close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Рука помощи ..;pdf

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Виноградская Ирина Сергеевна
Морфометрический анализ митохондрий при наследственно
обусловленных состояниях скелетной мышечной ткани
03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
14.03.02 – патологическая анатомия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2014
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации и в Научно-исследовательском клиническом институте
педиатрии ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский
университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор
Глинкина Валерия Владимировна
доктор медицинских наук, профессор
Сухоруков Владимир Сергеевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Валиуллин Виктор Владимирович
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального
образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства
здравоохранения Российской Федерации, профессор кафедры гистологии, цитологии и
эмбриологии.
доктор медицинских наук, профессор
Михалева Людмила Михайловна
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Российской академии медицинских наук, заведующая лабораторией клинической морфологии.
Ведущая организация:
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального
образования «Ярославская Государственная медицинская академия» Министерства
Здравоохранения Российской Федерации.
Защита состоится 23 декабря 2014 года в 14.00 часов на заседании Диссертационного
совета Д 208.072.04 на базе ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России
по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д.1.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке и на сайте: http://rsmu.ru.
ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва,
ул. Островитянова, д.1.
Автореферат разослан «
»
2014 года
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор
Леонова Людмила Васильевна
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность. Одной из центральных проблем в любой области знаний, является выбор инструментов исследований. Особенно это актуально в области медицины и здравоохранения, где правильная диагностика играет ключевую роль в выборе стратегии и
тактики лечения, а впоследствии и определяет его успешность.
Нервно-мышечные заболевания, в особенности, обусловленные генетическими
дефектами миопатии, составляют большую группу наследственных заболеваний человека, приводящих к инвалидности и фатальному исходу у детей и взрослых. Дифференциальная диагностика этих заболеваний остается трудной в силу недостаточно специфичных проявлений и большого клинического сходства состояний, обусловленных разными
генетическими дефектами.
Большой интерес в исследованиях патогенетических механизмов миопатий вызывает изучение морфологии митохондрий в скелетной мышечной ткани, так как с нарушением их связаны митохондриальные заболевания. Свидетельством универсальной роли митохондрий в патогенезе различных заболеваний мышц является исследование,
проведенное J. Muller-Hocker и соавт. [Muller-Hocker J. et al., 1986], в котором было показано, что ослабление-сопряжение окислительного фосфорилирования тесно, но не
обязательно связано с пролиферацией митохондрий. В ряде исследований [Sukhorukov
V.S., 1998, 2006, 2011] было высказано предположение, что при определенных формах
заболеваний увеличение числа и размеров митохондрий в мышцах может влиять на
клиническую картину заболевания. Но до сих пор остается открытым вопрос о компенсаторной роли увеличения числа митохондрий и о возможности этих органелл влиять на
снижение степени тяжести заболевания. Любое изменение архитектуры мышечной
клетки, особенно морфологии митохондрий, может нанести функциональный урон [Jouberi F. et.al., 2008, Piquereau J. et.al., 2012]. Именно, поэтому по-прежнему остается неясным вопрос: какова роль изменения числа митохондрий в скелетной мышечной ткани
при врожденной миопатии? Врожденные миопатии являются редкими, клинически и генетически гетерогенными заболеваниями, лечение которых на сегодняшний день составляет большую сложность. Среди них первое место по частоте занимает врожденная
миопатия центрального стержня, относящаяся к так называемым «немитохондриальным» заболеваниям [Сухоруков В.С., Харламов Д.А., 2010], поэтому в качестве группы
3
сравнения было выбрано заболевание, вызываемое первичным поражением митохондрий, а именно митохондриальная миопатия, сходная по светооптическим гистоферментохимическим характеристикам с миопатией центрального стержня. Митохондриальные
болезни составляют большую группу патологических состояний, связанных с генетически детерминированными нарушениями клеточной биоэнергетики. Их частота встречаемости варьирует от 1:5000 до 1:10000 населения [Schaefer A.M. et al., 2008; Chinnery
P.F. et al., 2012; Bannwarth S. et al., 2013], однако лечение таких больных актуально.
Связь с развитием миопатий различной степени тяжести определяет особый интерес к структурной реорганизации митохондрий в мышцах. На сегодняшний день организация митохондриона в зрелых мышечных волокнах человека практически не изучена, а глубокое понимание энергетических процессов клетки, несомненно, требует комплексного подхода, сочетающего исследования биоэнергетики и митохондриальной
биохимии с анализом морфологии митохондрий, что было бы полезно для практической
медицины и для лечения таких тяжѐлых наследственных заболеваний.
Точная морфологическая оценка параметров митохондрий в скелетной мышечной ткани при адаптационных процессах особенно актуальна на современном этапе развития клинической миологии, когда ещѐ отсутствуют генетические методы лечения подавляющего большинства нервно-мышечных заболеваний.
Анализ морфометрических параметров митохондрий при патологических состояниях скелетной мышечной ткани в сопоставлении с другими клинико-лабораторными
показателями больных может помочь при разработке неспецифических терапевтических
подходов в лечении различных заболеваний мышц.
Цель исследования: изучить морфометрические параметры митохондрий скелетных мышц при врожденной миопатии центрального стержня и при митохондриальной миопатии и определить возможности их использования для диагностики заболеваний мышц.
Задачи исследования:
1. Определить морфометрические ультраструктурные характеристики митохондрий
в межмиофибриллярных и субсарколеммальных участках волокон поперечнополосатой
скелетной мышечной ткани у больных врожденной миопатией центрального стержня и
оценить наличие корреляционных связей между полученными показателями.
4
2. При миопатии центрального стержня определить корреляционные связи между
выявленными морфометрическими показателями митохондрий скелетной мышечной
ткани с клинико-лабораторными показателями тяжести заболевания, а также напряженностью энергетического метаболизма, используя следующие показатели крови: активность лактатдегидрогеназы, уровень креатинина, уровень лактата (молочная кислота),
уровень пирувата (пировиноградная кислота), лактат/пируват, концентрация общего
кальция.
3. Определить морфометрические ультраструктурные характеристики митохондрий
в межмиофибриллярных и субсарколеммальных участках волокон поперечнополосатой
скелетной мышечной ткани у больных митохондриальной миопатией и оценить наличие
корреляционных связей между полученными показателями.
4. При митохондриальной миопатии определить корреляционные связи между выявленными морфометрическими показателями митохондрий скелетной мышечной ткани
с клинико-лабораторными показателями тяжести заболевания, а также напряженностью
энергетического метаболизма, используя следующие показатели крови: активность лактатдегидрогеназы, уровень креатинина, уровень лактата (молочная кислота), уровень
пирувата (пировиноградная кислота), лактат/пируват, концентрация общего кальция.
5. Сопоставить полученные морфометрические показатели состояния митохондрий
скелетной мышечной ткани при миопатии центрального стержня и при митохондриальной миопатии, а также оценить интенсивность адаптационных и патологических процессов при изменении указанных показателей.
6. Выявить диагностические значимые морфометрические критерии состояния митохондрий, позволяющие эффективно использовать их для оценки компенсаторных и
патологических процессов в скелетной мышечной ткани при различных нервномышечных заболеваниях.
Научная новизна. В настоящем исследовании впервые проведена полноценная
морфометрическая характеристика параметров митохондрий в межмиофибриллярных и
субсарколеммальных участках волокон поперечнополосатой скелетной мышечной ткани
больных врожденной миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией.
Впервые выявлены информативные морфометрические параметры митохондрий и
изложены доказательства компенсаторной роли изменения числа и размеров митохонд5
рий при наследственно обусловленных патологических состояниях скелетной мышечной ткани. Безусловной новизной обладают сведения о различных компенсаторных механизмах энергетического аппарата мышц при митохондриальной и немитохондриальной миопатиях. В частности, оценена эффективность увеличения числа митохондрий в
поперечнополосатой скелетной мышечной ткани при названных заболеваниях.
Приоритетным являются предложенные в работе механизмы поддержания удельного объѐма митохондриальной популяции в поперечнополосатой скелетной мышечной
ткани больных миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией.
С помощью корреляционного анализа впервые была выявлена взаимосвязь между
морфометрическими параметрами митохондрий и клинико-лабораторными показателями тяжести заболевания и активности энергетического метаболизма при данных заболеваниях.
Впервые проведена сравнительная оценка между морфометрическими показателями состояния митохондрий в скелетной мышечной ткани больных миопатией центрального стержня и митохондриальной миопатией.
Впервые предложены дополнительные маркеры для дифференциальной диагностики и расшифровки патогенеза миопатии центрального стержня и митохондриальной
миопатии.
Впервые предложен показатель энергетической обеспеченности мышечного волокна, выражающий соотношение удельного объѐма митохондрий к удельному объѐму
миофибрилл, который может быть применѐн для оценки компенсаторных митохондриальных изменений в скелетной мышечной ткани при нервно - мышечных заболеваниях.
Практическая значимость работы. Разработанные критерии морфометрической
оценки параметров митохондрий при наследственно обусловленных патологических состояниях скелетной мышечной ткани, с использованием компьютерной электронномикроскопической морфометрической обработки полученных данных, позволяют существенно повысить качество результатов патоморфологического исследования биопсийного материала и уровень эффективности диагностики у больных нервно-мышечными
заболеваниями. Указанные критерии внедрены в практическую деятельность психоневрологического отделения №2 НИКИ педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова
Минздрава России. Материалы исследования включены в лекционные курсы для сту6
дентов, учащихся в ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России на кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии лечебного факультета.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Морфометрические параметры субсарколеммальных и межмиофибриллярных митохондрий (относительное количество, размеры и удельный объѐм) существенно различаются между собой при врожденной миопатии центрального стержня и при митохондриальной миопатии, в то время как форма и электронная плотность в вышеуказанных участках одинаковы.
2. При врожденной миопатии центрального стержня удельный объѐм митохондриальной
популяции в большей степени зависит от размеров, а не от их количества. При митохондриальной миопатии выявлены нарушения механизмов поддержания объѐма митохондриальной популяции за счѐт координации процессов пролиферации и роста этих органелл.
3. При врожденной миопатии центрального стержня, увеличенные субсарколеммальные
скопления митохондрий, имеют компенсаторную природу. Таким образом, чем больше
относительное количество и размер митохондрий под сарколеммой мышечного волокна,
тем меньше степень тяжести заболевания.
4. Показатель энергетической обеспеченности мышечного волокна может быть применѐн для оценки компенсаторных митохондриальных изменений в скелетной мышечной
ткани больных нервно-мышечными заболеваниями.
Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на совместном
заседании кафедры гистологии, эмбриологии и цитологии лечебного факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России и научно-исследовательской лаборатории
общей патологии Научно-исследовательского клинического института педиатрии ГБОУ
ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России. Основные положения диссертации
доложены на XI Российском Конгрессе «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2012), на XX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2013), на XXI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2014), на ХIII
Международном конгрессе по нервно-мышечным заболеваниям (Ницца, Франция 2014).
7
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, из
них три - статьи в журналах рекомендованных ВАК РФ.
Объѐм и структура работы. Диссертация состоит из глав введения, обзора литературы, материала и методов исследования, результаты собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, списка литературы и приложения. Общий
объѐм диссертации составил 146 страниц машинописного текста. Работа содержит список литературы из 204 ссылок (27 отечественных и 177 иностранных авторов), 55 рисунков, 2 таблицы и 12 графиков в приложении.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материал исследования. Работа основана на комплексном морфологическом
изучении биоптатов четырехглавой мышцы бедра больных, находившихся на лечении в
отделениях психоневрологии, а также врожденных и наследственных заболеваний
НИКИ педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова Минздрава России с их информированного согласия. В работе было обследовано 39 пациентов, из них: 21 пациент
с диагнозом врожденная миопатия центрального стержня в возрасте от 4 до 27 лет и 18
пациентов с диагнозом митохондриальная миопатия в возрасте от 4 месяцев до 16 лет.
Морфологическое исследование биоптатов мышечной ткани осуществлялось
с помощью специального метода окраски гистоферментохимического выявления активности сукцинатдегидрогеназы (СДГ) по Нахласу и др. Материал подвергался замораживанию, для этого его погружали в среду для заливки в жидкий азот фирмы Sigma. Для
получения срезов свежей ткани толщиной 10-12 мкм использовали микротом-криостат
Microm HM 505 N. Анализ и фотосъемка светомикроскопических препаратов производились на световом микроскопе Nikon eclipse 80i.
Для
электронно-микроскопического
исследования
мышц
проводили
префиксацию ткани, взятой всегда в строго определенном месте (четырехглавая мышца
бедра) размером не более 1мм3 в 2.5%-ном растворе глутарового альдегида на
фосфатном буфере (рH=7.4) при 0°С. После отмывки ткани фосфатным буфером
(рH=7.4) проводили фиксацию 1%-ным раствором четырехокиси осмия в течение часа
при 2-4°С. Затем ткань обезвоживали в спиртах восходящей концентрации. Заливку
ткани производили в эпоновую смолу после трехкратной обработки ацетоном по
8
методике Лафта [Luft, 1961]. Срезы получали на ультратоме фирмы REICHERT Nr.
321850/E и контрастировали цитратом свинца по методике Рейнольдса [Reynolds, 1963].
Исследование проводили на трансмиссионном электронном микроскопе JEOL JEM100B.
Морфометрический
анализ
проводился
путем
подсчета
митохондрий,
разделенных на две популяции в зависимости от их места расположения в мышечном
волокне:
под
сарколеммой
(субсарколеммальная)
и
между
миофибриллами
(межмиофибриллярная) с помощью компьютерной программы для микрофотометрии
«Image J» при увеличении х 10 000. Для каждого пациента было изготовлено 5 блоков. С
каждого блока проанализировано не менее 20 полей зрения.
относительное
Определяли
количество
митохондрий
их
размерные
характеристики, такие как: площадь, периметр, максимальный и минимальный диаметр
Фере; показатели формы – фактор формы «эллипс», «округлость»; среднюю
электронно-оптическую плотность и удельный объѐм митохондрий. Параллельно
определяли удельный объѐм миофибрилл.
В
процессе
обеспеченности
работы
мышечного
нами
был
волокна,
предложен
равный
показатель
отношению
энергетической
удельного
объѐма
митохондрий к удельному объѐму миофибрилл.
Биохимические исследования были проведены в Научно-исследовательском
клиническом институте педиатрии ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова Минздрава
России. Из результатов проведенных биохимических исследований были проанализированы следующие показатели: концентрация креатинина (Ммоль/л), уровень молочной и
пировиноградной кислот (Ммоль/л), уровень активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ
Ед/л) и концентрация общего кальция (Ммоль/л) в крови. Биохимический анализ крови
был проведен натощак. Определение уровня молочной и пировиноградной кислот в
крови проводили с помощью энзиматического метода Rollinghoff (1967) натощак и после стандартной нагрузки глюкозой (из расчета 1,75 г/кг массы тела, но не более 50 г) на
60 и 180 минутах.
Степень тяжести заболевания у больных детей оценивалась совместно с клиницистами Научно-исследовательского клинического института педиатрии ГБОУ ВПО
9
РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России при помощи различных тестов мышечной активности.
Статистическая
обработка
данных.
Определяли
средние
значения
и
стандартные ошибки среднего для абсолютных показателей. Абсолютные показатели
при условии нормального распределения сравнивали с помощью t-критерия Стьюдента
для независимых выборок. При распределении, отличном от нормального, использовали
тест Манна-Уитни. Для выявления взаимосвязей между изучаемыми признаками и
продолжительностью воздействия возмущающих факторов был проведен ранговый
корреляционный анализ Спирмена. Различия считались статистически достоверными
при p<0,05. Статистическая обработка данных выполнена с помощью электронных
таблиц «Microsoft Excel» и пакета прикладных программ "STATISTICA 6.0".
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЕ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Гистоферментохимическое выявление активности сукцинатдегидрогеназы в скелетной мышечной ткани пациентов
В скелетной мышечной ткани больных врожденной миопатией центрального
стержня активность сукцинатдегидрогеназы была выявлена в периферических участках
мышечных волокон, тогда как в центральных участках наблюдалось значительное снижение активности этого фермента или его отсутствие. Это может указывать на то, что
периферические участки энзиматически активны в отличие от центральных участков
мышечных волокон.
Анализ полученных препаратов показал, что при гистоферментохимической
оценке активности сукцинатдегидрогеназы у 16 из 18 пациентов с диагнозом митохондриальная миопатия, обнаруживались участки мышечных волокон с повышенной активностью фермента, главным образом в периферических участках, а у некоторых больных и в центральных участках мышечных волокон.
Электронно-микроскопическое исследование изменений митохондрий в скелетной мышечной ткани пациентов
При ультраструктурном анализе скелетной мышечной ткани у больных врожденной миопатией центрального стержня в центральных участках мышечных волокон
были выявлены атрофические изменения пучков миофиламентов, очаги дезориентации
и их расщепление (рис.1.А). Такие деструктивные участки, как правило, сопровожда10
лись вакуолизацией и деструкцией митохондрий, а также деструкцией т-трубочек, саркоплазматических цистерн (триад). У некоторых пациентов была обнаружена грубая
дезориентация миофиламентов с расширением центральных пространств между ними,
заполненных мелкогранулярным материалом на фоне вакуолизации и деструкции митохондрий. В центральных участках со слабо выраженными вышеописанными ультраструктурными изменениями или с полным их отсутствием, были выявлены митохондрии с электронно-плотным матриксом (рис.1.Б).
В периферических (субсарколеммальных) участках часто, хотя и не всегда, выявлялись многочисленные скопления митохондрий с электронно-плотным матриксом
(рис.1.В), в отличие от центральных (межмиофибриллярных) участков мышечных волокон. При этом признаков изменения миофиламентов и других ультраструктур в субсарколеммальных участках не обнаружено (рис.1.Г).
А
В
Б
Г
Рис. 1. Ультраструктурные изменения при врожденной миопатии центрального стержня: (А)
возраст 14 лет. Увл. х 15 000; (Б) возраст 12 лет Увл. х 8 000; (В) возраст 10 лет. Увл. х 6 000;
(Г) возраст 10 лет. Увл. х 6 000.
При митохондриальной миопатии в отличие от миопатии центрального стержня
ультраструктурные изменения затрагивают главным образом митохондрии.
11
Так под сарколеммой мышечных волокон были выявлены участки с массовым набуханием митохондрий, с признаками деструкций крист и с наличием липидных включений (рис.2.А).
Между миофибриллами были обнаружены крупные, удлиненные митохондрии
рис 2.Б), группы митохондрий с частым расположением в виде цепочек или других
своеобразных комплексов (рис.2.В), гипертрофированные митохондрии с деструкцией
наружной мембраны и плотности матрикса. Матрикс большинства межмиофибриллярных митохондрий просветлен и увеличен в объѐме, видны электронно-прозрачные зоны,
лишенные крист, межмембранное пространство сжато (рис.2.Г, Д). Такую ультраструктуру митохондрий связывают с нарушениями сопряжения процессов окисления и фосфолирования. Также под сарколеммой мышечных волокон могут в небольшом количестве встречаться увеличенные митохондрии с электронно-прозрачным матриксом, лишенным крист (рис.2.Е).
А
Г
Б
Д
В
Е
Рис.2. Ультраструктурные изменения митохондрий в скелетной мышечной ткани больных митохондриальной миопатией: (А) возраст 9 лет. Увл. х 15 000; (Б) возраст 13 лет. увл. х 50 000;
(В) возраст 17 лет Увл. х 20 000; (Г) возраст 6 лет. Увл. х 30 000; (Д) возраст 7 лет увл. х 40 000;
(Е) возраст 6 лет. Увл. х 20 000.
Отметим, что у некоторых пациентов в центральных участках мышечных волокон
были выявлены незначительные разрастания соединительной ткани. В таких участках на
фоне истончения, атрофии миофибрилл, обнаружены измельченные митохондрии с не12
четкими контурами и с участками лизиса крист. В центральных участках мышечных волокон были так же, как и при миопатии центрального стержня выявлены атрофические
изменения пучков миофиламентов, очаги дезориентации и их расщепление.
Морфометрическое исследование митохондрий в скелетной мышечной ткани
пациентов
В нашей работе была проведена комплексная морфометрическая оценка электронно-микроскопических изображений поперечнополосатых скелетных мышечных волокон у 21 больного с врожденной миопатией центрального стержня.
Анализ полученных параметров показал, что митохондрии представляют собой
относительно округлые структуры (среднее значение округлости митохондрий 0,8±
0,008 в относительных единицах), со средней площадью 0,13±0,009 мкм2, средним максимальным диаметром Фере 0,5± 0,02 мкм и минимальным диаметром Фере 0,29±0,01.
Введенный нами показатель энергетической обеспеченности мышечного волокна, составил в среднем 0,187 ± 0,03.
Количество и размер митохондрий различались в зависимости от их локализации
в мышечном волокне. Относительное количество митохондрий в субсарколеммальных
участках, более, чем в двое превышало соответствующее значение межмиофибриллярных участков мышечных волокон (рис.3). По размерам межмиофибриллярные митохондрии были достоверно меньше, чем субсарколеммальные (рис.3). В связи с этим определяется существенное различие в значениях удельного объѐма митохондрий в этих участках (рис.3). Было выявлено, что показатель удельного объѐма миофибрилл, также существенно различается в зависимости от их расположения в мышечном волокне. Так, в
субсарколеммальном участке среднее значение удельного объѐма миофибрилл составило 49,39±5,40 %, а в межмиофибриллярном участке 93,32±0,64 %.
Так как, под сарколеммой мышечных волокон локализуется больше по количеству и объѐму митохондрий, чем между миофибриллами, то очевидно, что и энергетическая мощность в этих участках будет больше, чем в центральных участках мышечных
волокон. Среднее значение показателя энергетической обеспеченности мышечного волокна в субсарколеммальном участке 0,34±0,05, а в межмиофибриллярном участке 0,04±
0,02 (рис.3).
13
Относительное количество митохондрий
Площадь митохондрий (мкм2)
Удельный объѐм митохондрий (%)
Показатель ЭОМВ
Рис.3. Сравнение средних морфометрических показателей митохондрий в различных участках
мышечных волокон поперечнополосатой скелетной мышечной ткани больных врожденной
миопатией центрального стержня.
ЭОМВ – энергетическая обеспеченность мышечного волокна.
Также была проведена комплексная морфометрическая оценка электронномикроскопических изображений поперечнополосатых мышечных волокон у 18 пациентов с диагнозом митохондриальная миопатия. В результате морфометрического анализа было выявлено, что митохондрии представляют собой относительно округлые
структуры (среднее значение округлости митохондрий 0,78±0,008 в относительных единицах). Были установлены размерные параметры митохондрий: средняя площадь 0,1±
0,008 мкм 2, средний максимальный диаметр Фере 0,49±0,018 мкм и средний минимальный диметр Фере 0,29±0,09 мкм. Введенный нами показатель энергетической обеспеченности мышечного волокна в среднем составил 0,27±0,122.
Следует отметить, что две популяции: субсарколеммальная и межмиофибриллярная, различались ещѐ в большей степени, чем при миопатии центрального стержня.
Например, количество органелл под сарколеммой, почти втрое больше, чем между миофибриллами мышечных волокон (рис.4).
Размерные характеристики межмиофибриллярных митохондрий меньше, чем у
субсарколеммальных (рис.4). Соответственно в субсарколеммальном участке удельный
14
объѐм митохондрий и показатель энергетической обеспеченности мышечного волокна
значительно больше, чем в межмиофибрилляном (рис.4).
Среднее значение удельного объѐма миофибрилл в межмиофибриллярном участке 81,94 ±5,96 %, а в субсарколеммальном 38+75 ±6+65%.
Данные рангового корреляционного анализа
Вполне объяснимо, что удельный объѐм митохондрий в скелетной мышечной
ткани больных врожденной миопатией центрального стержня, положительно коррелирует с их размерами (с площадью R=0,61; достоверность p<0,05, с периметром
R=0,60; достоверность p<0,05).
Относительное количество митохондрий
Удельный объѐм митохондрий (%)
Площадь митохондрий (мкм2)
Показатель ЭОМВ
Рис.4. Сравнение средних морфометрических показателей митохондрий в различных участках
мышечного волокна больных митохондриальной миопатией.
ЭОМВ – энергетическая обеспеченность мышечного волокна.
Кроме этого была выявлена положительная корреляция между размерами митохондрий и их формой фактор «эллипс» в обеих популяциях митохондрий:
- с площадью митохондрий в субсарколеммальной и межмиофибриллярной популяциях (R=0,98; достоверность p<0,05 и R=0,95; достоверность p<0,05, соответственно);
- с периметром митохондрий (в обеих популяциях коэффициент корреляции составил R=0,97; достоверность p<0,05).
15
Следовательно, увеличение размеров этих органелл сопровождается их удлинением. Более крупные митохондрии имеют вытянутую, эллипсоидную форму. Об этом также свидетельствует положительная корреляция между фактором «эллипс» и удельным
объѐмом митохондрий в субсарколеммальной популяции (R=0,66; достоверность
p<0,05) и в межмиофибриллярной популяции (R=0,48; достоверность p<0,05).
Таким образом, можно предположить, что в качестве ведущего компенсаторного
механизма используется гипертрофия с формированием вытянутых форм митохондрий.
В то же время, следует обратить внимание на умеренную отрицательную корреляцию между относительным количеством митохондрий и их размерами, обнаруженную
для обеих популяций митохондрий:
- с площадью митохондрий в субсарколеммальной популяции (R=-0,43; достоверность p<0,05), а в межмиофибриллярной популяции (R=-0,46; достоверность p<0,05);
- с периметром митохондрий в субсарколеммальной и в межмиофибриллярной
популяциях митохондрий (R= -0,40 и R= -0,51; достоверность p<0,05, соответственно).
Таким образом, при уменьшении размеров митохондрий происходит увеличение
их числа. Мы предполагаем, что это происходит вследствие пролиферации митохондрий.
Положительная корреляция между «эллипсоидностью» субсарколеммальных митохондрий и уровнем лактата до нагрузки глюкозой (R=0,90; достоверность p<0,05) и
после нагрузки (R=0,46; достоверность p<0,05), указывает на то, что более вытянутые
органеллы в большей степени, обеспечивают реакцию ткани в ответ на повышение
уровня молочной кислоты. Субсарколеммальные митохондрии эллипсоидной формы,
представляют собой эффективный в функциональном отношении пул и их число связано положительной корреляцией с коэффициентом «лактат/пируват» после нагрузки
глюкозой (R=0,42; достоверность p<0,05) и с концентрацией креатинина крови (R=0,50;
достоверность p<0,05). Полученные результаты в целом свидетельствуют о том, что
увеличение количества эллипсоидных органелл в субсарколеммальных участках мышечных волокон является важным компенсаторным механизмом при заболеваниях
мышц «немитохондриального» генеза.
Количество и удельный объѐм межмиофибриллярных митохондрий отрицательно
коррелируют с показателем концентрации лактата, как до нагрузки (с относительным
16
количеством R=-0,77; достоверность p<0,05; с удельным объѐмом R=-0,62; достоверность p<0,05), так и после нагрузки глюкозой (R= -0,60; достоверность p<0,05; R= -0,66;
достоверность p<0,05, соответственно). Это может объясняться относительной недостаточностью митохондриальной активности в условиях пониженного количества этих органелл, и соответствующим повышением концентрации молочной кислоты, как биохимическим проявлением этой недостаточности.
Наиболее значимым представляются выявленные отрицательные корреляции:
- между относительным количеством субсарколеммальных митохондрий и степенью тяжести этого заболевания (R= -0,80; достоверность p<0,05) (рис.5);
- удельным объѐмом субсарколеммальных митохондрий и степенью тяжести заболевания (R= -0,76; достоверность p<0,05);
- размерными показателями субсарколеммальных митохондрий и степенью тяжести заболевания (R= -0,72; достоверность p<0,05);
- эллипсоидностью субсарколеммальных митохондрий и степенью тяжести заболевания (R= -0,86; достоверность p<0,05) (рис.5).
Мы считаем, что это свидетельствует о том, что увеличение количества эллипсоидных митохондрий, их размеров и удельного объѐма в субсарколеммальных участках
мышечных волокон скелетной мышечной ткани имеет очевидный компенсаторный эф-
Баллы
Баллы
фект и напрямую связано с более легким течением заболевания.
N
У: степень тяжести заболевания (баллы)
У: степень тяжести заболевания (баллы)
Х: относительное количество митохондрий (N) Х: форма субсарколеммальных митохондрий
фактор «эллипс»
Рис.5. Корреляционная взаимосвязь морфометрических параметров митохондрий с показателем
степени тяжести заболевания у больных врожденной миопатией центрального стержня.
17
Наиболее яркие отличия в межмиофибриллярных и субсарколеммальных популяциях выявлены между взаимосвязями коэффициента лактат/пируват с показателем энергетического обеспеченности мышечного волокна (R=-0,48; достоверность p<0,05,
R=0,46; достоверность p<0,05, соответственно). Показатель энергетической обеспеченности субсарколеммального участка мышечного волокна отрицательно коррелирует со
степенью тяжести заболевания (R=-0,43; достоверность p<0,05) (рис.6.А) и положительно коррелирует с биохимическими параметрами (а именно содержанием креатинина
R=0,63; достоверность p<0,05) (рис.6.Б) и общего кальция R=0,42; достоверность p<0,05
в крови).
В связи, с чем указанный показатель может эффективно использоваться для оцен-
Баллы
Ммоль/л
ки компенсаторных митохондриальных изменений в мышечной ткани.
А.
Б.
У: степень тяжести заболевания (баллы); У: показатель креатинин крови (ммоль/л)
Х: показатель (ЭОМВ)
Х: показатель ЭОМВ (субсарколеммальный)
Рис.6. Корреляционная взаимосвязь между показателями: (А) энергетической обеспеченности
мышечного волокна (ЭОМВ) и степени тяжести заболевания; (Б) энергетической обеспеченности мышечного волокна и креатинина крови у больных врожденной миопатией центрального
стержня.
В субсарколеммальном участке показатель энергетической обеспеченности мышечного волокна отрицательно коррелирует с объѐмом миофибрилл (R= -0,71; достоверность p<0,05). Таким образом, чем больше энергетическая мощность мышечного волокна, тем меньше удельный объѐм миофибрилл.
Следовательно, энергетическая мощность мышечного волокна больше зависит от
удельного объѐма митохондрий, а не от объѐма миофибрилл в этом участке. Об этом
18
свидетельствует выявленная положительная корреляция между данным показателем и
удельным объѐмом митохондрий (R=0,53; достоверность p<0,05).
При митохондриальной миопатии обнаружена достоверная положительная корреляция между показателем энергетической обеспеченности мышечного волокна и
удельным объѐмом митохондрий (R=0,83; достоверность p<0,05), которая свидетельствует, о том, что увеличение энергетической мощности мышечного волокна сопровождается пропорциональным увеличением объѐма митохондрий во всех участках мышечного
волокна. В субсарколеммальном участке выявлена отрицательная корреляция между показателем энергетической обеспеченности мышечного волокна и удельным объѐмом
миофибрилл (R=-0,62; достоверность p<0,05), а в межмиофибриллярном (R= -0,82; достоверность p<0,05).
Однако, в отличие от миопатии центрального стержня, при митохондриальной
миопатии увеличение объѐма митохондрий в субсарколеммальном и межмиофибриллярном участке достигается только за счѐт увеличения размеров митохондрий (т.е. гипертрофии). Это подтверждает выявленная положительная корреляция между удельным
объѐмом митохондрий и их размерами в обеих популяциях:
- с площадью митохондрий (в субсарколеммальной популяции R=0,45; достоверность p<0,05, а в межмиофибриллярной R=0,52; достоверность p<0,05);
- с периметром митохондрий (в субсарколеммальной популяции R=0,48; достоверность p<0,05, а в межмиофибриллярной R=0,62; достоверность p<0,05);
- с максимальным диаметром Фере митохондрий (в субсарколеммальной и в
межмиофибриллярной R=0,45, R=0,63; достоверность p<0,05).
- с минимальным диаметром Фере митохондрий (в межмиофибриллярной популяции R=0,47; достоверность p<0,05).
Кроме этого была выявлена положительная корреляция между размерами и формой фактор «эллипс» этих органелл. Так, в субсарколеммальной популяции (с площадью R=0,55; достоверность p<0,05, с периметром R=0,80; достоверность p<0,05, с максимальным и минимальным диаметром Фере R=0,98, R=0,89; достоверность p<0,05), а в
межмиофибриллярной популяции (с площадью R=0,93; достоверность p<0,05, с периметром R=0,97; достоверность p<0,05, а с максимальным и минимальным диаметром
Фере R=0,99, R=0,90; достоверность p<0,05). Таким образом, также как и при миопатии
19
центрального стержня, чем больше удельный объѐм митохондрий, тем они становятся
крупнее и принимают эллипсоидную форму.
Однако установленная отрицательная корреляция между относительным количеством межмиофибриллярных митохондрий и относительной электронной плотностью
этих органелл (R=-0,52; достоверность p<0,05) указывает на то, что в межмиофибриллярных участках мышечных волокон мало функционально активных митохондрий.
Также в межмиофибриллярной популяции митохондрий обнаружена отрицательная корреляция между размерами митохондрий и их электронно-оптической плотностью
(R= -0,45; достоверность p<0,05). Это, очевидно, позволяют сделать вывод о том, что
эллипсоидность характерна для менее функционально активных органелл в этом участке. Таким образом, с увеличением размеров митохондрий форма этих органелл меняется
от округлой к эллипсоидной форме с более светлым матриксом и с менее развитыми
кристами. Следовательно, можно предположить, что мышечное волокно может обслуживаться малым количеством мелких округлых митохондрий.
Выявленная отрицательная корреляция между числом субсарколеммальных митохондрий и концентрациями лактата (R=-0,40; достоверность p<0,05) в периферической крови, очевидно, свидетельствуют о том, что число органелл именно в этом участке может варьировать и играть, таким образом, существенную роль в реализации обмена
глюкозой.
Отмеченное различие между субсарколеммальными и межмиофибриллярными
митохондриями, выявляется в том, что только у первых из них отмечается выраженная
положительная взаимосвязь между числом, удельным объѐмом митохондрий и уровнем
креатинина в крови (R=0,67; R=0,64; достоверность p<0,05, соответственно). Это подтверждает наши предположения о том, что количество субсарколеммальных митохондрий влияет на интенсивность энергообмена в мышце.
Важно отметить, что количество митохондрий во всех участках мышечного волокна не связано достоверным соотношением со степенью тяжести заболевания. Считаем, это принципиальной особенностью митохондриальной миопатии, адаптационная вариабельность этого показателя в отличие от «немитохондриальных» заболеваний не является достаточно эффективной, чтобы воздействовать на тяжесть заболевания в целом.
20
Была выявлена положительная корреляции между размерными показателями
(площадью, периметром) митохондрий и коэффициентом «лактат/пируват» до нагрузки
глюкозой (в субсарколеммальной популяции с площадью R=0,52; достоверность p<0,05
а с периметром R=0,50; достоверность p<0,05, а в межмиофибрилярной популяции
R=0,46; R=0,51; достоверность p<0,05, соответственно), через час после нагрузки глюкозой в субсарколеммальной популяции (R=0,40, R=0,40; достоверность p<0,05, соответственно), а через три часа после нагрузки только в субсарколеммальной популяции была
установлена отрицательная корреляция (R=-0,53, R=-0,47; достоверность p<0,05, соответственно). Мы предположили, что более крупные и светлые органеллы менее эффективно справляются с метаболизмом глюкозы. Установленный факт является доказательством значительного истощения митохондрий в условиях митохондриального заболевания.
Предположения о компенсаторной роли увеличения числа субсарколеммальных
митохондрий в мышцах больных митохондриальной миопатией также находят свое подтверждение при анализе взаимоотношения введенными нами показателя энергетического обеспечения мышечного волокна с концентрациями креатинина крови (R=0,68; достоверность p<0,05).
ВЫВОДЫ
1.
При врожденной миопатии центрального стержня количество и размеры мито-
хондрий в межмиофибриллярных и субсарколеммальных участках мышечных волокон
существенно различаются между собой, в то время как форма и электронная плотность
этих органелл в вышеуказанных участках одинаковы; Выявлена достоверная отрицательная корреляция между размерами митохондрий и их количеством, при этом удельный объѐм митохондриальной популяции в большей степени зависит от размеров отдельных органелл, а не от их количества.
2. Относительное количество митохондрий в мышечном волокне при врожденной
миопатии центрального стержня связано положительными корреляциями с метаболической активностью мышечной ткани; при этом увеличение числа митохондрий в большей
степени характерно для относительно эффективной компенсации тканевого энергообмена, а повышение размеров органелл происходит на фоне его декомпенсации.
3. Относительное количество митохондрий в периферических участках мышечных
21
волокон у больных миопатией центрального стержня положительно коррелирует с базовыми биохимическими показателями энергообмена; в то же время степень функциональной активности митохондрий, выражающаяся в их относительной эллипсоидности,
больше обусловливает адаптационный потенциал тканевых биоэнергетических реакций
и эффективность тканевого ответа на повышение концентрации глюкозы в организме.
4. При врожденной миопатии центрального стержня, увеличенные субсарколеммальные скопления митохондрий, имеют компенсаторную природу; повышение размеров этих органелл под сарколеммой и в меньшей степени увеличение их количества в
этих участках достоверно коррелирует со снижением степени тяжести заболевания.
5. При митохондриальной миопатии морфометрические характеристики митохондрий во многом изменены за счет набухания и деструкции, наиболее сохранными очевидно являются относительно мелкие и округлые органеллы; при этом отрицательная
корреляция между размерами и количеством митохондрий в мышечном волокне не выявляется, что свидетельствует о нарушении механизма поддержания объѐма митохондриальной популяции за счѐт координации процессов пролиферации и роста этих органелл.
6. Корреляционный анализ морфометрических характеристик митохондрий и клинико-лабораторных показателей при митохондриальной миопатии показывает, что увеличение удельного объѐма субсарколеммальных митохондрий в условиях полисистемной митохондриальной недостаточности имеет адаптационное значение для всего организма; в то же время в отличие от миопатии центрального стержня удельный объѐм митохондрий в мышечном волокне при митохондриальной миопатии не связан достоверным соотношением со степенью тяжести заболевания, то есть адаптационная вариабельность этого показателя в отличие от «немитохондриальных» заболеваний не является достаточно эффективной, чтобы воздействовать на тяжесть заболевания в целом.
7. Предложенный нами показатель энергетического обеспечения мышечного волокна, выражающий соотношение удельного объѐма митохондрий к удельному объѐму
миофибрилл и отрицательно коррелирующий со степенью тяжести заболевания, может
эффективно использоваться для оценки компенсаторных митохондриальных изменений
в мышечной ткани при различных нервно-мышечных заболеваниях.
22
Практические рекомендации
1. При дифференциальной диагностике биопсийного материала поперечнополосатой
скелетной мышечной ткани больных врожденной миопатией центрального стержня и
митохондриальной миопатией следует учитывать полученные в работе взаимосвязи между морфометрическими параметрами митохондрий и клинико-лабораторными показателями, позволяющие значительно уменьшить число проводимых биопсий.
2. Предложенный в работе показатель энергетической обеспеченности мышечного волокна может быть эффективно применен для оценки компенсаторных митохондриальных изменений в скелетной мышечной ткани при различных нервно-мышечных заболеваниях.
3. Полученные результаты морфометрического анализа митохондрий при наследственно
обусловленных патологических состояниях скелетной мышечной ткани могут быть использованы в качестве диагностических маркеров в неврологической практике при
оценке характера течения нервно-мышечных заболеваний.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Виноградская И.С. Адаптационные возможности мышечной ткани при болезни центрального стержня. / В.С. Сухоруков, Д.А. Харламов, И.С. Виноградская и др. // Материалы Третьего Балтийского конгресса по детской неврологии. С-Пб. - 2011.- с.94-95.
2. Виноградская И.С. Диагностическая эффективность биопсии мышечной ткани при
болезни центрального стержня. / В.С. Сухоруков, Д.А. Харламов, И.С. Виноградская и
др. // Материалы Всероссийской научно-практической «Приоритетные направления охраны здоровья ребенка в неврологии и психиатрии (диагностика, терапия, реабилитация
и профилактика)». Тула - 2011.- с. 110-111.
3. Виноградская И.С. Компенсаторный эффект митохондриальных изменений при врожденной миопатии «центрального стержня». / В.С. Сухоруков, П.А. Шаталов, И.С. Виноградская и др. // Материалы Научно-практической конференции с международным
участием «Фармакотерапия и диетология в педиатрии» и VIII Конференция «Педиатрия
и детская хирургия в Приволжском федеральном округе». Казань – 2011. - с. 177.
4. Виноградская И.С. Значение митохондриальных изменений при врожденной миопатии «центрального стержня». // Материалы VII Международной Пироговской научной
23
медицинской конференции студентов и молодых ученых. Москва Вестник РГМУ. Москва - 2012 . Специальный выпуск №1. - с. 240.
5. Виноградская И.С. Ультраструктурные изменения скелетномышечной ткани при нарушениях рианодиновых рецепторов. / П.А. Шаталов, И.С. Виноградская // Материалы
XIX международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых
«Ломоносов». Москва - 2012. - С.146-147.
6. Виноградская И.С. Применение электронной микроскопии в дифференциальной диагностике врождѐнной миопатии «центрального стержня». // В.С. Сухоруков, П.А. Шаталов, И.С. Виноградская и др. // Сб. материалов XI Российского Конгресса «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии». Москва - 2012. - с.145.
7. Виноградская И.С. Морфометрические особенности митохондрий поперечнополосатых мышечных волокон при врожденной миопатии «центрального стержня». // В.С. Сухоруков, И.С. Виноградская, П.А. Шаталов и др. // Сб. материалов XI Российского Конгресса «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии». Москва - 2012. с. 270-271.
8. Виноградская И.С. Электронно-микроскопические критерии дифференциальной диагностики врожденной миопатии «центрального стержня» у человека. / П.А. Шаталов,
В.С. Сухоруков, И.С. Виноградская и др. // Вестник Российского государственного
медицинского университета. – 2012. № 5. - с. 66-70.
9. Виноградская И.С. Морфометрический анализ изменений митохондрий в мышечном
волокне при митохондриальной миопатии. / И.С. Виноградская, П.А. Шаталов. // Материалы XX международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Москва -2013. - с. 146.
10. Виноградская И.С. Морфометрическое подтверждение компенсаторной роли митохондрий при врожденной миопатии «центрального стержня». / И.С. Виноградская, В.С.
Сухоруков, Д.А. Харламов. // Сб. материалов XII Российского Конгресса «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии». Москва -2013. - с.154.
11. Виноградская И.С. Морфометрический анализ характеристик митохондрий в скелетной мышечной ткани больных детей врожденной миопатией центрального стержня. /
И.С. Виноградская. // Материалы XХI международной научной конференции студентов,
аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Москва - 2014.- с. 157.
24
12. Виноградская И.С. Новые доказательства адаптационной роли митохондриальных
изменений при врожденной миопатии центрального стержня. / И.С. Виноградская, В.С.
Сухоруков, Д.А. Харламов и др. // Российский вестник перинатологии и педиатрии. 2014. Том 59.- № 2. – с. 80-82.
13. Виноградская И.С. Митохондриальная сеть скелетных мышечных волокон. / И.С.
Виноградская, Т.Г. Кузнецова, Е.А. Супруненко. // Вестник Московского Университета. Серия 16. Биология. – 2014. № 2. с.16-26.
14. Vinogradskaya I.S. Adaptive role of mitochondrial changes in congenital central core
myopathy. / Vinogradskaya I.S., Sukhorukov V.S., Kharlamov D.A., et al. // 13th International
congress on Neuromuscular Diseases. - 2014. - P.172.
Список сокращений
СДГ – сукцинатдегидрогеназа;
ЛДГ – лактатдегидрогеназа;
ЭОМВ – энергетическая обеспеченность мышечного волокна
25
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа