close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

ПРОДУКЦИЯ ФАБРИКИ Industrie Valentini ОТНОСИТСЯ К;docx

код для вставкиСкачать
Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное агентство по образованию
Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Казанский государственный технологический
университет»
ТЕХНОЛОГИЯ МЯСА И МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ
Методические указания к лабораторным работам
Казань 2005
1
УДК637.5.002(31)
637.07(076.5)
Технология мяса и мясных продуктов: Методические указания к
лабораторным работам / Смирнова О.В., Р.Э.Хабибуллин, Хусаинова Х.Р., Г.О.Ежкова, В.Я.Пономарев, О.А.Решетник. Казан. гос.технол. ун-т, Казань, 2005, 80 с.
Освещены основные методики определения органолептических,
функционально-технологических, физико-химических и санитарно-микробиологических показателей сырья и мясных продуктов.
Предназначено для студентов 5-6 курсов дневной и заочной
форм обучения, обучающихся по специальности 270900 - «Технология мяса и мясных продуктов», при проведении ими лабораторных работ и для самостоятельной работы.
Подготовлено на кафедре технологии пищевых производств.
Печатается по решению редакционно-издательского совета
КГТУ.
Рецензенты:
проф. кафедры гистологии КГАВМ,
д-р. биол. наук В.И.Усенко
С.н.с. кафедры микробиологии,
канд.биол.наук Зарипова С.К.
©
Казанский государственный
технологический университет, 2005 г.
2
Лабораторная работа №1
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ ВЛАГИ
В МЯСЕ И МЯСНЫХ ПРОДУКТАХ
Цель работы. Приобрести навык в освоении методов определения массовой доли влаги в мясе и мясных продуктах
Задачи. Определить массовую долю влаги в мясе и мясных
продуктах термогравиметрическим методом.
Объекты исследования. Мясо и мясные продукты различных ассортиментных групп, включая копченые, варенокопченые, вареные, фаршированные колбасы, мясные хлеба, сосиски, сардельки, продукты из свинины, баранины, говядины,
мяса птицы, других видов скота, зельцы, студни, паштеты, фаршевые консервы и т.д.
Материалы, реактивы и оборудование. Электрическая мясорубка с диаметром отверстий решетки от 3 до 4 мм; шкаф сушильный электрический с терморегулятором; весы лабораторные; баня водяная; стаканчики для взвешивания или бюксы металлические диаметром 50мм и высотой 25—35 мм; эксикатор;
палочки стеклянные; предварительно обработанный песок речной или кварцевый, этанол.
Методические указания. Влажность продуктов - весьма
важный показатель при оценке качества мясных продуктов, который влияет на сохранность, выход, консистенцию и другие
технологические характеристики. В аналитической практике
применяются различные методы и их модификации, в основе
которых лежит гравиметрическое определение.
Порядок проведения анализа.
Приготовление песка. Песок просеивают через сито с диаметром отверстий 1,5 мм, а затем через сито с диаметром отверстий 0,3 мм, промывают водопроводной водой до тех пор, пока
вода перестанет мутнеть. Затем песок заливают двойным объемом разбавленной (1:1) соляной кислоты и выдерживают в тече-
3
ние суток, периодически перемешивая. После обработки кислотой песок промывают водой до нейтральной реакции промывных вод на лакмус, высушивают при 150—160 °С до постоянной
массы и хранят в закрытой склянке.
Подготовка проб. Пробы продуктов освобождают от оболочек и измельчают.
Пробы колбасных изделий, вареных, варено-копченых,
копчено-запеченных, запеченных и жареных продуктов, фаршевых консервов, а также соленого бекона два раза измельчают на
бытовой или электрической мясорубке и тщательно перемешивают.
Пробы сырокопченых колбас дважды измельчают на электрической мясорубке или нарезают острым ножом на круглые
ломтики толщиной не более 1 мм, после чего их режут на полоски и рубят ножом так, чтобы размер частиц пробы не превышал 1 мм, все тщательно перемешивают.
Пробы паштетов, студней и зельцев измельчают на бытовой или электрической мясорубке один раз и тщательно перемешивают.
Подготовленную пробу помещают в стеклянную банку с
притертой пробкой вместимостью 200-400 см3, заполнив ее полностью, и хранят при температуре от 3 до 5 °С в течение 24 ч.
В бюкс помещают песок в количестве, примерно в 2-3 раза
превышающем навеску продукта, стеклянную палочку длиной
немного большей диаметра бюкса (чтобы она не мешала закрыть бюкс крышкой) и высушивают в сушильном шкафу в открытом бюксе при температуре (103 ± 2) °С в течение 30 мин.
Затем бюкс закрывают крышкой, охлаждают в эксикаторе до
комнатной температуры и взвешивают. Во взвешенный бюкс с
песком вносят навеску продукта массой 5 г и повторно взвешивают. К содержимому приливают 5 см3 этанола и перемешивают
стеклянной палочкой.
4
Помещают бюкс на водяную баню (температура 80—90
°С) и, помешивая палочкой, нагревают до исчезновения запаха
этанола. Затем пробу высушивают в течение 2 ч в сушильном
шкафу при температуре (103 ± 2) °С, охлаждают в эксикаторе и
взвешивают.
Высушивание продолжают до постоянной массы. Каждое
повторное взвешивание проводят после высушивания в течение
1 ч при температуре (103±2)°С. Результаты двух последовательных взвешиваний не должны отличаться более чем на 0,1 %
массы навески. Взвешивание проводят на весах с погрешностью
не более ± 0,001 г.
Массовую долю влаги рассчитывают по разнице массы
проб:
Х=100*(m1-m2) / (m1-m),
где m1, m2- массы бюкса с песком, стеклянной палочкой и
навеской соответственно до и после высушивания, г; m - масса
бюкса с песком и стеклянной палочкой после высушивания, г.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое трех параллельных измерений. Расхождение не должно
составлять более 0,5 %. Окончательный результат вычисляют с
точностью до 0,1 %.
Контрольные вопросы:
1.
Какими методами можно определить массовую
долю влаги в мясе и мясных продуктах.
2.
Порядок проведения опыта.
3.
Перечислите и охарактеризуйте формы связи влаги в мясных продуктах.
Лабораторная работа № 2
Анализ аминокислот методом бумажной хроматографии
5
Цель работы. Приобрести практический навык анализа
аминокислот мяса и мясопродуктов методами бумажной хроматографии.
Задачи. Подготовить хроматографические камеры и пробы
для хроматографирования, проявить бумагу и идентифицировать аминокислоты.
Объекты исследования. Мясо, мясопродукты, кровь и ее
фракции.
Материалы, реактивы и оборудование. Раствор НСlO4 молярной концентрацией 0,5 моль/дм3; раствор КОН молярной
концентрацией 5 моль/дм3; раствор нингидрина в ацетоне массовой долей 0,2%; стандартные растворы аминокислот молярной концентрацией 0,025 моль/дм3; этанол (на 50 см3 этанола
добавляют 0,02см3 насыщенного раствора CuSO4); раствор изопропанола массовой долей 10%; диазореактив; хроматографические камеры; бумага; пульверизатор; ножницы; фотоэлектроколориметр или спектрофотометр, бутанолуксусная смесь.
Бутанолуксусная смесь: смесь нормального бутанола, уксусной кислоты и воды в соотношении 4:1:5 (верхний слой) и
8:3:1 (нижний слой) тщательно встряхивают в делительной воронке и после расслаивания используют верхний слой.
Диазореактив: смешивают один объем раствора сульфаниловой кислоты (к 0,9 г кислоты прибавить 9 см3 концентрированной НС1 и 90 см3 Н2О) и пять объемов свежеприготовленного раствора NaNO2 массовой долей 5 %, объем доводят водой до
50 см3.
Методические указания. Метод основан на распределении
соединения между двумя жидкими фазами. Хроматографическая
бумага обладает свойством поглощать воду из атмосферы и задерживать ее между своими целлюлозными волокнами. Эту воду можно рассматривать как один из растворителей (как неподвижную фазу). Когда по бумаге под действием капиллярных сил
движется неводный растворитель (подвижная фаза), молекулы
6
вещества, нанесенного на бумагу, распределяются между двумя
фазами в соответствии с их коэффициентом распределения. Чем
выше растворимость вещества в подвижной фазе, тем дальше
оно продвинется по бумаге вместе с растворителем, и наоборот.
Как правило, при бумажной хроматографии неподвижная
фаза является водной, а в качестве подвижной используются органические растворители.
Метод хроматографического разделения на бумаге уступает колоночным методам по ряду показателей, однако имеет в
ряде случаев определенное преимущество.
Определение свободных аминокислот сводится к хроматографическому анализу безбелковых фильтратов на бумаге и определению аминокислот после обработки хроматограмм нингидрином.
В присутствии нингидрина отдельные аминокислоты проявляются в виде пятен, окрашенных в голубой, фиолетовый,
желтый или другой цвет (в зависимости от химической структуры аминокислоты).
Идентификацию аминокислот в смеси проводят путем сопоставления распределения известных аминокислот (стандартов).
Подготовка проб.
1. Раствор суммарных аминокислот получают путем предварительного гидролиза. Для этого образец измельченного мяса
массой 150—250 мг (белка должно быть не менее 25—50 мг)
помещают в стеклянные ампулы или термостойкие пробирки с
пришлифованными пробками и добавляют 25 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрацией 6 моль/дм3. Затем ампулы запаивают (или плотно закрывают пробирки пробками) и
выдерживают в термостате при 114—115 ºС в течение суток.
При этом необходимо помнить, что при кислотном гидролизе
триптофан разрушается полностью, серии и треонин -на 5-10%,
цистин, цистеин, метионин - частично. Перед гидролизом об-
7
разцы следует пометить. Приготовленные пробы устанавливают
в термостат и оставляют под наблюдение и контроль лаборанта
до следующего занятия.
На втором этапе по окончании гидролиза образец фильтруют через стеклянный фильтр, испаряют избыток соляной кислоты. Для этого 5 см3 гидролизата помещают в роторный испаритель и упаривают досуха при температуре 40 ºС. После этого
в сухой остаток приливают 1,5 см3 дистиллированной воды и
снова упаривают, повторяя операцию дважды. Освобожденный
от соляной кислоты остаток растворяют в 10 см3 буферного раствора (рН 2,2).
При определении аминокислот в жидких материалах, например в крови убойных животных и ее фракциях, к 1-2 см3 образца добавляют равный объем раствора СН3СООН молярной
концентрацией 0,04 моль/дм3, нагревают на водяной бане, доводят до кипения и кипятят 2-3 мин, охлаждают и осадок белка
отделяют центрифугированием. Центрифугат сливают и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 0,1—0,2см3 смеси муравьиной, уксусной кислот и воды (7:5:13), нерастворившийся
осадок отбрасывают.
2. Свободные аминокислоты извлекают из образцов раствором спирта (75-80 %), нагретого до температуры 60-70 ºС на
водяной бане. Полученную смесь тщательно растирают в течение 15 мин и фильтруют через вставленный в воронку складчатый фильтр в чашку для выпаривания, которую используют в
качестве приемника.
Порядок проведения анализа. Для анализа используют
хроматографическую бумагу ватман или пластины Силуфол.
Вырезают полосы длиной около 50 см и шириной 18-50 см (размер бумаги определяется размером исследуемых проб и величиной хроматографической камеры). В 5-10 см от конца полоски
(зависит от высоты лодочки) простым карандашом проводят
стартовую линию и отмечают точки нанесения раствора в 3 см
8
от краев хроматограммы и в 2,5 см одна от другой. Для лучшего
разделения образцов с большим набором аминокислот край бумаги, на который наносят гидролизат, вырезают, как это показано на рис. 1.
Рис. 1. Форма бумажной полосы, обеспечивающая лучшее разделение
аминокислот (размеры даны в мм): а - точки нанесения образцов
Чашку с экстрактом помещают на водяную баню при температуре кипения и полностью выпаривают спирт. Полученный
сухой остаток растворяют в растворе изопропанола массовой
долей 10 % с таким расчетом, чтобы 1 см3 раствора соответствовал 1,5—2 г ткани. Раствор наносят на хроматограмму в количестве, эквивалентном 30—50 мг ткани. На ту же хроматограмму
рядом с исследуемым раствором наносят растворы известных
аминокислот - «свидетелей». Стандартные растворы глутаминовой кислоты и аланина (или любых других аминокислот) наносят в отдельные точки (обычно 3-5 точек) в строго определенном количестве. По этим точкам строят стандартные калибровочные графики для количественного определения аминокислот
в экстракте ткани.
Построение калибровочного графика. Для каждой аминокислоты строят свой калибровочный график. В ряд точек хроматограммы наносят стандартные растворы аминокислот в коли9
честве 0,05; 0,1; 0,15 и 0,2 мкмоль каждой. В качестве стандартных растворов удобно пользоваться смесями аминокислот известного состава, хорошо разделяющимися в данных условиях и
содержащими определенные количества аминокислот. Стандартные смеси готовят из стандартных растворов отдельных
аминокислот молярной концентрацией 0,025 моль/дм3, приготовленных на растворе изопропилового спирта массовой долей
10 %, смешиванием по 1 см3 (0,5 см3) раствора каждой аминокислоты. Стандартные растворы аминокислот наносят на ту же
хроматограмму, что и опытные пробы. Если размеры хроматограммы не позволяют этого, полоски бумаги, используемые для
хроматографии стандартных и опытных растворов, вырезают из
одного и того же листа хроматографической бумаги.
После проявления хроматограммы окрашенные участки
обводят простым карандашом, вырезают, измельчают ножницами и помещают в пробирки. Окрашенный продукт элюируют 5
см3 перегнанного метанола (предварительно к 500 см3 метанола
добавляют 0,2 см3 насыщенного раствора нитрата меди) или 5
см3 этилового спирта (в этом случае вместо нитрата меди добавляют сульфат меди). Пробы до колориметрирования необходимо
периодически встряхивать и держать в темноте. Элюаты начинают колориметрировать, когда в раствор перейдет краска из
наиболее интенсивно окрашенных пятен (обычно через 30—60
мин). Определение проводят на фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром (500 нм) в кювете толщиной 0,5-1,0см.
Для контроля вырезают чистый участок хроматограммы на том
же уровне, что и проявленные пятна, и обрабатывают его так же,
как и опытные пробы.
Калибровочный график строят, откладывая на оси абсцисс
концентрацию аминокислоты, а на оси ординат - величины оптической плотности.
Исследуемый раствор наносят микропипеткой с оттянутым
в капилляр и изогнутым концом вместимостью 0,1 см3, полуав-
10
томатической пипеткой или калиброванным капилляром. Диаметр наносимых пятен не должен превышать 0,3-0,5 см (объем
каждой капли около 0,003-0,005 см3). При нанесении раствора в
одну и ту же точку бумаги соответствующее место каждый раз
подсушивают током теплого воздуха. Если расстояние между
точками нанесения превышает 2,5 см, раствор можно наносить в
виде полосы.
Для идентификации аминокислот в исследуемом гидролизате наряду с опытными пробами (или предварительно, до анализа опытных проб) на хроматограмму наносят растворы аминокислот - «свидетелей». После установления местоположения
пятен отдельных аминокислот - «свидетелей» в дальнейшем последние можно наносить на хроматограмму в виде смесей. Смеси должны иметь известный состав и хорошо разделяться при
данных условиях хроматографирования. Этим требованиям
удовлетворяют смеси аминокислот следующего состава:
1. Цистеиновая кислота, гистидин, аспарагиновая кислота,
глицин, глутаминовая кислота, аланин, триптофан, метионин,
фенилаланин, лейцин.
2. Цистеиновая кислота, лизин, аргинин, серии, треонин,
аланин, пролин, тирозин, валин, изолейцин.
Смеси «свидетелей» помещают в крайние точки стартовой
линии хроматограмм по 0,05-0,1 мкмоль каждой аминокислоты
в пятно.
В качестве растворителей для хроматографии аминокислот
обычно используют последовательно две системы: н-бутанол уксусная кислота - вода в соотношении 4:1:5 (верхний слой) и нбутанол - уксусная кислота - вода в соотношении 8:3:1.
Для лучшего разделения сложной смеси аминокислот,
имеющих близкие величины R, каждый растворитель пропускают по хроматограмме несколько раз (обычно дважды). В этом
случае фронт каждого последующего растворителя должен продвигаться несколько дальше, чем предыдущего. Перед исполь-
11
зованием каждого следующего растворителя хроматограммы
вынимают из камеры и сушат на воздухе.
Хроматограмму проявляют раствором нингидрина массовой долей 0,2 %, приготовленным на перегнанном ацетоне. К
раствору нингидрина прибавляют 4 см3 воды и 1 см3 ледяной
уксусной кислоты. Этот раствор готовят непосредственно перед
проявлением. Раствор наливают в ванночку и равномерно пропитывают им хроматограмму. Затем ее сушат под тягой и выдерживают в темноте при комнатной температуре около 12 ч. В
этих условиях с нингидрином реагируют все α-аминокислоты
(все другие аминокислоты дают реакцию при более высокой
температуре - около 100 °С). Проявление хроматограмм при качественной хроматографии можно ускорить, помещая последние на 10-15 мин в термостат при 60 °С. Окраска, полученная
при проявлении аминокислот нингидрином, неустойчивая. Ее
можно закрепить, опрыскивая проявленную хроматограмму из
пульверизатора раствором ацетона, содержащим нитрат меди. К
100 см3 ацетона прибавляют 1 см3 насыщенного раствора
Cu(NO3)2 и 0,02 см3 концентрированной азотной кислоты.
Сопоставляя положение аминокислот гидролизата с положением аминокислот-«свидетелей», определяют аминокислотный состав гидролизата.
Наряду с нингидриновым реактивом существуют и другие
реактивы, дающие цветные продукты с некоторыми аминокислотами. Это свойство избирательного окрашивания часто используют в хроматографии для идентификации отдельных аминокислот. Так, для определения соединений с гуанидиновой
группой (аргинин) используют реакцию Сакагуши. Хроматограмму смачивают раствором 8-оксихинолина в ацетоне с массовой долей 0,1 % и после ее подсушивания на воздухе слегка
опрыскивают из пульверизатора раствором гипобромита (1 см3
брома в 500 см3 раствора NaOH молярной концентрацией 0,5
моль/дм3). Наблюдается оранжевое окрашивание.
12
Реакция Эрлиха. Производные индола и оксииндола (триптофан,
5-окситриптофан,
5-окситриптамин,
5оксииндолуксусная кислота) с реактивом Эрлиха дают лиловую
окраску. Хроматограмму погружают в раствор, содержащий диметиламинобензальдегид массовой долей 10 % в концентрированной НСl с четырьмя объемами ацетона. Окраска появляется
через 20 мин при комнатной температуре.
Реакция Паули. Соединения, содержащие имидазольное
кольцо (гистидин, метилгистидин, гистамин, карнозин), а также
тирозин дают красно-оранжевое окрашивание после обработки
диазореактивом. Хроматограмму из пульверизатора слегка опрыскивают сначала диазореактивом, а затем раствором Na2CO3
массовой долей 10 %. Окраска устойчивая. Перечисленные реакции можно применять после проявления хроматограммы нингидрином.
Для обнаружения материала, имеющего пептидные связи,
но не дающего нингидриновую реакцию (например, циклические пептиды), применяют реакцию Райдона и Смита. С этой
целью хорошо высушенную хроматограмму смачивают в смеси
спирта и эфира (1 : 1). Избыток растворителя удаляют фильтровальной бумагой. Влажную хроматограмму помещают в замкнутое пространство над свежеприготовленной смесью раствора
НС1 массовой долей 10 % и раствором КМпО4 массовой долей 1
% (в соотношении 1 : 1) на 5-15 мин. Затем хроматограмму погружают в смесь раствора KJ молярной концентрацией 0,05
моль/дм3 и насыщенного раствора о-толуидина (или бензидина)
в уксусной кислоте массовой долей 2 % (1 : 1). На месте пептидов и белка появляются синие пятна. Через 1-3 мин хроматограмму промывают раствором СН3СООН массовой долей 2 % и
высушивают на воздухе. Окраска устойчивая. Для пептидов эта
реакция более чувствительна, чем нингидриновая. Реакцию дают также пуриновые и пиримидиновые основания, нуклеозиды,
нуклеотиды и др.
13
Количественное содержание аминокислот рассчитывают
по калибровочным графикам, построенным после хроматографирования стандартных растворов аминокислот, взятых в различных количествах.
Содержание аминокислот в мышцах рассчитывают в микромолях, миллиграмм-процентах на массу ткани или процентах
к небелковому или общему азоту.
Полученные экспериментальные и расчетные данные
оформляют в виде таблицы. Самостоятельно анализируют их и
формулируют выводы по работе.
Контрольные вопросы:
1. Аминокислоты: определение, функции, нингидриновая
реакция.
2. На чем основан метод определения аминокислот.
3. Порядок проведения работы.
4. Коэффициент распределения.
Лабораторная работа № 3
Определение содержания крахмала
Методические указания. Крахмал относится к вспомогательному сырью и является наполнителем эмульсии (после термообработки набухает и связывает воду). Оказывает влияние на
качество готовых изделий, а именно: снижает биологическую
ценность; устраняет бульонные отеки; придает монолитность;
увеличивает выход. При избыточном введении – резиноподобная консистенция, «пустой» вкус.
В изделиях, рецептура которых предусматривает использование крахмала, массовая доля его не должна превышать 5%.
Цель работы: определить содержание крахмала в исследуемом образце.
14
Задачи: Определить содержание крахмала в различных
мясных продуктах качественным и количественным методами.
Объект исследования: колбасные изделия и полуфабрикаты, содержащие крахмал.
При определении содержания крахмала используют качественный и количественный методы.
Качественный метод. На поверхность свежего разреза колбасы наносят каплю раствора Люголя. Появление синей или
черно-синей окраски указывает на присутствие крахмала.
Количественный метод. Метод основан на окислении альдегидных групп моносахаридов, образующихся при гидролизе
крахмала в кислой среде, двухвалентной медью жидкости Фелинга с образованием осадка закиси меди. Количество невосстановленной меди определяют йодометрическим методом в кислой среде.
Гидролиз крахмала с образованием моносахаридов.
(C6H10O5 )n → n(C6H12O6).
Реакция восстановления меди редуцирующими сахарами и
уравнение реакции йодометрического определения двухвалентной меди
I2 + 2Na2S2O3 → 2Na I +Na2S4O6.
15
Порядок выполнения работы. Образец фарша (20 г), взвешенный с точностью до 0,01 г, помещают в коническую колбу
вместимостью 250 мл и приливают небольшими порциями 80 мл
10%-ного раствора соляной кислоты при постоянном помешивании стеклянной палочкой. Колбу с содержимым присоединяют к обратному водяному или воздушному холодильнику, ставят на плитку, подложив под колбу асбестовую сетку, и кипятят
15 мин, периодически помешивая содержимое колбы. Затем
колбу охлаждают до комнатной температуры холодной водой и
содержимое количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 мл. Объем жидкости доводят дистиллированной водой до метки (попавший в колбу жир должен находиться над
меткой). После перемешивания содержимое колбы фильтруют
через бумажный фильтр.
Фильтрат в количестве 25 мл вносят пипеткой в мерную
колбу вместимостью 50 мл, добавляют две капли 1%-ного раствора фенолфталеина и нейтрализуют 10%-ным раствором гидроксида натрия до появления от одной капли щелочи краснова-
16
той окраски. Сразу же добавляют в колбу по каплям 10%-ный
раствор соляной кислоты до исчезновения красноватой окраски
и еще две-три капли этой же кислоты для установления слабокислой реакции раствора.
Для осветления гидролизата и осаждения белков к раствору в колбе вместимостью 50мл пипеткой добавляют 1,5мл 15%ного раствора желтой кровяной соли (калия гексацианоферрат
(II) тригидрат) и 1,5 мл 30%-ного раствора цинка. Содержимое
колбы охлаждают до комнатной температуры, доводят объем
дистиллированной водой до метки, перемешивают и фильтруют
через бумажный фильтр (в случае образования пены добавляют
одну-две капли серного эфира).
В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 10 мл прозрачного бесцветного фильтрата (при контрольном определении
10 мл дистиллированной воды), добавляют 20 мл жидкости Фелинга, взбалтывают и кипятят 3 минуты. После кипячения колбу
охлаждают холодной водой, доводят объем жидкости дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивают и дают
осесть выпавшему оксиду меди.
В коническую колбу вместимостью 100...150 мл вносят
пипеткой 20 мл отстоявшейся жидкости, а затем последовательно добавляют мерным цилиндром 10 мл 30%-ного раствора йодида калия и 10мл 25%-ного раствора серной кислоты и сразу
же титруют 0,1 М раствором тиосульфата натрия до слабожелтой окраски. Затем добавляют 1 мл 1%-ного раствора крахмала и продолжают титрование медленно (с промежутками между каплями 5...6 с) до полного исчезновения синей окраски
раствора. Точно также титруют контрольный раствор.
Массовая доля крахмала (в %)
х = т • 250 • 50 • 100/(20 • 25 • 10) = т • 250,
где т — количество крахмала, соответствующее объему 0,1
М раствора тиосульфата натрия (определяют по табл. 1), г; 250
— объем гидролизата, мл; 50 — разбавление фильтрата после
17
нейтрализации и осаждения белков, мл; 20 — масса образца, г;
25 — объем фильтрата, взятого для нейтрализации и осаждения
белков, мл; 10 — объем гидролизата, взятого для кипячения, мл.
Таблица 1
Количество крахмала, соответствующее объему 0,1 М
раствора тиосульфата натрия
Объем
Количество
Объем расКоличество крахраствора,
крахмала, мг
твора, мл
мала, мг
мл
1
2,8
11
32,3
2
5,6
12
35,4
3
8,4
13
38,6
4
11,3
14
41,8
5
14,2
15
45,0
6
17,1
16
48,3
7
20,1
17
51,6
8
23,1
18
54,9
9
26,1
19
58,2
10
29,2
20
61,9
Объем точно 0,1 М раствора тиосульфата натрия (мл) рассчитывают по формуле
V=K(V0-V1)100/20
где K —коэффициент пересчета на точно 0,1 М раствор
тиосульфата натрия; V0, V1— объем 0,1 М раствора тиосульфата
натрия, израсходованного на титрование соответственно контрольного и испытуемого растворов, мл; 100 — разведение гидролизата после кипячения, мл; 20 — объем титруемого раствора,
мл.
Затем определяют соответствующую объему тиосульфата
массу крахмала по таблице и выражают в граммах.
18
Реактивы. Используют: сульфат меди; тартрат калиянатрия (сегнетова соль); 10%-ный раствор соляной кислоты;
15%-ный раствор желтой кровяной соли (калия гексацианоферрат (II) тригидрат); 10%-ный раствор гидроксида натрия; 30%ный раствор сульфата цинка; 0,1 М раствор тиосульфата натрия;
30%-ныи раствор йодида калия (если раствор имеет желтоватый
цвет, его необходимо обесцвечивать добавлением по каплям 0,1
М раствора тиосульфата натрия); 25%-ный раствор серной кислоты;1%-ныи раствор фенолфталеина; йод кристаллический;
1%-ный раствор крахмала в насыщенном растворе хлорида натрия; жидкость Фелинга; раствор Люголя (2 г йодида калия и
1,27 г кристаллического йода растворяют в 100 мл воды).
Жидкость Фелинга состоит из двух растворов: раствор I —
40 г перекристаллизованного сульфата меди растворяют в воде и
доводят объем раствора до 1 л, раствор II — 200 г калия-натрия
виннокислого и 150 г гидроксида натрия растворяют в воде и
объемдоводят до 1 л. Растворы хранят отдельно и смешивают в
равных объемах перед использованием.
Контрольные вопросы:
1.
Крахмал, его технологические функции как компонента эмульсии.
2.
Методы определения крахмала.
3.
Порядок проведения опыта.
4.
Расчет содержания крахмала.
Лабораторная работа № 4
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФРАКЦИОННОГО СОСТАВА ЖИРОВ
Цель работы. Установить состав и массовую долю фракций животных жиров на основе их способности к кристаллизации и плавлению.
19
Задачи. Выделить низко-, средне- и высокотемпературные
фракции пищевых топленых жиров разных видов и сортов; определить температуры плавления фракций жира и рассчитать их
массовые доли.
Объекты исследования. Пищевые животные жиры разных
видов и сортов.
Материалы, реактивы и оборудование. Капилляр, открытый с двух концов термометр; штатив с кольцом; стакан вместимостью 500 см3; вакуум-насос; колба Бунзена; мешалка; термостат; весы аналитические; прибор для определения температуры плавления.
Методические указания. При медленном охлаждении жиры способны кристаллизоваться. Это свойство лежит, например,
в основе получения маргарина. Триглицериды жирных кислот в
расплавленном состоянии не имеют цвета, вкуса и запаха. На
способности различных жировых фракций плавиться, кристаллизоваться, при определенной температуре основан метод их
разделения.
Пониженная усвояемость и высокая температура плавления ограничивают применение говяжьего и бараньего жиров в
качестве пищевых продуктов. Значительная часть этих жиров
используется на технические цели. Повышения потребительских
свойств говяжьего и бараньего жиров можно достигнуть за счет
разделения их на фракции, содержащие различные по температуре плавления триглицериды.
Переход в капельно-жидкое состояние совершается не
мгновенно, а в пределах некоторого интервала температур, в котором плавятся отдельные компоненты смеси. У насыщенных
жирных кислот температура плавления возрастает с увеличением молекулярной массы. У ненасыщенных жирных кислот на
температуру плавления влияют не столько двойные связи,
сколько их положение в цепи и пространственное расположение
20
отдельных частей молекулы. Определенное влияние на изменение температуры плавления оказывает полиморфизм.
Методы определения температуры плавления заключаются
в постепенном нагревании твердого жира до момента расплавления, который характеризуется по прозрачности, подвижности,
осветленности и т. п. На практике температура плавления устанавливается по температуре, при которой жир становится подвижным.
Существует два метода определения температуры плавления: по сползанию капли жира в капилляре с расширением и по
поднятию жира в открытом капилляре.
При разделении жировых фракций на основе кристаллизации используют различные подходы.
Классический метод проведения процесса фракционирования животных жиров заключается в медленном охлаждении
расплавленного жира, в результате чего из говяжьего и бараньего жиров получают легкоплавкую фракцию - олео-маргарин или
олео-ойл, из свиного — лярд-ойл, а также твердую фракцию олеостеарин.
Олео-маргарин имеет цвет от светло-желтого до желтого,
приятный вкус, напоминающий сливочное масло, его можно использовать в домашних условиях, для производства высококачественной маргариновой продукции, в хлебопечении. Костный
жир, полученный из цевок крупного рогатого скота, фракционируют с целью выделения легкоплавкой фракции для производства смазочных масел, не замерзающих при низкой температуре.
Обнаружение и расчет массы фракций весьма полезны при
оценке биологической ценности жиров.
Подготовка проб. Образцы пищевых топленых жиров массой по 35—40 г помещают в предварительно высушенные и
взвешенные пробирки и нагревают в камере ультратермостата
UTU-2, защищенной от естественного света, до температуры
65—70 ºС. Первую стадию кристаллизации проводят при темпе-
21
ратуре 40—45°С в течение 24 ч для наиболее полного разделения твердой и жидкой фракций. Для обеспечения равномерной
кристаллизации содержимое пробирок рекомендуется периодически плавно перемешивать.
Порядок проведения анализа. Оставшуюся жидкой при
температуре 40—45°С жировую фракцию отфильтровывают вакуум-насосом в колбу Бунзена, помещают в высушенную и
взвешенную пробирку термостатируют далее, снизив температуру в термостате на 10 °С.
Операции по разделению фракций жира повторяют, ступенчато проводя снижение температуры до 20—22°С. Продолжительность каждой стадии кристаллизации 30—40 мин.
Выход каждой фракции жира определяют гравиметрически.
Массовый выход фракций жира (%) определяют по формуле:
M=[(m2-m3)/m1]100,
где m2— масса пробирки с соответствующей фракцией
жира, г; m3 — масса пустой пробирки, г; m1— масса исходной
пробы жира, взятой на фракционирование, г; 100 — коэффициент для перевода в проценты.
Определение температуры плавления фракций
Порядок проведения анализа. Пробу исследуемой фракции
жира, полученной по п. 1, нагревают в пробирке на водяной бане до полного расплавления. Чистую сухую, открытую с двух
концов капиллярную трубочку из тонкого стекла с внутренним
диаметром 1,0—1,2мм (длина капилляра. 50—60 мм) погружают
одним концом в расплавленный жир так, чтобы высота его в капилляре была равна 10 мм. Затем капилляр с жиром выдерживают на льду в течение 10 мин.
После этого капилляр прикрепляют к термометру с ценой
деления шкалы 0,1°С тонким резиновым кольцом так, чтобы
столбик жира находился на одном уровне с ртутным шариком
22
термометра. Термометр с капилляром опускают в стакан с дистиллированной водой на глубину 3—4 см. Начальная температура воды в стакане должна быть 15—18 °С. Следят, чтобы в незаполненный конец капилляра не попала вода. При непрерывном перемешивании магнитной мешалкой воду в стакане нагревают сначала со скоростью приблизительно 2 °С/мин, а по мере
приближения к ожидаемой температуре плавления — не более
чем 1 °С/мин. Общий вид установки показан на рисунке.
В качестве температуры плавления фиксируют ту, при которой жир в капилляре начинает подниматься. Эксперимент повторяют не менее двух раз, за результат принимают среднее
арифметическое двух параллельных опытов, результаты которых должны отличаться не более чем на 0,5 °С.
Установка для определения температуры плавления в открытом с
двух концов капилляре: 1 - механическая или магнитная мешалка; 2- термометр; 3 - капилляр
Результаты экспериментов оформляют в виде таблицы. Затем самостоятельно анализируют полученные результаты, формулируют выводы и заключение по работе.
23
Контрольные вопросы:
определение, состав, технологические
1.
Жиры:
свойства.
2.
Какими методами определяют температуру плавления жира.
3.
Оценка биологической ценности жиров.
Лабораторная работа № 5
Определение фенолов в копченых мясных продуктах
Цель работы. Освоить методы качественного обнаружения
и количественного определения суммарных фенолов в колбасных и копченых изделиях.
Задачи. Определить зоны проникновения фенолов при
копчении мясных продуктов различных ассортиментных групп;
установить суммарное содержание фенолов в копченых колбасных изделиях различного группового ассортимента; по результатам исследований дать санитарно-гигиеническую оценку копченым мясным изделиям.
Объекты исследования. Копченые колбасные изделия различного группового ассортимента или копчености.
Материалы, реактивы и оборудование. Раствор ацетона
массовой долей 50 %; раствор тетрабората натрия массовой долей 0,5 %; раствор 4-аминоантипирина массовой долей 2 %; раствор гексацианоферрата калия (II) массовой долей 8 %; гваякол
(для построения калиброчного графика); раствор персульфата
аммония массовой долей 20 %; раствор карбоната натрия массовой долей 1 %; проявитель; фильтровальная бумага; дистиллированная вода; фотоэлектроколориметр ФЭК-56М или КФК-2;
мерные колбы вместимостью 50 см3; мерный цилиндр вместимостью 150 см3; пипетки вместимостью 1, 5, 10см3; колориметрические пробирки; коническая колба вместимостью 250 см3;
стеклянная палочка; бумажный фильтр «синяя лента»; весы тех-
24
нические, вибровстряхиватель; гидроксид натрия NaOH и его
водный раствор молярной концентрацией 0,1 моль/дм3; серная
кислота H2SO4 и ее раствор массовой долей 25 %; сульфат цинка
ZnSO4 и его водный раствор массовой долей 0,45 %; нитрит натрия NaNO2 и его свежеприготовленный водный раствор массовой долей 0,5 %; гидроксид аммония NH4OH и его раствор массовой долей 10 %; стандартный водный раствор фенола (с = 1
мг/см3).
Методические указания. Фенольные соединения обладают
токсическим и даже канцерогенным действием, в связи, с чем
количество их в пищевых продуктах должно быть сведено до
минимума. Для гарантии экологической чистоты пищевых продуктов необходимо строго контролировать содержание фенолов.
При копчении фенолы сначала интенсивно накапливаются
в поверхностном слое. В дальнейшем проникновение их в колбасу значительно замедляется. Одновременно происходит диффузия фенольных компонентов дыма во внутренние слои колбасы. На последней стадии копчения и сушки количество фенольных соединений в поверхностном слое уменьшается почти наполовину и заметно возрастает во всех внутренних слоях колбасного батона. Фронт проникновения фенольных соединений
внутрь колбасного батона тесно связан с химическим составом
сырья и технологическими режимами производства копченых
изделий и характеризует качество копчения. Например, фенолы
хорошо растворяются в жире, причем в жировой ткани их в 1,5
раза больше, чем в мышечной. В процессе холодного копчения в
копченостях накапливается в среднем 15 мг % (9-24 мг %) фенолов.
При изучении вопроса о скорости и характере проникновения фенолов в колбасные изделия удобно пользоваться методом отпечатков, который основан на развитии качественной реакции фенолов в присутствии карбоната натрия и специального
проявителя.
25
Количественное определение фенолов в колбасных изделиях проводят одним из колориметрических методов. Суммарное определение содержания фенолов основано на измерении
оптической плотности окрашенного раствора, цвет которого
возникает в результате качественной реакции:
Другой метод суммарного определения содержания фенолов основан на получении нитрозосоединений при взаимодействии фенола с нитритом натрия. В результате реакции нитрозосоединение образует с избытком аммиака продукт, окрашенный
в желтый цвет, который затем фотоэлектроколориметрируют.
Подготовка проб. Образцы продуктов (не менее 500 г)
дважды измельчают на мясорубке.
Перед определением фенолов в копченых изделиях проводят органолептическую оценку продуктов. При этом осматривают поверхность колбасного батона, отмечают вид колбасной
оболочки, групповой ассортимент и наименование колбасы (с
помощью преподавателя). Путем визуальной оценки устанавливают цвет, состояние поверхности на разрезе, запах и вкус. Данные фиксируют в таблице результатов.
1. Определение границ проникновения фенолов.
Приготовление реактивов и материалов. Фильтровальная
бумага для определения границ проникновения фенолов.
26
Фильтровальную бумагу погружают на 20— 30 с в раствор
Na2CO3 массовой долей 1 %, после чего ее сушат на воздухе и
хранят.
Проявитель для определения границ проникновения фенолов. 1г 4-аминоантипирина растворяют в 50 см3 раствора этанола (96 об. %).
Порядок проведения анализа. Полученный со среза копченой колбасы отпечаток проникших фенолов должен быть видимым и отличаться по цвету от фона предварительно подготовленной фильтровальной бумаги. Подготовленную фильтровальную бумагу опрыскивают из пульверизатора проявителем и
плотно прижимают к срезу колбасного батона. Спустя 20—30 с
бумагу отделяют от поверхности среза колбасы и опрыскивают
раствором персульфата аммония массовой долей 20 %. Через 2
мин на бумаге образуется отчетливый, окрашенный в розовый
цвет отпечаток границ проникновения фенолов. Отпечаток зарисовывают, измеряют с точностью до 0,1 мм границы проникновения или аккуратно вырезают ножницами и вносят в таблицу
результатов.
2. Количественное определение фенолов в колбасных
изделиях
2.1. Колориметрический метод на основе цветной реакции
с 4-аминоантипирином и гексицианоферратом калия (II).
Навески измельченных колбас массой 3—5 г помещают в
малый сосуд гомогенизатора, заливают раствором ацетона массовой долей 50 % в соотношении 1:4 (по объему) и гомогенизируют в течение 5 мин, а затем фильтруют. К 5 см3 прозрачного
раствора добавляют 20 см3 раствора тетрабората натрия массовой долей 0,5 %, 0,5 см3 раствора_4-аминоантипирина массовой
долей 2 % и 0,25 см3 раствора гексацианоферрата калия (II) массовой долей 8 %. Все реагенты перемешивают и по истечении 15
мин измеряют оптическую плотность (интенсивность окраски)
27
на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М с зеленым светофильтром при длине волны 510 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.
Параллельно готовят контрольную пробу, в которой вместо исследуемого фильтра используют 5 см3 раствора ацетона
массовой долей 50 %.
Содержание суммарных фенолов (мг/100 г) вычисляют по
формуле:
X = 100 B A / Vm ,
где В — объем ацетонового экстракта, см3; 100 — коэффициент пересчета на 100 г продукта; А — содержание фенолов в 5
см3 окрашенного раствора, определенное по калибровочному
графику; К—объем фильтрата, взятый для анализа, см3; т —
масса навески продукта, г.
Для проведения расчетов готовят растворы гваякола в диапазоне концентраций от 1 до 100 мкг/см3 и строят график в координатах: оптическая плотность (D) — концентрация гваякола.
2.2. Колориметрический метод, основанный на получении
нитрозосоединений при взаимодействии фенола с нитритом
натрия
В коническую колбу помещают 15 г копченой колбасы,
добавляют 50 см3 дистиллированной воды, закрывают пришлифованной стеклянной или корковой пробкой и встряхивают на
вибро-встряхивателе в течение 15 мин. Содержимое конической
колбы фильтруют в мерную колбу вместимостью 50 см3 и доводят дистиллированной водой до метки. Для осаждения белков 10
см3 полученного раствора переносят в колориметрическую пробирку, добавляют пипеткой 4 см3 раствора ZnSO4 массовой долей 0,45 %, 1 см3 раствора NaOH молярной концентрацией 0,1
моль/дм3 и выдерживают 5 мин на водяной бане при температуре кипения, после чего раствор фильтруют. В колориметрическую пробирку помещают 5 см3 фильтрата, добавляют 0,25 см3
раствора H2SO4 массовой долей 25 % и 2,5 см3 раствора NaNO2
массовой долей 0,5 %. Содержимое пробирки нагревают в тече-
28
ние 5 мин на водяной бане, охлаждают и добавляют 5 см3 раствора NH4OH массовой долей 10 %. Оптическую плотность окрашенного в желтый цвет раствора измеряют на фотоэлектроколориметре ФЭК-56М придлине волны Х = 400нм в кювете с
толщиной рабочего слоя 3 см. Содержание фенола в пробе определяют по калибровочному графику, построенному по стандартным растворам фенола.
Построение калибровочного графика. В четыре мерные
колбы вместимостью 50см отмеряют пипеткой 2,5; 5,0; 7,5 и
10см3 стандартного раствора фенола (с = 1 мг/см3) и доводят
дистиллированной водой до метки. В четыре колориметрические пробирки помещают по 5 см3 фенола, добавляют 1 см3 раствора NaOH молярной концентрацией 0,1 моль/дм3, 0,25 см3
раствора H2SO4 массовой долей 25 % и 2,5 см3 раствора NaNO2
массовой долей 5 • 10~5 %. Содержимое пробирок перемешивают стеклянной палочкой, нагревают на водяной бане при тепературе кипения, охлаждают и добавляют в каждую пробирку
5 см3 раствора NH4OH массовой долей 10 %. Растворы тщательно перемешивают и через 15 мин измеряют оптическую плотность окрашенных в желтый цвет растворов в кюветах с толщиной рабочего слоя 3 см при длине волны Х. = 400нм. В качестве
раствора сравнения используют раствор, содержащий все компоненты, кроме фенола. Каждое измерение выполняют три раза.
По результатам измерений строят калибровочный график
D =f(c).
Содержание фенолов (мг %) рассчитывают по формуле
J = c-50/m-100,
где с — концентрация фенолов в водной вытяжке, найденная по калибровочному графику, мг/см3; 50 — объем водной вытяжки, см3; m — масса навески продукта, г.
Полученные результаты сводят в таблицу:
На основании полученных результатов студенты самостоятельно формулируют выводы и делают общее заключение по
29
работе с учетом отмеченных органолептических показателей и
количественного содержания фенольной фракции в мясных
продуктах.
Контрольные вопросы:
1. Фенолы в колбасных изделиях, способы их проникновения.
2. Методы их определения.
3. Выводы по проделанной работе.
Лабораторная работа № 6
КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНЫХ
ЛИПИДОВ В ЖИВОТНЫХ ТКАНЯХ
Цель работы. Освоить методы количественного определения суммарных липидов в животных тканях.
Задачи. Провести экстракцию липидной фракции в аппарате Сокслета и определить массовую долю суммарных липидов
гравиметрически и (или) колориметрически.
Объекты исследования. Мясо различных видов убойных
животных аналогичных анатомических участков или одного животного от разных отрубов мясной туши, субпродукты I и II категорий, яичный желток, жировые ткани.
Материалы, реактивы и оборудование. Петролейный или
диэтиловый эфир; смесь хлороформа, метанола и воды (2:1: 8);
безводный бензол; хлороформ; концентрированная серная кислота; прокаленный песок; фильтровальная бумага; водяная баня; термометр; часовое стекло; аппарат Сокслета; сушильный
шкаф; бюксы; пленочный испаритель, колбы; аналитические весы; магнитная мешалка; центрифуга лабораторная; фосфованилиновый реактив.
Приготовление реактивов. Фосфованилиновый реактив.
400 мг ванилина, перекристаллизованного из хлороформа или
30
этанола, растворяют в 40 см3 воды и доводят объем до 200 см3
раствором Н3РО4 массовой долей 85 %. Получают раствор ванилина молярной концентрацией 0,013 моль/дм3 в растворе фосфорной кислоты молярной концентрацией 11,8 моль/дм3. Реактив можно длительно хранить в темной склянке при комнатной
температуре.
Методические указания. Большинство липидов легко
окисляются вследствие наличия в их структуре двойных связей,
поэтому для их экстракции следует применять более чистые органические растворители, не содержащие следов окислителей.
Склянки с растворителями хранят в металлических шкафах,
вдали от нагревательных приборов, в темноте.
Для экстракции и хранения растворов липидов используют
посуду из темного стекла. Колбы, делительные воронки и другую посуду при работе с липидами закрывают только пришлифованными стеклянными пробками.
Для экстракции липидов применяют смесь из двух-трех
растворителей. Суммарные липиды извлекают чаще всего смесью хлороформа и метанола в объемных соотношениях 2 :1, 1 : 1
и 1 : 2 или этанола и диэтилового эфира 3:1, 1:1. Наиболее распространенным способом является метод Фолча — экстракция
смесью хлороформа и метанола (2:1), позволяющий извлекать
90—95 % всех клеточных липидов. Преимуществом метода
Фолча является то, что используемая смесь растворителей не
проявляет селективности по отношению к тем или иным группам липидов. Для определения массовой доли суммарных липидов предварительно обезвоженный образец ткани экстрагируют
петролейным эфиром, диэтиловым эфиром или смесью эфира и
этанола. Полное извлечение липидов из тканей достигается путем многократной экстракции летучим растворителем в аппарате Сокслета (рис. 2). Все части аппарата плотно соединяют между собой при помощи шлифов. Пары эфира из экстракционной
колбы при нагревании поднимаются по трубке экстрактора и
31
попадают в холодильник. Здесь они охлаждаются, сгущаются и
каплями стекают в экстрактор, где в бумажной гильзе находится
исследуемый материал. Гильза постепенно наполняется эфиром,
который экстрагирует жир из ткани. Когда уровень эфира поднимется выше верхнего колена сифонной трубки, эфир вместе с
растворенным в нем жиром стечет в нижнюю часть аппарата —
экстракционную колбочку. Жир остается в колбочке, а пары
эфира вновь поднимаются и экстрагируют новую порцию жира.
Исследуемое вещество, подвергаясь многократной повторной
экстракции, полностью обезжиривается. Жир перемещается в
колбочку.
Массовую долю экстрагированных липидов определяют
гравиметрически или колориметрически.
1. Гравиметрический метод в аппарате Сокслета
Подготовка проб. Образец мяса тщательно измельчают
ножом на часовом стекле, взвешивают навеску массой (3,0000 ±
0,0002) г и помещают в тарированный бюкс с прокаленным до
постоянной массы песком.
Стеклянной палочкой перетирают мясо с песком и высушивают в сушильном шкафу при 100—105 ºС до постоянной
массы. Вычисляют массовую долю влаги в исследуемом образце. Сухой остаток используют для определения суммарных липидов.
Порядок проведения анализа. Сухую пробу количественно
переносят в предварительно взвешенную гильзу из фильтровальной бумаги, гильзу повторно взвешивают и помещают в
экстрактор аппарата Сокслета.
32
Рис. 2. Аппарат Сокслета:
1 - приемная колба; 2 -трубка для поступления паров растворителя из
колбы в экстрактор; 3 - холодильник; 4 - экстрактор; 5 - сифонная трубка;
6- бумажная гильза с навеской исследуемого материала
В экстракционную колбу аппарата наливают эфир и соединяют все части прибора. Прибор помещают на водяную баню. Холодильник соединяют с водопроводным краном, включают воду и нагревают баню до 45—50 ºС. Ориентировочная
продолжительность экстрагирования 4—6 ч. Конец экстрагирования определяют, поднося к экстрактору часовое стекло, куда
стекает немного эфира. Экстрагирование считается законченным, если после испарения эфира на стекле не остается налета
жира.
33
По окончании экстрагирования гильзу вынимают из экстрактора, высушивают до постоянной массы и вычисляют массовую долю липидов в исходной навеске по формуле
X1 = 100(m3- m4)/ (m1- m0),
где m3 — масса гильзы с навеской до обезжиривания, г;
m4 — масса гильзы с навеской после обезжиривания, г;
m1— масса бюкса с песком и навеской до высушивания, г; m0—
масса бюкса с песком, г.
Массовую долю липидов (% к массе абсолютно сухого вещества) определяют по формуле
X2 = 100(m3- m4)/ (m3- m5),
где m5— масса гильзы, г.
Контрольные вопросы:
1. Методы определения липидов в животных тканях.
2. Методика проведения анализа.
3. Аппарат Сокслета.
4. Выводы по проделанной работе
Лабораторная работа № 7
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБНЫХ КОНТАМИНАНТОВ В
МЯСЕ
Цель работы. Освоить практические методы определения
микробных контаминантов в мясе на основе бактериологического анализа.
Задачи. Отбор проб мяса для проведения микробиологических анализов; изучение и реализация схемы бактериологического исследования мяса; санитарная оценка мяса.
Объекты исследования. Образцы мяса различных видов
убойных животных.
Питательные среды. Мясо-пептонный агар (МПА); мясопеттонный бульон (МПБ); элективные среды (Эндо, Левина);
34
среды обогащения (среда Киллиана); желатин; среда КиттаТароцци; физиологический раствор.
Методические указания. Вследствие высокого содержания
влаги и белков мясо здоровых животных является благоприятной средой для развития микрофлоры, вызывающей гнилостную
порчу. В обычных условиях убоя стерильного мяса не бывает, в
нем идентифицируются все группы микроорганизмов: бактерии,
микромицеты, чистые грибки, дрожжи.
Санитарное состояние мяса и его устойчивость к гнилостному разложению зависят от соблюдения санитарногигиенических требований при выращивании и заготовке скота,
транспортировании, первичной переработке и производстве
мясных продуктов. У истощенных и утомленных животных понижается устойчивость организма, и бактерии из кишечника и
лимфоузлов проникают в кровь и ткани. В этом случае в мясе
обнаруживают кишечную палочку, протей, стафилококки и анаэробные палочки. При различных заболеваниях животных и
птицы мышцы и внутренние органы нередко обсеменены микроорганизмами. Продукты из этих животных (птицы) могут вызвать у человека инфекционные заболевания или пищевые отравления. Обсеменение мяса микроорганизмами может происходить и в процессе переработки скота: при съемке шкуры, извлечении внутренних органов, обескровливании, зачистке,
шпарке, а также при использовании грязного инструмента, низком уровне личной гигиены работников.
С целью предотвращения микробной кросс-контаминации
мяса в процессе переработки рекомендуется делать акцент на
выявление потенциально опасного пищевого сырья и ингредиентов, которые могут содержать токсические вещества, патогенные бактерии или большое количество микроорганизмов, вызывающих порчу продуктов; обнаружение вдоль всей технологической цепи источников и конкретных точек, где может возник-
35
нуть контаминация продукта; предотвращение условий, при которых возможны выживание и рост микроорганизмов.
Учитывая скоропортящийся характер сырья и благоприятные естественные условия развития микрофлоры в мясе, контроль общей микробной обсемененности и определение наличия
патогенных бактерий и бактериальных токсинов являются обязательным этапом исследования сырья и готовой продукции.
Бактериологический анализ проводят в следующих случаях:
при подозрении на остропротекающие инфекционные заболевания, обнаружении в мышцах единичных некротических
очагов, наличии патологических изменений в мышцах туши и во
внутрених органах;
при поражении отдельных лимфатических узлов или органов, нескольких органов и удовлетворительной упитанности
туши; при беломышечной болезни и кетозах;
при маститах, эндометритах, параметритах коров и овец;
во всех случаях вынужденного убоя животных независимо
от причин убоя и принадлежности животных;
при отравлении или подозрении на отравление ядовитыми
веществами химического или растительного происхождения;
при подозрении на сальмонеллез;
при желудочно-кишечных заболеваниях; при заболеваниях
органов дыхания; при обширных ожогах, кровоизлияниях и небольших кровоизлияниях в подкожной клетчатке, во внутренних
органах, на слизистых оболочках;
при отеках внутренних органов и частей туши;
при жировом перерождении печени;
при наличии гнойных очагов в печени, почках, селезенке и
легких;
при желтушном окрашивании всех тканей туши, исчезающем в течение двух суток;
36
при сомнительной свежести мяса или других продуктов и
невозможности установить их доброкачественность органолептическим путем;
по требованию ветеринарного или медико-санитарного
надзора.
Параллельно с бактериологическим анализом в лаборатории проводят биохимические, органолептические и физикохимические исследования. Это позволяет сделать более обоснованное заключение о предубойном состоянии животного и порядке реализации продуктов убоя.
Бактериологическое исследование мяса проводят по схеме,
приведенной на рисунке.
Придерживаясь этой схемы, можно сравнительно быстро
дать заключение о наличии в мясе возбудителей основных микробных инфекций, вызываемых аэробами (сибирской язвы, рожи свиней, пастереллеза, листериоза, кокковых инфекций), а
также бактерий рода сальмонелла (Salmonella) и условнопатогенных микроорганизмов, вызывающих пищевые отравления.
Исследование мяса и мясопродуктов на наличие микроорганизмов основано на бактериоскопии мазков-отпечатков из
глубоких слоев образцов и посеве на простые и элективные (избирательные) среды и среды обогащения. В зависимости от результатов бактериоскопии и характера роста на питательных
средах проводят исследования на наличие определенных микробов.
Рекомендуемый план исследований, проводимых студентами на занятии по бактериологическому исследованию мяса,
предусматривает:
изучение характера роста бактерий на мясо-пептонном
агаре. Цветным карандашом по донышку чашки студенты обводят несколько колоний, готовят из них мазки, окрашивают по
Граму, микроскопируют;
37
определение общей бактериальной загрязненности мяса по
числу колоний, выросших на мясо-пептонном агаре при поверхностном посеве;
38
Образец мяса
Мазок-отпечаток
Окраска по Граму, окраска капсул
Гр+, капсулы,
короткие палочки с обрубленными
концами
Сибирская
язва
Приготовление водной вытяжки и посев на
среды
МПА
поверх
н.
Среда
Эндо
Среда
Левина
Среда Плоскирева
ОМЧ
Накопление в жидких средах
МПА
глубинно
Отбор образцов из подозрительных
колоний
Клостридии
Посев на твердых средах
Окраска, морфологические, культуральные и биохимические свойства
Сальмонелла
Схема. Бактериологическое исследование мяса
39
изучение характера роста бактерий на среде Эндо или других элективных средах. Студенты обводят цветным карандашом
несколько колоний, похожих по внешнему виду на колонии бактерий сальмонеллезной группы;
подсчет колоний на среде Эндо;
приготовление мазков из подозрительных колоний на среде Эндо, окрашивание по Граму, определение морфологии бактерий;
исследование бактерий из подозрительных колоний на
подвижность;
высев микробов из подозрительных колоний на пестрый
ряд, в 2—3 пробирки на скошенный агар и в 2—3 пробирки со
средой для определения образования индола.
Подготовка проб. При анализе в образцах мяса устанавливают патологоанатомические и органолептические характеристики. После этого проводят бактериоскопию мазков-отпечатков
из глубоких слоев и посев на простые и элективные (избирательные) среды и среды обогащения.
Каждый образец перед посевом освобождают от видимых
жировой и соединительной тканей, погружают на 5 мин в смесь
этанола и эфира (1:1) и два раза обжигают с поверхности. Затем
стерильными ножницами из глубины различных мест каждого
образца вырезают кусочки размером не менее 2,0 х 1,5x2,5 см;
лимфатические узлы разрезают пополам. Затем все вырезанные
кусочки измельчают стерильными ножницами.
Для посева готовят две пробы по 15 г каждая, одна из которых состоит из кусочков мышц и лимфатических узлов, другая - из кусочков паренхиматозных органов (печень, почки и селезенка).
Каждую пробу измельчают стерильным скальпелем, помещают в стерильный стакан (колбу), добавляют по 15 см3 физиологического раствора и настаивают 20-30 мин. 1 см3 приготовленной взвеси содержит 0,5 г продукта.
40
При органолептической и визуальной оценке следует обращать внимание на цвет, консистенцию, запах, состояние поверхности, а также наличие изменений структуры тканей, нехарактерные включения и другие показатели. Результаты органолептической и визуальной оценки фиксируют в тетради. В зависимости от результатов органолептических исследований намечают план дальнейшего бактериологического анализа.
1. Приготовление и бактериологический анализ препаратов
Порядок проведения анализа. В зависимости от характера
патологических изменений и предполагаемого диагноза из проб
готовят от 2 до 10 мазков-отпечатков. Препараты сушат на воздухе, фиксируют и окрашивают одновременно по Граму и раствором сафранина массовой долей 2 % (метод Ольта) или раствором Ребигера.
1.1. Окраска мазка по Граму
На фиксированный мазок помещают полоску фильтровальной бумажки и наливают карболовый раствор генцианвиолета. Выдерживают 1 -2 мин, после чего снимают бумажку, сливают краску, мазок промывают водой и наносят на него раствор
Люголя (мазок чернеет). Через 1-2 мин раствор сливают и наливают этанол на 0,5-1 мин. Затем мазок вновь промывают водой и
дополнительно окрашивают водным раствором фуксина или
раствором сафранина в течение 1-2 мин. Затем мазок промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.
1.2. Окраска капсул по методу Ольта
Мазки окрашивают водным раствором сафранина массовой долей 2 % в течение 1-3 мин (при нагревании) и быстро
промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой.
Препараты микроскопируют. Наличие в мазках грамположительных палочек с обрубленными концами, палочек или це
41
почек с капсулами, при обнаружении теней в мазках из лимфатических узлов свиней со специфической для сибирской язвы
патологоанатомической картиной дает основание для предварительного заключения о бактериоскопическом выявлении микробов, характерных для возбудителя сибирской язвы.
1.3. Окраска капсул по методу Ребигера
Мазки окрашивают и фиксируют одновременно. Нефиксированные мазки окрашивают раствором генцианвиолета в течение 15—20 с, быстро промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.
При окраске по методу Ребигера сибиреязвенные бациллы
окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а капсулы - в краснофиолетовый.
Результаты бактериологического анализа представляют в
виде таблицы рекомендуемой формы:
Таблица 1
Результаты бактериологического анализа
Обра- Оценка ор- Способ окраски Зарисовка Описазец
ганолептипрепарата
микроско- ние микческих покапического роскопизателей
поля пре- ческой
парата
картины
Студенты самостоятельно делают выводы о наличии признаков исследуемых возбудителей и строят дальнейший план
бактериологического анализа.
42
2. Приготовление посевов и определение физиологобиохимических и культурных признаков микроорганизмов
Порядок проведения анализа. Готовят посевы из исследуемого материала на мясо-пептонный агар, на агар Эндо и агар
Левина, на среду накопления и в конденсационную воду скошенного агара (по Шукевичу).
Полученные на этапе подготовки проб взвеси отстаивают
10 мин. Из верхней части надосадочной жидкости пипеткой
Пастера или петлей вносят в чашку с мясо-пептонным агаром и
элективной средой (Эндо, Левина) одну-две капли взвеси (или
одну петлю) и тщательно втирают материал в поверхность предварительно подсушенных сред шпателем Дригальского.
Одновременно с посевом на плотные среды проводят посев материала для накопления сальмонелл в среду обогащения
(среда Киллиана). Для этого 20 см3 взвеси из мышц и лимфатических узлов вносят в один флакон (колбу), а 20 см3 взвеси из
паренхиматозных органов - в другой. В каждый флакон наливают по 50 см3 среды обогащения.
Посевы помещают в термостат при температуре 37 °С. Через 18 ч чашки с первичными посевами на плотных средах извлекают из термостата и просматривают визуально, при необходимости через лупу или под малым увеличением микроскопа.
При отсутствии роста через 18 ч посевы выдерживают в
термостате дополнительно 6 ч.
На мясо-пептонном агаре отыскивают колонии, характерные для сибирской язвы, рожи, пастереллеза, листериоза, кокковых инфекций, а на чашках с элективными средами (Эндо, Левина) - колонии, характерные для бактерий группы кишечных
палочек.
При обнаружении в мазках микробов, подозрительных на
сибирскую язву, посевы на элективные среды и среды обогащения не проводят.
43
2.1. Обнаружение аэробных бактерий
Бациллы сибирской язвы (антракса). Сущность метода заключается в определении характерной морфологии и характера
роста на питательных средах.
Бациллы сибирской язвы неподвижны, в организме образуют капсулы, а во внешней среде при доступе кислорода и температуре 12—42°С - споры. При микроскопии мазков из патологического материала обнаруживают крупные грамположительные палочки, соединенные в короткие цепочки; иногда цепочки
имеют форму бамбуковой трости.
При окраске раствором сафранина массовой долей 2 % сибиреязвенные бациллы окрашиваются в кирпично-красный цвет,
а капсулы и тени (следы распада бактерий) - в светло-желтый.
При окраске раствором Ребигера бациллы антракса окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а капсулы - в краснофиолетовый.
На МПА через 16—24 ч бациллы растут в виде серобелых, шероховатых, с бахромчатыми краями колоний, напоминающих при осмотре через лупу головку медузы или львиную
гриву. Из подозрительной колонии делают посев в пробирку с
МПБ.
На МПБ сибиреязвенные бациллы растут в виде крупных
хлопьев, оседающих на дно пробирки к концу первых суток, с
образованием осадка, напоминающего комок ваты. Бульон остается прозрачным. Из бульонной культуры готовят препарат
«раздавленная», или «висячая», капля. При микроскопировании
препарата под средним увеличением микроскопа обнаруживают
неподвижные сибиреязвенные палочки.
Иногда возникает необходимость отличать сибиреязвенные бациллы от сапрофитных бацилл, которые морфологически
очень похожи. В этом случае чистую культуру, выросшую на
МПА или МПБ, исследуют: на капсулообразование in vitro, на
гемолитическую активность, на тест «жемчужное ожерелье», на
44
чувствительность к сибиреязвенному фагу или на свертываемость желтка куриного яйца.
Основанием для подтверждения диагноза сибирской язвы
являются: наличие в мазках капсулообразующих палочек, а из
колоний грамположительных - неподвижных бацилл; характерный рост на питательных средах; положительная реакция преципитации и положительный результат биологической пробы.
Бактерии рожи свиней, листериоза и пастереллеза. Сущность метода заключается в определении специфического роста
этих микроорганизмов на мясо-пептонном агаре и их дифференциации по морфологическим, культуральным и биологическим
свойствам.
На мясо-пептонном агаре они растут в виде мелких прозрачных колоний. Из этих колоний готовят мазки, окрашивают
по Граму, исследуют на подвижность и проводят посев на мясопептонный агар и мясо-пептонный бульон.
Для проведения анализа пробы на каталазу к суточной
культуре добавляют 1 см3 раствора пероксида водорода массовой долей 10 %. Листерии, выделяя каталазу, расщепляют пероксид водорода с образованием пузырьков газа.
О наличии бактерий судят по характеристикам, представленным в табл. 2.
45
Таблица 2
Морфологические и культуральные свойства возбудителей рожи свиней, листериоза и пастереллеза
ПоказаХарактеристика бактерий
тель
Рожа свиней
Листериоз
Пастереллез
Рост
на Мелкие, росинчатые про- Мелкие, росинчатые прозрач- Мелкие, росинчатые,
МПА
зрачные колонии
ные колонии, через 2-3 сут - слегка опалесцируюпомутнение колоний
щие, прозрачные колонии, через 2-3 сут
приобретают серовато-белый цвет
Рост
на Слабое помутнение, под- Слабое помутнение с выпаде- Равномерное помутМПБ
нимающийся при встряхи- нием слизистого осадка, при нение с осадком
вании осадок
встряхивании которого образуется косичка
МазкиНеспорообразующие, тон- Неспорообразующие короткие Неспорообразующие
отпечатки кие, прямые или слегка палочки с закругленными кон- мелкие,
биполярно
из
мате- изогнутые палочки, иногда цами; расположены поодиноч- окрашивающиеся париала
нити
ке, попарно, в форме римской лочки
цифры V или в виде палисада
46
Мазки из Короткие, прямые или изокультуры
гнутые палочки; при хроническом течении инфекции - короткие тонкие палочки и удлиненные цепочки и нити
Окраска
Положительная
по Граму
ПодвижНеподвижны
ность
Проба на Отрицательная
каталазу
Продолжение таблицы 2
Короткие, прямые, овоидные Мелкие палочки, бипалочки, иногда почти кокки; полярность
почти
располагаются кучками или всегда отсутствует
поодиночке
Положительная
Отрицательная
Подвижны лишь в молодой 6- Неподвижны
20-часовой культуре, выращенной при 20-22°С
Положительная
Не ставят
47
Бактерии кокковой группы (стафилококки, стрептококки).
Сущность метода заключается в определении морфологии, характера роста на питательных средах и способности отдельных
стафилококков коагулировать цитратную плазму крови кролика
под воздействием фермента коагулазы.
В зависимости от пигмента, образующегося на питательных средах, различают золотистый, белый и лимонно-желтый
стафилококки (St. aureus, album, citreus). Из различных серологических групп стрептококков (А, В, D, Н) в патологии животных и человека имеют значение Str. haemolyticus, Str. viridans,
Str. faecalis. Стафилококки и стрептококки - аэробы или факультативные анаэробы шаровидной формы, располагаются в виде
единичных кокков, скоплений диплококков и в других сочетаниях, не имеют капсул и жгутиков, не образуют спор, хорошо
растут на обычных питательных средах, окрашивание по Граму
дает положительную реакцию.
Золотистый и другие виды стафилококков, а также некоторые стрептококки обладают патогенными свойствами и продуцируют токсины.
Наличие на чашках с мясо-пептонным агаром мелких прозрачных или мутноватых колоний, иногда образующих различные пигменты, вызывает подозрение на присутствие возбудителей кокковых инфекций (дилококкоза, стафилококкоза, стрептококкоза).
Дифференциальный диагноз ставят на основании микроскопического исследования (грамположительные, неподвижные,
неспорообразующие, круглые клетки, располагающиеся поодиночно, цепочками, гроздями и в виде ланцетовидных диплококков), а также определения характера роста на питательных средах.
На мясо-пептонном бульоне стафилококки и диплококки
дают равномерное помутнение с выпадением обильного осадка.
При росте стрептококков на бульоне с 2 % глюкозы бульон
остается прозрачным, а на дно пробирки выпадает осадок.
48
Для установления патогенности стафилококков ставят реакцию коагулирования плазмы крови. Плазму крови кролика,
приготовленную соответствующим образом, разливают в две
стерильные пробирки по 0,5 см. В одну из них вносят петлей суточную агаровую культуру испытуемого стафилококка, другая
пробирка служит контрольной. Внесенную культуру тщательно
перемешивают, после чего обе пробирки помещают в термостат
при температуре 37ºС. Затем пробирки осторожно, избегая
встряхивания, просматривают. Результаты реакции коагуляции
регистрируют в течение 2-4 ч и через 24 ч. Штаммы стафилококков, продуцирующие фермент плазмокоагулазу, вызывают
свертывание плазмы, вследствие чего она превращается в студнеобразную массу, не выливающуюся при перевертывании пробирки. Свертывание плазмы обозначают знаком «+» с указанием
времени, в течение которого произошла реакция. Бактерии рода
сальмонелла (Salmonella). Наиболее трудоемка часть бактериологического исследования мяса и мясопродуктов -3 установление вида бактерий, вызывающих пищевые токсикоинфекции, к
которым относятся сальмонеллы. Бактерии различный видов
рода Salmonella по морфологическим и культуральным свойствам друг от друга не отличаются; помимо этого они имеют общие признаки с бактериями рода Е. coli (кишечная группа) и рода Shigella (дизентерийная группа).
Сущность метода выявления сальмонелл заключается в
определении их характерного роста на элективных (избирательных) cpeдах и установлении их специфических ферментативных
и серологических свойств.
Сальмонеллы выявляют в четыре последовательных этапа:
первичный посев, обогащение, посев со среды обогащения и
подтверждение.
На первом этапе из взвеси исследуемого материала делают
посев на плотные элективные среды. Эти среды выдерживают в
термостате при 37°С в течение 18—24 ч и определяют наличие
колоний типичных или подозрительных на сальмонеллы.
На плотных элективных средах сальмонеллы растут в виде
характерных колоний, на среде Эндо - в виде круглых бесцвет49
ных или слегка розоватых прозрачных (полупрозрачных) мелких колоний. На среде Левина сальмонеллы растут в виде прозрачных бледных нежно-розовых или розовато-фиолетовых колоний.
На втором этапе (этапе обогащения) для накопления сальмонелл проводят посев на жидкие селективные среды (среду
Киллиана) и выдерживают в термостате при температуре 37°С.
На третьем этапе осуществляют пересев из жидких сред на
плотные селективные диагностические среды, которые после
термостатирования исследуют на присутствие колоний типичных или подозрительных на сальмонеллы.
На четвертом этапе проводят подтверждение наличия бактерий из рода сальмонелл определением морфологических, биохимических и серологических свойств.
При наличии роста микроорганизмов на питательных средах берут три-пять подозрительных колоний с каждой чашки. Из
части колоний готовят мазок, окрашивают по Граму, микроскопируют. Одновременно исследуют на подвижность в «висячей»
капле. Оставшуюся часть колонии растирают в конденсационной воде скошенного агара или в одной-двух каплях добавленного к агару стерильного бульона. Эта взвесь служит исходным
материалом для биохимической и серологической типизации.
Сальмонеллы относятся к одному из 12 родов семейства
бактерий Enterobacteriacae. По серологической типизации систематизировано около 2000 серотипов сальмонелл. Они встречаются (обитают) в кишечнике животных и человека, а также во
внешней среде. Морфологически эти палочки имеют закругленные концы, иногда овальной формы, длиной 2-4 и шириной 0,5
мкм. Подвижны, окрашивание по Граму дает отрицательную реакцию, спор и капсул не образуют. Аэробы или факультативные
анаэробы. Оптимальная реакция среды для роста - слабощелочная (рН 7,2-7,5), оптимальная температура роста 37 0С, хотя
сальмонеллы хорошо растут и при комнатной температуре, и
даже при низких плюсовых температурах (5-8 °С). По росту на
простом агаре и обычных жидких питательных средах сальмонеллы почти неразличимы. На мясо-пептонном агаре гладкие
50
формы (S-формы) этих бактерий образуют круглые, полупрозрачные, выпуклые, иногда со слегка вдавленным центром и
влажные колонии с легким металлическим блеском. Шероховатые (R-формы) растут в виде неровно округленных, шероховатых, тусклых и сухих колоний. На скошенном агаре растут
пышно, образуя в конденсационной воде сильную муть, на мясо-пептонном бульоне они вызывают равномерное помутнение
среды, желатин не разжижают, индол не образуют, молоко не
ферментируют.
Сальмонеллы продуцируют эндотоксины - глюцидолипоидо-полипептидные комплексы, тождественные с соматическим
антигеном бактерий, термостабильные. При парентеральном
введении они высокотоксичны.
Вместе с большой общностью морфологических и культуральных характеристик, а также токсинообразования бактерии
рода Salmonella отличаются друг от друга по биохимическим и
антигенным (серологическим) свойствам. Эти различия положены в основу методов типизации (установления видов) бактерий
рода Salmonella.
Условно-патогенные бактерии. Определенную роль в пищевых токсикоинфекциях могут играть некоторые бактерии,
объединяемые под названием «условно-патогенные». К ним относят группы кишечной палочки и протея, которые могут быть
источниками пищевых отравлений. Морфологически они представляют собой палочки с закругленными концами или овальной формы, длиной 1-4 и шириной 0,5-0,6 мкм. За исключением
некоторых видов, эти бактерии подвижны, окрашивание по
Граму дает отрицательную реакцию, спор и капсул не образуют,
аэробы хорошо растут на обычных питательных средах.
Название «кишечная палочка» носит собирательный характер, виды отличаются друг от друга культуральными, биохимическими, серологическими и патогенными свойствами.
Биохимически кишечные палочки весьма активны. Все они
расщепляют лактозу, глюкозу, маннит, мальтозу, декстрозу, галактозу и ксилозу; разжижают желатин, редуцируют нитраты в
нитриты, подавляющее большинство образует индол, но не раз51
лагает инозита и не образует сероводорода. Для выделения кишечной палочки из различных объектов и дифференциации их
подгрупп в лабораторных условиях используют элективные среды Эндо, Левина, Плоскирева и Хейфеца.
При выявлении бактерий из рода кишечной палочки (рода
Escherichia) определяют морфологию, характер роста на элективных средах с лактозой, неспособность образовывать цитохромоксидазу, утилизировать цитрат, образовывать сероводород
и способность продуцировать индол.
На среде Эндо бактерии из рода кишечной палочки растут
в виде красных с металлическим блеском (или без блеска), розовых с красным центром или белых колоний; на среде Левина - в
виде темно-фиолетовых блестящих колоний; на среде Плоскирева - в виде кирпично-красных с глянцевой поверхностью колоний.
Для определения подвижности культуры готовят препарат
«раздавленная капля» и микроскопируют. Бактерии кишечной
палочки чаще подвижны.
При наличии колоний, характерных для бактерий кишечной палочки (рода Escherichia), их выделяют из других сходных
микроорганизмов по биохимическим свойствам (табл. 3).
52
Таблица 3
Биохимическая дифференциация бактерий групп кишечной палочки и протея
Биохимические дифференцирующие
Род микроба
свойства
Биохимические варианты Escherichia Рг.
Рг. mivulrabilis
1
2
3
4
5
6
garis
Образование сероводорода на трех+
+
сахарном агаре с солью Мора
Образование газа на глюкозе, на +
+
+
+
+
трехсахарном агаре с солью Мора
Ферментация раствора лактозы мас- +
+
+
+
совой долей 10%
Образование индола
+
+
+
+
+
Расщепление мочевины
+
+
Утилизация цитрата (на среде СимРазРазмонса)
лично
лично
Подвижность
+/- +/+/+/+/+/+
+
Ферментация мальтозы
+
+
+
+
+
+
+
Ферментация маннита
+
+
+
+
+
+
Примечание. Под знаком «+» в таблице обозначен положительный результат; знаком «-» отрицательный результат; знаком «+/-» - положительный или отрицательный результат.
53
Бактерии рода Proteus. Сущность метода заключается в определении морфологии, роста на питательных средах.
На обычных средах бактерии рода Proteus растут в виде
вуалеобразного налета (Н-форма), при микроскопировании которого находят полиморфные грамотрицательные подвижные
палочки. Это указывает на присутствие вульгарного протея. Однако могут быть определены изолированные колонии средней
величины, нежные полупрозрачные с розоватым центром (0форма). При микроскопировании этих колоний палочки лишены
жгутиков и неподвижны.
Для подтверждения наличия протея (Н-форма) проводят
посев в конденсационную воду скошенного агара (по Шукевичу). Для обнаружения О-форм делают посев на среде Плоскирева. На этой среде протей растет в виде прозрачных колоний с
характерным запахом. Общую характеристику признаков выявления см. в табл. 3.
2.2. Обнаружение анаэробов
К анаэробам, представляющим большую опасность для
людей и животных, относят палочку ботулиниум (Cl. botulinum)
и перфрингенс (Cl. perfringens).
Cl. botulinum - слабоподвижная палочка длиной 4-8 и шириной 0,6-0,8 мкм, окрашивание по Граму дает положительную
реакцию. Спора обычно располагается на конце палочки, в связи
с чем споровые формы микроба имеют вид теннисной ракетки и
короткой свечи с пламенем. Вегетативные формы Cl. botulinum
инактивируются при 800С в течение 30 мин, а споры не погибают при кипячении даже в течение 4-5 ч. Палочка ботулиниум
относится к группе сапрофитных почвенных микробов, широко
распространенных в природе. Она присутствует в почве, листьях, траве, сене, овощах, фруктах, на поверхности тела и в кишечнике крупных рыб, кишечном канале человека и животных,
навозе и т. д. Различают шесть серотипов этого возбудителя, которые обладают различной патогенностью по отношению к животным и человек Последние заболевают ботулизмом только
54
при проникновении в организм токсинов, накопившихся в продуктах и кормах.
При наличии анаэробных условий в продуктах и кормах
животного и растительного происхождения Cl. botulinum продуцирует токсин, в среднем по активности в семь раз превышающий столбнячный. Образование токсина происходит при температуре выше 200С. Однако имеются сведения, что он может образовываться и при 10°С, исключение составляет серотип Е, который может продуцировать токсин даже при температуре
3,3°С. Содержание в продуктах поваренной соли 6 % и более
тормозит образование токсина, а при содержании соли более 10
% токсин вообще не образуется. Для образования токсина оптимальной является нейтральная среда (рН 6,95-7,0). Кислая среда
препятствует развитию возбудителя ботулизма, поэтому в продуктах, где происходит молочнокислое брожение (моченые яблоки, кислая капуста, соленые огурцы и томаты), токсин развивается слабо. Однако кислая среда не разрушает токсин, а щелочная способна его разрушить. Токсин не обладает и высокой
термостабильностью. При температуре 80°С и выше он разрушается в течение 30-60 мин, а при 1000С - через 10-15 мин. Для
образования ботулинического токсина требуется 5-7 сут, поэтому употребление в пищу свежих продуктов после тепловой стерилизации к отравлению не приводит.
Cl. perfringens - короткая, спорообразующая, неподвижная,
грамположительная палочка, анаэроб. Существуют 6 типов Cl.
perfringens, обозначаемых начальными буквами латинского алфавита. Некоторые представители этих типов могут быть патогенными. Типы В, С, D, Е являются возбудителями энтеротоксемии различных животных, а тип С служит также возбудителем
некротического энтерита у людей.
В отличие от ботулизма пищевые заболевания, связанные с
заражением продуктов Cl. perfringens, отнесят к токсикоинфекциям.
Сущность выявления анаэробов заключается в определении их способности расти в отсутствие кислорода воздуха, морфологии возбудителей и роста на питательных средах.
55
Удовлетворительные анаэробные условия создаются в
жидкой питательной среде, где в качестве восстановителя применяют мясо, печень, которые одновременно служат и источником питания.
Среда должна быть расфасована во флаконы или пробирки
таким образом, чтобы площадь поверхности среды по абсолютной величине не превышала 1/10 ее объема и поверхность ее
была изолирована от кислорода воздуха.
Диагноз на анаэробные инфекции ставят на основании
бактериоскопии, посева материала на питательные среды и биопроб на лабораторных животных.
Для бактериоскопии готовят 2-5 мазков-отпечатков из каждой пробы и окрашивают по Граму или метиленовой синью, а
при необходимости выявления спор или капсул сибиреязвенных
бацилл - по методу Ребигера. При микроскопировании обращают внимание на форму, наличие спор и капсул и расположение
отдельных микроорганизмов.
Для посева на питательные среды пробы обжигают и навеску массой около 10 г растирают в стерильной ступке с физиологическим раствором в соотношении 1 : 2.
По 3-5 см3 приготовленной взвеси засевают пипеткой по
0,5 мл исходной взвеси в четыре большие пробирки с мясной
средой Китт-Тароцци, залитой слоем вазелинового масла толщиной 0,5 см. предварительно пробирки прогревают на водяной
бане при температуре кипения в течение 20-30 мин, а затем быстро охлаждают до температуры не ниже 500С.
Посевы перед термостатированием прогревают при температуре 800С в течение 20 мин (одну пробирку); при температуре
60°С в течение 15 мин (одну), две пробирки не нагревают.
Две пробирки - одну непрогретую и одну прогретую до
600С - выдерживают при комнатной температуре, другие две
пробирки (непрогретую и прогретую при 80°С) инкубируют при
температуре 37°С для выявления остальных анаэробов.
Термостатирование проводят в течение 7 сут, за ростом
наблюдают ежедневно. При обнаружении роста проводят микроскопическое исследование. В первых двух пробирках растет
56
Cl. botulinum, в двух вторых остальные анаэробы, в основном Cl.
Perfringens.
Контрольные вопросы:
1. Способы стерилизации посуды.
2. Способы стерилизации и классификация сред.
3. Случаи проведения бактериологического анализа
4. Схема проведения бактериологического анализа.
5. Методика проведения анализа.
6. Характеристика роста различных микроорганизмов и
их признаки.
7. Выводы по проделанной работе.
Лабораторная работа № 8
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБНЫХ КОНТАМИНАНТОВ
В КОЛБАСАХ И МЯСОПРОДУКТАХ
Цель работы. Приобрести практический навык в анализе
микробных контаминантов мясных продуктов на основе бактериологического анализа.
Задачи. Отбор и подготовка проб, определение общей
микробной обсемененности и анализ на выявление отдельных
наиболее опасных возбудителей токсикоинфекций.
Объекты исследования. Продукты кулинарной готовности
из мяса на основе цельномышечной ткани (деликатесная продукция в ассортименте), студни, паштеты, мясные хлеба.
Методические указания. Обсеменение мясных изделий
микрофлорой происходит в основном через сырье, оборудование, инвентарь, тару и т. п. По количественному и качественному составам микрофлора сырого мясного сырья разнообразна.
Общее количество микроорганизмов в 1 г сырого мясного фарша, например, составляет 0,6•105 - 1,4 106.
В готовых копченых изделиях не должно быть патогенной
и условно-патогенной микрофлоры.
Бактериологический анализ колбасных изделий и продуктов из мяса включает определение: общего количества микроорганизмов; бактерий группы кишечной палочки; бактерий рода
57
Salmonella; бактерий рода Proteus; коагулазоположительных
стафилококков; сульфитредуцирующих рода Clostridium
perfringens.
Обнаружение кишечной палочки и протея в глубоких слоях продукта указывает на нарушение технологии изготовления,
прежде всего температурного режима. Наличие в колбасных изделиях кишечной палочки свидетельствует о неудовлетворительных санитарно-гигиенических условиях технологического
процесса и обязывает принять незамедлительные меры по их
улучшению.
При наличии кишечной палочки и протея, но при хороших
органолептических показателях вареные и полукопченые колбасы направляют на переработку на низшие сорта с повторной
проваркой. Сыровяленые и сырокопченые изделия в этом случае
дополнительно выдерживают 10—12 сут и повторно исследуют
в лаборатории на наличие микрофлоры. При отрицательном результате продукцию реализуют без ограничений, при положительном - перерабатывают на вареные виды колбас.
При обнаружении в колбасных изделиях аэробных сапрофитов (В. subtilis, В. mesentericus) или спорообразующих непатогенных анаэробов (В. putrificus, В. sporogenes и др.), но при
хороших органолептических показателях продукцию выпускают
без ограничений.
Анализ продуктов из мяса рекомендуется проводить по
следующему плану:
бактериоскопическое исследование продуктов из мяса;
посев на среду Эндо для определения обсемененности их
бактериями группы кишечной палочки;
посев для учета общего количества микроорганизмов в 1 г
продукта;
посев в конденсационную воду скошенного агара (по Шукевичу) с целью выявления протея.
По истечении времени (24-48 ч) рекомендуется организовать анализ по плану:
изучение характера роста микрофлоры на питательных
средах;
58
подсчет общей бактериальной обсемененности продукта;
приготовление мазков из подозрительных колоний с окрашиванием по Граму и микроскопированием;
определение подвижности микроорганизмов;
пересев на одну из сред накопления (Мюллера, Киллиана
или Кауфмана);
изучение биохимических и антигенных свойств выросшей
культуры и идентификация вида микроорганизма.
Предложенный план может быть изменен.
Микробиологическое исследование колбасных изделий заключается в приготовлении мазков-отпечатков из поверхностных и глубинных слоев батона и посеве на питательные среды с
последующим изучением полученной культуры и подсчетом количества микробных тел в 1 г продукта.
Для бактериоскопического исследования пробы берут непосредственно из-под оболочки и из середины батона. Если
колбасное изделие без оболочки, то срезают верхний слой на 1-2
мм. Стерильными ножницами вырезают два кусочка колбасы и
прикладывают к поверхности предметного стекла. Подсушивают, фиксируют над пламенем горелки, окрашивают по Граму и
микроскопируют.
В случае порчи колбас накопление микрофлоры отмечается в мазках-отпечатках из поверхностных слоев.
Для выявления аэробов и анаэробов, а также для подсчета
общего количества микробных тел в 1 г готового продукта готовят взвесь, которая служит исходным материалом для посева на
питательные среды.
Определение общего количества микробов в колбасных
изделиях служит дополнительным методом установления их
свежести. Наличие более 1,5 млн микробов в 1 г продукта свидетельствует о его порче.
Подготовка проб. Учитывая, что микробы развиваются в
мясных и колбасных изделиях неравномерно (погнездно), пробы
для приготовления взвеси отбирают как можно с большей площади продукта.
59
Отбор точечных проб в условиях производства для бактериологического анализа проводят в соответствии с действующей нормативной документацией.
В зависимости от вида продукта объединенную пробу массой 50 г составляют из точечных проб следующим образом:
- колбасные изделия в оболочке и продукты из свинины,
баранины и говядины помещают в металлический или эмалированный тазик (тарелку), тщательно протирают ватным тампоном, смоченным этанолом, и дважды обжигают над пламенем.
Затем батоны разрезают вдоль стерильным ножом или скальпелем на две половинки, не рассекая оболочку противоположной
стороны батона. Пробу отбирают из нескольких участков центральной части и из-под оболочки обеих половинок батона;
- из свиных, бараньих, говяжьих продуктов на костях и из
бекона пробы вырезают стерильным инструментом из различных участков обожженного образца на глубине 2—3 см от поверхности, предпочтительно ближе к кости;
- изделия без оболочки (мясные хлебы, паштеты, студни и
другие изделия) исследуют с поверхности и в глубине продукта.
Пробы помещают в пробирки, заполненные на 3/4 их высоты средой «ХБ», Хейфеца или 5 см3 среды Кесслера.
Для анализа глубинных участков продукта образцы помещают в металлический или эмалированный тазик (тарелку),
смачивают этанолом и обжигают. Затем делают продольный
разрез и отбирают навеску методом, указанным для колбасных
изделий и продуктов в оболочке, составляя из них одну объединенную пробу для каждого образца в отдельности, которую помещают в предварительно взвешенный стерильный бюкс или
чашку Петри.
Из объединенной пробы каждого образца в стерильную
посуду (пергамент) берут навеску массой 20 г с точностью
± 0,1 г.
Навеску помешают в стерильную колбу (стакан) и гомогенизируют для приготовления испытуемой взвеси. При отсутствии гомогенизатора допускается готовить взвесь путем растирания 20 г продукта в стерильной фарфоровой ступке с 2-3 г сте60
рильного песка, постепенно приливая 80 см3 раствора стерильной пептонной воды массовой долей 0,1 % или физраствора.
При растирании проб вареных изделий мажущейся консистенции (ливерные, кровяные колбасы) стерильный песок можно не
добавлять.
Для посевов на питательные среды стерильной градуированной пипеткой отбирают взвесь после 15 мин выдержки при
комнатной температуре. 1 см3 приготовленной взвеси содержит
0,2 г продукта.
1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО КОЛИЧЕСТВА
МИКРООРГАНИЗМОВ
Сущность метода заключается в способности мезофильных
аэробов и факультативных анаэробов расти на питательном агаре при температуре (37,0 ± 0,5) °С с образованием колоний, видимых при увеличении в 5 раз. Метод не распространяется на
сырокопченые колбасы.
Порядок проведения анализа. Для определения общего количества микроорганизмов микропипеткой берут 0,1 см3 взвеси
из верхнего слоя жидкости, выливают на середину стерильной
чашки Петри и заливают 12—15 см3 остуженного мясопептонного агара (45-50°С), равномерно распределяя его по всей
поверхности. Чашку помещают в термостат и спустя 48 ч подсчитывают общее количество колоний на поверхности среды и в
глубине.
Мясо-пептонный агар расплавляют на водяной бане и охлаждают до температуры 45ºС. Стерильные чашки Петри раскладывают на столе, подписывают наименование анализируемого продукта, дату посева и количество посеянного продукта.
Из каждой пробы должно быть сделано не менее двух посевов, различных по объему, взятых с таким расчетом, чтобы на
чашках выросло от 30 до 300 колоний. При этом на одной чашке
Петри проводят посев 0,1 г, а на другой — 0,01 г продукта.
Для посева 0,1 г продукта готовят первое разведение испытуемой взвеси: стерильной пипеткой с широким концом отбирают 5 см3 испытуемой взвеси, переносят ее в пробирку с 5 см3
61
стерильного физиологического раствора или пептонной воды.
Конец пипетки должен быть опущен ниже поверхности раствора, не прикасаясь к стенкам пробирки, чтобы избежать смывания бактерий с наружной стороны. 1 см3 полученного раствора
содержит 0,1 г испытуемого продукта.
Другой стерильной пипеткой тщательно перемешивают
содержимое пробирки продуванием, отбирают 1 см3 и переносят
в стерильную чашку Петри, слегка приоткрывая крышку.
Для посева 0,01 г продукта готовят следующее разведение:
стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое
пробирки, отбирают 1 см3 и переносят в пробирку с 9 см3 стерильного физиологического раствора. 1 см3 испытуемого раствора вторичного разведения содержит 0,01 г испытуемого продукта. 1 см3 этого раствора переносят в стерильную чашку Петри так, как описано выше. При необходимости таким же образом готовят последующие разведения.
После внесения разведения анализируемой взвеси в чашки
Петри последнюю заливают 12-15см3 расплавленного и охлажденного питательного агара при фламбировании краев пробирки
или бутылки, где он содержится. Быстро смешивают с мясопептонным питательным агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, незалитых участков дна чашки Петри,
попадания среды на края и крышку чашки.
Для того, чтобы помешать развитию на поверхности агара
спорообразующих микробов и бактерий группы протея в Нформе, допускается наслоение расплавленного и охлажденного
до температуры 45—50 °С голодного агара толщиной 3—4 мм.
После застывания агара чашки Петри перевертывают и
помещают в термостат температурой 37°С на 48 ч. Затем подсчитывают общее количество колоний бактерий, выросших на
чашках.
Колонии, выросшие как на поверхности, так и в глубине
агара, подсчитывают при помощи лупы с пятикратным увеличением или специальным прибором с лупой. Для этого чашку кла62
дут вверх дном на черный фон и каждую колонию отмечают со
стороны дна тушью или чернилами для стекла.
Для определения общего количества микробов в 1 г продукта подсчитанное количество колоний умножают на степень
разведения анализируемого продукта.
За окончательный результат определения количества бактерий в 1 г анализируемого продукта принимают среднее арифметическое результатов подсчета двух чашек разной массы продукта.
2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИЙ ГРУППЫ КИШЕЧНОЙ
ПАЛОЧКИ
Метод основан на способности бактерий группы кишечной
палочки расщеплять глюкозу и лактозу. При этом в средах
«ХБ», Хейфеца и КОДА образуются кислые продукты, меняющие цвет индикаторов, а в среде Кесслера в поплавке вследствие
расщепления лактозы образуется газ.
Порядок проведения анализа. Для установления характера
микрофлоры по 0,1 см3 взвеси наносят на поверхность мясопептонного агара и среды Эндо, равномерно распределив ее по
всей площади. После суточного термостатирования изучают
морфологию выросших колоний, а из подозрительных на кишечную палочку или на сальмонеллы готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. При необходимости идентификации микробов взвесь пересевают на среду накопления и типизируют по биохимическим и серологическим свойствам.
В пробирки, содержащие по 5 см3 среды «ХБ», среды
Хейфеца двойной концентрации или среды КОДА, вносят стерильной пипеткой вместимостью 5-10 см3 с широким концом по
5 см3 испытуемой взвеси. Для анализа можно также использовать среду Кесслера (10см3).
Пробирки со средами «ХБ», Кесслера, Хейфеца и КОДА
помещают в термостат температурой (37 ± 0,5) °С на 18-20 ч.
Посевы смывов, отобранных тампонами с поверхности изделий без оболочки, выдерживают при температуре 43°С (для
обнаружения повторного бактериального загрязнения).
63
При росте бактерий группы кишечной палочки среды
«ХБ» и КОДА окрашивают в желтый цвет, среда Хейфеца приобретает также желтый цвет, который может изменяться до салатно-зеленого, на среде Кесслера в поплавке образуется газ.
Для окончательного заключения о наличии в продукте
бактерий группы кишечной палочки проводят высев со среды
Кесслера (забродившие пробирки) или Хейфеца (с измененным
цветом среды) в чашки Петри со средой Эндо или Плоскирева,
или Левина. Чашки Петри помещают в термостат температурой
37°С на 18— 20 ч, после чего посевы просматривают. На среде
Эндо бактерии группы кишечной палочки образуют темнокрасные колонии с металлическим блеском или розово-красные
без блеска, на среде Плоскирева - кирпично-красные с глянцевой поверхностью, на среде Левина - темно-фиолетовые или
фиолетово-черные блестящие колонии. Из подозреваемых колоний готовят мазки, которые окрашивают по Граму.
Специфическое изменение сред «ХБ» и КОДА не требует
дальнейшего подтверждения.
При заведомо высокой обсемененности анализируемый
продукт массой не более 0,25 г помещают в пустую пробирку, в
которую закладывают комочек стерильной фильтровальной бумаги размером 5x5 см, и стерильной стеклянной палочкой или
фламбированной проволокой проталкивают материал до дна, не
уплотняя. В пробирку наливают среду «ХБ», КОДА или Хейфеца (нормальной концентрации), заполняя ее на 3/4 высоты пробирки. Последнюю помещают в термостат температурой 37°С
на 8-10ч. При росте бактерий группы кишечной палочки на средах «ХБ» и КОДА среда изменяет свой цвет из фиолетовопурпурного в желтый, на среде Хейфеца - из краснофиолетового в желтый, который затем может меняться до салатно-зеленого.
Пробы, отобранные с поверхности изделий без оболочки
тампонами, анализируют аналогично.
Обнаружение грамотрицательных не образующих спор палочек, специфически изменяющих цвет жидких дифференциально-диагностических сред и образующих характерные коло64
нии на элективных средах с лактозой, указывает на наличие бактерий группы кишечной палочки.
3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ БАКТЕРИЙ ИЗ РОДА SALMONELLA
Сущность метода заключается в определении характерного
роста сальмонелл на элективных средах. При необходимости рекомендуется проводить идентификацию биохимических и серологических свойств.
Порядок проведения анализа. Навеску продукта массой 25
г, взятую из объединенной пробы, вносят во флакон Сокслета,
содержащий 100см3 среды обогащения (Мюллера, Кауфмана,
хлористомагниевой среды «М»). Жидкость во флаконе должна
подняться до отметки 125 см3. Флаконы тщательно встряхивают
и помещают в термостат температурой 37 °С. Через 16—24 ч
после тщательного перемешивания с помощью бактериологической петли (диаметр 0,4—0,5 мм) или пастеровской пипетки
проводят высев из среды обогащения в чашки Петри с предварительно подсушенной средой Эндо, Плоскирева, Левина или
Вильсона- Блера (по выбору).
Чашки с посевами помещают в термостат температурой
37 °С. Посевы, выращенные на средах Эндо, Плоскирева и Левина, просматривают через 16—48 ч, на висмут-сульфитном
агаре через 24—48 ч.
На среде Эндо бактерии из рода сальмонелл образуют бесцветные или с розовым оттенком колонии.
На среде БФА сальмонеллы образуют крупные, гладкие,
красноватого оттенка прозрачные колонии (колонии сальмонеллы Salm. tuphius, как и на среде Эндо, мелкие). Бактерии группы
кишечной палочки образуют колонии желто-зеленоватого цвета.
Бактерии группы протея дают рост через 72 ч.
На среде Плоскирева сальмонеллы растут в виде бесцветных колоний, но они более плотные и несколько меньшего размера, чем на среде Эндо.
На среде Левина сальмонеллы растут в виде прозрачных,
бледных, нежно-розовых или розовато-фиолетовых колоний. На
висмут-сульфитном агаре сальмонеллы растут в виде черных
65
или коричневых колоний с характерным металлическим блеском. При этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией. Исключение составляют некоторые
серологические типы из группы С, которые на этой среде растут
в виде нежных светло-зеленых или крупных серовато-зеленых
колоний.
Изолированные колонии, характерные для бактерий из рода Salmonella, пересевают на среду Крумвиде-Олькеницкого в
модификации Ковальчука штрихом по скошенной поверхности
и уколом в столбик. Посевы помещают на 12—16 ч в термостат
температурой 37 °С.
При росте бактерий из рода сальмонелл цвет скошенной
поверхности среды Крумвиде-Олькеницкого в модификации
Ковальчука розовый, столбика - желто-бурый; газообразование
устанавливают по наличию трещин и разрыву столбика агара,
сероводородобразующие вызывают потемнение столбика.
Другие грамотрицательные бактерии дают следующие изменения цвета среды:
бактерии группы кишечной палочки - вся среда окрашивается синий или сине-зеленый цвет с образованием газа или без
него;
бактерии из группы протея - среда окрашивается в яркокрасный цвет, может образоваться черный осадок;
шигеллы и возбудители брюшного тифа - косяк окрашивается в розовый цвет, столбик - в синий или сине-зеленый.
Вместо среды Крумвиде-Олькеницкого в модификации
Ковальчука допускается посев на углеводные среды в короткий
пестрый ряд, включая среды с глюкозой, лактозой, сахарозой,
маннитом и мальтозой, полужидкий агар уколом (для определения подвижности) и бульон Хоттингера (для определения образования индола и сероводорода).
Для дальнейшей идентификации бактерий готовят мазки,
которые окрашивают по Граму, микроскопируют и изучают серологические свойства микроорганизмов путем постановки
пробной агглютинации на предметном стекле с агглютинирующей адсорбированной поливалентной сальмонеллезной О66
сывороткой. При получении положительной реакции на стекле с
поливалентной сывороткой проводят идентификацию с помощью монорецепторных агглютинирующих О-сывороток.
Установив серологическую группу, к которой относятся
исследуемые бактерии, с помощью Н-сывороток можно определить тип бактерий.
Обнаружение подвижных (кроме S. pullorum и S.
gallinarum) грамотрицательных палочек, дающих характерный
рост на элективных средах, не ферментирующих лактозу и сахарозу, ферментирующих глюкозу и маннит с образованием кислоты и газа (Salm. typhisuis не ферментирует маннит), дающих
положительную реакцию агглютинации с монорецепторными Ои Н-сальмонеллезными сыворотками, указывает на наличие бактерий из рода Salmonella.
4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕЯ
Метод основан на определении морфологии и роста на питательных средах, способности гидролизовать мочевину и образовывать сероводород.
Порядок проведения анализа. Для определения присутствия протея вносят 0,1 см3 взвеси в конденсационную воду скошенного мясо-пептонного агара (по Шукевичу), термостатируют 18—24 ч и изучают полученную культуру.
Для подтверждения наличия протея в Н-форме 0,5 см3 анализируемой взвеси вносят в конденсационную воду свежескошенного мясо-пептонного агара, разлитого в широкие пробирки,
не касаясь поверхности среды (метод Шукевича). Пробирки помещают в термостат температурой 37°С строго вертикально.
Через 18—24 ч посевы просматривают. Обращают внимание на
образование ползучего вуалеобразного налета с голубым оттенком; на скошенном мясо-пептонном агаре культура поднимается
из конденсационной жидкости вверх по поверхности среды. При
появлении характерного роста микробов рода Proteus окрашенные по Граму мазки микроскопируют и изучают подвижность
микробов в «раздавленной» или «висячей капле».
67
Для обнаружения нероящихся О-форм можно проводить
посев на поверхность среды Плоскирева. О-форма протея растет
на этой среде в виде прозрачных колоний, слегка подщелачивающих среду, окрашивая ее в желтый цвет. После пересева на
среду Крумвиде- Олькеницкого в модификации Ковальчука при
наличии бактерий из группы протея среда окрашивается в яркокрасный цвет (вследствие расщепления мочевины) и может образовываться черный осадок с возможным разрывом агарового
столбика (вследствие образования сероводорода).
Обнаружение в среде полиморфных грамотрицательных
палочек, образующих характерный рост на средах в R-форме
(подвижные) и О-форме (неподвижные), ферментирующих глюкозу и мочевину и не ферментирующих лактозу и маннит, указывает на наличие бактерий из рода Proteus.
5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОАГУЛАЗОПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ
СТАФИЛОКОККОВ
Сущность метода заключается в определении морфологии,
характера роста на питательных средах и в способности отдельных стафилококков продуцировать лецитиназу и коагулировать
цитратную плазму крови кролика под воздействием фермента
коагулазы.
Порядок проведения анализа. Из разведения анализируемой взвеси продукта (1:10) в физиологическом растворе или
пептонной воде для выявления пигмента проводят посевы на
молочно-солевой агар, содержащий 6,5 % хлорида натрия, или
желточно-солевой агар, содержащий 6,5 % хлорида натрия, для
выявления лецитиназной активности.
Взвесь объемом 0,2 см3 наносят на поверхность агара и
равномерно растирают по всей поверхности агаровой среды.
Посевы термостатируют в течение 24 ч при температуре 37 0С и
в течение 24 ч выдерживают при комнатной температуре.
На поверхности питательной среды колонии стафилококка
имеют вид плоских или слегка выпуклых блестящих колоний с
ровным краем. При этом на молочно-солевом агаре лучше проявляется пигмент (эмалево-белый или золотистый), а желточно68
солевом агаре колонии стафилококков могут образовывать радужный венчик, что является одним из признаков их патогенности.
Из подозрительных колоний готовят препараты, которые
окрашивают по Граму. При наличии стафилококков в препарат
грамположительные мелкие кокки располагаются в виде неправильных гроздьев.
Для подтверждения признаков патогенности стафилококке
ставят реакцию плазмокоагуляции. В пробирку с 0,5 см3 цитратной плазмы крови кролика, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1:4, вносят петлю чистой суточной культуры стафилококка и ставят в термостат при температуре 37°С.
Результаты реакции плазмокоагуляции фиксируют через 3-4 ч
(встряхивая пробирку) и оставляют в термостате на сутки для
окончательного заключения.
Для постановки реакции плазмокоагуляции можно использовать также сухую цитратную плазму крови кролика. Реакцию
считают положительной, если плазма коагулируется в сгусток.
Для определения количества стафилококков учитывают
колонии стафилококков, давшие положительную реакцию плазмокоагуляции. При расчете на 1 г продукта количество колоний
умножают на степень разведения и на количество посевного материала.
6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУЛЬФИТРЕДУЦИРУЮЩИХ
КЛОСТРИДИЙ
Сущность метода заключается в специфическом росте клостридий перфрингенс в средах СЦС и Вильсона-Блера, на которых в результате восстановления сульфита натрия в сульфат натрия происходит взаимодействие с хлоридом железа и фиксируется почернение среды за счет сульфида железа.
Порядок проведения анализа. Анализируемую взвесь объемом 1 см3 стерильной пипеткой вносят в пробирку с 9 см3 жидкой сульфит-циклосериновой среды (среды Вильсона-Блера),
затем проводят последовательные пересевы на аналогичные
объемы среды, в результате чего получают возрастающие деся69
тикратные разведения суспензии. Инкубируют в течение 8—12ч
при 46 °С. При наличии роста сульфитвосстанавливающих клостридий фиксируют почернение среды.
Почернение среды Вильсона—Блера могут вызвать многие
энтеробактерии. Для подтверждения роста сульфитвосстанавливающих клостридий используют пересев в пробирки со средой
Китта-Тароцци, предварительно прогретой в течение 25 мин в
водяной бане при температуре кипения и быстро охлажденной
до 45 °С. Термостатирование посевов проводят при (37 ± 0,5) °С,
ежедневно в течение 5 сут, проверяя в них помутнение среды,
выделение газа, появление постороннего запаха, иногда разложение кусочков печени. Сразу после появления признаков роста
готовят микроскопический препарат. Для этого материал берут
пастеровской пипеткой со дна пробирки. При микроскопировании отмечают грамположительные палочки, образующие овальные споры.
У спорообразующих грамположительных микроорганизмов выявляют каталазную активность с помощью раствора пероксида водорода концентрацией 30 г/дм3. Отсутствие пузырьков газа при добавлении к капле культуральной жидкости такого
же объема раствора пероксида водорода позволяет считать, что
в посевах присутствуют микроорганизмы из рода клостридий.
При отсутствии спор в микроскопическом препарате положительной пробы на каталазу и наличии в посевах смешанной
микрофлоры 1—2 капли накопительной среды переносят в стерильную чашку Петри и заливают расплавленной и охлажденной до 45 °С средой Вильсона—Блера. Застывшую поверхность
плотной среды заливают холодным агаром. Посевы термостатируют в течение 24—48 ч при (37 ± 0,5) °С. Появление в нижнем
слое агара черных или коричневых колоний свидетельствует о
присутствии в посевах сульфитвосстанавливающих клостридий.
За
положительный
титр
клостридий
(сульфитвосстановителей) принимают то максимальное разведение суспензий, в посеве которого произошло почернение среды. Например, если характерные изменения наблюдаются в пробирках
с разведением 10-1, то считают, что в исследуемом продукте бу70
дет 10 (или 1•101) клеток в 1 г; если характерные изменения наблюдаются в пробирках с разведением 10-2, то считают, что в
исследуемом продукте 100 (или 1•102) микробных клеток в 1 г.
Результаты бактериологического исследования колбасных и
мясных изделий оформляют в виде таблицы. При этом фиксируют морфологические и культуральные признаки выявленных
микроорганизмов, сопоставляют результаты исследований с
требованиями соответствующей нормативной документации,
дают обоснованную оценку состояния мясных продуктов.
Контрольные вопросы:
1. Способы стерилизации посуды.
2. Способы стерилизации и классификация сред.
3. Бактериологический анализ (что в себя включает и ваши действия при обнаружении различных микроорганизмов ).
4. Методика проведения анализа.
5. Характеристика роста различных микроорганизмов и
их признаки.
6. Выводы по проделанной работе.
Лабораторная работа № 9
ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИТРАТОВ И НИТРИТОВ
Цель работы. Освоить ионометрический и фотометрический методы определения нитратов и нитритов в мясе, вторичных продуктах убоя скота, мясных изделиях.
Задачи. Изучить ионометрический и фотометрические методы количественного определения нитратов и нитритов; установить содержание нитрат- и нитрит-ионов в мясе, вторичных
продуктах убоя скота, мясных изделиях различного группового
ассортимента; по результатам исследований дать санитарногигиеническую оценку мяса, вторичных продуктов убоя скота,
мясных продуктов кулинарной готовности.
Объекты исследования. Мясо различных видов убойных
животных и птицы; субпродукты I и II категорий, колбасные изделия, продукты из свинины, говядины, баранины, мяса птицы;
консервы, при изготовлении которых применяют нитрит натрия.
71
Методические указания. Среди перечня токсических и
вредных веществ, обнаруживаемых в сырье и продуктах, большое практическое значение имеет определение нитрат- и нитрит-ионов, источниками которых служат корма животных и
собственно нитрит, добавляемый для имитации цвета при производстве мясных продуктов.
Проблема производства экологически чистых продуктов
питания связана с реализацией инструментальных методов контроля вредных веществ, применяемых в условиях производства
и имеющих достаточную точность и экспрессность. Существующие фотоколориметрические, хроматографические, спектрофотометрические и химические методы определения нитратов и нитритов не отвечают в полной мере требованиям и условиям производственных лабораторий. Методики имеют ряд недостатков: длительность, использование токсичных и дефицитных реактивов, дорогостоящей аппаратуры, определенный уровень требований к квалификации оператора для выполнения работ и т. д. По сравнению с перечисленными ионоселективный
метод определения нитрат- и нитрит-ионов имеет ряд достоинств, прежде всего связанных с малой продолжительностью,
точностью и простотой определения, а также компактностью
приборов.
В зависимости от уровня материальной базы в аналитической практике могут быть применены те или иные методы.
Принципы и основная суть их изложены ниже.
Ионометрический метод определения нитрат- и нитритионов предусматривает использование ионоселективного (нитратного) электрода типа ЭМ-ЛО3-01 путем индикации и измерения ЭДС электрода на ионометре И-130 (или нитратомере).
Ионометр предназначен для измерения активности ионов водорода (рН), одновалентных и двухвалентных анионов и катионов
(рХ), окислительно-восстановительных потенциалов в цифровой
форме и в виде сигналов постоянного тока. Содержание нитратионов можно фиксировать без предварительного измерения рН.
На точность измерения не влияет присутствие фосфора, белков
и жиров. Не рекомендуется проводить определение в объектах,
72
содержащих хлорид натрия в массовых концентрациях более
3,5%.
Измерение ЭДС и определение концентрации нитратов
проводят в водной вытяжке, полученной из пробы продукта после предварительной экстракции при интенсивном перемешивании смеси с последующим фильтрованием.
Для исследования растворов с небольшими концентрациями нитрат- и нитрит-ионов используют метод добавок. В 50 см3
вытяжки измеряют ЭДС, затем в нее вводят нитрат калия так,
чтобы массовая концентрация нитрата увеличилась до значений,
соответствующих предварительно построенному калибровочному графику. По разнице значений рассчитывают искомую величину.
Для определения содержания нитритов их окисляют персульфатом аммония до нитратов. Разность между найденным
суммарным содержанием нитрат-ионов и начальной концентрацией нитрат-ионов равна концентрации нитрит-ионов.
Фотометрические методы применяют в ряде модификаций,
каждая из которых имеет практическое значение в анализе мясных продуктов и основана на той или иной химической реакции
с образованием специфически окрашенных растворов. Например, применяется метод, основанный на реакции нитрита с N-1нафтилэтилендиамином дигидрохлорида и сульфаниламидом в
фильтрате с удаленным белком с последующим фотометрированием или визуальным определением интенсивности окраски. При фотоколориметрическом определении интенсивности
окраски метод соответствует международному стандарту и применяется при разногласиях в оценке.
Используют также метод, основанный на реакции нитрита
с реактивом Грисса (смесь растворов сульфаниловой кислоты и
а-нафтиламина в уксусной кислоте) в фильтрате.
Метод определения нитрита натрия по реакции Грисса
Материалы, реактивы и оборудование. Мясорубка; весы
лабораторные; баня водяная; колбы мерные вместимостью 100,
200см3; стакан химический; конические колбы вместимостью
100см3; воронки стеклянные; фильтры беззольные бумажные;
73
фотоэлектроколориметр или спектрофотометр; раствор гидроксида натрия молярной концентрацией 0,1 моль/дм3; раствор
сульфата цинка массовой долей 0,45 %; водный раствор аммиака
молярной концентрацией 3,0 моль/дм3; раствор соляной кислоты
молярной концентрацией 0,1 моль/дм3; реактив Грисса; раствор
сравнения, содержащий 1 мкг нитрита натрия в 1 см3; рабочий
раствор нитрита натрия; кислота сульфаниловая безводная, ч. д.
а. (или х. ч.); а-нафтиламин, х. ч.
Приготовление реактивов.
Реактив Грисса. Готовят растворы 1 и 2 и смешивают их
равные объемы. В случае появления при смешивании растворов
розовой окраски добавляют цинковую пыль, взбалтывают и
фильтруют. Готовят непосредственно перед употреблением.
Раствор 1. 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в
150см3 раствора уксусной кислоты молярной концентрацией
2 моль/дм3.
Раствор 2. 0,2 г а -нафтиламина кипятят с 20 см3 воды, раствор фильтруют и прибавляют к фильтрату 180см3 раствора уксусной кислоты молярной концентрацией 2 моль/дм3. Раствор
хранят в темной склянке.
Раствор сравнения. Готовят с использованием стандартного и рабочего растворов нитрита натрия.
Для приготовления стандартного раствора нитрита натрия
взвешивают навеску нитрита натрия, содержащую 1 г основного
вещества. Массу навески (г) для химически чистого реактива с
массовой долей основного вещества 99 % вычисляют по формуле
100 ⋅1
X =
= 1, 0101
99
Навеску переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3
и доводят дистиллированной водой до метки. Для приготовления рабочего раствора нитрита натрия 10 см3 основного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 500 см3 и доводят
водой до метки. Рабочий раствор нитрита натрия используется
для построения калибровочного графика.
74
Для приготовления раствора сравнения 5 см3 рабочего раствора переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят водой до метки. 1 см3 раствора сравнения содержит 0,001 мг
(или 1 мкг) нитрита натрия.
Порядок проведения анализа. Взвешивают 20 г подготовленной к анализу пробы с точностью не более 0,01 г, помещают
в химический стакан, заливают 35—40 см3 дистиллированной
воды, нагретой до (55 + 2) °С и настаивают, периодически перемешивая, в течение 10 мин. Затем вытяжку фильтруют через
фильтр в мерную колбу вместимостью 200 см3. Навеску несколько раз промывают и переносят на фильтр, вновь промывают водой, затем раствор охлаждают и доводят водой до метки.
Для приготовления вытяжки сырокопченых продуктов из
свинины, баранины, говядины и сырокопченых колбас навеску
массой 20 г заливают 200 см3 предварительно нагретой до (55 ±
2) 0С дистиллированной воды и настаивают, периодически помешивая, в течение 30 мин. Затем вытяжку фильтруют через
фильтр, не перенося осадка на фильтр.
20 см3 вытяжки помещают в мерную колбу вместимостью
100см3, добавляют 10см3 раствора гидроксида натрия молярной
концентрацией 0,1 моль/дм3 и 40см3 раствора сульфата цинка
массовой долей 0,45 % для осаждения белков. Смесь в колбе нагревают в течение 7 мин на водяной бане при температуре кипения, после чего охлаждают, доводят до метки водой, перемешивают и фильтруют через обеззоленный бумажный фильтр.
Параллельно проводят контрольный анализ на реактивы,
помещая в мерную колбу вместимостью 100 см3 вместо 20 см3
вытяжки 20 см3 дистиллированной воды.
В коническую колбу вместимостью 100 см3 наливают 5 см3
прозрачного фильтрата, полученного после осаждения белков, 1
см3 раствора аммиака, 2 см3 раствора соляной кислоты, 2 см3
дистиллированной воды и, для усиления окраски, 5 см3 раствора
сравнения, содержащего 1 мкг нитрита натрия в 1 см3. Затем в
колбу приливают 15 см3 реактива Грисса и через 15 мин измеряют интенсивность окраски на спектрофотометре при длине
волны 538 нм или на фотоэлектроколориметре с зеленым свето75
фильтром (№ 6) в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 2
см в отношении раствора сравнения.
Массовую долю нитрита (%) вычисляют по формуле
M 1 ⋅ 200 ⋅ 100 ⋅ 100 ⋅ 30
m ⋅ 20 ⋅ 5 ⋅ 10 6
Х=
где М1 — массовая концентрация нитрита натрия, найденная по калибровочному графику, мкг/см3; т — масса навески
продукта, г; 106 — коэффициент перевода в граммы.
Построение калибровочного графика. В 6 мерных колб
вместимостью 100 см3 каждая пипеткой вносят следующие объемы рабочего раствора: 0; 1,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0 см3. В первую
колбу рабочий раствор не вносят, используя ее как контрольную. В каждую колбу добавляют 5см3 раствора аммиака, 10см3
раствора соляной кислоты, доводят водой до метки и перемешивают. В конические колбы вместимостью 100см3 пипеткой переносят по 15см3 приготовленных растворов, 15см3 реактива
Грисса и после 15 мин выдержки при комнатной температуре
измеряют интенсивность розовой окраски на спектрофотометре
при длине волны 538 нм или фотоэлектроколориметре с зеленым светофильтром (№ 6) в кювете с толщиной поглощающего
свет слоя 2 см в отношении раствора сравнения.
Готовят три серии стандартных растворов, начиная каждый раз с приготовления основного раствора из новой навески
нитрита натрия.
По полученным средним данным из трех стандартных растворов на миллиметровой бумаге размером 25 х 25 см строят калибровочный график. На оси абсцисс откладывают массовую
концентрацию нитрита натрия (мкг/см3), а на оси ординат — соответствующие значения оптической плотности. Калибровочный график должен проходить через начало координат.
Полученные результаты анализа сводят в таблицу
Полученные результаты студенты сравнивают с предельно
допустимыми значениями для данного вида продуктов, делают
выводы и формулируют общее заключение по работе.
76
Контрольные вопросы:
1. Использование нитритов в колбасных изделиях и продуктах из мяса
2. Методы определения нитрат- и нитрит-ионов.
3. Порядок проведения анализа.
4. Выводы по проделанной работе.
77
СОДЕРЖАНИЕ
Введение
Лабораторная работа № 1.
Лабораторная работа № 2.
Лабораторная работа № 3.
Лабораторная работа № 4.
Лабораторная работа № 5.
Лабораторная работа № 6.
Лабораторная работа № 7.
Лабораторная работа № 8.
Лабораторная работа № 9.
78
3
5
14
19
24
30
34
57
71
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. . 3аяс Ю.Ф. Качество мяса и мясопродуктов. - М.:Легкая
и пищевая промышленность, 1981. - 480 с.
2. . Технохимический контроль производства мяса и мясопродуктов/ Н.К. Журавская, Б.Е. Гутник, Н.А. Журавская. М.:Колос,1999.-176с.
3. Исследование и контроль мяса и мясопродуктов/ Н.К.
Журавская, Л.Т. Алехина, Л.М. Отряшенкова. М.: Агропромиздат, 1985. - 296с.
4. Переработка птицы / Н.С.Митрофанов, Ю.А.Плясов,
Е.Г.Шумков и др. М.:Агропромиздат, 1990. - 272 с.
5. Физико-технические основы холодильной обработки пищевых продуктов / Г.Д.Аверин, Н.К.Журавская,
Э.И.Каухчешвили и др. М.:Агропромиздат, 1985.- 256 с.
6. Структурно-механические характеристики пищевых продуктов / А.В.Горбатов, А.М.Маслов, Ю.А.Мачихин и др.
М.:Легкая и пищевая промышленность, 1982. -296 с.
7. Справочник технолога колбасного производства./ Под
ред. И.А.Рогова. - М.:Колос. 1993.– 432с.
8. Лаврова Л.П., Крылова В.В. Технология колбасных изделий / - М.:Пищевая промышленность, 1975. – 344 с.
9. Руководство по ветеринарно-санитарной экспертизе и
гшигиене производства мяса и мясных продуктов/Под
редакцией М.П.Бутко и Ю.Г.Костенко. М.:РИФ «Антиква», 1994.-600с.
79
Смирнова Ольга Валерьевна,
Хабибуллин Рустем Эдуардович
Хусаинова Халида Рашатовна,
Ежкова Галина Олеговна
Пономарев Всеволод Ярославович
Решетник Ольга Алексеевна
ТЕХНОЛОГИЯ МЯСА И МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ
80
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа