close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Vertical Blue 2011, мировой чемпионат по фридайвингу 2011;pdf

код для вставкиСкачать
DOT117v8: Инструкции по применению наборов для типирования HLA SSPGoTM HLA. Редакция СЕ 5
Страница 1 из 12
Инструкции по использованию наборов реагентов для типирования Biofortuna SSPGo TM HLA
Версия СЕ 5, январь 2014 г.
1. Назначение
Biofortuna HLA SSPGo Kits – это наборы реагентов для ДНК-зависимого HLA-типирования в "низком
разрешении" или в "промежуточном/среднем разрешении" при помощи группоспецифической
амплификации. Общепринятый уровень разрешения считается средним, когда большинство результатов четко
определяются на уровне двух цифр, напр., DQB1*02, DQB1*05 и т.д. Высоким, как правило, обычно считается
уровень, на котором большинство аллелей имеют 4-цифровой уровень, напр., DQB1*02:01, DQB1*05:01 и т.д.
Это продукт диагностики in vitro, предназначенный для использования только квалифицированными
специалистами.
2. Введение
Молекулы HLA (лейкоцитарных антигенов человека) играют ключевую роль в иммунитете и распознавании
"свой – не свой", следовательно, проведение HLA-генотипирования и исследований на HLA-совместимость
обязательны в большинстве случаев перед трансплантаций. Поскольку HLA-антигены ограничивают
специфичность регулируемого T-клетками иммунного ответа, HLA-генотипирование целесообразно при
любых иммунных заболеваниях или при прогнозировании иммунного ответа на патогены, вакцинацию или
медицинское лечение. HLA-генотипирование также рекомендовано при диагностировании заболевания,
когда доказано, что определённые HLA-аллели в значительной степени связаны с течением заболевания.
Большинство HLA-генов высокополиморфичные, и обычно ДНК-генотипирование требуется для точного
определения HLA-антигенов. ПЦР-типирование с использованием сиквенс-специфических праймеров (SSP)1 быстрый метод HLA-генотипирования, особенно пригодный в ситуациях, в которых требуется разрешение
среднего уровня. Наборы Biofortuna SSP - готовые решения, в них входят сухие реагенты, включая полимеразу,
и пользователю перед ПЦР требуется только добавить ДНК.
Наборы постоянно совершенствуются в соответствии с последней информацией по HLA-типированию в базе
данных IMGT. Последние данные по наборам доступны на www.biofortuna.com.
3. Описание теста
Технология ПЦР - SSP основывается на следующем принципе: амплифиция происходит только с праймерами, у
которых 3'-концы полностью комплементарны последовательности-мишени. Праймеры с "мисматчами" не
дают положительных результатов амплификации2. В каждую реакционную смесь ПЦР добавлена пара
праймеров внутреннего контроля, амплифицирующая консервативную область конститутивного гена
C
V
C
DOT117v8: Инструкции по применению наборов для типирования HLA SSPGoTM HLA. Редакция СЕ 5
Страница 2 из 12
(housekeeping gene); пара праймеров внутреннего контроля является индикатором достоверности результатов
реакции ПЦР. В SSP HLA-генотипировании обычно применяются различные реакции, которые при совместном
исследовании указывают на генотип. Визуализация амплифицированных продуктов достигается с
использованием систем для электрофореза в агарозном геле, разделяющем фрагменты ДНК по размеру.
4. Содержимое набора





Полипропиленовые планшеты или полоски для ПЦР на 8-96 лунок (в зависимости от расфасовки), каждая
лунка содержит предварительно лиофилизированные праймеры, полимеразу, ДНТФы* и буфер.
Планшеты или полоски поставляются с герметичным покрытием (листовое покрытие или колпачок),
упакованные в фольгированный пакет с влагопоглотителем.
Листовое покрытие или колпачки для герметизации планшетов или полосок для ПЦР.
1x инструкция по использованию.
Сертификат анализа.
Таблицы интерпретаций и Паспорт безопасности вещества (ГОСТ) можно скачать с сайта Biofortuna
www.biofortuna.com. При отсутствии такой возможности обратитесь к местному дистрибьютору.
*ДНТФы CleanAmp™ лицензированы Trilink Biotechnologies Inc для использования в продуктах Biofortuna
SSPGo.
5. Непоставляемые реагенты и оборудование









Соответствующие калиброванные дозаторы и стерильные фильтрующие наконечники, напр., дозаторы
P10 и 10 мкл наконечники.
Набор/оборудование для изоляции ДНК.
Спектрофотометр в УФ.
Полипропиленовые пробирки.
Стерильная вода для применения в молекулярной биологии.
Термоциклер со следующими характеристиками:
 Термоциклер на 96 лунок с нагревательной крышкой на температуру 104°С для режима работы без
масла
 Скорость линейного изменения температуры 1,0°С/с
 Температурный диапазон от 4,0°С до 99,9°С
 Точность определения температуры ±0,25°С в диапазоне от 35°С до 99,9°С
 Температурная калибровка с возможностью контроля по стандартному образцу
 Программирование термоциклера с использованием параметров цикла ПЦР, указанных в разделе 8
(см. далее)
Примечание. Конкретная информация о термоциклере содержится в инструкции по эксплуатации,
составленной производителем. Термоциклер должен быть откалиброван в соответствии с правилами
аккредитации Американского общества гистосовместимости и иммуногенетики (ASHI) или Европейской
федерации иммуногенетики (EFI).
Реагенты для гель-электрофореза (агароза, 0,5x TBE, ДНК-маркер молекулярного веса 1000 пар
оснований, 10 мг/мл бромида этидия).
Оборудование для гель-электрофореза (ёмкость для геля, источник питания, система гель-документации с
прибором для УФ-просвечивания).
Программное обеспечение для оказания помощи в ручном анализе SSPGo результатов испытаний
комплекта и хранения архивных данных можно скачать с веб-сайта Biofortuna www.biofortuna.com.
Примечание. Изменения указанных условий, например, скорости линейного изменения температуры
термоциклера, может оказать влияние на интерпретацию результатов теста.
C
V
C
DOT117v8: Инструкции по применению наборов для типирования HLA SSPGoTM HLA. Редакция СЕ 5
Страница 3 из 12
6. Безопасность и предупреждения









Для диагностики in vitro.
Тесты должны проводиться только соответственно обученными специалистами.
Все результаты типирования должны быть проверены квалифицированными сотрудниками и
подтверждены другой методикой типирования, если используются при принятии клинических решений.
Обращайтесь со всеми реагентами в соответствии с правилами лабораторной практики.
Рабочие зоны лаборатории для пред- и пост-ПЦР стадий должны быть разделены. Не возвращайте какиелибо материалы, прошедшие ПЦР, обратно в зоны пре-ПЦР.
Предупреждение о биологической опасности: Обращайтесь со всеми продуктами крови как с
потенциально инфекционными.
Предупреждение о биологической опасности: Бромид этидия является потенциальным канцерогеном.
При его использовании всегда надевайте перчатки, лабораторный халат и защитные очки.
Предупреждение о биологической опасности: При использовании источников УФ-излучения соблюдайте
меры предосторожности: всегда надевайте перчатки, лабораторный халат и защитные очки. Никогда не
смотрите без защитных очков непосредственно на источник ультрафиолетового излучения.
Таблицы факторов риска доступны на www.biofortuna.com.
7. Хранение и стабильность
Храните наборы Biofortuna SSPGo kit при температуре 2-28°C. После извлечения лунок для ПЦР из
фольгированных пакетов добавляйте в реагенты в течение 3 часов воду и ДНК. См. на упаковке срок годности.
Не используйте продукты после истечения срока годности.
Не используйте наборы, если фольгированные пакеты порваны или проколоты, или если в них отсутствует
пакетик с влагопоглотителем.
При использовании герметизирующего листового покрытия или колпачков, поставляемых только в комплекте,
убедитесь в том, что лунки для ПЦР плотно закрыты после добавления образца ДНК. Несоблюдение этого
требования может привести к испарению во время ПЦР-амплификации. Особо обратите внимание на края и
углы.
Примечание (1). При необходимости негидратированные планшеты и полоски для ПЦР, извлеченные из
упаковки, могут храниться в течение 3 часов до добавления ДНК при температуре до 21oC и влажности не
более 60%.
Примечание (2). После нанесения раствора ДНК (гидратации) планшеты и полоски для ПЦР, извлеченные из
упаковки, могут храниться в течение 24 часов при температуре 2-8oC до проведения этапа ПЦР. Это возможно
при условии, что лунки должным образом герметизированы во избежание испарения.
8. Инструкции по использованию
Требования к образцу ДНК
Каждая реакция в тесте оптимизирована с тем, чтобы использовать 50 - 100 нг раствора ДНК, но в каждую
реакцию необходимо добавить точно 10 мкл жидкости. Поэтому тест может быть проведён только с 10 мкл
раствора ДНК с концентрацией 5-10 нг/мкл. Разведите образец ДНК до требуемой концентрации; для этого
следует использовать только стерильную воду, предназначенную для применения в молекулярной биологии.
Внимание! Убедитесь в том, что полученный образец ДНК не содержит более 2,5 ммоль/л Трис/0,25 ммоль/л
ЭДТА. Используйте только образцы ДНК, экстрагированные из образцов, полученных с помощью цитрата и
ЭДТА. Поскольку гепарин может ингибировать ПЦР, не рекомендуется экстрагировать ДНК из
гепаринизированных образцов крови. Было показано, что гемоглобин влияет на результат, полученный с
помощью набора SSPGo HLA, если присутствует в образце в концентрации более 1 мг/дл.
C
V
C
DOT117v8: Инструкции по применению наборов для типирования HLA SSPGoTM HLA. Редакция СЕ 5
Страница 4 из 12
ДНК можно экстрагировать с использованием всех традиционных методов экстракции. Убедитесь в том, что
показатель OD260/280 образца ДНК должен составлять 1,66 – 1,94 по данным УФ-спектрофотометрии.
Инструкции по предварительной подготовке ПЦР
i.
ii.
iii.
Извлеките планшет SSPGo или полоску из запечатанного мешка.
Запишите номер партии продукта, используемого для данного анализа
Перед удалением герметизирующего покрытия или колпачка убедитесь в том, что все
лиофилизированные частицы (реагенты ПЦР) находятся на дне лунки планшета/пробирки. В
противном случае аккуратно встряхните упаковку, чтобы частицы реагента упали на дно пробирки.
Обратите внимание, что во всём наборе первая реакция каждого локуса теста всегда помечена бледнорозовым цветом (метка становится красной при гидратации). В некоторых планшетах для ПЦР последняя
помеченная пурпурным цветом лунка используется при отсутствии контроля по шаблону.
iv.
С помощью стерильного оборудования добавьте 10 мкл раствора ДНК в каждую реакционную лунку
планшета или полоски. См. примечание в Разделе 8, "Требования к образцу ДНК". Если в планшете
имеется помеченная пурпурным цветом лунка для использования при отсутствии контроля по
шаблону, добавьте в неё 10 мкл буфера или разбавителя образца (не содержащего ДНК). См.
примечание в Разделе 8, "Без контроля по шаблону".
v.
Убедитесь в том, что ДНК вступила в контакт с сухими реагентами в каждой реакции до термического
циклирования.
vi.
Закройте реакционные лунки листовым покрытием или крышечками для пробирок, входящими в
комплект поставки. Убедитесь в том, что лунки закрыты как можно плотнее, чтобы предохранить
содержимое от испарения. Особо обратите внимание на края и углы.
vii.
Поместите планшет или полоски непосредственно в термоциклер. Убедитесь в том, что ячейки
полностью вставлены в блок, а крышка плотно закрыта. Если крышка не закрыта плотно, это может
вести к ошибке отдельной ПЦР вследствие испарения и конденсации реакционной смеси.
viii.
Активируйте программу ПЦР (см. Параметры ПЦР).
РЕСУСПЕНДИРОВАНИЕ, ПРИМЕЧАНИЕ. После извлечения лунок для ПЦР из фольгированных пакетов следует
незамедлительно регидратировать реагенты с помощью раствора ДНК. Дополнительная информация
приведена в примечаниях (1) и (2).
"ОТРИЦАТЕЛЬНЫЙ КОНТРОЛЬ БЕЗ МАТРИЦЫ ДНК", ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые наборы в последней лунке
содержат отрицательный контроль без матрицы ДНК (NTC). Эта лунка окрашена в пурпурный цвет, чтобы
отличить её от остальных реакций. Отрицательный контроль без матрицы ДНК нужен для контроля за
контаминацией ПЦР, или геномной контаминацией ДНК, которая может присутствовать в воде, используемой
для ресуспендирования исследуемой ДНК. Если имеет место контаминация ПЦР, то в результате будут
наблюдаться ампликоны непостоянных размеров.
ПРОФИЛЬ ВЫСОТЫ ПЛАНШЕТА/ПОЛОСКИ ДЛЯ ПЦР, ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы высота планшетов и
полосок при помещении их в одну и ту же машину ПЦР была одинаковой. Разные профили высоты могут вести
к плохому контакту с нагреваемой крышкой установки. Это может быть причиной слабой или ошибочной ПЦР
амплификации.
Параметры ПЦР
Следует использовать следующие параметры ПЦР. Проследите за тем, чтобы скорость температурного нагрева
составляла 1°C в секунду, и включите нагрев крышки. Подробные инструкции по использованию находятся в
руководстве по эксплуатации производителя термоциклера. Термоциклер должен быть откалиброван в
соответствии с правилами аккредитации Американского общества гистосовместимости и иммуногенетики
(American Society of Histocompatibility and Immunogenetics) (ASHI) или Европейской федерации
иммуногенетики (European Federation of Immunogenetics) (EFI).
C
V
C
DOT117v8: Инструкции по применению наборов для типирования HLA SSPGoTM HLA. Редакция СЕ 5
Денатурация 94°C
5 минут
Денатурация 96°C
Отжиг
66°C
Удлинение
72°C
15 секунд
50 секунд
30 секунд
10 циклов
Денатурация 96°C
Отжиг
64°C
Удлинение
72°C
15 секунд
50 секунд
30 секунд
20 циклов
Страница 5 из 12
УДЕРЖАНИЕ при 15°C в течение не более чем 72 часов до прогона гелей. При необходимости планшет
для ПЦР можно хранить при 2-8°C в течение 24 часов до прогона гелей. При этом следует убедиться в
правильной герметизации планшетов.
Гель-электрофорез
Эти инструкции относятся к горизонтальному электрофорезу в агарозном геле: Приготовьте 2% агарозный гель
в 0,5x буфере TBE. После охлаждения геля до температуры 60°C добавьте бромид этидия, конечная
концентрация должна быть 0,5 мкг/мл. Разлейте гель и установите гребёнки для микротитрования (напр.,
12x8 лунок с расстоянием 9 мм). Затем удалите гребёнки и поместите гель в 0,5x буфер TBE. После этого
загрузите продукт ПЦР в той же последовательности в 2% агарозный гель, отмечая позицию каждой реакции.
Рекомендуется использовать лесенку на 1000 пар оснований для установления размера. Условия
электрофореза - 20 минут при 10 В/см.
См. подробную информацию о специальном оборудовании в инструкциях производителя системы для
электрофореза. Визуализация результатов осуществляется при помощи системы гель-документации с
устройством для УФ-просвечивания.
Примечание. Слишком короткий электрофорез может привести к тому, что большие ампликоны (более 600
пар оснований) будут сливаться с контрольным ампликоном. Убедитесь в том, что продолжительность
электрофореза достаточна для визуализации таких ампликонов. Слишком продолжительный электрофорез
может привести к потере малых ампликонов и попаданию их в предыдущую лунку на геле.
9. Интерпретация
Наборы SSPGo разработаны таким образом, что результаты можно определить вручную с использованием
таблиц интерпретаций, доступных на сайте www.biofortuna.com. Если вы не можете зайти на веб-сайт,
обращайтесь к местному дистрибьютору.
Таблицы интерпретации могут включать примечания, особые для определенной партии продукта, имеющие
значение для правильной интерпретации результатов.
Приложите фотографию геля к соответствующей форме интерпретации, номер набора и номер партии
должны совпадать. Изучите изображение геля. В каждой реакции должна быть полоска положительного
контроля. См. таблицы интерпретаций, так как в разных продуктах SSPGo размер может быть различным.
Полоски внутренних контролей могут быть намного бледнее, если имеются специфические полоски аллелей.
Если имеется специфическая полоска аллеля, а полоски контроля - нет, результат всё равно должен считаться
положительным. Игнорируйте все полоски менее 70 пар оснований, так как они являются
"неинкорпорированными" праймерами.
Определите положительные реакции. Индикаторами положительных реакций являются полоски ожидаемой
величины, как указано в таблицах интерпретаций. Имейте в виду, что в определённой реакции могут быть
продукты более одного размера – это мультиплексные реакции, они представлены в таблицах интерпретаций.
C
V
C
DOT117v8: Инструкции по применению наборов для типирования HLA SSPGoTM HLA. Редакция СЕ 5
Страница 6 из 12
Сравните положительные реакции с таблицами интерпретаций. Положительный результат реакции указывает
на наличие по крайней мере одного аллеля, приведённого в таблице интерпретаций для данной реакции.
Любой используемый аллель может быть амплифицирован в нескольких пробирках – если присутствует
аллель, во всех соответствующих лунках должен присутствовать продукт реакции.
Полоска
контроля
Специфическая
полоска аллеля
Направление
электрофореза
Рис. 1 Примеры положительных реакций, на которые указывает наличие специфической полоски аллеля и
полоски контроля (реакции 1-3); отрицательные реакции, на которые указывает наличие полоски контроля и
отсутствие специфических полосок аллелей (реакции 4-7); ошибочная реакция, в которой отсутствуют любые
полоски (реакция 8).
Убедитесь в том, что номер партии набора соответствует номеру партии в таблице интерпретаций.
Программное обеспечение для оказания помощи в ручном анализе SSPGo результатов испытаний комплекта
и хранения архивных данных можно скачать с веб-сайта Biofortuna www.biofortuna.com.
10. Обеспечение и контроль качества
До выпуска продукта в продажу компания Biofortuna проверяет качество каждой партии SSPGo. Образцы
каждой партии набора проверяются по определённой партии образцов ДНК человека, чтобы обеспечить
адекватные рабочие характеристики. Каждая реакция валидирована в соответствии с по крайней мере 47
хорошо описанными образцами ДНК клеточных линий. Biofortuna рекомендует каждой лаборатории провести
внутреннюю валидацию всех новых продуктов для типирования до использования их на клинических
образцах. Только полностью обученный и квалифицированный персонал может проводить диагностическое
типирование, а результаты должны быть перепроверены другим обученным сотрудником.
11. Клинические данные
В пяти лабораториях было проведено исследование диагностического оборудования in vitro, в котором
наборы для типирования HLA SSPGo сравнивались с предикативными наборами One Lambda Labtype SSO.
Типирование локуса с помощью SSPGo было проведено для HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLADRB1/3/4/5, HLA-DPB1, DPA1 и HLA-DQA1*05, DQB1*02, DQ8.
Клиническое применение наборов для типирования HLA SSPGo показало, что результаты на 98,3-100%
соответствуют результатам, полученным с помощью предикативных наборов (метод SSO). Достоверность
генотипирования для аллелей HLA классов I и II (для ДНК, полученной из цельной крови, при концентрации 510 нг/мкл) составила не менее 95%.
За исключением 3 (трех) подтвержденных несовпадающих результатов генотипирования для 3 партий
тестовых наборов и 1222 образцов, исследованных в разных лабораториях США и Великобритании,
совпадение составило 100%.
Воспроизводимость результатов, получаемых с помощью наборов для типирования HLA SSPGo, для разных
лабораторий была проверена тремя лабораториями. Для этого использовалась репрезентативная партия из 8
ПЦР по методу SSPGo. Исследовались предоставленные образцы ДНК в виде растворов в концентрации 4
нг/мкл и 11 нг/мкл (т.е. крайние значения концентрационного диапазона тестового набора). Всего в трех
независимых лабораториях было проведено 960 отдельных реакций; соответствие было получено в 958
случаях. Таким образом, достоверность составила 99,7% (нижний контрольный предел 0,995).
C
V
C
DOT117v8: Инструкции по применению наборов для типирования HLA SSPGoTM HLA. Редакция СЕ 5
Страница 7 из 12
Воспроизводимость результатов, полученных с помощью наборов из разных партий, была проверена в одной
лаборатории одним работником. Для этого использовались наборы для исследования HLA SSPGo из трех
партий. Исследовались образцы ДНК с концентрацией 5-10 нг/мкл. Воспроизводимость результатов,
полученных с помощью наборов для типирования HLA SSPGo из разных партий, составила 100%, что
соответствует характеристике предикативных наборов. Всего было исследовано 130 образцов ДНК с помощью
наборов для типирования HLA SSPGo из 3 (трех) партий, т.е. всего было проведено 390 тестов.
Соответствующая HLA-положительная верификация SSPGo была получена для аллелей классов I и II с
помощью сравнительного тестирования клинических образцов, анализированных с помощью LABType (SSO).
Внутреннее тестирование HLA с помощью SSPGo дало такие же результаты для стандартных образцов ДНК, за
исключением недоступных образцов, например, для редких аллелей HLA-DPB1 и HLA-B, а также аллельных
групп, таких как B*59:01, B*78 и B*83:01 Подтверждение не было получено для следующих редких аллельных
групп: B*59, B*78, B*83, DPB*21:01, DPB*26:01:02, DPB*27:01, DPB*28:01, DPB*29:01, DPB*31:01, DPB*34:01,
DPB*35:01:01, DPB*39:01, DPB*45:1, DPB*46:01, DPB*51:01, DPB*55:01, DPB*59:01, DPB*63:01, DPB*81:01,
DPB*85:01 & DPB*105:01
12. Библиография
1) Bunce M et al Tissue Antigens. 1995 Nov;46(5):355-67.
2) Saiki RK et al. Nature. 1986 Nov 13-19;324(6093):163-6.
13. Руководство по устранению неисправностей SSPGo
Проблема
Нет амплификации ни
в одной реакции
Возможная причина
Неправильная концентрация
используемой ДНК
Ингибиторы ПЦР в образце
ДНК
Низкое качество
использованного образца
ДНК
Устранение
Определите количество ДНК путем измерения при
OD280 и убедитесь в том, что в 10 мкл раствора,
используемого для реакции, содержится 50-100 нг
ДНК.
Не используйте гепаринизированную кровь,
избегайте использования образцов ДНК, содержащих
более 1 мг/дл гемоглобина.
Определите качество ДНК. Соотношение OD260/280
должно составлять 1,66 – 1,94 (по данным УФспектрофотометрии).
ДНК до использования должна полностью
ресуспендироваться в растворе.
Реагенты не полностью
ресуспендированы
Термоциклер неправильно
настроен
Убедитесь в том, что образец ДНК разбавлен водой,
предназначенной для применения в молекулярной
биологии, и не содержит более 2,5 ммоль/л Трис/0,25
ммоль/л ЭДТА.
Частицы реагента должен быть полностью
гидратированы при добавлении ДНК.
Убедитесь в том, что для реакции использоваться 10
мкл раствора ДНК.
Убедитесь в том, что программа ПЦР введена
корректно, в соответствии с инструкциями по
использованию.
Убедитесь в том, что нагревательная крышка
C
V
C
DOT117v8: Инструкции по применению наборов для типирования HLA SSPGoTM HLA. Редакция СЕ 5
Проблема
Возможная причина
Проблемы электрофореза
Страница 8 из 12
Устранение
термоциклера зафиксирована и плотно закреплена.
См. более подробную информацию в инструкциях по
использованию термоциклера.
Убедитесь в том, что в резервуаре для электрофореза
есть питание – проверьте блок питания и очистите
электроды.
Повторите форез в 0,5X буфере TBE.
Убедитесь в том, что используется свежий бромистый
этидий, 0,5 мкг/мл.
Проверьте достаточность УФ освещения при
формировании сигналов изображения гелей.
См. дальнейшие инструкции в руководстве
производителя камеры для геля и блока питания.
Планшеты не запечатаны
корректно.
Выборочные
пропадания сигналов
специфических
ампликонов контроля
и/или аллеля.
Ошибки гель-фореза
Неплотно запечатанные планшеты могут быть
причиной испарения во время ПЦР. Biofortuna
поставляет рекомендованное герметизирующее
листовое покрытие в наборе. Для решения вопросов
о поставках свяжитесь с представителем компании.
Убедитесь в том, что лунки закрыты герметично.
Обратите особое внимание на лунки по краям
планшета или полоски ПЦР.
Убедитесь в том, что продукты реакции были
нанесены во все соответствующие лунки в
рекомендованном объёме.
Калибруйте дозаторы в соответствии с инструкциями
производителя.
Убедитесь в том, что лунки полностью
сформировались.
Осторожно удаляйте гребёнки, так как можно легко
повредить дно лунки.
До разливания геля убедитесь в том, что агароза
полностью растворилась.
Гель-форез не должен проходить слишком долго, так
как более мелкие ампликоны могут "убежать" из
геля.
Убедитесь в том, что форез полностью прошёл и
полоски разделились.
C
Проблемы термоциклера
Используйте свежий раствор бромида этидия.
Ошибки в крайних лунках могут быть в результате
V
C
DOT117v8: Инструкции по применению наборов для типирования HLA SSPGoTM HLA. Редакция СЕ 5
Проблема
Возможная причина
Страница 9 из 12
Устранение
того, что крышка закрыта недостаточно плотно. Это
может вести к испарению и конденсации реакции
ПЦР в лунке ПЦР на полпути и к неправильным
результатам анализа ПЦР.
Обязательно следуйте инструкциям производителя
по техобслуживанию и калибровке термоциклера.
Проблемы испарения
Убедитесь в том, что параметры ПЦР корректны и
соответствуют инструкциям по использованию.
Убедитесь в том, что лунки закрыты герметично.
Обратите особое внимание на лунки по краям
планшета или полоски ПЦР.
Убедитесь в том, что нагревательная крышка
закреплена и обеспечивает достаточную компрессию.
Убедитесь в том, что используется герметизирующее
листовое покрытие Biofortuna, входящее в комплект
поставки. Для решения вопросов о поставках
свяжитесь с местным дистрибьютором.
Спорадические ошибки из-за Не присутствует ДНК: убедитесь в том, что в каждой
проблем ДНК
лунке имеется ДНК.
Неправильный объём: убедитесь в том, что в каждую
реакцию добавлено 10 мкл раствора ДНК.
Добавлено слишком много ДНК: концентрация выше
200 нг или менее 20 нг может вести к ошибке ПЦР.
Наличие смазанных
полос – "шмера" на
геле
ДНК
Слабая
амплификация.
Проблема концентрации
ДНК
Проблемы термоциклера
Ошибки при гель-форезе
Контаминанты в ДНК могут быть причиной
спорадической или масштабной ошибки
амплификации.
Проверьте концентрацию и чистоту ДНК. Добавление
слишком большого количества ДНК в реакции ПЦР
может быть причиной получения смазанных
изображений.
Причиной может быть разложение или низкая
чистота. Заберите свежий образец ДНК.
Проверьте концентрацию ДНК: она должна быть не
слишком высокой и не слишком низкой. Целевая
концентрация 50-100 нг ДНК на реакцию, в 10 мкл.
Обязательно следуйте инструкциям производителя
по техобслуживанию и калибровке термоциклера.
Убедитесь в том, что параметры ПЦР корректны и
соответствуют инструкциям по использованию.
В каждую лунку необходимо добавлять одинаковый
объём реакции, от 5 мкл до 10 мкл.
Калибруйте дозаторы в соответствии с инструкциями
C
V
C
DOT117v8: Инструкции по применению наборов для типирования HLA SSPGoTM HLA. Редакция СЕ 5
Проблема
Неспецифическая
амплификация
Возможная причина
Проблема концентрации
ДНК
Реакции загружены в
неправильном порядке
Определен новый аллель
Рисунок
амплификации не
может быть
интерпретирован
Неправильная
интерпретация артефакта
как специфической полоски
Реакции загружены в
неправильном порядке
Ошибка отдельной ПЦР
Отсутствуют ампликоны
небольшого размера
В образце определён новый
аллель
C
V
Страница 10 из 12
Устранение
производителя.
Используйте свежий раствор бромида этидия.
Проверьте концентрацию ДНК: она должна быть не
слишком высокой и не слишком низкой. Целевая
концентрация - 50 - 100 нг ДНК на реакцию, в 10 мкл.
Проверьте расположение полос ПЦР и геля.
Не допускайте физического перетекания через край
из соседних лунок при электрофорезе, не
переполняйте лунки, удаляйте гребёнки из
застывшего геля.
Аллели, ранее не выявленные методом прямого
секвенирования, могут присутствовать с новым
рисунком амплификации. Если вы используете старые
таблицы интерпретаций, загрузите более позднюю
версию с сайта www.biofortuna.com. Если это не
соответствует новому рисунку, необходимо провести
проверку с использованием другого набора
Biofortuna или попробовать определить
последовательность типированием
последовательности.
Проверьте правильность размера полоски в таблицах
интерпретаций.
Проверьте правильность размеров определённых
полосок, произведите проверку на присутствие
артефакта (перенос, праймер-димер), который был
неправильно интерпретирован как истинный продукт
амплификации.
Проверьте расположение полос ПЦР и геля.
Убедитесь в том, что присутствуют все внутренние
положительные контроли. Интерпретируйте снова
без каких-либо пропущенных реакций.
Слишком продолжительный электрофорез приводит к
уходу ампликонов небольших размеров из заднего
участка геля или их проходу мимо переднего участка
бромида этидия, либо к рассеиванию при попадании
в предыдущую гелевую лунку. Проследите за тем,
чтобы условия электрофореза соответствовали
используемой гель-системе.
Эпизодически могут обнаруживаться новые аллели,
которые дают рисунок амплификации, не
соответствующий ни одному из существующих.
Обратитесь к местному дистрибьютору.
C
DOT117v8: Инструкции по применению наборов для типирования HLA SSPGoTM HLA. Редакция СЕ 5
Страница 11 из 12
14. Описание изменений
Изменения: отличия между редакциями 4 и 5
Дата редакции: 21 января 2014 г.
Раздел
Описание изменения
Раздел 4: содержимое набора
Добавлены герметизирующие покрытия, входящие в комплект набора
Раздел 5: непоставляемые реагенты
и оборудование
Обновлены характеристики термоциклера на 96 лунок
Изменены условия хранения набора (2-28 oC)
Обращение с негидратированными планшетами и полосками для ПЦР
Обращение с гидратированными планшетами и полосками для ПЦР
Раздел 8: инструкции по
использованию
Разведение образцов ДНК стерильной водой, предназначенной для
применения в молекулярной биологии
Добавление мешающих веществ и обновление рекомендаций по
чистоте ДНК
Обновление измерения OD260/280
Добавление положения лиофилизированных частиц до добавления
образца
Добавление условий хранения амплифицированного продукта
Добавление примечания о продолжительности электрофореза геля
Раздел 9: интерпретация
Комментарий относительно примечаний для определенных партий
продукта
Номер партии набора должен соответствовать номеру партии в
таблице интерпретации
Раздел 11: клинические данные
Добавление целого раздела
Раздел 14: описание изменений
Добавление целого раздела
C
V
C
DOT117v8: Инструкции по применению наборов для типирования HLA SSPGoTM HLA. Редакция СЕ 5
Страница 12 из 12
15. Используемые символы
X
P
i
M
V
H
4: s28
g
:
Количество тестов
Представитель EC
консультации инструкции по применению
Местоположение производителя
In Vitro диагностика
Срок годности
Температура хранения
Поставщик серии номер...
Дистрибьютор
Глобальный номер товарной продукции
16. Контактная информация производителя
Biofortuna Ltd
1 Hawkshead Road
Croft Business Park
Bromborough, CH62 3RJ, UK
T: +44 (0) 151 334 0182
E: [email protected]
W: www.biofortuna.com
17. Переводы
FranÇaise:
Deutsch:
Español:
Italiano:
České:
Danske:
Έλληνες:
Magyar:
Norske:
Polska:
Português:
Русский:
Slovenskému:
Türk:
Svenska:
Traductions disponibles
Übersetzungen verfügbar
Traducciones disponibles
Traduzioni disponibili
Překlady k dispozici
Tilgængelige oversættelser
διαθέσιμες μεταφράσεις
Fordítások
Oversettelser tilgjengelig
Dostępne tłumaczenia
Traduções disponíveis
Переводы доступны
Preklady k dispozícii
Çeviriler mevcut
Översättningar tillgängliga
www.biofortuna.com
C
V
C
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа