close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

...генерации оксида азота в условиях карбонильного стресса у крыс

код для вставкиСкачать
УКРАЇНСЬКИЙ БІОФАРМАЦЕВТИЧНИЙ ЖУРНАЛ, № 5 (10) 2010
УДК 577.126:57.042
А.Л. Загайко, Л.Н. Воронина, О.А. Красильникова
Национальный
фармацевтический
университет
СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ ГЕНЕРАЦИИ
ОКСИДА АЗОТА В УСЛОВИЯХ
КАРБОНИЛЬНОГО СТРЕССА У КРЫС
Исследована работа системы генерации NO в стенке аорты крыс в условиях моделиро­
вания карбонильного стресса. Показано, что увеличение содержания
метилглиоксаля
сопровождается повышением уровня аргинина, снижением образования NO. В услови­
ях in vitro метилглиоксаль уменьшает содержание [14 С]аргинина и увеличивает [14 С]
орнитина в стенке аорты крыс. Внесение L-норвалина и генистеина в среду инкубации
ткани аорты полностью отменяло действие метилглиоксаля.
Установлено, что ме­
тилглиоксаль активирует аргиназу в стенке аорты, и этот процесс
осуществляется
путем тирозинового
фосфорилирования.
Ключові слова: к а р б о н и л ь н ы й стресс; глюкозотоксичность; оксид азота; э н д о т е л и а л ь н а я
дисфункция
ВСТУПЛЕНИЕ
Хроническая гипергликемия приводит к раз­
витию карбонильного стресса и накоплению
в организме токсичных дикарбонильных соеди­
нений, например, метилглиоксаля. Метилгли­
оксаль увеличивает образование конечных про­
дуктов гликирования белков, а N0 тормозит их
накопление.
Хроническое состояние гипергликемии при­
водит к накоплению в крови и клетках органов
и тканей дикарбонильных соединений: метилгли­
оксаля, глиоксаля, 3-деоксиглюкозона и других
[11]. Эти высокореактивные продукты гликилируют белки, липиды, нуклеиновые кислоты, при­
водя к образованию конечных продуктов глики­
рования (КПГ). Данное состояние носит название
«карбонильный стресс» [3,19]. Гликированные
белки вносят вклад в развитие атеросклеротического повреждения сосудов, возникновение микроангиопатий, нефропатий и нейропатий. Они
стимулируют секрецию воспалительных цитокинов, агрегацию тромбоцитов, хемотаксис моноци­
тов, экспрессию эндотелиального фактора роста
сосудов и многое другое [10,19].
Оксид азота продуцируется разными типами
клеток организма и контролирует множество
биохимических процессов и функций: тонус
гладкой мускулатуры сосудов, поддержание им­
мунитета, является нейромедиатором, угнетает
агрегацию тромбоцитов, опосредует взаимодей©А. Л. Загайко, Л. И. Воронина, О. А. Красильникова, 2010
Біохімія
ствие последних с эндотелиальными клетками
и др. [16].
Метаболизм NO можно рассматривать как
один из механизмов регуляции содержания
активированных метаболитов кислорода. N0, су­
пероксид и продукт их реакции — пероксинитрит
являются медиаторами воспаления, участвуют
в развитии атеросклероза, модифицируют белки
и повреждают нуклеиновые кислоты [8].
Противоречивы данные о влиянии кар­
бонильного стресса на метаболизм NO. Ме­
тилглиоксаль и гликированные белки подав­
ляют экспрессию NO-синтазы и нарушают
N0-опосредованную вазорелаксацию в стенках
артерий крыс [12]. В то же время NO тормозит об­
разование ГПК и предотвращает развитие атеро­
склероза [17]. Целью настоящего исследования
было изучение работы системы генерации NO
в стенке аорты крыс в условиях карбонильного
стресса.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Опыты проводили на крысах линии Вистар
массой 150—200 г, содержавшихся на стандарт­
ном рационе вивария. Карбонильный стресс
моделировали внутрижелудочным введением
животным водного раствора глюкозы из рас­
чета 2,5 г на 1 кг массы тела в течении 60 дней
[1]. По ходу эксперимента определяли концен­
трацию глюкозы, метилглиоксаля, аргинина
в крови. На 60 день эксперимента определяли
содержание оксида азота, цитруллина. Содержа-
УКРАЇНСЬКИЙ БІОФАРМАЦЕВТИЧНИЙ ЖУРНАЛ, № 5 (10) 2010
ниє глюкозы и аргинина определяли с помощью
стандартных наборов реактивов фирмы "Felicit".
Содержание оксида азота оценивали по образо­
ванию нитратов и нитритов, которые определя­
ли по методу Грисса [15].
Изолировали участки аорты интактных крыс
и инкубировали участки ткани в среде, пред­
ложенной в работе Brouwers et al. [12] в присут­
ствии 2,5иСі/мл L-[U-14C] аргинина («Sigma»,
США) в течение 24 часов. После этого участки
аорты отмывали свежей инкубационной сре­
дой от избытка радиоактивности и инкубиро­
вали в присутствии 1,0 ммоль/л метилглиок­
саля, 10 ммоль/л генистеина («Sigma», США),
20 ммоль/л L-норвалина в течение 3 часов, 0,1 мл
среды инкубации отбирали на определение
NO. Реакцию останавливали на холоде. Ткань из­
мельчали и центрифугировали при 3000 об/мин
в течение 10 мин. 14 С-меченые аминокислоты
аргинин, орнитин и цитруллин из надосадочной
жидкости разделяли при помощи тонкослойной
хроматографии [2]. Радиоактивность образцов
определяли в сцинтилляционной жидкости при
помощи счетчика радиоактивности БЕТА. Со­
держание белка в пробах определяли по методу
Лоури [4]. Статистическую обработку данных
проводили с использованием вариационной
статистики (ANOVA). Р<0,05 — статистически
достоверные результаты.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Длительное содержание крыс на рационе
с высоким уровнем глюкозы вызвало стойкое
повышение уровня глюкозы в крови животных,
которое сопровождалось увеличением содержа­
ния метилглиоксаля и повышением уровня ар­
гинина в крови во второй половине эксперимента
(рис. 1, табл. 1). Повышение концентрации
метилглиоксаля в данных условиях свиде­
тельствует о развитии карбонильного стресса.
Таблица 1
СОДЕРЖАНИЕ ГЛЮКОЗЫ И АРГИНИНА В КРОВИ КРЫС
НА РАЗЛИЧНЫХ СРОКАХ ВВЕДЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ
Условия э к с п е р и м е н т а
Содержание глюкозы, ммоль/л
Содержание аргинина, ммоль/л
Контроль
3,97*0,71
68,7±4,33
5-й д е н ь
4,84*1,21
69,5*2,88
10-й день
6,37*1,36
59,3*3,12
20-й день
7,51*0,98*
54,8*2,78*
30-й день
9,11±1,09*
52,8*4,01*
40-й день
10,94±1,54*
44,9*2,34*
50-й день
11,68+2,76*
45,7*2,67*
60-й день
13,64±1,68*
43,7*1,99*
* - Р контроль-опыт<0,05 - статистически достоверные результаты.
і
O
b
І
3
- !
4
І
5
6
'
7
I
8
I
9
'
—
10
--¬
11
12
Концентрация глюкозы, ммоль/л
—•— Опыт
Контроль
Рис. 1. Содержание метилглиоксаля в крови крыс с различным уровнем
* — Р контроль-опыт<0,05 — статистически достоверные результаты.
глюкозы.
13
УКРАЇНСЬКИЙ БІОФАРМАЦЕВТИЧНИЙ ЖУРНАЛ, № 5 (10) 2010
Снижение уровня аргинина сопровождалось
снижением уровня нитратов и нитритов, что мо­
жет свидетельствовать о снижении продукции
N0, при этом коцентрация цитруллина достовер­
но не изменялась (рис. 2). Известно, что аргинин
является предшественником N0, который об­
разуется при действии NO-синтазы [9]. Вторым
продуктом данной реакции является цитруллин.
Поддержание постоянного вне- и внутриклеточ­
ного уровня аргинина — необходимое условие
нормального функционирования NO-синтазы.
Аргинин также под действием аргиназы метаболизируется до орнитина и мочевины [б].
; Данные пути тесно связаны между собой. NO
регулирует экспрессию и активность аргиназы
в эндотелиоцитах, а мочевина, в свою очередь,
образование NO [9]. Снижение уровня аргини­
на и нарушение состояния равновесия между
данными метаболическими путями может стать
одной из причин эндотелиальной дисфункции
[б]. Принимая во внимание изложенное выше,
а также тот факт, что метилглиоксаль принима­
ет участие в регуляции экспрессии NO-синтазы
[6], целью следующего этапа нашей работы было
изучение влияние метилглиоксаля на мета­
болизм аргинина и работу системы генерации
NO. Изолированные участки аорты интактных
крыс инкубировали в присутствии 14 С-меченого
аргинина в течение 24 часов. После этого ткань
инкубировали в присутствии метилглиоксаля.
Внесение метилглиоксаля в среду инкубации
снижает содержание [14 С]аргинина, повышает
содержание [14 С]орнитина (табл. 2). Внесение
в среду инкубации L-норвалина, специфическо­
• контроль
го ингибитора аргиназы [13], полностью отме­
няло эффект метилглиоксаля и стимулирова­
ло образование нитратов и нитритов (рис. 3).
Полученные данные свидетельствуют о том,
что метилглиоксаль стимулирует активацию
аргиназы в данных экспериментальных услови­
ях. Внесение в среду инкубации генистеина, ин­
гибитора тирозинового фосфорилирования [18],
также отменяет эффект метилглиоксаля, что мо­
жет свидетельствовать о важной роли тирозино­
вого фосфорилирования в регуляции активнос­
ти аргиназы в данных условиях.
Метилглиоксаль также сокращает время по­
лужизни молекул N0, тем самым также снижая
их биодоступность [12], тормозит образование
NO путем усиления использования аргинина.
Метилглиоксаль и другие продукты автоокис­
ления глюкозы взаимодействуют с радикалами
аргинина и лизина, что приводит к образованию
КПГ белков [3]. КПГ, связываясь со специфичес­
кими рецепторами на поверхности плазматичес­
кой мембраны, активируют сигнальные каскады
реакций, в которые включены JNK-киназа,
СОХ-2, вызывают образование простагландина
В2, что приводит к усилению воспалительного
процесса и поражению сосудистого эндотелия
[7]. Метилглиоксаль, в свою очередь, также ини­
циирует каскад сигнальных реакций с участием
JNK-киназы и белка р38 [14]. NO тормозит обра­
зование КПГ [17]. Таким образом, наблюдаемое
в условиях нашего эксперимента снижение гене­
рации NO, по-видимому, может усиливать обра­
зование КПГ и состояние карбонильного стресса
в организме в целом.
ЕЭ опыт
Рис. 2. Содержание аргинина, цитруллина, оксида азота в крови контрольных животных и
животных с повышенным содержанием глюкозы (концентрация глюкозы 13,64^1,68 ммоль/л).
* - Р контроль-опыт<0,05 - статистически достоверные результаты.
[54]
Біохімія
УКРАЇНСЬКИЙ БІОФАРМАЦЕВТИЧНИЙ ЖУРНАЛ, № 5 (10) 2010
Таблица 2
ВЛИЯНИЕ МЕТИЛГЛИОКСАЛЯ НА СОДЕРЖАНИЕ [14С]АРГИНИНА, [14С]
ОРНИТИНА И [14СЩИТРУЛЛИНА В АОРТЕ КРЫС (ИМП/МИН/МГ БЕЛКА)
[14С]аргинин
[14С]орнитин
[14С]цитруллин
Контроль
Условия эксперимента
3601*208
2674*311
1652*171
Метилглиоксаль
1741*118*
3999*307*
1711*107
МетилглиоксальНL-норвалин
3434*199
2345*358
1345*244
Метилглиоксаль+генистеин
3371*355
2549*274
1568*199
* - Р контроль-опыт<0,05 - статистически достоверные результаты.
140
120
• Контроль
• Метилглиоксаль
Н Метилглиоксапь+Lнорвалин
• Метилглиоксаль +
генистеин
Рис. 3. Влияние метилглиоксаля на образование нитратов+нитритов
* - Р контроль-опыт<0,05 - статистически достоверные результаты.
2.
ВЫВОДЫ
1. Хроническая гипергликемия вызывает по­
вышение концентрации метилглиоксаля
в крови крыс.
2. Метилглиоксаль ингибирует аргиназу в эн­
дотелии аорты крыс.
3. Метилглиоксаль нарушает работу системы 3.
генерации NO в стенке аорты крыс.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ
ИСТОЧНИКОВ ИНФОРМАЦИИ
1. Вплив одноразового R-опромінення на інсулінорезистентність організму щурів різ­ 4.
ного віку / Є. М. Горбань, М.В.Осипов,
Н. В. Топольнікова / / Одеський мед. журн. —
2008. — № 5 . — С . 6-10.
в аорте крыс.
ADP-ribosylation of human defensin HNP-1
results in the replacement of the modified arginine with the noncoded amino acid ornithine /
[L. A. Stevensa, R . L . Levineb, B.R. Gochuicoc et all.] / / Proc. Natl. Acad. Sci. USA. —
2009. — № 47 — P. 19796-19800.
Alterations in nonenzymatic biochemistry in
uremia: origin and significance of «carbonyl
stress* in long-term uremic complications /
[T. Miyata, C. van Ypersele de Strihou, K. Kurokawa et all.] / / Kidney Int.— 1999. —
№ 2. — P. 389-399.
A rapid and simple method for measurement of
total protein in very low density lipoproteins by
the Lowry assay / M . L . Kashyap, B.A. Hynd,
K. Robinson / / J. Lipid Res. — 1980. — № 4. —
P. 491-495.
[55]
УКРАЇНСЬКИЙ БІОФАРМАЦЕВТИЧНИЙ ЖУРНАЛ, № 5 (10) 2010
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
[56]
Arginase: a critical regulator of nitric oxide
synthesis and vascular function / W. Durante,
F.K. Johnson, R. A. Johnson//Clin. Exp. Phar­
macol. Physiol. — 2007. — №9. — P. 906-911.
Chan W . H . Methylglyoxal and high glucose
co-treatment induces apoptosis or necrosis in
human umbilical vein endothelial cells /
W.H.Chan, H . J . Wu / / J . Cell Biochem.—
2008. — № 4. — P. 1144-1157.
COX-2 and iNOS are critical in advanced glycation and product-activated chondrocytes in vi­
tro / / [C. Y. Huang, L.F. Hung, C.C. Liang et
all.] / / Eur. J. Clin. Invest. — 2009. — № 5.—
P. 417-428.
Endothelial dysfunction in diabetes mellitus:
molecular mechanisms and clinical implica­
tions / [C.E.Tabit, W.B.Chung, N.M.Ham­
burg et all.] / / Rev. Endocr. Metab. Disord. —
2010. — № 1. — P. 61-74.
Ffirstermann U. Endothelial nitric oxide syn­
thase in vascular disease: from marvel to men­
ace / U. Fdrstermann, T. Miinzel / / Circula­
tion. — 2006. — № 13. — P. 1708-1714.
Galkina E. Immune and inflammatory mecha­
nisms of atherosclerosis / E. Galkina, K. Ley / /
Annu Rev. Immunol.— 2009.— Vol. 27,—
P. 165-197.
Hyperglycemia and glycation in diabetic com­
plications / [A. Fegre-Salvayre, R. Salvayre,
N. Auge et al.] / / Antioxid. Redox Signal. —
2009. — № 11. — P. 3071-3109.
Hyperglycaemia-induced impairment of endothelium-dependent vasorelaxation in rat me­
senteric arteries is mediated by intracellular
methylglyoxal levels in a pathway dependent on
oxidative stress / [O. Brouwers, P.M. Niessen,
Біохімія
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
G. Haenen et all.] / / Diabetologia. — 2010.—
№ 5 . — P . 989-1000.
Inhibition of S6K1 accounts partially for the
anti-inflammatory effects of the arginase in­
hibitor L-norvaline / [X. F.Ming, A . G . Rajapakse, J. M. Carvas et all.] / / BMC Cardiovasc. Disord. — 2009. — № 3. — P. 9-12.
Methylglyoxal mediates vascular inflamma­
tion via JNK and p38 in human endothelial
cells / [H. Yamawaki, K. Saito, M. Okada et
all.] / / Am. J. Physiol. Cell Physiol. — 2008. —
№ 6. — P. C1510-C1517.
Nitric oxide activity in women with intrauteri­
ne growth restriction treated by L-arginine /
[A. Karowicz-Bilinska, U. Kowalska-Koprek,
J.Suzin et all.] / / Gynecol Pol.— 2003.—
№ 8. — P. 612-617.
Nitric oxide and coronary vascular en­
dothelium adaptations in hypertension /
[A. S. Levy, J. C. Chung, J. T. Kroetsch et all.] //
Vase. Health Risk Manag.— 2009.— № 5.—
P. 1075-1087.
Nitric oxide inhibits the formation of advanced
glycation and products / [K. Asahi, K. Ichimori, H. Nakazawa et all.] / / Kidney Int. —•
2000. — № 4. — P. 1780-1787.
The involvement of tyrosine kinases, cyclic
AMP/protein kinase A , and p38 mitogen-activated protein kinase in IL-13-mediated argi­
nase I induction in macrophages: its implicationsinIL-13-inhibitednitricoxideproduction//
[С. I. Chang, B. Zoghi, J. C. Liao et all.] / / J. Im­
munol. — 2000. — № 4. — P. 2134-2141.
Turk Z. Glycotoxines, carbonyl stress and
relevance to diabetes and its complications /
Z. Turk / / Physiol. Res. — 2010. — № 2.—
P. 147-156.
УКРАЇНСЬКИЙ БІОФАРМАЦЕВТИЧНИЙ ЖУРНАЛ, № 5 (10) 2010
УДК 277.126:57.642
А. Л. Загайко, Л. М. Вороніна, О. А. Красильнікова
СТАН СИСТЕМИ ГЕНЕРАЦІЇ ОКСИДУ АЗОТУ В УМОВАХ КАРБОНІЛЬНОГО СТРЕСУ У ЩУРІВ
Досліджена робота системи генерації оксиду нітрогену в умовах моделювання
карбонільного стресу. Показано, що збільшення рівня метилгліоксалю корелює
зі зниженням вмісту аргініну та утворенням оксиду нітрогену. В умовах in vitro
метилгліоксаль зменшує вміст [14 С]аргініну та збільшує [14 С]орнітину у стінці аор­
ти щурів. Внесення L-норваліну та геністеїну у середовище інкубації тканини аорти
повністю відміняло дію метилгліоксалю. Встановлено, що метилгліоксаль активує
аргіназу у стінці аорти, і до цього процесу залучене тирозинове фосфорилювання.
Ключові слова: карбонільний стрес; глюкозотоксичність; ендотеліальна дисфункція;
Нітрогену оксид
UDC 577.126: 57. 042
A. L. Zagayko, L. М. Voronina, О. A. Krasylnikova
CONDITION OF GENERATION SYSTEM OF NO UNDER CARBONYL STRESS IN RATS
The aim of the present study is investigation of NO generation and NO-dependent enzymatic
pathways activity in rat aorta under carbonyl stress. Our study shows that high glucose
leads to methylglyoxal level increase, arginine and nitric oxide level reduction. In vitro
methylglyoxal stimulates [14C]arginine degradation and [14C]ornitine formation in rats"
aorta. Pre-incubation with L-norvalin and genistein reduces the effect of methylglyoxal.
Key words: carbonylic stress; glucose-toxity; NO; endotelial disfunction
Адреса для листування:
м. Харків, вул. Мельнікова, 12
Кафедра біохімії НФаУ
Надійшла до редакції:
25.10.2010 р.
[57]
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа