close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Бизнес;pdf

код для вставкиСкачать
научные исследования
в
с т о м а т о л о г и и
РЕЗУЛЬТАТЫ АУТОТРАНСПЛАНТАЦИИ
васкулярно-стромальноклеточной фракции при пародонтите
и особенности формирования раннего тканевого регенерата
Summary. In the present study were demonstrated
favorable results on the growth of clinical attachment
level using autological processed lipoaspirate cells
at advanced periodontitis. Immunohistochemistry
using a monoclonal antibody to Ki-67 showed the
lack of mitosis in new tissue cells without significant
differences in research groups. Cytological analysis in
an initial stage of regeneration process has shown that
granulation tissue growth realized due to transformation
of the neutrophils, which populates periodontal defects
intensively. In an exudative stage wound neutrophils
participate in formation of extracellular traps (NETs)
for tissue pathogens, in a dehydration stage consecutive
neutrophil transformation in connective tissue cells
is marked. Grafted stromal cells (MMSC) are capable
to be rapidly differentiated at once in precursors of
fibroblasts therefore high clinical efficacy of treatment
is achieved.
Key words: transformation of neutrophils,
processed lipoaspirate (MMSC), proliferation
index, new tissue cellular composition.
М.Д.Перова
• д.м.н., профессор, засл. врач Российской
Федерации, руководитель, “Краснодарский
Центр пародонтологии и дентальной
имплантации”®, г. Краснодар
Адрес: 350078, г. Краснодар, Тургенева, д. 203
Тел./факс: 8 (861) 2206223
E-mail: [email protected]
М.Г.Шубич
• д.м.н., профессор, КГМУ, г. Краснодар
Адрес: 350000, г. Краснодар, ул. Седина, д. 4
Тел./факс: 8 (861) 2680159
E-mail: [email protected]
В.А.Козлов
• д.м.н., профессор, засл. деятель науки
Российской Федерации, член-корр. РАМН,
кафедра хирургической стоматологии
и челюстно-лицевой хирургии, СПбМАПО
Адрес: 191015, Санкт-Петербург,
Кирочная ул., д. 41
Тел./факс: 8 (812) 303-50-92
E-mail: [email protected]
При
хроническом воспалительно-деструктивном процессе в “открытой” биологической системе — тканях пародонта (при пародонтите) создаются неблагоприятные условия
А.В.Тропина
• врач-пародонтолог, “Краснодарский Центр
пародонтологии и дентальной имплантации”®
Адрес: 350078, Краснодар, Тургенева, д. 203
Тел./факс: 8 (861) 2206779
E-mail: [email protected]
Резюме. В работе продемонстрировано положительное влияние аутологичных стромальных
клеток (ММСК) на рост зубодесневого прикрепления при развившемся пародонтите. Иммуногистохимическое исследование выявило малое
количество клеток регенерата, находящихся в
клеточном цикле, без значимых различий в
группах исследования. Анализ цитограмм в
начальном периоде регенераторного процесса
показал, что развитие грануляционной ткани
происходит за счет трансформации пришедших
в рану нейтрофильных гранулоцитов, которые
массово заселяют тканевые дефекты. В стадии
экссудации раны нейтрофилы участвуют в образовании внеклеточных ловушек для уничтожения тканевых патогенов, в стадии дегидратации
отмечается последовательная трансформация
нейтрофилов в клетки соединительной ткани.
Трансплантированные стромальные клетки способны сразу дифференцироваться в предшественники фибробластов, в результате чего достигается высокая клиническая эффективность
лечения пародонтита.
Ключевые слова: трансформация нейтрофилов, васкулярно-стромальноклеточная фракция (ММСК), индекс пролиферации, клеточный
состав регенерата.
Evaluation of processed lipoaspirate cells
autografting for the treatment of advanced
periodontitis and features of granulation tissue
growth (M.D.Perova, M.G.Shubich, V.A.Kozlov,
A.V.Tropina).
для восстановления опорного аппарата зуба, в
результате чего на месте повреждения возникают структуры, не аналогичные предшествовавшим: формируются пародонтальные карманы с эпителиально-фиброзной выстилкой
[4]. Поскольку имеет место не физиологическое
отмирание тканевых элементов, а патологическая их гибель, то и восстановление пародонта количественно и качественно отличается от
нормологической регенерации. Поэтому для
достижения высоких клинических результатов
более надежно использовать регенеративные
методы лечения.
Начиная с 2005 года, в нашем Центре, совместно с врачом-хирургом Южно-Российского
центра косметологии и пластической хирургии
канд. мед. наук В.Б.Карпюком, больным с развившимися воспалительно-деструктивными и
невоспалительными (тканевая рецессия) заболеваниями тканей пародонта применяется методика аутотрансплантации васкулярно-стромальноклеточной фракции, выделенной из жировой
ткани [1]. Первые результаты исследования на
небольшом клиническом материале, суть которых сводится к существенному и статистически
значимому приросту структур зубодесневого
■Рис. 1. Динамика основных клинических показателей в группах исследования
Примечание: звездочками помечены статистически значимые различия показателей в группе сравнения
при p ≤ 0,05; скобках указана величина стандартного отклонения
62
2010/2
ИНСТИТУТ
СТОМАТОЛОГИИ
instom.ru
научные исследования
в
с т о м а т о л о г и и
■Рис. 2
Рентгенологическая
картина
восстановления
твердых тканей
в фуркационном
дефекте (F III) моляра
верхней челюсти
через 24 мес.
■Рис. 3а. Гистологический образец регенерата.
■Рис. 3б. Гистологический образец
В тканях обнаруживается небольшое количество
Ki-67 позитивных клеток (темно-коричневое
окрашивание ядер). Иммуногистохимическая
окраска: Ki-67-антиген. Ув. 120
поврежденной ткани. Большинство клеток
эпителия базального слоя находится в клеточном
цикле. Иммуногистохимическая окраска: Ki-67антиген. Ув. 120
прикрепления, по сравнению с таковым при
использовании регенеративных мембран, были
опубликованы нами ранее [5].
Цель настоящей работы: с помощью объективных методов исследования оценить клиническую эффективность лечения больных
развившимся пародонтитом и особенности
формирования тканевого регенерата после
аутотрансплантации васкулярно-стромальноклеточной фракции.
ределяли значения индекса налета (Löe, 1964)
и десневого индекса (Löe&Silness, 1963). Состояние костной ткани оценивалось с помощью
цифрового радиовизиографического комплекса Gendex.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В настоящее исследование включено 105
пациентов (68 из них — соматически здоровы) с
хроническим генерализованным пародонтитом
средней и тяжелой степени, в возрасте от 28 до
60 лет: у 67 из них (38 муж., 29 жен.) использовали тестируемый метод клеточной терапии; 38
пациентам, вошедшим в контрольную группу
(15 муж., 23 жен.), применяли метод направленной регенерации тканей (нерезорбируемые
ПТФЭ мембраны “Экофлон”, биоситалл “НПФ
Элкор”, СПб). Лечение больных пародонтитом
проводилось после оформления договора с подписанием формуляра добровольного информированного согласия.
В работе использован протокол выделения
мультипотентных мезенхимных стромальных
клеток (ММСК) из липоаспирата пациента в
условиях операционного блока по методике
P. Zuk с соавт. (2002) в собственной модификации (Патент РФ на изобретение №2320285)
[10]. Без дополнительной экспансии клеток in
vitro проводили ex tempore аутотрансплантацию
васкулярно-стромальноклеточной фракции с
элементами стромы жировой ткани (без адипоцитов) в хирургически санированные пародонтальные дефекты, с добавлением биоситалла,
под барьерную мембрану во избежание потери
гелеобразного трансплантата.
Для клинической оценки результатов измеряли глубину зондирования, величину рецессии десневого края, подсчитывали потерю
и прирост зубодесневого прикрепления, что
было уже описано нами ранее [5], а также оп-
■Рис. 4. Цитограмма регенерата на 2-е сутки
после операции. Инфильтрация нейтрофилами,
находящимися в состоянии трансформации.
Окраска по Май-Грюнвальд-Романовскому. Ув. 480
■Рис. 5. Цитограмма регенерата на 3-и сутки
после операции. Формирование внеклеточных
нейтрофильных ловушек, которые визуализируются
в оптическом микроскопе в виде сети между
взаимодействующими трансформированными
нейтрофилами. Окраска по Май-ГрюнвальдРомановскому. Ув. 1200
Материалом для морфологического исследования послужили 43 тканевых образца обеих
групп, стандартно фиксированных и окрашенных гематоксилином-эозином для верификации сформированных структур. Иммуногистохимическое исследование проводилось пероксидазно-антипероксидазным методом на
депарафинированных срезах с первичными
моноклональными антителами к маркёру пролиферации Ki-67 (клон MIB-1) (DAKO, Дания) в
гистологической лаборатории Краснодарского
краевого онкологического диспансера. Индекс
пролиферации (ИП) рассчитывали как процент
Ki-67 окрашенных ядер по следующей формуле:
ИП = число Ki-67 окрашенных ядер/500 клеточных ядер в регенерате х 100% [7]. Клеточный состав раннего регенерата в динамике изучен с помощью 240 препаратов-отпечатков 43
больных с поверхности ткани de novo, которые
после высушивания и фиксации окрашивали
по Май-Грюнвальд-Романовскому.
Статистическая обработка данных проведена с использованием традиционных методов
с подсчетом средних значений параметров (M),
ошибки средней арифметической (m), стандартного отклонения (σ) и вычислением доверительного интервала (ДИ). Значимость различий показателей до и после лечения, а также в
группах сравнения при р≤0,05 определялась с
помощью t-критерия Стъюдента и программного
обеспечения “Биостат” (С.Гланц, 1999).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
И ОБСУЖДЕНИЕ
Оценка клинических показателей в группах сравнения в ранние (1 и 6 месяцев) и отдаленные сроки (12 и 24 месяца) представлена
на рис. 1. Показатель прироста зубодесневого
прикрепления (как единственно объективный
критерий эффективности лечения пародонтита)
имел в основной группе устойчивую тенденцию
к росту: с 4,8 мм через 1мес. после операции до
5,7 мм через 2 года с пиковым значением в этом
отдаленном периоде. Восстановление твердых
тканей особенно было заметно в фуркационных
дефектах моляров — FIII (рис. 2) при характерных низких значениях глубины зондирования
(до 2 мм) и снижении подвижности зубов с
3-ей степени до состояния физиологической. В
контроле наибольший прирост зубодесневого
прикрепления зафиксирован через полгода после лечения (3,27 мм), после чего наблюдалась
тенденция к его потере до 3 мм. Объективные
результаты клинической оценки убеждают в
существенном улучшении качества структур
прикрепления у пациентов основной группы,
что подтверждает наличие индуцирующего
влияния вносимого в пародонтальный дефект
трансплантата на восстановление поврежденных тканей опорного аппарата зуба.
В гистологическом исследовании большинства биоптатов обеих групп наблюдалось формирование молодого эпителия зубодесневого
прикрепления, не отличающегося по своим
характеристикам от нормального. В апикальном участке этого эпителия обнаруживались
вплетенные в корневой субстрат волокна соединительной ткани de novo, что представляло
собой участок ингибирования эпителиального
роста, как было нами документировано ранее
[3]. Этот феномен объясняет отсутствие остаточного пародонтального кармана. Только в 3-х
случаях в контрольной группе и у одного больного основной группы наблюдались остаточные
пародонтальные карманы на фоне неудовлетво-
63
2010/2
ИНСТИТУТ
СТОМАТОЛОГИИ
instom.ru
научные исследования
в
■Рис. 6. Цитограмма поверхностного слоя
регенерата на 14-е сутки после операции. Среди
волокон молодой ткани видны многочисленные
фиксированные нейтрофилы с разной степенью
трансформации, справа внизу — моноцитарная
клетка. Окраска по Май-ГрюнвальдРомановскому. Ув. 1200
■Рис. 7. Цитограмма регенерата на 2-е сутки
после операции с клеточной терапией. На
фоне активной трансформации нейтрофилов
определяются большие отросчатые клетки
с базофильной цитоплазмой и ядрами
сетчатой структуры, а также сформированные
моноцитарные клетки. Окраска по МайГрюнвальд-Романовскому. Ув. 480
рительного гигиенического ухода за полостью
рта (ИН выше 2,5 баллов), у курящих лиц и с
отягощенным анамнезом (аутоиммунный тиреоидит, язвенная болезнь желудка и 12-перстной
кишки, сердечно-сосудистые расстройства).
При довольно выраженном объеме тканипролиферата на гистологических срезах обеих
групп обнаруживалось только небольшое число Ki-67-позитивных ядер (рис. 3a, б). Частота
встречаемости ядер, вступивших в реакцию с
белком MIB-1, была сравнительно выше в десневом эпителии, чем в клетках соединительной ткани регенерата, но существенно ниже,
чем в образцах до лечения. Индекс пролиферации в основной группе составил 4.5-9.8%
(m±SD; 6.3±2.2%; 95%ДИ = 5.8-7.2%). В контрольной группе ИП составил 3.7-8.3% (m±SD;
6.8±2.7%; 95%ДИ = 5.2-6.6%). Для сравнения:
до лечения этот показатель составлял 38-53%
(m±SD; 44±8.2%; 95%ДИ = 44-50%). Исходя из
этих данных, можно предположить, что ткани
пародонта в процессе репаративной регенерации формируются не только за счет митотического деления клеток сохраненных структур
периодонтальной связки и кости альвеолы, как
предполагалось ранее.
Клеточный состав поверхности раны с развитием грануляций — наиболее подходящий
объект для выяснения генеза соединительной
ткани в зоне регенерации, так как известно,
что формирование регенерата происходит за
счет верхних его слоёв наименее зрелых и еще
с т о м а т о л о г и и
не прочно связанных с основным веществом
соединительной ткани клеток — переходных
форм [2]. В более поздние сроки (17-21 сутки)
отпечатки получали с внутренней поверхности
барьерной мембраны после её эксплантации из
раны, т.е. оценивали поверхностный монослой
регенерата. Наблюдались типичные и довольно
характерные изменения цитологического состава на поверхности регенерата: от сплошной
инфильтрации нейтрофильными гранулоцитами (НГ) в первые трое суток после операции
до межклеточных контактов видоизмененных
НГ с большим количеством гистиоцитарных и
фибробластоподобных элементов к 21-м суткам (рис. 4, 6).
Мигрировавшие в зону регенерации активированные НГ изменяли во времени свой
первоначальный вид, структуру и форму, увеличиваясь в размерах в несколько раз. Единичное
количество НГ проявляло свою фагоцитарную
функцию. У большинства же НГ наблюдалось
ослабление ядерного окрашивания (деконденсация хроматина) и аутолиз цитоплазмы, что
было принято считать деградацией клетки.
Однако, как обнаруживалось в большинстве
послеоперационных образцов, видоизмененные
таким образом НГ взаимодействовали между
собой по нескольку элементов, образовывая
сетчатую структуру в виде нечёткой вуали, в
составе которой визуализировалось хроматиновое вещество (рис. 5). Описанная картина соответствует исходной форме образования так
называемых внеклеточных нейтрофильных ловушек (neutrophil exrtacellular traps, NETs) [6,
8], которые формируются активированными
клетками для уничтожения микробных и иных
патогенов за счет создания в межклеточной среде
высоких концентраций антимикробных молекул. В составе ловушек выявляются не только
белки гранул цитоплазмы (эластаза, катепсин
G, миелопероксидаза, желатиназа, лактоферрин), но и гистоны с ДНК, что дало основание исследователям назвать явление NETóзом,
предполагая неизбежную клеточную смерть (по
аналогии с некрозом или апоптозом). Тем не
менее, как недавно выяснилось, в формировании ловушек принимают участие не только
погибшие, но и живые клетки, поскольку в их
составе определяется, помимо ядерной, ещё и
митохондриальная ДНК [9]. Другими словами,
формирование NETs предположительно может
рассматриваться как одна из форм трансформации нейтрофила.
Доля действительно деградированных клеточных элементов (бесформенные “розовые
кляксы”) в первые трое суток после операции
оказалась примерно одинаковой в группах исследования и составила 15-26%. В периоде формирования первичной тканевой структуры нами
отмечены различные формы трансформации НГ:
1) потеря перемычек между сегментами ядер
НГ и их обособление за пределы клетки с приобретением более интенсивного базофильного
окрашивания; 2) обособление за пределы клетки
подобных ядерных сегментов при сохранении
межсегментных перемычек; 3) увеличение размеров обособленных ядер с потерей интенсивности окрашивания и визуализацией внутри
ядра нескольких ядрышек с окружением таких
ядер вытянутой цитоплазмой, что напоминает
образование фибробластоподобных элементов;
4) увеличение размеров сегментов ядер и их
слияние внутри НГ с появлением мононуклеарных форм при ослаблении ядерного окрашивания; 5) формирование многоядерных клеток
с большим количеством цитоплазмы, возможно образованных путем слияния нескольких
трансформированных НГ.
В группе с клеточной терапией наблюдалась
более интенсивная реакция нейтрофилов, не
зависящая от исходной степени потери тканей
прикрепления, возраста, пола и наличия у пациентов сопутствующей соматической патологии
— образование многочисленных фибробластоподобных клеточных элементов уже на вторые сутки после операции, чего не отмечалось
в контрольной группе. В остальном процессы
клеточного поведения в группах исследования
оставались идентичными. По-видимому, строма жировой ткани, сохраненная нами в составе
аутотрансплантата, служит оптимальной биоинертной матрицей, которая после операции
довольно плотно заселяется нейтрофильными
гранулоцитами по всему объему и способствует
прикреплению, поляризации и последующей
коммуникации клеточных форм в регенерате.
На основании различий клеточного состава в
группах исследования есть основания полагать,
что стромальные клетки аутотрансплантата
(ММСК) быстро дифференцируются в предшественников фибробластов уже в первые двое
суток (рис. 7).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенное исследование позволяет заключить о наличии выраженного индуцирующего эффекта ММСК в составе аутологичной
васкулярно-стромальноклеточной фракции на
восстановление поврежденного опорного аппарата зуба, а также о достижении высоких
результатов лечения больных развившимся пародонтитом. Наличие морфологической особенности нейтрофилов — сегментированного
ядра, позволило нам проследить динамику клеточных форм, обусловленную трансформацией НГ в очаге воспалительной регенерации с
формированием внеклеточных нейтрофильных
ловушек и новых клеточных форм, что, очевидно, имеет реальное значение в заполнении
пародонтальных дефектов.
ЛИТЕРАТУРА:
1.
Карпюк В.Б., Перова М.Д., Шубич М.Г. К изучению
свежевыделенных аутологичных стромальных клеток
подкожной жировой клетчатки для регенерации
биологических тканей // Институт Стоматологии. - 2009. №3(44). - C. 74-76.
2. Макаров А.С. Роль гранулоцитов в процессе
воспалительной регенерации по данным сравнительного
цитологического исследования. - Ставрополь, 1975. - 280 с.
3. Перова М.Д. Ткани пародонта: норма, патология, пути
восстановления. - М.: Триада Лтд, 2005. - 312 с.
4. Перова М.Д., Шубич М.Г. Молекулярные аспекты
инициации и развития воспалительно-деструктивных
заболеваний пародонта // Архив патологии. - М., 2006 - №5,
(Т.68). - C. 59-63.
5. Перова М.Д., Тропина А.В., Фомичёва Е.А. Карпюк В.Б.
Оценка роста нового зубодесневого прикрепления после
аутотрансплантации стромальных клеток, выделенных из
жировой ткани // Пародонтология. - 2006. - №4. - С. 28-31.
6. Brinkmann V., Reichard U., Goosmann C., Fauler B., Uhlemann Y.,
Weiss D.S., Weinrauch Y., Zychlinsky A. Neutrophil extracellular
traps kill bacteria. Science 2004; v. 303:1532-1535.
7. Jangjetriew P., Sukpanichnant S. Proliferation index in
tuberculous lymphadenitis. Asian Pacif J Allergy Immun 2009;
27:147-152.
8. Vitkov L., Klappacher M., Hannig M., Krautgarten WD.
Extracellular neutrophil traps in periodontitis. J Periodontal Res
2009; 5:664-672.
9. Yousefi S., Michalache C., Kozlowski E., Schmid I.,
Simon H.U. Viable neutrophils release mitochondrial DNA
to form neutrophil exrtacellular traps. Cell Death and
Differentiation 2009; 16:1438-1444.
10. Zuk P.A., Zhu M., Ashjian P., De Ugarte D. A., Huang J.I.,
Mizuno H., Alfonso Z.C., Fraser J.K., Benhaim P., Hedrick M.H.
Human Adipose Tissue Is a Source of Multipotent Stem Cells.
Mol. Biol. Cell. 2002; 13:4279-4295.
64
2010/2
ИНСТИТУТ
СТОМАТОЛОГИИ
instom.ru
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа