close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

...каналов в регуляции фенотипа дифференцированных клеток

код для вставкиСкачать
московский ордена Ленина, ордена трудового красного знамени
и ордена октябрьской революции государственный университет
ПГR
ОД
имени м.в.ломоносова
'
НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ
,- г-ФИЗИКО;ХИМИЧЕСКОМ БИОЛОГИИ ИМЕНИ А.Н.БЕЛОЗЕРСКОГО
^Г.
^ '
оД
На правах рукописи
УДК 577:519
ШАРОВСКАЯ ЮЛИЯ ЮРЬЕВНА
РОЛЬ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ДИФФУЗИОННЫХ КАНАЛОВ В
РЕГУЛЯЦИИ ФЕНОТИПА ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫХ
КЛЕТОК
03.00.02-Биофизика
ДИССЕРТАЦИЯ
в виде научного доклада
на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва-1996г.
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
член-корреспондент РАН,
до>сгор биологических наук, профессор
доктор биологических наук, профессор
доктор биологических наук
А.Л.Вызов
А.А.Нейфах
А.А.Ставровская
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Институт цитологии РАН, г, Санкт-Петербург
Защита состоится "i^'
/ . g ^ ^ ^ ^ 1996 г. в / ^ ' ч а с о в на
заседании диссертационного совета Д.200.22.01 в~ Институте
теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу:
142292, г. ПущинЪ Московской области проспект науки ИТЭБ
РАН.
С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в
библиотеке Научного центра биологических исследований РАН
(г.Пущино,ИТЭБРАН).
Диссертация в виде научного доклада разослана"/^" / /
Ученый секретарь диссертационного совета
кандидат биологических наук
1996г.
П.А.Нелипович
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1 Аюуальность проблемы.
В многоклеточном организме фенотип каждойклепси определяется,
во-первых, ее генотипом, и во-вторых, регулирующими воздействиями
остальных членов клеточного сообщества. Такая межклеточная
регуляция осуществляется на двух уровнях: дистантного и
преимущественно мекпсаневого взаимодействия при помощи
гумморальных факторов (гормоны, факторы роста, морфогены,
нейромедиаторы), которое обеспечивается лиганд-рецепторным
механизмом, и преимущественно внутритканевого взаимодействия на
локальном уровне при непосредственном контакте соседних клеток
друг с другом Существенная роль второго способа взаимодействия
для контроля роста и социального поведения клеток была показана
при изучении процессов морфогенеза
днфференцировки и
регенерации в частности в феноменах эмбрионГьной индукции и
контактного торможения,деления и движения клеток в культуре В
качестве механизмов такой регуляцшг рассматривались процессы
адгезии и взаимодействие ютеток чео^ вне^еточный матрикс
Шасшьев Ю М Маленков А Г "Клеточные поверхности и реакции
клеток" Медицина М 1968;TDHHK^VT "От клеток к органам" Мир
мТ972)
.
Опсрыгае проницаемых межклеточных контактов (Loewenstein W.R.,
Каппо Y. J.Cell Biol., 1964, 22, 565-586), т.е. каналов прямой диффузии
веществ между клетками, обнаружило принципиально новый механизм
локальных
межклеточных
взаимодействий,
при
котором
непосредственно между цитоплазмами соседних клеток, несмотря на
двойной мембранный барьер происходит обмен гидрофильными
соединениями с молекулярной массой до 1000 Д: неорганическими
ионами клеточными метаболитами (строительный или энергетичес­
кий материал)
сигнальными и регуляторными молекулами
Морфологической основой такой межклеточной диффузионой связи
является специализированная структура щелевого контакта (ЩК, gap
1
junction), предсггавляющего собой кластер из множества гидрофильных
каналов-коннексонов.
Функционирование проницаемых контактов проявляется в
нескольких феноменах и, соответственно, может быть обнаружено
несколькими различными методами. 1 - повышенная проницаемость
щелевых контактов для небольших неорганических ионов создает
высокую электропроводность контактных мембран, которая может
быть количественно оценена электрофизиологическими методами с
использованием внутриклеточных микроэлеородов (метод оценки
межклеточной электрической связи); 2 - проницаемость контактных
мембран для более крупных соединений определяется с помощью
внутриклеточных инъекций флуоресцентных или радиоактивных меток
и последующей регисрацией распространения метки в окружающие
клетки; 3 - метаболическая кооперация клеток при которой
межкл^очный обмен естественными клеточными метаболитами
приводит к изменению фенотипа ютеток-реципиентов клеток-доноров
или и тех и других исследуется в клеточных культура^ при кооперации
клеток, деффектных по какому-нибудь свойствГи их норм^ьных
"""""^Определение морфологической стуктуры ЩК (электронномикроскопическими и иммунологическими методами), или белка,
иРНК и гена ЩК также с большой вероятностью свидетельствует о
наличие межклеточной диффузионной связи.
К настоящему времени установлено, что взаимодействие клеток при
помощи
диффузионных
межклеточных
контактов
является
фундаментальным свойством живых тканей: такие контакты
обнаружены у всех классов животного царства от гидры до
млекопитающих и практически во всех видах ткани, как взрослой, так
и эмбриональной. Свойства проницаемых контактов и их широкое
распространение позволяют рассматривать их как систему регуляции
клеточньГх функций на локальном уровне дополнительную к нервной
и гормональной системам
Функциональная роль этой системы ясна для возбудимых тканей здесь высокая проницаемость контактных мембран для неорганичес­
ких ионов обеспечивает непрерывность и большую скорость процесса
распространения возбуждения. Для невозбудимых тканей главное
значение такого межклеточного взаимодействия состоит в
возможности интенсивного диффузионного обмена большим числом
функционально- значимых соединений Такой обмен может играть
существенную роль в важнейших тканевых процессах: дифференцнровки и морфогенеза, регенерации и новообразований, в организации
устойчивых тканевых СФУК1УР.
Одним из наиболее актуальных является вопрос о роли проницаемых
контактов в процессе опухолевой •1рансформации ткани. В первых
исследованиях, проведеннь.х Левенштейном и сотрудниками
(Loewenstein W.R., Kanno Y., Nature, 1966, 209, 1248-1249) на опухолях
желудка, щитовидной железы, гепатомах и на аналогичных им
нормальных тканях, было показано полное отсутствие проницаемых
контактов между опухолевыми клетками, в то время как нормальнь.е
ткани демонстрировали высокий уровень мешслеточной связи.
Подобный результат был получен также в нескольких линиях культур
трансформированных клеток Авторы пришли к выводу что
отсутствие межклеточных диффузионных каналов может бь.ть как
причиной малигнизации так и маркером злокачественных клеток
позволяющим распознавать рак на клеточном уровне Ими была также
разработана модель саморегуляции клеточного деления основанная на
механизме
распростсанения
через
проницаемые
контакты
росткотролирующихТеществ асинхронно синтезируемых клетками
Большое значение этих данных, полученных к моменту начала нашей
работы, для решения вопроса об этиологии злокачественных опухолей,
а также общебиологических вопросов о механизме регуляции
клеточной
пролиферации
и
фенотипической
устойчивости
соматических клеток, требовало более широкого исследования
проницаемых межклеточных контактов в различных малигнизированных тканях Это и определило первоначальную цель настоящего
исследования.
1.2 Цель и задачи исследования
Основной целью настоящей работы являлось изучение роли
межклеточных диффузионных контактов в регуляции фенотипа
дифференцированных соматических клеток в следующих системах:
процессы
неоплаегической
трансформации
печени
мышей;
взаимодействие нормальных и трансформированных клеток в
культуре; ре-экспрессия во взрослых дифференцированных паренхима­
тозных клетках печени - гепатоцитах раково-эмбрионального
сывороточного белка альфа- фетопротеина (АФП).
В соответствии с этим задачи работы заключались в следующем:
1. сравнительное исследование элеюрической структуры ткани печени
мышей, индуцированных и переваемых гепатом, а также ткани
печени в процессе канцерогенеза.
2. Создание структурных моделей и расчет значений удельной прово­
димости наружных и контактных мембран клеток печени и
индуцированных гепатом.
3. Исследование возможности изменения фенотипа опухолевых клеток
при их локальном взаимодействии с аналогичными нормальными
клетками в культуре.
4. Оценка особенностей метода флуоресцентных меток при работе с
культурами эптггелиальных клеток.
5. Исследование факторов, модулирующих проницаемость межклеточ­
ных контактов: ненасыщенные жирные кислоты.
6. Изучение роли проницаемых межклеточных контактов в процессе
индукции и ингибиции синтеза АФП в первичных монослойных
культурах гепатоцитов из взрослых интактных мышей и в
трехмерных модельных системах.
7. Исследование межклеточных контактов в культурах клеток,
трансфицированных генами различных коннексинов.
1.3 Научная новизна работы
В настоящей работе впервые проведено систематическое
исследование электрической структуры печени и гепатом различного
происхождения и созданы модели этих тканей, позволяющие
определять мембранные харектеристики их клеток. Проведен рачет
значений удельных сопротивлений наружных и контактных мембран
клеток печени и гепатом
Разработана методика электрофизиологического эксперимента,
которая позволяет поддерживать устойчивые значения электрических
параметров препарата печени в течение 10-12 часов измерения.
Показано, что в процессе канцерогенеза в печени развитие опухолей
может происходить без нарушения проводимости межклеточных
контактов для неорганических ионов в основной массе клеток.
Высказана гипотеза что существенное значение могут иметь
локальные (по времени и пространственно) изменения проницаемости
контактов
Впервые показано, что трансформированные L клетки, растущие в
смеси с нормальными фибробластами, становятся чувствительными к
токсическому действию канцфогена. Таким образом продемонстриро-
вано изменение фенотипа опухолевых клеток при их локальном
взаимодействии с нормальными клетками.
В работе обнаружен новый фактор, индуцирующий межклеточную
связь в установившихся линиях эпителиальных клеток, исходно не
связанных проницаемыми межклеиочными контактами - облучение
клеток светом длиной волны 300-480 нм. Существенно, что условия
такого облучения создаются при изучении межклеточной связи широко
распространенным методом флуоресцентных меток (dye coupling)
Впервые обнаружен феномен контактного ингибирования синтеза
раково-эмбрионального белка альфа-фетопротеина в культуре
гепатоцитов и отчетливая обратная корреляция между функционированием проницаемых межклеточных контактов и экспрессией в
гепатоцитах альфа-фетопротеина.
Впервые найдено, что трехмерная организация культуры
гепатоцитов (при помощи искуственного внеклеточного матрикса или
ко-культивирования гепатоцитов с эпителиальными клетками печени)
является необходимым и достаточным фактором для ингибиции
"эмбрионального" фенотипа гепатоцита
Проведено исследование действия опухолевых промоторов на
проницаемость межклеточных контактов и ре-экспрессию синтеза
альфа-фсгопротеина в культуре гепатоцитов. Впервые установлена
возможность и определены условия, при которых опухолевый
промотор ДДТ, уменьшая проницаемость контактов, повышает
уровень синтеза альфа-фетопротеина.
Проведено сравнительное исследование межклеточной диффузион­
ной связи в культурах опухолевых клеток HeLa, трансфицированных
генами коннексиноз Сх32 и Сх26. Обнаружена физиологическая
регуляции проницаемости межклеточных контактов у этих клеток и
существенные различия в чувствительности контактов к ингибирующему действию СО2 У клеток с различными коннексинами.
1.4 Научно-практическая цеииость работы.
Работа относится, в основном, к числу фундаментальных научных
исследований. Исследование проведено на стыке биофизики,
клеточной биологии и онкологии и поэтому представляет интерес для
всех этих дисциплин. Проведено систематическое исследование
межютеточных контактовв нормальной печени, гепатомах различного
происхождения и ткани печени в процессе канцерогенеза. Получены
новые данные об изменении свойств трансформированных клеток при
их локальном взаимодействии с нормальными клетками в культуре.
Показано, что межклеточные диффузионные каналы являются
существенным звеном в регуляции синтеза раково-эмбрионального
белка альфа-фетопротеина во взрослых гепатоцитах. Эти результаты
позволяют расширить и конкретизировать наши представления о роли
проницаемых межклеточных контактов в процессах регуляции
фенотипа дифферевдирован«ых клеток и, в частности, в процессах
трансформации ткани.
Выяснение механизмов взаимодействия нормальных и опухолевых
клеток (нормальные фибробласты и трансформированные L клетки)
имеет большое значение для онкологии, т.к. в организме такое
взаимодействие может быть фактором, ограничивающим развитие
опухоли. Кроме того, испытание многих противоопухолевых
препаратов проводится первоначально в клеточной культуре.
Результаты данной работы показывают, что при этом более
адекватной моделью является смешанная культура нормальных и
трансформированных клеток
Обнаруженный в настоящей работе феномен индукции
межклеточной связи в культуре эпителиальных клеток требует
внесения корректировки в метода флуоресцентных меток (dye
coupling), который широко используется для изучения межклеточных
контактов. Полученная в этой части работы экспериментальная
система может быть использована для изучения механизмов
образования проицаемых межклеточных контактов
а также
механизмов воздействия коротковолновой част светового спектра на
структуру биологических мембран
Изучение механизмов регуляции проницаемости межклеточных
диффузионных контактов в культурах клеток, трансфицированных
генами различных коннексинов, позволяет выяснить как свойства
каналов сформированных из конкретных коннексинов, так и их
влияние наметочный фенотип.
1.5 Апробация работы.
Результаты работ, вошедших в диссертацшо, представлялись на:
* Всесоюзном симпозиуме Межклеточные взаимодействия в
дифференцировкеиросте" (Тбилиси, 1968)
* Всесоюзном симпозиуме "Биофизика мембран" (Паланга, 1971);
* IV Международном биофизическом конгрессе (Москва, 1972);
* Всесоюзном совещании: "Локальные взаимодействия клеток и
свойства контактных мембран" (Пущине, 1976);
* I, II и III Всесоюзных школах по механизмам взаимодействия клеток
(Каунас, 1978; Друскенинкай, 1984; Каунас, 1988),
* Советско-американском семинаре "Кодирование и передача
информации в биологических системах" (Суздаль, 1986);
* Всесоюзном совещании "Немышечные формы подвижности"
(Чернигов, 1988);
* Всесоюзном совещании "Проблемы детерминации" (Москва, 1988);
* Всесоюзном совещании "Клеточные и молекулярные механизмы
канцерогенеза и антиканцерогенеза (Ленинград, 1988);
* II международном симпозиуме "Hepatic Gene Function in Health and
Disease" (Cold Spring Harbor, USA, 1989);
* Международном симпозиуме "Sapporo seminars on cancer and
differentiation" (Sapporo, Japan, 1989);
* Международной конференции: "XVIII Meeting of the International
Society for Oncodevolopmental Biology and Medicine" (Москва, 1990);
* Советско-финском симпозиуме "Сигнальные молекулы и клеточная
дифференцировка (Суздаль, 1991);
* Международной конференци "Workshop on intercellular
communication" (Pushcino, Russia, 1994);
* Международной конференции "Annual Meeting of the German
Biophysics Society" (Osnabrueck, Germany, 1992);
* Семинаре кафедры биофизике Штутгатрского Университета,
руководитель проф. Д.Хюльзер (Штутгарт, Германия, 1996).
1.6 Публикации
По материалам диссертационной работы опубликовано 32 работы, в
том числе коллективная монография "Высокопроницаемые котактные
мембраны" Наука, Москва, 1981 г. и 23 статьи в отечественных и
зарубежных журналах и сборниках. Список опубликованных работ
приведен в разделе 8.
1.7 Положения, выносимые на защиту
* Результаты сравнительного исследования электрической структуры
ткани печени мышей, индуцированных и перевиваемых гепатом.
* Разработка структурных моделей и расчет значений удельной
проводимости наружных и контактных мембран клеток печени и
гепатом.
7
* Результаты исследования чувствительности к канцерогенам опухо­
левых клеток, растущих в смешанной культуре с нормальными
клетками.
* Оценка особенностей метода внутриклеточных флуоресцентных
меток при работе с культурами эпите^тиальных клеток.
*
Результаты исследования механизма действия арахидоиовой
кислоты на проницаемость межклеточных контактов.
* Результаты исследования регуляции межклеточных контактов в
культурах клеток, трансфицированных различными коннексинами.
* Результаты изучения роли проницаемых межклеточных контактов в
процессе ре-экспрессии раково-эмбрионального белка апьфафетопротеина в первичных монослойных культурах гепатоцитов нз
взрослых интактных мышей и в трехмерных культуральных
системах.
1.8 Благодарности
Прежде всего, мне хочется сердечно поблагодарить Левона
Михайловича Чайлахяна - моего руководителя от самой первой
научной работы (диплома при окончании МГУ) и до настоящего
времени.
С неизменной признательностью и чувством глубоково уважения я
благодарю первого руководителя нашей группы Межклеточных
взаимодействий в НИИ ФХБ МГУ Сергея Адамовича Ковалева.
Я благодарна И.М.Гельфанду, Ю.М.Васильеву, В.И.Гельштейн,
Г.И.Лбелеву, А.Л.Вызову за счастливую возможность учиться у них
высокому уровню научного ремесла.
Моя искренная благодарность моим коллегам и соавторам по
совместной дружной работе на протяжении многих лет:
Л.Ю.БОЙЦОВОЙ, Л.А.Митгельману, Л.Б.Марголису, А.С.Глейберману,
В.В.Смолянинову,
М.Б.Беркинблшу,
А.Я.Дуниной-Барковской,
Е.И.Кудрявцевой Е.С.Снегиревской, Я.Ю.Комиссарчику, а также
Д.Хюш,зеру (D.FHulser, Германия) и всем сотрудникам ру^соводимой
им кафедры биофизики fuT^pTCKoro Университета, с которыми мне
посчастливилось работать в пошеднее время.
Мне хочется поблагодарить директора нашего Института (НИИ
ФХБ им.А.Н.Белозерского МГУ) В.П.Скулачева и всех сотрудников за
удивительную атмосферу доброжелательности и свободы научного
творчества, которая сохраняется у нас со дня образования корпуса "А"
30 лет назад и по сей день.
2. ЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА ТКАНИ НОРМАЛЬНОЙ ПЕЧЕНИ
МЫШЕЙ И ГЕПАТОМ РАЗЛИЧНОЙ ЭТИОЛОГИИ
Цель данной части исследования состояла в сравнении
проницаемости межклеточных контактов для неорганических ионов в
ткани нормальной печени мышей, в перевиваемых и индуцированных
гепатомах мыши, и в ткани печени в процессе канцерогенеза. Прямым
показателем такой проницаемости является уделывая проводимость
(или обратная ей величина удельного сопрот^.вления) контактных
мембран. Определение этой величины в тканях со сложной структурой,
какими являются печень и гепатомы, включает в себя три этапа: 1)
измерение системных электрических параметров ткани: входного
сопротивления клеточной системы (г«,) и распределения по ткани
потенциала приложенного внутриклт,чно (ЭТП); 2) создание ее
структурной модели; 3) расчет искомой характеристики на основе
р^работанной дая возбудимых тканей кабельной теории и теории
синц1пиальныхтааней.
2.1 Материалы и методы
Электрические характеристики нормальной ткани были исследованы
на интактной печени мь.шей (in vivo) и на изолированных фрагментах
печени (in vitro). Использование этих двух методик объясняется
следующими соображениями. 1) В опытах на интактной печени
измерения производятся в условиях, наиболее приближенных к
условиям ее нормального функционирования. Однако, на целой печени
невозможно осуществить визуальный контроль за положением
электродов в клетках. Это обстоятельство может существенно
сказываться на точности измерения ЭТП, особенно в точке
поляризации (г,^, когда поляризующий и регистрирующий электрод
должны находиться в одной клетке. Кроме того, печень в
наркотизированном животном движется при движении диафрагмы,
что увеличивает повреждение при вкалывании двух электродов. В
опытах на изолированных фрагментах печени, отсекаемых от края
печеночной доли, устраняются эти причины ошибки измерения:
препарат неподвижен; край печеночной доли представляет собой одно, двух- слойную пластинку, в которой на просвет видны отдельнь.е
клепси. 2) In vivo исследованы перевиваемые, а in vitro индуцированные гепатомы и ткань печени на ранних стадиях
канцерогенеза. Данные полученные на нормальной печени в соответ­
ствующих условиях, служат контролем для эп1х малигнизированных
тканей
Объекты исследования: Опыты in vivo проводили на нормальной
печени беспородных мышей и на медленно растущих штаммах
перевиваемых гепатом 46, 48, 49 (Гельштейн, Вопр.онкол.,1964, 10, 7:
65-70) трансплантированных под кожу бедра мышей линии СЗНА
(любезно предоставленных В.И.Гельштейн) В опытах ш vitro
использовали мышей-самцов линии СЗНА как для исследования
нормальной печени так и для получения гепатом. Индуцированные
гепатомы получали путем введения мышам орто-аминоазотолуола
(ОЛАТ) 1 раз в месяц подкожно по 10 мг на животное в течение 5-8
месяцев Использовали небольшие опухолевые узелки возникающие на
краях печеночных долей Для измерений от края печеночной лопасти
отсекали кусочек размером 15x1 см (нормальной ткани или с
опухолью) КОТОРЫЙ сразу помещали в раствор в термостатированную
рабочую камеру расположенную в е р т и к ^ н о под объективом
LKpooLna укрепленного "на спине"
Растворьг'в опытах ш vivo в качестве омывающего препарат раствора
использовали раствор Рингера (156,5 мМ Na+ 5,6 мМ К+ 2,1 мМ
Са++, 163,8 мМ CI-, 2,5 мМ НСО3-), нагретый до 30-370 С, который
наливался в брюшную полость или (для гепатом) в углубление на
бедре образованное кожным лоскутом. В опытах in vitro фрагмент
исследуемой ттсани помещали в камеру объемом 1,5 мл, в которой
подлаживался постоянный проток раствора состоящего из среды 199
(45%) гидролизата лакт^ьбумина (45%),и сыворотки крупного
рогатогоскота(10%) Объем циркулирующего раствора был равен 150200 мл Температура раствора (36 36 5" С) потдержившгась при
помощи ультратер^стата NBE (VEB Pnifgera e-Werk Medin.en ГДР)
и
измерялась
в
рабочей
камере
полупроводни^совым
микротермосопротивлением МТ-54 Карманова (Агрофизический
НИИ Ленинград)
Измерение системных электрических параметров исследуемых тканей
проводилось стандартньш методом прямоугольных импульсов
10
гиперполяризующего тока (Hodgkin et al, Proc. Roy. soc... 1946, B,
133:444-479) с использованием двух стеклянных внутриклеточных
мнкроэлектродов, заполненных 2,8 М раствором KCL. Толщина
кончика около 0,5 мкм, сопротивление порядка 10-70 мОм. Между
введенным в клег-ку микроэлектродом и хлор-серебряиным
индифферентным электродом
пропускались
импульсы
тока
длительностью 10-30 мсек и силой 3 0-4 5x10-7 д от генератора
прямоугольных импульсов. Другим вну^иклеточным микроэле J o дом регистрировались изменения мембранного потенциала клеток
расположенньГх на разных расстояниях от поляризуемой клетки Один
из микроэлектродов мог переключаться из поляризующей цепи в цепь
регистрирующую Оба элеггрода соединялись со входами катодных
повторителей собранных по схеме Вызова АЛ и Бонгарда ММ
(Физиол ж , 1959 45 3: 110-113) Далее сигналы подавались. на
усилители постоянного,тока двухлучевого осшшюскопа Universal Disa
Indicator
и
репотия
потенциалов
производилась
фотографированием с его экрана. Сила тока измерялась по падению
напряжения на сопротивлении 200 кОм, включаемом на время
измерения последовательно
с индифферентным
электродом.
Измереннь.е значения потенциалов U^ (х - расстояние от точки
поляризации до точки регистрации потенциала в мкм.) относили к
величине тока и выражали величиной r,-U,/io в килоомах. При малых
значениях х (не более 10 мкм оба электрода находятся в одной клетке)
Гх равно г,,.
Введение электродов в юзетки осуществляли при помощи
микроманипуляторов ММ-1; в опытах in vivo - под контролем
бинокулярного микроскопа, в опытах « vitro - под контролем
микроскопа МБИ (увеличение 225х, точность определения расстояния
между электродами - 1 мкм). Положение электродов внутри клеток
тестировалось по величине мембранного потенциала (МП).
2.2 Системные элеютические характеристики ткани печени и гепатом.
Результаты измерения мембранных потенциалов (МП) и входных
сопротивлений в тканях нормальной печени и гепатом представлены в
таблице I. В опь.тах ш vivo значение средних величин гГд определялось
суммарно по нескольким опьтгам; в опытах in vitro среднее значение Гвх
определено в кавдом опыте и приведены данные для опытов с
минимальным и максимальным его значениями Сравнение МП
опухолевь.х и нормальных клеток показывает, что у двух штаммов
II
гепатом (46 и 48) мембранный потенциал почти в 2 раза ниже, чем МП
клеток нормальной печени в тех же условиях: соответственно 19,7; 15,9
и 36,2 мВ. МП клеток штамма 49 (34,4 мВ) достоверно не отличается от
МП клеток нормальной печени. Среднее значение МП клеток
индуцированных гепатом (43,4 мВ) соответствует значению МП в
нормальной печени в условиях in vitro (42,5 мВ). Таким образом не
наблюдается корреляции между типом клеток и величиной их МП:
существуюткак гепатомы со^ачительно сниженным значением МП
что может свидетельствовать об изменениях ионных градиентов так и
гепатомы, сохраняющие нормальный уровень МП.
Таблица 1. Мембранные потенциалы и входные сопротивления ттсани
печени, перевиваемых и индуцированных гепатом мыши.
Видткани
МП,мВ
Гвх.кОм
Нормальная печень
(invivo)
Нормальная печень
Цп vitro)
Перевиваемые
гепатомы (/«V/VO)
штамм 46
штамм 48
штамм 49
Индуцированные
гепатомы (ш«М
36,2 ±0,6
81±8
42,5 ±0,4
от189±9до613±
25
21
19,7 ±0,5
15,9 ±0,7
34,4 ±0,8
43,4 ±0,6
98±9
ПО ±17
146 ± 17
от215±16до522
±27и800±46в
одном опыте
от 151 ±25 до 338
±83
7
3
4
8
Печень в ранние сроки
канцерогенеза 0«vf/r.)
кол-во
опытов
5
10
Среднее значение входных сопротивлений нормальной печени,
измеренное in vivo, в несколько раз ниже, а дисперсия регистрируемых
значений Tg^ существенно выше, чем в опытах in vitro. Вероятно, это
объясняется описанными выше систематическими
ошибками
измерения, возникающими в первой случае. Для проверки этого
предположения мы провели оценки г,, и спада потенциала на ткани
печени in vitro также на объемной части печеночной доли т е вдали от
ее края. Согласно этим измерениям, только самые высокие из
12
зарегистрированных in vivo величин г,, (200 кОм) следуп- считать
истинными значениями, т.е. случаями, когда оба электрода находятся в
одной клетке. При этом, спад потенциала в объемной части препарата
происходит круче, чем ..а краю печеночной доли и в гепатомах.
Существенным при сравнении результатов, полученных с помощью
этих двух методик, является тот факт, что выделение фрагмента печени
из организма животного и работа на этом препарате в условиях
разработанной нами методики в течение 7-8 часов, не нарушают
метаболическую активность и ионньп! баланс, присущие клеткам
иитактиой печени, что отражается в сохранении уровня МП, а также
не изменяет принципиально структуру межклеточных связей, о чем
свидетельствуют результаты измерения входных сопротивлений и
ЭТП
Средние величины Гвх у 8 из 9 исследованных индуцированных
гепатом соответствукуг входным сопротивлениям в нормальной печени
in vitro. Измеренное нами в одном опыте увеличение т,, до 800 кОм не
свидетельствует о разобщении контактов, т.к. кривая спада потенциала
в этом случае не отличалась от таковых на других гепатомах.
Существенно не отличаются входные сопротивления перевиваемых
гепатом и нормальной печени in vivo
Значения г^, на ранних ст..диях канцерогенеза соответствуют его
величинам в нормальной печени в зимне-весенний период, однако
здесь не наблюдается высоких (до 600 кОм) значений, харатстерных для
нормальной печени в летние месяцы. Это может указывать на
невосприимчевость клеток печени, подвергшихся воздействию
канцерогена, к регулирующим гормональным влияниям.
Распределе.ше по ткани нормальной печени и индуцированной
гепатомы потенциала, приложенного внутриклеточно, иллюстрирует
рис. la, б. Кривые имеют ступенчатьш вид, т.к. основная доля спада
потенциала на внутреннем сопротивлении ткани происходит на
контактных мембранах, а цитоплазма клеток практически эквипотен­
циальна что показали наши измерения ЭТП вблизи точки поляриза­
ции Заметное изменение МП в ответ тш внутриклеточную поляриза­
цию регистрируется на расстоянии до 14 клеточных размеров от
поляризуемой клетки в обоих типах ткани Это однозначно свидетель­
ствует о резко повышенной проводимости контактных мембран по
сравнению с мембранами обращенными в наружную среду '
13
т
.
300
^
»-
~1
:
•
мл.
60
180
т
^
J?'^.^^r^
'?
о
т
но
зоо
.
'•
ISO
1.21)
б
500-
WD
300
'
в
S
t
' 60 ' ш ' m ' г1о зоГ
Рис. 1. Распределение электротонического потенциала Р Т П ) по ткани
нормальной печени (а) и по ткани индуцированной гепатомы (б) при
внуфиклеточном пропускании тока. По оси абсцисс - расстояние от
точки поляризации до точки регистрации потенциала: верхняя шкала в ед.среднего диаметра клеток (для а -30 мкм, для б -22 мкм) . По оси
ординат - величина ЭТП (в килоомах). Амплитуды ЭТП нормировань,
по величине поляризующего тока и поэтому имеют размерность
сопротивления. Вькота отдельного столбика равна средней величине
из всех измерений (обозначены точками) ЭТП в данной точке Для
каждого случая приведены данные, полученные в одном опь.те in vitro
и
Рис. 2. Распределение по ткани
нормальной печени (а) и перевиваемой гепатсмь, 46 (б) элеюгротонического потенциала. По оси
QMucc-рассггояние от точки по,
,
ляризации
до точки регистрации
< > ^
Ы
потенциала Яо
o c / o j r ~---^-T.s -'-.-_
в ^ и ч ш Т э Т П А Г Л И ™ ЭТП
1
7о k - i1.-7^-^
нГмГованы пп ™ и н е поля
™ щ е г о тока и поэтому им^ют
размерность сопротивления (Л - нормТьная печень и ^2) r e L ™
S r
з н а ч е н Т э т П Z даннотГГсст^ния Каадьш i^^^^^^^ с?Гарный р™т^всеГопь^^^^^^^^^
J/7/:,//«
100
• ^
Кривые распределения ЭТП в ткани перевиваемой гепатомь, (штамм
46) и нормальной печени in vivo (рис 2) представляют собой
экспоненть! проведенные при помощи метода наименьших квадратов
определить
характер спада потенциала
(ступенчатый
иш,
непрерывный) в этих опытах не удается из за дисперсии значении ЭТП,
особенно высокой в области поляризации. Сравнение кривых
показываете что затухание ЭТП с расстоянием в нормальной печени и
р гепатоме 46 практически ны отличается. Сходнь^ кривые
3 c ^ B V j , ^ S L a « ^ e ^ H 4 S a « с ^ Г Г к и межГ
ноом^ьн^й п е ч З H e o S 3 ^ ^ ^ ^
MS з ^ н и е
эле.^отонического ^ S S a
не зависиТ от направления
п^ЩШияадодовТ^^^
? е электрическая
структура исслед^нных тканей изотропна
2.3 Струюурные модели ткани печени и индуцнрованных гепатом
мыши.
Полученнь,е экспериментальные данные были использованы для
расчета удельных сопротивлений наружных и контактных мембран
клеток печени и индуцированных гепатом, проведенного совместно с
д.б.н. В.В.Смоляниновым на основе унифицированной теории
электрических сипцитиев (Смолянинов В.В., Математические модели
биологических тканей. М "Наука" 1980).
Ткань, у которой клетки соединены системой проницаемых
межклеточнь.х контактов, можно представить в виде электрического
синцития, состоящего из отрезков кабеля, имеющих наружную
15
мембрану с высоким сопротивлением и проводящий "сердечдечник"
(протоплазму и контактные мембраны) с низким сопротивлением.
Такие отрезки кабеля состоят из одной или нескольких клеток,
последовательно примыкающих друг к другу. В структурной модели
синцития схема соединения этих отрезков кабеля в разветвленную сеть
выбирается в соответствии с морфологией данной ткани.
Основными парамефами аруктурной модели синцития являются:
размерность сети синцития (п); степень связности клеток (S), т.е.
количество клеток, с которыми каждая данная клетка связана
проницаемыми контактами; а так же характеристики кабельного
элемента. Для обозначения таких моделей используется символ N,".
Детальное морфологическое исследование структуры нормальной
печени было проведено Элиасом (Elias Н. In: The liver. N.Y.; L., 1964, 1,
p.41-87), который показал, что каждая доля печени предсталяет собой
единую, широко ветвящуюся сеть печеночных клеток. Исходя из этого
и из обнаруженной нами электрической изотропности ткани, в
качестве средней модели реальной структуры объемной части
паренхимы печени и индуцированных гепатом, имеющих сферическую
форму, использовали модели правильной трехмерной сети. Бьши
рассмотрены модели сетей, отличающиеся величиной S и длиной
кабельного элемента: N ] - с минимальной степенью связности, равной
3; N ^ в которой каждая клетка контактирует с 4 соседними. В этих
моделях кабельный элемент сети эквивалентен клетке На их основе
можно строить варианты с более "разреженой" упаковкой заменяя
каждую клетку колонкой из m клеток
Однако структура края печеночной доли, на которой проведены
основные электрофизиологические измерения на нормальной печени in
vitro, значительно отличается от ее объемной части. Самый край
лопасти представляет собой пластинку толщиной в одну клетку,
которая, постепенно расширяясь, переходит в объемную часть.
Поэтому для измерений, проведеннь.х на краю печени, когда
поляризующий электрод находится в краевой клеттсе пластинки, расчет
электрических характеристик проводился на основе модели
правильной двухмерной сети со степенью связности 6 (Ng). Таким
образом при расчетах для ткани печени были использованы две
независимые модели
При выборе характеристик кабельного элемента синцития
необходимо знать диаметр клеток и плотность их упаковки, косвенным
16
показателем которой может служить доля внеклеточного пространства
в объеме ткани. Так как гепатомы различного происхождения по
морфологии значительно отличаются друг от друга, мы провели
морфометрические измерения на ткани тех же гепатом, на которых
проводились элекфофизиологаческие опыты, сравнивая морфологию
печени и гепатомь. (табл. 2). На гистологических препаратах
(парафиновые срезы толщиной 13 мки, содержащие учаспси
нормальной ткани и гепатомы) измеряли следующие величины. N число клеток в квадратном поле зрения с длиной стороны 225 мкм; do диаметр клеток; а - относительная площадь, занятая клепсами. Кроме
того, в табл. 2 приведены расчетные величины: Р - "плотноегь", или
число клеток в 1 мм^, вычисляемая по числу N и объему среза в поле
зрения; Рщ - максимальная плотность, определяеая как плотность
упаковки сферических клеток данного диаметра; ао - теоретическая
оценка доли паренхнмногопрос-транства определяемая как Р/Рщ атак
же d - диаметр клеток, измеренный в клеточной суспензии.
Таблица 2. Морфометрические характеристики ткани печени и
гепатомы
ъ^ъ
Нормальная
печень
Гепатома
|N*| do i.i:аi
I
IмKMI
I
Р
I
р;;;
га^~
I I мкм
80
23,3 0,25 1,22*105
1,51*105 0,2
30
95
18 0,33 1,44*105
3,20*105 0,55
22,5
Как видно из таблицы, измерения в клеточной суспензии и на срезах
дают сходные соотношения диаметров клеток печени и гепатомь.. В
соответствии с этим в моделях печени d = 30 мкм., гепатомы - 22,5 мкм.
Определение на гистологических срезах и теоретическая оценка доли
паренхнмного пространства (а и ао) показывают, что ткань гепатомы
организована более рыхло, чем ткань печени.
Модель кабельного элемента сети выбирается так, чтобь, его
поперечное сечение имело ту же площадь, что и область контакта
клеток. Площадь наружной клеточной мембраны распределяется по
длине элемента. При расчетах использовали два значения величины
площади наружной мембраны клетки, выбор которых основан на
следующих предположениях: 1) в области клеточного контакта, кроме
небольших участков повьиненной проводимости, остальная мембрана
17
практически не проводит ток из-за слабой утечки его в наружную
среду; 2) в другом крайнем случае можно полагать утечку через
контактную щель вполне хорошей и относить мембрану этих областей
к наружно.", мембране. Поскольку по литературным данным в клетках
печени мыши площадь, занимаемая структурами щелевого контакта,
составляет 1,5% от площади всей клеточной мембрань,, то в этом
случае практически всю поверхность клетки можно считать наружной.
2.4 Расчет удельных сопротивлений наружных и контактных мембран
клеток печени и гепатом.
Кабельный элемент синцития
определяется
двумя
характеристическими величинами: р - входЕ.ое сопротивление
нолубескоисчного кабеля и X - расаоян1е вдоль кабеля, па котором
ЭТП уменьшается в е раз. При произвольной форме поперечного
ссчення элемента эти величины определяются как:
Здесь RM - удельное сопротивление наружной мембрань,, Ro6 суммартюе удельное сопротивление проводящего
сердечника
кабельного
элемента,
включающее
удельное
сопротивление
цитоплазмы Rg и контактной мембраны R, :
Коб = RB + 2RK//C
(2)
.-де / - длина элемента, е - доля площади проводящего контакта по
отношению к площади поперечного сечения. В формулах (1) ах площадь поперечного сечения элемента, р^ - площадь наружной
мембраны на единицу длины кабельного элемента. В общем виде
величины а^, Рх и / определяются следующими образом:
ax = cd2, рх = bd, / = .Tid
(3)
где d - линейная характеристика поперечного размера элементаклетки, с, b и m - коэффициенты, которые зависят отвыбора модели
кабельного элемента.
Процедура расчета состояла в следующем
1) По полученной в эксперименте кривой распределения ЭТП
определялись значения S и 1. Для этого экспериментальная кривая
сравнивалась с кривь.ми распределения потенциала, расчитаными при
разных значениях ?. и S для данной структурной модели синцития.
Значения этих величин при которых наиболее полно совпадал^
экспериментальная и расчетная кривые являются искомьши
2) По измереииой величине Гр^ определялась пелмчима R,,. Для
•Шехмшюи однородно!! сети расчетная (l.opN.ynа лая R,^:
Для рассматриваемой двухмерной сети К^e = ^ c d , , , '
(5)
m e r = ln(2v''6X/l)
3) Удельное сопротивление наружной мембрань, тлмислялось г.о
формуле:
R^^R^.M^/cdd
(6)
а кчм.тактной мембрань, - по формуле (2) для всех испояь:юваннь,х
мопспш.
Данные по распределению ЭТП, нолученнь.е на краепсй зоне печени,
удовлетворительно
аппрокхимпруются
торанческой
кривo,;
распределения потенциала, рассчитанной для сети Щ при значен.н. Х=
500мкм(рис.3),
я
и
12
I»
Рис. 3. Иормнрованнн,й с а д потенциала в пластинке печени при
удалении от поляризующе,-о эле,<трода. По оси абсциссс -асстояние ео
точки поляризации до точки регистрацпп потсишала (в ед. среднего
диаметра клетки - 30 MKN,.); па оси ороииат - амплитуда ЭТП,
нормированная к вел,.ч,„ш ,ютен,и.ала в "нулевой " клетке, где
производ,1ТСЯ поляр.пация. Ломаная лишш - теоретическая аппрокс,«аация (см. текст ; оОинаковшт значками ибоз,;аченьы экспери.ментальныс нормирован,п„е средние значения ЭТП .дтя одного опыта.
13 объемной часгн печени экспер,^ментальная кривая спада
потенциала .и.тересш тe^,, что она не может быть описана трехмерной
моделью со степенью связности клеток S = S - 9, которая вь.текает из
^,oдeJrн Г.Эл,.аса. Соответствует 3KeпepHN.e„raabHb,M ттиьш только
модел> с ме,п.н,ей сгспеь-,ь,о связности: N] при ).= 500 мкм. Таким
образом, ;утя объемной часз, печени X = 500 мкм и S = 4.
кривая спада ЭТП в гепатоме имеет еще более пологий характер, чем
в объемной часгги печени. Даже при минимальной для трехмерной сети
степени связности S = 3, и при Х= «, расчитанное поле потенциала
спадает круче, чем экспериментально измеренное в ткани гепатомы.
Поэтому соответствовать экспериментальным данным может только
трехмерная есть с более рыхлой организацией. Поле модели N3 при m
= 2 и X = 600 мкм удовлегворительно аппроксимирует
экспериментальные данные. Таким образом, для модели ткани
гепатомы S = 3 , т = 2 и ; i = 600 мкм.
Используя найденные для всех трех моделей значения S и ;. и
характерисгики их кабельных элементов, расчитывали величины R„ и
R^. Результаты расчета и значение основных параметров моделей
приведены в табл.3. Указанный в таблице разброс величины R ,
обусловлен описанным выше выбором модели клетки, т.е. учетом доли
наружной мембраны.
Для ткани печени обе независимые модели дают близкие значения
величин Ry и RK- Использование двухслойной модели печеночной
пластинки приводит к некоторому занижению величины R„, т.к. в ней
не учитывается постепенное увеличение числа клеточных слоев при
удалении от края пластинки. Расчитанные нами значения величин R„ и
Ro6 совпадают со значениям, полученными позже в работе (Graf et al.,
J Physiol,1978, 284:105-126) на печени мыши в аналогичной
экспериментальной системе (микроэлектродный метод и использова­
ние расчетной модели) и несколько ниже значений для печени крысы в
тех же условиях (Meyer etal J Cell Biol 1981 91:505-523) Они также
подтверждаются результатами измерения R и R методом пэтч-кламп
на одиночных клетках и двух^а.еточнь"х атегатах в культуре
гепатоцитовмыши(Плонскийидр Биол мембраны 1988 5-44.50)
Полученная для клеток гепатомы величина R J соответствует ее
значениям для клеток печени, а расчетная величина R^ не только не
выше, но даже несколько ниже, чем в печени, что является результатом
более пологой кривой спада ЭТП на ткани гепатомы, чем в объемной
части печени.
Важным результатом настоящей модельной работы является тот
факт, что удовлетворительную аппроксимацию реальной картины
спада потенциала как в печени, так и в гепатоме, удается получить
только на основе трехмерных моделей с небольшой степенью связности
клеток 5=3-4 в то время как из модели структуры печени, созданной
Элиасом на основе классических морфомефических измерений,
20
следует степень связности S=8-9. Одним из вариантов решения этого
противоречия может бь>ть предположение, что не всякий
морфологический контакт между клетками паренхимь, печени является
электропроводящим.
Таблица 3. Геометрические и электрические характеристики сшщитиев
ткани печени и гепатомы.
Параметры сцинтиев
Нормальная печень
Гвх,Ом
п
S
m
Л,см
Коб, Ом* см
на краю
лопасти
0,4М06
2
6
I
5»10-2
1800
RM,0M*CM2
1,4-3,6*103
Як,ОМ*си2прие=1
2,7
К „ О М * с м п р и е = 0 , 0 3 8*10-2
в объемной
части
0,2*106
3
4
1
5*10-2
1400
2,4-7,2* 103
2,2
6,5* 10-2
Гепатома
(объемная
структура)
0,35* 106
3
3
2
6*10-2
590
3,3-5,6* 103
0,66
2*10-2
Таким образом, как качественный анализ кривых распределения
ЭТП, так и проведенный расчет удельных сопротивлений контактных
мембран клеток показывают, что в исследованных нами гепатомах, а
также а процессе канцерогенеза, не происходит генерализованной
потери проницаемости межклеточных контактов для неорганических
ионов. При этом необходимо отметить что использованный метод не
позволяет обнаружить немногочисленные несвязанные клетки если
они имеются в ткани или кратковременные нарушения межклеточной
связи.
Данные, полученные в этой серии экспериментов, доказывают, что
существуют опухоли, у которь.х контакты по проницаемости для
неорганических ионов не отличается от контактов соответствующей
нормальной ткани. Качественно анлогичный результат был получен в
работе Шеридана (Sheridan, J.Cell Biol., 1970,45:91-99): пары
электрически связанных опухолевых клеток были обнаружены во всех
21
типах нсследованных им оухолей (3 вида гепатом и 2 вида сарком).
Следовательно, отсутсггвие проницаемых межклеточных контактов не
является обязательиьш свойством опухолевых клеток, воз.шкающим в
момент трансформации или в процессе опухолевой прогрессии.
Однако, как уже указь.валось выше, существуют опухоли и линии
трансформированных клеток, у которых полноегью утрачивается
межклеточная диффузионная связь (см. также: Krutovskikh et al., Int. J.
Cancer, 1994, 56: 87-94 - значительная редукция дифузионной связи в
первичных опухолях печени человека) При этом такая утрата
"кo^.^.yннкaбeльнocт-и" происходит только у раковых и 1рансформи­
ровапных клеток и всегда связана с потерей контроля роста
Основываясь на этих данных и более общих соображениях о
свойегвах проницаемь.х межклеточнь.х контактов, мь, высказали
предположение (Бойцова и др., 1970), что наиболее существенным
являйся вопрос о проницаемос-ти контактов между нормальными и
опухолевыми клетками а пе между клетками внутри гепатомы
Действительно высокая проницаемость контактов аюсобствуя
усреднению содержимого клеток за счет взаимообмена химическими
компонентами может гасить изменения возникающие в отдельных
клетках или в небольших участках ткани и приводить к тому что не
будет проявш,ться фенотип трансформированных клеток т е не будет
происходить образование опухоли Условие неконтролируемого роета
в таком случае будет состоять в нарушении контактной проводимоети
в самые тшчальные сроки процесс малигнизации и в небольшом
количестве клсток Возможность передачи через клегочные контакты
физиологических мстаболитов от клетки способной к определенной
метаболической реакции к клетке генегически деффсктной по ЭТОМУ
nmi3HaKv так называемая ме;-абочическая коопепаиия^ бмлз
!L; пботы IT ™
тГшсформированньхкл™
нормальных
22
3. ИЗМЕНЕНИЕ ФЕНОТИПА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК ПРИ ИХ
ЛОКАЛЬНОМ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С НОРМАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ
В КУЛЬТУРЕ
Многие типы неопластическнх соединительнотканных клеток
грызунов значительно более резистентны к токсическому действию
канцерогенных полициклических углеводородов, таких как 7,12диметил-беизо(а)антроцеи
(ДМБА),
чем
их
нормальные
предшественники (Starikova V.B., Vasiliev J.М., Nature, 1962, 195:42-43).
Эти различия чувствительности обусловлены тем, что в опухолевых
клетках
происходит
редукция
ферментной
системы,
метаболизирующей эти углеводороды, а токсическим действием
обладает не сам углеводород, а какой-то из его метаболитов. При этом
метаболиты, накапливающиеся в среде культур чувствительных клеток,
не токсичны ни для нормальных, ..и тя опухолевых клеток. Повидимому, активными являются короткоживущпе метаболиты,
которь,е могут действовать лишь в клетке, где он», образуются, ,ш, в
непосредственной близости от нее. По апологии с явлением метаболи­
ческой кооперации можно ожидать что активные метаболиты
канцерогена могут действовать и на резистентные опухолевые клетки
если эти клетки окажутся в контакте с нормальньши клетками
метабилизирующими добавленнь.й в культуру углеводород Проверка
этого предположения и составляла задачу данной части исследования.
3.1 Материалы нметоды
Объекты исследования. Использовались два типа клеточных культур:
(а) - нормальные эмбриональные фибробласты мыши, чувствительные
к канцерогенным углеводородам (НФ) и высоко-резистентные
неопластические мышинь.е фибробласты линии L. Нормальные клетки
получали путем трнпсннизации 16-18 суточных мышиных эмбрионов и
рассаживали в пеницилиновые флаконы на покровные стекла в
количестве 4-5x10^ клеток на флакон. Через 3 суток с части покровных
стекол механически удаляли половину образовавшегося монослоя НФ,
23
после чего в эти же флаконы высевали 2,5-10x10* клеток L. Таким
образом, на одном и том же стекле мы имели смешанную культуру НФ
и L клеток и чистую культуру L клеток. Оставшиеся флаконы с НФ
служили контрольной чистой культурой НФ, а контрольные культуры
L клеток высаживали на чистые покровные стекла в тех же
концентрациях, что и в смешанных культурах.
Растворы и реактивь.. Культуральная среда состояла из 45% среды
199, 45% гидролизата лактальбумина и 10% сыворотки крупного
рогатого скота. ДМБА, синтезированнь.й в химической лаборатории
ИЭиКО АМН СССР, предварительно растворяли в сьшоротке и
добавляли в к среде культур в конечной концентрации 1 мкг/мл. Среду
меняли через 2-3 суток; после добавления ДМБА среду не меняли до
конца опыта.
Для авторадиографических исследований использовали тимидин,
меченый тритием (удельная активность 500 млкюри/ммоль). В опытах с
предварительно мечеными клетками L их культуры выращивали в
течение 2 суток с НЗ-тимидином (0,1 мккюри/мл). Затем клетки
отмывали, суспендировали и в присутствии немеченого тимидина
добавляли к культуре НФ, как описано выше. При дальнейшем
культивировании клеток к среде добавляли немеченый тимидин в
концентрации 2 5 мкг/мл для предотврашения реугелизации метки В
опытах с импульсной меткой Н^-тимидин (0 5 мккюри/мл) добавляли к
среде за 1 час до фиксации Культуры в этих опытах фиксировали
покрывали жидкой эмульсией типа М(НИИХИМФОТО) проявляли в
амидоловом проявителе и докрашивали гематоксилином.
3.2 Влияние ДМБА на клеточную плотность в культурах НФ и L
клеток.
3 . 2 . 1 Морфологические изменения в культурах.
В предварительных опытах был проверен эффект ДМБА в чистых
(однородных) культурах нормальных фибробластов и клеток L. В
чистых культурах НФ, инкубированных с ДМБА в концентрации 1
мкг/мл, количество НФ через 3 суток бьшо в 2-3 раза ниже, чем в
контрольных культурах, и их морфология заметно менялась. В чистых
культурах клеток L после инкубации в течение 3 суток с ДМБА
плотность клеток отличалась от контроля не более, чем на 10-20% и
клетки сохраняли свою исходную морфологию. Таким образом, эти
опыты подтвердили описаннь.е ранее сущеавенные различия между
24
НФ и L клетками в чувствительности к ДМБА (Андрианов и др.,
Медицина, Москва, 1971).
В контрольных смешанных культурах L клетки интенсивно
размножались как в той части культурь,, где они росли на моиослое
нормальных клеток, так и в той, где монослой НФ был предваритель­
но удален. Клетки L в таких культурах были легко отличими
морфологически от подлежащих нормальных клеток: они были менее
распластанными имели более темноокрашенную цитоплазму и более
узкие отростки
В смешанных культурах, инкубированнь,х в течение 3-5 суток с
ДМБА, потность L клеток, растущих на стекле, была такой же, как в
контрольных культурах. Напротив, в той части культуры, где L клетки
находились на монослое НФ, их количество резко уменьшалось и они
приобретали более вытянутую версгеновидную форму. Плотность
нормальных фиброблааов в таких культурах также уменьшалась и
форма их становилась более вытянутой При этом бьшо невозможно
надежно отдифференцировать НФ от L клеток по морфологическим
признакам Поэтому для количественного определения влияния ДМБА
на клеточную плотность в смешанной культуре бьши поставлены
опыты с предварительно меченными Н^-тимидином L клетками.
3 . 2 . 2 Опыты с предварительно меченными клетками L.
При размножении предварительно меченых L клеток, растущих на
стекле, их плотность увеличивалась за 3-5 суток в 3-4 раза. Тем не мене,
в таких культурах подавляющее большинство клеток оставалось
мечеными (82-95%). Следовательно, интенсивность предварительной
метки была достаточной для того, чтобы она обнаруживалась в
клетках после нескольких делений.
В смешанных культурах, инкубированньи 3-5 суток в присутствии
ДМБА, плотность меченых клеток L на монослое нормальных
фибробласгов была в 3-6 раз ниже, чем в контрольных смешанных
культурах, не инкубированных с ДМБА (табл. 4). Плотность
нормальных немеченых клеток под влиянием ДМБА снижалась в 2-2,5
раза. Количество L клеток в тон части стекла, где предварительно был
удален слой НФ, лишь незначительно отличалось от контрольных
культур. Таким образом, опыты с предварительно мечеными L
клетками подтвердили, что ДМБА резко уменьшает плотность клеток
L, растущих в непосредственном контакте с нормальными
фибробластами, и не влияет на L клетки, растущие на том же стекле, в
той же среде, но не имеющих такого контакта.
25
Таблица 4. Влияние ДМБА на плотность клеток в различных часггях
смешанной культуры.
№
опыта
Воздействие
Меченые L клепси
Немеченые
нормальные
клепси
2058±189
1057±152
на стекле
на слое НФ
533±76
Контроль
666±82
ДМБА,
484±67
228±21
72 час.
Контроль
4671±536
2
2978±166
2019±80
ДМБА,
3612±277
452±55
851+77
120 час.
Контроль
3
1687±84
2146±151
5787±239
ДМБА,
1977±66
330+21
3005+396
72 час.
Контроль
4
3040+422
3619±288
2802±419
ДМБА,
2570±481
905+234
1563±86
120 час.
Результать. представлены в виде среднего (из 3 повторностей) числа
к л 4 к Е 100 полях зрения микроскопа (7850 м к А и средней
квадратичной ошибки.
1
3.3 Влияние ДМБА на синтез ДНК в культурах НФ и L клеток
Целью этой серии опытов было выяснение вопроса о том, будет ли
ДМБА в смешаной культуре тормозить вхождение клеток L в фазу
стнтеза ДНК. Как уже говорилось, морфологически отличить
нормальные и L клетки возможно в контрольных смешанных
культурах, но не в культурах, обработанных ДМБА, поэтому в
последних определяли лишь суммарный ИМ для обоих типов клеток
(табл. 5). Так как контрольные культурь. нормальных клеток
находились уже в стационарной фазе и фиксировались через 3 суток
после смены среды, то ИМ в таких культурах был низким. Столь же
низким был ИМ фракции НФ в смешанной контрольной культуре.
Напротив, ИМ фракции клеток L в такой культуре был таким же
высоким, как и в изолированой культуре данного типа. Суммарный
индекс метки в смешанных культурах имел промежуточное значение.
Трех-суточная инкубация с ДМБА не влияла на клеточную плотность и
26
и м в чистых культурах клеток L. В культурах нормальных
фибробластсв под влиянием ДМБА, так же как в предыдущих опытах,
плотность клеток существенно снижалась, и без того низкий ИМ
снижался незнач1гтельно.
Таблица 5. Влияние ДМБА на синтез ДНК в чистых и смешанной
культурах НФ и L клеток.
~ ^ п
культуры
Количество клеток в одном
поле зрения
контроль
ДМБА
Чистые культуры:
НФ
13,5+0,7
6,1+0,2
Lклетки
4,2±0,4
6,3+0,6
Индекс метки (%)
контроль
ДМБА
2,4+0,2
53,0+1,2
1,6Ю,3
51,3+2,1
Смешанная культура:
суммарно
23,6+0,5
8,6+0,2
13,4+0,7
1,4+0,3
НФ
17,5+0,8
2,0±О,2
Lклетки
6,1±0,6
46,21Д,9
Индекс метки = процент меченых ядер от всех ннтерфазных ядер +
средняя квадратичная оип.бка. ИМ определяли при подсчете 500-2000
клеток в каждой культуре. Данные одного опыта.
Опыты с предварительно меченными L клетками, описанные выше,
показали, что в смешанных культурах, инкубированных 3 с^ок с
ДМБА, L клетки составляют значительную долю всей популяции (1/5 1/2 часть всех клеток). Если бы ИМ этих клеток оставался столь же
высоким, как ИМ клеток L в чистых культурах и в контрольных
смешанных культурах, то суммарный ИМ в смешанных культурах,
обработанных ДМБА, был бы значительно более высоким, чем в
чистых культурах НФ, обработанных ДМБА. В действительности в
смешанной культуре, подвергшейся действию ДМБА, суммарный ИМ
был столь же низкий, как ИМ в культуре нормальных фибробластов.
Следователыю, доля клеток L, синтезирующих ДНК, среди всей
популяции L клеток смешанной культуры, подвергшейся действию
ДМБА, была намного ниже, чем в контрольной смешанной культуре.
Иньши словами, ДМБА в смешанной культуре резко тормозил
вхождение клеток L в фазу синтеза ДНК.
27
3.4 Специфичность действия ДМБА на L клетки в смешанной культуре.
Что является токсическим фактором для L клеток: ДМБА и его
метаболить, или токсические продукты распада НФ? Для решения
этого вопроса мы растили L клетки на монослое НФ, предварительно
проинкубированных с ДМБА, но при отсутствии канцерогена в
культуральной среде. Для этого культуры НФ растили на покровных
стеклах, в часть культур (табл.6, группы 2 и 3) на 4-й день при смене
среды вносили 1 мкг/мл ДМБА и растили в присутствии канцерогена
еще 3 суток На 7-й день во всех культурах меняли среду на свежую без
ДМБА а на 8-й день во всех культурах удаляли половину слоя НФ и
высевали предварительно меченые Н -тимидином L клетки На 9-й
день в часть культур (группы 3 и 4) при смене среды вносили .1 мкг/мл
ДМБА; в группах 1 и 2 в это время меняли среду на свежую без ДМБА
Еще через 3 суток все культуры фиксировали и готовили
радиоавтографы описанным в M c r o Z e способом.
Таблица 6. Размножение L клеток на предварительно обработанном
ДМБА монослое нормальных фибробластов.
Воздействие
дни культивирования
1-3
4-6 7-8 9-11
Количество клеток на 100 полей
зрения
Меченые L клетки Немеченые
Группа
на стекле на слое нормальные
НФ
фибробласты
2146+151
1687+84
5788±239
+
2615+146
1970+95
978±108
+
+
2928±П7
930±110
575112
+
1977+66
330±2!
3005+396
+: в среду добавлен ДМБА, -: феда без ДМБА.
Как видно из таблицы, степень снижения плотности НФ одинакова
после первого и второго добавления в культуру ДМБА. Количество L
клеток, растущих на поверхности стекла, не обнаруживает
статистически значимых различий. Значительное снижение плотности
L клеток наблюдается только в группах 3 и 4, когда L клетки находятся
на монослое НФ в присутствии канцерогена, как в случае с
предварительным инкубированием НФ с ДМБА - группа 3 так и бш
него - группа 4 (Более слабый эффект в группе 3 по сравнению с 4
объясняется,
очевидно,
меньшим
количеством
подлежащих
28
нормальных клеток.) В то же время, количество L клеток, раегущих на
монослое НФ. предварительно проинкубированном с ДМБА, но в
отсутствии канцерогена (группа 2), не отличается от их количества на
интактном монослое НФ (группа 1).
Известно, что нормальные клетки, проинкубированные с
токсичными дозами ДМБА, продолжают гибнуть много дней после
удаления канцерогена из культуральной среды (Андрианов и др.,М.
Медицина, 1971). Однако мы видим, что мопослой таких
поврежденных и гибнущих НФ не токсичен для контактирующих с ним
L клеток, если в среде отсутствует канцероген Следовательно
токсическое действие ДМБА на L клетки растущие в контакте с Нф'
является специфическим действием канцерогена
3.5 Проницаемость межклеточных контактов.
Проницаемость межклеточных контактов между НФ и L клетками
была измерена как для неорганических ионов электрофизнолотическим методом с использованием двух внутриклеточных электродов (см.
2.1), так и для флуоресцентного красителя трипафлавина с мол.массой
214 методом внутриклеточной инъекции красителя (см. 4.1)
В культуре НФ 67% клеток демонстрируют наличие между ними
электрической связи (средний коэффициент связи равен 0,2). В культуре
L клеток только в одном случае из 24 измерений (4%) была
зарегистрирована электрическая связь с коэффициентом К=0,02. В
смешанной культуре в 40% случаев наблюдается затекание тока из L
клеток в НФ (К=0 2) Аналогичные результать. получены в опытах по
распространению ,красителя- в смешанных культурах перетекание
трипафлавина из L клеток 'в НФ наблюдалось в 9 случаях из 14
инъекций в то время как в чистой культуре L клеток только в 4
случаях из 26 инъекций краситель обнаруживался в соседних клетках
Таким образом, L клетки, демонстрирующие в чистой культуре
почти полное отсутствие проницаемых межклеточнь.х контактов,
способны
устанавливать
такие
контакть.
с
нормальными
фибробластами в условиях смешанной культуры
Полученные в этой серии экспериментов данные показывают, что
резистентные к действию полициклических углеводородов клетки L
становятся чувствительными к токсичесому действию ДМБА в том
случае, если они выращиваются в контакте с чувствительньши
нормальными фибробластами. Токсическое действие ДМБА в таких
смешанных культурах проявляется в уменьшении плотности клеток L,
29
в резком снижении доли клеток, синтезирующих ДНК, среди клеток,
остающихся в культуре, в изменении морфологии L клеток. Эти
изменения идентичны характерным проявлениям действия ДМБА и
других
полициклических
углеводородов
на
чувствительные
нормальные фибробласты. Степень выраженности этих изменений у L
клеток оказывается такой же, или даже несколько большей, чем у НФ.
Токсические продукты распада предварительно проинкубированных с
ДМБА нормальных фибробластов не оказывают на L клепсн
подобного действия. Наиболее существенным является то
обстоятельство, что L клетки, растущие в той же культуре, но на
чистом стею1е, остаются резистентными к действию ДМБА
Следовательно изменение чувствительности L клеток к ДМБА
является строго локальным эффектом т е для его проявления
необходим непосредственный контакт нормальных и неопластических
клеток Кроме того между Ю1етками L и НФ устанавливаются
проницаемые контакты*
Все эти данные делают наиболее вероятным предположение, что
изменение чувствительности L клеток к токсическому действию ДМБА
в смешанной культуре обусловлено тем, что токсичные продукты
метаболизма этого канцерогена, образующиеся в нормальных клетках,
передаются через межклеточные контакты непосредственно в L клетки.
Это явление весьма сходно с явлением метаболической кооперации
контактирующих клеток. Особенность нашей экспериментальной
системы состоит в том, что межклеточная кооперация приводит здесь к
патологическому результату к повреждению и гибели клеток L
Возможно что такая "летальная кооперация" с окружающими
нормальными клетками может существенно изменять чувствительность
неопластических клеток к различным токсическим воздействиям in
vivo
Таким образом, эти опыты демонстрируют существенное изменение
("нормализацию") фенотипа опухолевых клеток при их локальном
взаимодействии с нормальными клежами в культуре. Вовлеченность
проницаемых межклеточных контактов в супрессию роста
неопластических юхеток и проявления трансформированного фенотипа
(как in vitro так и in vivo) т е возможность фенотипичес-кого
исправления генетических деффектов показана в ряде недавних работ
(см обзор Yamasaki Carcinogenesis 1990 11:1051-1058)
В связи с этим возникает не менее, интересный вопрос: реализуется ли
подобный механизм регуляции клеточного фенотипа в реальных
30
физиологических процессах, при функционировании нормальных
дифференцированиь.х тканей? Для изучения такой возможности мы
исследовали роль межклеточнь.х взаимодействий в регуляции синтеза
раково-эмбрнонального белка альфа-фетопротениа в паренхиматоз­
ных клетках печени - гепатоцитах.
Однако прежде изложения этих результатов рассмотрим де!1етвие
некоторых физических н химических факторов на межклеточную связь.
31
4.
ФАКТОРЫ,
МОДУЛИРУЮЩИЕ
МЕЖКЛЕТОЧНЫХ КОНТАКТОВ
ПРОНИЦАЕМОСТЬ
4.1 Материалы иметоды
Объекты исследования. В опытах с индукцией межклеточной связи в
культурах эпителиальных клеток использовались три установившихся
клеточных линии: FBT из трахеи быка (Machtakova et al.. Folia Biol.,
1975, 21:117-121), МПТР из почки мыши, трансформированные
вирусом ОВ-40 (получены в ОНЦ РАМН) и СПЭВ из почки эмбрионов
свиньи (любезно предоставлены И.И.Воробьевым). Клетки этих линий
культивировали в среде содержащей 45% среды Игла, 45% 0,5%
гидролизата лактальбумина и 10% сыворотки крупного рогатого
скота Для определения жизнеспособносгги клеток использовали метод
окраски родамином 123 ("Sigma" США) - 10 мкг/мл 10 мин как это
описано в работе (Jonsonetal Pros Na Acad Sci U S А 1980 77-990994)
, •
Опь.ты по исследованию действия арахидоновой кислоты (АК) на
межклеточные контакти проводили на культурах фибробластоидных
клеток опухолевого происхождения (рак молочной железы крысы)
линии BICR/MIRk (Rajevsky et al., Eur. J. Immunol., 1972, 2: 445-447).
Клетки культивировали в COi -инкубаторе в модифицированной по
Дальбекко среде Игла ("Biochrom КБ" Германия), с 37 г/л
бикарбоната натрия и10% неонатальной телячей сыворотки крови
("Biochrom КБ" Германия) АК ("Sigma" США) растворяли в
физиологическом растворе с фосфатным буфером с кальцием и
магнием (PBS++) или в растворе Хенкса путем озвучивания в
ультразвуковой ванне Bransonic ("Branson" Франция) в течение 2 мин
Маточнь,й раствор АК (10 мМ в гексане) хранили при -18^ С Перед
озвучиванием растворитель высушивали в потоке азота Альбумин
свободный от жирных кислот ("Sima") растворяли в PBS++ в
концентоации 1 мг/мл Состав PBS++ в мМ 137 NaCl; 2 7 КС1; 6 5
N a 2 H P ? 15 КН2РО4'0 5 MgCh О 8 MgSOT'O 9 CaClj' pH=7 4
32
Определение уровня межклеточной связи осуществлялось- методом
внутриклеточных инъекций непроникающих через наружную
мембрану флуоресцентных красителей с последующей регистрацией
распросфанения метки в окружающих клспсах (метод dye coupling).
Микропипетки, изготовленные из стеклянных капиляров ("WPI",
США) на горизонтальной микрокузнице PN-3 ("Narishige", Япония)
заполняли 4% раствором Люциферового желтого СН ("Sigma") в
дистиллированной воде или 0,1 М раствором флуоресцината натрия
("Merck" Германия) в О 1 М KCL Микроинъекцию производили при
помощи механического микроманипулятора ("ЭЗНП НТО АН СССР"
Черноголовка) под водноиммерсионным фазовым объективом 40х'
ионофорезом гиперполяризующими импульсами тока (-20-30 нА 200
мс I имп/с),отзлектросгнмулятораЭС-50-1 (СССР) Длителыюсть
инъекции - 30 с Использовали люминнсцентный микроскоп ЛЮМАМИ2 ("ЛОМО" СССР) с автоматической микрофотонасадкой (МФНЭ-1
"ЛОМО") в, режиме й)азово-контрастной и эпифлуоресцснтной
микроскопии Источники света - лампа накаливания ОП12-100 (12В
100 Вт) и .ртутно-кварцевая лампа ДРШ-250-3 Использовался
стандартный L L светофильтров возбуждения: БС 8 3 СС 15 2 и
m
Т п о л о с Г З п у с Г н и Г 3?0 460 Z
а также УфЬ 6 (полоса
ппопускя,шГзОоТ90 , ш Г и ZZl^^Ll»^^,rZl^
408 нм
TeMnenatTv в световом пятГе иГепя™ Г и к Т т е п 1 , ™ ^ " Л О М ( ^ ' ^
я Г,ГпетЛяето^пго ппхГка ^ ^ т Г п о Г Опь^тГ!^п1олил^
L ™ o ^
ZHHLHU
тГмГпТт^е
П 1 Р ™ Я ,
уГо^нГме^^™
. о и Г . Р е т Г v^^^^^
распространился через 2 минуты после инъекции.
Измерение внутриклеточного рН проводили микрофлуориметрическим методом, при помощи рН-чувствительного флуоресцентного
красителя ацетоксиметилового эфира 2',7'-бис(2-карбоксиэтил)-5(6)карбоксифлуоресцеина ("Molecular Probes", США) используя метод,
описанный в работе (Paradisoetal. Ргос Natl. Acad Sci USA, 1984 81:
7436)
Испльзовался
фотомикроскоп
("Zeiss"
Германия)
оборудованный фотометрической приставкой ФМЕЛ-2("ЛОМО")
Внутриклеточную концентрацию кальция определяли методом
поточной флуориметрии (Kachel Clinical Cytometry 1986 468:28-44;
Valet et al NaUirwissenschaften ,1985 72: 600-602) с использованием
Са2+-чувствительного индикатора lNDO-1 ("Molecular Probes" США)
Измерения проводили в поточном флуориметт,е FACS Analyser
("Beckton-Dickinson", Германия), соединенном с компьютером Hewlett
33
Packard. Концентрацию кальция измеряли у 10 000 клеток в
контрольных условиях, у 20 000 клеток в присутствии АК и у 10 000
клеток при добавлении альбумина.
Для сканирующей электронной микроскопии препараты клеток
фиксировали 2%-ным глутаровым альдегидом ("Merck") в фосфатном
буферном растворе, рН 7,4, обезжиривали с помощью ацетона в
возрастающих концентрациях и высушивали в критической точке С02.
Наблюдение проводили на сканирующем электронном микроскопе
("Hitachi" S-405A, Япония).
4.2 Индукция межклеточной связи в культуре эпителиальных клеток.
Как уже упоминалось, проницаемость межклеточных контактов для
более крупных соединений, чем ионы, ответственные за явление
электрической связи, определяется методом внутриклеточных
инъекций непроникающих через наружную мембрану флуоресцентнь.х
красителей с последующей регистрацией распространения метки в
окружающих клетках (метод dye coupling). Мы обнаружили что само
наблюдение за клетками в режиме флуоресцентной микроскопии
может индуцировать возникновение межклеточной диффузионной
связи в культуре исходно не связанных эпителиальных клеток
Появлению проницаемых контактов предшествуют характерные
морфологические изменения
Клетки трех исследованных эпителиальных клеточных линий (FBT,
МПТР и СПЭВ - см. 4.1) образуют пласты с хорошо видимыми при
фазово-контрастной
микроскопии
светлыми
межклеточными
границами. При инъекции Люцифера желтого или флуоресцината
натрия в одну из клеток, краситель не обнаруживался в соседних
клетках по крайней мере в течении 1 часа, при условии, что контроль
за введением и распространением красите;^ проводился при очень
коротком (5-10 сек) освещении ртутно-кварцевой лампой ДРШ-250-3
(рис 4 а Ь)
Однако, если наблюдение за клетками в режиме флуоресцентной
микроскопии в процессе инъекции красителя продолжалось 1-5 минут,
то через 10-60 минут происходили существенные изменения
морфологии ю1еток, экспонированных в поле зрения микроскопа.
Межклеточные границь, уплотнялись и становились черными при
фазово-контрастном изображении, резко вьщелялись ядра клеток, вся
клеточная поверхность наблюдалась в одной фокальной плоскости.
34
Рис. 4. Морфология и распространение красителя Люциферового
желтого в культуре эпителиальных клеток FBT. (а), (h) - контрольные
клетки; (с), (d) - клетки через 20 MHHVT после 2 минут воздействия света
с длиной волны 300-390 нм и мощностью 290 мВт/см^, (аЦс) - фазовоконтрастная микроскопия и (Ь), {ф- флуоресцентная микроскопия тех
же полей зрения. Бар-10 мкм
Размер морфологически измененного участка клеточного пласта
строго соответствовал размеру освещенной области монослоя. При
инъекции красителя в любую клетку этого участка через 2 минуть,
35
окрашивались все окружающие клетки, а нередко и контактирующие с
ними клетки второго кольца (рис, 4 с, d). При этом наружная
клеточная мембрана оставалась непроницаемой для Люцифера
желтого: если электрод прикасался к клеше, но не был введен внуть
нее, поступающая из электрода краска не окрашивала ни эту, ни
соседние клетки, т.е. распрооранение красителя могло происходить
только через межклеточные контакты. За пределами морфологически
измененной области все клепси оставались несвязанными.
Определение характеристик эффективной засветки показало, что при
использовании
стандартного
набора
светофильтров
(полоса
пропускания 380-460 ни) мощность излучения, измеренная в фокальной
плоскости микроскопа, равна 100-380 мВт/см^ для объективов 10х и 40х
соответственно. При использовании стеклянного светофильтра УФС-6
(полоса пропускания 300-390 нм, мощность - 300 мВт при объективе
40х) требовалось более короткое время экспозиции для возникновения
морфологических изменений в клеточном монослое
Освещение препарата светом данной волнь. более 490 нм в течение 15
ишгут не приводило к изменению морфологии и межклеточной связи в
последующие 2,5 часа наблюдения, а 30' минутное подобное
воздействие вызывало гибель клеток.
Несмотря на значительнь.е морфологические изменения, клетки не
казались поврежденными: они оставались прикрепленными к
субстрату до 25 суток после облучения; через 1-7 суток (в разных
опытах) "черные" границы между клетками исчезали, и хотя клетки не
двигались, они могли образовывать небольшие ламеллы. Потенциал
митохондрий в клетках облученных областей не изменялся по
сравнению с контрольными окружающими клетками что было
показано при окраске родамином 123 накапливаемым,в митохон­
дриях по градиенту потенциала Более детальное исследование
морфологического эффекта было проведено с использованием
сканирующей и трансмиссионной микроскопии (последняя выполнена
Е С Снегиревской в Институте цитологии АН СССР) Было найдено
что. основными ультраегруктурными изменениями в облученных
клетках является значительное снижение количества ворсинок на
апикальной поверхности вьшавнивание складчатости латеральных
клеточных мембран локальные сужения межклеточных шелей В
H c L o P b х случаях обнапГивались СТРУКТУРЫ сходные со С^УКТУРОЙ
USTBOTO к о Т а к т Г ^ л ю ^ ^ ^ ^ ^
36
большинства клеточных органелл: митохондрий, эидо-плазматическогоретикулума,ядер.
Межкжгточные контакты в облученных областях становились более
резистентными к механическим воздействиям, что видно по характеру
разрывов, возникающих иногда при приготовлении препаратов для
сканирующей микроскопии. В контрольных образцах разрывы,
проходящие вдоль клеточных контактов, разделяли плазматические
мембраны соседних клеток в то время как в облученных областях
мембраны двух соседних клеток оставались сцепленными (подобно
замку "молнии") а разрыв проходил по цитоплазме вдоль клеточной
границы
Набухание облученных клеток позволяло предположить в качестве
причины описанного эффекта нарушение осмотического равновесия.
Действительно, при уменьшении тоничности культуральной средь, в 2
раза происходило набухание клеток и возникала морфологическая
картина сближения клеточных границ, сходная с описанной для
облученных клеток. Однако эта изменения были кратковременными и
не приводили к возникновению межклеточной диффузионной связи
Другим действующим фактором могло бы быть локальное
нагревание клеток в поле зрения микроскопа при освещении от ртутнокварцевой лампы. Однако измфение в световом пчтне в фокальной
плоскости микроскопа показали, что температура сохраняется
стабильной (+ 0,1 о С). Более того, нагревание клеток до 45^ С в
течение 10 минут не индуцировало морфологических изменений.
Для различных клеточных систем показано соответствие между
эффективностью межклеточной связи и вн>ариклеточным рН:
закисление цитоплазмы приводит к подавлению межклеточной связи
(см. обзор: Bennet et al.. In "Gap Junctions", Eds: Hertzberg E.L
Johnson R.C.,N.Y.:AlanRLiss Inc 1988 p 287-304) При сравнении
величин внутриклеточного рН интактных,иоблученнь.х клеток FBT
мы обнаружили что в связанных благодаря облучению клетках
происходит заще^тачивание цитоплазмь, примерно на 0 4 единицы рН
(от 6 4-6 6 до 6 8-7 0 соответственно) которое может способствовать
возникновению межклеточной связи
Сводится ли действие облучения только к установлению между
клеточными мембранами устойчивого во времени тесного контакта,
при котором в области сблизившихся мембран латерально
диффундирующие
полуканалы
могут
формировать
полные
кониексины, или действие света опосредованно какими-то
37
дополнительными эффектами, например, индукцией перекиснош
окисления липидов? Эти вопросы требуют дальнейшего изучения.
Существенный вьшод из полученных зксперима.тальнь.й данных
состоит в том, что мониторинг межк;1почных контактов методом dye
coupling с использованием люминисцеитного микроскопа в некоторых
случаях может индуцировать перетекание красителя в исходно
несвязанных клетках. Следовательно, во избежании возможных
артефактов, при использовании этой техники для анализа
проницаемых межклеточных контактов требуется соответствующий
контро.т,ь за клеточной морфологией.
4.3 Действие арахидоновой кислоты на проводимость межклеточнь.х
к-оитак-тоB.
Арахидоновая кислота (АК) является важным компонентом
клеточных мембран, так как она входит в состав ряда фосфолипидов
(фосфагидилхолин,
фосфатиднлииозит,
фосфатиднлэтаноламин),
участвующих в передаче сигн^гла с клеточной поверхности в
цитогшазму Связывание многих лигандов на клеточной поверхности
приводит к активации фосфолипаз которые либо непосредственно
высвобождают
АК
либо
гидролизуют
фосфолипид
до
диацилглицерина и АК высвобождается уже в процессе метаболизма
последнего С другой стороны недавно было показано что АК
вызывает угнетение проницаемости межклеточных контактов (Giaume
etal PnugersArch 1989:413 273-279) Положение АК на пересечении
важнейших путей клеточного метаболизма ее участие в сигнальных
к',скадах внутшклеточных реакции и активность АК в отношении
м'Гжктеточпь^ коь,тактов позволяет гшедположить что АК может
бь,ть'о^ппм из энлогеннь>х физиологических регуляторов контактной
гфонинаёмости
Совместно с кафедрой биофизики Штутгартского Университета
(Германия) мы исследовали, эффект АК на проницаемые контакть, в
культуре фибробластоидных клеток опухолевого происхождения (рак
молочной железы крысы) линии BICR/MIR^ и возможное участвие
вторичных мессенджеров (Н+ и Са2+) модулирующих проницаемость
межклеточных каналов в механизме действия АК
Параллельные измерения межклеточного перетекания красителя
люциферового желтого и внутриклеточного рН (pHJ показали, что
через 30 минут инкубации клеток в присутствии ШО мкМ АК
происходит полное блокирование межклеточной связи и небольшое, но
38
статистически достоверное снижение рН^- от ~ 7,2 в контроле до ~ 7,0
после обрабо-пси АК (рис. 51,11. III). Последующая инкубация клеток в
среде с сывороткой в течение 30 мин. вызывала восстановление
межклеточной связи и увеличение рН выше контрольного уровня (рис
5 IV).
Для определения рН-чувствительности ме=кклеточной диффузионной
связи в культуре BICR/MIR бьша проведена серия экспериментов, в
которь.х снижение внутриклсгочнош рН достигалось путем обработай
клеток физиологическим раствором, закисленным до рН = 6,5 с
помощью MES. Инкубация клеток в таком растворе в течение 30 мин.
приводила к такому же снижению рН , что н обработка АК. Однако
проницаемость межклеточных контактов для люциферового желтого
приэтомнеизменяется(рис5УУ1)
а 1
J
..
J.
й
Ш
S
Рис. 5. Действие АК на внутриклеточный рН (рН^) и межклеточную
диффузионную связь в культуре клеток линии В1СШМЖк. Ось
ординат: слева - рНд, справа - N • среднее (из 8-10 инъекций) число
окрашенных соседних клеток через 2 мин. после инъекции красителя в
одну из клеток монослоя. I - контроль в растворе Хенкса с рН 7,4; II и
III - АК (100 мкМ в растворе Хенкса) вызывает небольшое снижение
рН и угнетает межклеточную диффузию красителя (II - через 15 мин. и
III - через 30 мин. от начала инкубации); IV - отмывка средой Дульбеко
с 10% эмбриональной телячьей сыворотки; V - контроль в растворе
Рингера с рН 7,2; VI - раствор Рингера с рН=6,5 через 30 мин. от
начала инкубации вызывает тот же сдвиг pH^ что и АК (II и III), но не
влияет на межклеточную передачу красителя
Для измерения концентрации внутриклеточного кальция ([Са2+]в) с
помощью метода поточной флуориметрии клетки сначала переводили
39
в суспензию, и затем измеряли [Са2+], до обработки АК, в присутствии
100 мкМ АК и при отмывки средой с добавлением 1 мг/мл альбумина.
В контроле [Cа2+]е составляла в среднем 80 нМ, через 2-3 мин. после
добавления АК происходило повышение [Са^^]в до 100-200 нМ и
восстанавливление до контрольного уровня в растворе с альбумином.
Таким образом, проведенные нами измерения показали, что
арахидоновая
кислота
обратимо
блокирует
межклеточную
диффузионную связь, и что этот эффект сопровождается небольшим
(на 0,1-0,2 единицы рН) снижением внутриклеточного рН и
незначт,тельньш
увеличением концентрации
внутриклеточного
кальция. Однако такой же сдвиг рН„ вызванный инкубацией клеток в
физиологическом растворе с рН - 6,5 не влиял на межклеточную
связь Вместе с тем, и обнаруженного нами повышения концентрации
свободного Са2+ в цитоплазме недостаточно для разобщения клеток
т к для полной блокады межклеточных контактов требуется
увеличение [Cа2+1„ до сотен мкМ (Spray et al Ртос Nat Acad Sci USA
1982 79-441-445 Основываясь на полученных данных. можно
полагать' что АК действует непосредсгвенно на контактную мембрану
ПРиВОДЯ к ее реорганизации и в результате к блокированию контактов
Мы не мож-м исключить что какие-то иные факторы опосредуют
действие АК \ а контактную проницаемость Однако в пользу
высказанного предположения свидетельствуют такие факты как
увеличение содержания АК в клеточных мембранах при обработке
клеток экзогенной АК кислотой Ю Zemoel неопубликованные
л Г н JeV о б т т 1 о ^ э 1 е Г а АТпосле
™
б^Гсвяз!™
„ме™Г
и н^кяГГГемТпанГсГпее по J v n l T v ^ ТУПЯ Г к я L кякие^о её
м ^ Г Г „ ^ ! л V ^ ^ R Z H T O отм^^^
7 Z
чт^ nnvr^P Г.шные
п р и м е р н о в тех ж е КОНЦсНтраЦИЯлу ч т о и /\Iv.
Поскольку свободная АК появляется в клеточных мембранах в
процессе регуляции функций клетки, то независимо от правильности
высказанной гипотезы о механизме действия АК, можно полагать, что
АК является одним из эндоге.н.ых физиологических регуляторов
межклеточных контактов
40
5. РЕГУЛЯЦИЯ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ КОНТАКТОВ В КУЛЬТУРАХ
ОПУХОЛЕВЫХ
КЛЕТОК,
ТРАНСФИЦИРОВАННЫХ
ГЕНАМИ
КОННЕКСИНОВ
Одной из перспею-нвных экспериментальных моделей, широко
используемых в настоящее время для исследования структуры и
функции межклеточных диффузионных контактов, являются культуры
клеток, трансфицированных генами различных коннексинов. Как уже
упоминалось, коннексины (Сх) - белки, формирующие каналы щелевых
контактов
(ЩК),
морфологическую
основу
межклеточной
диффузионной связи. Такой методический подход создает возможность
провести более детальный анализ влияния межклеточных контактов
сформированных из конкретных исходно заданных коннексинов на
различные клеточные функции ,Так в работе группы Дмасаки из
Международного агентства .то изучению рака в Лионе (Ivtenil et al
Cancer research 1995 55- 629-639) показано что трансфекция
деффектных по ЩК опухолевых клеток человека линии HeLa геном
коннексина Сх2б (но не Сх40 или Сх43) приводит к восстановлению
негативного контроля роста: клетки полученнь.х клонов утрачивают
опухолеродность ПРИ прививке мышам бестимусной линии и
показывают существенное замедление СКОРОСТИ роста в мягком агаре
нГсоГне^т^ с Г л и т е Г с к и 1 Т ^ ^ ^ ^
П Р ^ ЭТОМ устойчивая
м е Х З н а я связь MyecounTn^ Л ™ И П У Г С Я во всех этих
™ а Т ф ^ ц ™ а н Г х к л е т о ч н ь ^ линиях
Мы провели на кафедре биофизики Штутгартского Университета
(Германия) сравтштельное исследование диффузионной межклеточной
связи в культурах клеток HeLa, трансфицированных генами
коннексинов Сх32 и Сх26, и некоторых возможных механизмов ее
физиологической регуляции в этих клонированных клеточных линиях.
5.1 Материалы и методы;
Культура клеток HeLa. Клетки HeLa (эпителноидные клетки
карциномы человека) были трансфицированы генами Сх26 и Сх32 в
41
лоборатории проф. К. Виллеке доктором К. Эльфганг (Бонский
университет,
лаборатория
генетики,
Германия).
Клетки
культивировали при 37^ С в атмосфере 8 % COz в среде ДМЕМ в
присутствии 10% эмбриональной сыворотки телят и 0,5 мкг/мл
пуромицина ("Sigma", США). Для проведения опытов клетки растили в
60 мм пластиковых чашках Петри в среде без пуромицина.
Растворы. Измерения межклеточной связи проводили при комнатной
температуре в стандартном физиологическом растворе с кальцием и
магнием и фосфатным буфером (PBS^+). Состав РВ8+-ь в мМ: ВО
NaCl; 5 КС1; 0,5 MgClr, 0,9 CaCla; 8 Na2HP04; 1,5 KH2PO4; рН 7,4.
Использовались также растворы PBS-^+ с рН 5,5 и 6,0 которые
получали, меняя соотношение количеств КН2РО4 и Na2HP04 в
стандартном PBS++ (Wissenschaftliche Tabdlen Geigy 1979 р: 61-62)
При исследовании эффектов СО, использовали физиологический
раствор с бикарбонатньш буфером состав основных солей тот же что
и в PES++) с различными концентрациями NaHCOз (см таблиц; 7 в
тексте) В этих опыгах через камеру для измерения межклеточной связи
при помощи перистальтического насоса осуществлялся проток
раствора обогащенного СО, а рН измерялся в режиме непрерывной
регистрации цифровым РН-МШ>ОМ негюсоедственно в вытекающем из
рабочей камеры растворе
^
^ "^
Эффективность межклеточной диффузионной связи определяли
методом dye coupling (см. раздел 4.1), используя Люциферовый желтый
СН ("Sigma", США).
Плотность клеток определяли в тех же культуральных чашках Петри,
в которых проводили измерение межклеточной связи. Клетки
суспензировали и подсчитывали их количество на автоматическом
проточном счетчике ("Coulter electronics LTD. LUTON", Англия).
5.2 Зависимость уровня межоеточной связи от клеточной плотности в
культурах клеток HeLa Сх32 и HeLa 0x26.
В отличие от родительских нетрансфицированных клеток HeLa, у
трансфектантов на криосколах обнаруживаются
характерные
структуры щелевых контактов, которые иногда сопровождаются
плотными контактами. Иммуноцитохимическое окрашивание клеток
HeLa Сх32 антителами к коннексину Сх32 выявляет крупнь.е
иммунореактивнь.е пятна в областях межклеточных контактов, причем
характер окрашивания одинаков в монослоях с низкой (20 000 кл/см2 )
и среден (100 000 клУсм2) плотностью клеток.
42
в М01ЮСЛОЙНЫХ культурах клеток HeLa Сх32 с различной исходной
плотностью (19 000, 9 500, 4 600 кл/см^ при посеве) мы тестировали
межклеточную диффузионную связь в течение 4 дней культивирования
без смены культуральной среды. В первые 3 суток повышение уровня
связи происходило во всех трех вариантах культур (рис. 6).
40
30
20
3
}
Ч
/
\ / > '
..ДС
'
'\/\
\
3
И
:'
4
Рис. 6. Динамика величины
диффузионной связ., в процессе культивирования. Культуры с различной нсходной
плотностью:1-плотность при
посеве- 1 9 0 0 0 к л / с м ^ , 2 и 3 соответственно 1/2 и 1/4 от
плотности 1. По оси абсцисс:
продолжительность
культи­
вирования, сутки; по оси
ординат: среднее (из 7-10
инъекций) количество окрапгенных соседних клеток за
инъекцию (N).
Рис. 7. Зависимость эффективности межклеточной диффузии красителя
Люцнферового желтого от локальной клеточной плотности в культуре
клеток HeLa-Cx32. Фазопо-контрастные (а, б) и соответствующие им
флуоресцентные (6, г) микрофотографии.
43
Максимальные средние значения степени связи (25-33 окрашенных
соседних клеток за одну инъекцию) регистрировалось при достижении
клеточной плотности, равной 100 000-200 000 кл/см^. Однако при
средней плотности в 200 000 клУсм^ наблюдалась значительная
морфологическая неоднородность в пределах одной культуральной
чашки Псфи. В то время как одни участки культуры представляли
собой монослой распластанных клеток (рис 7 а 6) в других ее
областях образовывался монослой плотно упакованных сжатых
клеток линейный размер которых в фокальной плоскости бьш
существенно снижен Раздельное измерение межклеточной связи в
таких морфологически разнородных участках показало что в плотном
монослое уровень связи примерно в 2 раза ниже чем в монослое
распластаньГых клеток (18±3 и 40±4 соответственно) Дальнейшее
увеличение локальной плотности приводило к полной потере обмена
Люциферовым желтым (рис 7 в г) Такая же практически полная
потеря связи наблюдалась в культурах клеток этого клона со средней
плотностью превышающей 400 о Х л / с м 2 Необходимо подчеркнуть
что наблюдаемое снижение связи коррелировало именно с увеличением
клеточной плотности и различиями в МОРЛОЛОГИИ клеток а не со
сроками культивирования на 4 l^^ки в к ™ е с низкой начальной
плотно^ю М 600 ^ с м г Л е г и ^ ^ ^ ^ ^
знГчениТвашчины ^AZL
ОННО7СВЯЗИ В ТО воемя К!^ В к1л1тч^е с
нигокой ™ ь н о й ™ о Г Г п 9 000 Г л ^ Г Г ж к л ^ о ч н а я З з ь
Г о ч т и п о л н о Г ь ю ^ ™ ^ ? я L c 6)
межклеточная
Аналогичные изменения электрической проводимости контактных
мембран в этих культурах были обнаружены в параллельных опытах
(на клетках из тех же культуральных чашек Петри), проведенных
А.Я.Дуниной-Барковской.
Таким образом, в культуре клеток H e U Сх32 уровень межклеточной
связи существенно зависил от клеточной плотности. Какой механизм.
лежит в основе этой зависимости? Является ли изменение клеточной:
морфологии непосредственной причиной изменения степени связи
(например, за счет различной площади контактных мембран,
пересфойки цитоскелета и т.д.) т1ли основную роль играют какие-то
иные факторы, например меняющийся состав культуральной средь.-? :
График на рис. 8 а демонсфирует изменение диффузионной связи и
рН культуральной среды при увеличени клеточной плотности в
монослое клеток субклона HeLa Сх32 HG-2, а на рис. 8 б - для
культуры клеток HeLa Сх26. Картина зависимости межклеточной
44
связи от клеточной плотности идентична как для обоих клонов
трансфектантов HeLa Сх32, так и для линии HeLa Сх26. Некоторым
отличием субклона HeLa Сх32 HG-2 от исходных клеток является то,
что максимальные и минимальные значения межклеточной связи
регистрируются здесь при более низких значениях величины клеточной
плотности, чем в исходном клоне (около 100 000 кл/см2 и около 200
000кл/см2 соответственно). Существенно отметить, что в культуре
HeLa Сх26 скорость клеточного роста была ниже, чем в культуре HeLa
Сх32 HG-2, и клетки не достигали плотности более высокой чем 150
000 кл/см2- Затем часть клеток погибала и плотность их снижаелась
при дальнейшем культивировании Этот результат согласуется с
данными приведенными в цитированной выше работе группы
Ямасаки.,
рн
Рис. 8. Динамика клеточ35
' -7,6' ной плотности, рН и меж­
30
клеточной
диффузионной
7.4
25
связи в течение 4 5 суток
7,2
культивирования: а - в
20
культуре HeLa CX32HG-2; 6
15
7
- в культуре HeLa Сх26. Я«
10
6,8
осиаМисс: верхняя шкала5
клеточная
плотность.
I
6,6
нижняя
время
культивиро37000
66000
176000
215000 1сл/см2
, , „ , г^ш^^^;по оси ординат: сп^ш
'
среднее
количество
окрашенных
соседних
рн
7,6 клеток за инъекцию (N),
справа - рН. Столбики 7.4 степень связи (N); ломатя
линия - рН культуральной
^2 среды.
6,8
аООО
60000
1С8000 149000
6,6
1Ша^аЛ
Как видно из графиков, рН культуральной среды снижался
параллельно возрастанию плотности культуры также для обеих
клеточных линий. Так как для многих клеточных систем показана рНзависимость межклеточных контактов, т.е. подавление контактной
проводимости при внутриклеточном закислении (наример. Spray et al.,
45
J.Cell Biol., 1986, 103:135-144), то можно полагать, что обнаруженная
зависшость межкл^очной связи от клеточной плотности является
результатом закнсления культуральиой среды.
Действительно, при смене культура1ьной средь, на свежую (3 раза в
течение 4 дней культивирования) культура клеток HeLa Сх32 HG-2
достигала на 4 сутки плотности 450 000 кл/см2 и при этом сохраняла
высокий уровень межклеточной связи и рН = 6,9, что косвенно
подтверждает высказанное выше предположение (рис. 9).
рН
т7.4
30
,_^:._.^,^
25 •
20
7,2
I
ч
Г"
•
15
.^
6,8
10
i
-5
^.
39000
1
100000
6.6
U=
=20^00.П...2
j _
_1
7
190000
3
4
^^F^4
Рис. 9 Влияние смены среды
на клеточную плотность, J H и
межклеточную связь в культу­
ре клеток HeLa Сх32 HG-2: аконтроль без смены средь, в
течении всего срока культивирования; б -Техкратная сме­
на среды (на ^ о р ы е трегьи и
ч ^ в е р ™ е % Г ) По осям
то
- " ^ ^ и р и Г з
Столбики
-
степень свя и ШУ
ZaL
—
рН
культуральной
ср^ды
культуральной
30
25
7,2
20
7
-•
15
6,8
10
6,6
5
П
L
зэооо
100000
240000
1
2
3
6,4
450000 т\см2
4
сутки
Однако, при замене культуральной среды на PBS++, рН которого
был доведен с помощью 10 мМ фосфатного буфера до 6,2 - 6,0 - 5,6, мы
не обнаружили угнетения контактной проницаемости и, более того,
при замене среды в трех-суточной культуре на раствор с рН = 5,6
обнаружилось существенное увеличение уровня межклеточной связи
(см.рисЮиП)
46
рн
7,4
''
4S
40
7,2
35
30
7
25
20
10
6,9
•""
6,6
Рис. 10 Замена культуральнон
среды на растворы PBS++ с
различными рН в культуре
HeLa Сх32 HG-2. Ось абсцисс:
верхняя шкала - возраст куль­
тур (в супсах), в которых про­
изведена смена средь, нишшя
шка^а
в е л и ч и ^ ^ Н в пас^
твошх P"Scb
ординат-
^ева - среднее к о л и ч ™ о
Гкрашенньи ТседнихТл^-ок
рН=6,2
рН=6,0
рН=5 6
за инъекГю (N) с п р а в а ^ Н
Светлые столбики - уровень межклеточной связи (N) в контроле!
6,4
0
заштрихованше е - врстворах PBS"+. Ломаная ялиш, - величины ыН в
культуральнон среде перед ее заменой на PBS++. До момента
измерения связи клетки инкубировались в растворах PBS++ по 5 - 6
часов в термостате.
Рис.
11. Замена культураль­
нон среды на растворы PB+++
с различными рН.
1-культура
HeLa Сх32 HG-2; 2 - HeLa
Сх2б. По оси абсцисс: рН
2
использованных растворов; по
2 0,5
оси
ординат:
отношение
среднего количества окрашен­
ных соседних клеток за 1
5.5
инъекцию в эксперименталь­
ных чашках Петри (Ыэк) к
рн
ЭТОМУ же показатешо в кон­
троле (NKOH). Использовались односуточные культуры. Измерение
связи проводили без предварительной инкубации клеток в указанных
растворах.
1,5 т
Следовательно, повышение в культуральной среде концентрации Н "
ионов само по себе не подавляет проницаемость контактов. Легко
предположить, что в культуральной среде накапливаются какие-то
факторы кислой природы, продуцируемые самими клетками в процессе
их жизнедеят^ьности, которые и ингибируют межклеточную связь. В
таком едучае эффект увеличения связи в трех-сутсчной культуре при
замене среды на физиологический раствор с фосфатным буфером (рН
= 5,6) объясняется отсутствием в нем этих веществ.
47
Наиболее очевидным претендентом на роль такого фактора является
СОг или другие слабые органические кислоты, которые, как известно,
являются модуляторами межклеточной связи (Turin 1., Warner А.Е.,
J.Physiol., 1980, 300:489-504). Предпологаемый механизм их действия
состоит в том, что в недиссоциированном виде эти молекулы легко
проникают внутрь клетки, где их диссоциация вызывает снижение
внутриклеточного рН (рН^). Непосредственной причиной перехода
межклеточного канала из открытого состояния в закрытое является
прямое
протонирование
коннексина
и
его
последующие
конформационные изменения
Однако полученые в работе (Муравьева и др., Биол. мембраны, 1993,
10:527-534) данные позволяют предположить существование иного
механизма разобщающего дейс-твия СО2 (и, возможно, других слабь.х'
кислот), который состоит в прямом взаимодействии этих веществ с
мембранными липидами и/или с белками межклеточных каналов: так
как слабые кислоты в недиссоциированной форме хорошо растворимы
в мембране то они могут влиять на конт1сгную проводимость, либо
взаимодействуя с каналами непосредственно либо воздействуя на
мембранные липиды подобно липофильньш агентам
Поэтому при исследовании действия СО2 на межклеточную связь в
культурах трансфицированных клеточных линий мы провели
измерение уровня связи в растворах, обогащенных СОг, меняя
независимо или рН раствора или концентрацию в нем
недиссоциированной угольной кислоты ([Нг СО3 ]).
5.3Эффе.стС02.
Растворы, использованные в этой серии экспериментов, получали,
добавляя в стандартньш физиологический раствор (см. 5.1) различные
количества бикарбоната натрия и перфузнруя их 100% СОг, доводя рН
до 6 5 или 6,1. При добавлении бикарбоната количество NaCl
соответственно уменьщалось. Концентрацию недиссоциированной
угольной кислоты в этих растворах расчитывали по уравнению
Хендерсона-Хассельбаха:
pH=ppKlg-ii
(1)
или
[HA] = lgP^-P"[A-l
(2)
[НА]
^- -^
где рК = IgK, К - константа диссоциации слабой кислоты, [А,-] и [НА]
концентрации., анионов
и
недиссоциированной . кислоты
соответственно. Для нашего случая: [ Н J C O , ] = 10Р^-Р«[нСОз-].
48
Состав растворов приведен в таблице N 8. В таблице также показан
качественный результат измерения межклеточной связи в этих
растворах для культур клеток HeLa Сх32 HG-2 и HeLa Сх26.
Количественно результаты отражены в последующих графиках.
Таблица N 8
Номер
расгвора
1
2
3
4
5
6
рН
[МаНСОз]
тМ
6,5
6,5
6,5
6,1
6,1
6,1
5
12,5
20
2
5
10
[Н2СОз! Межклеточная связь
тМ
HeLa Сх32 HeLa Сх26
2
5
8
2
5
10
+
+
+
+
+
+
+ : среднее количество окрашенных соседних клеток за 1 инъекцию в
экспериментальных чашках Петри (Ыэк) равно или больше этого
показателя в контроле (NK), т.е. N 3 K M K > 1.
- : отношение Ыэк/Мк = 0,01-0,04 в течении всего периода измерения,
т.е. 2-45 минут после •замены культуральной среды на
экспериментальный раствор;
+ : отношение N3K/NK = 0,8-1,0 в первые 10 минут после смены среды и
0,08-0 в течении последующих 35 минут измерения.
На рисунке 12 приведена зависимость уровня межклеточной связи от
концентрации недиссоциированной угольной кислоты в наружном
растворе ([Иг СОз]н) при постоянном рН: рис. 12 а - при рН = 6,5 и
рис. 12 б - при рН = 6,1. Зависимость межклеточной связи от изменения
рН наружного раствора обогащенного СОг, при постоянной
концентрации угольной кислоты ([Иг СО3] = 5 мМ) демонстрирует
рис 13 Стабильность рН и концетрации угольной кислоты в этих
растворах достигается соответствующим изменением в них
концентрации бикарбоната (FNaHCO,]) поэтому на графиках для оси
абсцисс указано и это начение Необходимо отметить что
ингибирующий эффект СО2 бьш полностью обратим: при замене
каждого из использованных растворов обогащенных СО, на
стандаотный PBS++ с рН =7 4 или даже с рН = 6 5 величина
межклLчной связи восстанавливалась до уровня контроля.,
49
5
12.5
1,4
1,2
1
I 0.8
i 0,6
"" 0,4
0,2
'"""'^ Рис. 12. Зависимость межклеDCX26 точной связи от концентра­
ции угольной кислоты в на­
ружном растворе при посто­
янной величине рН в культу­
рах HeLa Сх32 HG-2 и HeLa
Сх26. а - рН = 6,5; б - рН =
6,\. Ось абсцисс- верхняя и
нижняя шкалы - соотетствен8mMН2C03
но концентрации угольной
20mMNaHCO3
кислоты и бикарбоната в на­
ружном растворе; ось орди­
нат - отношение среднего
•Сх32
количества окрашенных со­
П 0x26
седних клеток за 1 инъекцию
в экспериментальных чаш­
ках Петри (N3K) К этому же
показателю
в
контроле
(NKOH).
О
Рис.13. Зависимость меж­
клеточной связи от измене­
ния рН в растворах с
постоянной концентрацией
Н2СО3, обогащенных СОгОсь абсцисс: верхняя шкала
- рН, нижняя - концентра­
ция бикарбоната в раство­
ре. Ось ор1шш - то же. что
на рис. 19. Культуры HeLa
Сх32 G-2 и HeLa Сх26;
плотность около 100 000
кл/см2.
1,21
x0,8
О
10,6
2 0,4
0.2
О
Использовались
культуры с плотностью око­
ло 100 000 кл/см2, т.е. с
10 шМН2С03
10 шм NaHC03 максимальным уровнем диф­
фузионной связи
6,1
тМ№О03
5
mWI№HXB
Приведенные графики показывают, что межклеточные контакты в
культуре клеток HeLa, трансфицированных геном коннексина 26,
обладают значительно более высокой чувствительностью к
ингибирующему действию СОг, чем в культуре клеток HeLa,
трансфицированных геном коннексина 32. Так, в культуре HeLa Сх26
50
полная блокада диффузионной связи происходила через 10 мин^г от
начала перфузии раствора N 1, содержащего 2 мМ Н2СО3 при рН =
6,5, а в культуре HeLa Сх32 HG-2 такой же эффссг наблюдался только
в растворе N5, содержащим 5 мМ HjCOs при рН = 6,1 (рис.12 а, б).
Во-вторых, ингибирующий эффект СОг в обеих клеточных линиях
зависит как от концентрации в наружном растворе недиссоциированной угольной кислоты при посггоянном рН (рис. 12 а для клеток
HeLa Сх26 и 12 б для HeLa Сх32 HG-2), так и от рН, т.е. концентрации
протонов, при постоянной pi2CO,] (рис.13).
Рассмотрим этот последний ряд полученных данных с точки зрения
двух изложенных выше гипотез о механизме ингибирующего действия
С02 на межклеточную диффузионную связь. Гипотеза первая: эффект
СО2 состоит в увеличении внутриклеточной концентрации протонов
[Н+] и прямом протонировании коннексинов. В таком случае, при
постоянной концентрации бикарбоната в наружном растворе
([ЫаНСОз]н)
ингибирующий эффект будет усиливаться при
увеличении концентрации СО2 и происходящим одновременно
снижение как рН„ так н рНв что и показано для различных клеточных
систем (например Morleyetal Biophys J 1996 70:1294-1302) Однако
в наших экспериментах концентрация C o i возрастала при стабильном
рН наружного раствора При этом ингибирующий эффект также
усиливался при увеличении концентрации СОУ([Н2СО,1У для клеток
HeLa Сх26 это видно при рН = 6 5 (рис 12 а) а для HeLa Сх32 HG-2
ПРи р Н = 6 1 (рис 12 б) Так как а-абильностьрН достигалась за счет
увеличения, концентрации бикарбоната в наружном растворе то
L о r o ГОВОРЯ этиграфики можно рассматривать и как обратную
зависимость межклеточной связи от [NaHCOs]
Что происходит при увеличении ЫаНСОз]н"? Если полагать, что за
время проведения измерений (40-45 минут для каждой чашки Петри)
внутриклеточная концентрация бикарбоната ([HCOa^H ) существенно
не изменяется, то этим параметром можно пренебречь, и в таком
случае рНз» будет снижаться пропорционально увеличению
концентрации СОг, в то время как рН„ остается стабильнь.м
Следовательно мы должны предположить н^ависимость (или слабую
зависимость) вш1ичины рН,„ от рН наружного раствора по крайней
мере в пределах производимь.х нами сдвигов рН Такое же
предположение приходится сделать при использовании гипотезы 1 и в
случае когда закнсление наружного раствора производилось при
помощи фосфатного буфера (растворы PBS++ - рис. 10 и 11): здесь
51
снижение рНн до 5,5 не вызывает нарушения диффузионной связи, что
должно было бы происходить, если рНзн снижается при таком
существенном сдвиге наружного рН. Однако для других клеточных
систем показана зависимость pH^n от рН наружного раствора (Smith et
al.,J.Biol.Chem., 1989,264:8723-8728).
Если же мы предположим, что при увеличении концешрации
бикарбоната в наружном растворе увеличивается и [НCOj-],», то это
будет приводить к стабилизации внутриклеточного рН, как это и
происходит в наружном расгворе (см. уравнение 1). И, следовательно,
ингибирующее действие СОг не должно усиливаться при увеличении
его концентрации в наружном растворе так как не увеличивается (или
слабо увеличивается) концентрация протонов внутри клетки Однако
это противоречит нашим экспериментальным данным
Кроме того, в растворах со стабильной концентрацией Н2СО3 в
наружном растворе (рис.13), ингибирующий эффект усиливается при
снижении рН и пропорциональном снижении [МаНСОз]». Это можно
объяснить только при предположении, что рН,„ и/или [КаНСОз]^»
существенно зависят от рН„ и/или от [ЫаНС0з1„. что не согласуется с
изложенными выше соображениями.
Таким образом, попытка объяснить полученные нами эксперимен­
тальные данные, исходя из гипотезы, что механизм действия СОг
сводится к увеличению рНв„ и последующему протонированию
коннексина, приводит к серьезным противоречиям.
Вторая гипотеза предполагает, что механизм действия СОг на
проницаемость межклеточных контактов состоит в прямом взаимодей­
ствии слабой кислоты (Н2СО3) с мембранными липидами и/или с
белками межклеточных каналов. В таком случае, эффективность
действия раствора, обогащенного СОг, зависит в первую очередь от
концентрации в нем недиссоциированной угольной кислоты а не от
его способности снижать внутриклеточнь.й рН Полученные нами
данные о зависимости ингибирующего действия СО2 от концентрации
недиссоциированной угольной кислоты в наружном растворе при
постоянном рН хорошо согласуются с этим предположением Однако
з-нвисимость эффекта от рН при постоянной концентрации ЬЬСО3
требует некоторых дополнительных допущений
В заключение необходимо отметить, что приведенные выше
результаты и разработанная экспериментальная система позволяют
спланировать эксперимент, который даст возможноегь вь.яснить
рассмотренные выше противоречия. Для этого необходимо измерить
52
внутриклеточный рН (например, микрофлуориметрическим методом)
в тех же условиях, в которых бьши получены настоящие даннь.е. В
результате мы получим информацию как о механизме закисляющего
цитоплазму действия СОг, так и о механизме ингибирующего действия
С02 на межклеточные диффузионные каналы.
Рассмотрев, таким образом, некоторые факторы и механизмы
регуляции диффузионной межклеточной связи, вернемся к вопросу об
участи проницаемых межклеточных контактов в определении
фенотипа взрослых паренхиматозных клеток печени - гепатоцитов.
53
6.
ПРОНИЦАЕМЫЕ
МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ
КОНТА1СГЫ И
ЭКСПРЕССИЯ РАКОВО-ЭМБРИОНАЛЬНОГО БЕЛКА АЛЬФАФЕТОПРОТЕИНА В КУЛЬТУРАХ ВЗРОСЛЫХ ГЕПАТОЦИТОВ
6.1 Предпосылки к постановке задачи.
Альфа-фетопротеин (АФП), эмбриоспецифический сывороточный
белок млекопитающих, синтезируется в эмбриональной печени и при
развнти гепатоцеллюлярных опухолей (Abelev, Advan.Cancer Res.,
1971, 14: 295-358), в связи с чем в клинической онкологии АФП широко
используется как иммунологический маркер для ранней и весьма
надежной диагностики гепатоцеллюлярного рака (Abelev, Transplant
Rev 1974 20:3-37). Во взрослом организме синтез АФП наблюдается
при регенерации печени после частичной гепатэктомии или отравления
гспатотоксинами Показано что при этом происходит ре-экспрессия
АФП во взрослых дифференцированных предсуществу-ющих
гепатоцитах (Engelhardt et al Nature 263:146-148) и что возобновление
синтеза эмбрионального белка во взрослых клетках не зависит ни от их
пролифепативного егатуса ни от стадии дифференцировки или
плоидносги (Лазарева Бюл эксп биол мед 1977 84 97 101)
'
Морфологические закономерности появления АФП-продуцирующих
клеток в регенерирующей печени мышей привели к предположению,
что ре-экспрессия АФП в этом случае связана с локальными
нарушениями структуры ткани, с временной "индивидуализацией"
гепатоцитов и выходом их из под контороля окружающих клеток
(Abelev In: "Cell Differentiation and Neoplasia", Ed.Saunder^ Raven
Press N Y 1978- Gleiberman et al Int Rev Cytol 1985 95:229-266)
Подтверждением' этого представления является" тот, факт что
ферментативная диссоциация ткани печени взрослых мышей с
последующей эксплантацией гепатоцитов в монослоиную культуру
является мощным стимулом ре-экспрессин АФП (Глейберман Бюл
эксп биол мед 1982 93:55-58)
I
P
,
.
Как отмечалось выше (глава 2), исследование проницаемь.х
межклеточных контактов в ткани печени и гепатом привело нас к
54
шключению, что в процессе опухолевой трансформации нарушения
межклеточной связи могут носить локальный характер и, в таком
;лучае, они не могут быть обнаружены в экспериментах по измерению
электрической связи на целом органе. Поэтому первичная культура
гепатоцитов представлялась нам весьма интересной моделью которая
юзволяла исследовать роль межклеточных контактов в регуляции
п,нтеза раково-эмбрионального белка во взрослых гепатоцитах и в
эолее общем плане в регуляции фенотипа дифференцированных
клеток В соответствии с этим мь, провели сравнительное исследование
проницаемых межклеточных контактов и синтеза АФП в первичной
культуре гепатоцитов из интактной печени взрослых мышей при
различнь.х условиях культивирования.
S.2 Материалы и методы.
Объекты исследования.
а) монослойные культуры гепатоцитов. Суспензию гепатоцитов
получали по методу, описанному в работе (Глейберман, Бюлл.
эксп.биол.мед., 1982, 93: 55-58), из интактной печени взрослых мышейсамок линии С57В1/6 после двух-этапной перфузии in situ растворами
ЭГТА ("Serva", ФРП и коллагеназы ("Boehringer-Mannheim", Австрия).
Суспензию клеток помещали ,в пластиковые чашки Петри диамегром
40 мм на субстрат из сухой желатины ("Sigma", тип I, США), и
культивировали в среде Лейбовича L-15 ("Flow" UK) с 10% фетальной
гелячей сыворотки (Ин-т Гамалеи СССР) с добавлением глютамина и
антибиотиков
б) ко-культуры гепатоцитов с крысиными эпителиальными клетками
печени линии ИАР-20 (любезно предоставленными Г.Банниковым из
ОНЦ РАМН) получали по методике, описаной в работе (GuguenGuillouzo et all., Expt. Cell Res. 1983, 143: 47-54), с некоторыми
модификациями (в среду не добавляли глюкокортикостероиды и
уменьшили клеточную плотность) В культуральные чашки диаметром
40 мм вносили около 250 тысяч гепатоцитов и после их прикрепления
на подложке из сухой желатины добавляли 500-600 ть.сяч клеток ИАР20 При этом для клеток ИАР-20 формировали градиент клеточной
плотности (в центре чашки - зона повышенной плотности) путем
легкой ротации чашек при внесении этих клеток в культуру Среду
меняли 2 3раза в неделю
с) культуры с использованием коллагенового геля. Коллагеновый
гель готовили из раствора уксуснокислого коллагена, выделенного из
55
хвостовых сухожилий крыс, смешивая его в соотношении 4:1 с 5кратной средой Дальбекко, содержащей 0,125 М NaOH и 0,26 М
МаНСОз- Для полн*,еризации чашки с этой смесью помещали в
термостат при 37^ С на несколько минут. При культивировании внутри
коллагенового геля после прикрепления гепатоцитов к коллагеновому
субстрату в чашки вносили дополнительную порцию смеси и после
окончания
полимеризации
вносили
полную
среду
для
культивирования.
Проницаемость межклеточных контактов определяли методом
внутриклеточных инъекций флуоресцентного красителя (dye coupling),
используя Люциферовый желтый СИ ("Sigma", США) - см. раздел 4.1.
Иммуногистохимические методы. Помимо синтеза АФП, в качестве
дифференцировочных
маркеров
гепатоцитов
использовалась
локализация домен-специфических мембранных антигенов гепатоци­
тов мыши: антигена желчных капиляров (АГ 1) и рецептора к
асиалогликопротеинам (РАГП), а также характер распределения
актиновых филаментов. Выявление перечисленных антигенов
проводили непрямыми нммунофлуоресцентным и иммунопероксидазным методами (Глейберман Бюлл эксп биол мед 1982 93: 55-58)
Культуру фиксировали 10-15 мин в.10% формалине на забуференном
физиологическом растворе с добавлением 0 05% сапонина для
пермеабилизации клеток После отмывки в физиологическом растворе
с сапонином клетки обрабатывали последовательно первыми и
вторыми антителами Актин вьшвляли с помощью фшцюидина
коньюгисованного с TRITC (Faulstich et al Expt Cell Res 1983'
144:73-82)
"'
'
Антитела, исг.ользованнь.е в работе. Для выявления АФП
использовали кроличьи аффинно очищенные антитела; для РАГП кроличью моноспецифическую антисыворотку, любезно предост^авленнуюД.М.Беленьким(Я05епГе1с1е1а1. Biochim. Biophys. Acta 1986,883:
306-312) В качестве второго реагента в обоих случаях использовали
овечьи аффинно очищенные антитела к IgG кролика коньюгированные с пероксидазой хрена (RZ 3-0; "Serva" ФРП АГ 1 выявляли
последовательно крысиными моноклональными антителами В 10
(Рудинская и др
Биол мембр
1987 4194-207) любезно
предоставленными Н И Куприной „ Г Д Рудинской (ВОНЦ РАМН)
кроличьими антителами к LG кОЫС и овечьими антителами к ЫС
кролика коньюгированными с пероксидазой
56
6.3
Поницаемые межклеточные ко1.т..кгь. и экспрессия ЛФП в
монослойных культурах гепатоцитов.
Опыты проводили в культурах гепатоцитов из интактной печени
взрослых мышей при плотности 2-4-105 клеток на чашку Петри
диаметром 40 мм. Первые случаи перетекания красителя наблюдались
спустя 4-5 часов после выделения гепатоцитов, несмотря на то что
многие клетки находились в морфологическом контакте сразу после их
прикрепления к культуральной подложке Уровень межклеточной
связи быстро нарастал и достигал максимума к 24-48 часам
культивирования после чего происходило резкое падение обоих
измеряемых показателей контактной проницаемости- I - степени
связи т е числа клеток в которые распространяется краситель в
течение 2.минут после инъекции и 2 - процента "положительных"
инъекций (в которых наблюдалось перетекание красителя в соседние
клетки) от общего числа инъекций АФП-содержащие клетки
обнаруживались как правило через 48.часов культивирования и их
количество увеличивалось в последующие дни параллельно снижению
УРОВНЯ межклеточной связи (РИС М Т П Р И этом в культуре происхояили
Существенные морфологические изменения: гепатоии7ь^ вытя и в З с ь
прнобр^^^и
О Р Г О Л О Г ! акт-L
л^
обра
ов^^в^и
п о л н с л о Т М°Р*
" ГлТижушихся
° движущихся кклеток,
образовывали
Рис. 14. Динамика межкле­
точной связи и синтеза АФП
в монослойной культуре гепатоцитов. 1 - степень связи,
т.е. среднее (из 7-10 инъек­
ций) количество окрашенных
соседних клеток за инъекцию
(N); 2 - количество АФПположительных клеток (%).
4
24
48
72
96
время в культуре (часы)
Однако в этих культурах наблюдалась значительная неоднородность
в распределении АФП-содержащих клеток и уровня диффузионной
связи как внутри каждой культуральной чашки, так и между опытами,
что не позволяло определить, происходит ли утрата межклеточных
контактов и синтез АФП в одних н тех же клетках. Мы предположили,
57
что подобный разброс связан с локальными колебаниями клеточной
плот.10сти. Поскольку создать равномерную плотность в культурах
гепатоцитов практически невозможно, мь. постарались упорядочить ее
неоднородность и разработали систему создания в этих культурах
градиента клеточной плотности.
6.4 Контактное торможение синтеза АФП в культурах гепатоцитов.
Для создания градиента клеточной плотности около 10^ гепатоцитов
помещали в пластиковые чашки Петри диаметром 40 мм и в первые 20
мин. чашки слегка вращали. В результате этого часть клеток
собиралась в центре, где после прикрепления и распластывания они
образовывали участок плотного монослоя диаметром 3-5 мм. По
периферии монослоя располагался более разряженный слой клеток, а
на всей остальной поверхности чашки находились небольшие
гепатоцитарные островки и отдельные клетки
Измерение межклеточной связи, проведенное раздельно для
центральной и периферической частей монослоя, показало (рис. 15 а),
что через 24 часа после прикрепления практически все клетки
обладают межклеточными диффузионными каналами; 100% положи­
тельных инъекций регистрировалось в обоих морфологических
популяциях клеток. Однако уже на вторые сутки на периферии
монослоя происходило снижение, а затем резкое падение измеряемых
показателей межклеточной связи и к 5 суткам межклеточная связь
гхрачивалась здесь полностью В то же время в плотной центральной
части монослоя уровень связи снижаясь между 2 и 5 сутками
сохранялся
достаточно
высоким
в течение всего
срока
культивирования
АФП-положительные клетки в первые двое суток отсутствовали во
всех морфологических областях культуры. Начиная с 3 суток в
периферической части монослоя появлялось значтельное количество
(около 20%) АФП-положительиь,х клеток. К 5 суткам их количество
возрастало до 50-75% в различных опытах. При этом в центральной
части монослоя вплоть до 5 суток находились лишь единичные АФПсодержащие клелси(рис 15бирис16)
В различных по плотности областях клеточной культуры
наблюдалась существенная морфологическая неоднородность. На
.териферии монослоя гепатоциты, уже на I сутки значительно более
58
аэ
ш
\ 1
s
S12
ш
^J 10
л
I. 8
С
Щ 6
" 4,
Л...-.
24
72
48
96
120
б
100,
Вцентр
Рнс. 15. Межклеточная СВяЗЬ
(а) и колнчесгво АФП-пролуцирующих клеток (б) в
культуре гепатоцнтов с ipaдиентом клеточной плотно­
сти. а - среднее количество
(из 8-20 инъекций красителя)
окрашенных соседних клеток
за инъекцию (N) в центре (/)
и па периферии (2) культуры б - процент АФП-положнтелькь.х клеток в центре и
на периферии; в кавдом
случае просчитывали НО500800гепатоцитов
Ыкрай
50•
о
¥
в
<
^Хт.
1
3
4
времявкугьтуре(суш,)
Рис. 16. АФП-содержащие клетки в культуре
гепатоцитов с градиен­
том клеточной плотнос­
ти на 4 сутки. Иммунопероксндазное окраши­
вание, контрастнрованное гематоксилином. В
плотной центральной
части культурь, большинство клеток АФПнегативные; в разрежен­
ной периферии более
половины клеток АФПположительные (клетки
с темными отложения­
ми в цитоплазме). Бар 59
распластанные, чем в его центре, после 2 суток культивирования
вытягивались, становились фибробластоподобными, в дальнейшем
образовывали полислой. В плотной центральной части сохранялась
морфология эпителиального клеточного пласта, а гепатоциты
обладали присущими им in vivo полигональной формой. В культурах с
аналогичным количеством клеток, не организованных в плотный
монослой и состоящих из отдельных небольших осггровков
межклетотчая связь гграчивалась практически полноестью после 2
суток культивирования К 5 суткам обычно до 50-70% клеток были
АФП-положительными
Таким образом, создание культуры с градиентом клеточной
плотности позволило сгруппировать однородные по своим свойствам
клетки: расположенные в плотном эпителиальном монослое
гепатоциты сохраняли исходную морфологию и проницаемые
контакты и оставались АФП-негатнвньши а в участках культуры с
исходно более низкой плотностью происходило изменение
морфологии потеря межклеточной связи и возобновление синтеза
АФП Иными словами было гюказано что ре-экспрессия АФП
происходит только в , гепатоцитах утративших межклеточные
диффузионные контакты и характерную для них эпителиальную
ФОРМУ Т е бьшо выявлено строгое соответствие этих трех процессов в
однихитехжеклепсах
Обнаруженный нами в этой серии экспериментов феномен
"контактного торможения" синтеза АФП однозначно указывает на
вовлеченность межклеточнь.х взаимодействий в механизм регуляции
фенотипа гепатоцита. Четкая корреляция между потерей проницаемых
межклеточных контактов и ре-экспрессией АФП позволяет
предполагать их причинную взаимосвязь. В таком случае,
восстановление межклеточной
связи должно
приводить к
ингибированию синтеза АФП Проверку этого предположения мы
осуществили в ко-культуре гепатоцитов с эпителиальными клетками
печени.
6.5 Стабилизация взрослого фенотипа гепатоцнта при трехмерной
организации клеточно!! культуры.
6.5.1 Ко-культуры.
Совместное культивирование гепатоцитов с эпителиальными
клетками печени дает возможность сохранять функции зрель.х
гепатоцитов в течение длительного времени (Guguen-Guillouzo et. al.,
60
Exp. Cell Res., 1983, 143:47-54). Мы использовали в качестве партнеров
для ко-культивирования с гепатоцнтами мь.ши нетрансформированные крысиные эпителиалы^ые клетки линии ИАР-20. При этом мь,
создавали в культуральпой чашке градиент плотности кл(ггок ИАР-20,
в то время как гепатоциты распределялись по возможности
равномерно.
В 1 - 2 сутки культивирования, пока количество клеток ИАР-20 еще
невелико, распластывание гепатоцитов происходило как в стандар­
тной монослойной культуре. При этом гепатоциты оставались АФПнегативными и демона-рировали вь.сокий уровень межклеточной
связи. Среди клеток ИАР-20 также регистрировалось 100% положи­
тельных инъекций в течении всего периода культивирования
Существенно отметить, что перетекание красителя никогда не
наблюдалось между гепатоцигами и клетками ИАР-20, т.е. гетероген­
ные проницаемые контс^кты в этой клеточной системе не образуются К
третьим сулсам дальнейшему распластьшанию гепатоп.п-ов начинали
препятствовать активно пролифирирующие клетки ИАР-20 а так как
их плотность уменьшалась от центра культуры к периферии
создавалась возможность наблюдать различный харатер эволюш1и
гепатоцитарных островков
В участках с наивысшей плотностью клеток ИАР-20 уже на 3-4 сутки
возникали гепатоцитарные островки (островки 1 типа), состоящие из
полигональных клеток, которые обладали отчетливо выраженной
системой межклеточных контактов (рис. 17 е, О и оставались АФПнегативными в течении 10-15 дней культивирования. В них также
сохранялись и остальнь.е черты взрослого фенотипа гепатоцита:
типичные желчнь.е капиляры с соответствующим антигеном (АГ I)
локализация рецептора к асиалоглнкопротеинам на синусоидальной
поверхности гепатоцитов распределение актина в виде тонкой
внприплазматической сети филламентов и подмембранного кортикаГьного слоя многократно усиленного вокруг желчных капиляров
Наиболее интересным было поведение гепатоцитов в областях
культуры с первоначально невысокой плотностью клеток ИАР-20.
Здесь на 3-5 сутки распластьшание гепатоцитов еще не было
ограничено и происходящие нзмениения соответствовали обычной
монослойной культуре того же срока: гепатоциты приобретали
подвижность утрачивали эпителиальную морфологию и проницаемые
контакты (рис 17 g h) и возобнавляли синтез АФП
61
»%kj
t'lit,,
. -1
Ti4i I
1 I ' I ''laiit'r
liliitr
'^
I ••
''
- " I
r-iCT
Рис. 17. Межклеточная диффузия красителя Люциферового желтого в
культуре гепатоцитов. (а)Ж(с), fe) ) <1«1^овь,й конт|^аст; (6), М, ,/), (Л)
- соотв^ггствующие флуор^сцстт.е изображения, (« и (/,) - высо-юш
уровень мсжт<лспочио1 связи (dye couplinL) в органотипических
трабек-улах внутри ко;.лагеново,о геля и (О и ^ - в гепатоцитарн.лх
островках I типа при ко-культивирова.тш с кх.етками ИЛР-20, (с) и (d) отсутствие межкл^чмой связи в шмененнь.х трабекулах внутри
коллагеиового геля и О?) и (h) - в островках 11 типа в ко-культурах.
Увеличение 200х.
62
Доме..-спе11ифические маркеры взрослого генатоцита сначала теряли
присущую им in vivo локал.пацию, а затем исчезали с клеточной
мембраны. Наблюдалось распределеане акпша, типичное для
фибробластоподобпых клсггок - в цитоплазме появлялись яркие пучки
актина. Однако под дсГнпвием увеличивающейся со временем
плотности клеток ИАР-20 происходила реверсия этих гепатоцитарнь.х
островков II типа в описанные вь.ше островки I тип Полностью
восстанавливалась межклеточная связь исчезали АФП^положитель..ь,е клетки восстанавливалась картина распределения антигенов и
актина т е происходило возвращение к взрослому фенотипу
гепатоцига.
В участках культуры с наи^,cнь,пeм плотностью клеток ИАР-20
островки из вьггянутых АФП-продуцирующих гепатоцитов, не
связанных между собой диффузнош1ыми контактамH, сохранялись
вплоть до 10 дней культивирования.
При помощи инъекций Lucifer yellow в одну из клеток ИАР-20 мы
показали (рис. 18), что в островках ! типа гепатоциты были не только
окружены клетками ИЛР-20 на уровне культура.пьиой подложки, по и
покрыты сверху непрерьнмпим пластом этих клеток: инъекция
красителя в одну из клеток ИАР-20, при высоком уровне связи между
ними делала хороню заметнь.м расположение большого числа
окружающих ее клегок То есть в этих островках возникала трехмерная
система культивирования гепатоцитов В то же время островки из
ползущих
ЛФП-содержащих гепатоцитов не имели этого
покрываюгцего клеточного пласта Сун.ественно отметить что в кокультурах происходило интеисипное отложение компонентов внекле­
точного магрикса между гепато.цыами и клетками ИЛР-20
Рис. 18. Выявление клеток ИАР-20 на поверхности гепатоцитарнь.х
островков I типа при микроинъекции Люцнферового желтого.
(а) • фазово-коктрастное и (б) - флуоресцентное изображение.
Увеличение 200х.
63
Таким образом, эти эксперименты показывают, что синтез АФП
подавляется до тех пор, пока осггровки гепатоцитов сохраняют
эпителиальную морфологию и вь.сокий уровень межклеточной связи
характерные для них in vivo. Более того, восстановление утраченной
морфологии под действием формирующегося монослоя клеток ИАР20 приводит к возобновлению межклеточной связи и повторному
ингибированию синтеза АФП
Какой элемент этой клеточной системы является непосредственной
причиной супрессии АФП? В работе (Mesnil et al., Exp.Cell.Res., 1987,
173, 524-533) показано, что экспрессия специфических дифференцировочных генов и морфология взрослых крысиных гепатоцитов
сохраняется в течении длительного времени при их культивировании с
эпителиальными
клетками желчных капиляров. При этом
проницаемые контакты между клетками этих двух типов отсутствуют
Авторы приходят к выводу что необходимым условием сохранения
специфических гепатоцитарных функций является морфологический
контакт но не взаимодействие через проницаемые контакты между
гепатоцитами и клетками желчных капиляров
В то же время, в работах группы Рейд (Reid et al.. Isolated and
Cultured Hepatocytes, Guillouzoo A. & Guguen-Guillouzo С (eds.), 1986,
225-258, INSERM, Paris; Spray et al., J.Cell Biol., 1987, 105, 541-551)
показано, что добавление в культуру гепатоцитов компонентов
внеклеточного матрикса, и особенно специфического для печени
гепаран-сульфат протеогликана приводит к восстановлению спектра
экспрессируемых тканеспецефических белков включая белок щелевых
контактов коннексин
Данные, полученные в исследованных нами югеточных системах,
позволяют предположить, что именно эволюция морфологии
гепатоцитарных осфовков от эпителиальной к фибробластоидной
является первопричиной двух других процессов - падения уровня
межю,еточной связи и ре-экспрессии АФП а роль плотного монослоя
как гомогенных клеток - гепатоцитов так и гетерогенных клеток ИАР20 состоит в предотвращении такой эволюции т е в сохранении
органотипическои балочной морфологии островка Возможно что и
внеклеточный матрикс также оказывает свое влияние на фенотип
гепатоцита в качестве структурообразующего фактора Для проверки
этого предположения мы гтовели исследование в культуре трехмерная
организация которой создавалась за счет белкового ,компонента
внеклеточного матрикса - коллагена.
64
6 . 5 . 2 Культивирование гепатоцитов внутри коллах-енового
геля.
При культивировании гепатоп.ггов между двумя слоями геля из
полимеризованного коллагена 1 типа распластывание клеток было в,
значительной степени ингибировано. При этом гепатоциты уже через
двое суток выстраивались в разветвленные трабекулярные структуры
из клеток полигональной формы с типичными желчными капилярами
между ними, идентичные печеночной балке взрослой печени В этих
органотипнческих структурах которые сохранялись вплоть до 9-10
суток регистрировалась 100% межклеточная связь и полностью
отсутствовали АФП-содержащие клетки (рис 11 а Ь) Локализация
домен-специфических мембранных антигенов и распределение актина
соответствовали наблюдаемым в интактной взрослой печени т е
гепатоциты в таких органотипнческих трабекулах сохраняли все
признаки взрослого фенотипа
Однако, в некоторых участках культуры можно было наблюдать
локальные повреждения в структуре балок. Это было связано,
повидимому, с поврежде/.ием слоя полимеризованного коллагена,
покрывающего гепатоцить,. или же с отлипанием верхнего слоя
коллагена от слоя, находящегоог под клетками. В этом случае
происходило изменение морфологии гепатоцитарных агрегатов клетки теряли свою полигональною форму, вытягивались, исчезали
структуры желчных капиляров между ними Межклеточная связь
полностью утрачивалась (рис 11 с d) а си,п-ез АФП возобнавлялся во
многих клетках Все это сопровожда^ось утратой домен-специфичес­
ких мембранных маркеров и перестройкой цитоскелета
Необходимо отметить, что культивирование гепатоцитов на
подложке из коллагенового геля, но не внутри него, не приводило к
описанным выше результатам. В этом случае в первые 2 суток
распласть,вание гепатоцитов существенно замедлялось, но начиная с 3
суток поведение гепатоцитов на слое из полимеризованного коллагена
ничем существенно не отличалось от стандартной монослойной
культуры на подложке из желатины
Таким образом, результаты, полученные в данной эксперименталь­
ной системе, как и в ко-культурах гепатоцитов с клетками ИАР-20,
показывают, что сохранеь.ие (и восстановление) взрослого фенотипа
гепатоцита требует трехмерном организации культурь,: в случае геля
это трехмерный коллаген, в случае ко-культур - это сочетание
трехмерной организации клеток-партнеров и внеклеточного матрикса.
65
Такая трехмерная сисгема обеспечивает существование органотипических структур, идентичных балкам взрослой печени.
Тот факт, что эпителиальнь>е клетки печени могут быть заменены
искуственным внеклеточным матриксом, позволяет полагать, что
ключевым звеном в стабилизации взрослого фенотипа гепатоцита
является взаимодейсгвие между самими гепатоцитами, которое может
осуществляться только в опеределеиным образом организованной
морфологической
структуре
Действительно,
межклеточное
взаимодействие существенно зависит от таких морфологических
параметров, как степень сближения двух сосед1.их клеток
определяющая
возможность образования
специализированных
межклеточных ко.гтактов; площадь контактной мембраны между
двумя соседними клетками;величина связности т е количество клеток
с которыми каждая данная клегка связана проницаемыми контактами ,
Если высказанное предположение верно то воздействия
блокирующие межклеточный обмен через проницаемые контакты'
должньГприводить к усилению синтеза АФП в гепатоцитах Одним из
таких блокирующих контакть, факторов являются опухолевые
ПРОМОТОРЫ В связи с этим мы исшедовали их действие на
межклеточную связь и синтез АФП в культурах гепатоцитов из
6.6 Влияние опухолевых пpомотopoв па проницаемость межклеточных
контактов и синтез АФП.
Как известно, канцерогенез является многоступенчатым процессом, в
котором выделяют три основных стадии: инициации, промоции и
прогрессии (см.,например, Банников, в "Явления индукции и
дифференцировки при опухолевом росте", 1981, Наука, М., с. 4-69). На
кратковременной стадии инициации под воздействием мутагенов
происходит необратимое наследуемое превращение клетки в премалигнизированную (генотипическое изменение) На более длительной и
обратимой стадии промоцин образуются клоны инициированных
клеток из которых на стадии прогрессии формируется автономная
опухоль В соответствии с этим в процессе химического канцерогенеза
рассматривается два класса веществ: инициаторь. и промоторы
Опухолевые ПРОМОТОРЫ - это соединения которые не способны
вызывать опУХОЛИ но усиливают и УСКОРЯЮТ их образование при
предварительном 'воздействии инициирующего агента Свойства
промоторов проявляются только при хроническом действии, а их
66
эффект, в противоположность действию инициаторов - канцерогенов,
обратим.
Одним из наиболее характерных признаков опухолевых промоторов
является их способность снижать проницаемость межклеточных
контактов (см. обзор Yamasaki, 1990, Carcinogenesis, 11:1051- 1058).
Предпологается, что именно этим и обусловлено их действие при
развитии опухоли. При изучении ннгибирующего действия
промоторов на межклеточные контакты часто используется наиболе
активный промотор кожного канцерогенеза in vivo - форболовый эфир
12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат (ТФА) который также резко
увеличивает эффективность трансформации во многих клеточных
стстемах in vitro
Мы провели сравнительное исследование действия ТФА в первичной
монослоинои культуре гепатоцитов и в культуре эпителиальных
клеток печ1ни линии ИАР-20. Исследовали также действие
специфического промотора гепатоканцерогенеза in vivo ДДТ (1,1бис(4-хлорофенил)-2,2,2 трихло-розтан) в культурах гепатоцитов nppi
различных условиях культивирования. Во всех случаях культуры
получали из печени мышей линии С57В1/6 Использовали раствор ТФА
("Sigma") в этаноле и раствор ДДТ ("Sigma") в DMSO Конечная
концентрация растворителя в. рабочем растворе или в культуральной
среде не превышала 0 1%
Мы обнаружили, что ТФА не оказывал ннгибирующего действия на
диффузионную межклеточную связь в монослоинои культуре
гепатоцитов даже в концентрации 10-^ г / ^ , в то время как для клеток
ИАР-20 эффективная концентрация ТФА, при которой полностью
блокировалось рапространение красителя, составляла 5-10-9 rlun (таб.
7) (Для многих исследованнь,х кпсток действующая концентрация
ТФА составляет 10-7 г / ^ Д ) Интересно отметить что клетки ИАР-20
демонстрировали присущий действию ТФА эффект потери чувстви­
тельности к нему при ;щительной (48 часов) инкубации клеток с ТФА
Добавление свежей порции ТФА на 30 мин не приводило к изменению
уровня межклеточной связи В настоящее время хорошо известно что
явление рефрактерности к действ.ш ТФА связано с потерей
чувствительности
к
нему
протеинкиназы
С
являющейся
внуттзиклсточным рецептором ТФА (Blackshl et а Г J Biol Chem
198^260 13304 13315) Мы не обшоужили также изменения уровня
синтеза АФП в культуре гепатоцитов подвергшейся действию ТФА
67
Таблица 7. Действие ТФА на межклеточную диффузионную связь в
первичной культуре гепатоцитов и в культуре клеток И АР-20.
^
кШШЕы
коьщентрация ТФА (г/мл) и время воздействия
10-9
1час
ИАР-20
контроль
опbfT
5.10-9 5-10-9 10-8
10-7
10-7
30 мин. 48 час 30 мин. 2 час. 4 час.
37±2* 36±2
(9/9)
(9/9)
38+3
0
(11/11) (0/7)
36+2
(9/9)
60+3
(7/7)
гепатоцить,
контроль
,о-6
1час
24±2
(15/16)
0
(0/7)
7±1
(8/8)
6±1
(7/7)
12±1
(11/11)
12±1
(9/9)
15+2
(7/7)
12±2
(12/13)
* - среднее количество окрашенных соседних клеток через 2 минуты
после внутриклеточной инъекции красителя. В скобках- отношение
количества "положительных" инъекций (при которых регистрирова­
лось перетекание красителя) к общему количеству инъекций в опыте.
Исследование действия ДДТ на межклеточную связь и синтез АФП
проводилось в обычных монослойных культурах гепатоцитов, в
культурах с градиентом клеточной плотности и в культурах гепатоци­
тов внутри коллагенового геля.
В 1-2-3 суточной монослойной культуре при инкубации клеток с ДДТ
в концентрации 5-10-6 ,,^п в течение 24 часов средний уровень
межклеточной связи снижался в 2-3 раза по сравнению с контролем, а
количество АФП-положительнь,х клеток увеличивалось в двухсуточ­
ной культуре с 6,5% до 15%, в четырех-сзточной культуре с 39% до 60%
(данные одного опыта). Существенно отметить, что более длительная
инкубация этой культуры в присутствии ДДТ (30 и более часов)
приводила как к полной потере межклеточной связи, так и к снижению
количества АФП-синтезирующих клеток в сравнении с контролем.
В культуре с градиентом клеточной плотности ДДТ в концентрации
5-10-10-6 г/мл, внесенное в одно -двухсуточные культуры, на 3 сутки
приводило к практически полному разобщению клеток в периферичес­
кой части культуры, где клетки образуют неплотную клеточную сеть. В
68
то же время в центральной части, представляющей собой сплошной
монослой плотно упакованных клеток, проводимость межклеточных
контактов для красителя сохранялась, а иногда и превышала таковую в
контроле. Количество АФП-полож.п-ельных клеток в лериферичес-кой
части монослоя увеличивалось в 2-3 раза. В плопюй центральной
части монослоя количество АФП-продуцирующих клеток не
превышало, как и в контроле, нескольких процентов однако площадь
плотной части монослоя в опытных чашках уменьшалась. Инкубация
гепатоцитов с более высокой концентрацией ДДТ - 20-10-6 г/мл
приводила к потере межклеточной проводимости как в центре так и на
периферии моноотоя и к полному отсутствию АФП-положитель-ных
клеток
Кльтивирование гепатоцитов внуфи коллагенового геля приводит,
как уже говорилось (5.5.2), к образованию органо-типических
структур, характерных тя интактной печени, в которых вплоть до 910 суток сохраняется вь.сокий уровень межклеточной связи и
практически отсутствуют АФП-содержащие клетки. При внесении в
такую культуру на 4 сутки ДДТ в концентрации 15-10-6 р/мл в течение
последующих 3-4 суток происходило локальное изменение морфологии
гепатоцитарных пластов клетки распластывались приобретали
вытянутую форму выползали из состава балок утрачивали
межклеточную диффузионную связь В таких измененых структурах
регистрировалось до 50% АФП-положительных клеток На 8 сутки
только в небольшой наиболее плотной части культурь.' сохранялись
органопшнческпе структтрь, с вь.соким уровнем межклеточной связи и
свободные от АФпТооЗиоующих клеток В контрольных культурах
незнаадтельное количе^во АФП содержащих клеток наблюдалось
только в м е с т ! с напушенной СТОУКТУООЙ гепато циташых балок как
правило п р Т п о в ^ а ш Г с л Г Г о л л а г е н о в о г о ге;^ покрьГающего
Тй ™
;
1ГяГгГсм 1 1 Г . т Г п ^ п ! 1 й сТпГчеп?.^^^^^^
70
Таким образом, в трех культуральных системах мы обнаружили, что
специфический промотор гепатокапцерогенеза ДДТ снижал проводи­
мость межклеточных контактов и значительно увеличивал количество
гепатоцитов, синтезирующих АФП. Этот эффект наблюдался только в
строго определенных рамках концентраций ДДТ, при действии
которых проводимость межклеточных контактов сохранялась в
морфологически устойчивых областях клеточной культуры и
69
утрачивалась в периферических зонах, т.е. увеличивался фадиент связи
между морфологически различными учасггками клеточного пласта.
Более высокие дозы, или большее время инкубации без смены среды,
приводящие к полной потере мажклеточной связи, также полностью
ингибировали и синтез АФП. Необходимо отметить, что и в этой
системе ушата межклеточной связи и усиление синтеза АФП
происходили одновременно с изменением формы клеток от
полигональной с эпителиальной полярностью в распластанную
фибробласто-подобную форму
Не специфичный для печени в процессе канцерогенеза in vivo
опухолевый промотор ТФА не влиял на уровень межклеточной связи.
Данные о специфичности ингибирующего действия промоторов на
межклеточные контакты приведены в работе (Klaunig et all., Cancer
Letters, 1987, 36: 161-168). Показано, что в культуре гепатоцитов
промотор гепатоканцерогенеза фенобарбитал (ФБ) оказывает
ингибирующее действие на межклеточные контакты клеток из мышей
только тех линий, для которых он является промотором in vivo.
Полученные в этой части работы результаты, в совокупности с
закономерностями ре-экспрессии АФП в регенерирующей после
отравления четыреххлористым углеродом печени и в постнатальном
развитии печени мышей (Gleibcrman et al., Int. J. Cancer, 1983, 32: 8592), убедительно свидетельствуют, что синтез АФП регулируется на
тканевом уровне локальны^,н ^,eжклеточными взаимодействиями
Полученные нами данные позволяют также полагать
что
про4цаемые межклеточнь.е контакты ^.аряду с сохранением эпителиальной формы гепатоцита являются одним из основных механизмов с
помощью которого осуществляется эта регуляция Подержание
полигональной формы осуществляется в свою очередь как с помощью
межгепатоцитарньГх взаимодействий, так и кOHTaiaoM клеток с
трехмерным внeклeroчнь•^, матриксом
При этом
наличие
проницаемых межклеточнь.х конт-.ктов является надежным маркером
сохоанения взоос^го сЬенотип-, гепатоиитов и 015ганотипической
^у^урыгепат^тарнГхоа^ро^к
орг нотип чес
70
7. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Проведенное нами исследование электрической струюгуры ткани
нромальной печени и гепатом мышей показало, что и в процессе
канцерогенеза, и в исследованных нами перевиваемых и
индуцированных гепатомах проницаемость контактных мембран для
неорганических ионов практически не отличается от нормальной
ткани. Следовательно, генерализованная потеря проницаемых
межклеточных ко^ггактов не является обязательным условием
малигнизации как это предполагалось авторами первых иследований
этого вопроса
В то же время, при изучении взаимодействия нормальных и
неопласгнческих клеток в культуре мы обнаружили сущесгвенное
изменение (нормализацию) фенотипа неопластических клеток L, если
они растут в контакте с нормальнь.ми клетками. Весьма вероятно, что
это изменение обусловлено передачей
через
проницаемые
межклеточнь,е контакты в L клетки продуктов метаболизма
нормальных клеток Таким образом, этот результат позволяет
полагать что межклеточные диффузионные контакты могут служить
фактором супрессии трансформированного фенотипа и роста
неопластических клеток ^^ ^ ' '
В культурах гепатоцитов на взрослой пнтактной печени мышей при
различиь,х условиях культивирования наблюдается строгая обратная
корреляция между ре-экспрессией раково-эмбрионального белка и
уровнем диффузионной межклеточной связи. Специфический
промотор гепатоканцерогенеза ДДТ в этих культурах вызывает
снижение уровня связи и увеличение синтеза АФП в одних и тех же
клетках Эти результаты позволяют рассматривать проницаемые
межклеточные контакты наряду с эпителиальной формой клетки в
качестве одного из осн^вньи элементов системы тканевого уровня
регуляции синтеза АФП в гепатоцитах
При этом необходимо отметить следующее обстоятельство. При
воздействии ДДТ эффеюгивными в отношении синтеза АФП являются
только такие дозы промотора, при которых межклеточная
диффузионная связь сохраняется в плотных, морфологически более
устойчивых, областях клеточной культуры и утрачивается в
разреженной периферии, т е. когда возникает градиент межклеточной
связи Это происходит при использовании низких доз ДДТ и
длительного его воздействия (сутками) т е в условиях аналогичных
действию промотора in vivo. При более вьюоких дозах,, вызывающих
7!
общее (и обратимое) разобщение клеток, синтез АФП ингибируется.
Также и в монослойных культурах с градиентом клеточной плотности
наибольший синтез АФП наблюдается на границе плотного монослоя,
сохраняющего проницаемые конта1сгы, и разреженной зоны, где
происходит потеря межклеточной связи, т.е. в условиях возникновения
градиента связи как в пространстве, так и во времени. Аналогичная
морфологическая закономерность ре-экспрессии АФП наблюдается в
регенерирующей после отравления четыреххлориетьш углеродом
печени мышей - здесь синтез АФП возобновляется в узком
перинекротическом слое клеток Во всех этих случаях происходит
выход (выползание) клеток из клеточного пласта
Мы полагаем, что эти данные свидетельствуют о том, что в
механизме влияния межклеточных контактов на синтез АФП
существенным является не ингибирование межклеточной связи по
механизму перехода каналов щелевого контакта из открытого в
закрытое состояние, а нарушение целостности каналов при нарушении
дифинитивной структуры ткани.
Проницаемые межклеточные контакты в невозбудимь.х тканях
традиционно рассматриваются как пути диффузии функционально
значимых веществ из клетки в клетку. И это, очевидно, составляет их
бесспорную функцию. Однако из перечисленных выше фактов
возникает представление, что кониексоны на клеточной мембране
могут также играть роль своеобразного клеточного рецептора к
соседним клеткам при помощи которых клетка может получать
позиционную информацию о наличии и количестве гомологичных (а
может бь<ть и гетерологичных) соседних клеток В норме при
сохранении структурной целостности ткани полуканаль, (коннексоны)
каждой клетки состыкованы с полуканалами соседних клеток При
локальных нарушениях тканевой структуры на мембране появляются
свободные коннексоны которые как известно связаны с элементами
цитоскелета и следовательно информация об изменении их состояния
может перелаваться ВНУТРШ клетки Помимо этого коннексоны
становятся noCTvn„«MH возпействиям извне от котопых они были
изопиповянь, ппи сохпанении стт,vктvpы полого KZL
R nnnb3v
группы Яма^Г(Кг^^^^^^
печени человека снижение уровня межклеточной связи происходило
без изменения уровня экспрессии гена и белка коннексина 32, и без
уменьшения интенсивно<ли окрашивания при иммунной реакции, с
антителами к Сх32. Однако, если в нормальной ткани и в
доброкачественных опухолях сх32 обнаруживался в области контакта с
соседними клетками, то в малигнизированных опухолях он находился,
главным образом, в областях плазматической мембраны, свободных от
контакта с соседними клепсами.
В нашей работе рассмотрены также .1екоторые физиологические
регуляторь. межклеточной связи - арахидоновая кислота и СО2. Они
оказывают быстрое (мр,нуты) обратимое ингнбирующее действие на
межклеточные контакты. При этом реализуется, очевидно, именно
механизм регуляции контактной проводимости за счет перехода
кокалов из открытого в закрытое состояние.
Мы надеемся, что полученные нами данные конкретизируют и
подтверждают представление о вовлеченности диффузионных межкле­
точных контактов как в регуляцию фенотипа дифференцированных
клеток, так и в процессы малигнизации.
8. ВЫВОДЫ
1. Электротонический потенциал, приложенный внутриклеточно,
распространяется равномерно во все стороны от точки поляризации
на расстояние до 12-14 клеточных диаметров как в ткани
нормальной печени мышей, так и в трех штаммах перевиваемых
гепатом и в индуцированных канцергеном гепатомах мышей.
Расчет значений проводимости наружных и контактных ^,eмбран
клеток, проведенный на основе разработанных структурных
моделей, обнаружил идентичность этих величин в нормальной и
опухолевых тканях. Следовательно, в исследованных гепатомах не
происходит потери проницаемости межклеточных контактов для
неорганических ионов в основной массе клеток.
2. Неопластические мышиные фнбробласты линии L, в отличие от
нормальных фибробластов мыши, высоко резистентны к токсичес­
кому действию канцерогенного углеводорода ДМБА. Те же L
клетки становятся чувствительными к токсическому действию
канцерогена, если они растут в смеси с нормальными фибробластами: в смешанной культуре ДМБА значительно снижает количество
L клеток и синтез ДНК в оставшихся клетках L. Эти изменения
идентичны изменениям, наблюдаемым в культуре нормальных
фибробластов при действии ДМБА.
73
3. Изменение чувствительности к канцерогену у L клеток в смешанной
культуре является ciporo локальным эффектом: Ьклетки, растущие
в той же культуре, но не контактирующие с нормальными
фнбробластами, остаются резистентными к ДМБА. Между
нормальными фнбробластами и L клетками образуются
проницаемые межклеточные контакты, в то время как они
отсутствуют в однородной культуре L клеток.
4. Обнаружен новый фактор, индуцирующий мелослеточную связь в
установившихся линиях эпителиальных клеток, исходно не
связанных проницаемыми межклеточными контактами - облучение
клеток светом длиной волны 300-480 нм и интенсивностью 100-300
мВт/см2. Условия такого облучения создаются при изучении
межклеточной связи широко распространенным методом внутри­
клеточных флуоресцентных меток.
5. Арахидоновая кислота обратимо блокирует межклеточную
диффузионную связь в культуре опухолевых клеток. Эффект
сопровождается снижением внутриклеточного рН на 0,1-0,2
единиць, и повышением концетрации внутриклеточного кальция до
100-200 нМ. Такое незначительное изменение кониентрацн!* этих
внутриклеточных регуляторов межклеточнь.х каналов не может
объяснить ингибирующее действие АК на межклеточную связь.
Высказываегся гипотеза
что эффект АК состоит в ее
непосредственном действии на контактную мембрану
6. Исходно не образующие проницаемых межклеточных контактов
опухолевые клетки HeLa, трансфицированные генами коннексинов
Сх32 и Сх26, демонстрируют высокий уровень межклеточной
диффузионной связи. В культурах HeLa Сх32 и HeLa Сх26 уровень
связи зависит от клеточной полотности и изменения состава среды
по мере культивирования. Межклеточные контакты клеток HeLa
Сх26 значительно более чувствительны к ингибирующему действию
СО, - физиологического регулятора межклеточной связи чем
клеток HeLa Сх32
7. В первичной монослойной культуре гепатоцитов из интактной
печени взрослых мышей наблюдается отчетливая обратная
корреляция между уровнем межклеточной диффузионнной связи и
количеством клеток, синтезирующих раково-эмбриональнь.й белок
альфа-фетопротеин (АФП). Морфологические закономерности
обнаружения АФП и проницаемых контактов в культурах с
градиентом клеточной плотности позволяют говорить о феномене
74
контактного торможения синтеза АФП, который сопровождается
сохранег,ием межклеточной связи в областях культуры с высокой
плотностью.
i. Трехмернная организация культуры гепатоцитов при помощи
искусственного внеклеточного матрикса или ко-культивирования
гепатоцитов с эпителиальными клепсами печени приводит к
сохранению (н восстановлению) в культуре взрослого фенотипа
гепатоцита. В образующихся органотипических трабекулах
наблюдается эпителиальная- форма клеток, локализация доменспецифических антигенов и актина, характерная для взрослой
ткани 100% уровень межклеточной связи отсутствие АФПположительных клеток
. В культурах гепатоцитов специфический промотор гепатокаицерогенеза ДДТ снижает проводимость межклеточных контактов и
значительно увеличивает количество
АФП-продуцирующих
гепатоцитов. Этот эффект наблюдается при длительном действии
низких концентраций ДДТ, при которых проводимость межклеточ­
ных контактов сохраняется в морфологически устойч,1Вых областях
клеточной культуры и утрачивается в периферических зонах
1. Рассмотрена гипотеза о возможной роли ко.н.ексинов в процессе
обеспечения клекн позиционной информацией.
Э. ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРИАЦИИ
1. Божкова В.П., Бойцова Л.Ю., Ковалев С.А., Миттельман Л.А.,
Чайлахян Л.М., Шаровская Ю.Ю.. Шилянская Э.Н. (1970) Высокая
проницаемость контактных мембран - возможный механизм
межклеточного взаимодействия. В сб.: "Межклеточные взаимодей­
ствия в дифференцировке и росте". Наука, Москва, стр. 183-193.
2. Бойцова Л.Ю., Ковалев С.А., Чайлахян Л.М., Шаровская Ю.Ю.
(1970) Сравнительное исследование электрической связи клеток
нормальной печени и гепатом. Цитология, т. 12, стр. 1256-1265.
3. Бойцова Л.Ю., Ковалев С.А., Миттельман Л.А., Потапова Т.В.,
РывКИн Е.Н., Чайлахян Л.М., Шаровская Ю.Ю. (1971)
Сравнительное исследование проницаемости поверхностных и
. контактных мембран нормальных и трансформированных
фибробластов в культуре ткани. В сб.: "Биофизика мембран".
Каунас,T.I,стр.175-184.
4. Потапова Т.В., Шаровская Ю.Ю.. Ковалев С.А., Миттельман Л.А.,
• Чайлахян Л.М. (1972) Влияние ионного состава окружающей среды
75
на мембранный потенциал клеток L. Цитология, т. 14, N 11, стр.
1335-1341.
5. Mittdman L.A.. Sharovskava Ju.Ju.. Vasiliev Ju.M. (1972) Toxic effect
of 7,12-dimethylbenz-anthracene on neoplastic cells grown in mixed
cultures with normal fibroblasts. Int. J. Cancer, v. 10, pp. 667-674,
6. Миттельман Л.А., Шаровская Ю.Ю. (1972) Изменение чувствительносгги к 7,12-диметип-бензо(а)антрацену L клеток, растущих в
связи с нормальными фибробластами. Тезисы докладов 4
Международного биофизического конгресса, т.З, EXY, а2/3.
7. Васильев Ю.М., Миттельман Л.А., Шаровская Ю.Ю. (1973)
Токсическое
действие
7Л2-диметилбензоОантрацена
на
неопластические клетки штамма L, выращенные в смешанное!
культуре с нормальными клетками. Цитология, т. 15, N 1, стр. 67-72.
8. Шаровская Ю.Ю.. Миттельман Л.А., Смолянинов В.В. (1975)
Электрическая структура ткани нормальной печени. Цитология,
T.I7,N 12, стр. 1376-1382.
9. Беркннблит М.Б., Божкова В.П., Бойцова Л.Ю., Миттельман Л.А.,
Потапова Т.В., Чайлахян Л.В., Шаровская Ю.Ю. (1981)
Бысокопроницаемые контактные мембраны. Наука, Москва. 464
стр.
10. Шаровская Ю.Ю.. Миттельман Л.А., Смолянинов В.В., Чайлахян
Л.М. (1981) Бысокопроницаемые контакты и электрические
характеристики
ткани
нормальной
печени
и гепатом.
I.Бысокопроницаемые контакты в индуцированных гепатомах
мыши. Цитология, Т.23, N Ш, стр. 1142-1148.
П. Шаровская Ю.Ю., Миттельман Л.А., Смолянинов В.В., Чайлахян
Л.М. (1982) Высокопроницаемые контакты и электрические
характеристики ткани нормальной печени и гепатом. II
Структурная модель и рачет проницаемости мембран клеток
индуцированных гепатом мыши Цитология т24 N1 стр 26-34
12. Шаровская Ю.Ю., Марголис Л.Б. (1985), Образование высоко­
проницаемых контактов н морфологические изменения в культуре
эпителиальных клеток. ДАН СССР, т.281, N 1, стр. 233-235.
13. Шаровская Ю.Ю., Марголис Л.В., Комиссарчик Я.Ю., Снегиревская Е.С., Чайлахян Л.М. (1987) Индукция высокопроницаемых
межклеточных контактов в культуре эпителиальных клеток. Биол.
Мембр.,Т.4,N3, стр. 298-314.
14. Глейберман А.С., Левин С.А., Чайлахян Л.М., Шаровская Ю.Ю.
(1987) Синтез а-фетопротеина и Бысокопроницаемые межклеточные
76
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
контакты в культуре взрослых мышиных гепатоцигов. ДАН СССР,
т, 296, N 5, сггр. 1243-1245.
SharovskaiaYu.Yu.. Chailakhjan L.M., Margolis L.B. (1988) Induction
of intercellular communications in epithelial cell culture. Exp. Cell Res.,
V. 175, N2, pp. 404-408.
Шаровская Ю.Ю.. Бойцова Л.Ю., Чайлахян Л.М. (1988) Высоко.,роницаемь.е контакты и электрические характеристики ткани
нормальной печени и гепатом. III. Отсутствие влияния опухолевого
промотора фенобарбитала на межклеточные контакты в печени
мыши. Цитология, т.ЗО, N 6, стр. 678-684.
Глейберман А.С., Шаровская Ю.Ю.. Кудрявцева Е.И. (1988)
Регуляция синтеза альфа-фетопротеина в культурах гепатоцитов
взрослых мышей. Цитология, т.ЗО, N 9, стр. 1126.
Gleiberraan A.S., Sharovskaya Yu.Yu.. Chailakhjan L.M. (1989)
"Contact inhibition" of -a-fetoprotem synthesis and junctional
communication. Exp. Cell Res., v. 184, pp. 229-234.
Gleiberman A.S., Kudrjavtseva E.I., Sharovskaya Yu.Yu., Abelev G.I.
(1989) Synthesis of alpha-fetoprotein in hepatocytes is co-ordinately
regulated with cell-cell and cell-matrix interactions. Mol. Biol. Med., v.
6, pp. 95-107.
Gleiberman A.S., Kudrjavtseva E.I., Sharovskaya Yu.Yu., Abelev G.l.
(1989) Cell-cell and cell-matnx interactions are involved in the regulation
of alpha-fetoprotein synthesis in hepatocytes. In: Regulation of liver gene
expresion. Cold Spring Harbor, New York, p. 209.
Gleiberman A.S., Kudrjavtseva E.I., Sharovskaya Yu.Yu., Abelev G.I.
(1989) Regulation of alpha-phetoprotein synthesis in mouse hepatocytes
in vitro. In: "89 Sapporo cancer seminars", Sapporo, p. 50.
Глейбериан A.C. и Шаровская Ю.Ю. (1990) Высокопроницаемые
контакты и экспрессия фетального фенотипа во взрослом
гепатоците. В кн. "Механизмы детерминации", ред. А.И.Зотин,
Наука, Москва,
Gleiberman A.S., Kudrjavtseva E.I., Sharovskaya Yu.Yu. and Abelev
G.I. (1990) Tissue mechanisms involved in the regulation of AFP
synthesis. In: Abstract Book of XVIII Meetmg of the International
Society for Oncodevelopment Biology and Medicine Moscov, p.7.
Sharovskaya Yu.Yu.. Gleiberman A.S., Kudrjavtseva E.I. (1991)
Intercellular communication and alpha-fetoprotein synthesis in adult
hepatocyte culture. In: Intercellular communication, Ed.: F.Bucauskas,
Manchester University Press, Manchester and New York, p. 91-106.
77
25. Staroverov D.B., Krutovskikh V.A., Kudryavtseva E.I., Sharovskava
Yu.Yu., Gleiberman A.S. (1991) Gap junctional communication and
production of alpha-fetoprotein in adult mouse liver. Онтогенез, т.22, N
4 crp.427-428.
26. Zempel G., Dunina-Barkovskaya A.Y., Muravyova O.V., Sharovskaya
Yu.Yu., Margolis L.B., Weber M, Hlser D.F. (1992) Polyunsaturated
fatty adds reversibly reduce gap junctions communication by direct lipidprotein interactions. Abstr. Book, of the Annual Meeting of the German
Biophysics Society, Osnabrueck, Germany, p.l31.
27. Zempel G., Reuss B.,Suhr D., Hlser D.F, Sharovskava Yu.Yu..
Muravjova O.V., Dunina-Barkovskaya A., Margolis L.B. (1993)
Arachidonic acid reversibly reduces gap junctional permeability.
Abstracts, International Meeting on Gap Junctions, Hiroshima, Japan,
p. 115.
28. Хюльзер Д., Цемпель Г., Ройс Б., Зур., Шаровская Ю.Ю.. Муравьева
О.В., Дунина-Барковская А.Я., Марголис Л.Б. (1994) Арахидоновая
кислота обратимо блокирует высокопроницаемые межклеточные
контакты. Биологич.мембраны,т..1,N 1,стр.50-61
29. SharovskavaYu.Yu.. Gleiberman A.S., Chailakhyan L.M. (1994) Effect
of tumor promoters on the intercellular communication and alphafetoprotein synthesis in primary culture of mouse hepatocyles. Abstracts,
Workshop on intercellular communication, Pushcino, Moskow region,
Russia p.82.
30. Zempel G.,Reuss В., Suhr D., Huelser D.F., Sharovskava Yu.Yu..
Muravjova O.V,, Dunina-Barkovskaya A.Ya., Margolis L.B. (1995)
Arachidonic acid reversibly reduces gap-junctional permeability.
Progress in Cell Research. Intercellular Communication through Gap
Junctions. Elsevier, Amsterdam - Lausanne - New York - Oxford Shannon-Tokyo, Vol.4, pp.447-450.
31. Ecker R, Dunina-Barkovskaya A.Y., Sharovskava Y.Y.. Knsciukaitis A.,
Hlser D.F. (1995) Regulation of mouse 0x32 transfe'cted into a human
cell line. Abstracts, 1995 Cap Junction conference, France.
32. Дунина-Барковская А.Я., Шаровская Ю.Ю.. Эккерт P., Хюльзер
Д.Ф. (1995) Регуляция межклеточных контактов в культуре клеток,
трансфицированных геном коннексина 0x32. Молекулярная
биология, т.29, стр. 1349-1358.
78
СОДЕРЖАНИЕ
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1 Актуальность проблемы
.1.2 Цель и задачи исследования
1.3 Научная новизна работы
1.4 Научно-практическая данность работы
1.5 Апробация работы
1.6 Публикации
1.7 Положения, выносимые на защиту
1.8 Благодарности
2. ЭЛЕКТРИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА ТКАНИ НОРМАЛЬНОЙ
ПЕЧЕНИ МЫШЕЙ И ГЕПАТОМ РАЗЛИЧНОЙ
ЭТИОЛОГИИ
2.1 Материалы н методы
2.2 Системные электрические характеристики ткани печени и
гепатом
2.3 Структурные модели тка.ги печени и нидуцироваииы.х
гепатом мыши
2.4 Расчет удельных сопротивлений наружных и контакл.ых
мембран клеток печени и гепатом
.".
3. ИЗМЕНЕНИЕ ФЕНОТИПА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
ПРИ ИХ ЛОКАЛЬНОМ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С
НОРМАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ В КУЛЬТУРЕ
3.1 Материалы и методы
3.2 Влияние ДМБА на клеточную плотность в культурах НФ
и L клеток
3.2.1 Морфологические изменения в культурах
3.2.2 Опыты с предварительно меченными клетками L
3.3 Влияние ДМБА на синтез ДНК в культурах НФ и L
клеток
3.4 Специфичность действия ДМБА на L клетки в смешанной
культуре
3.5 Проницаемость межклеточных контактов
4. ФАКТОРЫ, МОДУЛИРУЮЩИЕ ПРОНИЦАЕМОСТЬ
МЕЖКЛЕТОЧНЫХ КОНТАКТОВ
4.1 Материалы и методы
4.2 Индукция межклеточной связи в культуре эпителиальных
клеток
79
I
1
3
4
5
6
7
7
8
9
9
II
15
18
23
23
24
24
25
26
28
29
32
32
34
5.
6.
7.
8.
9.
4.3 Действие арахидоновой кислоты на проводимость
межклеточных контактов
38
РЕГУЛЯЦИЯ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ КОНТАКТОВ В
КУЛЬТУРАХ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК,
ТРАНСФИЦИРОВАННЫХ ГЕНАМИ КОННЕКСИНОВ
41
5.1 Материалы и методы
41
5.2 Зависимость уровня межклеточной связи от клеточной
плотнос^ги Б культурах клеток HeLa Сх32 и HeLa Сх2б
42
5.3 Эффект С02
48
ПРОНИЦАЕМЫЕ МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ КОНТАКТЫ И
ЭКСПРЕССИЯ РАКОБО-ЭМБРИОНАЛЬНОГО БЕЛКА
АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА В КУЛЬТУРАХ ВЗРОСЛЫХ
ГЕПАТОЦИТОВ
54
6.1 Предпосылки к постановке задачи
54
6.2 Материалы и методы
55
6.3 Поницаемые межклеточные контакты и экспрессия АФП
в монослойных культурах гепатоцитов
57
6.4 Контактное торможение синтеза АФП в культурах
гепатоцитов
58
6.5
Стабилизация взрослого фа.отипа гепатоцнта при •
трехмерной организации клеточной культуры
60
6.5.1 Ко-культуры
60
6.5.2 Культивирование гепатоцитов внутри коллагенового
геля
65
6.6 Влияние опухолевых промоторов пг проницаемость
межклеточных контактов и синтез АФП
66
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
71
ВЫВОДЫ
73
ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
75
80
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа