close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

https://www.cci.by/sites/default/files/files/11_ Белорусский;ppt

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Володько Александра Викторовна
Полиэлектролитные комплексы хитозан-каррагинан
02.00.10 − Биоорганическая химия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Владивосток – 2014
Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической
химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН
Научный
руководитель:
доктор химических наук, старший научный сотрудник
Ермак Ирина Михайловна
Официальные Варламов Валерий Петрович
доктор химических наук, профессор,
оппоненты:
зав. лабораторией инженерии ферментов
Центра «Биоинженерия» РАН
Попов Сергей Владимирович
доктор биологических наук, доцент,
зав.
отделом
молекулярной
иммунологии
и
биотехнологии Института физиологии Коми научного
центра УрО РАН
Ведущая
организация:
Тихоокеанский научно-исследовательский
рыбохозяйственный центр (ТИНРО-Центр),
г. Владивосток
Защита состоится « »
2014 года в 10 часов на заседании
диссертационного совета Д 005.005.01 при Тихоокеанском институте
биоорганической химии им. Г. Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022,
г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН.
Факс: (423) 231-40-50, e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной
научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет
Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).
Текст диссертации и автореферата размещен на сайте
www.piboc.dvo.ru
Автореферат разослан
« »
Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат биологических наук
2014 года
Черников О. В.
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования. Одной из актуальных задач
современной биологии и медицины является создание новых композитных
материалов с широким спектром биологической активности и минимальным
побочным действием. В последние годы для их получения используются как
синтетические, так и природные полимеры, в зависимости от структуры которых
могут формироваться стехиометрические или нестехиометрические композиты в
виде раствора, геля, нано- и микрочастиц, пленок, мембран, и
жидкокристаллических дисперсий. В создании таких полимерных систем особая
роль отводится полиионным полисахаридам морского происхождения благодаря
их биоразлагаемости, биосовместимости, доступности и разнообразной
биологической активности. Способность противоположно заряженных
полиионов образовывать полиэлектролитные комплексы (ПЭК) открывает
возможность создания на их основе различного рода биологически активных
композитов.
Среди полианионных полисахаридов важное место занимают
каррагинаны – линейные сульфатированные полисахариды красных водорослей,
построенные из остатков D-галактозы и ее производных, соединенных β-(1→4) и
α-(1→3) гликозидными связями. Структурное разнообразие каррагинанов
обусловлено
присутствием
β-(1→4)-связанной
3,6-ангидрогалактозы,
местоположением и количеством сульфатных групп и нерегулярной или
гибридной структурой полисахарида. Каррагинаны обладают уникальными
физико-химическими свойствами и разнообразной биологической активностью,
в том числе выраженной антивирусной, антимикробной, иммуномодулирующей
и антикоагулирующей.
Хитозан – природный поликатионный линейный полисахарид,
полимерная цепь которого состоит из β-(1→4)-связанных остатков
D-глюкозамина и N-ацетил-D-глюкозамина. К настоящему времени установлено,
что хитозан обладает широким спектром биологической активности, в том числе
гиполипидемической,
гепатопротекторной,
радиопротекторной,
антибактериальной и противовирусной.
Биологические и физико-химические свойства ПЭК, полученных на
основе каррагинанов и хитозанов, могут существенно отличаться от свойств
исходных полимеров и будут зависеть, как от структурных особенностей
полисахаридов (молекулярной массы, плотности заряда, распределения
ионизированных групп вдоль полимерной цепи, конформации в растворе и
макромолекулярной организации), так и от условий, при которых происходит
образование комплексов.
Сокращения, используемые в тексте: АСМ – атомно-силовая микроскопия; ВТМ –
вирус табачной мозаики; ДРС – динамическое рассеяние света; ИК – инфракрасный; ИП –
индекс Паулса; К – каррагинан; ММ – молекулярная масса; ПЭК – полиэлектролитный
комплекс; СА – степень N-ацетилирования; СС – степень сульфатирования; ТИ –
тиксотропный индекс; ФНО – фактор некроза опухоли; Х – хитозан; ЯМР – ядерный
магнитный резонанс.
3
Изучение влияния всех этих факторов позволит дополнить представление о
механизме образования ПЭК и расширит возможности получения новых
композитных материалов с заданными физико-химическими характеристиками и
биологической активностью. Наличие в нашем распоряжении ряда каррагинанов
различных структурных типов с одной стороны и хитозанов разной степени
N-ацетилирования и полимеризациии с другой, позволит получить широкий
набор ПЭК и выбрать наиболее эффективные из них.
Получение растворимых форм комплексов каррагинан-хитозан позволит
расширить возможности применения ПЭК и увеличить их биодоступность. В
связи с этим, в данной работе основное внимание уделено получению
растворимых форм ПЭК каррагинана с хитозаном и изучению их состава,
макромолекулярной организации и биологической активности.
Целью диссертационной работы является получение и характеристика
полиэлектролитных комплексов каррагинан-хитозан, изучение влияния
структурных особенностей полисахаридов на процесс формирования
комплексов, а также экспериментальное обоснование возможности
использования
полиэлектролитных
комплексов
для
биомедицинского
назначения.
Основные задачи диссертационной работы:
1. Получить и охарактеризовать каррагинаны различных структурных типов и
хитозаны с разной степенью N-ацетилирования и полимеризации;
2. Подобрать условия образования растворимых комплексов каррагинанхитозан;
3. Изучить влияние на процесс формирования комплексов структуры и
молекулярной массы полисахаридов, концентрации и соотношения исходных
компонентов, а также условий среды;
4. Охарактеризовать полученные ПЭК (определить их размер, ζ-потенциал,
константы
связывания
каррагинана
с
хитозаном
и
изучить
макромолекулярную организацию комплексов);
5. Получить гелевые формы ПЭК и оценить их реологические свойства;
6. Изучить биологическую активность полученных комплексов в сравнении с
исходными полисахаридами.
Научная новизна работы. Впервые охарактеризованы растворимые
ПЭК каррагинан-хитозан (К-Х), полученные на основе каррагинанов различных
структурных типов с хитозанами разной степени N-ацетилирования и
полимеризации. Показано влияние структурных особенностей полисахаридов на
процесс формирования комплексов. Впервые определены константы связывания
каррагинана с хитозаном, методом компьютерного моделирования рассчитаны
теоретические модели пространственных структур комплексов. Впервые
методом атомно-силовой микроскопии изучена надмолекулярная структура
комплексов К-Х, и показана ее зависимость от соотношения исходных
компонентов.
Впервые
показано,
что
комплексы
К-Х
обладают
гастропротекторной активностью, которая зависит от их состава.
Практическая значимость работы. На основе полисахаридов морских
гидробионтов создано средство, обладающее гастропротекторной активностью и
4
представляющее собой водорастворимый ПЭК каррагинана с хитозаном при
соотношении Х:К 10:1 в/в. Показано, что парентеральное введение ПЭК
каррагинан-хитозан экспериментальным животным достоверно снижает
выраженность воспалительной реакции организма, индуцированной гистамином.
Полученный ПЭК может найти применение в медицине для профилактики и
лечения язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, а также для
снижения
побочного
ульцерогенного
действия
нестероидных
противовоспалительных средств и других лекарственных препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Подобраны условия для получения комплексов каррагинан-хитозан в
растворимой и гелевой форме.
2. Образование растворимых ПЭК в широком диапазоне соотношений
исходных
компонентов
определяется
степенью
сульфатирования
каррагинанов и степенью N-ацетилирования хитозанов.
3. Высокосульфатированный x-К полностью связывается с хитозанами
различной степени полимеризации, а хитозан с низкой степенью
полимеризации полностью связывается с каррагинанами (κ-К и x-К).
4. Гелевые формы полученных ПЭК представляют собой неньютоновские
псевдопластичные жидкости с тиксотропными свойствами.
5. Макромолекулярная структура ПЭК зависит от концентрации и соотношения
исходных полисахаридов.
6. Комплексы с высоким содержанием каррагинана проявляют цитокининдуцирующую, антивирусную и антиоксидантную активности in vitro.
7. ПЭК каррагинан-хитозан снижают выраженность воспалительной реакции,
индуцированной гистамином, и проявляют гастропротекторную активность,
которая зависит от их состава.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены
автором в виде устных и стендовых сообщений на XIII и XIV Всероссийской
молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии
(Владивосток, Россия, 2010, 2012); «Renewable wood and plant resources:
chemistry, technology, pharmacology, medicine» (Санкт-Петербург, Россия, 2011);
«2nd International symposium on life sciences» (Владивосток, Россия, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в
международных журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 7 тезисов докладов в
материалах научных конференций.
Диссертация обсуждена и одобрена на расширенном заседании отдела
молекулярной иммунологии ТИБОХ ДВО РАН 18 февраля 2014 г.
Личный
вклад
соискателя
в
проведение
исследования.
Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены
лично автором и совместно с сотрудниками ЛМОАБИ и других лабораторий
ТИБОХ ДВО РАН, а также совместно с сотрудниками ИАПУ ДВО РАН и
НИОХ СО РАН. На защиту вынесены только те положения и результаты
экспериментов, в получении которых роль соискателя была определяющей.
Структура и объем диссертации. Диссертация содержит разделы:
Введение, Литературный обзор, Результаты и обсуждение, Материалы и методы,
5
Выводы и Список литературы, включающий 217 наименований. Диссертация
изложена на 137 страницах. Результаты представлены в 18 таблицах и
иллюстрированы 30 рисунками.
Автор выражает искреннюю благодарность своему руководителю д.х.н.
И.М. Ермак за неоценимую помощь в выполнении диссертационной работы,
к.х.н. В.Н. Давыдовой, к.х.н. В.И. Горбачу за любезное предоставление образцов
полисахаридов и помощь при проведении экспериментов, д.х.н. Т.Ф. Соловьевой
и всем сотрудникам ЛМОАБИ ТИБОХ ДВО РАН, В.П. Глазунову за получение
и помощь в интерпретации ИК-спектров, д.б.н. А.В. Реунову и к.б.н. В.П.
Нагорской за проведение экспериментов по антивирусной активности
полисахаридов и их комплексов, к.ф-м.н. Г.Н. Лихацкой за компьютерное
моделирование взаимодействия каррагинана с хитозаном. Сотрудникам ИАПУ
ДВО РАН к.ф-м.н. Е.А. Чусовитину и С.А. Балагану за предоставление
возможности проведения экспериментальных работ на атомно-силовом
микроскопе и помощь в интерпретации результатов, а также сотрудникам НИОХ
СО РАН д.б.н. И.В. Сорокиной, д.б.н. Т.Г. Толстиковой и М.П. Долгих за
проведение экспериментов по изучению биологической активности in vivo.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Получение и характеристика исходных компонентов комплекса
Понимание процесса взаимодействия биополимеров невозможно без
характеристики каждого из компонентов в отдельности. Поэтому, прежде чем
приступить к исследованию взаимодействия каррагинана с хитозаном,
полисахариды были получены и охарактеризованы (таблица 1).
В работе использовали образцы полисахаридов различных типов: κ-, κ/β
и λ-каррагинаны (κ-К, κ/β-К и λ-К), структура которых была ранее установлена в
Лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета ТИБОХ
ДВО РАН. Как было показано, желирующий каррагинан выделенный из
водоросли Tichocarpus crinitus относится к гибридному κ/β-К, тогда как
модифицированный нежелирующий полисахарид, содержащийся в небольших
количествах в стерильной форме этой водоросли, был отнесен к новому
структурному типу, обозначенному как x-каррагинан (x-К). Так как
количественный и качественный полисахаридный состав красных водорослей
зависит от стадии их развития, для уточнения структуры нежелирующего типа
каррагинана в настоящей работе был выделен и изучен сульфатированный
полисахарид из водоросли T. crinitus, находящейся в репродуктивной стадии
развития. Он представлял собой каррагинан, структура которого, по данным ИК
и ЯМР-спектроскопии, а также МАЛДИ-спектрометрии, была идентична
структуре x-К.
В качестве поликатиона в работе использовали пять образцов хитозана:
3 образца хитозана с высокой ММ со степенью N-ацетилирования (СА) 1%, 6% и
17%, полученные методом щелочного N-дезацетилирования хитина, и 2 образца
хитозана с низкой ММ и СА 1% и 11%, полученные методом химической
деполимеризации с использованием перекиси водорода.
6
Средневязкостные ММ полисахаридов (таблица 1), были рассчитаны на
основании измеренного значения характеристической вязкости согласно
эмпирическому уравнению Марка-Хаувинка-Куна.
Таблица 1 – Физико-химические характеристики полисахаридов
Степень
ХарактеристиПолиММ,
ческая вязкость
сульфатирования на
сахарид
кДа
[η], мл/г
дисахаридное звено
κ/β-К
0.619×103
380
0.6
κ-К
κ-К
x-К
λ-К
Х-300
Х-130
Х-110
Х-11
Х-17
3
311
550
527
650
300
130
110
11
17
1
1
2
3
0.512×10
0.885×103
0.845×103
1.035×103
0.225×103
0.105×103
0.089×103
0.011×103
0.015×103
N-ацетилирования, %
17
1
6
1
11
2. Подбор условий для получения растворимых ПЭК каррагинан-хитозан
Для подбора условий получения растворимых комплексов К-Х
использован метод турбодиметрического титрования, основанный на
регистрации мутности раствора. Проведен анализ формирования комплексов в
зависимости от способа их приготовления, состава буфера, структуры
каррагинана и хитозана, концентрации и соотношения исходных компонентов.
Формирование осадка в смеси полисахаридов выражалось в резком увеличении
мутности раствора (τ). Значение τ≤5 соответствовало растворимым комплексам,
τ>5 – нерастворимым комплексам. На представленных рисунках граница
образования растворимых комплексов обозначена звездочкой (*).
Как показали экспериментальные данные (рис. 1), процесс
формирования комплексов зависит от способа их получения. При титровании
одного компонента другим (способ I) растворимые комплексы формировались в
очень узком диапазоне соотношений Х:К (до соотношения Х:К 6:1 моль/моль
при низкой концентрации каррагинана (0.1 мг/мл)). При этой же концентрации
каррагинана и смешивании заданных соотношений исходных компонентов
(способ II) растворимые ПЭК К-Х получались во всем исследованном диапазоне
соотношений Х:К (от 0.1:1 до 30:1 моль/моль). При более высоких
концентрациях полианиона (Cк = 0.5 и 1 мг/мл) растворимые комплексы
формировались в более узком диапазоне соотношений К:Х. Процесс
образования комплекса незначительно зависел от времени и состава буфера.
Постоянное значение мутности достигалось после часа инкубации смеси при
25°C и не изменялось в течение 24 ч.
7
а
100
80
3
2
60
100-T (%)
100-T (%)
80
40
20
0
б
100
1
0 1 2 3 4 5 10
20
30
40
50
60
40
3
21
20
*
60
0
0
1
2
5 10 15 20 25 30
*
Соотношение Х:К, моль/моль
Рисунок 1 – Зависимость мутности смесей κ-К с Х-130, полученных способом I
(а) и способом II (б), от соотношения Х:К
1 – Cκ-К= 0.1 мг/мл, 2 – Cκ-К= 0.5 мг/мл, 3 - Cκ-К= 1 мг/мл
100 - T(%)
Для изучения влияния структурных особенностей полианиона на
формирование ПЭК использовали три типа каррагинана: κ-К, κ/β-К и x-К,
различающиеся СС и Х-130 (рис. 2).
7
6
5
4
3
2
1
0
а 35
б 80
30
*25
1 20
2
15
3
10
5
0 1 2 3 4 5 10 20 30 40 50 00 2 4 6
1
в
60
40
1
20
2 3
3
*0
2
*
0 1 2 3 4 5 10 20 30 40 50
100 200
Соотношение Х:К
К:Х, моль/моль
Рисунок 2 – Зависимость мутности смеси каррагинана с Х-130 от соотношения
Х:К: а – CК = 0.1 мг/мл; б – CК= 0.5 мг/мл; в – CК = 1 мг/мл
1 – x-К:Х-130; 2 - κ-К:Х-130; 3 – κ/β-К:Х-130
Как видно из рисунка 2а, при Cк = 0.1 мг/мл κ-К и κ/β-К образуют с
Х-130 растворимые комплексы во всем исследованном диапазоне молярных
соотношений. В случае x-К наблюдается формирование осадка при
соотношениях Х:К от 20:1 и 25:1 моль/моль. При увеличении концентрации
каррагинанов в смеси до 1 мг/мл преимущественно образуются нерастворимые
комплексы (рис. 2б, в). При этом диапазон молярных соотношений Х:К, при
которых образуется растворимый ПЭК, для x-К несколько шире, чем для κ-К и
κ/β-К, что, вероятно, обусловлено как высокой СС этого типа каррагинана, так и
его конформацией в растворе. Полученные в данных условиях ПЭК оставались
стабильными в течение 24 ч.
8
100 - T(%)
30
25
20
15
10
5
0
2
б
а
30
25
20
15
10
5
1*
0
0 10 20 30 50 100 150
2
3
3*
0 10 20 30
100
200
35
30
25
20
15
10
5
0
4
в
1
*
0 5 10 15 20 25 30 35
Х:К моль/моль
Соотношение К:Х,
Рисунок 3 – Зависимость мутности смеси каррагинана с хитозаном от молярного
соотношения Х:К: а – влияние ММ хитозана, б – влияние СА хитозана,
в – влияние ММ каррагинана
1 – κ-К-311:Х-130; 2 – κ-К-311:Х-11; 3 – κ-К-311:Х-17; 4 – κ-К-550:Х-130
ММ и СА хитозана играют важную роль в образовании растворимых
ПЭК. Как видно из рисунка 3а, снижение ММ хитозана сопровождается
увеличением интервала образования растворимых комплексов до соотношения
Х:К 30:1 моль/моль. В случае снижения ММ κ-К (рис. 3в) интервал образования
растворимых комплексов меняется незначительно. Увеличение СА хитозана
изменяет характер формирования комплекса (рис. 3б, кривая 3) - вначале
наблюдается увеличение мутности реакционной смеси, а затем ее уменьшение и
образование растворимых комплексов.
Таким образом, согласно данным турбодиметрического титрования,
образование растворимых комплексов зависит от способа их получения,
структуры и концентрации каррагинана, ММ и СА хитозана, а также
соотношения исходных компонентов.
3. Характеристика образования растворимых комплексов К-Х
Метод турбодиметрии позволяет быстро следить за формированием
ПЭК, однако не дает информации о полноте связывания компонентов в
комплексе, что является важным параметром процесса взаимодействия. Для
регистрации образующихся комплексов в данной работе использовали методы
гель-проникающей хроматографии и центрифугирования в градиенте перколла.
3.1. Гель-проникающая хроматография
На рисунке 4 представлены результаты гель-проникающей
хроматографии исходных полисахаридов: Х-130, κ-К, κ/β-К и их смесей в
соотношении Х:К 10:1 в/в.
9
0.25
0.20
A535/475 нм
а
3
2
0.15
1 б
0.15
0.12
1
0.06
0.05
0.03
в
0.12
0.09
0.10
1
0.15
0.09
2
3
0.06
0.03
0.00
0.00
0.00
0 10 20 30 40 50 60 70 80
0
0 20 40 60 80 100 120
V, мл
30 60 90 120 150
Рисунок 4 – Гель-проникающая хроматография полисахаридов и их смесей при
соотношении Х:К 10:1 в/в: а – исходные полисахариды; б – κ-К:Х;
в – κ/β-К:Х; 1 – Х-130; 2 – κ-К; 3 – κ/β-К
Анализ кривых показывает, что Х-130 представляет собой гомогенный
по ММ полисахарид. Профили элюции для κ-К и κ/β-К свидетельствуют о
высокой ММ полианионов, что соответствует данным вискозиметрии (таблица
1). Совпадение максимумов выходных кривых для смесей κ-К с Х-130 (рис. 4б) и
κ/β-К с Х-130 (рис. 4в) указывает на образование комплекса, помимо этого
остается часть свободных полисахаридов.
3.2. Центрифугирование в градиенте перколла
Наиболее информативным методом регистрации формирования
комплексов является метод градиентного центрифугирования, позволяющий
разделять макромолекулы в соответствии с их плавучей плотностью. Этим
методом были проанализированы смеси двух образцов хитозана (Х-130 и Х-17) с
тремя типами каррагинанов: κ-К, κ/β-К и x-К.
а
A
475 нм
0.8
1
A
535 нм
0.25
б
4
0.20
0.6
2
0.4
0.10
0.2
3
0.15
5
0.05
0.0
0
2
4
6
8 10 12 14
0.00
0
2
Номер фракции
4
6
8 10 12 14
Рисунок 5 – Результаты центрифугирования в градиенте перколла: а содержание аминогрупп хитозана, б – содержание сульфатных групп
каррагинана; 1 – Х-130; 2 – Х-17; 3 – x-К; 4 – κ-К; 5 – κ/β-К
10
Как можно видеть из рисунка 5, Х-130, κ/β-К и х-К представляют собой
гомогенные полисахариды, тогда как Х-17 и κ-К в условиях центрифугирования
разделяются на две фракции. Совпадение максимумов кривых распределения
компонентов для смеси Х-130 с κ/β-К (Х:К 10:1 в/в), представленных на рисунке
6, указывает на образование комплекса. Наряду с комплексом в растворе
присутствуют свободный Х-130 и κ/β-К.
1
A535/475 нм
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0.00
2
0
2
4
6
8 10 12
Номер фракции
Рисунок 6 – Результаты центрифугирования в градиенте перколла смеси κ/β-К с
Х-130: 1 – Х-130; 2 – κ/β-К
В случае смесей κ-К с Х-130 (рис. 7), независимо от соотношения Х:К,
образуются два типа комплекса с разной плавучей плотностью. На это указывает
совпадение максимумов кривых распределения Х-130 и κ-К. Наряду с этим, при
высоком содержании полианиона в смеси остается несвязанный κ-К, а при
избытке Х-130 – хитозан.
0.12
а
б
0.05
в
A535/475 нм
0.12
2
0.10
0.09
0.08
0.03 1
2
0.06
0.06
0.02
2
0.04
0.03
0.01
0.02
1
0.00
0.00
0.00
0 2 4 6 8 10 12 14
0 3 6 9 12 15 18
0 2 4 6 8 10 12 14
1
0.04
Номер фракции
Рисунок 7 – Результаты центрифугирования в градиенте перколла смеси κ-К с
Х-130: а – Х:К 10:1 в/в; б – К:Х 10:1 в/в; в – К:Х 2:1 в/в; 1 – Х-130; 2 – κ-К
При взаимодействии высокосульфатированного каррагинана (x-К)
наблюдается полное связывание полисахаридов с образованием двух типов
комплекса (рис. 8), о чем свидетельствует совпадение максимумов кривых
распределения x-К и Х-130.
11
а
A535, 475 нм
0.25
1
0.20
0.08
б
2
0.06
0.15
0.04
0.10
2
0.05
0.00
0
0.02
3
6
9
1
0.00
0
12 15 18
3
Номер фракции
6
9
12 15 18
Рисунок 8 – Результаты центрифугирования в градиенте перколла смеси x-К с
Х-130: а – Х:К 10:1 в/в; б – К:Х 2:1 в/в; 1 – Х-130; 2 – x-К
В то же время снижение ММ хитозана (со 130 до 17 кДа) приводит к
полному связыванию поликатиона не только с x-К, но и с κ-К и образованию
двух типов комплексов (рис. 9). Однако в случае κ/β-К, имеющего низкую СС,
наряду с комплексом в растворе остается часть несвязанного каррагинана (рис.
9а).
0.25
A535/475 нм
2
0.20
0.15
а 0.5
0.2
0.05
0.1
3
6
9
12 15
0.0
0
4
в
0.10
0.08
0.3
1
0
б 0.12
0.4
0.10
0.00
3
1
0.06
0.04
3
6
9
1
0.02
12 15
0.00
0
Номер фракции
3
6
9
12 15 18
Рисунок 9 – Результаты центрифугирования в градиенте перколла смесей
каррагинана с Х-17 при соотношении К:Х 2:1 в/в: а – κ/β-К:Х-17; б – κ-К:Х-17;
в – x-К:Х-17; 1 – Х-17; 2 – κ/β-К; 3 – κ-К; 4 – x-К
Таким образом, результаты гель-проникающей хроматографии и
центрифугирования в градиенте перколла позволили установить, что каррагинан
с высокой СС (x-К) полностью связывается с хитозанами различной степени
полимеризации, а хитозан с низкой степенью полимеризации полностью
связывается с κ-К и x-К.
3.3. ИК-спектроскопия
Формирование ПЭК К-Х регистрировали методом ИК-спектроскопии
(рис. 10). Разложение ИК-спектра на индивидуальные компоненты позволило
оценить образование ПЭК вследствие связывания сульфатных групп
12
каррагинана с аминогруппами хитозана. Для этого были рассчитаны отношения
площадей полос поглощения при 1259 см-1 (валентные колебания ν(SO3−)) и при
842 см-1 (деформационные колебания δ(S−O−C(4)) как в исходном каррагинане,
так и в его комплексе с хитозаном.
1065
1259 1220
1215
2.0
1.5
1655 1593
0.5
3
2
1
0.0
1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 900 800 ν, см-1
Поглощение, от. ед.
б
1065
2.5
2.0
1259 1215
933
842
1.0
0.5
0.0
1400
933
842
1.0
3.0
1.5
а
2.5
1300
1200
1100
1000
900
800
2.0
Поглощение, от. ед.
Поглощение, от. ед.
3.0
ν, см-1
в
1071
1259
1220
1.5
927
1.0
846
0.5
0.0
1400
1300
1200
1100
1000
900
800
ν, см-1
Рисунок 10 – ИК-спектр: а – полисахаридов и их комплекса; б – ПЭК К-Х;
в – κ-К; 1 – хитозан; 2 – κ-К; 3 – ПЭК К-Х
Расчет показал, что для κ-К отношение (R) площадей полос S1259 и S842
равно 4.0, тогда как для комплекса К-Х отношение R = 1.7. Такое уменьшение
отношения площадей полос поглощения сульфатных групп в комплексе
приблизительно в два раза указывает на связывание этих групп κ-К с
аминогруппами хитозана.
4. Компьютерное моделирование 3D-структуры комплексов хитозана с κ-К
в растворе
Методами
компьютерного
моделирования
впервые
получены
теоретические модели 3D-структуры комплексов хитозана с κ-К в водной фазе.
Рассчитаны структуры 30 комплексов. На рисунке 11 представлена
полноатомная модель комплекса пентасахаридного фрагмента хитозана с κ-К с
наиболее низкой энергией.
13
1
2
Рисунок 11 – Полноатомная модель 3D- структуры комплекса пентасахаридного
фрагмента хитозана (1) с κ-К (2)
Как видно из таблицы 2, водородные и ионные связи аминогрупп
хитозана вносят наибольший вклад в энергию образования комплекса хитозана с
каррагинаном.
Таблица
2
–
Контакты,
стабилизирующие
пентасахаридного фрагмента хитозана с κ-К
структуру
комплекса
Лиганд
Рецептор
Связь
Расстояние, Ǻ
E, ккал/моль
O6 19
O3 46
N2 60
N2 60
O3 69
O3 115
O4 117
N2 12
N2 60
N2 60
O7 G4S 1
O7 DG 6
O7 DG 6
O8 DG 6
O1 DG 6
O7 G4S 1
O7 G4S 1
O9 DG 6
O7 DG 6
O8 DG 6
(B) водородная
(A) водородная
(A) водородная
(A) водородная
(A) водородная
(B) водородная
(B) водородная
(A) ионная
(A) ионная
(A) ионная
3.01
2.72
3.00
3.27
3.18
2.89
2.95
2.96
3.00
3.27
-1.6
-1.9
-0.9
-5.3
-0.7
-2.2
-2.0
-4.7
-4.5
-2.9
G4S – 4-O-сульфо-β-D-галактопираноза; DG – 3,6-ангидро-D-галактоза
С помощью программы GRAMM 1.03 рассчитаны структуры 100
комплексов хитозана в протонированной форме (состоящего из 50
моносахаридных остатков) с κ-К. Показано, что хитозан может иметь несколько
сайтов связывания с двойной спиралью κ-К, наиболее вероятные комплексы
получаются, когда на 1 аминогруппу хитозана приходится 1 или 1.5 сульфатные
группы κ-К.
5. Определение параметров связывания каррагинана с хитозаном
На основании структуры исходных полисахаридов, а также данных
экспериментов in silico можно считать, что связывание хитозана с каррагинаном
осуществляется в основном за счет ионного взаимодействия катионных и
анионных групп полимеров. В связи с этим для определения констант
связывания ПЭК К-Х был использован метод конкурентного связывания
14
полианиона с комплексом хитозан/анионный краситель, основанный на
вытеснении каррагинаном красителя из комплекса хитозан/краситель с
последующей регистрацией высвободившегося красителя.
Как показали результаты экспериметов, для достижения постоянной
величины оптической плотности раствора при титровании комплекса
тропеолин/Х-130 κ-К требовалось время. Экстинция реакционной смеси
достигала постоянного значения через 24 ч, что указывает на достаточно
сложный процесс образования комплексов. На основании кривых титрования
было определено количество остатков глюкозамина, связанных с 1 молекулой
каррагинана, и число сульфатых групп, приходящихся на 1 аминогруппу
хитозана (n*). Полученные значения представлены в таблице 3.
Таблица 3 - Количество сульфатных групп в молекуле каррагинана, которые
связываются с одним остатком глюкозамина в молекуле хитозана
Молекулярная масса
Тип
каррагинана
Число
сульфатных
групп в
молекуле
каррагинана
Количество
остатков
глюкозамина,
связанных с
молекулой
каррагинана
Число
сульфатных
групп на 1
NH3+, n*
Каррагинана,
кДа
Структурного
фрагмента,
Да
κ-К
367
392
936
722
1.3
λ-К
κ/β-К
x-К
650
380
527
630
1754
510
3095
650
2066
1512
934
1728
2.0
0.7
1.2
Как известно на одно дисахаридное звено κ-К приходится 1 сульфатная
группа, x-К – 2 сульфатных группы, λ-К – 3 сульфатные группы. В случае κ/β-К
на 5 дисахаридных звеньев приходится 3 дисахаридных звена κ-К и 2 – β-К.
Таким образом, на дисахаридное звено κ/β-К приходится 0,6 сульфатных групп.
При расчете n* (таблица 3) для этих полисахаридов соответствующей
корреляции между количеством связанных аминогрупп хитозана и числом
сульфатных групп каррагинана, участвующих в связывании с хитозаном, не
наблюдается. Вероятно, это связано с тем, что не все сульфатные группы в
молекуле каррагинана доступны для связывания с Х-130, что может быть
обусловлено конформацией молекул каррагинана. Как известно, наличие
3,6-ангидрогалактозы и небольшое количество сульфатных групп приводит к
снижению гибкости молекулы. Такая жесткость молекулы полианиона может
обуславливать пространственные затруднения для его взаимодействия с
катионом. Необходимо отметить, что эти данные согласуются с результатами
экспериментов in silico.
Использование метода графического представления данных в
координатах Скетчарда (рис. 12) позволило нам определить константы
связывания (Kсв) каррагинанов с Х-130. Их значения представлены в таблице 4.
15
∆D/C
25
20
15
10
2 4
5
3
1
0
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
∆D
Рисунок 12 – Графики Скетчарда связывания каррагинана с хитозаном
1 – κ-К:Х-130; 2 – λ-К:Х-130; 3 – κ/β-К:Х-130; 4 – x-К:Х-130
Полученные
зависимости
имеют
линейный
характер.
Это
свидетельствует о том, что в электростатическом связывании хитозана с
каррагинаном участвуют сайты одного типа и взаимодействие носит
некооперативный характер.
Как видно из таблицы 4, Ксв Х-130 с каррагинанами различных
структурных типов различаются между собой. Этот эффект может быть связан
как с количеством сульфатных групп, их распределением вдоль полимерной
цепи, так и конформацией макромолекулы каррагинана. Макромолекулярная
организация λ-К отличается от таковой для κ-К и κ/β-К. λ-К имеет в растворе
конформацию неупорядоченного клубка. Вследствие гибкости полимерной цепи
λ-К места связывания на нем могут смещаться одно относительно другого в
пространстве и уменьшать стерические препятствия при связывании с
хитозаном. В случае жестких молекул κ-К и κ/β-К, которые образуют
двухцепочечные спирали, это становится невозможным.
видимо,
определяется
Достаточно
высокая
величина
Ксв,
дополнительной стабилизацией комплекса водородными связями между
молекулами хитозана и каррагинана, наличие которых подтверждается
экспериментами in silico.
Таблица 4 - Значения констант связывания (Kсв) в комплексе К-Х
Комплекс
Kсв, ×107 моль-1
κ-К:Х-130
2.38
λ-К:Х-130
23.39
κ/β-К:Х-130
2.85
x-К:Х-130
8.47
Таким образом, данные центрифугирования и значения Ксв
свидетельствуют о существенной роли структуры каррагинана в процессе его
взаимодействия с хитозаном.
16
6. Размер и ζ-потенциал комплексов κ-К с Х
Для более детальной характеристики ПЭК κ-К с хитозаном был
использован метод динамического рассеяния света (ДРС) и электрокинетических
измерений. Для этих целей были приготовлены 2 серии растворимых ПЭК κ-К с
хитозаном: первая – с избытком хитозана, вторая – с избытком κ-К (таблица 5).
Таблица 5 – Размер и поверхностный потенциал ПЭК К-Х
Образец
Х-110 0.5 мг/мл
К:Х 0.05:1 в/в
К:Х 0.1:1 в/в
К:Х 0.15:1 в/в
К:Х 0.25:1 в/в
К:Х 0.35:1 в/в
К:Х 0.45:1 в/в
К:Х 0.5:1 в/в
К:Х 0.6:1 в/в
К:Х 0.65:1 в/в
К:Х 0.7:1 в/в
К:Х 0.8:1 в/в
К:Х 1:1 в/в
κ-К
Х:К 0.05:1 в/в
Х:К 0.1:1 в/в
Х:К 0.15:1 в/в
Х:К 0.25:1 в/в
Х:К 0.35:1 в/в
Х:К 0.45:1 в/в
Х:К 0.5:1 в/в
Размер частиц
D, нм
%
541.9±55.2
23.1±4.8
163.1±15.67
168.7±2.171
192.6±20.16
222.0±3.6
241.4±17.55
277.2±15.9
270.2±19.8
335.5±43.8
535.1±81.5
4600.0±100.0
460.6±21.8
4518.0±685.0
647.6±168.0
4844.0±135.0
569.0±189.0
4874.0±249.0
231.5±39.4
758.8±55.8
338.6±76.7
538.5±266.0
117.5±63.5
557.4±79.3
61.8±15.9
461.1±4.5
195.5±21.4
702.7±115.0
269.5±122.5
1001.5±277.6
650.5±146.7
4185.0±112.7
374.0±92.9
1548.0±319.9
75
25
100
100
100
100
100
100
100
100
96
4
88
12
90
10
88
12
41
59
38
62
17
83
6
94
23
77
29
71
76
24
38
62
17
Индекс
полидисперсности
ζ-потенциал,
мВ
0.986± 0.018
38.3±0.9
0.397± 0.018
0.276± 0.007
0.244± 0.015
0.230± 0.006
0.223± 0.011
0.255±0.009
0.251±0.007
0.263±0.012
33.7±1.3
29.1±2.5
32.3±1.28
38.5±1.6
36.2±0.3
32.2±0.9
35.6±0.8
34.5±0.2
0.394±0.007
31.7±0.9
0.389±0.020
35.5±0.9
0.441±0.020
32.9±0.7
0.463±0.062
31.9±0.6
0.499±0.046
-54.2±2.3
0.520±0.040
-48.3±1.5
0.343±0.041
-45.0±0.5
0.294±0.011
-48.1±1.9
0.327±0.046
-42.0±2.1
0.303±0.010
-41.2±1.5
0.463±0.018
-41.3±1.3
0.641±0.088
-35.8±1.82
Как показали данные ДРС, растворимые комплексы при избытке
хитозана представляют собой гомогенные по размерам (от 160 до 335 нм)
положительно заряженные частицы. Увеличение содержания каррагинана в
смеси до соотношения К:Х 0.65:1 в/в приводит к увеличению индекса
полидисперсности и размера частиц от 460 до 647 нм, а также образованию еще
одной популяции частиц с размером более 1 мкм (4-8.5%).
Во второй серии комплексов с избытком κ-К формируются более
крупные полидисперсные отрицательно заряженные частицы. В данном случае
образование частиц с размером более 1 мкм происходит уже при соотношении
Х:К 0.35:1 в/в.
Незначительное изменение ζ-потенциала и размеров ПЭК в случае
комплексов
с
избытком
хитозана
позволяет
предположить,
что
электростатическая стабилизация сформированных частиц ПЭК осуществляется
непрореагировавшими группами компонента находящегося в избытке (в данном
случае аминогруппами хитозана) за счет образования так называемой
гидрофильной «короны», описанной в литературе. При небольшом содержании
κ-К в смеси сначала наблюдается уменьшение ζ-потенциала комплекса, а потом
его стабилизация, что подтверждает сделанное нами предположение.
Анализ комплексов, полученных с избытком κ-К, позволяет
предположить несколько иной характер формирования частиц ПЭК. С
увеличением содержания хитозана в комплексе величина ζ-потенциала ПЭК
уменьшается с -55 до -35 мВ. Это означает, что количество несвязанных
сульфатных групп κ-К с увеличением содержания в комплексе хитозана
уменьшается и стабилизации частиц ПЭК непрореагировавшими группами в
этом случае не происходит.
Таким образом, на механизм образования ПЭК оказывает влияние
полимер, находящийся в избытке. При достижении соотношения К:Х 0.65:1 в/в и
Х:К 0.35:1 в/в наблюдается формирование крупных частиц с диаметром больше
1 мкм. Однако это не приводит к значительной нейтрализации поверхностного
ζ-потенциала частиц комплекса. ПЭК, полученные с избытком хитозана, более
стабильны, чем ПЭК с избытком каррагинана.
7. Изучение макромолекулярной структуры комплексов К-Х методом
атомно-силовой микроскопии
Макромолекулярная структура комплексов κ-К с Х-110, полученных при
разном соотношении К:Х и Х:К 10:1 в/в, в сравнении с исходными
полисахаридами была изучена методом АСМ (рис. 13).
При концентрации 0.01 мг/мл хитозан формирует однородную и очень
ровную (среднеквадратичная шероховатость – 0,13 нм) плёнку (рис. 13а). Как
видно из рисунка 13б, κ-К образует трехмерную сетчатую структуру высотой
стенок ячеек до 2.5 нм, что указывает на характер межмолекулярной ассоциации
полисахарида по типу «бок-к-боку». Сеть непрерывна и состоит из
разветвленных волокон. Средняя толщина стенки ячейки составляет 50 нм. На
рисунке 13г изображена гистограмма распределения площадей ячеек, на которой
для κ-К наблюдается мономодальное распределение площадей с максимумом
около 1600 нм2.
18
Рисунок 13 – АСМ образцов, нанесенных на свежесколотую слюду:
а – Х-110 (0.01 мг/мл); б – κ-К (0.1 мг/мл); в – κ-К:Х-110, 10:1 в/в; и гистограмма
распределения площадей ячеек: г – κ-К (0.1 мг/мл); д – κ-К:Х-110, 10:1 в/в
Макромолекулярная структура ПЭК κ-К с Х-110 при соотношении К:Х
10:1 в/в отличается от структуры исходных компонентов. Структура комплекса
представлена несколькими слоями. Нижний слой имеет сетчатую структуру
аналогичную структуре κ-К, но со значительно меньшей толщиной стенок (25
нм). Гистограмма распределения площадей ячеек (рис. 13д) имеет бимодальный
характер с двумя максимумами около 150 и 300 нм2, что в 10 раз меньше, чем
области, соответствующие пику гистограммы для κ-К (рис. 13г). Второй слой,
расположенный над сетчатой структурой, состоит из длинных перекрученных
фибрилл. Возможно, эти два слоя соответствуют двум типам комплексов,
которые регистрировались при центрифугировании этого ПЭК в градиенте
перколла (рис. 7б).
Увеличение концентрации Х-110 в 10 раз приводит к изменению его
надмолекулярной структуры (рис. 14а), которая представлена неоднородной
поверхностью, составленной из плотно упакованных шарообразных частиц
(среднеквадратичная шероховатость – 14.3 нм).
При низкой концентрации (0.01 мг/мл) κ-К образует длинные
нитеобразные структуры, переплетенные в некоторых местах, что приводит к
увеличению высоты и может соответствовать образованию двухцепочечных
структур, характерных для κ-К.
19
Рисунок 14 – АСМ образцов, нанесенных на свежесколотую слюду:
а – Х-110 (0.1 мг/мл); б – κ-К (0.01 мг/мл); в – Х-110:κ-К 10:1 в/в
АСМ комплекса κ-К с Х-110 при соотношении Х:К 10:1 в/в
свидетельствует об образовании морфологически неоднородной структуры,
отличной от таковой для исходных полисахаридов.
На рисунке 14в видны плотно упакованные образования, состоящие из
похожих сегментов, характерных для Х-110, вероятно, в основе которых
расположены фибриллы κ-К (в среднем длина 500 нм). Равномерный подслой,
сформированный из шарообразных сегментов, возможно, соответствует
свободному Х-110. Неоднородность наблюдаемой структуры соответствует
данным, полученным методом центрифугирования, согласно которым при этих
соотношениях полисахаридов образуются два типа комплекса, при этом остается
часть несвязанного хитозана (рис. 7а).
8. Реологический свойства гелевых комплексов К-Х
В современной литературе достаточно широко описано получение
гелевых ПЭК на основе полисахаридов. Большинство этих работ посвящено
исследованию прикладных аспектов таких систем. В то же время данные о
влиянии структурных особенностей полисахаридов на формирование таких
композитов и исследовании их реологических свойств очень немногочисленны.
Для получения гелевых ПЭК были использованы κ-К, x-К и так
называемый суммарный каррагинан (Σ-К), представляющий смесь κ-К и λ-К в
соотношении 3:1, а также Х-110 и Х-300. Характер зависимости напряжения
сдвига от скорости сдвига (рис. 15) указывает на то, что исследуемые
каррагинаны и комплексы на их основе представляют собой неньютоновские
псевдопластичные жидкости.
Как можно видеть из графика зависимости напряжения сдвига от
скорости сдвига (рис. 15б, г), для комплексов κ-К:Х-110 (5:1 в/в) и κ-К:Х-300
(10:1 в/в) восходящая кривая петли гистерезиса лежит ниже нисходящей, что
указывает на наличие реопексных свойств. Это может быть следствием сильного
межмолекулярного взаимодействия между компонентами комплекса. В то же
время для комплекса κ-К:Х-110 (10:1 в/в) наблюдается поведение, характерное
для тиксотропной системы.
20
lgη
3.5
3.0
2
3
4
5
2.5
Напряжение сдвига, Н/м2
а
4.0 1
в
4.0
lgη
3.5
3.0
2.5
8
9
6
7
Напряжение сдвига, Н/м2
2.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
lgγ
2.0
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
lgγ
50
1
40
30
3 4б
2
5
20
10
0
0
50
40
30
50 100 150 200
Скорость сдвига, 1/сек
г
6
7
8
9
20
10
0
0
50 100 150 200
Скорость сдвига, 1/сек
Рисунок 15 – Реологические свойства ПЭК К-Х: а, в – кривые вязкости в
логарифмических координатах; б, г – зависимость напряжения сдвига от
скорости сдвига; 1 – κ-К + K+; 2 – κ-К:Х-110 (10:1 в/в); 3 – κ-К:Х-110 (5:1 в/в); 4 – κ-
К:Х-300 (10:1 в/в); 5 – κ-К; 6 – Σ-К:Х-110 (10:1 в/в); 7 – Σ-К + K+; 8 – Σ-К:Х-300 (10:1 в/в);
9 – Σ-К
Кривые вязкости Σ-К и его комплексов с хитозанами (рис. 15в)
указывают на меньшую вязкость системы по сравнению с κ-К и его комплексами
с хитозанами (рис. 15а). Наблюдаемая разница в реологическом поведении,
вероятно, связана с присутствием в Σ-К λ-К, который имеет конформацию
неупорядоченного клубка, в отличие от κ-К, имеющего спиральную
конформацию. Добавление ионов калия к Σ-К приводит к увеличению вязкости
(рис. 15в, кривая 7). Наличие петли гистерезиса и расположение восходящей и
нисходящей кривой указывает на реопексию.
В условиях эксперимента для x-К, а также его комплексов с хитозанами,
зависимости вязкости от скорости сдвига не наблюдалось. Гелеобразующих
свойств эти системы не проявляли, что может быть обусловлено как высокой СС
и распределением сульфатных групп вдоль полимерной цепи, так и
конформацией полисахарида в растворе.
Полученные системы могут представлять практический интерес.
Наличие тиксотропных свойств позволяет рассматривать тестируемые гели как
перспективные основы для создания кремов и мазей, которые могут обладать
собственной биологической активностью.
21
9. Биологическая активность полисахаридов и их комплексов К-Х
9.1. Антивирусная активность на модели вируса табачной мозаики
Биологическая активность полученных комплексов (κ-К:Х, κ/β-К:Х и
x-К:Х) была изучена на модели ВТМ. Комплексы К-Х проявляют способность
ингибировать ВТМ, которая зависит от соотношения исходных компонентов и
структуры каррагинана. Наибольшую антивирусную активность проявляют
комплексы хитозана с каррагинанами тех структурных типов, которые имеют
конформацию двойной спирали.
9.2. Цитокин-индуцирующая активность
Полиионные полисахариды, в том числе каррагинан и хитозан способны
к многоточечному взаимодействию с поверхностью иммунокомпетентных
клеток, что может обеспечивать модуляцию различных компонентов иммунной
системы организма.
Сравнительное изучение влияния полисахаридов и их комплексов К-Х
на индукцию синтеза ФНО-альфа клетками периферической крови человека
показало, что κ/β-К, x-К и их комплексы с хитозаном (при соотношении К:Х 2:1
в/в) проявляют цитокин-индуцирующую активность, стимулируя синтез ФНОальфа мононуклеарными клетками.
9.3. Антиоксидантная активность
Было показано, что комплексы К-Х проявляют способность
перехватывать оксид азота, и их активность сравнима с действием стандарта
(аскорбиновая кислота). Антиоксидантная активность комплексов К-Х зависит
от содержания каррагинана в комплексе: ПЭК с высоким содержанием
каррагинана проявляют активность, сопоставимую с активностью исходного
каррагинана.
9.4. Противовоспалительный эффект ПЭК К-Х
Исследование противовоспалительной активности проводили на модели
воспаления, индуцированного гистамином и формалином, а также на модели
«псевдоаллергического» воспаления лапы, индуцированного конканавалином А.
Проведенное
исследование
противовоспалительных
свойств
полисахаридов и их комплексов показало, что они наиболее эффективны при
эксудативном воспалении, вызванном гистамином (таблица 6). В этих тестах их
активность сравнима с нестероидным противовоспалительным средством.
Следует подчеркнуть, что противовоспалительная активность свободных
полисахаридов в условиях гистаминного воспаления сохраняется при их
комплексообразоваии.
22
Таблица 6 - Противовоспалительный эффект полисахаридов и их ПЭК К-Х на
модели гистаминного отека лапы у мышей
Доза
Средний индекс
Размер
ПротивовоспалительГруппа
мг/кг
отека
отека, %
ный эффект, %
в/бр.
##
Контроль
35.84±3.56
100
0
κ-К:Х 1:10
10
17.45±3.04*
49
51
κ-К:Х 10:1
10
22.44±1.53*##
63
37
Σ-К:Х 10:1
10
19.5±2.32*#
54
46
κ-К
9.0
20.77±2.56*#
63
37
Σ-К
9.0
17.34±2.47*
48
52
*
Хитозан
9.0
16.70±3.66
47
53
Индометацин
50
12.61±1.11**
35
65
Р<0.01, **Р<0.001 относительно контрольной группы;
внутрибрюшинным введением (в/бр.) индометацина (50 мг/кг)
*
Р<0.05,
#
##
Р<0.001
относительно
группы
с
Результаты эксперимента на формалиновой модели воспаления не
выявили противовоспалительного действия у всех протестированных агентов.
Все полисахариды и их комплексы проявили небольшой провоспалительный
эффект на этой модели.
В результате эксперимента на модели «псевдоаллергического»
воспаления лапы, индуцированного конканавалином А, установлено, что
свободные
полисахариды
обладают
высокой
противовоспалительной
активностью,
однако
после
образования
ими
комплекса
их
противовоспалительный эффект исчезает. На основании полученных данных
можно прогнозировать отсутствие у комплексов антиаллергенного действия.
Оценку влияния агентов на клеточный иммунный ответ проводили с
использованием в качестве модели реакции гиперчувствительности
замедленного типа к эритроцитам барана. Результаты эксперимента показали,
что комплексы κ-К и Σ-К с хитозаном проявляют иммунологическую
толерантность по отношению к антигену, при этом свободные полисахариды κ-К
и Σ-К оказывают иммунотоксическое действие, в отличие от хитозана. Таким
образом, комплексирование с хитозаном устраняет иммунотоксичность
каррагинана в составе комплекса.
9.5. Гастропротекторное и противоязвенное действие полисахаридов и их ПЭК
К-Х на модели индометациновой язвы желудка у крыс
Было исследовано гастропротекторное и противоязвенное действие двух
комплексов κ-К с хитозаном при соотношении компонентов К:Х и Х:К 10:1 в/в,
которые, как было показано выше, имеют разную морфологию. Исследование
показало, что оба комплекса обладают гастрозащитным эффектом (ПА>2.0 ед.),
однако его выраженность различна. Введение комплекса κ-К:Х 10:1 в/в снижает
количество язв в желудке в 2.2 раза, тогда как под действием комплекса Х:κ-К
10:1 в/в язвообразование уменьшается почти в 7 раз. По своей гастрозащитной
активности комплекс Х:κ-К 10:1 в/в превышает активность препарата сравнения
Фосфалюгель (таблица 7).
23
Таблица 7 – Гастрозащитная активность κ-К, Х-130 и их ПЭК в сравнении с
препаратом Фосфалюгель
Образец
Среднее
число язв
на 1 крысу
Общее
число язв
на группу
(6 крыс)
Индекс
Паулса
Противоязвенная
активность, ед
Гиперемия
слизистой в
баллах
Контроль
κ-К
Х-110
κ-К:Х 10:1 в/в
Х:κ-К 10:1 в/в
Фосфалюгель
9.2±1.6
2.8±1.5 **
6.2±1.9 #
4.2±1.3 *
1.3±1.0 ***
1.0±0.4 ***
55
17
37
25
8
6
9.2
1.9
6.2
4.2
0.4
0.7
4.8
1.5
2.2
23.0
13.1
3.2±0.4
3.0±0.37
3.7±0.2
3.2±0.5
1.5±0.2 **#
3.3±0.4
P<0.05, **P<0.01, ***P<0.0001 относительно контрольной группы; #P<0.01 относительно референсной группы
*
При профилактическом введении исследуемые полисахариды и их
комплексы не повышают собственные защитные свойства слизистой желудка,
обуславливающие ее устойчивость к ульцерогенному воздействию. Полученные
результаты позволяют предположить, что гастропротекторное действие
комплексов полисахаридов может быть связано с созданием ими на поверхности
слизистой оболочки желудка защитного слоя, затрудняющего непосредственный
контакт с ульцерогенным агентом (индометацином).
Выводы
1. Показано, что образование растворимых полиэлектролитных комплексов
каррагинан-хитозан зависит от способа их получения, соотношения и
концентрации исходных компонентов. Установлено, что растворимые
комплексы формируются при смешивании полисахаридов в широком
диапазоне соотношений Х:К (от 0.1:1 до 30:1 моль/моль, при Cк = 0.1 мг/мл).
2. Установлено, что образование растворимых полиэлектролитных комплексов
каррагинан-хитозан зависит от структуры каррагинанов и хитозанов.
Каррагинаны с высокой степенью сульфатирования, а также хитозаны с
низкой степенью ацетилирования и полимеризации образуют растворимые
комплексы в широком диапазоне соотношений исходных компонентов.
Высокосульфатированный
x-каррагинан
полностью
связывается
с
хитозанами различной степени полимеризации. В случае κ- и κ/βкаррагинанов в комплексе с хитозаном при высоком содержании полианиона
в смеси остается несвязанной часть каррагинана, а при избытке
высокомолекулярного поликатиона свободным остается хитозан.
3. Определены константы связывания и количество мест связывания хитозана с
каррагинанами различных структурных типов. Установлено, что наибольшую
аффинность к хитозану проявляют каррагинаны с высокой степенью
сульфатирования и гибкой конформацией макромолекул в растворе.
4. Исследована надмолекулярная структура полиэлектролитного комплекса κкаррагинан-хитозан и показано, что ее особенности зависят от концентрации
и соотношения исходных полисахаридов.
24
5. Показано, что полученные гелевые комплексы каррагинан-хитозан
представляют собой неньютоновские псевдопластичные жидкости с
тиксотропными свойствами.
6. В экспериментах in vitro показано, что полиэлектролитные комплексы с
высоким содержанием каррагинана проявляют цитокин-индуцирующую,
антивирусную и антиоксидантную активности.
7. В экспериментах in vivo установлено, что парентеральное введение
полиэлектролитных комплексов каррагинан-хитозан достоверно снижает
выраженность воспалительной реакции, индуцированной гистамином.
Показано, что водные растворы комплексов κ-каррагинана с хитозаном
обладают гастропротекторным действием, выраженность которого зависит от
их состава. Высокую гастропротекторную активность, превосходящую
действие эталонного препарата Фосфалюгель, проявляет полиэлектролитный
комплекс с высоким содержанием хитозана (Х:К 10:1 в/в).
Основное содержание диссертации изложено в следующих
работах:
1.
Volod’ko A. V., Davydova V. N., Chusovitin E. A., Sorokina I. V., Dolgikh M. P., Tolstikova T. G.,
Balagan S.A., Galkin N.G., Yermak I. M. Soluble chitosan–carrageenan polyelectrolyte complexes and
their gastroprotective activity // Carbohydr. Polym. – 2014. – Vol. 101. – P. 1087-1093.
2. Volod’ko A.V., Davydova V.N., Barabanova A. O., Solov’eva T.F., Ermak I.M. Formation of soluble
chitosan-carrageenan polyelectrolyte complexes. // Chem. Nat. Compd. – 2012. – Vol. 48. – P. 353-357.
3. Byankina (Barabanova) A.O., Sokolova E.V., Anastyuk S.D., Isakov V. V, Glazunov V. P., Volod’ko
A.V., Yakovleva I. M., Solov’eva T. F., Yermak I. M. Polysaccharide structure of tetrasporic red
seaweed Tichocarpus crinitus // Carbohydr. Polym. – 2013. – Vol. 98. – P. 26-35.
4. Лихацкая Г.Н., Володько А.В., Трифонов Е.В., Нурминский Е.А., Ермак И.М., Давыдова В.Н.
Изучение in silico 3D-структуры комплексов хитозана с каппа-каррагинаном в растворе //
Акутальные проблемы биохимии и бионанотехнологии: III Международная Интернетконференция. Казань. – 2012. – С. 189-192
5. Давыдова В.Н., Володько А.В., Ермак И.М., Изучение процессов формирования комплексов
хитозан-каррагинан в разбавленных растворах // Современные перспективы в исследовании
хитина и хитозана: Материалы Десятой Международной конференции. Н. Новгород: ННГУ. –
2010. – С. 95-97.
6. Volodko A. V., Davydova V. N., Glazunov V. P., Chusovitin E. A., Sorokina I. V., Yermak I. M.
Soluble Polyelectrolyte Carrageenan:Chitosan Complexes and Their Gastroprotective Activity // 2nd
International Symposium on Life Sciences. Vladivostok. – 2013. – P. 92.
7. Volodko A.V., Davydova V.N., Yermak I.M. Rheological properties of chitosan-carrageenan
polyelectrolyte complexes in gel form // 4th Annual Russian-Korean conference «Current issues of
natural products chemistry and biotechnology». Novosibirsk. – 2012. – P. 161.
8. Калитник А.А., Марков П.А., Володько А.В. Противовоспалительная активность хитозана и его
низкомолекулярого производного // Тезисы докладов II Всероссийской научной конференции
молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия». Санкт-Петербург. –
2012. – С. 60-61.
9. Volodko A.V., Davydova V.N., Glazunov V.P., Barabanova A.O., Gorbach V.I., Yermak I.M. The
effect of structural features of carrageenan and chitosan on the formation of soluble polyelectrolyte
complexes // International conference «Renewable wood and plant resources: chemistry, technology,
pharmacology, medicine». Saint-Petersburg. – 2011. – P 275-276.
10. Володько А.В., Давыдова В.Н., Ермак И.М., Растворимые комплексы хитозан-каррагинан //
Науч.-практ. конф. «Физико-химическая биология». Сыктывкар. – 2009. – С. 42–43.
25