close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

...препарата нафтизин в вещественных доказательствах

код для вставкиСкачать
Исследование препарата нафтизин в вещественных доказательствах
и биологических жидкостях
Соиск. Д.Б. ФЕДОРОВ1, зав. отд. С.В. ВОЛЧЕНКО2, интерн Н.А. НОВОКШОНОВА1,
д.фарм.н., проф. В.Н. КУКЛИН1
1
Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия (ректор — проф. И.А. Наркевич) Минздрава РФ;
Бюро судебно-медицинской экспертизы Ленинградской области (нач. — к.м.н., доц. В.Н. Лебедев), Санкт-Петербург
The study of naphthyzin present in material evidence and biological fluids
D.B. FEDOROV, S.V. VOLCHENKO, N.A. NOVOKSHONOVA, V.N. KUKLIN
1
Sankt-Peterburg Chemical Pharmaceutical Academy, Russian Ministry of Health; 2Leningrad Regional Bureau of Forensic Medical Expertise,
Sankt-Peterburg
Определены оптимальные условия изолирования нафазолина из препарата нафтизин и биологических жидкостей
хлороформом при рН среды 9,18. Исследуемое вещество идентифицировали с использованием цветных и осадочных
реакций, ИК- и УФ-спектроскопии, тонкослойной и газовой хроматографии с масс-селективным детектором и
высокоэффективной хроматографии, а также с помощью химических методов: высокоэффективной жидкостной
хроматографии, хроматоденситометрии, УФ-спектроскопии. Результаты трех методов сопоставимы.
Ключевые слова: нафазолин, изолирование, идентификация, количественное определение.
The optimal conditions for isolation of naphazoline from naphthyzin preparations and biological fluids with chloroform at pH 9.18
are described. The compound of interest was identified with the use of color and precipitation reactions, IR and UV spectroscopy,
thin-layer and gas chromatography, and chemical methods including
high performance liquid chromatography,
chromatodensitometry, and UV spectroscopy. The results obtained by the three methods are comparable.
Key words: naphazoline isolation, identification, quantitative determination.
Злоупотребление наркотическими, психотропными
средствами и сильнодействующими веществами является
острой социальной проблемой. В последнее время среди
наркоманов стали популярны такие препараты, как нафазолин, тропикамид и циклопентолат. Они широко используются наркозависимыми людьми как фармакологическая добавка к героину. Кроме того, нафазолин способен изменять картину наркотического опьянения и удлинять его продолжительность, что приводит в случае передозировок к летальному исходу. Нафазолин используется
наркоманами также в качестве средства, сужающего сосуды глаз и расширяющего зрачок, для скрытия следов употребления наркотических средств, в частности марихуаны, гашиша и конопли. Немедицинское употребление
нафазолина, тропикамида и циклопентолата приобретает
угрожающие масштабы. По результатам исследования
2009 г. [1], 80 из 100 респондентов отметили, что хотя бы
раз использовали циклопентолат, тропикамид или нафазолин для разведения героина.
В последние годы обращает на себя внимание рост отравлений детей нафтизином и его гомологами (санорин,
риназол, галазолин). Это связано с широким использованием препарата без назначения врача, передозировкой и
небрежным хранением [2].
Методики химико-токсикологического анализа биологических объектов на присутствие нафазолина отсут-
ствуют или не позволяют сделать заключение об использовании этого лекарственного препарата в немедицинских целях, в том числе при приеме совместно с наркотическими, психотропными средствами.
Цель исследования — разработка методик химикотоксикологического анализа нафазолина в вещественных
доказательствах и биологических жидкостях при судебнохимическом и химико-токсикологическом исследовании.
© Коллектив авторов, 2013
1
СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА, 5, 2013
Объекты исследования
— Нафтизин — 0,1% раствор, действующее средство
нафазолин является
неселективным альфа-адреномиметиком для местного применения. Химическое название: 2-(1-нафтелинилметил)-4,5-дигидро-1Н-имидазол,
рКа 10,9. В доступной литературе не удалось разыскать
сведений о его фармакокинетике и метаболизме.
— Кодеин, морфин выделены из токси-дисков системы ТОXI – LAB.
— Биологические жидкости (кровь, моча) от экспериментальных животных (крысы).
При проведении исследования в качестве рабочего
стандартного образца (РСО) использовали нафазалин,
выделенный из лекарственной формы — капли, раствор
нафтизина 0,1%, подлинность и чистота которого были
подтверждены химическими и физико-химическими методами анализа.
Тел.: 8 (812) 234 1359 ; 2e-mail: [email protected]
29
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 1. Эффекты реакций взаимодействия нафазолина с некоторыми реактивами, используемыми в химико-токсикологическом анализе
Реактив
Драгендорфа
Марки
Манделина
Раствор железа (III) хлорида 3%
Кислота серная концентрированная
Эффект реакции
Бурое окрашивание
Сине-серое окрашивание, при стоянии исчезающее
Коричнево-фиолетовое окрашивание
Коричнево-зеленый осадок
Светло-розово-коричневое окрашивание, при нагревании темнеющее
Предел
обнаружения, мкг*
1
1
1
5
5
Примечание. * — при детекции в УФ-свете предел обнаружения составляет 1 мкг.
Методики исследования, приборы и реактивы
При разработке методик химико-токсикологического
анализа нафазолина в вещественных доказательствах и
биологических жидкостях применяли следующую аппаратуру:
— ультрафиолетовый спектрофотометр марки СФ 2000;
— высокоэффективный жидкостной хроматограф
Waters 2695 с УФ-детектором;
— инфракрасный спектрофотометр марки Спекорд
М-80;
— видеоденситометр для тонкослойной хроматографии ДенСкан;
— газовый хроматограф Agilent HP 6850 с массселективным детектором НР 5973N (оборудование фирмы «Hewlett Packard», США);
— пластинки Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ на алюминиевой подложке.
Для проведения цветных и осадочных реакций и физико-химических исследований использовали следующие реактивы и растворители: реактив Драгендорфа,
реактив Марки, реактив Манделина, кислоту серную
концентрированную, раствор железа (III) хлорида, раствор кислоты хлористоводородной 0,1 М, раствор аммония гидроксида 25%, буферные растворы, приготовленные из фиксаналов, pH 4,01 (ацетатный буферный раствор); рН 6,86 (фосфатный буферный раствор); рН 9,18
(боратный буферный раствор); рН 12,43 (гликолевый
буферный раствор), натрия сульфат безводный. Растворители марки ХЧ и ЧДА: хлороформ, этанол 95%, ацетон, 2-пропанол, 1-бутанол, этилацетат, гексан, ацетонитрил.
Результаты и обсуждение
Действующее вещество изолировали посредством
жидкость-жидкостной экстракции при различных значениях рН среды: 2,0; 4,01; 6,86; 9,18; 12,43. Для изолирования применяли растворители: хлороформ, этилацетат,
гексан, 2-пропанол — хлороформ (1:9). Полученные извлечения пропускали через натрия сульфат безводный в
фарфоровые чашки и упаривали.
Процент извлечения нафазолина из водных растворов
определяли методом УФ-спектроскопии в растворе кислоты хлористоводородной 0,1 М при длине волны 280 нм
по заранее построенному калибровочному графику.
Установили, что максимальное количество нафазолина извлекается хлороформом (92%) и смесью растворителей 2-пропанол-хлороформ 1:9 (83%) с рН 9,18. Использование электролита натрия хлорида приводит к
уменьшению процента извлечения (78%), как и исполь30
зование в качестве экстрагентов этилацетата (41%) и гексана (10%).
Нами предложена следующая методика изолирования анализируемого вещества из вещественных доказательств. К части раствора нафтизина в делительной воронке добавляют боратный буферный раствор с рН среды
9,18 и проводят экстракцию хлороформом трижды по
5 мл в течение 5 мин. Органический слой отделяют, пропускают через натрия сульфат безводный, вытяжки объединяют и выпаривают в токе теплого воздуха до сухого
остатка.
Для идентификации нафазолина, выделенного из водного раствора, нами апробированы следующие методы:
цветные и осадочные реакции, тонкослойная хроматография (ТСХ), УФ- и ИК-спектроскопия, высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и газовая хроматография с масс-селективным детектором (ГХ/МС) [3].
Если обстоятельства проведения экспертизы или оснащение лаборатории не позволяют использовать сложную высокочувствительную аппаратуру, то проводят
цветные и осадочные реакции в качестве одного из предварительных этапов исследования (табл. 1).
Тонкослойная хроматография на предварительном
этапе служит основным источником информации в судебно-химическом и химико-токсикологическом анализе
[4]. Хроматографическое исследование нафазолина проводили методом одномерной восходящей хроматографии
в разных системах растворителей на пластинках Сорбфил
ПТСХ-П-А-УФ с алюминиевой подложкой, как и в случае качественного и количественного определения его методом хроматоденситометрии (табл. 2).
Результаты определения хроматографической подвижности нафазолина, тропикамида, кодеина, циклопентолата и морфина представлены в табл. 3. Среднее значение Rf исследованных веществ рассчитывали по результатам не менее 5 опытов.
Оптимальной системой растворителей для определения нафазолина методом тонкослойной хроматографии
совместно с тропикамидом, циклопентолатом, кодеином
и морфином является система этилацетат — этанол — раствор аммония гидроксида 25% (17:2:1) (табл. 4).
Хроматоденситометрию как еще один современный
физико-химический метод, предназначенный для одновременного качественного и количественного определения состава проб, проводили с помощью видеоденситометра ДенСкан. Сначала была установлена линейная зависимость для РСО вещества и проведено его количественное определение в извлечениях из водных растворов
(табл. 5). Хроматографирование осуществляли в указанных ранее условиях. Предел обнаружения для вещества
СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА, 5, 2013
Таблица 2. Значение Rf нафазолина при хроматографировании в разных системах растворителей
Система
Этилацетат — этанол — раствор аммония гидроксида 25% (68:12:4)
Метанол — раствор аммония гидроксида 25% (100:1,5)
Этанол — ацетон — хлороформ — раствор аммония гидроксида 25% (30:30:5:2)
Хлороформ — этанол (9:1)
Хлороформ — метанол (9:1)
Бутанол — этанол — раствор аммония гидроксида 25% (9:3:1)
Этанол — раствор аммония гидроксида 25% (100:1,5)
Ацетон — бутанол (1:2)
Хлороформ — ацетон — раствор аммония гидроксида 25% (20:20:1)
Rf нафазолина
0,12
0,14
0,06
0,11
0,3
0,23
0,11
0,13
0,21
Таблица 3. Хроматографическая подвижность нафазолина, тропикамида, циклопентолата и наркотических средств
Система
Этилацетат — этанол — раствор аммония гидроксида 25% (17:2:1)
Хлороформ — ацетон —
этанол — раствор аммония гидроксида 25% (30:30:5:2)
Метанол — раствор аммония гидроксида 25% (100:1,5)
нафазолин
тропикамид
0,12
0,06
0,6
0,53
Rf
циклопентолат
0,23
0,04
0,14
0,74
0,12
кодеин
морфин
0,42
0,35
0,36
0,3
0,37
0,32
Примечание. Детекция в УФ-свете или реактивом Драгендорфа.
на пластинке составил 0,5 мкг, диапазон линейности соблюдался в интервале 1—8 мкг. Детекцию хроматографических пластинок осуществляли при длине волны 254 нм.
Для идентификации нафазолина, выделенного из
раствора, использовали ИК- и УФ-спектроскопию, а последнюю еще использовали для количественного определения его из биологических жидкостей [5].
ИК-спектры получали из образца нафазолина, выделенного из лекарственной формы препарата Нафтизин
(спрессованные таблетки нафазолина с бромидом калия).
Спектры снимали на спектрофотометре Спекорд М-80 в
пределах 400—4000 см–1 [6]. В ИК-спектре исследуемого
вещества наблюдали полосы валентных колебаний С=С
связей ароматических колец в области 1600 см–1, NHгрупп 3300 см–1 и валентные колебания CH3-групп в области 2800—2920 см–1. В УФ-спектрах в растворе кислоты
хлористоводородной 0,1 М максимумы поглощения нафазолина обнаружили при длине волны 270, 280, 287 и 291
нм. Записанные спектры оказались идентичны спектрам,
приведенным в литературе.
Для исследования нафтизина, содержащего нафазолин, совместно с тропикамидом и циклопентолатом методом ГХ/МС использовали оборудование фирмы «Hewlett
Packard» (США): газовый хроматограф Agilent HP 6850 с
масс-селективным детектором НР 5973N; капиллярную
колонку НР — 5 MS (5% фенилметилсилоксан) с внутренним диаметром 0,25 мм и длиной 30 м (НР — 5 MS); газноситель — гелий; скорость газа-носителя 0,8 мл/мин; начальная температура 80 °С (0,5 мин), конечная — 290 °C;
объем пробы 1 мкл.
Для хроматографирования взяли сухой остаток хлороформного извлечения, который растворяли в 100 мкл
метанола. При времени удерживания для нафазолина
12,45 мин в масс-спектре наблюдали характерные пики
ионов с m/z 208, 209, 210, 141, 115, 153, 195, 181. Полученный спектр совпадал с данными библиотек. Для циклопентолата и тропикамида время удерживания этим методом в данных условиях составило 7,95 и 16,3 мин.
СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА, 5, 2013
Идентификацию и количественное определение нафазолина проводили методом ВЭЖХ, позволяющим выделить вещество из сложных смесей органических соединений и одновременно проанализировать его качественно
и количественно.
Использовали оборудование фирмы «Waters»: жидкостный хроматограф Waters 2695 с ДМД; колонку NovaPak C18 4 мкм 3,9×150 мм; скорость подачи подвижной
фазы 400 мкл/мин; время регистрации хроматограммы
20 мин; подвижная фаза: ацетонитрил, фосфатный буфер
с рН 3,0 (60:40); температура термостата колонки 30 °C;
изократический режим и РСО нафазолина. Фиксировали
для нафазолина время удерживания 3,22 мин.
Таким образом, для установления наличия нафазолина в объектах исследования, доставленных на судебно-химическую экспертизу или химико-токсикологическое исследование с места происшествия в качестве вещественных доказательств, следует использовать методы ТСХ,
ВЭЖХ, ГХ/МС и УФ- и ИК-спектроскопию, а также
цветные и осадочные реакции.
Определение нафазолина в биологических объектах. Для
определения процента извлечения из биологических жидкостей готовили модельные комплексы. Использовали
образцы мочи и крови от здоровых добровольцев, не принимавших лекарственные препараты в течение 1 мес до
отбора проб. Модельные смеси мочи и крови готовили
путем добавления рабочего стандартного раствора с концентрацией 1 мг/мл к биожидкостям до получения концентраций 10,0; 50,0; 100,0 мкг/мл. Приготовленные модельные смеси инкубировали при температуре 37 °С в
течение 2 ч.
К 5 мл биологической жидкости (кровь, моча) добавляли 5 мл воды очищенной, вносили в пенициллиновый
флакон, содержащий 0,3 мл кислоты хлористоводородной
концентрированной. Флакон закрывали резиновой пробкой и помещали в металлический контейнер и нагревали
30 мин на кипящей водяной бане. После охлаждения содержимое флакона центрифугировали и фильтровали. За31
32
7,29
16,33
0,0343
0,006000
0,01342
0,00018
0,21
14,7
32,9
0,0428
0,007483
0,01673
0,00028
0,13
5
21,2
46,5
0,0512
0,008944
0,02000
0,0004
0,11
5
5
Хлороформ — ацетон — раствор аммония гидроксида 25% (20:20:1)
Ацетон — бутанол (1:2)
Этанол — раствор аммония гидроксида 25% (100:1,5)
10,7
23,91
0,0550
0,009592
0,02145
0,00046
0,23
5
Бутанол — этанол – раствор аммония гидроксида 25% (9:3:1)
2,12
4,6
0,014
0,002445
0,00547
0,00003
0,3
24,1
54,09
0,0595
0,01039
0,02324
0,00054
0,11
5
5
Хлороформ — метанол (9:1)
8,11
18,17
0,0109
0,00189
0,00424
0,000018
0,06
5
Хлороформ — ацетон — этанол — раствор аммония гидроксида 25%
(30:30:5:2)
Хлороформ — этанол (9:1)
5,17
11,57
0,0162
0,002828
0,00633
0,00004
0,14
5
Метанол — раствор аммония гидроксида 25% (100:1,5)
4,09
9,16
0,0110
0,002
0,00447
0,00002
0,12
5
Этилацетат — этанол — раствор аммония гидроксида 25% (68:12:4)
x¯
f
Система
Таблица 4. Статистическая обработка данных ТСХ на пластинках Сорбфил ПТСХ-П-А-УФ
S
2
S
Нафазолин
Sx
Δx
E%
E¯%
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
тем фильтрат помещали в делительную воронку, доводили до значения рН 9,18 буферным раствором и экстрагировали 3 раза хлороформом порциями по 5 мл. Хлороформные извлечения объединяли, пропускали через слой
натрия сульфата безводного в фарфоровые чашки и упаривали в токе теплого воздуха. При определении процента
извлечения нафазолина использовали УФ-спектроскопию
(табл. 6).
Разработанные методики химико-токсикологического анализа нафазолина в биологических жидкостях были
апробированы на экспериментальных животных, поскольку они в определенной степени воспроизводят процессы, происходящие с ксенобиотиками при введении
последних в живой организм.
Исследование проводили на 15 экспериментальных
животных — белых беспородных крысах-самцах массой
180—220 г. Раствор препарата нафтизин вводили однократно внутрибрюшинно в количестве 1—2 мг действующего вещества с последующим введением водной нагрузки. Контрольную группу составили 5 животных, которым
внутрибрюшинно вводили воду для инъекций. Забор
крови производили из десны через 1, 2, 4, 6 и 24 ч, забор
мочи — в течение 24 ч. Для установления элиминации нафазолина забор мочи осуществляли после введения препарата в течение 24 ч. Для анализа брали по 4—5 мл крови
и мочи от каждого животного.
Изолирование нафазолина из биологических жидкостей животных проводили по разработанной нами методике.
Для анализа извлечений из биологических жидкостей
после очистки использовали ТСХ, УФ- и ИК-спектроскопию, ВЭЖХ и ГХ/МС.
В извлечении из крови нафазолин был обнаружен через 1 и 2 ч, а через 4 ч препарат не обнаружили. При исследовании извлечения из мочи, собранной в течение
24 ч, выявили нафазолин и его метаболит, структура которого не установлена.
С помощью ТСХ наблюдали пятна по значению Rf,
окраске и флюоресценции соответствующие РСО нафазолина, выделенного из раствора препарата нафтизин.
По данным ВЭЖХ (кровь — 3,22; моча — 3,25) и ГХ/МС
(кровь — 12,50; моча — 12,46), значения времени удерживания и масс-спектр вещества, выделенного из биожидкостей, совпадали с таковыми, полученными при
анализе нафазолина, выделенного из раствора нафтизина.
К сожалению, не удалось очистить анализируемое вещество от компонентов биологической матрицы, поэтому
использование ИК-спектроскопии наиболее оправдано
при анализе вещественных доказательств — капли нафтизин.
Количественное определение нафазолина, выделенного из биологических жидкостей, проводили параллельно методами ВЭЖХ, хроматоденситометрии и УФспектрометрии (табл. 7).
Сравнивая результаты трех методов, можно судить об
их сопоставимости. Относительная погрешность определения составляет 2% для денситометрии, 0,68% для спектрофотометрического метода и 1,6% для ВЭЖХ, т.е. результаты методов можно считать достоверными с вероятностью 95%.
СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА, 5, 2013
Таблица 5. Расчет и статистическая оценка параметров линейной зависимости в методе хроматоденситометрии для нафазолина
f
x¯
y¯
B
A
t(p,F)
Δb
Δa
S02
r
Sx
Δx
Δx×100/x
5
3,5
9,882
3,08
–0,889
2,78
0,0172
0,2614
0,109
0,9986
0,0642
0,1785
5,1
Таблица 6. Процент извлечения нафазолина из биологических комплексов
Содержание вещества в биологической жидкости, мкг/мл
Моча
10
50
50 с предварительным гидролизом
100
Кровь
10
50
100
Нафазолин,%
95,8
97
82
94,75
45,5
50
43,38
Таблица 7. Содержание нафазолина в крови и моче, мкг/мл
Метод
УФ-спектрофотометрия
ВЭЖХ
Хроматоденситометрия
Кровь
1ч
36,50±0,02
30,8±0,02
32,67±0,02
2ч
1,6±0,02
1,4±0,02
—
Моча
24 ч
57,20±0,01
32,58±0,02
31,79±0,03
Выводы
1. Изолирование из вещественных доказательств анализируемого вещества следует проводить с помощью жидкость-жидкостной экстракции хлороформом при рН 9,18,
а из биожидкостей в тех же условиях — после кислотного
гидролиза для мочи и для крови.
2. Установлено, что ТСХ, ГХ/МС, ВЭЖХ, УФспектроскопия позволяют идентифицировать компонент
препарата нафтизин в вещественных доказательствах и
биологических жидкостях.
3. Разработаны условия для количественного определения нафазолина, выделенного из биологических
жидкостей, методами высокоэффективной жидкостной хроматографии, УФ-спектрофотометрии и денситометрии.
ЛИТЕРАТУРА
1.
Белов В.А., Дмитриева Г.Б. Опийная наркомания. [Электронный ресурс] – Режим доступа — http://narcolicbez.ru/opiumdepend.htm.
2.
Даутова А.Я. Отравления нафтизином. [Электронный ресурс] —
Режим доступа – http://www.kaznmu/kz/press/2012/01/20/отравления-нафтизином.
3.
Clarke`s analysis of drugs and Poisons. 4th Ed. Ed. A. Moffat, M. Osselton,
B.Widdop. London: Pharmaceutical Press 2011.
СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКАЯ ЭКСПЕРТИЗА, 5, 2013
4.
Киреева А.В., Куклин В.Н., Ваталев А.А., Волченко С.В., Горбачева Т.В.
Тонкослойная хроматография в анализе некоторых противовоспалительных средств. Суд-мед эксперт 2010; 5: 25—30.
5.
НД 42-0254-07 на субстанцию Нафазолина нитрат.
6.
Государственная фармакопея Российской Федерации. Ч. 1. М: Научный центр экспертизы средств медицинского применения 2008;
704.
33
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа