close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Вакансия: Менеджер по продажам ( банк+страхование) Условия;pdf

код для вставкиСкачать
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
(19)
RU
(11)
2 506 595
(13)
C2
(51) МПК
G01N 33/68
(2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
(12) ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21)(22) Заявка: 2012116999/15, 26.04.2012
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
26.04.2012
(72) Автор(ы):
Гареева Анна Эмировна (RU),
Закиров Денис Филарисович (RU),
Хуснутдинова Эльза Камилевна (RU)
C 2
2 5 0 6 5 9 5
R U
(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ПАРАНОИДНОЙ ШИЗОФРЕНИИ
(57) Реферат:
Предлагаемое изобретение относится к
медицине, а именно к медицинской генетике и
психиатрии, и может быть использовано для
прогнозирования риска развития параноидной
шизофрении. Сущность способа: выделяют
ДНК
методом
фенольно-хлороформной
экстракции, проводят генотипирование по
полиморфным локусам rs 1443445 гена NTRK2,
rs 1946698, rs 7170062, rs 11631508 гена NTRK3,
rs 1469794 гена NRXN1, при выявлении
генотипа
NTRK2*C/*C
(rs
1443445),
генотипа
NTRK3*G/*G
(rs
1946698),
генотипа
NTRK3*T/*T
(rs
7170062),
генотипа NTRK3*A/*A (rs 11631508) у русских;
генотипа NRXN1*A/*A (rs 1469794) у татар,
прогнозируют риск развития параноидной
шизофрении.
Использование
изобретения
позволяет получить точный, объективный
прогноз развития заболевания. 1 табл., 2 пр., 5
ил.
(56) (продолжение):
Ñòð.: 1
ru
C 2
Адрес для переписки:
450054, г.Уфа, пр-кт Октября, 71,
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт биохимии и
генетики Уфимского научного центра
Российской академии наук (ИБГ УНЦ РАН),
патентоведу О.Г. Милюковой
2 5 0 6 5 9 5
(73) Патентообладатель(и):
Федеральное государственное бюджетное
учреждение науки Институт биохимии и
(43) Дата публикации заявки: 10.11.2013 Бюл. № 31
генетики Уфимского научного центра
(45) Опубликовано: 10.02.2014 Бюл. № 4
Российской академии наук (ИБГ УНЦ РАН)
(RU),
(56) Список документов, цитированных в отчете о
Федеральное государственное бюджетное
поиске: WO 2009143622 A1, 03.12.2009. WO
образовательное учреждение высшего
2001087231 A2, 22.11.2001. RU 2338788 C2,
профессионального образования
20.11.2008. ЛАВРУШИНА О.М. и др.
"Башкирский государственный университет"
Влияние полиморфизма гена рецептора
(БашГУ) (RU)
серотонина типа 2а на прогноз шизофрении с
ранним началом, медицинская генетика. - М.:
Гениус Медиа, 2005, т. 4, №5, с.217.
АХМЕРОВА И. Ю. Клиникоэпидемиологическое и молекулярногенетическое (см. прод.)
R U
Приоритет(ы):
(22) Дата подачи заявки: 26.04.2012
исследование шизофрении в Республике Башкортостан. Автореф. дисс. к.м.н. - М., 2012, с.131.
R U
R U
2 5 0 6 5 9 5
C 2
C 2
2 5 0 6 5 9 5
Ñòð.: 2
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
2 506 595
(13)
C2
(51) Int. Cl.
G01N 33/68
(2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY
(12) ABSTRACT
OF INVENTION
(72) Inventor(s):
Gareeva Anna Ehmirovna (RU),
Zakirov Denis Filarisovich (RU),
Khusnutdinova Ehl'za Kamilevna (RU)
(21)(22) Application: 2012116999/15, 26.04.2012
(24) Effective date for property rights:
26.04.2012
(43) Application published: 10.11.2013 Bull. 31
(45) Date of publication: 10.02.2014 Bull. 4
genetic type NTRK2*C/*C (rs 1443445), the genetic
type NTRK3*G/*G (rs 1946698), the genetic type
NTRK3*T7*T (rs 7170062), the genetic type
NTRK3*A/*A (rs 11631508) in Russian people; the
genetic type NRXN1*A/*A (rs 1469794) in the Tatar
people, the risk of paranoid schizophrenia is
predicted.
EFFECT: using the invention enables the more
accurate, objective prediction of the disease.
1 tbl, 2 ex, 5 dwg
R U
2 5 0 6 5 9 5
(57) Abstract:
FIELD: medicine.
SUBSTANCE: present invention refers to
medicine, namely to medical genetics and psychiatry,
and may be used for the prediction of a risk of
paranoid schizophrenia. Substance of the method:
DNA is recovered by phenol-chloroform extraction
that is followed by genetic typing of polymorphous
locus rs 1443445 of NTRK2 gene, locus rs 1946698,
locus rs 7170062, locus rs 11631508 of NTRK3 gene,
locus rs 1469794 of NRXN1 gene; if observing the
Ñòð.: 3
en
C 2
C 2
(54) METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF PARANOID SCHIZOPHRENIA
2 5 0 6 5 9 5
Mail address:
450054, g.Ufa, pr-kt Oktjabrja, 71, Federal'noe
gosudarstvennoe bjudzhetnoe uchrezhdenie nauki
Institut biokhimii i genetiki Ufimskogo nauchnogo
tsentra Rossijskoj akademii nauk (IBG UNTs
RAN), patentovedu O.G. Miljukovoj
(73) Proprietor(s):
Federal'noe gosudarstvennoe bjudzhetnoe
uchrezhdenie nauki Institut biokhimii i genetiki
Ufimskogo nauchnogo tsentra Rossijskoj akademii
nauk (IBG UNTs RAN) (RU),
Federal'noe gosudarstvennoe bjudzhetnoe
obrazovatel'noe uchrezhdenie vysshego
professional'nogo obrazovanija "Bashkirskij
gosudarstvennyj universitet" (BashGU) (RU)
R U
Priority:
(22) Date of filing: 26.04.2012
RU 2 506 595 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике
и психиатрии, и может быть использовано для прогнозирования риска развития
параноидной шизофрении.
Шизофрения - комплексное полигенно-наследуемое расстройство психики и
головного мозга, манифестирующее в результате взаимосочетания
предрасполагающих факторов наследственности и среды (психогенных, социогенных,
экзогенных) и проявляющееся дезорганизацией и диссоциацией психических функций с
развитием спектра психотических симптомов в виде бреда и галлюцинаций,
специфическими нарушениями мышления и постепенным формированием
эмоционально-волевого и когнитивного дефицита (Тиганов, 1999; Мосолов с соавт.,
2010; Gottesman et al., 2003; Tamminga et al., 2005). В 2001 году Всемирная организация
здравоохранения внесла шизофрению в список десяти ведущих причин
инвалидности (Tandon et al., 2008).
Несмотря на значительные успехи нейробиологии и фармакологии,
способствовавших формированию новых концепций патогенеза, диагностики, лечения
и профилактики шизофрении, данное заболевание по своим многообразным
последствиям является одним из самых тяжелых и по-прежнему представляет
серьезную социально-экономическую проблему, связанную с хроническим характером
болезни и четко выраженной тенденцией к углублению расстройств психики и
инвалидизации больных (Гурович с соавт., 2002; Любов с соавт., 2008). В связи с этим,
важной задачей, является необходимость исследования механизмов развития данного
заболевания с целью разработки эффективных методов диагностики, профилактики и
патогенетической терапии с учетом этнической принадлежности и генетической
предрасположенности каждого больного. Изучение структурных особенностей
генома, предрасполагающих к развитию различных многофакторных заболеваний,
особенно с использованием значительного числа полиморфных локусов, позволяет
оценить их вклад в этиопатогенез и выявлять факторы риска развития заболевания, а
также разрабатывать профилактические мероприятия. Исследование полиморфных
вариантов генов-кандидатов шизофрении дает возможность установить генетические
факторы повышенного и пониженного риска развития этой патологии,
представляющие собой различные сочетания тех или иных аллелей и генотипов.
Применение разработанного способа обеспечит выявление лиц с повышенным
риском развития параноидной шизофрении (ПШ) с целью формирования групп
высокого риска и осуществления своевременных, целенаправленных мероприятий по
профилактике развития данной патологии.
Известен способ прогнозирования риска развития шизофрении (Ш) на основании
учета роли наследственного фактора, согласно которому считается, что риск развития
Ш у родителей больных составляет 14%, у братьев и сестер - 15-16%, у детей больных
родителей - 10-12%, у дядей и теток - 5-6%. (Тиганов, 1999). Недостатком данного
способа является недостаточная точность и информативность, а также возможность
расчета риска только в том случае, если в семье есть больные шизофренией.
Задачей изобретения стала разработка объективного, высокоинформативного
способа прогнозирования риска развития параноидной шизофрении.
Технический результат при использовании изобретения повышение точности
прогноза.
Указанный технический результат достигается тем, что выделяют ДНК методом
фенольно-хлороформной экстракции, проводят генотипирование полиморфных
локусов rs 1443445 гена NTRK2, rs 1946698, rs7170062, rs 11631508 гена NTRK3, rs
Ñòð.: 4
DE
RU 2 506 595 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
1469794 гена NRXN1 при выявлении аллеля NTRK2*C (rs 1443445), NTRK3*G (rs
1946698), NTRK3*T (rs 7170062), NTRK3*A (rs 11631508) и генотипа NTRK3*G/*G (rs
1946698), NTRK3*T/*T (rs 7170062) у русских; аллеля NRXN1*А (rs 1469794) у татар,
прогнозируют риск развития параноидной шизофрении.
Способ осуществляется следующим образом. ДНК выделяют из лимфоцитов
периферической крови фенольно-хлороформной экстракции. Кровь набирают в
пробирку с консервантом, содержащим 0,48% лимонной кислоты, 1,32%
лимоннокислого натрия, 1,47% глюкозы, в соотношении 6:1, тщательно
перемешивают и хранят при температуре 40°С не более одной недели. Для выделения
ДНК к 8 мл крови добавляют 32 мл лизирующего буфера, содержащего 320 мМ
сахарозы, 1% тритон Х-100, 5 мМ MgCl2, 10 мМ трис-HCl, рН 7,6. Полученную смесь
перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об./мин. в течение 20 минут.
Надосадочную жидкость сливают, к осадку повторно приливают 20 мл лизирующего
буфера и центрифугируют при тех же условиях в течение 10 мин. К полученному
осадку добавляют 400 мкл буфера Soline ЭДТА (25 мМ ЭДТА, рН 8,0 и 75 мМ NaCl),
40 мкл 10% SDS, 30-40 мкл протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют при 37°С в
течение 16 часов. После этого из лизата последовательно в три этапа проводят
экстракцию ДНК равными объемами забуференного фенола (200 мкл
меркаптоэтанола на 50 мл фенола - Трис-HCI, рН 7,8), смесью фенол-хлороформа (1:1)
и хлороформа с центрифугированием при 10000 об./мин. в течение 10 минут и отбором
водной фазы после каждого этапа. ДНК осаждают двумя объемами 96% этанола.
Осадок промывают 70% этанолом, подсушивают на воздухе, растворяют в
дистиллированной воде и хранят при -20°С. Выделенная ДНК используется для
проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР).
Амплификация изученных ДНК-локусов rs 1443445 гена NTRK2, rs 1946698, rs
7170062, rs 11631508 гена NTRK3, rs 1469794 гена NRXN1 проводят методом ПЦР
синтеза ДНК в 25 мкл общего объема смеси, содержащей 2,5 мкл 10×Taq-буфера (67
мМ трис-HCl (рН 8,8), 16,6 мМ (NH4)2SO4 ,, 1,5 мМ MgCl2, 0,01% Tween-20), 0,1 мкг
геномной ДНК, смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP no 200 мкМ каждого), 1 ед. ДНКполимеразы Termus aquaticus (производства фирмы «Силекс», г.Москва) и 5-10 пМ
локусспецифичных олигонуклеотидных праймеров. Перечень исследуемых локусов,
последовательности праймеров, размеры амплифицируемых фрагментов и
температурные режимы ПЦР представлены в таблице 1.
Для определения нуклеотидных замен проводят гидролиз амплифицированных
фрагментов соответствующей рестриктазой. Данные о рестрикционных локусах,
названия рестриктаз и длины продуктов расщепления представлены в таблице 1.
Рестрикцию полиморфного локуса rs 1443445 гена NTRK2 проводили эндонуклеазой
рестрикции BstSFI, rs 1946698 гена NTRK3 - KspAI, rs 7170062 гена NTRK3- Cac8I, rs
11631508 гена NTRK3- Hpy188I, rs 1469794 гена NRXN1- Mph1103I, в соответствии с
рекомендациями фирм-производителей.
Разделение фрагментов ДНК после амплификации и рестрикции проводят при
помощи электрофореза в 7% полиакриламидном геле (ПААГ), приготовленном из 30%
раствора ПААГ (соотношение акриламид:N,N'-метиленбисакриламид - 29:1).
Электрофорез проводят в 1×ТБЕ буфере (0,089 М трис-HCl; 0,089 М борная кислота;
0,002 М ЭДТА, рН=8,0). Перед нанесением на гель пробы смешивают в
соотношении 5:1 с краской, содержащей 0,25% бромфенолового синего, 0,25%
ксиленцианола и 15% фикола. После окончания электрофореза гель окрашивают
раствором бромистого этидия и визуализируют при УФ-освещении на
Ñòð.: 5
RU 2 506 595 C2
5
10
15
20
25
30
трансиллюминаторе.
Частоты аллелей определяются по формуле (Животовский, 1991).
pi=Ni/N,
где Ni - число i-ых аллелей, N - объем выборки.
Стандартная ошибка частоты аллелей рассчитывается по формуле:
S=√pi(1-pi)/2N
При попарном сравнении частот генотипов и аллелей в группах больных и
здоровых лиц используется критерий χ 2 (Р) для таблиц сопряженности 2×2 с поправкой
Иэйтса на непрерывность, вычисляемый по формуле:
,
где n1 и n2 - объемы сравниваемых распределений; p1 и р2 - частоты
соответствующих классов. При числе наблюдаемых случаев <5 используется точный
двусторонний критерий Фишера р(F2).
Для выявления факторов повышенного и пониженного риска развития
параноидной шизофрении, проводится, для статистически значимо различающихся
вариаций вышеуказанных полиморфных ДНК-локусов, оценка статистики связи показателя отношения шансов (OR-odds ratio), а также границ его 95% доверительного
интервала (CI95%). OR является мерой ассоциации, количественно определяющей
взаимосвязь между фактором риска и развитием определенного признака. Степень
ассоциаций оценивается в значениях показателя соотношения шансов по формуле:
OR=(a×d)/(b×c),
где а - число лиц с наличием, b - с отсутствием маркера среди больных; с и d - число
лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера среди здоровых. При OR=1 нет
ассоциации, OR>1 рассматривается как положительная ассоциация с аллелем или
генотипом («фактор повышенного риска») и OR<1 - как отрицательная ассоциация
(«фактор пониженного риска»). Доверительный интервал для показателя отношения
шансов рассчитывается по следующей формуле:
35
40
45
50
Проведено клинико-генетическое изучение группы больных русских и татар с
параноидной шизофренией (N=436), проживающих в Республике Башкортостан.
Нозологический диагноз параноидной шизофрении F20.хх (с непрерывным или
эпизодическим типом течения, с неполной или отсутствием ремиссии) основывался на
данных комплексного клинико-параклинического обследования больных с учетом
диагностических критериев, представленных в МКБ-10. Диагноз верифицировался на
основании клинико-анамнестического обследования, лабораторного обследования,
данных ЭКГ, УЗИ, РЭГ, ЭЭГ, МРТ.
В контрольную группу вошли здоровые доноры (N=307) соответствующего
возраста и этнической принадлежности.
Нейротрофины - семейство структурно родственных пептидов, играющих важную
роль в регуляции и развитии как центральной, так и периферической нервной системы,
вовлечены в процессы выживания и дифференцировки нейронов в течение
эмбрионального развития, а также синаптической пластичности в различных регионах
мозга (Hunnerkopf et al., 2007).
Исследования на животных моделях по гену-нокауту NTRK1 (рецептор BDNF)
Ñòð.: 6
RU 2 506 595 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
обнаружили повреждения процессов выживания и дифференцировки неокортикальных
нейронов (Gates et al., 2000), а также нарушения в их обучении и поведении при
стрессовых ситуациях (Minichiello et al., 1999). Согласно литературным данным ряд
локусов гена тирозинкиназного рецептора NTRK2 (9q22.1) ассоциированы с
шизофренией (Pilla et al., 2008) с униполярной депрессией (Dong et al. 2009),
суицидальным поведением (Kohli et al., 2010), биполярным расстройством (Smith et
al., 2009), также было показано снижение экспрессии генов BDNF и TrkB в некоторых
структурах головного мозга (Thompson et al., 2011).
Проведенное исследование полиморфного локуса rs 1443445 гена NTRK2 выявило
выраженные отличия в распределении частот аллелей (χ2=4,02, Р=0,05) и генотипов
(χ 2=7,78; Р=0,02) между больными ПШ и здоровыми донорами русской этнической
принадлежности. Для оценки риска развития заболевания использовалась таблица
сопряженности 2×2 с вычислением статистик связи (с поправкой Иэйтса). У больных
ПШ частота аллеля NTRK2*С была выше, чем в соответствующей контрольной
группе русских (χ2=4,02, Р=0,05; OR=1,69, 95%CI 1,04-2,77) (фиг.1). Таким образом,
анализ полиморфного локуса rs 1443445 гена NTRK2 выявил ассоциацию
аллеля NTRK2*С с ПШ у больных русской этнической принадлежности.
Один из нейротрофических факторов - нейротрофин 3 - участвует в процессах,
контролирующих выживание взрослых нейронов, и в регуляции нервной системы;
кроме того, действие нейротрофина 3 опосредовано его взаимодействием с
тирозинкиназным рецептором TrkC, кодируемого геном NTRK3 (Conner et al., 2008).
Вариации в гене NTRK3 (15q25) могут обуславливать развитие психических
расстройств. Ассоциативные исследования показали вовлеченность некоторых
полиморфных вариантов в гене NTRK3 в развитие шизофрении и аффективных
расстройств (Weickert et al., 2005; Feng et al., 2008; Dwivedi et al., 2009; Otaess, 2009).
В результате изучения полиморфного локуса rs 1946698 гена NTRK3 были показаны
достоверные различия в распределении частот генотипов (χ2=19,24, Р<0,000) и
аллелей (χ2=16,37, Р=0,0001) между больными ПШ и здоровыми индивидами русской
этнической принадлежности, за счет достоверно более высокой частоты
генотипа NTRK3*G/*G (χ2=16,37, Р=0,0001; OR=5,69, 95%CI 2,38-13,61) и
аллеля NTRK3*G у русских больных ПШ по сравнению с контрольной группой (χ2=
16,23, Р=0,0001; OR=2,36, 95%CI 1,564-3,55) (фиг.2).
Исследование полиморфного локуса rs 7170062 гена NTRK3 продемонстрировало
нам достоверно значимые различия в распределении частот генотипов (χ2=18,39,
Р<0,000) и аллелей (χ2=17,46, Р=0,00003) между больными ПШ и здоровыми
индивидами русской этнической принадлежности. За счет достоверно более высокой
частоты генотипа NTRK3*T/*T у больных (χ2=6,85, Р=0,01; OR=2,99, 95%CI 1,37-6,54)
Показатель соотношения шансов для носителей аллеля NTRK3*Т составил 2,65 (С195%
1,69-4,16) (фиг.3).
Был проведен анализ распределения частот генотипов и аллелей полиморфного
локуса rs 11631508 гена NTRK3 между группами больных ПШ и здоровых в результате
которого нами была обнаружена ассоциация аллеля NTRK3*A с риском развития ПШ
у русских (χ2=7,74, Р=0,01; OR=2,18, 95%CI 1,28-3,69) (фиг.4).
Нейрексины - полиморфные мембранные белки, экспрессирующиеся в нейронах, и
необходимые для нормального высвобождения нейромедиаторов и обеспечивающие
функционирование синапсов (Kirov et al., 2009). Нарушения во взаимодействии
нейрексинов с нейролигинами (белков, участвующих в образовании синаптических
контактов между нейронами) может играть роль в патогенезе расстройств
Ñòð.: 7
RU 2 506 595 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
аутистического спектра и когнитивных отклонений (Sudhof et al., 2008). Поскольку
нейрексины (в частности, NRXN1) имеют большое число изоформ и сайтов
сплайсинга, то полиморфные локусы, находящиеся в этих сайтах, могут приводить к
формированию функционально различных белков. Было показано, что делеции
размером до нескольких сот тысяч пар оснований (т.п.о.) в гене нейрексина 1
NRXN1(2p16.3) приводят к развитию таких психических заболеваний, как
шизофрения (Rujescu et al., 2009).
Изучение полиморфного локуса rs 1469794 гена NRXN1 показало статически
значимые различия в распределении частот генотипов (χ 2=9,47, Р=0,01) и аллелей
(χ 2=9,35, Р=0,002) между группами больных ПШ и здоровых татарской этнической
принадлежности. Показатель соотношения шансов для носителей аллеля NRXN1*А
составил 2,75 (CI95% 1,47-5,15) (фиг.5).
Таким образом, исследование полиморфных вариантов генов NTRK2 NTRK3
и NRXN1 показало наличие ассоциации аллелей NTRK2*С, NTRK3*G, NTRK3*T,
NTRK3*A и генотипов NTRK3*G/*G, NTRK3*T/*T с ПШ у русских и аллеля
NRXN1*А (rs 1469794) у татар.
На фигуре 1 изображено распределение частот аллелей и генотипов полиморфного
локуса rs 1443445 гена NTRK2 в группе больных ПШ русской этнической
принадлежности и в контрольной группе
На фигуре 2 изображено распределение частот аллелей и генотипов полиморфного
локуса rs 1946698 гена NTRK3 в группе больных ПШ русской этнической
принадлежности и в контрольной группе
На фигуре 3 изображено распределение частот аллелей и генотипов полиморфного
локуса rs 7170062 гена NTRK3 в группе больных ПШ русской этнической
принадлежности и в контрольной группе
На фигуре 4 изображено распределение частот аллелей и генотипов полиморфного
локуса rs 11631508 гена NTRK3 в группе больных ПШ русской этнической
принадлежности и в контрольной группе
На фигуре 5 изображено распределение частот аллелей и генотипов полиморфного
локуса rs 1469794 гена NRXN1 в группе больных ПШ татарской этнической
принадлежности и в контрольной группе
Пример 1. Больная В., 1965 г.р., русская.
Клинический диагноз: параноидная шизофрения, непрерывный тип течения,
отсутствие ремиссии.
С целью проведения анализа полиморфных локусов rs 1443445 гена NTRK2, rs
1946698, rs 7170062, rs 11631508 гена NTRK3, у больной было взято 8 мл венозной
крови, из которой выделена ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции.
Амплификация полиморфных ДНК-локусов проводилась в 25 мкл общего объема
смеси, содержащей 67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 16,6 мМ (NH4)2SO4, 2,5 мМ MgCl2, 0,1 мкг
геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера (табл.1), по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP,
dTTP и 1 единицу ДНК-полимеразы. Температурные режимы ПЦР представлены в
таблице 1. Затем был проведен электрофорез ПЦР-продуктов в 7%
полиакриламидном геле при постоянном напряжении 280-300 вольт в течение 1 часа.
После окончания электрофореза гель был окрашен раствором бромистого этидия в
течение 10 минут и проанализирован при ультрафиолетовом освещении. Далее, после
определения наличия продукта амплификации, проводился анализ полиморфизма
длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) путем гидролиза амплификационного
фрагмента эндонуклеазой рестрикции: ПДРФ анализ полиморфного локуса rs 1443445
Ñòð.: 8
RU 2 506 595 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
гена NTRK2 проводили эндонуклеазой рестрикции BstSFI в течение 16 часов при 60°С,
rs 1946698 гена NTRK3 - KspAI в течение 16 часов при 37°С, rs 7170062 гена NTRK3Cac8I в течение 16 часов при 37°С, rs 11631508 гена NTRK3-Hpy188I в течение 16 часов
при 37°С. После этого для разделения продуктов ПДРФ-анализа проводился
электрофорез в 7% полиакриламидном геле с последующим окрашиванием раствором
бромистого этидия и визуализацией при ультрафиолетовом освещении. В результате
проведенного исследования выявлено, что больная Б. является носительницей
генотипов, гомозиготных по аллелям повышенного риска развития ПШ у русских:
NTRK2*С/*С, NTRK3*G/*G, NTRK3*T/*T и NTRK3*A/*A. Время исследования
составило 4 дня.
Пример 2. Больной Т., 1968 г.р., татарин.
Клинический диагноз: параноидная шизофрения, непрерывный тип течения,
отсутствие ремиссии
Для проведения анализа полиморфного локуса rs 1469794 гена NRXN1 у татар, у
больного было взято 8 мл венозной крови, из которой выделена ДНК методом
фенольно-хлороформной экстракции. Амплификация полиморфного ДНК-локуса
проводилась в 25 мкл общего объема смеси, содержащей 67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 16,6
мМ (NH4)2SO4, 2,5 мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера
(табл.1), по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу ДНК-полимеразы.
Температурные режимы ПЦР представлены в таблице 1. После определения наличия
продукта амплификации путем электрофореза в 7% полиакриламилном геле,
проводился анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) с
использованием эндонуклеазы рестрикции Mph1103I в течение 16 часов при 37°С.
Затем проводился электрофорез продуктов ПДРФ-анализа в 7% полиакриламидном
геле с последующим окрашиванием раствором бромистого этидия и визуализацией
при ультрафиолетовом освещении. В результате проведенного исследования
выявлено, что больной Т. является носителем гомозиготного генотипа по аллелю
повышенного риска развития ПШ у татар NRXN1*А/*А. Время исследования
составило 4 дня.
Использование данного способа выявления аллелей повышенного риска развития
параноидной шизофрении может быть полезно в качестве дополнительного критерия
при постановке диагноза, в прогностических целях при оценке течения и исхода
заболевания, а также на доклинической стадии заболевания, поскольку эти показатели
позволяют получить информацию на продромальном уровне или при инициальных
проявлениях заболевания, превышая возможности таких традиционно используемых в
клинической практике признаков как тип преморбида, возраст пациента ко времени
начала заболевания, что в свою очередь, делает реальным применение ранней
терапии, которая является более эффективной с точки зрения последующей
социальной адаптации больных. Определение генетических факторов риска
возникновения заболевания дает возможность определить риск развития патологии на
любой стадии развития организма, учитывая его индивидуальные особенности и
этническую принадлежность, что обеспечивает своевременность проведения
превентивных мероприятий.
Список литературы
1. Гурович, И.Я., Любов Е.Б. Фармакоэпидемиология и фармакоэкономика в
психиатрии // М.: Медпрактика-М, 2003. - 264 с.
2. Животовский, Л.А. Популяционная биометрия // М.: Наука, 1991. - 272 с.
3. Любов Е.Б., Бессонова А.А. Первый эпизод шизофрении: клиникоÑòð.: 9
RU 2 506 595 C2
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
эпидемиологический и социально-экономический аспекты // Российский
психиатрический журнал. - 2008. - №2. - С.46-50.
4. Мосолов, С.Н. Некоторые актуальные теоретические проблемы диагностики,
классификации, нейробиологии и терапии шизофрении: сравнение зарубежного и
отечественного подходов // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. 2010. - №6. - С.4-11.
5. Тиганов, А.С. Снежневский А.В., Орловская Д.Д. Руководство по психиатрии //
М.: Медицина, 1999. - Т.1. - 712 с.
6. Conner А.С., Kissling С., Hodges E. Neurotrophic factor-related gene polymorphisms and
adult attention deficit hyperactivity disorder (ADHD) score in a high-risk male population //
Am. J. Med. Genet. В Neuropsychiatr Genet. - 2008. - V.147B(8). - P.1476-80.
7. Dong С., Wong M.L., Licinio J. Sequence variations of ABCB1, SLC6A2, SLC6A3,
SLC6A4, CREB1, CRHR1 and NTRK2: association with major depression and antidepressant
response in Mexican-Americans // Mol.Psychiatry. - 2009. - V.14(12). - P.1105-18.
8. Dwivedi Y., Rizavi H.S., Zhang H. Neurotrophin receptor activation and expression in
human postmortem brain: effect of suicide // Biol Psychiatry. - 2009. - V.65(4). - P.319-28.
9. Feng Y., Vetro A., Kiss E. et al. Association of the neurotrophic tyrosine kinase receptor
3 (NTRK3) gene and childhood-onset mood disorders. // AmJPsychiatry. - 2008. - V.165(5). P.610-16.
10. Gates M.A., Tai C.C., Macklis J.D. Neocortical neurons lacking the protein-tyrosine
kinase В receptor display abnormal differentiation and process elongation in vitro and in vivo.
// Neuroscience. - 2000. - V.98(3). - P.437-47
11. Gottesman, H., Gould T.D. The endophenotype concept in psychiatry: etymology and
strategic intentions // Am. J. Psychiatry. - 2003. - Vol.160, №4. - P.636-45.
12. Kirov G., Rujescu D., Ingason A. Neurexin 1 (NRXN1) deletions in schizophrenia. //
Schizophr. Bull. - 2009. - №35. - P.851-54.
13. Kohli M.A., Salyakina D., Pfennig A. Association of Genetic Variants in the Neurotrophic
Receptor-Encoding Gene NTRK2 and a Lifetime History of Suicide Attempts in Depressed
Patients // Arch. Gen. Psychiatry. - 2010. - V 67(4). - P.348-59
14. Mathew C.C. The isolation of high molecular weight eucariotic DNA // Methods in
Molecular Biology / Ed. Walker J.M. - N -Y.: Human Press. - 1984. - V.2. - P.31-34.
15. Minichiello L., Korte M., Wolfer D. Essential role for TrkB receptors in hippocampusmediated learning // Neuron. - 1999. - V.24(2). - P.401-14.
16. Otnaess M.K., Djurovic S., Rimol L.M., Kulle В., Kahler A.K., Jonsson E.G.,…,
Andreassen O.A. Evidence for a possible association of neurotrophin receptor (NTRK-3) gene
polymorphisms with hippocampal function and schizophrenia. // Neurobiol. Dis. 2009; 34(3):51824.
17. Pillai A. Brain-derived neurotropic factor/TrkB signaling in the pathogenesis and novel
pharmacotherapy of schizophrenia. // Neurosignals.. - 2008; 16(2-3):183-93.
18. Rujescu D., Inganson A. Disruption of the neurexin 1 gene is associated with
schizophrenia. // J. Hum. Mol. Genet. - 2009. - Vol.18, №.5 - P.988-96.
19. Smith E.N., Bloss C.S., Badner J.A. Genome-wide association study of bipolar disorder in
European American and African American individuals // Mol. Psychiatry. - 2009. - V. 14(8). P.755-63.
20. Sudhof T.C. Neuroligins and neurexins link synaptic function to cognitive disease //
Nature. - 2008. - V. 455(7215). - P.903-11
21. Tamminga C.A, Holcomb H.H.. Phenotype of schizophrenia: a review and formulation //
Mol. Psychiatry. - 2005. - Vol.10, №1. - P.27-39.
Ñòð.: 10
RU 2 506 595 C2
5
22. Tandon R, Keshavan M.S., Nasrallah H.A. Schizophrenia "Just the Facts": what we know
in 2008 part 1: overview // Schizophr. Res. - 2008. - Vol.100, №1-3. - P.4-19.
23. Thompson Ray M., Weickert C.S., Wyatt E., Webster M.J. Decreased BDNF, trkB-TK+
and GAD67 mRNA expression in the hippocampus of individuals with schizophrenia and mood
disorders. //]. Psychiatry Neurosci. - 2011; 36(3):195-203.
24. Weickert C.S., Ligons D.L., Romanczyk T. Reductions in neurotrophin receptor mRNAs in
the prefrontal cortex of patients with schizophrenia // Mol Psychiatry. - 2005. - V.10(7). P.637-50.
10
15
Таблица 1
Ген
Полиморфный
локус
1
2
NTRK2
rs 1443445
rs 1946698
20
NTRK3
rs 7170062
rs 11631508
Последовательность праймеров
Метод детекции
температура отжига, 0С
Аллели (размер
фрагментов, п.о.)
3
4
5
5'-gaaacttacatgccaccacctt-3' 5'gactaaaaacagtgccaagcatt-3'
ПЦР/ПДРФ
(BstSF I), 60
*С(264)
*T(190+78)
5'-ggtaaaggtctgcttcctcattt-3' 5'atcctggcaatacactgaatgtt-3'
ПЦР/ПДРФ
(KspAI), 60
*G (222)
*С (71+151)
5'-ggggagcaagtttattcttgtaa-3' 5'aagtggttacccagtcctcctta-3'
ПЦР/ПДРФ
(Cac8I), 59
*С(210)
*T(180+30)
5'-ccaaatctcctgaccctctgt-3' 5'tggagtgcatgctaaaaataaga-3'
ПЦР/ПДРФ
(Пру 188I), 59
*А (98+205)
*G (98+102+104)
25
NRXN1
rs 1469794
5'-ctttttaagtaagccagaatgca-3' 5'gaaatgaaaaagcaaaattaacca-3'
ПЦР/ПДРФ
(Mph1103I),58
*4 (276)
*T (23+257)
Ссылка
6
Primer3 1
Primer3 1
Primer3 1
Primer3 1
Primer3 1
1
Примечание: - праймеры, подобранные с помощью программы Primer3 (http://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm)
30
35
40
Формула изобретения
Способ прогнозирования риска развития параноидной шизофрении, отличающийся
тем, что выделяют ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции, проводят
генотипирование по полиморфным локусам rs 1443445 гена NTRK2, rs 1946698, rs
7170062, rs 11631508 гена NTRK3, rs 1469794 гена NRXN1, при выявлении
генотипа NTRK2*C/*C (rs 1443445), генотипа NTRK3*G/*G (rs 1946698),
генотипа NTRK3*T/*T (rs 7170062), генотипа NTRK3 *A/*A (rs 11631508) у русских;
генотипа NRXN1 *А/*А (rs 1469794) у татар прогнозируют риск развития параноидной
шизофрении.
45
50
Ñòð.: 11
CL
RU 2 506 595 C2
Ñòð.: 12
DR
RU 2 506 595 C2
Ñòð.: 13
RU 2 506 595 C2
Ñòð.: 14
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа