосвязь с действием микроэлементов и витаминов. Витамины В1 и Вб участвуют в синтезе и
превращениях триптофана и других аминокислот. Недостаток
цинка отражается на их содержании. Этот недостаток можно
восполнить, внося в среду витамины В1 и В6 при выращивании
высших растений (Школьник, Давыдова, 1962). С другой стороны, недостаток цинка в среде приводит к значительному
уменьшению указанных витаминов в тканях растений.
Таким образом, определенное значение микроэлементов в
синтезе витаминов и гетероауксина микроорганизмами не подлежит сомнению.
Стимулирующее влияние микроудобрений на образование
биологически активных веществ (витаминов и гетероауксина).
у почвенных микроорганизмов, возможно, является одним из
факторов их действия на сельскохозяйственные растения. Кроме того, применение в сельском хозяйстве совместно с микроэлементами бактериальных препаратов (азотобактерин, нитрагин, фосфоробактерин), действие которых связывают с образованием микроорганизмами биотических веществ, может быть
более эффективным благодаря отмеченной их стимулирующей
способности.
•123
АНТИБИОТИКИ
Участие микроэлементов в разнообразных реакциях клетки микроорганизмов отразилось и на образовании ими
антибиотических веществ. Вполне понятно большое число исследований, посвященных пенициллам как продуцентам пенициллина. Изучение образования этого антибиотика включало
также и изучение роли металлоионов при биосинтезе. (Данные,
относящиеся к Pénicillium notatum, можно отнести также и к
Pénicillium
chrysogenum).
В своих ранних работах еще оксфордская группа ученых
заметила действие некоторых микроэлементов на эти грибы.
Изучение их поверхностных культур показало увеличение образования антибиотика под влиянием меди (Clayton et al.,
1944). Положительное действие цинка, стимулирующее выход
продукции, не зависело от наличия в среде других микроэлементов (Foster et al., 1943; Моуег a. Coghill, 1946). Авторы,
объясняют это действие способностью цинка задерживать образование глюконовой кислоты в фазе образования пенициллина.
При глубинном культивировании гриба обнаружились различия в отзывчивости его различных штаммов к микроэлементам в зависимости от состава сред. Опыты Фостера и др. (Foster et al., 1946) с большим количеством металлов также показали значительное увеличение выхода антибиотика под действием цинка. Однако это наблюдалось только на синтетических
средах.
Необходимость микроэлементов при культивировании Pénicillium chrisogenum подтвердили Жервис и Джонсон (Jarvis а.
Jonsôn, 1946, 1947). Но при работе с неочищенными солями
добавление их было необязательным.
В исследованиях Пратта и др. (Pratt a. Dufrenoy, 1947)
стимулятором образования пенициллина являлся хром; попытка
заменить его кобальтом или молибденом не увенчалась успехом. Найт, Коффлер и др. (Knight, 1946; Koffler et al., 1947)
пришли к заключению, что действующим началом стимулирующего влияния различных органических веществ и золы являются микроэлементы, содержащиеся в них (Со, Си, Fe, Мп,
Zn, W и др.).
В опытах Наместниковой (1960) при усовершенствовании
технологии получения антибиотиков выход пенициллина значительно повышался под влиянием M n S 0 4 , внесенного в среду в
дозе 0,004%.
Особого внимания заслуживают данные в отношении усиления образования антибиотических веществ актиномицетами под
влиянием микроэлементов.
По наблюдениям Аинсворса (Ainsworth, 1947), при поверх•124
ностном культивировании Streptomyces
griseus необходим марганец, который может быть заменен железом без нарушения
синтеза стрептомицина. Максимальная продукция этого антибиотика данным актиномицетом была получена при применении некоторых солей металлов. Торнберри и Андерсон (Thornberry a. Andersen, 1948) пришли к заключению о необходимости
К, Zn и Fe для оптимальной продукции стрептомицина. Стимуляция выхода последнего наблюдалась также и при внесении марганца. То же нашли Саундерс и Сильвестер (Saunders
a. Sylvester, 1947) относительно погруженных культур. Эти же
данные были подтверждены другими авторами, упоминающими кроме названных металлов еще и кобальт (Woodruff, 1947;
Tempi, 1948; Principe a. Thornberry, 1952). Однако при внесении кобальта большое значение имело определение оптимальных дозировок последнего.
Положительное действие металлов наблюдалось не только
в минеральных, но и в комплексных средах. Усиление выхода
стрептомицина получено при добавлении сернокислого цинка
к мясопептонной среде с глюкозой (Johnston a. Waksman, 1948).
Во всех положительных опытах играли роль концентрации взятых металлов.
Кроме стрептомицина, Лри наличии металлоионов отмечено
также увеличение продукции других антибиотиков.
Добавление цинка в очень малых концентрациях усиливало
выход неомицина у Streptomyces
fradiae (Lechevalier, 1951).
Образование этого же антибиотика усиливалось в синтетической среде под влиянием Zn, К, Mg, Fe (Dulmage, 1953).
На усиление продукции кандииина у Streptomyces
griseus
при добавлении к синтетической среде К, Mg, Fe и Zn указывает Акер и Лешевалье (Acker a. Lechevalier, 1954). Наряду с
этим ими не отмечено действие марганца.
Рейнольд и Ваксман (Reynolds a. Waksman, 1948) сообщают об усилении синтеза этим актиномицетом гризеина при добавлении железа. Увеличение доз элемента усиливало образование антибиотика в логарифмической пропорции. Это привело к уверенности, что железо входит в состав молекулы этого
антибиотика. В данном случае цинк не имел успеха.
О таком же усилении выхода актинорубина под влиянием
железа сообщают Кельнер и Мортон (Kelner a. Morton, 1947).
Однако излишек этого элемента вредно отражался на образовании антибиотика.
При изучении влияния ряда различных микроэлементов на
образование антибиотика Streptomyces
venezuelae
(Gallicchio
a. Gottlieb, 1958) изъятие цинка и железа из среды подавляло
его продукцию, а добавление действовало благоприятно. Марганец был полезен для продукции антибиотика, но не для роста
актиномицета.
•125
Приведенные данные говорят в пользу специфичности действия цинка и железа при синтезе антибиотиков. Кроме необходимых микроэлементов, для большинства, если не для всех
фаз метаболизма грибов и актиномицетов, требуются еще цинк
и железо. Усиление образования некоторых антибиотиков отмечалось при воздействии марганца. Однако металлы полезны
в определенных дозах; повышение содержания последних может
задерживать рост и синтез антибиотиков. Это особенно относится к кобальту и цинку.
Металлы могут играть роль как структурные элементы (например, железо в молекуле гризеина). С другой стороны, действие железа, молибдена и меди связывают с системой переноса электронов в молекулах. Эти металлы функционируют в
электронных связях от протеинных к другим системам клетки.
Функции марганца относятся к групповым реакциям, включающим фосфаты. Цинк и магний, а также марганец участвуют преимущественно в общем ферментативном декарбоксилировании и реакциях гидролиза.
ОБРАЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ МЕТАЛЛОВ
И АНТИБИОТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
Металлы способны вступать путем хелатных
связей в соединения со сложными органическими веществами,
меняя их структуру в сторону усложнения или упрощения. В
результате ' изменяются функциональные особенности этих соединений. Такие соединения могут возникать между металлами и антибиотиками, усиливая или ослабляя действие
последних.
В изучении данного вопроса определенных успехов добился
Вайнберг (Weinberg, 1955, 1959, 1960), установивший ряд интересных явлений при взаимодействии металлов и антибиотических веществ. Он испытывал влияние 21 микроэлемента на
действие бацитрацина на различные бактерии кишечной группы, споровые и другие. Цинк и кобальт усиливали действие
антибиотика. На действие кобальта указывает также Юнг
(Young, 1956). В его обзорной статье наряду со сведениями о
содержании кобальта в почвах разных стран, растениях и влиянии его на рост различных микроорганизмов приведены интересные данные о действии этого элемента на повышение антибактериальной активности некоторых антибиотиков.
Об усилении бактерицидное™ бацитрацина марганцем, кадмием и цинком сообщают Адлер и Сноке (Adler a. Snoke, 1962).
В данных опытах обнаружено действие иных элементов, чем в
опытах Вайберга, что говорит об иных условиях проведения
опытов или отличающихся свойствах антибиотика.
По данным Виндера (Winder, 1962), кобальт и железо уси•126
ливали бактериостатическое действие изониазида на Mycobacterium tuberculesis, или БЦЖ- Совместное же применение других металлов (Си, Mn, Сг) снимало это действие.
Кобальт в различных сочетаниях усиливал действие пенициллина против чувствительных и устойчивых к нему стрептококков (Naranjo, Munoz, 1957).
Однако образование внутрикомплексных связей между металлом и антибиотиком не всегда ведет к усилению действия
последнего. В работах того же Вайнберга с разными типами
антибиотиков установлено, что окси-, хлор- и тетрациклин задерживают споруляцию Вас. subtilis.
Применение марганца
снимало действие этих антибиотиков. В другом случае марганец
снимал торможение определенной группы ферментов, производимое ауреомицином (Saz a. Slie, 1954). Это, по-вцдимому,
обусловливалось образованием хелатных структур антибиотика
и марганца.
Того же порядка данные о действии микроэлемента на активность противотуберкулезных средств. Исследовалось образование комплексов металлов с^ПАСК, стрептомицином, ТВ-1
и другими антитуберкулезными веществами. Установлено, что
действие металлов зависит от образования комплексов с этими
веществами. При этом сила их влияния зависит от сродства
металла с этим веществом. Если сродство металла больше с
ферментом клетки бактерии, чем с антитуберкулезным веществом, образуется комплекс металл—фермент, в результате чего
наблюдается синергизм действия металла и этого вещества,
Если же металл, соединяясь с противотуберкулезным веществом, образует комплекс металл—антитуберкулезный агент, то
наблюдается антагонизм, то' есть задерживающее действие соединения на туберкулезную палочку (Уено, 1956).
Применение металлсвязывающих веществ, таких, как ЕДА и
другие (этилендиаминтетраацетат, циклогександиаминтетраацетат), до некоторой степени расшифровывает действие металлов в вышеприведенных случаях. ЕДА ингибировал действие
бацитрацина в опытах Вайнберга. Это ингибирование снималось
применением цинка.
Аналогичные данные получены в исследованиях Адлера и
Сноке (Adler a. Snoke, 1962). Цинк, кадмий и марганец снимали ингибирующее влияние хелат в отношении бацитрацина
и его действия на стафилококк. При этом последние два металла усиливали бактерицидность. По-видимому, для активности данного и некоторых других антибиотиков требуется металл, входящий в их соединение. Поэтому добавление металла
усиливает их активность. Применение металлсвязывающих веществ, отнимающих металл от антибиотика, ингибирует его действие, которое снимается при внесении добавочного металла.
Последний входит непосредственно в соединение антибиотика.
•127
Усиление бактерицидиости достигается также замещением одних ионов другими, более специфическими.
С другой стороны, наличие антибиотиков в среде может лишать бактерии необходимых для их роста элементов при возникновении хелатных связей и тем тормозить рост культуры.
Тонкими опытами Польман (Pohlman, 1962) экспериментально
доказал такие связи стрептомицина и полимиксина с микроэлементами, препятствующие росту стафилококка и ряда других
микроорганизмов.
Отмечено также действие металлов на развитие устойчивости бактерий к антибиотикам. Так, Черномордик (1959), изучая влияние микроэлементов на синегнойную палочку, установил, что Со тормозил скорость приобретения устойчивости этой
бактерии к стрептомицину, Mg — ускорял, а В, Zn, Си, Fe на
оказывали влияния. Это соответствовало также наблюдениям
с дизентерийными бактериями.
Микроэлементы, вступая в соединение с органически сложными веществами, могут изменять их структуру и функции,
тормозя или стимулируя их действие. Так, Мо снимал торможение роста Clostridium,
возникающее под влиянием некоторых
органических соединений (1,2-диацетилэтилен и др., Carnahan
et al., 1960). Ингибирующее действие а-йиколиновой кислоты
на споруляцию Вас. cereus снимало действие примененных Zri,
Со, Ni и некоторых фосфорных соединений (Krishnamurty et
al., 1960). В свою очередь, торможение а-амилазы, вызванное
рибофлавином в условиях светового облучения, снижается при
добавлении Са (Сонэ Коехидо, 1962).
К явлениям того же рода относится действие органических
соединений, нивелирующее влияние микроэлементов.
В опытах Тага и др. (Taha et al., 1959) метанол нивелировал стимулирующее действие Мп на образование лимонной кислоты Aspergillus
niger, а также устранял тормозящее влияние
на этот процесс больших доз Fe, Мп.
Другие сведения относятся к токсинам, образуемым Clostridium perfringens и дифтерийной палочкой. Fe и Со подавляли
действие этих токсинов. Обработка инактивированного при помощи Fe токсина цитратом восстанавливала его активность.
Так же действовал препарат ЭДТУ (Janoff et al., 1960).
Различное действие отдельных элементов на один и тот же
препарат (диметилхлортетрациклин) наблюдал Хамер (Нагпег, 1961). Цинк усиливал, а медь, никель, железо снижали
действие этого препарата на стафилококк.
Интересно взаимодействие аминокислот и микроэлементов.
Бактериостатическое действие 1-цистеина в отношении стрептококка и Е. coli усиливалось медью, а 1- и d-серина — кобальтом. Добавление 1-гистидина и 1-цистеина к системе серин + Со
уменьшало влияние последнего. Возможным объяснением та•128
кого явления служит конкуренция аминокислот за связывание
металла, особенно при наличии гистидина и цистеина (Weinberg, 1960).
При изучении способности тетрациклиновых антибиотиков
вступать в комплексные соединения с мёталлами было обнаружено торможение незначительными дозами железа антибиотического действия тетрациклина и некоторых других препаратов
на бруцеллы. В то же время марганец и барий усиливали действие антибиотиков на эти бактерии (Ктётёгу, Ferencik, 1961).
Аналогичное влияние на грамположительные и грамотрицательные бактерии оказывал оксин. Единственный из примененных различных катионов — Со — резко задерживал его действие. В отношении же грамотрицательных палочек такую же
роль играли железо, цинк и медь. Применение этого вещества
против грамположительных бактерий в среде, очищенной от микроэлементов, дает слабо токсичное действие. Антибактериальная
активность восстанавливается железом, медью, кадмием. Таким
образом, оксин антибактериально действует на грамположительные бактерии только при наличии некоторых металлов, с которыми он образует хелатные соединения, обладающие токсическим
действием.
Эта
токсичность
возникает
благодаря
каталитическому действию хелат, нарушающих окислительновосстановительные процессы клетки (Rubbo et al., 1950).
t
ОБРАЗОВАНИЕ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ
И ДРУГИХ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
Особый интерес представляет способность плесневых грибов повышать под действием микроэлементов образование некоторых веществ, используемых обычно в практике.
Так, образование лимонной кислоты Aspergillus
niger повышалось от применения железа (Perlman et al., 1946). То же
констатировал Васильев (Wassiljew, 1935) в отношении цинка,
применяя разные питательные среды. Другие микроэлементы
повышали выход этой кислоты у Aspergillus fonsacaens (Ciegler
a. Raper, 1960).
О положительном действии этих двух элементов, использованных в малых концентрациях, на образование кислоты Aspergillus wentii и Aspergillus glaucus сообщает ряд других исследователей (Timmonin a. Rouatt, 1944; Wyllie, 1945; Karow, 1947;
Karow a. Waksman, 1947).
В работах Локвуда и др. (Lockwood et al., 1945) благоприятное действие цинка и железа на продукцию Aspergillus
terreus итаконовой кислоты зависело в синтетической среде от
источника углевода.
Бейли и Кавалито (Bailey a. Cavallito, 1943) отмечали 30-разовое увеличение количества образуемого цитринина при добав9—388
129
лении железа в минеральную среду с глюкозой. Этот элемент
мог быть с одинаковой эффективностью замещен марганцем, но
не цинком и медью.
Некоторые органические вещества, введенные в среду, на
которой выращивались микроорганизмы, изменяли процессы метаболизма и влияние микроэлементов. Так, выход лимонной
кислоты у Aspergillus niger при использовании метанола в большой степени зависел от добавления в среду марганца, цинка и
железа. При наличии метанола для образования лимонной кислоты было необходимо добавление марганца или цинка (Bertrand, de Wolf, 1961а). Метанол, по-видимому, действовал на
обычные процессы метаболизма углеводов, изменяя их. Микроэлементы ингибировали это действие.
С другой стороны, -стимулирующее действие на выход этой
кислоты цинка при добавлении в среду метанола не проявлялось (Taha, El-Zainy et al„ 1958, 1959).
Широкие исследования в отношении изучения факторов,
влияющих на образование органических кислот плесневыми грибами, были проведены Буткевичем (1957). Стимулирующее
действие цинка на образование лимонной кислоты было настолько убедительным, что автор рекомендовал использование
этого элемента в промышленном производстве. Введение цинка
в среду имеет существенное значение в двух направлениях:
ускоряет развитие мицелия и, таким образом, сокращает время
его выращивания и повышает активность мицелия в отношении
его способности к превращению сахара в лимонную кислоту.
Мицелий, выращенный без цинка, не активировался при последующем введении его в среду.
Изучение влияния микроэлементов на Aspergillus niger и его
способность образовывать лимонную кислоту ведется в лаборатории химии микробов в Каире (Имшенецкий, 1961), где также
установлено, что цинк необходим для биосинтеза этой кислоты.
Такое ж е влияние микроэлементов наблюдалось и в отношении иных веществ, образуемых плесневыми грибами.
Работая с Pénicillium patulum, Брек (Brack, 1947) наблюдал
увеличение продукции гентизилового спирта и уменьшение образования патулина при высоких дозах железа в среде. Добавление меди в таких случаях уменьшало продукцию обоих веществ. Комбинация цинка и железа усиливала образование,
только гентизилового спирта, а железа и марганца — повышала
выход патулина и исключала образование спирта.
Синтез жира плесневым грибом из рода Pénicillium стимулировался рядом микроэлементов — Си, Zn, W, Br, Ni, Мп и др.
(Singh et al., 1962).
Басс-Шадхан (1962a) сообщает, что марганец, медь и кобальт значительно повышали образование биологически активного полисахарида — зимозана, концентрированного в оболочке
•130
Candida sp. Препараты зимозана, выделенные из дрожжей, обогащенных микроэлементами, отличались высокой биологической
активностью и большим содержанием углеводов.
Мало известны функции металлов в отношении защиты организма от радиационного воздействия. Однако первые работы
в этом направлении указывают на возможность создания комплексов металлоферментов, обеспечивающих защиту последних
от облучения. Таким комплексом может быть цистеин-п-фосфатаза (Albert et al„ 1962).
АНТАГОНИЗМ ИОНОВ
ПРИ ДЕЙСТВИИ НА МИКРООРГАНИЗМЫ
Антагонизм ионов, установленный в области физиологии высших растений, играет большую роль в снабжении
последних минеральными элементами. Это явление существует
также и в физиологии микроорганизмов. Однако тут оно изучено мало. С открытием металлоферментов и металлоорганических сложных комплексов ему даны новые объяснения. Полагают, что в основе антагонизма ионов лежит конкуренция за
связи в органических комплексах клетки. В процессе соревнования за связи при различных комбинациях металла и органических веществ возникают антагонистические и синергические
влияния на тот или иной процесс в организме. Так, при избытке
марганца, кадмия или »цинка может возникать недостаток необходимого железа, вызванный прямой конкуренцией этих элементов.
Некоторое объяснение антагонизма ионов дает Эпштейн
(Epstein, 1961). По его мнению, прохождение ионов через клеточные мембраны происходит с. помощью переносчица. Конкуренция между ионами наступает тогда, когда переносчик химически родственен нескольким находящимся в растворе ионам.
Так, конкурируют Ca—Sr, Cl—Вг и др. Физиологи растений
считают, что такой ионный обмен сыграл большую роль в эволюции органических структур в связи с возможностью образования множества схожих соединений.
В области микробиологии накоплен, но не обобщен материал
относительного ионного обмена. Переносить же сюда данные,
полученные на растениях, вряд ли можно, учитывая особенности
обмена микроорганизмов. Возможности комбинаций ионов очень
разнообразны, и это вызывает затруднение в установлении общих закономерностей.
Антагонистические взаимоотношения некоторых металлов отмечены при росте многих видов микроскопических грибов.
(Lohrmann, 1940). Они проявились в торможении действия одного элемента другим. Так, торможение роста ртутью или бором
9*
устранялось внесением магния, а торможение высокой дозой
последнего устраняли, в свою очередь ртуть и бор.
Избежать токсического действия относительно больших количеств кобальта, никеля и цинка на рост Aspergillus niger удавалось применением относительно высоких доз железа и магния
(250—25 000 мг/л).
Постепенное повышение дозы последних
соответственно уменьшало поглощение клеткой токсических количеств цинка и никеля. Меньшее ингибирующее действие проявилось в отношении кобальта (Adiga et al., 1962).
Угнетающее действие повышенных доз меди на рост Aspergillus niger снижали железо, молибден, цинк и марганец. Последние три действовали слабее, чем железо. Такое же действие
оказывала глюкоза, входящая в состав среды (Упитис, 1962).
Добавление молибдена снимало угнетение роста Neurospora
crassa вольфрамом при выращивании гриба на средах с NO3
или NH 3 . Можно предположить, что вольфрам создает недостаточность Мо и (что уже отмечалось) ингибирует определенные
биотические процессы, протекающие с участием Mo (Ramaiah
et al., 1961).
Действие металлов на рост бактерий наблюдалось в опытах
Хата (Hata, 1960), который сообщает об антагонизме ионов Мп,
Cd к Fe при выращивании морских сульфатредуцирующих бактерий.
Сегаль и Гиббоне (Sehgal a. Gibbons, 1960) сообщают о
взаимодействии железа и марганца при выращивании галофильных бактерий. Наличие железа снимало отрицательное влияние
больших концентраций марганца, задерживающее рост бактерий.
Действие сочетаний различных микроэлементов на рост девяти штаммов Streptomyces
наблюдали Хейм и Лешевалье
(Heim a. Lechevalier, 1956). Большинство штаммов увеличивало рост при воздействии суммы взятых элементов, однако два из них лучше развивались только при сочетании
железа и цинка.
Рост пропионовокислых бактерий угнетался сравнительно
высокими дозами цинка на фоне В, Си, Со, Fe. Это действие
цинка изменялось при применении других микроэлементов. Марганец усиливал токсичность при двухкомпонентном внесении.
Наличие же других микроэлементов устраняло синергизм цинка
и марганца (Воробьева, 1962).
Антагонизму цинка и марганца при развитии молочнокислых
бактерий посвящены работы Маклеода и Снела (Macleod
a. Snell, 1950). Ими была обнаружена токсичность цинка для
Lactobacillus
arabinosus. Эта токсичность снималась добавлением марганца. Магний, кальций, стронций также снимали токсичность цинка к двум видам, но не могли заменить марганца,
необходимого для роста молочнокислых бактерий. В то же вре•132
мя эти ионы не действовали на токсичность цинка к третьему
виду — Leuconostoc
mesenteroides.
В этих опытах вызывает интерес различное действие одних
и тех же ионов на три вида бактерий и, с другой стороны, различное действие нескольких ионов на один какой-либо вид.
Такой эффект разных ионов может быть объяснен их каталитической ролью в обменных реакциях клетки. Токсичность цинка можно рассматривать как результат образования с ним каталитически неактивных протеинов, а снятие угнетения — как
вытеснение цинка другими ионами с образованием нормально
активных протеинов. Такое объяснение механизма антагонистического действия дает возможность широко трактовать данные
явления.
Ионный антагонизм у бактерий обычно изучается в связи
с требованиями питания неорганическими ионами. Функция марганца заключается, по-видимому, как в питании, так и в образовании активных комплексов, активирующих необходимые ферменты. Возможно, что такой фермент может активироваться и
другими ионами, которые, однако, не могут замещать марганец
в питании организма.
Действуя на рост, микроэлементы влияют также и на ферментативные процессы микроорганизмов. Исследования Перлмана и др. (Perlman et al., 1946), наблюдавшего стимуляцию
выхода лимонной кислоты у Aspergillus niger при действии Fe,
Mn, Сг, А1, показали, что эту микроэлементы в смеси влияли
гораздо слабее, чем при поодиночном внесении. Оптимальные
дозы их были различны для различных штаммов гриба.
Цинк задерживал поглощение кислорода грибом Epidermophyton. Добавление кальция или молибдена снимало это действие (Nickerson, Chadwick, 1946).
В работах японских авторов (Fukumoto et al., 1960) образование амилазы Вас. amyloliquefaciens
подавлялось солями
цинка и кобальта. Это угнетение снималось добавлением кальция и стронция в дозах, увеличенных в 6 раз.
• Тормозящее действие цинка и меди на фосфоглюкомутазу
объясняется вытеснением этими элементами необходимого для
фермента магния (Milstein, 1961). Схожие по действию на азотобактер Mo, W и V в то же время являются антагонистами в
некоторых реакциях клетки.
В опытах с Neurospora crassa вольфрам является конкурентным антагонистом молибдена, полностью устраняющим его
активирующее действие на нитратредуктазу гриба (Aurich,
1959). Подобное же явление наблюдали Килер и Вернер (Кееler a. Varner, 1957, 1962), установившие, что вольфрам ингибирует функцию молибдена в клетках азотобактера. При внесении вольфрама поглощение М о " снижалось на 95%, но размножение клеток не замедлялось. По-видимому, вольфрам влияет
•133
на процесс образования «избыточных» молибдопротеинов в более сильной степени, чем на синтез молибдопротеинов, необходимых для размножения клеток. Ванадий не устранял угнетающего действия вольфрама, что показывает невозможность
замены им молибдена.
При изучении действия микроэлементов на азотфиксацию
азотобактера наблюдалось ослабление влияния молибдена при
совместном его применении с никелем и кобальтом. Последние
проявили антагонизм к молибдену в данном процессе (Lswaran,
Rao, 1960).
Антагонизм ионов можно наблюдать не только в живых
клетках, но и во внутриклеточном материале. Работая с клеточными экстрактами Lactobacillus
arabinosus, Кларк и Маклеод (Clark a. Mcleod, 1954) нашли, что при гликолизе необходим марганец (кроме АТФ и NH 4 ). Другие ионы (Mg, Со, Ni,
Zn) не могли заменить его или уменьшить необходимость в
нем. Задерживали гликолиз Na, Cs. Однако добавление Mg,
Со, Ni нивелировало торможение данного процесса.
Важным вопросом при использовании микроэлементов является выявление их эффективных комбинаций — двойных,
тройных и т. д. В этих соотношениях может играть роль антагонизм ионов. Априорные решения этого вопроса на основании
химических характеристик элементов невозможны. Кроме того,
как уже было сказано, организмы, находящиеся под влиянием
микроэлементов, не всегда одинаково реагируют на них.
При некоторых сочетаниях микроэлементов могут возникать
определенные торможения ферментативных процессов вследствие конкуренции ионов в соединениях, необходимых для ферментов. Горбах с сотрудниками (Gorbach u. al., 1957) занимался исследованиями влияния Zn, Fe, Си, Мп, взятых в отдельности и совместно, на рост и образование сахарозы
Aspergillus
niger. Цинк и медь оказывали стимулирующее действие на эти
процессы. При применении двойных комбинаций железо тормозило влияние цинка, в свою очередь это торможение снималось при внесении марганца и меди. Добавление цинка в среду,
содержащую Mn, Fe, Си, сильно повышало образование сахарозы. Это повышение в элюатах культур доходило до 288% и
в культуральных жидкостях — до 640%. Тормозящее действие
железа исключалось в этом случае благодаря марганцу и меди.
Авторы приходят к выводу, что при действии различных элементов проявляются их сложные взаимоотношения, выражающиеся в активации, синергизме и антагонизме ионов.
Антагонизм микроэлементов при испытании различных двух-,
трех- и четырехкомпонентных смесей Си, Mn, Fe, Са при их
действии на целлюлозные бактерии наблюдал Бортельс (Вогtels, 1956). Антагонизм проявлялся в реакциях гидролитического расщепления целлюлозы.
•134
Интересное объяснение антагонистическому действию металлов на ферменты дают Де Терк и Бернгейм (De Terk et
Bernheim, 1960). Они сообщают о своеобразном антагонизме
Со и Fe в клетках Pseudomonas
aeruginosa.
Кобальт может
вытеснять железо из клетки и задерживать усвоение аммиачного иона и ряда ферментных окислительных процессов. Это
торможение может в большинстве случаев сниматься солями
неорганического железа, взятого в определенных дозах. По
мнению авторов, подобные реакции обусловлены соединениями
этих металлов с некоторыми рецепторами клетки, причем роль
железа заключается в переносе соединений в сферу ферментного влияния. Таким образом, впервые действие микроэлементов пытались связать с рецепторным строением клетки бактерии.
Различные сочетания микроэлементов своеобразно действовали на образование витамина В12 пропионовокислыми бактериями (Воробьева, 1962). Высокие дозы цинка угнетали вита^
минообразование. Это угнетение снималось ^другими ионами,
причем действие последних было разным в отношении роста и
витаминообразования. Марганец и хром усиливали действие
цинка.
ЧАСТЬ
V
МИКРОЭЛЕМЕНТЫ И ИЗМЕНЧИВОСТЬ
МИКРООРГАНИЗМОВ
АМИНО- И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
Изменение состава аминокислот под действием
цинка в культурах Aspergillus
niger наблюдали Бертран и
Вольф (Bertrand a. Wolf, 1959). Цинк был необходим для синтеза триптофана. Действие этого элемента на синтез аминокислот не ограничивалось триптофаном, оно проявилось и в отношении тирозина, фенилаланина, треонина, лейцина, изолейцина, серина, валина. В этом случае кадмий лишь частично мог
заменить цинк и притом со значительно меньшей эффективностью. Авторы полагают, что некоторые аминокислоты образуются из общего предшественника, что обусловливает сходное
влияние на них цинка и кадмия.
Сведения о действии микроэлементов на нуклеиновые кислоты микроорганизмов в основном относятся к цинку и марганцу. В опытах с Nocardia ораса (Webley et al., 1962) исключение
из среды этих двух элементов вело к уменьшению синтеза Д Н К
и РНК- Некоторые данные говорят также о действии молибдена.
Применение его в условиях выращивания Clostridium
perfringens на казеиново-гидролизатной среде повышало содержание
общего азота и Р Н К этой культуры (Диневич, 1961).
О действии металлов на нуклеиновые кислоты можно судить
т а к ж е по активности ферментов, их расщепляющих.
Влияние различных катионов на активность Д Н К - а з ы изучалось в лабораторных условиях с выдерживанием постоянной
ионной силы. Лучшими активаторами в этих условиях оказались марганец, магний и железо в концентрации 0,01 М и кобальт — 0,0005 М. Понижение рН изменяло эффективность
действия элементов. Д Н К - а з а была т а к ж е выделена из заводского штамма Вас. subtilis, употребляемого для производства
амилазы. Фермент активировался марганцем и магнием. Эти
ж е металлы нужны для ферментативного процесса, производимого нуклеозидазой, выделенной из Xanthomonas
pruni (Van
Eys, 1960).
Виндер и o'Xapa (Winder a. o'Hara, 1962), работавшие с
Mycobacterium
smegmalis,
получили данные, говорящие об из•136
менениях в метаболизме клетки под влиянием микроэлементов.
Бактерия плохо растет в среде с недостачей железа и цинка.
Авторы сравнивали культуры, растущие в нормальной среде
и в среде без этих элементов. В последнем случае наблюдалось
угнетение роста, изменение морфологических и культуральных
особенностей культуры, а также количественные изменения
нуклеиновых кислот (исчисляемых в г нерастворимого азота).
Относительные количества Р Н К уменьшались, изменения в
Д Н К были несущественны. Все эти изменения, зависящие, повидимому, от замедления синтеза РНК, вели к задержке образования белка, то есть роста культуры. Авторы убедились, что
недостаток указанных микроэлементов оказывает специфическое тормозящее действие на синтез РНК- Нарушение соотношений в образовании ядерных кислот вело к другим нарушениям в метаболизме клетки. Так, при недостатке цинка наблюдалось относительное увеличение нерастворимых неорганических
полифосфатов, показывающее задержку хода энергетических
реакций. Количество аденозинтрифосфата
(АТФ), обычно
уменьшающееся к концу роста культуры, в 2п-дефицитных
культурах оставалось достаточно высоким. Количество пиридиннуклеотидов рано падало в 1п- и Ие-дефицитных культурах
из-за недостатка указанных металлов для синтеза этого соединения. Весьма возможно, что это исходило из задержки образования никотиновой кислоты или ее составной части. Дефицит
цинка отражался на общем числе липидов, количество которых
повышалось, особенно фосфолипидов. Вместе с тем падало количество нерастворимых форм азотных веществ и особенно
кислоторастворимого азота. Подобные явления наблюдались и
у высших растений (Possingham, 1957).
Приведенные данные указывают на определенное действие
микроэлементов на важнейшие соединения клетки и ее метаболизм. Опыты с металлдефицитными культурами убедительно
показали эти изменения. Действие некоторых микроэлементов
{1п, Ре, Мп) можно считать специфическим. Однако было бы
ошибочным приписывать специфичность соединениям некоторых ферментов с определенными металлами только потому, что
без наличия последних уменьшается концентрация фермента.
В данном случае может иметь место косвенное влияние на синтез апофермента, как это происходит при влиянии дефицита
цинка на синтез триптофана.
В некоторых случаях при дефиците нескольких металлов
наблюдается отрицательное влияние отсутствия только одного
из них, в других же необходимый металл может быть заменен
другим, сходным по физическим свойствам.
Как правило, действие микроэлементов зависит в значительной мере от условий их применения и особенностей микроорганизмов.
•137
ИЗМЕНЕНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКИХ СВОЙСТВ
АКТИНОМИЦЕТОВ
Учитывая литературные данные о действии микроэлементов на изменения активности ферментов, а также на
нуклеиновые кислоты, нами были проведены опыты с испытанием действия микроэлементов на антагонистические свойства
актиномицетов (Бершова, 1963).
Из большого количества выделенных из почв хозяйства Института микробиологии АН УССР «Феофания» актиномицетов
было отобрано 32 штамма разных видов, обладающих антагонистическими свойствами к стафилококку штамм 209. Эти виды
выращивались на агаризованной среде № 1 Красильникова с
добавлением отдельных микроэлементов. Через 5—7 суток из
проросшего актиномицетом агара вырезывались блоки с культурой и накладывались на газон чашки, засеянной стафилококком. Контроль — среда с микроэлементами. Через 24 ч измерялся размер зон отсутствия роста стафилококка вокруг
блока с актиномицетом. Полученные результаты опытов приведены в табл. 39.
Т а б л и ц а 39
Влияние микроэлементов на антагонистические свойства актиномицетов
к стафилококку (зоны отсутствия роста—в мм)
Номер
культуры
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Среда с микроэлементами
Вид актиномицета
Контроль
Mo
В
Mn
Zn
Cu
Co
Actinomyces griseus
Act. griseus zonatus
Act. griseus zonatus,
штамм № 2
Act. globisporus griseus
Act. globisporus
Act. flavus
Act. viridiflavus
Act. violaceus
Act. globisporus
Act. albus
15
18
20
20
20
25
17
20
22
25
24
22
20
24
20
15
20
25
20
22
22
22
15
15
17
16
18
14
20
17
18
19
12
16
17
25
20
18
18
12
18
18
22
16
19
15
15
20
20
22
18
12
12
11
13
24
22
12
10
12
12
20
20
24
20
12
17
11
25
23
Оказалось, что микроэлементы изменяют степень антагонистического действия актиномицетов на стафилококк. В большинстве случаев получены увеличенные зоны подавления роста
сравнительно с контрольными культурами. Эти увеличения в
некоторых случаях были значительными. Примером такого действия служит большинство культур. Усиление антагонизма проявилось под влиянием почти всех взятых элементов. Особенно
•138
активно действие марганца, цинка, кобальта. У некоторых видов наблюдалось действие только одного—трех элементов. Наряду с этим отмечены случаи уменьшения антагонистическо,го
действия. Один актиномицет (№ 8) снижал образование бактерицидных веществ под действием взятых микроэлементов.
При повторении опытов указанное явление воспроизводилось
Рис. 8. Антагонистическое действие
разных вариантов Actinomyces
griseus на стафилококк:
К — к о н т р о л ь , 1 — вариант, выращенный на среде с бором, 2 — с молибденом, 3 — с марганцем, 4 — с цинком,
5 — с медью, 6 — с кобальтом.
Рис. 9. Антагонистическое действие
разных вариантов Actinomyces
globosus на стафилококк.
Обозначения те же, что на рис. 8.
не всегда точно, наблюдались отклонения в сторону уменьшения или усиления его первоначального действия.
При испытании влияния микроэлементов на накопление актиномицетами разного возраста бактерицидных веществ оптимальным сроком оказались пятый—восьмой дни роста. Наиболее старые культуры показывали уменьшение действия микроэлементов. На рис. 8 и 9 видно это действие на двух видах актиномицетов. Представленные на рис. 8 блоки разных вариантов Actinomyces
griseus, выращенного на средах с Мо, В, Мп,
Zn, показывают большее бактерицидное действие, чем блок
контрольного варианта (выращенного на среде без микроэлементов). Вариант, выращенный на среде с медью, был менее
активен, чем контрольный. На рис. 9 представлены варианты
другого вида актиномицета, выращенного на средах с Мо, В,
Со. Они также оказались более активными.
Таким образом, можно говорить о действии определенных
микроэлементов, усиливающем антагонистические свойства актиномицетов. Однако не все актиномицеты подвержены такому
•139
влиянию. Некоторые из них реагируют в этом отношении слабее. Существуют видовые отличия в отзывчивости актиномицетов. На одни виды действуют больше молибден и бор, на другие—марганец, цинк и кобальт. Это действие различно по
силе у разных штаммов.
Такое усиление и ослабление антагонистических свойств
микроорганизмов при помощи микроэлементов может быть использовано при получении антибиотических веществ из актиномицетов.
ИЗМЕНЕНИЕ БИОХИМИЧЕСКИХ
АЗОТОБАКТЕРА
СВОЙСТВ
Исследования изменений свойств микроорганизмов под действием микроэлементов были продолжены в опытах
с азотобактером.
Некоторые литературные данные указывают на изменчивость азотобактера под влиянием его культивирования в разных условиях. Также подчеркивается трудность получения
стойких новых форм этой бактерии. Почти всегда у полученных
вариантов через некоторое время возвращались признаки исходных штаммов.
• Предпосылкой для нашей работы было влияние микроэлементов на обмен веществ клетки. Возникало предположение,
что с их помощью путем изменчивости можно получить новые
наследственные признаки или усилить уже существующие у
этой бактерии.
Работа проводилась в направлении получения вариантов
азотобактера, более активных по азотфиксации и влиянию на
растения, чем основные штаммы. Была также сделана попытка
закрепить полученные новые свойства азотобактера.
Предварительные опыты по выяснению отзывчивости разных штаммов азотобактера проводились с 20 штаммами, свежевыделенными из различных почв УССР. Все штаммы относятся к Аго^ЬаЫег скготососсит. Микроэлементы — бор в виде
буры (Ыа 2 В 4 0 7 ) и молибден в виде Ыа 2 Мо04.
Из 20 штаммов увеличили рост и азотфиксацию в первых
же опытах 14 (табл. 40). Увеличение азотфиксации от внесения
бора составило 1—3 мг на 1 г внесенного в среду сахара, молибден увеличивал азотфиксацию значительно больше — в 2—
3 раза по сравнению с азотфиксацией основного штамма.
Д л я дальнейшей работы были отобраны десять штаммов
азотобактера, особенно отзывчивых на влияние микроэлементов. С целью выявления действия и закрепления положительных новых свойств азотобактера проводилось длительное (3—
4 месяца) пассирование штаммов при последовательных пересевах на агаровой среде Эшби с добавлением бора или молиб•140
Т а б л и ц а 50'
Действие микроэлементов на рост и азотфиксацию разных штаммов
азотобактера
Номер
штамма
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
К
Общая
масса
бактерий
3,8
5,7
5,0
5,6
3,7
0,6
2,6
2,7
3,9
2,1
1,0
0,5
0,8
1,0
2,4
1,1
1,0
2,2
1,9
5,0
Общая
масса
бактерий
Азотфиксация
9,2
6,6
12,5
9,1
9,0
5,2
6,9
7,7
6,2
6,1
—
—
—
—
—
—
—
—
—
7,1
ч
4,1
6,1
5,6
5,7
4,1
0,7
3,3
3,3
3,1
3,0
1,5
0,7
1,3
0,9
3,0
0,6
0,9
3,0
2,7
5,0
Фосфорномолибденовая кислота
Молибден
Бор
Контроль
Общая
масса
бактерий
Азотфиксация
_
—
4,9
6,4
4,4
4,6
4,5
0,5
2,8
4,5
4,3
2,8
1,5
0,6
—
—
—
1,4
9,5
12,3
—
11,4
—
9,9
—
—
6,5
—
—
—
—
—
1" —
•
—
0,8
1,8
2,8
•1,8
5,3
Азотфиксация
Общая
масса
бактерий
Азотфиксация
4,5
5,0
4.4
5,6
4,2
0,5
2,6
4,2
4,8
2,9
14,5
16,8
—
—
14,5
—
—
19,1
10,2
7,9
—
—
—
—
—
— -
—
—<
13,6
7,5
—
—
—
—
—
—
—
. —
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—і
У
.
—
—
—
—
—
.
5,2
П р и м е ч а н и е . Общая масса бактерий определялась в г на чашку
Петри. Азотфиксация — в мг N на 1 г сахара, внесенного в среду.
дена, а также отбор колоний. Д л я испытания новых свойств
и их наследственного закрепления варианты штаммов культивировались на среде Эшби уже без микроэлементов. Изменение
свойств культуры определялось изменением роста, азотфиксации и наблюдаемых внешних признаков.
Азотфиксация определялась на десятый день роста азотобактера в промытом речном стерильном песке со средой Виноградского и соответствующими микроэлементами. Засев производился одинаковым количеством клеток. Через десять дней
инкубации при 25° С культуры сжигали по методике Кьельдаля, в растворе определяли азот колориметрическим способом.
В результате длительных пассажей и отбора были получены
варианты основных штаммов азотобактера, отличающиеся от
исходных штаммов культуральными и морфологическими свойствами и величиной азотфиксации. Последующее культивиро-141
вание этих вариантов на среде без микроэлементов в течение
нескольких месяцев не изменяло приобретенных признаков.
Увеличению роста варианта культур почти всегда сопутствует
увеличение азотфиксации. Варианты, полученные пассированием на среде с молибденом, значительно увеличили азотфиксирующую способность; некоторые из них (7 и 9) увеличили ее
более чем вдвое. Увеличение азотфиксирующей способности
подтверждается также сопоставлением увеличения роста и азотфиксации. Последняя у штаммов 7, 8, 9, К возросла в большей
степени, чем увеличение в росте.
Д л я закрепления полученных изменений у вариантов азотобактера проводилось дальнейшее пассирование их на средах
с микроэлементами. Периодические испытания показали, что
способность к высокой азотфиксации сохранялась у вариантов
на протяжении долгого времени.
В условиях лаборатории были проведены микровегетационные опыты с испытанием эффективности действия полученных
вариантов азотобактера на рост проростков некоторых растений. В этих опытах можно отметить положительное влияние
вариантов азотобактера, гораздо большее, чем влияние основных штаммов, на рост проростков. Кроме того, в опыте отмечены большие различия в развитии корневой системы проростков,
значительно большей у растений с бактеризацией семян вариантами азотобактера.
Полученные варианты были испытаны в вегетационных опытах с яровой пшеницей и овсом, а затем, на второй год, и в полевых опытах. Схему и результаты опытов приводим в табл.41,
42. Как видно из таблиц, урожай обоих растений при внесении
вариантов был повышенный в сравнении с урожаем по контрольным штаммам азотобактера. Из четырех вариантов, культивированных на среде с бором, два повысили урожай пшеницы
на 4—15% выше контрольного штамма. Все четыре варианта,
культивированные на молибдене, дали прибавки урожая зерна
на 15—25% выше основных штаммов. Прибавки урожая по
вариантам, выращенным на средах с молибденом, значительно
выше, чем по вариантам, выращенным на среде с бором.
Аналогичные результаты получены и в опытах с овсом
(табл. 42). Несмотря на то, что в опытах с овсом были взяты
варианты иных штаммов, кроме штамма № 7, который был
внесен с овсом и пшеницей, прибавка урожая была также при
внесении вариантов, культивированных на молибдене, и при
двух вариантах, культивированных на боре. Прибавки зерна
овса от тех и других вариантов в данном опыте были почти
одинаковыми— 16—22 % Производили также наблюдения над приживаемостью азотобактера в ризосфере и на корнях растений. При высевах;
земли с корней растений, бактеризованных вариантами, азото•142
Г
Т а б л и ц а 41
Урожай яровой пшеницы в опытах с азотобактером, культивированным
на средах с микроэлементами
Урожай в % к контролю
Урожай в % к основному штамму азотобактера
Вариант опыта
Контроль (без азотобактера)
Азотобактер, основной штамм № 2
Вариант штамма № 2, выращиваемого
на среде с Мо
То же на среде с В
Азотобактер, основной штамм № 5
Вариант штамма № 5, выращиваемого
на среде с Мо
То же на среде с В
Азотобактер, основной штамм № 7
Вариант штамма № 7, выращиваемого
на среде с Мо
То же на среде с В
Азотобактер, основной штамм № 18
Вариант штамма № 18, выращиваемого
на среде с Мо
То же на среде с В
Общая
масса
Зерно
Общая
масса
100
105
110
100
100
124
100
105
100
124
105
119
148
100
115
130
100
100
129
100
100
115
98
123
140
110
120
145
82
100
117
95
100
125
124
105
120
97
100
131
104
100
115
120
96
115
120
95
126
91
\
Зерно
_
Т а б л и ц а 42
Урожай овса в опытах с азотобактером, культивированным на средах
с микроэлементами
Урожай в % к контpujiiu
Урожай в % к неизмененному штамму
азотобактера
Вариант опыта
Контроль (без азотобактера)
Азотобактер, основной штамм № 15
Вариант штамма № 15, выращиваемого
на средах с Мо
То же на средах с В
Азотобактер, ^основной штамм К
Вариант штамма К, выращиваемого на
средах с Мо
Азотобактер, основной штамм № 8
Вариант штамма № 8, выращиваемого
на средах с Мо
То же на средах с В
Азотобактер, основной штамм № 7
Вариант штамма № 6, выращиваемого
на средах с Мо
То же на средах с В
Общая
масса
Зерно
Общая
масса
100
102
ИЗ
100
100
122
100
111
100
122
120
137
139
122
125
137
118
100
102
122
100
112
118
133
117
132
100
115
100
116
111
115
140
111
122
144
94
100
125
96
100
122
134
138
119
116
Зерно
_
•143
бактер всегда проявлял интенсивный рост, больший, чем рост
основных штаммов, и приживаемость вариантов была всегда
большей.
Испытание вариантов штаммов азотобактера было повторено в полевых условиях на культуре овса. В опыт были взяты
только варианты, полученные на средах с молибденом, как более эффективные, устойчивые и перспективные для дальнейшей
работы.
Опыт проводили на суглинистой дерново-подзолистой почве
опытного поля Института микробиологии АН УССР «Феофания». Семена овса обрабатывали суспензией культур основных
штаммов азотобактера и их вариантов. Всего было взято четыре штамма и четыре их варианта. Результаты опыта и схему
приводим в табл. 43.
Таблица
Полевые опыты с применением вариантов
азотобактера
Вес общей массы
Вариант опыта
Контроль (без азотобактера)
Азотобактер
штамм № 8
штамм № 15
штамм К
штамм № 2 <
Варианты
Штамма № 8
штамма № 15
штамма К
штамма № 2
43
штаммов
Вес зерна
ц/га
%
и,/га
%
49
100
9,4
100
62
59
55
42
126,5
120,4
112,2
85,4
10,2
10,1
10,5
10,0
108,9
107,4
111,7
106,4
62
61
63
60
126,5
124,5
128,6
122,2
11,3
11,5
12,1
11,7
111,2
122,5
128,9
125,1
Прибавка
урожая
зерна в %
к основному штамму
—
1—
(
—
—
2,1
15,1
17,2
18,9
Как видно из приведенных данных, урожай зерна овса повысился от применения всех четырех вариантов азотобактера.
На делянках с внесением основных штаммов азотобактера урожай также был выше, чем в контроле, не? действие вариантов
азотобактера было значительно сильнее, чем основных штаммов азотобактера во всех четырех случаях.
Таким образом, при воздействии микроэлементов были получены измененные свойства у азотобактера, которые затем
передавались по наследству. Микроэлементы В и Мо усиливали
рост и азотфиксацию азотобактера в определенных условиях
его культивирования на средах с этими элементами. При длительном пассировании штаммов азотобактера при наличии молибдена и бора рост, азотфиксирующая способность и морфо•144
логические признаки азотобактера значительно изменяются.
Однако не все штаммы азотобактера отзывчивы на влияние
указанных факторов. Более пластичны штаммы, свежевыделенные из почв. Наиболее стойкими в удержании приобретенных
признаков являются варианты, полученные при помощи молибдена.
Объяснение таких наследственных изменений в физиологических свойствах микроорганизмов следует, как нам кажется,
искать во влиянии микроэлементов на нуклеиновые кислоты
клеток. Как известно, эти кислоты играют определенную роль
в передаче наследственных черт организмов. Металлы, вступая
с ними и их компонентами (фосфорными и другими группами)
в комплексные соединения, как полагают, играют роль в стабилизации структур кислот и скорости белкового обмена. Кроме того, есть указания на их определенное значение при ферментативных реакциях распада и синтеза нуклеиновых кислот.
Некоторые микроэлементы активируют нуклеотилазы, Д Н К —
полимеразы, рибонуклеазы, фосфородиэстеразы и многие дру1,
гие ферменты^ В опытах Школьника и его сотрудников (1962)
показано влияние бора на синтез Р Н К и Д Н К у растений. Отсутствие этого элемента вело к снижению количества нуклеиновых кислот, особенно РНК, во всех частях растений.
Полученные нами изменения азотфиксирующей способности
азотобактера под влиянием бора и молибдена относятся, повидимому, к процессам подобного рода и подтверждают предположение Виндера и o'Xapa (Winder а. о'Нага, 1962) об участии микроэлементов в передаче наследственных признаков.
10—388
ЧАСТЬ
VI
УСВОЕНИЕ МОЛИБДЕНА БАКТЕРИЯМИ
(опыты с радиоактивным изотопом М о " )
Д о сих пор остается неясным вопрос, в какой
мере микроэлементы, находящиеся в среде, используются микроорганизмами. Определенные результаты в этом отношении
могли дать исследования с применением радиоактивных изотопов микроэлементов.
Задачей наших исследований было изучение путей и степени использования М о " почвенными бактериями. С другой стороны, работа с Мо была интересна с точки зрения азотфиксирующей способности азотобактера и других бактерий, усваивающих атмосферный азот.
Известно, что наличие Мо в среде значительно усиливает
азотфикСирующую способность азотобактера ( В о й е Ь , 1930; Матуашвили, 1947; Бершова, 1951, 1956, 1958; Федоров, 1952; Крылова, 1964).
Это усиление, по данным разных авторов, может достигать
80—600%.
Кроме того, обогащение почвы азотом идет и за счет азотоусвоения ряда почвенных микроорганизмов, в том числе олигонитрофилов. Действие на них молибдена совсем не изучено.
Вместе с тем можно было по аналогии полагать, что оно т а к ж е
будет положительным.
С помощью изотопа молибдена мы старались разрешить
следующие вопросы: о поступлении молибдена в клетки бактерий; скорости поступления Мо в зависимости от их роста;
адсорбции Мо размножающимися клетками азотобактера; поглощении Мо неразмножающимися клетками; об отношении
разных штаммов азотобактера к Мо; отдаче Мо клетками бактерий в среду; конкуренции за Мо между азотобактером и
растением; поступлении Мо из клеток бактерий в растение;
поглощении Мо азотобактером из почвы; влиянии М о " на размножение азотобактера и некоторых олигонитрофилов и их
азотфиксирующую способность.
Опыты проводили в лабораторных условиях. К а ж д ы й опыт
повторяли несколько раз. В качестве объекта исследований бы•146
ли взяты культуры Аго1оЬас1ег скгоососсит — штамм К и другие штаммы, а также ряд культур, выделенных из почвы и растущих на среде Эшби (табл. 55). Изотоп молибдена — М о " —
обладал следующими свойствами: формула соединения Мо0 3 ,
полураспад 67 ч, излучение — р, у, е - . Раствор изотопа вносили
в соответствующие среды в определенных, указанных ниже дозах. Большим неудобством был короткий срок полураспада Мо,
а также необходимость работы с малыми количествами этого
соединения, так как Мо усвояется растениями и бактериями в
относительно малых дозах; большие же дозы были токсичны
для объектов исследования.
Активность источников излучения измеряли на счетчике Гейгера — Мюллера. Количество импульсов в минуту в анализируемом объекте указывало на количество поступившего в него
молибдена. Д л я получения культуры бактерий, обладающих
радиоактивностью, их выращивали на агаризованных средах
Эшби и других с добавлением М о " . При испытании этих культур сначала производили отмыв их от частиц среды, затем
отбирали навески, распределяли на определенной площади
фильтровальной бумаги, подсушивали и помещали в счетчик.
При испытании фильтров культур или жидкой среды, в которой они росли, определенное количество таковых наносили на
фильтровальную бумагу и подсушивали перед определением.
Зеленые проростки растений разрезали на кусочки 1—2 см
длины. Из агара вырезывали блоки в 200 мм3, которые помещали в счетчик. Поправка на полураспад при измерениях в
разные сроки производилась ко времени первого измерения.
Более подробное описание методики приведено при изложении
каждого опыта. Культивирование азотобактера проводили на
обычной агаризованной и жидкой среде Эшби с дозой МоОз
20—30—50 мг/л. Большие дозы угнетали азотобактер.
ПОГЛОЩЕНИЕ Мо93 КЛЕТКАМИ АЗОТОБАКТЕРА
Исследование поглощения клетками азотобакэ
тера Мо из среды проводилось в следующем опыте. Двухсуточную культуру азотобактера, выращенную на среде с Мо", испытывали на радиоактивность. Кроме того, испытывали активность излучения агара, на котором она росла. Культуру брали
в количестве 3 млрд. клеток, агар — 200 мм3.
Как видно из табл. 44, клетки азотобактера поглотили Мо
в количестве, дающем ПО—220 импульсов, в зависимости от
взятой дозы Мо. При оптимальной дозе в 25 мг/л Мо поглощалось больше, чем при угнетающих культуру дозах. Поглощение
Мо подтверждается и анализом агара, на котором рос азотобактер. Больше импульсов давали блоки агара, вырезанные из
контрольной среды, меньше — блоки из среды, на которой рос
ю*
147
Т а б л и ц а 44
Поступление Мо в клетки азотобактера (в имп/мин)
»
Вариант опыта
Контроль. Среда с 25 мг Мо
Среда
с 25 мг Мо+азотобактер
с 50 мг Мо. Контроль
с 50 мг Мо-{-азотобактер
с 100 мг Мо. Контроль
с 100 мг Мо+азотобактер
'
Культура
Агар
140
220
—
110
—
175
80
260
140
420
210
азотобактер и из которой он поглотил Мо. Это повторялось при
всех взятых дозах Мо, изменялось только количественное соотношение импульсов в зависимости от вариантов опыта.
ВРЕМЯ ПОСТУПЛЕНИЯ М о " В КЛЕТКИ
Следующие исследования показали время поступления Мо в клетки азотобактера в процессе роста культуры.
Азотобактер высевали на чашки Петри с агаризованной средой
Эшби с молибденом. Анализ культуры проводили через определенные отрезки времени. Результаты двух опытов, проведенных
с препаратами М о 0 3 разной удельной активности, приведены в
табл. 45. Они показывают, что в процессе роста азотобактер активно поглощает Мо из среТ а б л и ц а 45
ды. Уже в 16-часовой культуре имеется определенное
Поступление Мо в клетки в процессе
роста азотобактера (в имп/мин)
количество Мо, нарастающее в течение двух суток
Возраст культуры (в часах)
роста. Дальнейшие опредеопыта
16
24
72
48
96
ления показывают некоторое
увеличение поглощения Мо,
32
28
67
1
70
но не в такой мере, как это
2
40
50
100
90
—
было в первый период размножения культуры. По-видимому, азотобактер нуждается в Мо в большей мере в начальном периоде роста молодых клеток. Некоторую аналогию данного явления можно провести с высшими растениями, которые
больше употребляли микроэлемента также в первые фазы роста (Власюк, 1964)
•148
АДСОРБЦИЯ М о "
Д л я решения этого вопроса был поставлен опыт
с внесением в жидкую среду Эшби с Мо молодых (2-суточных),
старых (10-суточных) и убитых (нагревом) клеток азотобактера. Количество клеток было одинаковым. Через 24 ч культуру
азотобактера отцентрифугировали, промывали до исчезновения
Мо в промывных водах и анализировали на радиоактивность
(табл. 46).
Т а б л и ц а 46
Полученные данные подтверждают результаты первых
Мо в клетках разного возраста
(в имп/мин)
опытов в том отношении, что
Мо поглощается больше молодой, развивающейся культуАзотобактер
Культура
Среда, 1 мл
рой. Гораздо меньше импульсов дала старая культура.
Незначительное
количество Клетки
молодые
87
690
импульсов получено и при
18
старые
750
анализе убитой культуры. Слеубитые
6
900
довательно, не исключено и
явление адсорбции Мо клетками азотобактера, но оно незначительно по сравнению с поглощением Мо живыми клетками с обменом веществ.
ПОГЛОЩЕНИЕ М о " НЕРАЗМНОЖАЮЩИМИСЯ КЛЕТКАМИ
Во втором опыте, проведенном для выяснения
того же вопроса, получены гораздо более показательные данные, вероятно потому, что здесь был взят препарат Мо с большей удельной активностью.
Молодую (двухсуточную) культуру азотобактера в количестве 3 млрд. клеток вносили в колбочки с физиологическим раствором с добавлением Мо. Культура находилась в условиях,
исключающих размножение. Через 3 и 5 суток культуру отцентрифугировали, промывали и испытывали на радиоактивность
(та'бл. 47).
Полученные данные показывают очень сильное поглощение
Мо культурой азотобактера. Увеличение дозы молибдена в среде благоприятствовало увеличению поглощения. Однако количество Мо в клетках, обнаруженное на пятые сутки, осталось относительно таким же, как и на третьи сутки. В неразмножающейся культуре количество Мо на пятые сутки не увеличилось.
Очевидно, и в данных условиях также происходит обмен веществ
в клетке, определяющий поглощение Мо.
•149
Таблица
50'
Поглощение Mo" неразмножающимися клетками азотобактера (в имп/мин)
Сроки испытания
(в сутках)
Вариант опыта
3
Азотобактер в физиологическом растворе с
15 мг/л Мо
Азотобактер с 30 мг/л Мо
|
5
15000
1250
3370
3200
!
ПОГЛОЩЕНИЕ М о " РАЗНЫМИ ШТАММАМИ
АЗОТОБАКТЕРА
Было также изучено поглощение Мо разными
штаммами азотобактера. Были взяты штаммы К и 53 Azotobacter chroococcum и Azotobacter agile. Культуры высевали в равных условиях на чашки Петри с агаризованной средой Эшби с
М о " . Через 3, 5, 10 суток испытывали их радиоактивность. Поглощение Мо разными штаммами характеризуется данными,
приведенными в табл. 48.
Т а б л и ц а 48
Поглощение Мо разными штаммами азотобактера (в имп/мин)
Сроки исследования (в сутках)
Дозы Мо,
добавленные в среду
(мг/л)
15
30
3
5
53
К
Аг.
agile
53
К
90
190
120
166
84
98
181
240
195
270
10
Аг.
agile
144
132
53
к
144
264
204
288
Оказалось, что различные штаммы азотобактера поглощают
Мо в неодинаковых количествах. В молодой, 3-суточной культуре поглощение Мо больше у штамма К при дозе 15 мг Мо.
При увеличении дозы до 30 мг больше Мо поглощает штамм
53. Однако во все последующие сроки при обеих дозах Мо
больше у штамма К. Значительно меньше поглощает Мо Azotobacter agile.
Приняв во внимание азотфиксирующую способность этих
трех штаммов, можно предположить, что более энергичные азотфиксаторы поглощают больше Мо.
-150
ОТДАЧА М о " В СРЕДУ
Наряду с опытами, показывающими поглощение
Мо, были проведены наблюдения над способностью культуры
отдавать Мо в среду. Радиоактивную культуру азотобактера в
количестве 1 г вносили в колбочку с 20 мл физиологического
раствора. После 24 ч пребывания в растворе в условиях, исключающих размножение, культуру отдентрифугировали. При определении Мо в культуре и в центрифужной жидкости получены
данные (табл. 49), показывающие, что клетки азотобактера могут отдавать поглощенный
Т а б л и ц а 49
молибден в среду, где он,
Отдача
Мо
клетками
азотобактера
по всей вероятности, может
быть использован последуКоличество
ющими генерациями бактеОбъект исследования
имп/мин
рий или растениями.
Данный процесс подобен
культура азо1290
динамике
радиоактивного Первоначальная
тобактера
фосфора, поглощаемого и Культура отцентрифугирован930
выделяемого в среду бактеная
200
риями (Котелев, Гаркавен- Физиологический'раствор после центрифугирования
ко, 1954; Ахромейко, Шестакова, 1958).
РЕУТИЛИЗАЦИЯ М о " РАСТЕНИЯМИ
Взаимоотношения между растениями и бактериями в отношении обмена микроэлементов совершенно не изучены и представляют определенный интерес. Поэтому были
проведены следующие исследования. Проростки яровой пшеницы «а бумажных поплавках помещали на дно большой пробирки с 15 мл воды. Туда же вносили в разных дозах (табл. 50)
культуру азотобактера, поглотившую М о " . Корни проростков
Находились вместе с азотобактером в воде. Поверхность зерен
пшеницы перед проращиванием предварительно стерилизовали.
Вся система пробирка — среда также была стерильной. Вода в
качестве среды была взята для более активного автолиза клеток бактерии. Анализу на радиоактивность подвергали зеленую
часть проростков. Результаты опыта представлены в табл. 50.
Данные опыта 1 подтвердили предположение о переходе Мо
из клеток азотобактера в ткани высшего растения. Однако отдача этого элемента происходила очень медленно. Через 4 суток в растение поступает незначительное количество Мо, пропорциональное внесенному количеству клеток азотобактера. Такое соотношение показывает, что Мо в растениях получен после
автолиза или выделения его из клеток азотобактера. Через 7 суток в растениях Мо гораздо больше, причем и количество его
•151
Т а б л и ц а
П о с т у п л е н и е М о из клеток а з о т о б а к т е р а в р а с т е н и е ( в
Вариант
опыта
1
2
3
4
5
Схема опыта
Растение (контроль)
Растение + азотобактер
То же
» »
» »
Импульсы в
3 млрд. клеток
первоначальной
культуры
азотобактера
Опыт 1
(без Мо)
Количество
клеток азотобактера, внесенное в среду
(млрд.)
50'
имп/мин)
Опыт 2
(внесен Мо)
Сроки анализа (в сутках)
«
2
5
18е
46
6
16
30
32
76
3
1,5
0,75
12
8
4
30
16
16
29
25
56
56
40
112
тоже относительно пропорционально количеству внесенных в
разных вариантах опыта клеток бактерии.
Опыт 2 был поставлен несколько иначе. При той ж е схеме,
что и в опыте 1, в каждую пробирку был внесен также и раствор Мо. Можно было предположить, что растение могло бы
ограничиться использованием неорганического соединения Мо.
Однако из полученных данных видно (варианты 2, 3, 4 опыта
2), что растение поглощает также Мо, бывший в клетках азотобактера. Особо отчетливо это обнаружено во второй срок исследования — на 5-е сутки. При этом данное явление наблюдается
только при больших количествах культуры азотобактера (варианты опыта 2, 3, 4). Весьма возможно, что Мо, высвобожденный из клеток бактерий, был в другой, более благоприятной для
растений форме соединения.
Отдача Мо клеткой азотобактера и поглощение его растением отмечены и в следующих опытах (табл. 51). Работу проводили на двух средах — голодном агаре и агаре Эшби — с целью
поставить культуру азотобактера в нормальные и неблагоприятные условия существования, исключающие размножение клеток
и способствующие более интенсивному протеканию их автолиза.
Опыт ставили в стерильных условиях с упомянутой агаровой
средой в количестве 10 мг на большую пробирку. На агар вариантов опыта 3 и 6 высевали азотобактер, содержащий Мо, и
проростки пшеницы, поверхность зерна которых была предварительно простерилизована. Анализу подвергали зеленые части
-152
Т а б л и ц а 51
Поступление Мо в растения (в имп/мин)
Номер
варианта
Схема опыта
Сроки испытания
(в сутках)
2
5
7
2
13
16
3
40
20
8
88
50
0
25
13
0
40
34
0
76
76
Агар Эшби
3
Растение (контроль)
Растение-)-Мо
Растение+азотобактер
4
5
6
Растение (контроль)
Растение+Мо
Растение+азотобактер
1
2
Голодный
агар
проростков растений. В варианты 2 и 5 вносили, кроме того,
раствор М о " .
При проведении опыта было видно, как корни растений проникают в агар и на них располагается азотобактер. Исследование радиоактивности молодых проростков показало (табл. 51),
что Мо попадает в растения уже через двое суток. Не исключена возможность попадания его и гораздо раньше, но мы проводили исследования начиная только со вторых суток, когда
проростки достигали определенной (величины. Мо поступал в
растения как из внесенного раствора, так и из клеток азотобактера. Усвоение Мо из внесенного раствора в первый период (на
вторые сутки) протекает более активно на голодной среде. Степень поглощения его из клеток азотобактера в этот период
почти равна на обеих средах (13—16 имп). На 5-е и 7-е сутки
начинает, вероятно, сказываться автолиз клеток и Мо оказывается больше в растениях на голодной среде (вариант опыта 6),
чем в среде Эшби (вариант 3).
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ М о " АЗОТОБАКТЕРОМ И РАСТЕНИЕМ
Как известно, Мо благоприятно влияет на продуктивность некоторых растений. Можно было предположить,
что в естественных условиях, при недостаточном его содержании в почве, может происходить конкуренция за него между
бактериями и растениями. Для выяснения этого вопроса был
поставлен опыт по той ж е методике, которая приведена в предыдущем исследовании. Азотобактер был выращен на обычной
(без Мо) среде. Раствор М о " и культуру азотобактера вносили
в пробирку с водой на дне. Корни проростков находились также
в этой воде. Схему и результаты двух опытов, проведенных с
•153
препаратами Мо разной удельной активности, приводим в
табл. 52.
Полученные данные двух опытов (табл. 52) свидетельствуют
о поглощении растением определенного количества Мо из среды.
Наличие в ней большого количества клеток азотобактера (варианты опыта 2 и 3) явно задерживают поглощение Мо растениями. Количество клеток в 1,5 и 0,75 млрд. уже мало влияет
на данный процесс.
Таблица
Конкуренция за Мо между азотобактером и растением
Номер
варианта
1
2
3
4
5
Схема опыта
Растение-}-Мо" (контроль)
Растение+Мо 9 ї -|-азотобактер
То же
» »
» »
Количество
внесенных
клеток
азотобактера
(млрд.)
3
1,5
0,75
Опыт 1
52
Опыт 2
Количество импульсов в
растениях
Сроки анализа (в сутках)
44
190
27
144
34
66
' 7
81
34
36
40
62
158
24
29
26
76
120
114
168
При проверке полученных данных в условиях естественной
почвенной среды проводили следующие исследования. В почву
двух типов (подзол и чернозем), помещенную в сосудики, вносили раствор соединения М о " в двух дозах: 12 и 20 мг на 100 г
почвы. Туда же вносили культуру азотобактера. Через 24 ч почву высевали крупными комочками на чашку Петри с агаром
Эшби. Спустя двое суток вокруг комочков можно было видеть
пышно развившиеся колонии азотобактера. Осторожно, чтобы
не затронуть почву, слизь культуры (3 млрд. клеток) была снята и подвергнута анализу на радиоактивность. Схема опыта и
результаты измерений представлены в табл. 53.
Культура азотобактера поглощала Мо из почвы, причем
выявить влияние типа почвы на. этот процесс не удалось. По-видимому, адсорбционные свойства почвы в данном случае не
влияли на поглощение Мо бактерией. Увеличение дозы Мо в
данном случае также не сыграло роли.
Испытывали также сравнительное действие стабильного и
радиоактивного молибдена на азотобактер и группу олигонитрофилов в отношении влияния этого микроэлемента на размножение и азотфиксацию бактерий. Можно было предположить, что
общность физиологических функций (фиксация азота) таких
•154
Т а б л и ц а 50'
Поглощение Mo азотобактером на почвы
(в имп/мин)
Вариант опыта
Азотобактер из
дозой 12 мг
Азотобактер из
дозой 20 мг
Подзол
Чернозем
32
35
31
34
почвы с
Мо
почвы с
Мо
бактерий, относящихся к различным родам, скажется в определенном влиянии на них Мо1. Полученные данные, приведенные
в табл. 54, подтвердили это предположение.
Т а б л и ц а 54
Влияние Мо на азотфиксацию и размножение азотфиксирующих бактерий
Количество фиксированного азота
на 1 г сахара (в мг)
Количество клеток
(в млн. на 1 мл
среды)
Вид
Без Мо
Pseudomonas rubigenosa
Bact. liquefaciens
Mycobacterium
vadosum
Вас. brevis
Micrococcus cinabareus
Mycobacterium
mibicum
Вас. polymyxa
Mycobacterium
lacticolum
tBact. radiobacter
Вас. glutinosum
Bact. agile
Bact. herbicola
Azotobacter croococcum
»
» штамм К
2,2
3,3
3,7
3,8
4,0
4,1
4,8
5,0
5,7
5,8
6,3
7,1
7,5
7,8
Мо
Мо радиоМо Мо радиостабильный активный стабильный активный
3,3
3,7
4,5
5,2
5,1
6,1
6,7
5,8
6,4
5,9
7,5
1,6
15,1
13,5
4,0
4,5
4,9
5,9
5,4
7,0
7,3
6,2
7,2
6,1
7,8
8,0
15,9
14,4
52
67
41
61
70
49
43
75
115
42
75
14
63
151
47
87
120
50
92
12
67
165
200
280
Стабильный Мо усиливал азотфиксацию почти всех видов
взятых в опыт бактерий. Однако азотфиксация у азотобактера
под влиянием Мо повышалась значительно больше, чем у других бактерий. У олигонитрофилов азотфиксация повышалась в
большинстве случаев (при действии стабильного Мо) с 12 до
40%, у азотобактера же — почти вдвое.
1
Названия испытанных видов приводили в таблицах.
-155
Интересно отметить положительное влияние радиоактивного
Мо на азотфиксацию тех же бактерий. Внесение такого Мо повысило интенсивность азотфиксации у всех 12 взятых в опыты
видов олигонитрофилов. Это увеличение различно у разных бактерий и колеблется в пределах 10—20% величины азотфиксации
под действием стабильного Мо. Что же касается азотобактера
(в опыт были взяты два штамма этой бактерии), то радиоактивный Мо также повысил его азотфиксацию, однако не в такой
мере. Нужно отметить, что положительное влияние Мо оказывает при применении его в микродозе. Повышение ж е дозы
свыше 50 иг/л начинает угнетать азотобактер. Олигонитрофилы
менее отзывчивы на повышение дозы Мо.
Наряду с азотфиксирующей способностью определялось такж е влияние радиоактивного Мо на размножение культур. Оказалось, что все бактерии, показавшие повышение азотфиксации,
лучше развивались в среде с радиоактивным Мо. Увеличение
количества клеток бактерий было относительно пропорционально большей азотфиксации культур. Наши данные были подтверждены исследованием Крыловой (1964), показавшей положительное влияние молибдена и ванадия на азотфиксацию некоторых видов азотобактера.
Таким образом, было показано, что:
1) клетки азотобактера поглощают из среды молибден;
2) молибден поглощается в значительно большей степени
молодыми, растущими, чем старыми клетками азотобактера;
3) покоящиеся молодые клетки азотобактера также активно
поглощают молибден;
4) молибден проникает в клетки различных штаммов и видов азотобактера в неодинаковом количестве;
5) часть поглощенного клетками азотобактера молибдена
выделяется в окружающую среду;
6) молибден, находившийся в клетках азотобактера, может
затем проникать в высшие растения;
7) развиваясь в почве, содержащей Мо, азотобактер использует его;
8) радиоактивный изотоп молибдена, применяемый в микродозе, оказывает положительное влияние на азотобактер и различные виды олигонитрофилов, повышая активность их размножения и азотфиксации.
І
ЧАСТЬ
VII
ДЕЙСТВИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ
НА КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ
И БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ
МИКРОФЛОРЫ РИЗОСФЕРЫ
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ
Действие микроэлементов на почвенную микрофлору изучалось в естественных условиях ее обитания в ризосфере растений. Исследования микрофлоры ризосферы с применением микроэлементов заключались в изучении качественных
и количественных ее изменений и корреляции этих изменений
с урожаем сельскохозяйственных культур. Указанные наблюдения проводились в полевых опытах с различными сельскохозяйственными растениями.
Полевые опыты ставили на опытном поле экспериментальной
базы Института микробиологии АН У С С Р «Феофания» в течение 6 лет в пятипольном севообороте по общепринятой методике
(Константинов, 1950). Почва — дерново-подзолистая. Были использованы следующие культуры, в двухгодичных опытах к а ж дая, по таким агрофонам:
Сорт
Предшественник
Озимая пшеница
Лютесценс 17
Овес на сено
Яровая пшеница
Лютесценс 62
Эспарцет
Сахарная свекла
Рамонская 0 , 6
Клевер
Кукуруза
Грушевская
Яровые
Картофель
Сеянец 36
Озимь
Растение
Удобрительный фон
10 т перегноя под пахоту
6 ц/га суперфосфата
и 3 ц/га калийной
соли
8 ц/га суперфосфата
и 4 ц калийной соли, 5 кг азота селитры в рядки
4 ц/га суперфосфата
и 4 ц/га калийной
соли
То
же
В схемы полевых опытов было включено изучение бора в
виде буры, молибдена — На 2 Мо0 4 , марганца — М п 5 0 4 . Имелось
•157
в виду выяснить сравнительное действие микроэлементов (Мо,
В, Мп) на почвенную микрофлору и урожай сельскохозяйственных растений, эффективность совместного применения микроэлементов и бактериальных препаратов (азотобактерина и фосфоробактерина)
и действие микроэлементов,
примененных
совместно с минеральными и органическими удобрениями. Микроэлементы брали в дозах: В — 3 кг/га, Мо — 3, Мп — 5 кг/га.
Дозы определяли по действующему началу микроудобрений.
. Бактериальные удобрения вносили по общепринятой инструкции. Фосфоробактерин (Киевского завода бактериальных удобрений) жидкий применяли в дозе 100 мл/га, или 40 млрд. клеток
на 1 га. Азотобактерин, изготовленный на штамме азотобактера
К, торфяной препарат, вносили из расчета 3 кг/га (около 100
млрд. клеток на 1 га) путем бактеризации семян. Дозы солей
В и Мо при совместном внесении с бактериальными удобрениями уменьшались до 2 кг/га.
В опытах с кукурузой и картофелем применяли гранулированный суперфосфат в дозе 40 кг/га действующего начала и
перегной сыпец в количестве 5 т/га. Как тот, так и другой вносили в лунки под упомянутые растения.
Средние пробы почвы для исследования микрофлоры брали
по диагонали делянок из ризосферы растений на глубине 10—
15 см с соблюдением стерильности. Пробы брали в такие фазы
роста растений: озимая пшеница — весеннее кущение, колошение, молочная зрелость; яровая пшеница — всходы, колошение,
молочная зрелость; кукуруза — период 4 листочков, выбрасывание метелок, начало налива зерна; сахарная свекла — период
3—4 листочков, образование розетки, смыкание рядов; картофель — всходы, цветение, начало образования клубней. Полученные урожайные данные различных растений статистически
обрабатывали.
Проводя исследования такого типа, необходимо было знать
количество микроэлементов в почве. Соответствующие анализы
изучаемых микроэлементов показали их наличие в таких количествах (определяли подвижные формы микроэлементов, количество которых отнесено к абсолютно сухой почве (в мг/кг):
Марганец — 203—359 (по методу Власюка и Горной,
извлечением 0,5 н. НгЭСи с нагреванием)
Молибден — 0,13—0,17 (роданитовым методом, по
Григу)
Бор — 0,56—0,54 (по методу Починка, извлечением
водой при нагревании с хинализарином)
Ц и н к — 1,54—1,99 (по Пейве и Ринькису извлечением
1 н. КС1)
Медь — 6,92—8,13 (по методу Секдела, модифицированному в Институте физиологии растений АН
УССР)
•158
Данные определения свидетельствуют о сравнительно больших количествах в почве .цинка и малых — молибдена. Количество бора и марганца соответствует таковому в большинстве
дерново-подзолистых почв.
Микробиологическая часть исследований охватывала вопросы:
1) общее количество бактерий (растущих в средах);
2) количество актиномицетов и микроскопических грибов;
3) динамика бактерий различных физиологических групп:
аммонификаторов, нитрификаторов, денитрификаторов, азотфиксаторов, бактерий аэробного и анаэробного разложения
клетчатки, маслянокислого брожения;
4) определение потенциальной биологической активности
микрофлоры почвы: аммонифицирующей, нитрифицирующей и
азотфиксирующей;
5) динамика нитратов и фосфорной кислоты в почвах, являющаяся в основном результатом происходящих биопроцессов.
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ДЕЙСТВИЕ БОРА, МОЛИБДЕНА,
МАРГАНЦА НА МИКРОФЛОРУ РИЗОСФЕРЫ РАСТЕНИЙ
Количественные изменения микрофлоры
после применения микроудобрений
В результате проведенных наблюдений удалось
обнаружить разницу, иногда значительную, в количестве микроорганизмов, обитающих в ризосфере. В табл. 55 представлены
данные по общему количеству бактерий, актиномицетов и грибов в 1 г почвы ризосферы разных растений.
Общее количество бактерий в ризосфере не одинаково. Так,
в ризосфере озимой пшеницы на контрольной делянке их обнаружено 2,5 млн., яровой пшеницы — 4,3, кукурузы — 3,9, сахарной свеклы — 4, картофеля — 2,4 млн. на 1 г.
Изменение этого количества по ф а з а м роста растений шло
в одном направлении почти для вСех растений: больше микроорганизмов обнаружено при втором взятии образцов, то есть
при цветении зерновых, перед цветением картофеля и образовании розетки листьев у сахарной свеклы. Почти на всех делянках, где были внесены микроудобрения, численность микрофлоры
увеличивалась в 1,5—2 раза. Особенно отмечены эти изменения
при втором взятии образцов почвы. Большее действие оказывал
молибден, затем марганец. Но в некоторых случаях эта последовательность нарушалась, и на первое место становился бор
или марганец.
Подобную картину наблюдали и в отношении актиномицетов. Однако в динамике этих микроорганизмов отмечены существенные различия в сравнении с бактериями. При всходах яро•159
Т а б л и ц а 50'
Действие микроэлементов на общее количество бактерий, актиномицетов
и грибов почвы (на 1 г почвы ризосферы)
Актиномицеты
(в тыс.)
Бактерии ( в млн.)
Растение
Грибы (в тыс.)
Вариант опыта
I
II
III
I
Озимая пше- Контроль
Бор
ница
Молибден
Маргане ц
2,5
3,5
4,5
2,9
3,5
4,5
7,0
3,0
1,8
3,5
3,8
2,3
1000
1600
1050
1600
1100 900
1800 1000
1600 1300
1800 1600
Яровая пше- Контроль
Бор
ница
Молибден
Марганец
4,3
5,6
6,5
6,0
4,7
6,0
12,0
5,1
2 , 7 Не
11,0 обна9,1 ружено
—
500 900
650 1500
850 1200
800 1600
Кукуруза
Контроль
Бор
Молибден
Марганец
3,9
6,2
6,6
4,9
4,5
6,9
7,5
4,9
2,9
2,8
3,7
2,9
55
105
80
100
Сахарная
свекла
Контроль
Бор
Молибден
Марганец
4,0
4,6
6,0
5,6
4,5
5,0
6,9
3,7
2,6
2,8
4,9
2,0
200
300
300
400
400 800
900 800
1100 1050
600 900
Контроль
Бор
Молибден
Марганец
2,4
2,3
3,8
2,9
3,7
4,8
4,8
3,4
2,0
2,2
2,6
2,9
200
400
400
400
1500 1600 180
1800 1600 280
2300 400 300
1630 1700 1400
Картофель
II
450
600
550
500
III
1050
1200
1000
1350
I
II
III
300
800
450
200
600
900
1200
300
150
100
190
130
Не исследовали
100
200
200
400
200
990
410
440
300 800
600 1200
500 800
400 600
600
600
800
100
190
300
520
400
—.
—
—
300
800
1100
400
П р и м е ч а н и е . В этой и последующих таблицах I, II, III обозначают:
I — первую исследуемую фазу роста, II — вторую, III — третью.
вой пшеницы эта группа микроорганизмов не была обнаружена,
а в ризосфере сахарной свеклы и кукурузы в этот же период
она была в малых количествах (55—200 тыс. на 1 г почвы).
Больше всего актиномицетов найдено в ризосфере озими
(1000 тыс. особей в 1 г). В последующих фазах роста растений
количество их увеличивается. Если в весенний период их было
значительно меньше, чем бактерий, то осенью численность этих
микроорганизмов почти одинакова. Актиномицеты меньше подвержены влиянию микроудобрений, чем бактерии, но все же и
на этой группе сказалось внесение микроэлементов. Численность
их увеличивается под влиянием всех трех элементов, но первое
место по силе действия занимают бор и марганец.
Положительное действие микроэлементов сказывается и на
плесневых грибах. Последние найдены в ризосфере озимой пше-160
I
ницы в больших количествах, чем у других растений, в меньших — у картофеля и кукурузы (300 тыс. на 1 г —у пшеницы,
180 — у картофеля, 100 тыс. на 1 г — у кукурузы). Как и у
бактерий, численность грибов увеличивается в период цветения.
Во все три периода роста грибов было больше на делянках с
молибденом и бором и в некоторых случаях — с марганцем.
Данные третьего взятия проб, отобранных при созревании
растений, мало отражали изменения в численности бактерий,
которые сглаживались к концу вегетационного периода. Активирующее микрофлору действие микроэлементов сказалось и на
бактериях различных физиологических групп.
Все микроорганизмы, осуществляющие основные процессы
круговорота азота, разлагающие и минерализующие органическое вещество, а также фиксирующие азот атмосферы, в той
или иной мере реагировали на внесение удобрений. В ризосфере
взятых растений на контрольной делянке количество аммонифицирующих бактерий в 1 г почвы было равно 1 млн. и только у
озимой пшеницы— 10 млн. Внесение микроудобрений повышало
их численность в 10 и 100 раз. Такое повышение количества бактерий этой группы в весенний период наблюдалось в ризосфере
у озимой пшеницы и кукурузы под влиянием бора и молибдена,
у сахарной свеклы и картофеля — всех трех элементов., Это
влияние продолжалось и в дальнейших фазах роста, несколько
варьируя в зависимости от растения.
Нитрифицирующие бактерии, найденные в количестве 10— "
1—0,1 тыс. на 1 г в ризосфере растений на контрольной делянке,
также увеличивались в численности в 10 раз у всех растений
при внесении молибдена и в большинстве случаев при внесении
других элементов.
Такое же действие микроэлементов обнаружено и в отношении денитрификаторов. Исключением являлась яровая пшеница,
в ризосфере которой наблюдалось уменьшение количества этих
бактерий при внесении бора и молибдена.
В почве данного участка («Феофания») на контрольной делянке азотобактер, находившийся, очевидно, в неактивном состоянии, не был обнаружен. Внесение молибдена активировало
его, и при первом взятии проб он был найден в ризосфере всех
растений, кроме яровой пшеницы. Кроме молибдена, такое ж е
действие оказал и бор в ризосфере озимой пшеницы и марганец — в ризосфере свеклы. На последующих этапах исследования эта бактерия в большинстве случаев не была выявлена.
Бактерии маслянокислого брожения больше реагировали на
микроэлементы в период цветения растений. Особенно это было
заметно в опытах с пшеницей, свеклой и картофелем. Что касается кукурузы, то повышение численности этих бактерий в ее
ризосфере относилось больше к периоду отрастания первых
листочков розетки.
11—368
161
Бактерии аэробного и анаэробного разложения клетчатки
реагировали на микроэлементы в ризосфере озимой пшеницы и
сахарной свеклы. В условиях ризосферы яровой пшеницы на
них действовали только бор и молибден. Что ж е касается кукурузы и картофеля, то особых изменений в количестве этих бактерий в их ризосфере не наблюдалось.
Биологическая активность почвы
Параллельно с приведенными исследованиями
определялась потенциальная активность почвенной микрофлоры
в отношении разложения органических веществ с образованием
аммиака, процессами нитрификации и азотфиксации. Опыты
проводили с почвой ризосферы упомянутых выше растений. Д а н ные приведены в табл. 56.
Таблица
56
Изменения биологической активности микрофлоры почв под
влиянием микроэлементов (МНз и ЫОз — в мг на 1 кг почвы,
N — в мг на 1 г внесенного сахара)
Способность почвы
Растение
Вариант
опыта
аммонифицирующая
нитрифицирующая
азотфиксирующая
гт,
N0,
N
I
II
I
II
I
II
Озимая пше- Контроль
Бор
ница
Молибден
Марганец
125
147
138
126
119
119
138
108
8,3
13,0
14,0
10,0
5,8
7,5
12,5
6,5
6,2
8,0
8,8
7,9
9,4
13,5
12,2
10,6
Яровая пше- Контроль
Бор
ница
Молибден
Марганец
42
90
105
81
20
65
45
52
9,1
14,0
13,0
12,0
10,0
27,0
29,0
18,0
7,8
8,7
9,0
9,0
6,1
8,6
8,1
7,9
Контроль
Бор
Молибден
Марганец
85
125
95
80
33
44
69
68
20,0
26,0
28,0
25,0
Контроль
Бор
Молибден
Марганец
127
159
173
152
109
109
109
92
16,0
20,0
16,0
20,9
Кукуруза
Сахарная
свекла
—
—
—
23,0
20,0
31,0
24,0
13,2
14,8
18,7
14,2
9,1
11,7
14,0
10,9
—
—
8,4
9,2
11,2
9,6
А м м о н и ф и к а ц и я . Процесс аммонификации проходил
наиболее активно в ризосфере сахарной свеклы и озими. Все
три взятые микроэлемента усиливали его. Особенно это отме•162
чено в первой фазе роста яровой пшеницы. При пересчете на
1 кг почвы контрольной делянки получено 42 мг ЫНз, на делянках ж е с микроудобрениями — 81, 90, 105. Что касается остальных культур, то величина аммонифицирующей способности доходила до 159—173 мг ЫН 3 при контроле 85—127 мг. На первом
месте по силе действия на микрофлору ризосферы яровой пшеницы и сахарной свеклы стоит молибден, влияние двух других
элементов почти одинаково. В ризосфере ж е озими и кукурузы
больше действовали бор, затем молибден. При втором взятии
проб действие микроэлементов остается четко заметным только
у яровой пшеницы и кукурузы.
Н и т р и ф и к а ц и я . То ж е можно сказать и о сопряженном
^ с аммонификацией процессе нитрификации. Более активно этот
процесс проходил в ризосфере кукурузы и свеклы. Действие
микроэлементов было большим в почве под пшеницей. Все три
элемента влияли на процесс с почти одинаковой силой. Во второй фазе роста усиление нитрификации от микроудобрений происходило в основном только в ризосфере пшеницы.
А з о т ф и к с а ц и я . Азотфиксирующая способность почв повышалась при внесении микроэлементов в меньшей степени, чем
предыдущие два процесса. Однако усиление азотфиксации под
влиянием удобрений достаточно показательно, особенно при
внесении молибдена. Так, в ризосфере Озимой пшеницы количество азота увеличивалось при пересчете на 1 г внесенного сахара до 7,9—8,8 мг при 6,2 мг в контроле, у сахарной свеклы — до
10,9—14,0 мг при 9,1 мг в контроле, у кукурузы соответственно
до 14,2—18,7 мг при контроле в 13,2 мг. Действие бора и марганца в этом случае было почти равным.
Показатели потенциальной биологической активности свидетельствуют о возможности значительного влияния микроэлементов на почвенную микрофлору при разных культурах севооборота.
Динамика нитратов и фосфорной кислоты
в почвах
Наряду с микробиологическими
проводились
агрохимические исследования в отношении динамики количеств
нитратов и подвижной фосфорной кислоты в почве опытных делянок (табл. 57). К&к известно, нитраты в ризосфере в период
вегетации растений обычно отсутствуют благодаря быстрому
использованию их растениями. Это также подтвердилось данными опытами: нитратов при втором и третьем взятии образцов
не обнаружено. Однако весной, в первый период роста, они найдены под сахарной свеклой, кукурузой и картофелем. Количество их повышено на делянках с внесением микроудобрений.
Так, под свеклой при внесении бора и марганца обнаружено
11*
*
163
Т а б л и ц а 50'
Динамика нитратов и фосфорной кислоты в почве под
влиянием микроэлементов (в мг на 1 кг почвы)
Р.о,
Нитраты
Растение
Вариант
опыта
I
Озимая •
пшеница
Контроль
Бор
Молибден
Марганец
Нет
Следы
7,5
Следы
Яровая
пшеница
Контроль
Бор
Молибден
Марганец
Следы
8,5
Следы
Следы
Контроль
Бор
Молибден
Марганец
10,0
11,1
18,1
13,1
Сахарная
свекла
Контроль
Бор
Молибден
Марганец
35
40
48
41
Картофель
Контроль
Бор
Молибден
6,0
Следы
Следы
Кукуруза
I
20
88
39
26
II
III
26
36
28
26
23
35
32
35
60
101
115
97 .
83
100
184
106
59
120
100
18,7
28,8
27
21
24
34
—
—
— ' .
—
—
86
80
120
109
65
59
66
62
31
40
82
30
42
63
—
— .
59
55
80
52
к
50
—
40—41 мг Ы0 3 на 1 кг почвы, при внесении м о л и б д е н а — 4 8 мг
при контроле в 35 мг. В ризосфере кукурузы найдено Ы0 3 соответственно 11, 13, 18 мг при контроле в 10 мг/кг.
Такой же эффект получен и в отношении фосфорной кислоты. Ее подвижные формы обнаружены в различных количествах
в зависимости от культур севооборота. Больше Р2О5 найдено
под яровыми и пропашными и меньше — у озими и кукурузы.
У всех культур, кроме свеклы, количество Р2О5 увеличивалось
на делянках с бором; подобное действие оказывал и молибден.
В период цветения растений разница сглаживается, но в культуре яровой пшеницы она достаточно показательна и в это
время.
Увеличение количеств растворимых форм фосфорной кислоты и накопление нитратов происходит, по-видимому, за счет
повышения активности микробиологических процессов, в частности нитрификации и бактерий, разлагающих органические и
неорганические соединения, содержащие фосфор.
Полученные урожаи сельскохозяйственных культур в боль-164
шинстве случаев коррелируют с наблюдаемыми изменениями в
биологических процессах. Данные об урожае опытных культур
приводим в табл. 58.
Таблица
58
Повышение урожая растений в условиях базы «Феофания» под влиянием
микроэлементов (в ц/га)
Прибавка на 1 га
%
Ч
Растение
Вариант опыта
Зерно Солона
Зерно Солома
Зерно
Солома
Точность
опыта
± Р % за
2 года
Яровая
пшеница
Контроль
Бор
Молибден
Марганец
10,0
10,6
11,1
11,0
16.5
17,7
18.6
18,3
0,6
1,1
1,0
1,2
2,2
1,8
6,0
11,0
10,0
7,2
13,3
10,0
±3,7%
±3,2%
Озимая
пшеница
Контроль
Бор
Молибден
Марганец
27,5
29,3
29,0
27,8
66,2
69,9
68,1
67,0
13
1,5
1,3
3,7
2,0
1,2
6,5
5,4
1,8
5,5
3,0
1,8
±3,2%
±3,3%
Контроль
Бор
Молибден
Марганец
Початки
47.1
51.2
52,9
49,0
Контроль
Бор
Молибден
Марганец
Корни
233
241
248
250
Контроль
Бор
Молибден
Марганец
Клубни
175
180
182
184
Кукуруза
Сахарная
свекла
Картофель
Стеб- Почат- Стеб- Почат- Стебки
ли
ки
ли
ли
104.1
111.2 4 , 2
8,9
7,1
6,8
122,4 5 , 9
12,5
18,3
17,6
113,2 2 , 0
4,2
9,1
4,0
Корни
Корни
8
15
17
3,4
6,7
7,3
±2,8%
±3,9%
±2,5%
—
Клубни
5
7
9
±3,3%
Клубни
2,6
4.0
5.1
±2,4%
±3,1
Как видно из приведенных данных, в условиях подзолистых
почв базы «Феофания» микроэлементы давали определенный
эффект. Их влияние больше сказалось на кукурузе и сахарной
свекле, чем на Других культурах. Все три взятых микроудобрения давали прибавку урожая. В зависимости от культуры эти
прибавки были различной величины. Так, прибавки зерна яровой пшеницы получены в пределах 1 ц/га, озимой — до 1,8,
кукурузы — 2—5,9 ц/га. Все полученные прибавки, даже относительно малые (яровая пшеница), представляют интерес для
сельского хозяйства страны, принимая во внимание простоту и
дешевизну применяемых микроудобрений.
•165
СОВМЕСТНОЕ ДЕЙСТВИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ
И БАКТЕРИАЛЬНЫХ УДОБРИТЕЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ
Участвуя в ферментативных процессах микроорганизмов, микроэлементы не могут не влиять на бактерии, используемые для изготовления бактериальных удобрительных
препаратов. Результатом этого влияния является повышение
действия препарата и получение больших урожаев сельскохозяйственных растений. О повышении действия нитрагина при
совместном применении его с молибденом сообщают Образцова
(1937), Афанасьева (1960).
Ратнер и Буркин (1959) указывают на высокую эффективность применения молибдена в посевах бобовых трав. Одни препараты нитрагина и азотобактерина давали прибавки урожая
в пределах 4—6%. На фоне же молибдена с гранулированным
суперфосфатом прибавки от препаратов повысились на 13—16%
(без учета фона). При совместном же действии обогащенного
молибденом гранулированного суперфосфата и бактериальных
препаратов урожай удвоился. Применение такого сочетания
привело к улучшению кормового качества сена — повысило содержание белка, каротинов и хлорофилла.
На торфяно-болотных и дерново-подзолистых почвах БССР
в опытах Института мелиорации АН БССР (Вавуло, 1958) применение молибдена с азотобактерином значительно повысило
урожай кукурузы: от азотобактерина повышение было равно
33%, при совместном внесении — 68%. Автор относит такое действие за счет повышения азотфиксирующей способности микрофлоры почв.
Повышение эффективности нитрагина в полевых и вегетационных опытах с люцерной, эспарцетом и викой в условиях
Армянской ССР наблюдали Асланян и Бабаджанян (1956).
К нитрагину добавляли бор, молибден и марганец в разных количествах. Наиболее постоянным и эффективным было действие
бора, повышающее урожай сена на 15—20%. Положительное же
действие марганца и молибдена было не постоянным.
Многочисленные исследования действия микроэлементов на
микрофлору почвы и бактериальные удобрения проведены в
условиях Эстонии Рахно (1950, 1953а, 1954, 1960). Им показано,
что микроэлементы Мо, В, Мп повышали эффективность азотобактерина и урожай зерновых культур. Автор пришел к заключению, что препараты азотобактера эффективны только на почвах, где содержится спонтанная культура этой бактерии, то есть
где имеются соответствующие условия для ее развития. Наряду
с благоприятным действием минеральных и органических удобрений на развитие азотобактера в почве оказывают также влияние и микроудобрения. Автор предлагает в качестве удобрительных препаратов смеси органических веществ и микроэлементов,
•166
которыми обрабатывают семена растений при посевах с целью
создания благоприятных условий для развития почвенной полезной микрофлоры. Испытание таких смесей показало увеличение количества азота в почве, нитрифицирующей и азотфиксирующей микрофлоры (Рахно, 1961).
Широкие исследования с применением совместного действия
микроэлементов и бактериальных удобрений проведены в Институте физиологии растений АН УССР (Власюк, Лисовал,
1960). Внесение марганца повышало действие азотобактерина и
фосфоробактерина в отношении сахарной свеклы, кукурузы и
озимой пшеницы.
Совместное действие бактериальных удобрений азотобактерина и фосфоробактерина с микроэлементами наблюдалось нами на нескольких растениях. Схема микробиологических исследований та же, что и в предыдущем разделе. Найденные изменения в общем количестве бактерий и актиномицетов приведены
в табл. 59.
Под влиянием азотобактерина и фосфоробактерина общее
количество бактерий и актиномицетов в ризосфере всех растений несколько увеличивается. Это увеличение колебалось в пределах 50% в зависимости от растения. Совместное внесение
азотобактерина и молибдена увеличивало численность микроорганизмов в два раза. Несколько слабее было положительное
действие бора.
Подобное действие на почвенную микрофлору наблюдалось
и при внесении фосфоробактерина под кукурузу. В 1 г почвы
контрольной делянки в ризосфере обнаружено 3,9 млн. бактерий
и 600 тыс. актиномицетов. Внесение фосфоробактерина усилило
рост микроорганизмов, и их численность повысилась до 4,6 млн.
бактерий и 800 тыс. актиномицетов. При добавлении молибдена
и бора найдено соответственно 6,8—5,9 млн. и 900 тыс.
Под влиянием этих удобрений повысилось также в почве
ризосферы число олигонитрофилов. Особенно заметно на этой
группе бактерий влияние молибдена и азотобактерина.
Численность бактерий различных физиологических групп
также повышалась при совместном внесении удобрений, причем
это увеличение количества микроорганизмов наблюдалось в течение всего вегетационного периода. Так, у большинства испытанных растений в их ризосфере повышалась численность аммонифицирующих и нитрифицирующих бактерий до 10 раз. Особенно это наблюдалось в ризосфере кукурузы и картофеля.
Несколько меньше проявилось действие совместного внесения
на группу денитрифицирующих бактерий. В ризосфере яровой
пшеницы и картофеля количество этих бактерий изменялось
мало. В ризосфере же свеклы, озими и кукурузы (на делянке с
фосфоробактерином) численность денитрификаторов также увеличилась в 10 раз.
•167
Т а б л и ц а 50'
Общее количество бактерий и актиномицетов в почве ризосферы
при совместном внесении бактериальных удобрений и микроэлементов (на 1 г почвы ризосферы)
Бактерии
Растение
(в млн.)
Вариант опыта
Актиномицеты
(в тыс.)
I
II
I
II
Озимая
пшеница
Контроль
Азотобактерин
Азотобактерин+молибден
Азотобактерин+бор
2,5
3,2
4,1
3,2
3,5
4,3
6,5
4,9
1000
1200
1800
1100
1100
1600
3000
2000
Яровая
пшеница
Контроль
Азотобактерий
Азотобактерин+молибден
Азотобактерин-}- бор
4,3
6,2
8,5
5,6
4,7
6,7
8,3
5,6
Не
обнаружено
500
800
1200
800
Кукуруза
Контроль
Азотобактерин
Азотобактерин+молибде
Азотобактерин+бор
Фосфоробактерин
Фосфоробактерин+молибде н
Фосфоробактерин+бор
^
3,9
3,4
6,8
3,9
4,6
6,8
5,9
4,5
6,1
7,2
7,6
5,3
7,0
6,9
600
700
900
900
800
900
900
900
1500
1200
1300
1500
1400
1400
Сахарная
свекла
Контроль
Азотобактерин
Азотобактерин+ молибден
Азотобактерин+бор
4,0
7,0
9,0
6,5
6,0
6,8
7,7
7,3
400
700
800
1100
700
1400
1500
1200
Картофель
Контроль
Азотобактерин
Азотобактерин+молибден
4,8
5,7
6,7
6,5
7,2
9,0.
500
600
1000
3500
3600
6000
Действие бактериальных удобрений в отношении азотобактера было положительным. Отсутствие последнего отмечено на
контрольных делянках; при внесении азотобактерина комочки
почвы из ризосферы растений этих делянок, высеянные на среду
Эшби, начали обрастать азотобактером. При внесении одного
азотобактерина получено 20—25% комочков обрастаний, при
совместном внесении азотобактерина с бором и молибденом
число комочков, обросших азотобактером, увеличилось соответственно до 48—75%. Более активно по фону азотобактерина
действовал молибден. Наличие азотобактера обнаружено также и при втором взятии проб.
Влияние микроэлементов и бактериальных удобрений на маслянокислые бактерии сказалось главным образом весной. Везде,
где были внесены эти удобрения, количество бактерий маслянокислого брожения увеличивалось.
-168
{
Численность бактерий аэробного и анаэробного разложения
клетчатки, обнаруженных в данном опыте, незначительна и характеризуется спадом их количества от первого взятия проб до
третьего. Внесение микроэлементов, как и бактериальных удобрений, мало влияло на эту группу бактерий.
Потенциальная биологическая активность почвы при внесении бактериальных удобрений с микроэлементами усиливалась
(табд. 60). Относительно больше сказывалось такое удобрение
на процессах нитрификации и азотфиксации, чем на аммонификации. Микрофлора ризосферы яровой пшеницы более активно реагировала на совместное внесение, чем микрофлора ризосферы свеклы. Так, при внесении одного азотобактерина получено 51 мг Г\1Нз на 1 кг почв, при добавлении же бора — 63,
молибдена — 83 мг аммиака, то есть аммонифицирующая- способность усиливалась в Д,5—2 раза. В ризосфере свеклы это
увеличение было только в 1,5 раза. Такие же изменения наблюдались и в процессах нитрификации.
Т а б л и ц а 60
Биологическая активность микрофлоры почвы при совместном внесении
бактериальных удобрений и микроэлементов (1ЧНз и Ы0 3 — в мг на 1 кг
почвы, N — в мг на 1 г внесенного сахара)
Способность почвы
Растение
Вариант опыта
аммонифицирующая
нитрифицирующая
азотфиксирующая
ГШ,
N0,
N
I
II
I
II
I
II
Яровая
пшеница
Контроль
Азотобактерин
Азотобактерин-!- молибден
Азотобактерйн+бор
42
51
83
63
20
26
42
37
9,0
12,0
18,0
15,0
10,0
14,0
28,0
26,0
8,8
11,7
19,0
12,8
6,4
8,6
8,6
7,1
Сахарная
свекла
Контроль
Азотобактерин
Азотобактерин+молибден
Азотобактерин+бор
127 ,
150
180
163
109
100
120
110
16,0
24,0
27,0
28,0
23,0
20,0
35,0
26,0
9,1
18,7
19,0
19,5
8,4
9,2
9,8
8,7
Азотфиксирующая способность микрофлоры ризосферы'обоих
взятых растений усиливалась в большей степени, чем вышеприведенные процессы. Так, у свеклы азотфиксация усиливалась в
два раза на всех делянках, где был внесен азотобактерин.
У пшеницы такое высокое действие наблюдалось только на делянках, где был внесен азотобактерин с молибденом.
Агрохимические показатели определений нитратов и подвижных соединений фосфорной кислоты (табл. 61) также подтверждают благоприятное действие совместного внесения удобрений^
•169
на микрофлору. Количество нитратов в почве ризосферы обоих
растений увеличивалось. Особенно это заметно на делянках с
внесением азотобактерина и молибдена. То же наблюдалось и
с Р2О5 в ризосфере пшеницы. Однако в ризосфере свеклы количество Р2О5 несколько уменьшено. Возможно, что в данном
случае происходит большее поглощение фосфора внесенной и
местной, активированной микрофлорой.
Т а б л и ц а 61
Динамика нитратов и фосфорной кислоты в почве
ризосферы при совместном внесении бактериальных
удобрений и микроэлементов (в мг/кг почвы)
Вариант опыта
Растение
Нитраты
I
Яровая
пшеница
Контроль
Следы
Азотобактерин
6,2
Азотобактерин^ молибден 13,5
Азотобактерин-)-бор
6,6
Сахарная
свекла
Контроль
Азотобактерин
Азотобактерин+молибден
Азотобактерин+бор
16,0
17,0
21,0
7,0
Р2О5
I
II
60
75
115
103
83
110
150
214
86
87
85
89
65
48
56
56
Полученный урожай опытных растений подтвердил благоприятное действие совместного внесения бактериальных удобрений с микроэлементами. Данные урожайности приводим в
табл. 62.
Действие бактериальных удобрений на урожай озимой и яровой пшеницы и кукурузы было более эффективно при совместном внесении с микроэлементами. Подобные результаты были
получены и другими исследователями в иных условиях применения бактериальных препаратов (Рахно, 1961; Ройзин и Эзрух,
1956).
г
СОВМЕСТНОЕ ДЕЙСТВИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ
С С У П Е Р Ф О С Ф А Т О М И ОРГАНИЧЕСКИМИ УДОБРЕНИЯМИ
В данном опыте, как и в предыдущих, результаты
микробиологических исследований показали положительное влияние микроэлементов на ризосферную микрофлору. Количественные изменения последней в значительной степени зависели
от того, с каким компонентом (суперфосфат или перегной) они
были внесены (табл. 63).
На делянках с внесением удобрений (суперфосфата и перегноя) количество бактерий и актиномицетов увеличивалось в
•170
Т а б л и ц а 50'
Урожай растений под влиянием совместного внесения бактериальных
удобрений и микроэлементов (в ц/га)
Прибавка урожая
%
ц/га
Растение
Вариант опыта
Зерно Солома
Зерно Солома
Зерно
Солома
Точность
опыта
± Р % за
2 года
Контроль
Озимая
пшеница Азотобактерин
Азотобактерин+
молибден
Азотобактерин+
бор
27,5
28,8
30,2
66,2
68,2
70,2
1,3
2,7
2,0
4,0
4,7
9,9
3,0 ± 3 , 4 %
6,0 ± 2 , 1 %
29,3
68,7
1,8
2,5
6,5
3,8
Контроль
Азотобактерин
Азотобактерин+
молибден
Азотобактерин+
бор
10,0
11,2
12,2
16,£
18,0
19,2
1,2
2,2
1,5
2,7
12,5
22
7,5
16
11,7
18,2
1,7
1,7
17
10
Яровая
пшеница
Кукуруза Контроль
Азотобактерин
Азотобактери н +
молибден
Азотобактерин-|бор
Фосфоробактерин
Фосфоробактерин+
молибден
±2,6%
Л
Початки
47,0
50,3
52,1
Стеб- Почат- Стеб- Почат- Стебли
ки
ли
ки
ли
—
—
—
—
104,1
109,3 3 , 3
4,3
7,0
4,1 ± 2 , 2 %
114,1 5 , 1
10,0
10,8
9,6 ± 2 , 6 %
51,0
—
4,0
52,7
54,5
114,0
121,0
5,7
7,5
—
10,0
12,0
-
8,5
і—
12,1
16,0
9,6
11,4
период отрастания листьев кукурузы и при ее цветении. То же
наблюдалось и в ризосфере картофеля. При добавлении к этим
удобрениям микроэлементов численность микрофлоры возрастала еще больше. Однако это увеличение не одинаково для этих
двух растений. В то время как в ризосфере кукурузы оно было
почти равным по обоим фонам, у картофеля по фону перегноя
численность бактерий оказалась гораздо меньшей, чем по фону
суперфосфата.
Количество бактерий разных физиологических групп увеличивалось на делянках с внесением суперфосфата и перегноя.
При добавлении микроэлементов численность аммонификаторов,
нитрификаторов и маслянокислых бактерий в ризосфере кукурузы и картофеля увеличивалась до 10—100 раз. Таким образом,
действие микроэлементов было заметно и по фону внесенных
удобрений.
-171
Т а б л и ц а 50'
Влияние совместного внесения микроэлементов
с суперфосфатом и органическими удобрениями
на количество бактерий и актиномицетов в почве
ризосферы (на 1 г почвы)
Общее количество
бактери й
(в млн. )
Вариант опыта
Ризосфера
I
І I
I
3,9
4,8
5.4
5,6
6.5
4.5
5.6
6,5
6,3
6,9
360
600
800
1000
1200
600
400
500
400
600
6,5
500
5,8
500
1 0 , 0 ' 600
12,0 1200
14,0 1600
800
800
1600
1800
1
Iі
кукурузы
Контроль
Суперфосфат
Су перфосфат+молибден+ бор
Перегной
Перегной+молибден+бор
ч Ризосфера
актиномицетов
( в тыс.)
картофеля
Контроль
Суперфосфат
Суперфосфат+молибден+бор
Перегной
Перегной+молибден+бор
4,8
5,5
9,0
9,5
9,8
Несколько меньшее влияние наблюдалось в отношении денитрификаторов. Количество бактерий этой группы увеличивалось в 10 раз только при внесении микроэлементов с суперфосфатом. На фоне же перегноя количественных изменений денитрификаторов от внесения микроэлементов не происходило.
Азотфиксирующая микрофлора ризосферы также активировалась при совместном внесении указанных удобрений, особенно
при внесении перегноя с микроэлементами; в этом случае интенсивность обрастания комочков почвы азотобактером возрастала.
Изменения в количестве бактерий наблюдались также и в
группе олигонитрофилов. Учет их численности в ризосфере разных растений показал увеличение в зависимости от внесенного
микроэлемента, а также фона, по которому последний был внесен. Данные исследования приведены в табл. 64.
При внесении Мо увеличение количества олигонитрофилов
в ризосфере кукурузы было большим, чем при внесении В и Мп.
В ризосфере озимой пшеницы больше действовал марганец.
Микроэлементы усиливали развитие данной группы бактерий
при внесении их по фону суперфосфата и перегноя. По-видимому, существует зависимость между действием микроэлементов
и фосфорным питанием микроорганизмов, при усилении которого увеличивается и влияние микроэлементов. Данные по биоло-172
Т а б л и ц а 50'
Количество олигонитрофилов в ризосфере
сельскохозяйственных растений (в тыс. на 1 г почвы)
Кукуруза
Вариант опыта
Контроль
Суперфосфат
Суперфосфат-(-молибден-)-бор
Перегной
Перегной -)- молибден+бор
Молибден+бор
Контроль
Бор
Молибден
1020
1150
1250
1540
2520
1320
1010
1740
2780
1100
1620
2250
Картофель
I
ІI
790
980
1310
1150
1650
900
960
1160
1660
1000
1000
1100
Озимая
пшеница
Кукуруза
I
I
500
800
1000
320
800
1500
гической активности почвы ризосферы взятых растений приведены в табл. 65.
В ризосфере кукурузы и картофеля добавление в почву микроэлементов активировало процессы превращения
азотных
соединений. Особенно это можно было отметить при совместном
внесении микроэлементов с суперфосфатом. В этих вариантах
опыта аммонифицирующая и азотфиксирующая способность
почв повышалась почти в равной, а в некоторых случаях — в
большей мере, как и при внесении микроэлементов с перегноем.
Также наблюдалось повышение активности нитрифицирующей
микрофлоры.
Благоприятное влияние на процессы нитрификации выразилось в накоплении нитратов в почве, которые были обнаружены
в первой фазе роста на делянках со смесями суперфосфат+
-{-микроэлементы и перегной+микроэлементы.
Кроме нитратов на этих же делянках в первый период роста
растений обнаружено значительное количество леЛсорастворимой фосфорной кислоты, доходящее до 154—334 мг на 1 кг почвы. Наличие таких форм фосфатов в меньших количествах было
обнаружено и в последующие этапы исследований.
В результате проведенных опытов получены следующие данные урожая взятых культур (табл. 66). Применение микроэлементов дало прибавку урожая початков с 3,2 до 6,5 ц/га — в
зависимости от компонентов, с которыми их вносили. При сов-173
)
Т а б л и ц а 50'
Биологическая активность почв при внесении микроэлементов
с суперфосфатом и перегноем (ИН 3 и N03 — в мг на 1 кг почвы,
N — в мг на 1 г внесенного сахара)
Способность почвы
Растение
Вариант опыта
аммонифи- нитрифици- азотфиксирующая
рующая
цирующая
МНз
NO a
N
I
I
I
Кукуруза
Контроль
Суперфосфат
Суперфосфат+бор+молибден
Перегной
Перегной+бор-)-молибден
105
169
260
350
470
167
180
200
274
353
9,0
10,8
17,8
12,8
15,6
Картофель
Контроль
Суперфосфат
Су перфосфат бор+мо либ ден
Перегной
Перегной+бор+молибден
156
209
378
292
392
130
138
147
260
349
8,1
7,0
18,1
14,1
18,1
,
местном внесении с суперфосфатом эффективность микроэлементов увеличивалась на 5 ц/га, с органическими удобрениями — на 6,5 ц/га. Подобный эффект наблюдался и на картофеле. Прибавка с 6 ц/га повышалась до 10 и 15,1 ц/га.
Таким образом, совместное внесение суперфосфата и микроэлементов является эффективным приемом для
развития
микрофлоры и повышения урожайности сельскохозяйственных
культур.
Аналогичная картина получена и при применении микроэлементов с органическими удобрениями. Как известно, навоз и перегной имеют значительное количество различных микроэлементов (Демолор, 1961). Казалось бы, что при внесении такого рода
удобрений растения и микроорганизмы не будут реагировать на
микроэлементы. Однако применение бора и молибдена по фону
упомянутого перегноя было эффективным.
Подобные данные получены при использовании бора при
компостировании местных удобрений и применении этих удобрений под растения. Бор способствовал уменьшению потерь органического вещества и азота, а также повышал эффективность
компоста (Вышинский, 1959).
Проведенные исследования почвенной микрофлоры показали
определенное влияние на нее в условиях дерново-подзолистой
почвы микроэлементов, внесенных под разные растения. В большинстве случаев численность исследуемых микроорганизмов
-174
Т а б л и ц а 50'
Урожай кукурузы и картофеля при совместном внесении
микроэлементов с суперфосфатом и перегноем (в ц!га)
Прибавка урожая
початков кукурузы
картофеля
Вариант опыта
общая
Контроль. Урожай на 1 га
Суперфосфат
Суперфосфат+бор+молибден
Перегной
Перегной-)-бор+молибден
Бор+молибден
54
5
10,0
11,0
17,5
3,2
от микроэлементов
по фону
—
5,0
—
6,5
3,2
'
общая
192
5,2
15,3
14,0
29,1
6
от микроэлементов
по фону
10,1
15,1
6
П р и м е ч а н и е . Точность опыта с кукурузой за 2 года Р = ± 2 , 6 % , ± 2 , 1 % ; точность опыта с картофелем Р =
= ±3,7%, ±3,7%.
увеличивалась. Это наблюдалось как у бактериального, так и у
грибного и актиномицетного населения почвы. Количество микроорганизмов возрастало в 1,5—2 раза, а в некоторых случаях
и больше. Бактерии были более отзывчивы на влияние микроэлементов, чем актиномицеты. Число последних, а также грибов
было подвержено меньшим изменениям, но и на них сказалось
упомянутое влияние.
Примененные микроэлементы действовали в различной степени в зависимости от микроэлемента и растения, в ризосфере
которого находилась исследуемая микрофлора. Большее влияние
оказывали молибден и марганец в сравнении с бором. Сильнее
реагировали на микроэлементы микроорганизмы ризосферы сахарной свеклы и кукурузы. По-видимому, ризосфера растений в
данном случае является определенным фактором, отражающимся на действии микроэлементов. Возможно, что в данном
случае играют роль состав корневых выделений растений, изменения влажности и структурности почв или какие-либо другие факторы, относящиеся к условиям их произрастания.
Как известно, состав корневых выделений неодинаков у разных растений. Микроэлементы способны образовывать различные комплексы с органическими соединениями. Можно предположить, что в данном случае возникают такие комплексы, состав
которых зависит от разнообразия корневых выделений. Эти образующиеся соединения могут играть определенную роль — как
положительную, ^так и отрицательную — при использовании их
почвенными микроорганизмами. Кроме того, по данным некоторых исследований (Березова с сотр., 1965), в ризосфере и на
-175
корнях отдельных видов растений развиваются особые комплексы микрофлоры, обладающие различными физиологическими
особенностями. Так, на корнях свеклы в определенные периоды
преобладают денитрификаторы и флюоресценты, на корнях кукурузы — фосфорные бактерии. По-видимому, эти различные
группы бактерий нуждаются в определенных микроэлементах.
Отсюда может возникать наблюдаемое в опытах явление — влияние определенных микроэлементов в ризосфере отдельных растений.
Изменения в численности микрофлоры отмечены и на различных физиологических группах" бактерий, обнаруженных в
ризосфере растений. Больше реагировали на микроэлементы
бактерии, принимающие участие в круговороте азота, меньше —
разлагающие клетчатку и бактерии маслянокислого брожения.
Данное явление в значительной степени зависит от сопряженности проходящих в почве процессов. Так, повышение количества
т а р и ф и к а т о р о в может зависеть как от непосредственного влияния микроэлементов, так и отчувеличения от того же действия
продуктов процесса аммонификации.
Различия в действии отдельных микроэлементов на различные группы микроорганизмов, по-видимому, также обусловлены
функциональными особенностями последних. Их различные
функции основаны на соответствующей ферментативной деятельности. И, естественно, она в отдельных ферментных процессах проявляется влиянием различных микроэлементов. Так, например, молибден влияет на размножение и усвоение азота
азотфиксирующими бактериями, в частности азотобактера, и
слабо действует на не усваивающих или мало усваивающих
азот актиномицетов.
Интересно действие молибдена, а в некоторых случаях марганца и бора, на размножение азотобактера, которого без этих
микроэлементов нельзя было выявить в данной почве. Такая
активация этой бактерии свидетельствует об усилении процессов
азотфиксаций атмосферного азота. Это подтверждается также
опытами с действием микроэлементов на биологическую активность микроорганизмов почвы в отношении аммонификации,
нитрификации и азотфиксации. Потенциальная активность данной микрофлоры почти во всех случаях повышалась под действием микроэлементов.
При внесении микроэлементов увеличивалось количество
олигонитрофилов, что также свидетельствует об усилении процессов связывания атмосферного азота.
Оптимальные условия для развития микроорганизмов создавало совместное внесение микроэлементов с бактериальными
удобрениями. Под влиянием микроэлементов улучшалась приживаемость внесенного с азотобактерином азотобактера, азотфиксирующая способность почв значительно повышалась, дей•176
ствие бактериальных удобрений сказывалось более эффективным.
Обнаруженная эффективность применения микроэлементов
совместно с суперфосфатом особенно сказывалась на усилении
биологических процессов превращения азотистых веществ почвы.
Действие микроэлементов в значительной степени зависело
также от фона применяемых удобрений. Несмотря на то, что
обычно в органических удобрениях (перегное) имеется определенное количество микроэлементов, применение в опытах молибдена и бора по фону этих удобрений также сказалось положительно на развитии микрофлоры ризосферы растений. Параллельно с активностью микрофлоры обнаружено увеличение в
почве усвояемых форм азотных соединений (нитратов) и фосфорной кислоты.
Учет урожая опытных растений показал определенную корреляцию между повышением урожая зерна, соломы, корне- и
клубнеплодов, початков кукурузы и повышением биологической
активности почвы под действием микроэлементов. Прибавки
урожая колебались в определенных границах, достигая 16% и
больше, и зависели от применяемого микроэлемента, удобрительного фона и других факторов. Такое повышение урожайности
различных растений на дерново-подзолистой почве имеет несомненное практическое значение и ценность для сельского хозяйства.
К числу факторов, влияющих на действие микроэлементов,
относятся также метеорологические условия. Так, в наших опытах с яровой пшеницей в засушливую весну и лето наблюдалось меньшее их действие как на микрофлору, так и на урожай
растения. В большой мере эффективность микроудобрений зависит от содержания микроэлементов в почве (Власюк, 1965).
В формировании урожая по всем вышепредставленным данным большое участие принимает микрофлора почв в связи с
положительным действием на нее микроэлементов. Последнее
не исключает их непосредственного действия на растения. Повидимому, эти оба процесса закономерны в естественных условиях при росте растений и имеют место при применении микроудобрений. В какой мере преобладает тот или иной путь воздействия микроэлементов, могут показать только дальнейшие
исследования.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ В ПОЧВАХ
Отзывчивость некоторых грибов и бактерий на
микроэлементы послужила основой для разработки методов определения микроэлементов Мп и Си в почве. Критерием этого
метода было отсутствие роста тест-организма в среде без мик12—388
177
роэлемента, наличие которого возмещалось навеской почвы. Степень роста организма зависела от величины навески. Мульдер
(Mulder, 1939, 1948) определял содержание меди в почве с помощью Aspergillus
niger. Этот же гриб использовали Веттер
(Wetter, 1954), Шеффер с -сотрудниками (Scheffer, Kloks, Hünerhoff, 1957) и другие для определения меди в почве, а Николас (Nicholas, 1 9 5 2 ) — в биологическом материале. Результаты
таких лабораторных определений согласовывались с результатами полевых и вегетационных определений.
Однако несколько позже Мульдер и Герретсен (Mulder
a. Gerretsen, 1952) нашли Aspergillus niger неудовлетворительным тестом для данного метода, поскольку образование грибом
кислоты увеличивало количество усвояемых Си и Мп.
Бентли с сотрудниками (Bentley, Snell, Phillips, 1947) использовали для определения марганца бактериальный тест —
Lactobacillus
arabinosus.
Д л я установления наличия ванадия в питательных веществах Хатнер (Hutner, 1958) предложил использовать Ochromonas
malhamensis.
)
ЧАСТЬ
VIII
СВЯЗЬ МЕЖДУ ДЕЙСТВИЕМ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ
НА МИКРООРГАНИЗМЫ
И РОСТОМ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ
Полученные результаты действия микроэлементов «а биологические свойства микроорганизмов (изменения наследственных свойств, ферментативной активности, образования
биологически активных веществ) и другие важные функции клетки свидетельствуют о возможности коррелятивной связи этих
изменений с действием микроорганизмов на сельскохозяйственные растения. Последнее подтверждено полевыми опытами, в
которых прибавки у р о ж а я растений в определенной мере соответствовали изменениям в активности и количестве микрофлоры.
Однако интересно было получить непосредственное доказательство такой взаимосвязи в ряду микроэлементы
микроорганизмы -V растения. Данные, подтверждающие такие взаимоотношения,
получены
нами в лабораторных . опытах
со
стерильными культурами, а т а к ж е в вегетационных опытах.
Прежде всего надо было показать поступление микроэлементов, предварительно использованных микроорганизмами, в
растение, то есть их реутилизацию.
Роль микроорганизмов в минеральном питании растений, в
том числе и в использовании ими микроэлементов, показана
многими исследованиями. Она чрезвычайно важна, поскольку
микроорганизмы подготавливают в почве усвояемые формы различных соединений микроэлементов для растений. С другой стороны, микроэлементы могут поступать в растения после контакта с микробной клеткой. Пути такого использования растениями
микроэлементов в качественном и количественном отношении
не ограничены, принимая во внимание огромное количество микроорганизмов, населяющих ризосферу, и разнообразие их функций.
Применение радиоактивных изотопов в исследованиях позволило проследить динамику фосфора, серы, передающихся
растению из клеток бактерий. Эти элементы в виде удобрений,
аминокислот или витаминов, внесенные в почву или среду для
бактерий, поступали в клетки последних, из которых, постепен• 12*
*
179
но высвобождаясь в процессах метаболизма, затем усваивались
растениями (Шавловский, 1953, 1954;. Котелев и Гаркавенко,
1954; Смалий, 1956; Ахромейко и Шестакова, 1958).
Такого рода динамика молибдена была показана в наших
опытах с азотобактером. Поглощенный этой бактерией, М о "
поступал затем в среду и в проростки растений в процессе их
роста.
Последовательный переход М о " от бактерий к растению был
также подтвержден рядом приведенных ниже опытов с другими
микроорганизмами. Так, были выделены из ризосферы пшеницы
и кукурузы многочисленные виды бактерий, из которых отобраны общие для взятых растений, растущие на соответствующей
среде. Эти виды (табл. 67) выращивали на синтетической среде
№ 1 Красильникова с добавлением М о " . При дальнейших исследованиях в клетках всех этих видов был обнаружен М о " .
Количество его, судя по импульсам, было неодинаково у разных
ЕИДОВ и колебалось в относительно нешироких пределах — 1 : 2 .
Яровая
пшеница
Овес
1
Вас.
megaterium
2
Вас. glutinosus
3 ' Вас.
oligonitrophilus
4
My cob act. vadosum
5
Ps. fluorescens
6
Bact. herbicola
7
Bact. agile
8
Ps. radiobacter
9
Ps. sinuosa
Контроль (без бактерий)
Кукуруза
Вид
Озимая
пшеница
Номер
культуры
Т а б л и ц а 67
Поступление Мо" из клеток бактерий в проростки растений
(количество имп/мин на навеску 50 мг ткани проростков)
30
32
39
14
22
28
35
28
35
2
39
39
33
45
36
29
40
36
37
4
28
28
47
36
24
17
26
33
39
4
36
25
47
34
23
22
35
30
44
5
Эти микроорганизмы суточного возраста были внесены в
стерильные культуры проростков различных растений, выращиваемых в больших пробирках с 15 мл среды Прянишникова. Поверхность семян растений была простерилизована обработкой
Нг0 2 и вся система пробирка — растение — среда выдерживалась стерильно. Бактерии вносили в количестве 20 млрд. клеток
каждого вида на пробирку под проростки пятидневного возраста.
Через три дня после внесения бактерий производились анализы на радиоактивность растений, то есть на поступление М о "
в ткани проростков.
Оказалось, что все растения через 3 дня после внесения бакф
•180
\
терий в той или иной мере содержали М о " . Из четырех растений несколько больше его поглотила кукуруза.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том,
что все взятые виды бактерий поглощали М о " , что показывает
общность данного явления для почвенных бактерий; в процессе
их метаболизма этот элемент выделялся в среду. Возможно также предположить, что в среду выделялась только часть поглощенного молибдена, параллельно же клетки усваивали из среды
новые количества этого элемента, необходимые им для некоторых биологических процессов. Выделенный из клеток молибден
поглощался растениями, в данном случае проростками озимой
и яровой пшеницы, кукурузы, овса.
На примере М о " можно думать об аналогичном процессе с
другими видами микроэлементов, обнаруженных в составе тканей растений. Приведенные же данные указывают на определенную связь между растением и микроорганизмами при использовании ими микроэлементов.
Другие опыты также подтверждают взаимосвязь между растением и бактериями в использовании микроэлементов. Так,
были взяты в чистых культурах девять видов бактерий (см.
табл. 67) с добавлением азотобактера. Все эти бактерии выращивали с соблюдением одинаковых условий параллельно на среде с микроэлементами (Мо, В, Мп) и без них. Через двое суток
роста культуры снимали шпателем с агаризованной среды и из
них делали суспензии, которые использовали в опытах. Как
те, так и другие культуры вносили в пробирку под растения.
В каждую пробирку вносили смесь десяти видов бактерий,
В первом опыте с проростками озимой пшеницы методика
была тождественна с приведенной выше, то есть выращивали
растения в стерильных условиях, в больших пробирках со средой Прянишникова. Культуры бактерий вносили в количестве
1 млн. клеток каждого вида на пробирку с растением.
Опыт второй был заложен по той же схеме, но в условиях
микровегетационных опытов со стерильной почвой. Зерна засевали с предварительно простерилизованной поверхностью (озимая пшеница, кукуруза, овес). С семян овса предварительно
снимали чешую. На пятый день роста проростков в чашки вносили в разные варианты опыта суспензии бактерий, выращенных
без микроэлементов и с ними, а также одни растворы микроэлементов, взятых в количестве: Мо — 20, В — 5, Мп — 50 мг на
чашку. Результаты обоих опытов приведены в табл. 68.
Данные, полученные в этих опытах, интересны, так как они
в известной мере указывают на взаимоотношения в определенных условиях бактерий с высшими растениями. В опыте № 1
одни микроэлементы без бактерий увеличили вес проростков
только на 3%. Следовательно, растения, развиваясь на среде
Прянишникова, которая, по-видимому, вполне удовлетворяла их
•181
Т а б л и ц а 50'
Действие бактерий и микроэлементов на рост проростков в стерильных
условиях (вес — в г и %)
Опыт 1
(в жидкой среде)
Вариант опыта
Опыт 2 (в почвенных условиях)
Озимая
пшеница
Озимая
пшеница
%
г
2
Контроль (нестерильный)
Контроль (стерильный)
Бактерии, выросшие
без микроэлементов
Бактерии, выросшие
на среде с микроэлементами
Микроэлементы (без
бактерий)
%
г
'
Овес
%
%
г
1
I."
10,0 100
1
2
100
40 100 6
54 100 3 , 2
88 220 11,6 105 193 7 , 8
40
99
100
244
112 10,5 105 262 12,4 113 208 8,7
108
272
27
69
6 , 3 103
4
8,8
4,3
43 107
11,0 100
г
2
8,0
6,1 100
5 , 3 87
6,8
Кукуруза
6,9
63 115 2 , 2
П р и м е ч а н и е . 1 — процент к контролю нестерильному, 2 — процеят к
контролю стерильному.
требования, не реагируют на микроэлементы. Не исключена так же возможность, что эта среда содержит достаточное для расте-.
ний количество микроэлементов в качестве примесей к солям.
Внесение бактерий (без микроэлементов) угнетает растения.
Возможно, что бактерии в этом случае, при тесном контакте в
жидкой среде с корнями растений, конкурируют с ними за питательные вещества.
Внесение бактерий, выращенных на средах с микроэлементами, дало другие результаты. В первые дни в этом варианте
опыта растения были также как бы угнетены, затем эта депрессия исчезла, растения приобрели ярко-зеленый цвет и хорошо
росли. В результате в этом варианте опыта получена прибавка
веса проростков на 12%. Объяснить это явление можно действием нескольких факторов, проявившихся под влиянием микроэлементов: а) большим снабжением азотом среды при активной
деятельности азотобактера и некоторых олигонитрофилов; б) ускорением процессов жизнедеятельности бактерий, при которых
происходит освобождение из клеток, а может быть, и синтез
усвояемых растениями питательных веществ; в) освобождением
из клеток микроэлементов в формах, более приемлемых для
растений, что ведет к изменению состава среды в более благо-182
приятном направлении; г) большим выделением этими бактериями активирующих рост веществ и многим другим.
В стерильном опыте № 2 в условиях почвы наблюдалась
иная картина, почти аналогичная для всех трех растений. В стерильной почве проростки этих растений развивались плохо, вее
их был равен соответственно 40, 54, 40% веса нестерильного
контрольного варианта. (Мы не останавливаемся на этом явлении угнетения растений в стерильной почве, поскольку оно известно из литературы).
Внесение в определенный вариант опыта микроэлементов
незначительно повысило вес проростков на стерильной почве
(на 3—9%) у первых двух растений и проявило еще большее
угнетение в отношении овса.
Добавление бактерий, выросших на обычных (без микроэлементов) средах, резко усилило рост проростков, вес которых
увеличился почти в два раза, достигнув 88, 99, 105% к контрольному весу на нестерильной почве, и 193, 220, 244% — к контролю на стерильной.
Еще больше усилился рост всех трех растений при добавлении бактерий, выросших на средах с микроэлементами. Вес
проростков в этих вариантах опыта больше веса проростков на
нестерильной почве на 5—8%, а в случае кукурузы — на 13%.
Таким образом, внесение комплекса бактерий, выделенных
из ризосферы, нивелировало токсическое действие на проростки
простерилизованной почвы, причем действие бактерий, выросших на средах с микроэлементами, проявлялось более активно.
Объяснением последнего могли служить уже высказанные соображения.
Полученные данные в определенной мере были подтверждены материалами вегетационных опытов, заложенных по той же
схеме, но без стерилизации почвы. Растения — яровая пшеница
Таблица
69
Урожай зерна пшеницы и овса при раздельном
внесении микроэлементов и бактерий (на сосуд)
Яровая
пшеница
Вариант опыта
Контроль
Микроэлементы
Бактерии, выросшие без
микроэлементов
Бактерии, выросшие на
средах с микроэлементами
Овес
а
%
г
%
10,1
10,8
1-0,9
100
108
109
11
11,8
12,2
100
107
111
11,6
115
12,9
118
•183
сорта Лютесценс 62 и овес Верхнячский. Бактерии — тех же видов, что и в микровегетационных опытах, в комплексе вносили
в количестве 1 млрд. клеток каждого вида на сосуд. Семена
бактеризовали суспензией клеток. Остатки суспензии после обработки зерна вносили в почву сосуда. Результаты опытов приведены в табл. 69. Как видно из ее данных, вес зерен пшеницы
и овса в варианте опыта с микроэлементами повысился на 7—
8%- Несколько выше было действие внесенных бактерий, давшее прибавку урожая 9—11%. При внесении же бактерий, выращенных на средах с микроэлементами, урожай зерна повысился на 15—18%.
Действие внесенных бактерий больше сказалось на овсе, чем
на пшенице. По-видимому, повышение активности культур под
действием микроэлементов благоприятно отражается на росте
растений и, в конечном результате, на их продуктивности.
Проведенные опыты в определенной мере подтверждают действие микроэлементов, включившихся в жизненные процессы
микроорганизмов, на рост и продуктивность сельскохозяйственных растений.
ЧАСТЬ
IX
РОЛЬ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ
В ПОВЫШЕНИИ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ
К ЗАБОЛЕВАНИЯМ
(грибным и бактериальным)
Определенную роль играют микроэлементы в
снижении грибных, бактериальных и вирусных заболеваний растений. В этом случае можно говорить о непосредственном
действии (бактерио- или фунгицидном) на возбудителя заболевания и об их косвенном действии, в той иди иной мере отражающемся на устойчивости растений против возбудителей заболеваний.
Данный вопрос начал изучаться только в последние годы в
связи с изучением физиологических особенностей растений при
действии на них микроэлементов. По мнению Страхова (1959)
и других исследователей, применением микроэлементов можно
повысить устойчивчсть сортов сельскохозяйственных культур,
приближая их свойства к естественно иммунным сортам. У растений с приЬбретенным иммунитетом возникают процессы, в
основном сходные с таковыми у естественно иммунных сортов,
угнетающие или убивающие проникшего в них возбудителя.
Микроэлементы, использованные растением, влияя на эти биохимические процессы, могут влиять и на его иммунные свойства.
Этот интересный вопрос вызвал многочисленные исследования
устойчивости зерновых и других культур к головневым, ржавчинным и мучнисторосяным грибным заболеваниям, вызывающим массовое поражение сельскохозяйственных культур, а такж е к бактериозам растений. Микроэлементы использовались при
корневом, внекорневом и других приемах внесения. Значительное уменьшение поражаемости растений упомянутыми грибами
дали Мп, N1, 2п, Ре, Си, В. В опытах Страхова и Ярошенко
(1952) железо снижало поражаемость овса пыльной головней
в 4—8, цинк — в 3 раза. Марганец снижал поражение головней
ячменя в 33 раза, никель — в 13, цинк — в 3 раза.
>
Подобные результаты получены в различных республиках
СССР, а т а к ж е за рубежом. Применение бора увеличивало стойкость пшеницы к ржавчинным и мучнисторосяным грибам.
•185
В отношении технических культур Березовой и Судакевич (1960)
установлено благоприятное действие бора при бактериозах и
фузариозах льна. Тот же микроэлемент и другие снижали в несколько раз поражение бобовых трав бактериозами (Бельтюкова
и др., 1964). То ж е можно сказать относительно сахарной свеклы, подсолнечника, кенафа. Микроэлементы повышали устойчивость картофеля к фитофторе и другим заболеваниям. В опытах Гедзь (1958) наблюдалось снижение на 17—34% поражаемое™ этой культуры раком. Защитное действие микроэлементов наблюдалось в культурах овощных, плодовых
и ягодных.
Особого внимания заслуживает действие микроэлементов на
вирусные заболевания растений. Правда, таких исследований
немного, но имеются сообщения о .действии цинка на Х-вирус
персика, марганца — на заболевание нитевидностью картофеля,
марганца и бора — на штриховатость и мозаичность томатов, на
У-вирус картофеля и некоторые другие. По данным Рыжкова и
Марченко (1957), наиболее сильное влияние на размножение
вируса мозаики табака оказали Си, Со, Ав.
У С Т О Й Ч И В О С Т Ь растений против бактериальных
заболеваний
повышается даже при кратковременном воздействии микроэлементов, например при инъекции их в сосудистую систему растения или обработке семян. Это обычно проявляется в большой
густоте всходов, возникающей благодаря снижению зараженности молодых растений.
Убедительны опыты с заражением отдельных частей растения
грибной инфекцией. Предварительная обработка этих частей
микроэлементами, особенно цинком и никелем, исключала развитие инфекции. При длительном воздействии микроэлементов
(например, при внесении в почву) положительные случаи их
действия наблюдаются чаще.
Устойчивость растений зависит также от количества поступивших в него микроэлементов. Их действие проявляется не
только в год применения, но и в последующие годы — как ПОС-,
ледействие. Повышение устойчивости к заболеваниям зависит
от сорта растений, а в некоторых случаях передается в потомство. Так, например, реагируют некоторые сорта картофеля и
помидоров.
Действие микроэлементов особо положительно по фону удобрений. Так, в опытах Пересыпкина и Мусатовой (1960) марганец и медь были наиболее эффективны по фону удобрений в
повышении устойчивости клевера к бактериозам и в повышении
стойкости озимого рапса к бактериозам корней (Пересыпкин,
1956). Смеси микроэлементов в ряде случаев влияют на устойчивость растений сильнее, чем отдельные элементы. По данным
Гедзя (1958), уменьшение заболевания картофеля раком при
использовании смеси микроэлементов было равно 34%, тогда
•186
как отдельные элементы понижали заболеваемость только на
17%.
Имеются сведения о возможности оздоровления заболевших
растений при применении цинка и бора (кила капусты, поражение мучнисторосяными грибами). Такое действие микроэлементов может получиться в результате подавления некоторыми
элементами (особенно медью) ферментов, необходимых для
жизни фитопатогенных грибов и бактерий.
В других случаях под действием микроэлементов увеличивается механическая прочность покровных тканей к воздействию
возбудителя. Это относится главным образом к мучнисторосяным грибам. Утолщение покровных тканей, вызываемое бором
и марганцем, вступающими в соединение с пектиновыми веще-,
ствами оболочки у картофеля, затрудняет проникновение в клубень фитофторы. По данным В л а с й к а (1952), марганец способствовал утолщению клеточных стенок механической ткани стебля пшеницы.
У льна борные удобрения улучшают углеводный режим, что
повышало его устойчивость к заболеваниям, вызываемым Вас.
тасегапБ. По мнению Каталымова (1957), Березовой и Судаковой (1960), применение борных удобрений может полностью
устранить бактериозы льна.
Устойчивость растений может быть т а к ж е связана с возможным влиянием микроэлементов на повышение содержания антибиотических веществ в корневых выделениях. В подтверждение
этого показано, что устойчивые сорта растений выделяют в почву вещества, тормозящие рост микроорганизмов ризосферы.
Такое наблюдалось в ризосфере Табаков, льна и других р а :
стений.
Интересны исследования Страхова и Ярошенко (1959), установивших, что Ре, Мп, 2п, В, N1, Си повышают интенсивность
прорастания хламидоспор головневых грибов, которые затем
дегенеративно изменяются и погибают в почве.
Данные Страхова (1959) по выяснению характера защитных
реакций у растений говорят о ряде регрессивных изменений грибов (ржавчинных, головневых, мучнисторосяных) в клетках растений, выросших с применением микроэлементов. Перерождение содержимого мицелия нередко заканчивалось полным растворением последнего.
Микроэлементы усиливают развитие микоризы, которая
т а к ж е способствует устойчивости растений. Примененные совместно с антибиотиками (стрептомицином, агримицином и др.),
они усиливали действие последних на возбудителя (Чжан Хецин, 1960; Gambogi е! а1., 1959). Возможно, что в этом случае
усиление фунгицидности смесей объясняется ослаблением проницаемости клеток растений, облегчавшее проникновение антибиотиков.
•187
Микроэлементы способны замедлять физиологическое старение ботвы и тем самым усиливать устойчивость картофеля
против фитофторы. К таким' же положительным факторам
относится усиление микроэлементами фотосинтеза растений и
связанного с ним образования пластических веществ, усиление
энергии дыхания и ферментативных процессов, что дает клеткам
растений возможность быстрее активизировать защитные реакции против внедрения и для борьбы с инфекцией.
К непосредственному защитному действию микроэлементов
(Мп, 2п, В, Си) относится инактивация, токсинов и ферментов,
выделяемых болезнетворными возбудителями (особенно грибами) в клетках и почве (Маленев, 1961). Так, пиколиновая кислота, входящая в состав фузариевой кислоты, относящейся к
токсинам, связывается тяжелыми металлами хелатным путем.
Токсины инактивируются не только отдельными микроэлементами, но и соединениями, в которые они входят. Такими являются соединения некоторых ферментов с металлами. Однако
иногда использование микроэлементов при инактивации токсинов вызывает недостаток их в растениях, что отрицательно отзывается на росте и развитии последних.
Влияние цинка на токсин грибов рода фузарий, вызывающих
увядание растений, может также объясняться его действием на
соединения, содержащие сульфгидрильные группы. Этот элемент
связывает и инактивирует данные токсины. С другой стороны,
цинк и другие микроэлементы рекомендуются против ТОЙ ЖГ
болезни хлопка как уменьшающие содержание продуктов гидролиза пектина у растения и понижающие активность соотве!
4
ствующих ферментов у грибов, возбудителей болезни.
Некоторые наблюдения говорят также об усилении под влия
нием микроэлементов образования фитонцидов в растениях,
действующих угнетающе на болезнетворных возбудителей.
Таким образом, литературные данные и проведенные эксгнриментальные исследования указывают на определенное дейп
вие микроэлементов (Мо, В, Мп, 2п) на почвенную микрофлору.
Эти микроэлементы активировали важнейшие ферментатии
ные системы микроорганизмов: дыхание, дегидрирование, ката
лазную, протеолитическую и амилазную активность.
Под влиянием микроэлементов у микроорганизмов усилив.'!
ется образование биологически активных веществ — витаминов
группы В и гетероауксина,— изменяются морфолого-культу
ральные и некоторые функциональные особенности с последующим закреплением и передачей их по наследству. Применение
радиоактивного М о " показало поглощение его микроорганизмами, выделение в среду и передачу растениям. В условиях полевых опытов под влиянием микроэлементов наблюдалось повышенное размножение бактерий, актиномицетов и грибов в
•188
ризосфере разных растений. Это сопровождалось повышением
биологической активности почвенной микрофлоры, особенно бактерий азотного обмена. Эти изменения сказывались на динамике
питательных веществ для растений в почве — нитратов и растворимых форм Р2О5. Как результат повышения активности микрофлоры отмечено увеличение урожайности сельскохозяйственных культур, достигающее в некоторых случаях значительных
размеров.
Исходя из всего сказанного, можно считать, что положительное действие микроэлементов на сельскохозяйственные растения
является сложным процессом, в котором определенную активную роль играют почвенные микроорганизмы.
13—388
189
W e 11 è r C.— Landw. Forsch., 66, 114—119, 1954.
W i l l i s t o n E., B i n g e n h e i m e r J., R o s e n t h a l S.—Ann. Ins. P a s t ,
94, 1, 49—60, 1958.
W i l l i s t o n E., R o s e n t h a l S.—Bull. Organ. Mond. Santé, 26, 1, 47—50
1962
W i n d e r F.— Amer. Rev. Respir. Dis., 85, 6, 925—926, 1962.
W i n d e r F., D e n n e n y J . — N a t u r e , 184, 4687, 742—743, 1959.
W i n d e r F. a. O'H a r a C.—Biochem. J., 82, 98—108, 1962.
W i n f i e 1 d M. E.— Rev. pure. a. Appl. Chem., 5, 4, 1955.
W o o d r u f f H. B.— J. Bact., 54, 42, 1947.
W o o 11 e y A.— J. Biol. Chem., 140, 311—312, 1941.
W o r a t z H., T h o f e r n E., K a r i m i n e j a d A.— Zbl. Bakt., 2, 168, 56,
436—440, 1957.
W y 11 i e J.— Can. J. Pub. Health., 36, 477—482, 1945.
Y a m m a m o t o T., F u k u m o t o J.—Bull. Agric. Chem. Soc. Japan., 23, 1,
68—70, 1959.
,
r
Y o s h i m u r a F.— Bot. Mag., 53, 125—128 1939.
Y o u n g R. S.—Sci. P r o g r , 44, 175, 16—37, 1956.
Z a m e c n i k P. C., B r e w s t e r L. E., L i p m a n . — J . Exp. Med., 85, 381—
394, 1947.
Z i t t l e C. A . — J . Biol. Chem., 163,1,111—117, 1946.
\
Содержание
Введение
. - . . : .
3
Ч А С Т Ь I. РОЛЬ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ В МЕТАБОЛИЗМЕ МИКРООРГАНИЗМОВ
Роль металла в ферментных системах
Хелатные образования
Ферменты, имеющие в своем составе металл
Окислительно-восстановительные ферменты
Гидролитические ферменты
Металлы в нуклеиновых кислотах
Фйзико-химические особенности действия микроэлементов
ЧАСТЬ
9
14
22
—
28
30
32
.
II. ДЕЙСТВИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ НА МИКРООРГАНИЗМЫ
Влияние микроэлементов на рост микроорганизмов
.
,
. - .
Изменение морфолого-культуральных признаков микроорганизмов
Культуральные особенности
Ч А С Т Ь П И . ДЕЙСТВИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ
ТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ
НА ФЕРМЕНТАТИВНУЮ
38
49
50
АК-
Дыхание
Дегидрогеназная активность
Каталазная активность
Протеолитическая активность
Амилолитическая активность
Фиксация атмосферного азота
60
69
76
79
85
91
Ч А С Т Ь IV. ВЛИЯНИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ НА ОБРАЗОВАНИЕ МИКРООРГАНИЗМАМИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ И ДРУГИХ ОРГАНИЧЕСКИХ
ВЕЩЕСТВ
Витамины группы В
99
Образование витаминов группы В почвенными микроорганизмами
.
104
Гетероауксин
114
Антибиотики
124
Образование комплексов металлов и антибиотических веществ
. 126
Образование лимонной кислоты и других органических веществ
129
Антагонизм ионов при действии на микроорганизмы
.
.
.
.131
Ч А С Т Ь V. МИКРОЭЛЕМЕНТЫ И ИЗМЕНЧИВОСТЬ
МИКРООРГАНИЗМОВ
Амино- и нуклеиновые кислоты
Изменение антагонистических свойств актиномицетов
Изменение биохимических свойств азотобактера
.
.
Ч А С Т Ь VI. УСВОЕНИЕ МОЛИБДЕНА БАКТЕРИЯМИ (ОПЫТЫ С РАДИОАКТИВНЫМ ИЗОТОПОМ Мо")
Ч А С Т Ь VII. ДЕЙСТВИЕ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ НА КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ И БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ МИКРОФЛОРЫ РИЗОСФЕРЫ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ РАСТЕНИИ
Сравнительное действие бора, молибдена, марганца на микрофлору
ризосферы растений
Количественные изменения микрофлоры после применения
микроудобрений
•1
136
.138
140
146
» .
^
159 •*"
—
Биологическая активность почвы
Динамика нитратов и фосфорной кислоты в почвах
.
Совместное действие микроэлементов и бактериальных удобрительных препаратов
Совместное действие микроэлементов с суперфосфатом и органическими удобрениями
Биологические методы определения микроэлементов в почвах
162
163
166
170
177
Ч А С Т Ь VIII. СВЯЗЬ МЕЖДУ ДЕЙСТВИЕМ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ НА МИКРООРГАНИЗМЫ И РОСТОМ ВЫСШИХ РАСТЕНИИ
179
Ч А С Т Ь IX. РОЛЬ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ В ПОВЫШЕНИИ УСТОЙЧИВОСТИ
РАСТЕНИИ К ЗАБОЛЕВАНИЯМ (ГРИБНЫМ И БАКТЕРИАЛЬНЫМ)
Литература
с
185
190
/
Ольга Ипполитовна
МИКРОЭЛЕМЕНТЫ
Печатается поо постановлению
И
Бершова
ПОЧВЕННЫЕ
МИКРООРГАНИЗМЫ
ученого совета Института микробиологии
им. Д. К- Заболотного
и
вирусологии
Редактор Т. И. Матяшевская
Художественный редактор В. П. Кузь
Оформление художника В. 3. Куницы
Технический редактор Б. А.
Пиковская
Корректор Л. Н. Регета
БФ 03276. Зак.. №
54. 54.
Тираж
2200.
Бумага
№ 2,
физ.физ
листов 12,75.
№388.
388.Изд.
Изд.№№
Тираж
2200.
Бумага
№602,x 90'/и.
60х90'Печ.
/ів. Печ.
Усл. печ. листов
12,75. Учетио-изд. листов 12,63.
12,63. Подписано к печати 25Л
25.V 1967 г. Це:тов 12,75.
на 86 коп.
Издательство «Наукова думка», Киев, Репина, 3.
Киевская книжная
іжная типография № 5 Комитета по печати при Совете Мині
Министров УССР,
Киев, Репина, 4.
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа