close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

- Портал электронных ресурсов Южного федерального

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Сазыкина Марина Александровна
ЭКОТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМ
С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОСЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ
ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫХ БАКТЕРИЙ
03.02.08 – экология (биологические науки)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Ростов-на-Дону - 2014
2
Работа выполнена в Научно-исследовательском институте биологии
Южного федерального университета
Научный консультант:
доктор биологических наук, старший научный
сотрудник Чистяков Владимир Анатольевич
Официальные оппоненты:
Чуйко Григорий Михайлович,
доктор биологических наук,
Институт биологии внутренних вод
им. И.Д. Папанина РАН,
заведующий лабораторией физиологии
и токсикологии водных животных
Тихомирова Елена Ивановна,
доктор биологических наук, профессор,
Саратовский государственный технический
университет имени Гагарина Ю.А.,
заведующая кафедрой «Экология»
Зобов Владимир Васильевич,
доктор биологических наук, профессор,
Институт экологии и географии
Казанского (Приволжского) федерального
университета, профессор кафедры
прикладной экологии
Ведущая организация: Институт озероведения РАН, г. Санкт-Петербург
Защита диссертации состоится 19 декабря 2014 г. в 15.00 на заседании
диссертационного совета Д 212.208.32 по биологическим наукам при Южном
федеральном университете (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Б. Садовая, 105/42, ЮФУ,
ауд. 203, зал заседаний по диссертационным советам, e-mail: [email protected],
факс: (863)263-87-23).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Южного
федерального университета (344090 г. Ростов-на-Дону, ул. Зорге, 21 ж).
Автореферат разослан « » ноября 2014 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор биологических наук
Денисова Татьяна Викторовна
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
Интерес к мониторингу токсичности воды в связи с масштабным
загрязнением гидросферы в последние годы значительно возрос. Сведения по
аккумуляции токсических веществ в водных экосистемах имеют определяющее
значение для прогноза их развития и состояния биоресурсного потенциала.
Также эта информация немаловажна в плане оценки появления негативных
последствий для человека. В связи с этим систематическому контролю качества
окружающей среды необходимо уделять особое внимание.
Традиционным подходом при проведении экологического мониторинга
водной среды является использование методов химического анализа для оценки
количественного содержания токсических веществ. Однако химический анализ
не учитывает их интегрального токсикологического эффекта на биологические
объекты. Для решения проблемы необходимо применение биологических
методов анализа. Сочетание химических аналитических методов совместно с
биотестированием в единую комплексную платформу мониторинга позволит в
значительной степени повысить эффективность оценки качества водных
экосистем.
Одним из наиболее перспективных методов, используемых при
проведении мониторинга окружающей среды, является анализ с
использованием биосенсоров (Daniel et al., 2008; Palchetti et al., 2008), в том
числе на основе биолюминесцентных бактерий (Woutersen et al., 2011; Elad,
Belkin, 2013; Zhang et al., 2013). Биолюминесцентные сенсоры, в которых в
качестве репортеров используются гены бактериальных люцифераз, могут
занять ключевую роль в биотестировании токсичности окружающей среды. С
этой
целью
необходимо
разработать
концепцию
использования
биолюминесцентных бактерий в экотоксикологическом мониторинге водных
экосистем.
Должны
быть
проанализированы
основные
принципы
формирования батарей lux-биосенсоров; учтены преимущества и недостатки
биолюминесцентного тестирования; рассмотрены перспективы, включающие
способы повышения его эффективности и технологичности.
Внедрение в практику экологического мониторинга невозможно без
анализа результатов, полученных при использовании lux-биосенсоров для
тестирования природных проб. Учитывая факт, что первоочередная проблема,
которая возникает в результате антропогенного прессинга, - проблема качества
воды, особый интерес представляет контроль с использованием биосенсоров
водных объектов. К наиболее значительным водным объектам по объему и
4
хозяйственной важности в Ростовской области относится р. Дон. Вода р. Дон –
основной источник питьевой воды населения Ростовской области. Кроме
донской воды, значительной ценностью обладает вода ростовских родников.
Практическое использование тест-системы на основе батареи luxбиосенсоров даст возможность проводить комплексную экспресс-оценку
токсичности компонентов водных экосистем, использовать полученные данные
для идентификации вида и источника загрязнения, способствуя тем самым
эффективности природоохранных мероприятий.
Цель работы: Разработать концепцию использования природных и
генно-инженерных биосенсоров на основе светящихся бактерий в мониторинге
токсичности
водных
экосистем
и
оценить
экотоксикологические
характеристики
водоемов
Азово-Донского
бассейна
с
помощью
сформированной батареи биолюминесцентных тестов.
Задачи исследования:
1. Разработать концепцию использования биолюминесцентных бактерий в
мониторинге токсичности водных экосистем на основе анализа принципов и
перспектив применения бактериальных lux-сенсоров в сочетании с
химическими аналитическими методами для оценки токсичности водных
экосистем.
2. Сформировать батарею биолюминесцентных тестов и оптимизировать
протоколы исследования с целью повышения чувствительности к
токсикантам различной природы.
3. Выделить, идентифицировать биолюминесцентные
бактерии из воды
Черного и Азовского морей с целью отбора штаммов, наиболее
чувствительных к действию различных токсикантов.
4. Определить таксономическое положение люминесцентного штамма VNB-15
на основе полифазного таксономического подхода, включающего
морфологические,
культуральные,
физиологические,
биохимические
свойства, хемотаксономическую характеристику и филогенетический анализ.
5. Оценить токсичность воды родников г. Ростова-на-Дону с помощью
репрезентативного набора биотестов. Сопоставить показатели токсичности,
полученные с помощью lux-биосенсоров, и результаты химического анализа
приоритетных поллютантов в родниках г. Ростова-на-Дону.
6. Оценить токсичность донных отложений участков Нижнего Дона с помощью
репрезентативного набора биотестов. Сопоставить показатели токсичности,
полученные с помощью lux-биосенсоров, и результаты химического анализа
приоритетных поллютантов в донных отложениях Нижнего Дона.
5
Научная новизна
Разработана научная концепция использования биосенсоров на основе
биолюминесцентных бактерий в мониторинге токсичности водных экосистем.
Впервые апробирована на приоритетных токсикантах и природных
образцах воды родников г. Ростова-на-Дону и донных отложений Нижнего Дона
батарея экспресс-тестов на основе биолюминесцентных бактерий, со временем
ответа, не превышающим 2 часа, позволяющая определять интегральную
токсичность, генотоксичность, прооксидантную активность, а также оценивать
присутствие ртути и мышьяка, и веществ, вызывающих повреждение белков и
мембран.
Выделен новый вид биолюминесцентных бактерий рода Vibrio из воды
Черного моря. Штамму присвоено название Vibrio aquamarinus sp. nov. Штамм
депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов
(Vibrio aquamarinus VKPM B-11245) и в Немецкой Коллекции
Микроорганизмов и Клеточных Культур (Vibrio aquamarinus DSM 26054).
Три штамма биолюминесцентных бактерий, выделенных из воды Черного
моря, предложены в качестве новых тест-культур для тестирования токсичности
компонентов окружающей среды (Сазыкина, Цыбульский, 2008; 2009;
Цыбульский, Сазыкина, 2010; Сазыкин и др., 2013-в).
Впервые получены результаты по токсичности, генотоксичности,
проооксидантной активности, присутствию ртути и мышьяка и веществ,
повреждающих белки и мембраны, в воде 23 родников г. Ростова-на-Дону в
период с 2009 по 2012 гг. (Сазыкина и др., 2010-а, в; 2011-а, б; 2013-а).
Новизной отличаются исследования генотоксичности экстрактов донных
отложений Нижнего Дона в разные сезоны 2003–2007 гг. и 2011 г. (Сазыкина и
др., 2012-а). Впервые с помощью батареи биолюминесцентных тестов
получены результаты по токсичности, проооксидантной активности,
присутствию ртути и мышьяка, а также веществ, вызывающих повреждение
белков и мембран, в донных отложениях Нижнего Дона в 2011 г. (Сазыкина и
др., 2009-в; Сазыкина и др., 2010-в; 2011-б).
Впервые в воде родников г. Ростова-на Дону (2011 г.) проведено
определение
содержания
ряда
приоритетных
токсикантов:
ртути, полиароматических углеводородов (ПАУ), индивидуальных конгенеров
полихлорированных бифенилов (ПХБ). Показано наличие в пробах
канцерогенных ПАУ.
Впервые проведено сопоставление показателей токсичности донных
отложений р. Дон, полученных при помощи батареи биолюминесцентных
6
тестов, с данными химического анализа по содержанию группы приоритетных
токсикантов.
Впервые проведено сопоставление показателей токсичности и
генотоксичности воды родников г. Ростова-на-Дону, полученных при помощи
батареи биолюминесцентных тестов, с данными химического анализа по
содержанию в воде группы приоритетных токсикантов.
Для выделения биолюминесцентных бактерий из морской воды
разработаны две новые питательные среды, состав которых запатентован
(Сазыкина и др., 2009-а, б).
Теоретическая значимость работы
Разработана научная концепция использования бактериальных luxбиосенсоров в мониторинге токсичности водных экосистем, позволяющая
повысить его эффективность.
Исследование выделенного из воды Черного моря штамма
биолюминесцентных бактерий Vibrio aquamarinus VKPM B-11245 (Vibrio
aquamarinus DSM 26054), относящегося к новому виду в роде Vibrio, позволило
расширить знания о разнообразии биолюминесцентных бактерий рода Vibrio.
Штамм может быть использован в фундаментальных исследованиях.
Результаты мониторинга токсичности воды родников г. Ростова-на-Дону
с 2009 по 2012 гг. свидетельствуют о системном характере загрязнения этих
водоемов. Особую опасность несет загрязнение воды исследованных родников
г. Ростова-на-Дону генотоксикантами. Выявленные факты являются
основанием для разработки комплексной программы улучшения качества воды
городских водоемов г. Ростова-на-Дону, неотъемлемой частью которой должно
быть внедрение в практику системы биомониторинга токсичности.
Определение количественных параметров загрязнения токсичными веществами
родниковой воды позволит проводить направленный поиск источников
загрязнения – предприятий, бытовых стоков, мусорных свалок, элементов
городского хозяйства, которые несут основную ответственность за рост
токсикологического прессинга городской среды.
Результаты мониторинга донных отложений Нижнего Дона в течение
2003–2007 гг. и в 2011 г. позволили зарегистрировать периоды времени, на
которые пришелся максимум загрязнения генотоксичными веществами.
Выявлен хронический характер загрязнения генотоксикантами ряда
исследованных районов.
Разработан проект методических рекомендаций «Оценка токсичности
компонентов экосистем на основе использования батареи бактериальных lux-
7
биосенсоров».
Материалы работы используются в лекциях на кафедре генетики Южного
федерального университета в спецкурсах: «Экологическая генетика»,
«Экотоксикология», «Мутагены окружающей среды».
В результате проведенных исследований зарегистрированы 6 патентов на
изобретения и 4 базы данных, которые используются при проведении
экотоксикологического мониторинга окружающей среды.
Практическая значимость работы
Сформирована батарея экспресс-тестов на основе биолюминесцентных
бактерий, со временем ответа, не превышающим 2 часа, позволяющая
определять интегральную токсичность, генотоксичность, прооксидантную
активность проб воды, а также оценивать присутствие в них ртути, мышьяка и
веществ, вызывающих повреждение белков и мембран. Данный набор
биолюминесцентных тест-систем может быть применен для решения широкого
спектра экотоксикологических задач. В настоящее время батарея
биолюминесцентных тестов используется для мониторинга токсичности воды,
донных отложений и гидробионтов Азово-Донского бассейна, почвы,
животных, растений, воздуха и атмосферных осадков Ростовской области,
сточных вод г. Ростова-на-Дону и г. Мюнхена, а также для скрининга
биологической активности природных и синтетических соединений.
Три выделенных из морской воды штамма биолюминесцентных бактерий
(в частности, штамм Vibrio aquamarinus VKPM B-11245) обладают высокой
чувствительностью к действию приоритетных токсикантов, что дает
возможность их непосредственного применения в биотестировании
токсичности водных экосистем, а также использования lux-оперонов данных
микроорганизмов
при
дальнейшем
конструировании
бактериальных
люминесцентных сенсоров.
Разработан состав двух новых питательных сред, использование которых
позволяет выделить максимальное количество биолюминесцентных бактерий
из морской воды.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Использование батареи бактериальных lux-сенсоров перспективно для
проведения комплексного экотоксикологического скрининга и позволяет
отобрать для детального анализа другими методами пробы, загрязненные
токсичными веществами. Исключение «чистых» проб из перечня
анализируемых повышает эффективность проведения исследования.
2. Сформирован комплекс экспресс-тестов на основе биолюминесцентных
8
бактерий, со временем ответа, не превышающим 2 часа, позволяющий
определять интегральную токсичность, генотоксичность, прооксидантную
активность в пробах водных экосистем, а также оценивать присутствие в них
ртути, мышьяка и веществ, вызывающих повреждение белков и мембран.
Оптимальная батарея биолюминесцентных тестов позволяет оценить спектр
токсического
действия
загрязняющих
веществ
при
проведении
экологического мониторинга водных экосистем.
3. Три штамма биолюминесцентных бактерий, выделенных из воды Черного
моря, обладают высокой чувствительностью к действию различных
токсикантов и перспективны для исследования токсичности проб
окружающей среды.
4. Биолюминесцентный штамм VNB-15, выделенный из воды Черного моря,
отнесен к новому виду рода Vibrio на основании результатов полифазного
таксономического подхода, включающего морфологические, культуральные,
физиологические,
биохимические
свойства,
хемотаксономическую
характеристику и филогенетический анализ.
5. Загрязнение воды родников г. Ростова-на-Дону в 2009–2012 гг. токсичными
веществами, в том числе способными повреждать генетический аппарат и
вызывать прооксидантные эффекты, носит масштабный характер.
Корреляционный
анализ
результатов,
полученных
с
помощью
биолюминесцентных сенсоров и показателей химического анализа, выявил
участие полиароматических углеводородов в развитии прооксидантного
эффекта и генотоксичности воды родников г. Ростова-на-Дону.
6. Для исследованных участков Нижнего Дона в 2003–2007 и 2011 гг.
характерно стабильное загрязнение генотоксическими веществами.
Корреляционный анализ результатов, полученных в 2011 г. с помощью
биолюминесцентных сенсоров и показателей химического анализа, выявил,
что источниками генотоксичности донных отложений Нижнего Дона служат
нефтепродукты, отдельные ПАУ (фенантрен, флуорантен, пирен, хризен,
бенз(k)флуорантен, бенз(a)пирен), ванадий, никель и ртуть.
Апробация работы. Результаты диссертации доложены на второй
Международной научной конференции «Биотехнология – охране окружающей
среды» (МГУ, 2004); III-й научно-практической конференции «Экологические
проблемы. Взгляд в будущее» (4-7 сентября 2006 г., СОЛ «Лиманчик»);
конференции грантодержателей регионального конкурса РФФИ и
администрации
Краснодарского
края
«ЮГ
РОССИИ»
«Вклад
фундаментальных исследований в развитие современной инновационной
9
экономики Краснодарского края» (г. Краснодар, 2006, 2007); Международной
конференции «Биоресурсы, биотехнологии, экологически безопасное развитие
регионов юга России» (3-5 октября 2007 г., г. Астрахань); Международном
Междисциплинарном Симпозиуме «От экспериментальной медицины к
превентивной и интегративной медицине» (Судак – Крым, Украина, 19–30
сентября 2008 г.); Международной научной конференции «Современные
основы формирования сырьевых ресурсов Азово-Черноморского бассейна в
условиях изменения климата и антропогенного воздействия» (15–18 декабря
2008 г., г. Ростов-на-Дону); 4-й Всероссийской научно-практической
конференции с международным участием «Экологические проблемы
промышленных городов» (г. Саратов, 2009); III Международной научнопрактической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий
и медицины», (г. Ростов-на-Дону, 1–4 октября 2009 г.); Всероссийской
конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии» (26-30
октября 2009 г., Пущино-Тула); Международной конференции «Антропогенная
трансформация природной среды» (18–21 октября 2010 г., г. Пермь); 4-й
Международной телеконференции «Фундаментальные науки и практика» (г.
Томск, 22 февраля–4 марта, 2011); 5-й Всероссийской научно-практической
конференции с международным участием «Экологические проблемы
промышленных городов» (г. Саратов, 12–14 апреля 2011 г.); Семнадцатой
Всероссийской научной конференции студентов-физиков и молодых ученых
(25 марта–1 апреля 2011 г., г. Екатеринбург); IV Международной научнопрактической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий
и медицины», г. Ростов-на-Дону, 22-25 сентября 2011 г.; Международной
конференции «Биология – наука XXI века» (г. Москва, 24 мая 2012 г.);
I Международном биологическом конгрессе Кыргызстана (24–26 сентября
2012 г., г. Бишкек), V Международной научно-практической конференции
«Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (г. Ростов-наДону, 3-5 октября 2013 г.) и Ученых Советах НИИ биологии ЮФУ.
Конкурсная поддержка работы. Автор как исполнитель участвовала в
работе по грантам, поддержанным РФФИ (№ 06-04-96803 «Разработка и
апробация тест-системы оценки токсичности компонентов экосистем морских
водоемов на основе биолюминесцентных аборигенных бактерий»,
№ 08-04-99108-р_офи «Разработка и апробация тест-системы оценки
токсичности компонентов экосистем морских водоемов на основе
флуориметрии аборигенных микроводорослей»), по гранту Президента РФ для
10
поддержки ведущих научных школ (НШ-2449.2014.4). В качестве руководителя
автор принимала участие в работе по грантам, поддержанным Министерством
образования и науки РФ в рамках АВЦП (№ 2.1.1/5028 «Мониторинг
загрязнения окружающей среды при помощи бактериальных lux-биосенсоров»);
в рамках ФЦП (№ 14.A18.21.0851 «Исследование экотоксикологических
параметров и бактериального загрязнения сточных вод г. Ростова-на-Дону и
г. Мюнхена»); по проекту 4.5835.2011 «Исследование механизмов действия
негативных антропогенных и экстремальных факторов среды с помощью
клеточных биосенсоров»; по проекту, выполняемому в рамках проектной части
внутреннего гранта ЮФУ № 213.01.-07.2014/12ПЧВГ «Мониторинг и изучение
влияния поллютантов, провоцирующих возникновение и передачу
бактериальных детерминант резистентности, в биотопах Азово-Черноморского
бассейна, подверженных антропогенному прессингу».
Личный вклад автора. Основу диссертации составляют результаты,
полученные автором в 2003–2012 гг. Автор принимала личное участие на всех
этапах работы, а именно: формулировка проблемы, постановка целей и задач,
планирование и проведение экспериментов. По результатам исследований
автором или научным коллективом с участием автора опубликованы научные
работы, где проанализированы и определены основные результаты
диссертации.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 102 работы (43,2 п. л.),
из которых – 30 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ (среди них 10 - в базе
данных «Scopus», 9 - в базе данных «Web of Science»), 2 монографии, 1 глава в
коллективной монографии, 6 патентов на изобретение, 4 базы данных.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 358 страницах
машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и
методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и
списка использованной литературы, включающего
134 источника
отечественных и 318 зарубежных авторов.
Автор выражает глубокую признательность за помощь в работе
сотрудникам лаборатории промышленных микроорганизмов НИИ биологии
ЮФУ, к.б.н., с.н.с. НИИ биологии ЮФУ Сазыкину И.С., д.б.н., в.н.с.
ФГУП «ГосНИИГенетика» Манухову И.В., к.б.н., зав. лабораторией
ФГУП «АзНИИРХ» Цыбульскому И.Е., специалистам ФГУП «АзНИИРХ»,
специалистам РГУНиГ имени И.М. Губкина. Особую благодарность за научные
консультации и неоценимую моральную поддержку автор выражает
д.б.н., проф. ФГУП «АзНИИРХ» Корниенко Г.Г.
11
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1 Обзор литературы
В 5-ти подглавах представлен обзор отечественной и зарубежной
литературы, в котором рассматривается современное состояние, тенденции
развития и использование биосенсоров для детекции загрязнения водных
экосистем. Дана общая характеристика родников г. Ростова-на-Дону и
характеристика химического загрязнения р. Дон.
Глава 2 Материалы и методы исследований
Пробы воды для выделения биолюминесцентных бактерий отбирали на
акватории Темрюкского района в Азовском море и на акватории Черного моря в
районе мыса Б. Утриш в июне 2006 г. и в 2009 г. в районе п. Абрау-Дюрсо.
В качестве материала для оценки токсичности водной среды служили
образцы донных отложений р. Дон и вода родников г. Ростова-на-Дону.
Пробы воды для исследований отбирали в течение весны и лета 2009 г. –
на акватории 19 родников; в июле 2010 г. – на акватории 8 родников; в октябре и
ноябре 2011 г. – на акватории 15 родников; в марте 2012 г. – на акватории
11 родников г. Ростова-на-Дону. Образцы донных отложений отбирали в
нижнем течении р. Дон в 2003–2007 гг. и в 2011 г. на 16 участках – от 500 м
выше устья р. Северский Донец до 0 км (створ).
Для исследования компонентов экосистем были отобраны: 71 образец
атмосферного воздуха (воздушные фильтры) на территории г. Ростова-на-Дону
в течение 2001–2010 гг.; образцы атмосферных осадков г. Ростова-на-Дону - 13
проб дождевой воды (декабрь 2010–январь 2011) и 13 проб снега (декабрь 2010–
март 2011 г.); 5 образцов почв в районе Новочеркасской ГРЭС в июне 2009 г. и 9
образцов почв в городах Ростовской области и в г. Ростове-на-Дону в сентябре
2010 г.; 8 образцов печени скворца обыкновенного (Sturnus vulgaris) в
х. Волочаевском Орловского района в апреле 2010 г.; 9 образцов бриофлоры в
апреле 2009 г., 15 образцов бриофлоры в апреле 2010 г. в г. Ростове-на-Дону.
В качестве экстрагента для приготовления экстрактов донных отложений,
почв, тканей животных и растений использовали 1 % раствор TWEEN-80 в
96 % этаноле. Выделение биолюминесцентных бактерий из воды Черного и
Азовского морей проводили концентрированием микроорганизмов на
мембранных фильтрах с последующим выращиванием на специально
подобранных селективных средах.
Идентификацию выделенных штаммов проводили в соответствии с
12
существующими рекомендациями по идентификации бактерий семейства
Vibrionaceae (Определитель бактерий Берджи, 1997) и согласно рекомендациям
по быстрой идентификации фотобактерий (Гительзон, 1984).
Для идентификации нового вида бактерий использовали полифазный
таксономический подход, включающий морфологические, культуральные,
физиологические
и
биохимические
свойства,
хемотаксономическую
характеристику и филогенетический анализ, основанный на сравнении
последовательностей трёх housekeeping генов и последовательностей генов 16S
рРНК. Vibrio harveyi ATCC 14126 был использован во всех вышеуказанных
тестах в качестве референсного штамма. Филогенетический анализ был
проведен совместно со специалистами ФГУП «ГосНИИГенетика» (г. Москва).
Хемотаксономический анализ был проведен по стандартной методике
совместно со специалистами РГУНиГ имени И.М. Губкина (г. Москва).
Электронные микрофотографии штамма VNB-15 получены совместно со
специалистами Широковым В.Б. (кафедра "Нанотехнологии" физического
факультета ЮФУ) и Гусенко И.В. (НКТБ «Пьезоприбор» ЮФУ).
Для определения токсичности использована батарея люминесцентных
бактериальных биосенсоров, полученных путём трансформации клеток E. coli
гибридными плазмидами, несущими lux-оперон под контролем необходимых
промоторов. Штаммы любезно предоставлены И.В. Мануховым (ФГУП
«ГосНИИГенетика») и Л.Р. Птицыным (ЗАО "АГРИ", г. Москва). Также был
использован природный штамм Vibrio, выделенный из воды Черного моря
(Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245).
Измерение люминесценции проводилось на микропланшетном
люминометре LM–01T (Immunotech). В качестве меры интегральной
токсичности, оцениваемой по подавлению свечения, использовали индекс
токсичности «Т» (Т = 100 (Ik-Io)/Ik, где Ik и Io, соответственно, интенсивность
свечения контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции
исследуемого раствора с тест-объектом). В качестве меры токсичности,
определяемой с помощью индуцируемых lux-биосенсоров, использовали
истинный фактор индукции «I» (I = Fi/K, где Fi - фактор индукции, K коэффициент подавления. Фактор индукции (Fi) определяли как отношение
интенсивности свечения cуспензии lux-биосенсора с индуцируемым
промотором в присутствии тестируемого соединения (Lc), к интенсивности
свечения контрольной суспензии (Lk): Fi=Lc/Lk. Коэффициент подавления
свечения (K) определяли по формуле: К = lc/lk, где lc - интенсивность свечения
суспензии lux-штамма с конститутивным промотором в присутствии
13
тестируемого соединения; lk - интенсивность свечения контрольной суспензии.
При статистически значимом (p<0,05) отличии опыта от контроля I ≤ 2,
обнаруженный эффект оценивали как «слабый», при 2 ≤ I ≤ 10 - как «средний»
и при 10 ≤ I - как «сильный» эффект. Метаболическую активацию промутагенов
проводили по стандартной методике в присутствии S9 фракции печени крыс,
активированной арохлором.
Микробиологические показатели определяли по стандартным методикам.
Содержание полиароматических углеводородов, полихлорированных
бифенилов, нефтепродуктов и тяжелых металлов определяли по стандартным
методикам совместно со специалистами ФГУП «АзНИИРХ».
Статистическую обработку проводили по стандартным биометрическим
формулам (Владимирский, 1983; Лакин, 1990). Все расчеты производили с
использованием программы Excel.
Структура исследований приведена на рисунке 1.
Глава 3 Выделение штаммов биолюминесцентных бактерий из воды
Азовского и Черного морей, их идентификация и определение
чувствительности к действию токсических факторов
Для выделения и культивирования биолюминесцентных бактерий было
подобрано 8 селективных питательных сред, 6 из которых являются
стандартными, используемыми в микробиологии. Среда № 3 содержала разное
количество NaCl (0, 10, 17, 30 г/л). В среде № 4 учитывалась соленость воды
районов Азовского и Черного морей, из которых выделялись бактерии. Таким
образом, были предусмотрены различные количественные потребности в ионах
натрия у разных штаммов. Установлено, что оптимальными средами для
выделения биолюминесцентных бактерий являются № 3 и № 4. Состав данных
сред запатентован (Сазыкина и др., 2009-а, б).
Была выделена 21 чистая культура люминесцентных бактерий.
Определены морфологические и биохимические свойства выделенных
биолюминесцентных бактерий. Анализ полученных данных и сопоставление со
свойствами бактерий семейства Vibrionaceaе (Определитель бактерий Берджи,
1997) позволили отнести штаммы: № 1, 2, 3, 6, 9, 14, 17, 18, 19, 20 – к роду
Vibrio sp.; № 4, 5, 7, 10, 11, 13, 14, 15, 16 – к виду Vibrio fischeri; № 8, 12, 21 – к
роду Photobacterium sp.
Была изучена чувствительность выделенных биолюминесцентных
штаммов к действию токсических факторов химического происхождения
(Цыбульский, Сазыкина, 2010).
14
Рисунок 1 – Структура исследований.
15
Для
сравнительной
оценки
чувствительности
использовали
характеристику ЕС50 (effective concentration) – концентрацию вещества,
вызывающую 50 %-ое снижение люминесценции бактериальной суспензии в
течение 30 мин. Данные по чувствительности штаммов люминесцентных
бактерий к модельным приоритетным токсикантам представлены в таблице 1.
Таблица 1 – Чувствительность выделенных штаммов биолюминесцентных
бактерий к действию модельных приоритетных токсикантов, мг/л
Токсикант
Штамм
1
Vibrio sp.
2
Vibrio sp.
3
Vibrio sp.
4
Vibrio fischeri
5
Vibrio fischeri
6
Vibrio sp.
7
Vibrio fischeri
8
Photobacterium sp.
9
Vibrio sp.
10
Vibrio fischeri
11
Vibrio fischeri
12
Photobacterium sp.
13
Vibrio fischeri
14
Vibrio sp.
15
Vibrio fischeri
16
Vibrio fischeri
17. Vibrio sp.
18. Vibrio sp.
19. Vibrio sp.
20. Vibrio sp.
21. Vibrio sp.
Е. coli С600 (pPBA-5)
Ph. phosphoreum (Cohn) Ford*
E. coli, тест-система «Эколюм»
ZnSO4
5,0
7,5
4,5
6,5
7,5
4,5
6,5
1,5
2,0
2,0
7,5
6,5
7,5
7,5
4,5
1,5
0,3
7,5
5,0
7,5
5,0
2,5
35
1,0
СuSO4
2,5
3,5
2,5
5,0
1,5
1,5
3,5
2,5
2,0
1,0
3,0
6,5
2,5
2,5
2,0
1,0
0,4
3,5
5,0
3,5
6,5
6,5
–
5,0
ЕС50, мг/л
ДСН
250
30
250
250
75
200
350
350
350
150
75
50
300
300
200
300
10
150
200
150
200
300
70
500
K2Cr2O7
50
50
100
30
30
50
30
80
60
30
50
125
10
10
50
30
5
100
125
100
125
150
250
100
Фенол
250
250
300
250
200
150
100
350
250
125
300
200
300
300
150
125
225
200
250
250
250
350
170
300
Примечание - Жирным шрифтом выделены штаммы, для которых средние значения ЕС50 для большей части
исследованных токсикантов были минимальны. *Данные приведены в работе Малыгиной и Кацева (2003).
В таблице 1 также приводятся данные по чувствительности к этим же
токсикантам штаммов Photobacterium phosphoreum (Cohn) Ford, который
рекомендован для биотестирования воды на территории Украины (КНД
211.1.4.060-97), генно-инженерного конститутивного lux-штамма Е. coli С600
16
(pPBA-5), и рекомбинантного люминесцентного штамма E. coli, используемого
в тест-системе «Эколюм», которая официально применяется в России для
тестирования токсичности разнообразных объектов, в том числе для контроля
качества питьевой, водохозяйственной и поверхностных вод (МР № 01.021-07).
Наибольшую чувствительность к исследованным токсикантам (по
величине минимальной ЕС50 (мг/л) и спектру токсикантов) показали штаммы
№ 10, 16 и 17 (Цыбульский, Сазыкина, 2010). Штаммы микроорганизмов
№ 10 (Vibrio fischeri ВКПМ В-9579) и № 16 (Vibrio fischeri ВКПМ В-9580)
депонированы в ВКПМ ФГУП «ГосНИИГенетика».
Зарегистрированы патенты на изобретение для использования данных
штаммов в качестве тест-культур для определения токсичности объектов
окружающей среды (Сазыкина, Цыбульский, 2008; 2009).
Штамм Vibrio sp. № 17, выделенный из воды Черного моря в 2009 г.,
обладает большей чувствительностью как в сравнении с ранее выделенными
V. fischeri ВКПМ В-9579 и V. fischeri ВКПМ В-9580, так и в сравнении с
биолюминесцентными бактериями тест-системы «Эколюм».
В сравнении с тест-системой «Эколюм», Vibrio sp. № 17 более
чувствителен к ZnSO4 (в 3,3 раз), СuSO4 (в 12,5 раза), ДСН (в 50 раз). К
бихромату калия штамм Vibrio sp. № 17 более чувствителен в 20 раз, а к фенолу
чувствителен незначительно больше (в 1,3 раза). Тестирование с Vibrio sp. № 17
морских грунтов, отобранных в районах с высокой антропогенной нагрузкой и в
«условно» чистых районах также подтвердило перспективность использования
штамма для определения токсичности водных сред. Получено положительное
решение по заявке на изобретение для использования штамма в качестве тесткультуры с целью определения токсичности объектов окружающей среды
(Сазыкин и др., 2013-в). В бактериальной коллекции лаборатории
промышленных микроорганизмов НИИ биологии штамму было присвоено
наименование VNB-15.
ГЛАВА 4 Vibrio aquamarinus sp. nov., люминесцентная бактерия,
выделенная из воды Черного моря
Для определения таксономического положения люминесцентного штамма
VNB-15 был использован полифазный таксономический подход. В результате
проведенных исследований можно дать следующее описание штамма VNB-15.
Грамотрицательный, оксидазоположительный, каталазоположительный,
подвижный за счет единственного полярного жгутика. Клетки диаметром около
1–1,5 мкм и длиной 2–3 мкм, прямые, слегка изогнутые палочки (рисунок 2).
17
Рисунок 2 – Микрофотография и рельефное изображение поверхности клеток
штамма VNB-15, полученные при помощи атомного силового микроскопа.
Для роста нуждается в присутствии в среде от 0,5 до 5 % (оптимум 1–4 %)
NaCl (w/v); уровне pH 6,0–9,0 (оптимум 7,0-8,0) и температуре 10–35оС
(оптимум 20–25оС). Факультативный анаэроб.
По образованию индола положительный. Сероводород не образует.
Желатин не гидролизует. Крахмал гидролизует. Реакция Фогес-Проскауэра
(образование ацетилметилкарбинола) отрицательная.
Положительный по следующей ферментативной активности: Ala-Phe-Proариламидаза, β-глюкозидаза, L-пролин-ариламидаза, амилаза, нитратредуктаза.
Отрицательный
по
следующей
ферментативной
активности:
L-пирролидон-ариламидаза, D-целлобиоза, β-галактозидаза, β-N-ацетилглюкозаминидаза,
глютамилариламидаза
pNA,
γ-глютамилтрансфераза,
β-ксилозидаза,
β-аланинариламидаза
pNA,
липаза,
палатиназа,
тирозинариламидаза, уреаза, α-глюкозидаза, β-N-ацетил-галактозаминидаза, αгалактозидаза, фосфатаза, глицинариламидаза, орнитиндекарбоксилаза,
лизиндекарбоксилаза, β-глюкуронидаза, Glu-Gly-Arg-ариламидаза, дезаминаза
фенилаланина, аргининдегидролаза, желатиназа.
Катаболизирует такие углеводы, как D-глюкоза, D-мальтоза. Не
утилизирует D-целлобиозу, арабинозу, D-маннозу, рамнозу, D-тагатозу,
D-трегалозу, сахарозу, раффинозу, лактозу. Не утилизирует спирты адонитол,
L-арабит, D-маннит, D-сорбит, инозит, дульцит, а также следующие соли:
малонат, 5-кето-D-глюконат, L-лактат, сукцинат, L-малат, цитрат (натрия).
От близко родственных видов отличается утилизацией глюкозы,
маннитола, инозитола, сорбитола, рамнозы и сахарозы, образованием
18
лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, липазы, кислой фосфатазы,
α-глюкозидазы, β-глюкозидазы, N-ацетил-β-глюкозаминидазы.
Не
устойчив
к
О/129
(2,4-диамино-6,7-диизопропилптеридин)
вибриостатическому агенту. Спектр люминесценции VNB-15 приходится на
«синюю» область. Максимум спектра биолюминесценции составляет 478 нм.
Основной состав жирных кислот штамма представлен С16:1,
значительное количество составляют C16:0, C18:1ω9c, С14:0, C14:0 3-OH и
C12:0. Дыхательные хиноны состоят из Q8 и DMK8. Полярные липиды
представлены
кардиолипином,
фосфатидилэтаноламином,
фосфатидилглицерином, фосфатидилсерином, фосфатидилинозитолом, и
неизвестным полярным липидом с Rf1 0,00-0,25 и Rf2 0,6-0,7.
Результаты филогенетического анализа, основанного на сравнении
последовательностей генов 16S rRNA, показали, что штамм VNB-15
принадлежит роду Vibrio. Этот штамм показывает филогенетическую схожесть
с рядом видов рода Vibrio: примерно 99,2 % с V. owensii (DY05Т), 99,1% с
V. jasicida (TCFB 0772T), 99,1% с V. communis (R 40496T), 98,9% с
V. sagamiensis (LC2 - 047T), 98,5 % с V. rotiferianus LMG 21460T. Объединённое
дерево, построенное на основе генов 16S rRNA и housekeeping генов recA, gyrB,
pyrH показывает, что штамм не кластеризуется ни с одним из известных видов
бактерий.
На основании филогенетического и хемотаксономического анализа,
морфологических, культуральных, физиологических и биохимических
характеристик, штамм VNB-15 следует идентифицировать как новый вид в
роде, для которого предложено название Vibrio aquamarinus sp. nov.
Прилагательное aquamarinus относится к аквамарину, прозрачному синеватозеленому или голубому минералу группы берилла. Относится к цвету
излучаемого света.
Штамм Vibrio aquamarinus sp. nov. депонирован во Всероссийской
Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП «ГосНИИГенетика» и в
Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (Deutsche
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; German Collection of
Microorganisms and Cell Cultures). Штамму присвоены названия Vibrio
aquamarinus VKPM B-11245 и Vibrio aquamarinus DSM 26054,
соответственно.
Штамм VNB-15 был выделен из воды, отобранной в Черном море в
районе п. Абрау-Дюрсо (44о40'36"N, 37о33'49"E).
Значимость работы определяется необходимостью поиска обладающих
19
высокой чувствительностью к токсическим веществам новых люминесцентных
бактерий и перспективностью их использования в экологическом мониторинге,
а
также
актуальностью
проблемы
природного
разнообразия
биолюминесцентных бактерий по видовым и экологическим критериям и
необходимостью сохранения биологических генотипов в коллекциях.
ГЛАВА 5 Принципы формирования батареи бактериальных
lux-биосенсоров, определение чувствительности биосенсорных штаммов к
стандартным контрольным веществам, подбор оптимальной плотности
суспензии биолюминесцентных штаммов
Для проведения мониторинга токсичности воды и оценки ее безопасности
важно правильно сформировать оптимальную батарею биолюминесцентных
тестов. В ее состав должны войти биосенсоры, способные дать максимальную
информацию о возможной природе токсикантов, присутствующих в
исследуемых образцах (Сазыкина и др., 2010-б).
Состав нашей батареи бактериальных lux-биосенсоров для проведения
работ по оценке эколого-токсикологических параметров компонентов водных
экосистем представлен в таблице 2.
Для экспресс-контроля интегральной токсичности природных сред во
многих странах используются официально узаконенные биолюминесцентные
тесты. Поэтому первоначально в состав нашей батареи были включены 3
штамма для определения интегральной токсичности – природный и 2 генноинженерных. Природные штаммы обладают большей чувствительностью к
токсикантам.
Генно-инженерные
штаммы
характеризуются
большей
стабильностью. Поскольку все биолюминесцентные сенсорные штаммы, как
правило, генно-инженерные, желательно, чтобы в их основе были непатогенные
бактерии, которые можно использовать за пределами лаборатории. В связи с
этим были использованы непатогенные штаммы.
Другой аспект, который необходимо принимать во внимание, –
чувствительность штаммов в сравнении с фактическим уровнем загрязнения в
водных экосистемах, а также в сопоставлении со стандартами по питьевой воде.
Также необходима информация о надежности и стабильности используемых
бактерий, когда они используются в течение длительных периодов. Все
штаммы, которые вошли в нашу биолюминесцентную батарею, как показал
опыт предыдущих исследований с их использованием, обладают достаточной
чувствительностью и стабильностью.
20
Таблица 2 - Бактериальные lux-биосенсоры, область их применения,
оптимальная плотность суспензии
№
Биосенсорный
lux-штамм
1. V. aquamarinus ВКПМ В-11245
2. Е. coli С600 (pPBA-5)
3. E.coli MG1655 (pXen7)
Область
применения штамма
контроль общей
(интегральной)
токсичности
4. Е. coli С600 (pPLS-1)
5. E. coli MG1655 (pRecA-lux)
6.
8. E. coli MG1655 (pSoxS-lux)
9. E. coli MG1655 (pMer-lux)
10. E. coli MG1655 (pArsR-lux)
11. E. coli MG1655 (pGrpE-lux)
12. E. coli MG1655 (pIbpA-lux)
13. E. coli MG1655 (pFabA-lux)
0,1
0,1
0,1
1,0
детекция
ДНК-тропных агентов
E. coliMG1655 (pColD-lux)
7. E. coli MG1655 (pKatG-lux)
Оптимальная
плотность культуры,
ед. МакФарланда
0,01
0,1
детекция ответа на
окислительный стресс,
вызываемый появлением
в среде пероксидов и
окисленного глутатиона
детекция ответа на
окислительный стресс,
вызываемый появлением
в среде супероксид-аниона
и оксида азота
детекция ртути
детекция мышьяка
детекция веществ,
вызывающих
повреждение белков
детекция веществ,
вызывающих
повреждение мембран
0,1
0,1
0,1
0,1
0,01
0,01
0,1
Особое значение при проведении экологического контроля воды имеют
эффект-специфичные штаммы. Из всех эффектов, которые могут быть
обнаружены штаммами биолюминесцентных бактерий, повреждение ДНК
наиболее актуально для человечества. Учитывая тот факт, что штаммы,
предназначенные для детекции ДНК-тропных веществ, отличаются по
чувствительности к типу повреждения ДНК, в состав нашей батареи были
включены 3 биосенсора. У двух штаммов имеется ColD-промотор, а у одного –
RecA-промотор. Комплексное использование этих биосенсоров позволило
регистрировать генотоксичные соединения, вызывающие разные виды
21
повреждения ДНК.
Присутствие штаммов для детекции прооксидантных веществ также
имеет весьма существенное значение. С этой целью в нашу батарею luxбиосенсоров были введены штамм, реагирующий на присутствие в среде
пероксидов и окисленного глутатиона, и штамм для детекции супероксиданиона и оксида азота.
Штаммы для детекции повреждений белков и мембран также относятся к
биосенсорам для выявления общего повреждения или стресса. Lux-биосенсоры
для выявления повреждений белков обладают разной чувствительностью,
поэтому были использованы два таких штамма.
Так как все штаммы для выявления веществ, вызывающих повреждения
мембран, имеют промотор гена fabA в качестве регулирующего элемента, то и
различия в чувствительности, селективности и времени реакции у этих
штаммов являются незначительными (Bechor et al., 2002). В связи с этим для
детекции веществ, повреждающих мембраны клеток, был использован только
один биосенсор.
Принимая во внимание распространенность тяжелых металлов в водных
объектах Азово-Донского бассейна (Экологический вестник Дона, 2001-2012), в
состав биолюминесцентной батареи были включены биосенсоры, которые
специфично отвечают на присутствие ртути, а также мышьяка.
У
всех
штаммов
была
проверена
способность
изменения
биолюминесценции в присутствии стандартных веществ – индукторов или
ингибиторов свечения. Также экспериментальным путем была подобрана
оптимальная плотность суспензии биолюминесцентных штаммов, при которой
достигался максимальный индекс токсичности/фактор индукции (таблица 2).
Глава 6 Экотоксикологическая оценка качества воды родников
г. Ростова-на-Дону при помощи биолюминесцентных сенсоров
Оценка качества воды родников г. Ростова-на-Дону при помощи
бактериальных lux-биосенсоров проводилась в течение 2009–2012 гг. (Сазыкина
и др., 2010-а, в; 2011-а, б; 2013-а). В таблицах 3 и 4 подведены суммарные
результаты тестирования воды родников г. Ростова-на-Дону в период с 2009 по
2012 гг. Всего в течение 2009–2012 гг. было исследовано 87 проб воды из 23-х
родников, с 13 биосенсорами было поставлено 1039 тестов. Число проб,
которые дали статистически значимый ответ, составило 562 (54,1 %).
Более чувствительным биосенсором на интегральную токсичность
оказался метод на основе V. aquamarinus ВКПМ В-11245 (таблица 3).
22
Таблица 3 – Количество проб (%), в которых обнаружен токсический эффект при помощи различных lux-биосенсоров в воде родников
г. Ростова-на-Дону
Биосенсор E. coli
V.
Е. coli
Е. coli
Е. coli
Е. coli
Е. coli
Е.coli
Е.coli
Е. coli
Е. coli
Е. coli
C600
aquaC600
MG1655
MG1655 MG1655 MG1655 MG1655 MG1655 MG1655 MG1655 MG1655
(pPBA- mari- (pPLS-1)
(pRecA(ColD(pKatG- (pSoxS- (pmerR- (pArsR(GrpE(pIbpA- (pFabA5)
nus
lux)
lux)
lux)
lux)
lux)
lux)
lux)
lux)
lux)
ВКПМ
Год
-S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9
Виссле11245
дования
06–07.2009
–
43,6
06.2010
–
75
100
10.2011
33,3
100
13,3 13,3 73,3
57,1
78,6
03.2012
0
2009-2012
32,5
11.2011
100
–
–
–
33,3
33,3
71,8
–
–
–
0
75
0
100
75
100
50
–
–
–
100
13,3
0
93,3
33,3
46,7
6,7
73,3
100
100
100
50
21,4
85,7
71,4
78,6
35,7
100
100
100
100
36,4 27,3 81,8 27,3
100
54,5
9,1
64
72,7
45,5
100
100
100
69
32,2 48,3
81,6 54,2 18,8
72,9
36,8
54
49,4
90
100
100
17,9 71,8 10,3
50
0
64,3
25
100
46
Прочерк – исследования генотоксичности не проводились.
23
Количество выявленных при его помощи статистически значимых
токсических эффектов в течение всего периода исследований превысило
таковое, выявленное при помощи биосенсора Е. coli С600 (pPBA-5).
При исследовании генотоксичности наибольшее число положительных
ответов зафиксировал биосенсор E. coli MG1655 (pRecA-lux) (81,6 %) в
условиях метаболической активации (100 % – в 2009 г., в октябре и ноябре
2011 г.). Наименьшее число генотоксичных проб зарегистрировал биосенсор
E. coli MG1655 (pColD-lux) (18,8 %) в условиях метаболической активации.
Прооксидантный эффект чаще наблюдался при использовании E. coli
MG1655 (pKatG-lux) (72,9 %). Для E. coli MG 1655 (pSoxS-lux) доля
«активных» проб составила 36,8%.
Эффект-специфические штаммы (выявление веществ, повреждающих
белки и мембраны), работали примерно одинаково. Наибольшее количество
ответов на присутствие веществ, повреждающие белки, дал биосенсор
Е. coli MG1655 (pIbpA-lux) (100 %). Сенсорный штамм Е. coli MG1655
(GrpE-lux) выявил 90 % положительных результатов. Стопроцентный ответ
зарегистрирован с lux-сенсором Е. coli MG1655 (pFabA-lux), реагирующим на
повреждение мембран.
За исключением 2009 г. среди специфических сенсоров на металлы
большую долю положительных проб зарегистрировал ртутный биосенсор
E. coli MG1655 (pMer-lux) – 54 %. С биосенсором на мышьяк E. coli MG1655
(pArsR-lux) обнаружено 49,4 % токсических эффектов.
В таблице 4 приведено количество проб (%), в которых обнаружены
различные токсические эффекты в разные годы исследования в родниках
г. Ростова-на-Дону. Наименьшее количество токсичных проб было выявлено в
2009 году в воде Богатяновского источника; источника на территории яхт-клуба
«Аврал», на Нижнем Железнодорожном проезде, д. 107; и в роднике в районе
ул. Можайской, у водоемов. Первые два источника исследовались только в
2009 г., а в последнем роднике наблюдалась тенденция роста токсических
эффектов с 2009 по 2011 год.
Самый большой процент проб с токсическими эффектами (93,3 %),
обнаружен в ноябре 2011 г. в воде родника «Гремучий» № 1. Для этого
источника характерно самое высокое количество обнаруженных токсичных
проб в течение практически всего периода исследований. Так, в 2009 г. оно
составило 61,1 %. В 2010 г. – 63,6 %. Такой же процент положительных проб –
63,6 % в 2010 г. обнаружен в воде родника, расположенного в районе
Ростовского зоопарка, на правом берегу р. Темерник.
24
Таблица 4 – Количество проб (%) воды, в которых обнаружен токсический эффект при помощи lux-биосенсоров в разные годы
исследования в различных родниках г. Ростова-на-Дону
Дата исследования
№
Наименование родника
06–07.2009
06.2010
10.2011
11.2011
03.2012
1. «Гремучий» № 1, ул. Амбулаторная, 55
61,1
63,6
66,7
93,3
66,7
2. В р-не Ростовского зоопарка, на правом берегу р.Темерник
52,2
63,6
33,3
53,3
–
3. Ул. Береговая, на территории Парамоновских складов
41,7
54,6
46,7
40,0
46,7
4. «Серебряный», район ж/д станции Первомайская, ГПЗ-10
52,2
–
46,7
46,7
53,3
5. Пересечение ул. Борко–Капустина
27,8
45,5
33,3
53,3
–
6. «Сурб-Хач», у мемориального комплекса «Сурб-Хач»
41,1
54,6
46,7
–
66,7
7. Источник им. Преподобного Серафима Саровского
51,1
45,5
60,0
60,0
46,7
8. Богатяновский, пр. Кировский-ул. Береговая
22,2
–
–
–
–
9. На территории яхт-клуба «Аврал», Нижний Ж/Д проезд, д. 107
22,2
–
–
–
–
10. Нижний Железнодорожный проезд, д. 37
33,3
54,6
40,0
53,3
–
11. Ул. Каяльская, 71
33,3
–
60,0
66,7
–
12. «Пост ВОХР», ул. Кобякова, 32
33,3
–
46,7
66,7
–
13. Ул. Кржижановского, 396
33,3
–
66,7
80,0
–
14. На правом берегу р. Темерник, родник Святого Павла
33,3
–
–
–
–
15. Район ж/д станции «Аксай»
55,6
–
86,7
86,7
–
16. Район ул. Можайской, у водоемов
22,2
–
46,7
80,0
17. У плотины низового водохранилища на правом берегу
33,3
–
–
–
73,3
р. Темерник в Северном жилом массиве
18. На правом берегу р. Темерник, на ул. Куликовской, около д. 37
55,6
–
60,0
93,3
–
19. «Богородичный», на правом берегу р. Темерник
55,6
54,6
60,0
80,0
60,0
20. Криница родника Воскресения Христова, ул. Всесоюзная,169
–
–
–
–
66,7
21. Гремучий № 2, ул. Подгорная, 61
–
–
–
–
73,3
22. Ул. Кржижановского, 334
–
–
–
–
46,7
23. Безымянная балка
–
–
–
–
73,3
Прочерк – исследования токсичности не проводились.
25
В октябре 2011 г. по числу положительных анализов (86,7 %) лидировал
источник, находящийся в районе ж/д станции «Аксай». В его воде, как и в воде
родника «Гремучий» № 1, в течение периода исследований наблюдалось
наибольшее количество токсических эффектов. В 2012 г. самый высокий
процент токсических эффектов был зарегистрирован в воде источника
«Гремучий» № 2, на ул. Подгорной, 61, и в воде источника в Безымянной балке.
Если рассматривать динамику токсичности по годам, в этом отношении
лидирует 2011 г. В большинстве исследованных родников именно в этот год
регистрировалось самое большое количество эффектов токсичности.
Таким образом, для воды исследованных родников г. Ростова-на-Дону
характерно системное загрязнение токсичными веществами, регистрируемыми
при помощи использованных биолюминесцентных сенсоров.
По результатам проведенного в 2011 г. комплексного тестирования на
основе использования бактериальных lux-сенсоров и химического анализа, был
проведен корреляционный анализ полученных нами данных генетикотоксикологического анализа с содержанием различных ксенобиотиков в воде
родников г. Ростова-на-Дону.
Коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r) между суммой ПАУ в
пробах октября 2011 г. и генотоксичностью в условиях метаболической
активации, определенной с помощью биосенсоров Е. coli MG1655 (pRecA-lux) и
Е. coli MG1655 (pColD-lux), составил 0,64 и 0,69, соответственно. Без
метаболической активации была обнаружена высокая (r=0,9) корреляция между
содержанием бенз(b)флуорантена и уровнем индукции Е. coli MG1655 (pRecAlux). Выявлены высокие уровни корреляции вышеназванных тестов с
использованием штаммов Е. coli MG1655 (pRecA-lux) и Е. coli MG1655 (pColDlux) и уровнем фенантрена (0,62 и 0,63, соответственно). Высокая (r=0,9)
корреляция обнаружена между содержанием бенз(b)флуорантена и уровнем
индукции Е. coli MG1655 (pRecA-lux) без метаболической активации (таблица
5).
Обнаружена высокая положительная корреляция между содержанием
бенз(b)флуорантена и эффектами биосенсоров на прооксиданты Е. coli MG1655
(pKatG-lux) (r =0,9) и Е. coli MG1655 (pSoxS-lux) (r =1,0) (таблица 5).
Коэффициент ранговой корреляции Спирмена (r) между содержанием
ртути и уровнем индукции сенсора Е.coli MG1655 (pmerR-lux) составил 0,72,
что лишний раз свидетельствует о правомерности использования lux-штаммов в
экологическом мониторинге (таблица 5). Обнаружена корреляция (r=0,52)
между индукцией ртутного сенсора Е. coli MG1655 (pmerR-lux) и
генотоксичностью, выявленной без использования метаболической активации с
26
помощью биосенсора Е. coli MG1655 (pRecA-lux) (таблица 6).
Таблица 5 - Коэффициенты ранговой корреляции между содержанием
химического загрязнения и показателями токсичности в воде родников
г. Ростова-на-Дону (2011 г.) (только значимые результаты, p<0,05)
Генотоксичность
Биосенсор
Токсикант
Ртуть
Фенантрен
Бенз(b)флуорантен
Сумма ПАУ
Е. coli
MG1655
(pRecAlux) -S9
Е. coli
MG1655
(pRecAlux) +S9
Е. coli
MG1655
(pColDlux) +S9
0,62
0,63
0,64
0,69
0,9
Прооксидантный
эффект
Е. coli
Е. coli
MG1655 MG1655
(pKatG- (pSoxSlux)
lux)
0,9
Присутствие ртути
Е.coli
MG1655
(pmerR
-lux)
0,72
1,0
Таблица 6 – Коэффициенты ранговой корреляции между результатами тестов,
применявшимися при исследовании воды родников
г. Ростова-на-Дону
(2011 г.) (только значимые результаты, p<0,05)
Е. coli
MG1655
(pRecA-lux)
-S9
Е. coli MG1655
(pIbpA-lux)
Е. coli MG1655
(pKatG-lux)
Е.coli MG1655
(pmerR-lux)
Е. coli
MG1655
(pRecA-lux)
+S9
Е. coli
MG1655
(ColD-lux)
+S9
Е. coli
MG1655
(GrpE-lux)
Е. coli
MG1655
(pIbpA-lux)
0,85
0,64
0,52
0,58
0,52
Достоверная ранговая корреляция (r=0, 52 и r=0,64) была обнаружена
между прооксидантным эффектом, зарегистрированным биосенсорным
штаммом Е. coli MG1655 (pKatG-lux) и эффектом генотоксичности в условиях
метаболической
активации,
определенном
при
помощи
штаммов
Е. coli MG1655 (ColD-lux) и Е. coli MG1655 (pRecA-lux) (таблица 6). Данная
корреляционная связь дает возможность рассматривать участие прооксидантов
в развитии генотоксичности в исследуемых образцах воды.
Также зарегистрирована достоверная положительная ранговая корреляция
(r=0,58) между прооксидантным эффектом биосенсорного штамма Е. coli
MG1655 (pKatG-lux) и эффектом повреждения белков, выявленным с
биосенсором Е. coli MG1655 (pIbpA-lux) (таблица 6). Возможно, она
обусловлена взаимосвязанными процессами окисления и возникающим в
результате его воздействия процессом повреждения структуры белков.
27
Высокий коэффицент ранговой
корреляции (r=0,85) между факторами
индукции двух биосенсоров, реагирующих на повреждение белков Е. coli MG1655 (pIbpA-lux) и Е. coli MG1655 (GrpE-lux), свидетельствует о том,
что оба сенсора можно успешно использовать для детекции веществ,
вызывающих повреждение белков (таблица 6).
Таким образом, сочетание методов химического анализа и
биолюминесцентного тестирования способствует повышению эффективности
экологического контроля. Данные биолюминесцентных тестов являются
достаточно информативными для выявления нетоксичных проб. В нетоксичных
образцах не имеет смысла проводить химический анализ, что позволит
значительно сократить объем работ. Также lux-биосенсоры позволяют
регистрировать тенденции в развитии токсичности окружающей среды,
идентифицировать районы с различной токсикологической нагрузкой.
Выявление районов загрязнения позволит сфокусировать на них усилия с целью
идентификации токсических веществ и устранения причин загрязнения.
Глава 7 Оценка экотоксикологических параметров донных отложений
Нижнего Дона при помощи биолюминесцентных сенсоров
(2003–2007, 2011 гг.)
Данные по генотоксичности донных отложений (ДО) Нижнего Дона,
отобранных в 2003–2007 и 2011 гг., представлены в таблице 7. Генотоксичность
ДО Нижнего Дона исследовалась нами и ранее, в течение 2001–2002 гг.
Результаты этого тестирования представлены в таблице 7 с целью сравнения
величин генотоксичности ДО, отобранных в разные периоды времени.
По результатам исследований можно выделить следующие районы, ДО
которых хронически загрязнены генотоксикантами: 0 км, створ; 500 м ниже
г. Азова; 500 м выше устья р. Аксай; 500 м ниже устья р. Маныч; устье
р. Маныч; 500 м выше устья р. Маныч (таблица 7). В этих районах число
генотоксичных проб в 2001–2011 гг. составило в сумме 51, 4 % без применения
метаболической активации и 55,3 % при ее использовании (Сазыкина и др.,
2009-в; 2010-в; 2011-б; 2012-а). Также по количеству загрязненных
промутагенами проб выделяется район 500 м выше устья р. Сал, но высокие
показатели генотоксичности регистрировались в нем преимущественно в 2011 г.
В таблице 8 представлены данные по количеству генотоксичных
экстрактов ДО р. Дон в каждом районе за весь период проведенного
исследования. Всего за весь период исследования было протестировано 128
проб ДО, из них в 36,7 % выявлена генотоксичность с использованием
метаболической активации, а в 28,9 % – без ее использования.
28
Таблица 7 – Генотоксичность экстрактов донных отложений р. Дон, отобранных в 2001–2007 и 2011 гг.
Время
отбора
04.2001#
10.2001#
04.2002#
05.2003
07.2003
06.2004
06.2005
06.2006
06.2007
06.2011
Метаболическая
активация
Места отбора проб
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
+
–
+
–
+
–
+
–
+
–
+
–
+
–
+
–
+
–
+
–
1,7*
1,9*
0,9
2,3*
0,6
1,6*
–
–
–
–
1,6*
1,7*
1,0
1,1
0,3
0,9
0,9
0,8
2,7*
2,1*
1,3
0,8
1,1
1,7*
0,8
1,5*
–
–
–
–
–
–
2,9*
2,2*
0,7
2,1*
0,9
1,1
2,5*
1,9*
1,0
0,6
0,9
2,1*
1,2
1,1
–
–
–
–
–
–
–
–
0,8
1,3
1,3
1,2
2,1*
1,2
0,6
0,4
0,6
1,4
1,1
0,8
–
–
–
–
–
–
–
–
0,8
1,2
1,1
1,3
1,5*
1,6*
1,5
0,4
0,7
0,9
1,4
1,0
1,6*
1,2
2,0*
1,4
3,2*
0,9
1,3
0,5
0,6
1,0
0,9
1,6*
2,9*
3,3*
1,2
0,4
0,4
0,8
1,5
1,0
2,1*
1,3
1,4
1,6*
1,9*
0,7
0,7
0,7
0,8
1,8*
1,4
1,1
3,0*
2,8*
–
–
0,4
1,2
1,4
1,1
1,5*
1,4
1,5*
1,0
–
–
2,3*
0,6
0,8
1,7*
1,5*
1,2
1,6*
1,1
1,0
0,4
0,7
2,6*
1,6*
1,1
1,7*
0,8
1,6*
0,8
3,4*
1,0
1,8*
1,2
1,1
1,6*
1,1
1,5*
2,0*
1,1
1,6*
0,3
0,8
1,6*
1,6*
0,7
2,0*
1,4
1,5*
1,0
1,2
1,0
1,0
0,8
1,1
1,8*
1,5*
0,9
2,1*
2,2*
–
–
0,7
1,3
2,5*
0,8
1,7*
1,4
1,7*
0,9
–
–
1,7*
1,3
0,7
1,6*
1,1
0,7
1,4
1,9*
–
–
0,5
0,9
1,5
0,7
1,4
1,2
1,3
1,4
1,9*
1,6*
1,3
1,2
0,6
3,4*
0,9
1,1
1,8*
1,9*
0,4
0,3
0,4
0,8
1,4
1,3
2,0*
1,0
1,4
1,2
–
–
–
–
1,1
2,5*
0,9
0,7
2,9*
3,1*
–
–
0,6
0,8
1,0
1,5
2,0*
1,0
1,6*
1,1
–
–
–
–
1,3
1,8*
0,9
1,0
2,6*
2,0*
0,6
0,3
0,9
1,2
–
–
1,6*
1,2
1,4
1,0
–
–
1,3
1,5*
–
–
1,1
1,3
–
–
1,0
0,3
0,7
1,3
1,0
0,7
1,9*
1,7*
1,6*
1,0
1,9*
0,5
1,0
1,2
–
–
1,1
1,4
–
–
–
–
0,8
1,3
1,0
0,5
1,4
1,7*
1,1
1,8*
2,1*
1,4
1,3
1,0
–
–
1,0
1,2
–
–
* отличия от контроля статистически значимы, t-критерий; р<0,05; прочерк – исследования генотоксичности не проводились; «+» – с применением метаболической
активации, «–» – без ее применения. # - данные взяты из работ по определению генотоксичности ДО Нижнего Дона, проведенных в 2001-2002 гг. (Сазыкина, 2003), до
начала настоящего исследования.
29
Таблица 8 – Количество генотоксичных проб (%) в экстрактах донных отложений р. Дон
(2001-2007 и 2011 гг.) в каждом исследованном районе
Количество генотоксичных проб, %
с использованием без использования
№
Место отбора
метаболической
метаболической
активации
активации
1 0 км, створ
37,5
62,5
2 500 м ниже Азова
28,6
71,4
3 500 м ниже канализации г. Ростова-на-Дону
16,7
16,7
4 500 м ниже устья р. Темерник
16,7
16,7
5 500 м ниже устья р. Аксай
40,0
20,0
6 Устье р. Аксай
30,0
30,0
7 500 м выше устья р. Аксай
62,5
12,5
8 500 м ниже устья р. Маныч
60,0
30,0
9 Устье р. Маныч
60,0
30,0
10 500 м выше устья р. Маныч
50,0
25,0
11 500 м ниже устья р. Сал
22,2
33,3
12 Устье р. Сал
25,0
25,0
13 500 м выше устья р. Сал
42,9
28,6
14 500 м ниже устья р. Северский Донец
16,7
16,7
15 Устье р. Северский Донец
37,5
12,5
16 500 м выше устья р. Северский Донец
14,3
28,6
В таблице 9 представлены данные по динамике генотоксичности в ДО
р. Дон в течение всего периода исследования.
Таблица 9 – Количество генотоксичных проб (%) в экстрактах донных отложений р. Дон
(2001-2007 и 2011 гг.), в разные даты их отбора
Количество генотоксичных проб, %
№
Дата
с использованием
без использования
пп
отбора
метаболической активации
метаболической активации
1
04.2001
18,2
5,6
2
10.2001
0
31,3
3
04.2002
20,0
13,3
4
05.2003
83,3
16,7
5
07.2003
58,3
16,7
6
06.2004
87,5
25,0
7
06.2005
33,3
16,7
8
06.2006
0
69,2
9
06.2007
12,5
12,5
10
06.2011
92,3
76,9
30
Максимальное количество мутагенных веществ прямого действия
обнаружено в экстрактах ДО, отобранных в октябре 2001 г. (31,3 %), июне
2006 г. (69,2 %) и в июне 2011 г. (76,9 %). Наибольшее количество
генотоксичных веществ – промутагенов выявлено в экстрактах ДО, отобранных
в мае–июле 2003 г. (83,3 % и 58,3 %, соответственно), в июне 2004 г. (87,5 %) и
в июне 2011 г. (92,3 %). Основной период, во время которого было обнаружено
максимальное количество генотоксикантов – 2011 г. (таблица 9).
Для выявления более детальной тенденции изменения генотоксичности
среды необходимы длительные наблюдения за ее динамикой в бассейне
Нижнего Дона.
Оценка экотоксикологических параметров донных отложений
Нижнего Дона, 2011 г.
Анализ экстрактов проб ДО с использованием штамма V. aquamarinus
ВКПМ В-11245 показал, что все пробы ДО токсичны (Сазыкина и др., 2010-в).
Шесть проб (37,5 %) были токсичны, остальные 10 экстрактов ДО (62,5 %) –
сильно токсичны. Наиболее токсичными оказались ДО, отобранные в районе
0 км, створ (индекс токсичности составил 96,16). Сильную токсичность ДО в
этом районе можно объяснить тем фактом, что здесь собираются и
концентрируются токсиканты со всей реки Дон.
Генотоксичность ДО была зарегистрирована во всех 16 исследованных
районах. Слабый генотоксический эффект был зарегистрирован без применения
метаболической активации в четырех (25 %) экстрактах ДО, и в трех экстрактах
(18,8 %) с применением метаболической активации. Средний генотоксический
эффект без применения метаболической активации был обнаружен в 8 из 16
экстрактов (50 %) и в 12 (75 %) – с применением метаболической активации
(Сазыкина и др., 2010-в).
Если сравнить данные по генотоксичности и общей токсичности, можно
заключить, что экстракт ДО, отобранных 500 м ниже устья р. Аксай, вызвавший
наиболее сильную реакцию Е. coli С600 (pPLS-1) (фактор индукции 3,27), при
тестировании с биосенсором V. aquamarinus ВКПМ В-11245 также показал
сильную токсичность (индекс токсичности 81,19).
Биосенсор Е. coli MG1655 (pSoxS-lux), предназначенный для выявления
супероксид-аниона, ответил усилением биолюминесценции в присутствии 3 из
16 экстрактов ДО (18,75 %). Штамм Е. coli MG1655 (pKatG-lux), реагирующий
на гидропероксиды, ответил на воздействие 14 из 16 экстрактов (87,5 %) ДО.
Присутствие ртути было зарегистрировано при помощи штамма Е. coli
31
MG1655 (pMerR-lux) во всех экстрактах ДО (100 %). Наличие мышьяка
обнаружено при использовании Е. coli MG1655 (pArsR-lux) в 15 из 16
экстрактов (93,75 %). Обнаруженные концентрации мышьяка и ртути находятся
в пределах нормы, если руководствоваться ГН 2.1.7.2041-06. Для ртути ПДК
составляет 2,1 мг/кг. Для мышьяка – 2,0 мг/кг. В России ПДК тяжелых металлов
для ДО не установлены.
При тестировании со штаммом E. coli MG1655 (pGrpE-lux) эффект был
зарегистрирован в 12 экстрактах (75 %), с Е. coli MG1655 (pIbpA-lux) - во всех
экстрактах ДО (100 %).
Тестирование ДО с биосенсором E. coli MG1655 (pFabA-lux), выявило
вещества, вызывающие повреждение мембран, в 12 экстрактах из 16 (75 %).
Максимальные эффекты при тестировании со штаммами Е. coli MG1655
(pIbpA-lux), Е. coli MG1655 (GrpE-lux) и Е. coli MG1655 (pFabA-lux)
зарегистрированы преимущественно в ДО, отобранных в районе устья рукава
Мокрая Каланча, устья рукава Большая Кутерьма и в районе ст. Багаевской. В
ДО этих участков Нижнего Дона зарегистрированы эффекты со всеми
использованными биосенсорами. При этом величина фактора индукции во всех
случаях, кроме генотоксичности, превышала полученные значения такового в
ДО на остальных участках р. Дон (Сазыкина и др., 2010-в).
Таким образом, в 2011 г. в ДО исследованных участков Нижнего Дона в
большинстве случаев зафиксированы эффекты со всеми lux-биосенсорами.
В октябре 2011 г. также было проведено определение содержания
приоритетных токсикантов в донных отложениях р. Дон - ПАУ, ПХБ, тяжелых
металлов, нефтепродуктов.
Максимальная концентрация ПАУ – 529 мкг/кг сухой массы обнаружена в
ДО рукава Большая Кутерьма. При этом почти 50 % приходилось на флуорантен
и бенз(b)флуорантен. ПАУ с высокой и средней канцерогенной активностью
присутствовали во всех исследуемых пробах. Их массовая доля изменялась от
7,0 % (выше устья р. Маныч) до 32,4 % (устье р. Большая Кутерьма) от суммы
идентифицированных соединений.
Полихлорированные бифенилы в концентрациях от 1,4 до 8,5 мкг/кг сухой
массы обнаружены в 38 % проанализированных проб.
Исследование содержания тяжелых металлов показало, что
максимальные концентрации ванадия, никеля и цинка обнаружены в устье
р. Аксай: хрома – в устье р. Сал; меди, свинца и мышьяка – в 0,5 км ниже устья
р. Темерник; ртути – в рукаве Большая Кутерьма, кадмия – в рукаве Мокрая
Каланча.
32
Максимальное количество бария зафиксировано в устье р. Аксай
(335 мг/л) и 500 м ниже устья р. Аксай (345 мг/л). Следует отметить, что все
растворимые соли бария ядовиты.
ПДК нефти для ДО не существует. ПДК для воды водных объектов
рыбохозяйственного значения (Нормативы, 2010) составляет 0,05 мг/дм3.
Результаты проведенных исследований показали, что в ДО р. Дон в 2011 г.
количество нефтепродуктов, равное 20 мг/кг, было минимальным (500 м выше
и 500 м ниже устья р. Маныч). Максимальное количество – 3,11 г/кг, было
зарегистрировано в устье р. Аксай, и 2,5 г/кг – в районе 500 м ниже
г. Азов.
Был проведен корреляционный анализ полученных нами данных
генетико-токсикологического анализа с содержанием различных ксенобиотиков
в ДО Нижнего Дона (таблица 10).
Показана корреляционная зависимость (от 0,51 до 0,71) генотоксичности
(биосенсор Е. coli C600 (pPLS-1)), обнаруженной с использованием
метаболической активации, с содержанием отдельных ПАУ: (фенантрен (0,66),
флуорантен (0,58), пирен (0,55), хризен (0,51), бенз(k)флуорантен (0,71),
бенз(a)пирен) (0,62). Без применения метаболической активации корреляция
генотоксичности (биосенсор Е. coli C600 (pPLS-1)) была зарегистрирована с
содержанием фенантрена (0,58) и бенз(k)флуорантена (0,51).
Корреляционная зависимость обнаружена между генотоксичностью,
зарегистрированной с помощью биосенсора Е. сoli
C600 (pPLS-1) с
применением метаболической активации, и содержанием никеля (0,52). В то же
время, между данными, полученными при помощи сенсора Е. coli MG1655
(pKatG-lux) и содержанием цинка и никеля выявлена обратная корреляция
(– 0,55 и – 0,54, соответственно). Можно предположить, что участие металлов в
разложении пероксида водорода является одним из механизмов проявления их
токсичности (Cameron et al., 2011).
Также выявлена корреляционная зависимость между генотоксичностью и
содержанием ванадия (0,56 и 0,60 - без применения метаболической активации
и с ее использованием, соответственно) с биосенсором Е. сoli C600 (pPLS-1)
(таблица 10).
Определена корреляция между содержанием ртути и генотоксичностью с
биосенсором Е. coli MG1655 (ColD-lux) (0,65) при использовании
метаболической активации.
Обнаружена корреляция (0,6) между содержанием ртути и
прооксидантным эффектом (сенсор Е. coli MG1655 (pKatG-lux)). Этот факт
33
может свидетельствовать о том, что соединения ртути могут усиливать
свободнорадикальные
процессы
и
тем
самым
способствовать
возникновению генотоксичности.
Таблица 10 - Коэффициенты ранговой корреляции между содержанием химического
загрязнения и показателями токсичности в образцах донных отложений р. Дон (2011 г.)
(только значимые результаты, p<0,05)
Биосенсор
Токсикант
Ванадий
Е. сoli C600
(pPLS-1)
–S9
Е. coli C600
(pPLS-1)
+S9
0,56
0,60
Е. coli G1655
(ColD-lux)
+S9
Цинк
-0,55
Никель
0,52
Ртуть
Фенантрен
-0,54
0,65
0,58
0,58
Пирен
0,55
Хризен
0,51
0,51
0,60
0,66
Флуорантен
Бенз(k)флуорантен
Е. coli MG1655
(pKatG-lux)
0,71
Бенз(a)пирен
0,62
Нефтепродукты
0,53
Выявлены коэффициенты ранговой корреляции и между результатами
тестов, применявшимися при исследовании ДО Нижнего Дона (таблица 11).
Самые высокие коэффициенты корреляции зарегистрированы между тестами
для детекции ДНК-тропных веществ (от 0,87 до 0,97).
Коэффициенты корреляции обнаружены между тестами для выявления
генотоксичности и определения прооксидантных эффектов (от 0,56 до 0,67).
Также обнаружена корреляционная зависимость между результатами
вышеуказанных тестов и данными, полученными при помощи сенсоров для
детекции ртути и мышьяка, что свидетельствует о генотоксичности
присутствующих в водоемах соединений ртути и мышьяка и участии АФК в
проявлении их генотоксичности.
Коэффициенты корреляции между результатами, полученными с
помощью биосенсоров для выявления генотоксичности и биосенсорами для
детекции веществ, вызывающих повреждение белков и мембран,
свидетельствуют о возможном присутствии в ДО Нижнего Дона веществ,
способствующих одновременному возникновению вышеназванных эффектов.
34
Таблица 11 – Коэффициенты ранговой корреляции между результатами тестов, применявшимися при исследовании
донных отложений р. Дон (только значимые результаты, p<0,05)
Е. coli
C600
(pPLS-1)
–S9
Е. coli C600 (pPLS-1)
+S9
Е. coli MG1655 (pRecA-lux)
+S9
Е. coli MG1655 (ColD-lux)
–S9
Е. coli MG1655 (pKatG-lux)
Е. coli
MG1655
(pRecAlux)
–S9
Е. coli
MG1655
(pRecAlux)
+S9
Е. coli
Е. coli
MG1655
MG1655
(ColD-lux) (ColD-lux)
–S9
+S9
Е. coli
MG1655
(pKatGlux)
Е. coli
MG1655
(pSoxSlux)
0,72
0,57
Е.coli
MG1655
(pmerRlux)
Е. coli
MG1655
(pIbpAlux)
0,87
0,96
0,97
0,96
0,67
0,61
Е. coli MG1655 (pSoxS-lux)
0,56
Е.coli MG1655 (pmerR-lux)
0,81
0,62
0,57
0,75
0,56
0,75
Е.coli MG1655 (pArsR-lux)
0,62
Е. coli MG1655 (pIbpA-lux)
0,81
0,72
0,77
Е. coli MG1655 (GrpE-lux)
0,76
0,83
0,83
Е. coli MG1655 (pFabA-lux)
0,51
0,59
0,78
0,59
0,67
0,89
0,80
0,66
35
Коэффициент корреляции между результатами, полученными при
помощи биосенсоров для детекции веществ, вызывающих повреждение белков
и мембран, и данными, зафиксированными с помощью биосенсоров для
обнаружения веществ, вызывающих окислительный стресс, свидетельствуют об
участии АФК в развитии данных процессов.
Зарегистрирована корреляционная зависимость и между показателями,
полученными при помощи различных биосенсоров для детекции веществ,
повреждающих белки. Данный факт говорит о релевантности этих биосенсоров.
В целом выявление ранговой корреляционной зависимости как между
содержанием приоритетных токсикантов и данными, полученными при помощи
сенсорных штаммов, так и между результатами самих биолюминесцентных
тестов,
свидетельствуют
о
правомерности
их
использования
в
экотоксикологическом мониторинге экосистем.
Глава 8 Перспективы использования бактериальных
lux-биосенсоров для оценки токсичности различных компонентов
окружающей среды – почвы, воздуха, тканей животных и растений
Результаты тестирования проб воздуха г. Ростова-на-Дону (2001-2010 гг.)
с биосенсорными штаммами E. coli MG1655 (pRecA-lux) и Е. coli MG1655
(pRecA-lux) позволили показать динамику увеличения содержания
генотоксикантов в течение 2005–2009 гг. (Сазыкина и др., 2011-в; 2013-б).
Биолюминесцентное тестирование атмосферных осадков г. Ростова-наДону (2010-2011 гг.) и почв г. Ростова-на-Дону и городов Ростовской области
(2010 г.) помогло выявить районы, наиболее загрязненные генотоксикантами и
веществами окислительной природы (Сазыкина и др., 2010-г; 2011-в; 2012-б).
Исследование экстрактов печени скворцов обыкновенных (Sturnus
vulgaris), отобранных в пос. Волочаевский Орловского района Ростовской
области в апреле 2010 г. показало, что генотоксические эффекты обязаны своим
происхождением исключительно веществам - прямым мутагенам (Сазыкина и
др., 2010-г).
При исследовании токсичности мхов, лишайников, трутовиков,
отобранных в г. Ростове-на-Дону в 2009-2010 гг., были зарегистрированы
высокие люминесцентные ответы бактериальных сенсоров, что хорошо
согласуется с фактом использования их в качестве организмов-индикаторов
загрязнения (Сазыкина и др., 2010-г).
Таким образом, представляется перспективным применение батареи luxбиосенсоров для тестирования проб воздуха, атмосферных осадков, почв,
36
тканей животных и растений с целью оценки токсичности комплекса веществ,
присутствующих в изучаемых образцах (Сазыкина и др., 2010-г; 2011-в; 2012-б;
2013-б).
Заключение
Анализ принципов и перспектив применения батареи на основе
бактериальных lux-сенсоров в сочетании с химическими аналитическими
методами для оценки качества водных экосистем
Принципы использования бактериальных lux-биосенсоров
Для проведения эффективного мониторинга экосистем должна
применяться батарея биолюминесцентных тестов, обладающих способностью
обнаружения токсичности, обусловленной присутствием отдельных классов
соединений. Использование батареи lux-биосенсоров позволяет не только
зарегистрировать наличие токсического вещества в среде, но и предположить
механизм его действия. Необходимо подобрать оптимальную комбинацию
биолюминесцентных тестов, с помощью которой можно получить наиболее
полную информацию по каждому исследованному образцу. Наиболее
подходящие батареи биолюминесцентных тестов должны отбираться, исходя из
полученных предварительных результатов, например, путем их анализа с
помощью статистических методов.
В состав батареи должны входить как природные, так и генноинженерные lux-биосенсоры. Эта стратегия даст возможность более корректно
проводить детекцию токсикантов различной природы. Для повышения
эффективности тестирования необходимо проводить поиск природных
биолюминесцентных
микроорганизмов,
наиболее
чувствительных
к
токсикантам. Чувствительность генно-инженерных lux-биосенсоров следует
повышать посредством генетических манипуляций. Для достижения этой цели
также необходимо осуществлять подбор штаммов-хозяев с повышенной
чувствительностью к токсическим веществам.
Должны использоваться непатогенные штаммы, отличающиеся
стабильностью при длительном использовании.
Сравнивать
производительность
различных
репортерных
биолюминесцентных штаммов необходимо с помощью ответа, вычисляемого
по соотношениям количественной оценки сигнала, которые определяются как
отношение люминесценции в опытных образцах к люминесценции в
контрольных пробах. Необходимо повышение надежности тестирования и
количественного определения сигнала бактерий.
Для каждого биолюминесцентного сенсора необходимо оптимизировать
37
методику исследования путем подбора условий для получения максимальной
ответной реакции.
Детальную картину загрязнения можно получить после совместного
применения биотестирования и химического анализа. Проведение
предварительного биотестирования на основе биолюминесцентных бактерий
позволит отобрать наиболее загрязненные пробы для их исследования методами
химического анализа.
Перспективы использования бактериальных lux-сенсоров
Биолюминесцентные тесты позволят идентифицировать районы с
различной токсикологической нагрузкой. Детекция наиболее загрязненных
районов с помощью люминесцентных биосенсоров даст возможность
сосредоточить усилия с целью идентификации доминирующих в этих участках
токсикантов. На основе полученных результатов появится возможность
целенаправленного поиска, выявления и устранения возможных источников
загрязнения. Использование биолюминесцентных бактерий позволит проводить
анализ токсичности компонентов не только водных, но и других экосистем.
Использование lux-биосенсоров для определения токсичности дает
преимущество, заключающееся в значительном уменьшении объема
тестируемых образцов. При использовании современных микропланшетных
люминометров для измерения свечения объем исследуемых проб может
составлять не более 10 мкл.
Появляется возможность детекции в предметах экспертизы новых
неизученных веществ, для которых еще не существует методик определения.
Отсутствует
необходимость
разделять
многокомпонентные
смеси.
Относительно низкая стоимость тестов разрешает проводить большее
количество анализов.
Решение проблемы официальной валидизации lux-биосенсоров и
превращения их в коммерческие тест-системы будет способствовать их
большей доступности и массовому использованию в экологическом
мониторинге токсичности компонентов экосистем.
Применение люминесцентных тестов позволяет проводить мониторинг
загрязнения быстрым, простым и недорогим способом. Бактериальные luxбиосенсоры обладают высокой степенью чувствительностью для выявления
соединений, которые могут быть токсичными для людей и окружающей среды.
Созданная на основе проведенных исследований концепция
использования природных и генно-инженерных биосенсоров на основе
биолюминесцентных бактерий в мониторинге токсичности водных экосистем в
38
виде основных положений представлена на рисунке 3.
Рисунок 3 - Схема использования бактериальных lux-биосенсоров в
мониторинге токсичности водных экосистем.
39
Выводы
1. Разработана концепция использования природных и генно-инженерных
биосенсоров на основе светящихся бактерий в мониторинге токсичности
водных экосистем, основные положения которой заключаются в том, что
биотесты на основе бактериальных lux-сенсоров позволяют значительно
сократить время исследования и отобрать токсичные пробы для проведения
детального химического анализа. Необходимо формирование и
единовременное использование батареи lux-биосенсоров для эффективной
детекции различных поллютантов, а также выявления механизма их
действия.
2. Применение батареи биосенсоров на основе люминесцентных бактерий как
природного происхождения, так и генно-инженерных штаммов E. coli,
оптимизация методик их использования, позволили выявить высокую
степень их чувствительности и возможность успешного применения для
оценки спектра токсических воздействий загрязняющих веществ (в том числе
эффекта соединений, которые еще не выявлены химическим анализом).
Сформированный комплекс бактериальных lux-биосенсоров позволяет
определить в пробах водных экосистем интегральную токсичность,
генотоксичность, прооксидантную активность и оценить присутствие в них
ртути, мышьяка, а также веществ, повреждающих белки и мембраны.
3. Изучение чувствительности выделенных из воды Черного моря штаммов
биолюминесцентных морских бактерий Vibrio fischeri ВКПМ В-9579, Vibrio
fischeri ВКПМ В-9580 и Vibrio aquamarinus VKPM B-11245 к модельным
приоритетным токсикантам показало перспективность их использования в
качестве тест-культур для определения токсичности объектов окружающей
среды.
4. Штамм VNB-15 идентифицирован как новый вид в роде Vibrio на основании
морфологических, культуральных, физиологических, биохимических
характеристик, филогенетического и хемотаксономического анализа.
Штамму присвоено название Vibrio aquamarinus sp. nov. Штамм депонирован
во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (Vibrio
aquamarinus VKPM B-11245) и в Немецкой Коллекции Микроорганизмов и
Клеточных Культур (Vibrio aquamarinus DSM 26054).
5. Свободных от генотоксикантов родников, среди исследованных в г. Ростовена-Дону, не выявлено. В ряду выявленных генотоксикантов преобладают
вещества промутагенной природы (81,6 % проб родниковой воды).
Основным источником прооксидантных веществ являются гидропероксиды
40
(72,9 % проб воды). Ртуть и мышьяк выявлены в 54 % и 49,4 % проб воды,
соответственно. Присутствие веществ, повреждающих белки и мембраны,
зарегистрировано в 100 % проб воды родников.
Для генотоксичных проб воды из родников г. Ростова-на-Дону характерно
присутствие полиароматических углеводородов.
6. Исследование токсичности донных отложений Нижнего Дона позволило
выявить районы, наиболее подверженные антропогенному прессингу. В
36,7 % исследованных районов Нижнего Дона обнаружены генотоксиканты
промутагенной природы, в 28,9 % - прямые мутагены. В пробах донных
отложений Нижнего Дона выявлен высокий уровень корреляции между
содержанием ванадия, никеля, полиароматичеких углеводородов и
генотоксичностью, определенной с помощью бактериальных luxбиосенсоров. Определен высокий уровень корреляции между содержанием
ртути и обнаруженным при помощи биосенсорных штаммов
генотоксическим эффектом, содержанием гидропероксидов.
1.
2.
3.
4.
Список основных работ, опубликованных по теме диссертации
Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК
Гуськов Е.П., Прокофьев В.Н., Клецкий М.Е., Корниенко И.В.,
Гапуренко О.А., Олехнович Л.П., Чистяков В.А., Шестопалов А.В.,
Сазыкина М.А., Маркеев А.В., Шкурат Т.П., Малхосьян С.Р., Жданов Ю.А.
Аллантоин как витамин // Доклады Академии Наук. – 2004. – Т. 398, № 6. –
С. 1–6 (10 % личн. вк., 0,29 п. л.).
Корпакова И.Г., Цыбульский И.Е., Виноградов А.Ю., Сазыкина М.А.,
Мирзоян А.В., Афанасьев Д.Ф., Чередников С.Ю. Оценка токсичности
среды обитания гидробионтов в районе лицензионного участка ООО «НК
«Приазовнефть» методами биологического тестирования // Защита
окружающей среды в нефтегазовом комплексе. – 2006. – № 9. – С. 98–106
(20 % личн. вк., 0,38 п. л.).
Корпакова И.Г., Афанасьев Д.Ф., Цыбульский И.Е., Сазыкина М.А.,
Виноградов А.Ю., Мирзоян А.В., Чередников С.Ю., Барабашин Т.О.
Методологические проблемы оценки токсичности компонентов среды
методами биотестирования // Защита окружающей среды в нефтегазовом
комплексе. – 2007. – № 9. – С. 23–29 (15 % личн. вк., 0,38 п. л.).
Корпакова И.Г., Цыбульский И.Е., Афанасьев Д.Ф., Виноградов А.Ю.,
Сазыкина М.А., Чередников С.Ю., Барабашин Т.О. Оценка токсичности
среды обитания в юго-восточной части Азовского моря методами
41
биологического тестирования // Защита окружающей среды в нефтегазовом
комплексе. – 2008. – № 11. – С. 62–69 (15 % личн. вк., 0,65 п. л.).
5. Корпакова И.Г., Афанасьев Д.Ф., Цыбульский И.Е., Виноградов А.Ю.,
Сазыкина М.А., Чередников С.Ю. О проблеме оценки токсичности
компонентов водной среды методами биологического тестирования //
Вопросы рыболовства. – 2008-б. – Т. 9. – № 4 (36). – С. 839–846 (20 % личн.
вк., 0,33 п. л.).
6. Чистяков В.А., Сазыкина М.А., Коленко М.А., Червяков Г.Г., Усатов В.А.
Метиленовый
синий
как
супрессор
генотоксического
эффекта
ультрафиолетового излучения длиной волны 300–400 нм // Генетика. – 2009.
– Т. 45, № 3. – С. 349–353 (60 % личн. вк., 0,21 п.л.).
7. Чистяков В.А., Сазыкина М.А. Реликтовые формы как источник
эффективных смесей антиоксидантов // Валеология. – 2009. – № 2. – С. 59–
63 (50 % личн. вк., 0,38 п. л.).
8. Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Коленко М.А., Азарин К.В. Аллантоин и
урат как супрессоры генотоксического эффекта ультрафиолетового
излучения длиной волны 300 – 400 нм // Экологическая генетика. – 2009. –
Т. 7, № 2. – С. 44–46 (50 % личн. вк., 0,197 п.л.).
9. Чистяков В.А., Сазыкина М.А., Сазыкин И.С., Латышев А.В. Проблемы
развития методологии мониторинга токсичности природных сред:
необходимость синтеза // Проблемы региональной экологии. – 2009. – Т. 5.
– С. 152–156 (25 % личн. вк., 0,44 п.л.).
10. Сазыкин И.С., Чистяков В.А., Сазыкина М.А. // Ферментативные и
неферментативные
механизмы
деградации
углеводородов
нефти
микроорганизмами // Труды Кубанского государственного аграрного
университета. – 2009. – Т. 6. – С.50–57 (30 % личн. вк., 0,94 п. л.).
11. Чистяков В.А., Сазыкина М.А., Александрова А.А., Беличенко Н.И.,
Машкина Е.В., Гутникова Л.В., Золотухин П.В., Шкурат Т.П.
Антимутагенная активность производного пластохинона, адресованного в
митохондрии // Биохимия. – 2010. – Т. 75, вып. 3. - С. 331 – 336 (15 % личн.
вк., 0,25 п. л.).
12. Цыбульский И.Е., Корпакова И.Г., Белова Л.В., Сазыкина М.А., Сазыкин
И.С., Афанасьев Д.Ф., Коленко М.А. Характеристика процессов
самоочищения
морской
среды
с
участием
нефтеокисляющих
микроорганизмов в районе аварии танкера в Керченском проливе // Известия
высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион. Естественные
науки. – 2010. – № 1. – С. 78–82 (15 % личн. вк., 0,53 п. л.).
42
13. Сазыкин И.С., Сазыкина М.А., Чистяков В.А. Разложение нефти
микроорганизмами. Экологические аспекты // Известия Высших учебных
заведений. Северо–Кавказский регион. – 2009. – Т. 6. – С. 88–93(30 % личн.
вк., 0,65 п. л.).
14. Чистяков В.А., Сазыкина М.А., Лысенко В.А., Вардуни Т.В., Севрюков
А.В., Празднова Е.В., Шкурат Т.П. Методика оценки эффективности
антимикробных агентов
на биопленки
бактерий по
данным
биолюминесценции // Валеология. – 2010. – № 1. – С.32–39 (25 % личн. вк.,
0,29 п. л.).
15. Сазыкина М. А., Чистяков В. А., Сазыкин И.С., Лагутова Л. П., Новикова
Е. М., Латышев А.В. Использование бактериального lux-биосенсора для
детекции загрязнения природных вод ртутью // Вода: Химия и Экология. –
2010-а. – № 5. – С. 24–29 (40 % личн. вк., 0,41 п. л.).
16. Цыбульский И.Е., Сазыкина М.А. Новые биосенсоры для мониторинга
токсичности среды на основе морских люминесцентных бактерий //
Прикладная биохимия и микробиология. – 2010. – Т. 46, № 5. – С. 1–6
(50 % личн. вк., 0, 65 п. л.).
17. Лысенко В.С., Чистяков В.А, Зимаков Д.В., Сойер В.Г., Сазыкина М.А.,
Сазыкина М.И., Сазыкин И.С., Краснов В.П. Разделение и масс–
спектрометрическая идентификация каротиноидов радиорезистентных
бактерий D. radiodurans // Масс–спектрометрия. – 2010. – Т. 7, № 4. –
С. 278–282 (15 % личн. вк., 0,38 п. л.).
18. Сазыкин И.С., Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Кленкин А.А., Павленко
Л.Ф. Утилизация углеводородов, смол и асфальтенов нефтеокисляющими
микроорганизмами Керченского пролива // Вода: Химия и Экология. – 2011.
– № 1. – С. 29–34 (25 % личн. вк., 0,49 п. л.).
19. Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Сазыкин И.С., Новикова Е.М., Кхатаб З.С.,
Лагутова Л.П., Латышев А.В. Генотоксичность воды родников г. Ростована-Дону (2009 г.) // Известия высших учебных заведений. СевероКавказский регион. Естественные науки. – 2011-а. – № 2. – С. 44–46 (40 %
личн. вк., 0, 32 п. л.).
20. Чистяков В.А., Лысенко В.С., Сазыкина М.А., Сазыкин И.С., Вардуни Т.В.,
Сазыкина
М.И.
Ультразвуковая
сенсибилизация
биопленок
люминесцирующих бактерий Vibrio fisheri к воздействию хлорамфеникола //
Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказский регион.
Естественные науки. – 2011. – № 1. – С. – 78–82 (20 % личн. вк., 0,21 п.л.).
43
21. Омельченко Г.В., Кхатаб З.С., Шерстнев А.К., Сазыкина М.А., Вардуни
Т.В., Шиманская Е.И. Оценка генотоксичности окружающей среды
г. Ростова-на-Дону и Ростовской области с использованием растительных и
бактериальных тест-систем. Экология урбанизированных территорий //
2011. – № 3. – С. 94–101 (20 % личн. вк., 0,64 п. л.).
22. Сазыкин И.С., Прокофьев В.Н., Чистяков В.А., Сазыкина М.А., Внуков
В.В. Хемилюминесценция экстрактов нефтеокисляющих бактерий
Acinetobacter calcoaceticus и их действие на PsoxS'::lux биосенсор //
Прикладная биохимия и микробиология. 2011. – Т. 47, № 4. – С. 1–5 (25 %
личн. вк., 0,45 п.л.).
23. Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Сазыкин И.С. Генотоксичность донных
отложений р. Дон (2001–2007 гг.) // Водные ресурсы. – 2012-а. – Т. 39,
№ 1. – С. 92–98 (80 % личн. вк., 0, 68 п. л.).
24. Чистяков В.А., Празднова Е.В., Гутникова Л.В., Сазыкина М.А., Сазыкин
И.С. Супероксидустраняющая активность производного пластохинона – 10
– (6'–пластохинонил) децилтрифенилфосфония (SkQ1) // Биохимия. – 2012.
– Т. 77. – № 7. – С. 932 – 935 (25 % личн. вк., 0,4 п. л.).
25. Афанасьев Д.Ф., Цыбульский И.Е., Ларин А.А., Корпакова И.Г., Сазыкина
М.А., Морозова М.А., Воловик С.П. Разработка тест-системы оценки
токсичности компонентов экосистем морских водоемов на основе
флуориметрии аборигенных микроводорослей // Известия высших учебных
заведений. Северо–Кавказский регион. Естественные науки 2012. – № 4. –
С. 55–59 (30 % личн. вк., 0,38 п.л.).
26. Сазыкина М.А., Новикова Е.М., Кхатаб З.С., Чистяков В.А., Сазыкин И.С.
Токсичность почв городов Ростовской области // Теоретическая и
прикладная экология. – 2012-б. – № 2. – С. 76–81 (30 % личн. вк., 0,53 п. л.).
27. Сазыкина М.А., Кхатаб З.С., Новикова Е.М., Сазыкин И.С. Оценка
качества воды родников г. Ростова-на-Дону на основе микробиологических
и токсикологических показателей // Вода: Химия и Экология. – 2013-а. – №
1. – С. 102–107 (40 % личн. вк., 0, 49 п. л.).
28. Сазыкина М.А., Кудеевская Е.М., Костина Н.В., Сазыкин И.С., Хмелевцова
Л.Е., Хаммами И.Х. Исследование динамики загрязнения воздуха
г. Ростова-на-Дону генотоксичными веществами c использованием
биолюминесцентных сенсоров // Валеология. – 2013-б. – № 3. – С. 21–25
(50 % личн. вк., 0, 4 п. л.).
29. Сазыкин И.С., Сазыкина М.А. Влияние антиоксидантов на
микробиологическую трансформацию нефти // Вода: Химия и Экология. 2013. - № 3. - С. 75-80 (40 % личн. вк., 0,25 п. л.)
44
30. Сазыкина М.А., Сазыкин И.С., Костина Н.В., Хмелевцова Л.Е., Трубник
Р.Г., Сазыкина М.И. Исследование экотоксикологических параметров
сточных вод г. Ростова-на-Дону и г. Мюнхена // Вода: Химия и Экология. –
2014. – № 1. – С. 3–10 (40 % личн. вк., 0,59 п.л.).
Статьи на английском языке
31. Chugunova E.A., Sazykina M.A., Gibadullina E.M., Burilov A.R., Sazykin I.S.,
Chistyakov V.A., Timasheva R.E., Krivolapov D.B, Goumont R. Synthesis,
Genotoxicity and UV-protective activity of new benzofuroxans substituted by
aromatic amines // Letters in Drug Design & Discovery. – 2013. – V. 10. –№ 2. –
pp. 145–154 (20 % личн. вк., 0,79 п.л.).
Патенты
32. Пат. 2342434. Российская Федерация, МПК C12Q1/02, C12R1/63. Штамм
бактерий Vibrio fischery, используемый в качестве тест-культуры для
определения токсичности объектов окружающей среды / Сазыкина М.А.,
Цыбульский И.Е.; заявитель и патентообладатель Федеральное
Государственное
унитарное
предприятие
Азовский
научно–
исследовательский институт рыбного хозяйства. – № 2007125181/13; заявл.
03.07.2007; опубл. 27.12.2008, Бюл. № 36. – 7 с. : табл. 4 (70 % личн. вк.,
0,43 п. л.).
33. Пат. 2346035. Российская Федерация, МПК C12N1/20, C12R1/01. Штамм
бактерий Vibrio fischery, используемый в качестве тест-культуры для
определения токсичности объектов окружающей среды / Сазыкина М.А.,
Цыбульский И.Е.; заявитель и патентообладатель Федеральное
Государственное
унитарное
предприятие
Азовский
научно–
исследовательский институт рыбного хозяйства. – № 2007130940/13; заявл.
13.08.2007; опубл. 10.02.2009, Бюл. № 4.– 7 с. : табл. 4 (70 % личн. вк., 0,44
п. л.).
34. Пат.2358009. Российская Федерация, МПК C12N 1/20, C12Q 1/04 Способ
выделения биолюминесцентных бактерий / Сазыкина М.А., Цыбульский
И.Е, Абросимова К.С.; заявитель и патентообладатель Федеральное
Государственное
унитарное
предприятие
Азовский
научно–
исследовательский институт рыбного хозяйства. – 2007114379/13, заявл.
16.04.2007; опубл. 10.06.2009-а, Бюл. № 16. – 7 с : табл. 1 (70 % личн. вк.,
0,361 п. л.).
35. Пат.2368658. Российская Федерация, МПК C12N 1/20, C12Q 1/04
Питательная среда для выращивания биолюминесцентных бактерий /
Сазыкина М.А., Цыбульский И.Е., Абросимова К.С.; заявитель и
45
патентообладатель Федеральное Государственное унитарное предприятие
Азовский научно–исследовательский институт рыбного хозяйства.–
2007114380/13, заявл. 16.04.2007; опубл. 27.09.2009-б, Бюл. № 27.– 6 с.:
табл. 1. (70 % личн. вк., 0,21 п. л.).
36. Патент 2457254. Российская Федерация, МПК C12Q 1/04 , C12N 13/00 .
Способ оценки эффективности антимикробного воздействия антибиотиков и
ультразвукового излучения на патогенные бактерии, существующие в форме
биопленки / Сазыкин И.С., Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Лысенко В.С.;
заявитель и патентообладатель Федеральное государственное автономное
образовательное учреждение высшего профессионального образования
"Южный федеральный университет". – 2011106708/10, заявл. 22.02.11;
опубл. 07.27.2012., Бюл. № 21 – 26 с.: рис. 25. (25 % личн. вк., 1,1 п. л.).
37. Положительное решение по заявке № 2012148361 от 12.12.2013-в на выдачу
патента на изобретение «Штамм Vibrio aquamarinus, способ определения
токсичности проб с его помощью и тест-культура для определения
токсичности проб» / Сазыкин И.С., Сазыкина М.А., Кудеевская Е.М.,
Сазыкина
М.И.;
заявитель
и
патентообладатель
Федеральное
государственное автономное образовательное учреждение высшего
профессионального образования "Южный федеральный университет".
Заявл. 13.11.2012. (50 % личн. вк., 0,53 п. л.).
Монографии, главы монографий
38. Цыбульский И.Е., Корпакова И.Г., Афанасьев Д.Ф., Барабашин Т.О.,
Бычкова М.В., Виноградов А.Ю., Купрюшкина О.П., Налетова Л.Ю.,
Сазыкина М.А., Чередников С. Ю., Цыбульская М.А. Оценка токсичности
воды и донных отложений Керченского пролива и прилегающих акваторий
Черного и Азовского морей по данным биотестирования // Керченская
авария: последствия для водных экосистем. – Авторский коллектив / под
ред. И.Г. Корпаковой, С.А.Агапова. – Ростов н/Д: ФГУП АзНИИРХ, 2008. –
С. 106–124 (15 % личн. вк., 0,73 п. л.).
39. Сазыкина М.А., Чистяков В.А. Мониторинг генотоксичности водной
среды: Азово-Донской бассейн: Монография / Сазыкина М.А., В.А.
Чистяков. – Ростов н/Д: Изд-во ЮФУ, 2009-в. – 183 с. (80 % личн. вк.,
6,94 п. л.).
40. Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Сазыкин И.С. Генотоксичность водной
среды. Генотоксиканты в экосистемах бассейна р. Дон и Азовского моря
Монография / Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Сазыкин И.С.– LAP
LAMBERT Academic Publishing GmbH & Co. KG, 2011-б. – p. 188 (80 %
46
личн. вк., 7,23 п. л.).
Базы данных
41. Программный комплекс «База данных по бактериальным lux-биосенсорам»:
свидетельство о регистрации электронного ресурса № 16198 / Сазыкина
М.А., Сазыкин И.С., Чистяков В.А., Празднова Е.В., Севрюков А.В.,
Денисенко Ю.В. № 50201001549; заявл. 23.09.2010; выдано 04.10.2010-б.
42. Программный комплекс «База данных по токсичности воды, донных
отложений и гидробионтов водоемов Азовского бассейна: свидетельство о
регистрации электронного ресурса № 16273 / Сазыкина М.А., Сазыкин
И.С., Чистяков В.А., Празднова Е.В., Севрюков А.В., Денисенко Ю.В. №
50201050037; заявл. 04.10.2010; выдано 14.10.2010-в.
43. Программный комплекс «База данных по токсичности почвы, животных и
растений экосистем Ростовской области»: свидетельство о регистрации
электронного ресурса № 16353 / Сазыкина М.А., Сазыкин И.С., Чистяков
В.А., Празднова Е.В., Севрюков А.В., Денисенко Ю.В. № 50201050106;
заявл. 29.10.2010; выдано 10.11.2010-г.
44. Программный комплекс «База данных по токсичности воздуха и
атмосферных осадков г. Ростова-на-Дону», свидетельство о регистрации
электронного ресурса № 17602 / Сазыкина М.А., Сазыкин И.С., Чистяков
В.А., Новикова Е.М., Денисенко Ю.В. № 50201151454; заявл. 18.11.2011;
выдано 21.11.2011-в.
Учебно-методические пособия
45. Сазыкина М.А., Сазыкин И.С.. Чистяков В.А., Машкина Е.В., Брень А.Б.
Инновационная биотехнология // Учебное пособие. – Ростов н/Д: Изд-во
ЮФУ, – 2009. – 75 с. (30 % личн. вк., 3,19 п. л.).
46. Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Сазыкин И.С., Машкина Е.В.
Биотехнология нефтепродуктов // Учебно-методическое пособие. – Ростов
н/Д: Изд-во ЮФУ, – 2010. – 53 с. (40 % личн. вк., 2,31 п. л.).
Статьи и тезисы в других изданиях
47. Сазыкина М.А., Чистяков В.А. Генотоксичность донных отложений реки
Дон и Азовского моря (2001–2003 гг.): Тез. докл. Второй Межд. науч. конф.
«Биотехнология – охране окружающей среды». – М.: Спорт и культура,
2004. – С. 192. (80 % личн. вк., 0,04 п. л.).
48. Сазыкина М.А., Цыбульский И.Е. Выделение из воды Азовского и Черного
морей перспективных для биотестирования штаммов биолюминесцентных
бактерий // Основные проблемы рыбного хозяйства и охраны
рыбохозяйственных водоемов Азово-Черноморского бассейна: сб. науч. тр.
47
(2006–2007 гг.) / Федер. агентство по рыболовству. ФГУП "АзНИИРХ". –
Ростов н/Д:Диапазон, 2008. – С. 346–353. (50 % личн. вк., 0,33 п. л.).
49. Сазыкина М.А., Цыбульский И.Е., Сазыкин И.С. Использование
биолюминесцентных
аборигенных
бактерий
в
биотестировании
токсичности компонентов экосистем морских водоемов // Сборник научных
статей на основе материалов 4-й Всероссийской научно-практической
конференции с международным участием «Экологические проблемы
промышленных городов» / под ред. Т.И. Губиной. – Саратов. 2009. – С. 56–
57 (40 % личн. вк., 0,08 п. л.) .
50. Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Сазыкин И.С., Празднова Е.В.
Генотоксичность донных отложений Азовского моря (2001–2007 гг.) //
Сборник научных статей на основе материалов 4-й Всероссийской научнопрактической конференции с международным участием «Экологические
проблемы промышленных городов» / под ред. Т.И. Губиной. – Саратов.
2009. с.60–62 (70 % личн. вк., 0,13 п. л.).
51. Сазыкина М.А., Чистяков В.А., Манухов И.В., Лагутова Л.П., Новикова
Е.М., Латышев А.В., Сазыкин И.С. Использование бактериальных luxбиосенсоров для определения тяжелых металлов в воде родников г. Ростована-Дону // Материалы Всероссийской конференции с элементами научной
школы
для
молодежи
«Экотоксикология-2009.
Современные
биоаналитические системы, методы и технологии, 26–30 октября 2009 г.,
Пущино-Тула» / под ред. Решетиловой Т.А., Алферова В.А. – Пущино:
ИБФМ РАН, 2009. – С. 104 (30 % личн. вк., 0,04 п. л.).
52. Сазыкина М.А., Новикова Е.М., Кхатаб З.С., Сазыкин И.С., Омельченко
Г.В., Сазыкина М.И. Генотоксичность почв городов Ростовской области
(2010 г.) // Проблемы и перспективы современной науки. – Т. 3, № 1. –
Межвузовский сб. науч. работ с материалами трудов участников 4–й
Международной телеконференции «Фундаментальные науки и практика»
(Томск, 22 февраля–4 марта, 2011). – Томск: СибГМУ, 2011. – С. 107–108
(40 % личн. вк., 0,08 п. л.).
53. Сазыкина М.А. , Новикова Е.М., Кхатаб З.С., Бураева Е.А., Сазыкин И.С.,
Сазыкина М.И. Детекция генотоксичных веществ в представителях
бриофлоры, лихенофлоры и микофлоры при помощи бактериальных lux–
биосенсоров // Сборник научных трудов на основе материалов 5-й
Всероссийской научно–практической конференции с международным
участием «Экологические проблемы промышленных городов» (г. Саратов,
12–14 апреля 2011 г.) / под ред. Е.И. Тихомировой. – Т. 1. – Саратов: СГТУ,
48
2011. – С. 128–129 (25 % личн. вк., 0,18 п. л.).
54. Сазыкина М.А., Широков В.Б., Новикова Е.М., Юзюк Ю.И. Исследование
морфологии клеток и жгутиков бактерии рода Vibrio с помощью атомно–
силового микроскопа // Материалы IV Междунар. науч.-практич. конф.
«Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», Ростов-наДону, 22–25 сентября 2011 г. Ростов н/Д: Изд-во СКНЦ ВШ ЮФУ, 2011. – С.
159 (40 % личн. вк., 0,04 п. л.).
55. Сазыкина М.А., Манухов И.В., Новикова Е.М., Сазыкин И.С. Vibrio sp.
nov., люминесцирующая морская бактерия, выделенная из воды черного
моря // Материалы IV Междунар. науч.-практич. конф. «Актуальные
проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», Ростов-на-Дону, 22–25
сентября 2011 г. Ростов н/Д: Изд-во СКНЦ ВШ ЮФУ, 2011. – С. 31
(50 % личн. вк., 0,04 п. л.).
56. Сазыкина М.А., Кхатаб З.С., Новикова Е.М., Сазыкин И.С. Токсичность
атмосферных осадков г. Ростова–на–Дону (2010–2011 гг.) // Материалы IV
Междунар. науч.-практич. конф. «Актуальные проблемы биологии,
нанотехнологий и медицины», Ростов-на-Дону, 22–25 сентября 2011 г.
Ростов н/Д: Изд-во СКНЦ ВШ ЮФУ, 2011. – С. 222 (25 % личн. вк., 0,04 п.
л.).
57. Сазыкина М.А., Кхатаб З.С., Новикова Е.М., Сазыкин И.С. Исследование
токсичности снежного покрова г. Ростова-на-Дону // Материалы IV
Междунар. науч.-практич. конф. «Актуальные проблемы биологии,
нанотехнологий и медицины», Ростов-на-Дону, 22–25 сентября 2011 г.
Ростов н/Д: Изд-во СКНЦ ВШ ЮФУ, 2011. – С. 221–222 (25 % личн. вк.,
0,04 п. л.).
58. Сазыкина М.А., Новикова Е.М., Сазыкин И.С. Использование нового вида
биолюминесцирующих бактерий для изучения токсичности окружающей
среды // Материалы Международной конференции «Биология – наука XXI
века», г. Москва, 24 мая 2012 г. М.: МАКС Пресс, 2012. – С. 804–805
(40 % личн. вк., 0,08 п. л.).
59. Сазыкина М.А., Сазыкин И.С. Кхатаб З.С. Использование светящихся
бактерий в системе мониторинга загрязнения родников Ростова-на-Дону //
Тез. докл. I Международного биологического конгресса Кыргызстана (24–26
сентября 2012 г.). – Бишкек: Кыргызско-Турецкий Университет Манас,
Publishing Office, 2012. – С. 101–102 (40 % личн. вк., 0,08 п. л.).
60. Сазыкина М.А., Сазыкин И.С., Кудеевская Е.М., Сазыкина М.И., Хаммами
И.Х. Новый штамм биолюминесцирующих бактерий для мониторинга
49
токсичности окружающей среды // Труды Второй Всероссийской научной
конференции с международным участием «Окружающая среда и устойчивое
развитие регионов», г. Казань, 24–26 сентября 2013 г. – Т. 1 – Казань:
Отечество, 2013. – С. 148–149 (40 % личн. вк., 0,14 п. л.).
61. Сазыкина М.А., Кхатаб З.С., Сазыкин И.С., Хмелевцова Л.Е., Сазыкина
М.И. Комплексная оценка качества воды родников г. Ростова–на–Дону
(2011 г.) Материалы V Международной научно–практической конференции
«Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», г. Ростовна-Дону, 3–5 октября 2013 г. Ростов н/Д: Изд-во Южного Федерального
Университета, 2013. – С. 414–415 (40 % личн. вк., 0,12 п. л.).
62. Сазыкина М.А., Сазыкин И.С., Хаммами И.Х, Сазыкина М.И., Костина
Н.В. Оценка экотоксикологических и химических параметров донных
отложений Нижнего Дона, 2011 г. Материалы V Международной научно–
практической
конференции
«Актуальные
проблемы
биологии,
нанотехнологий и медицины», г. Ростов-на-Дону, 3–5 октября 2013 г. Ростов
н/Д: Изд-во Южного Федерального Университета, 2013. – С. 415–416 (40 %
личн. вк., 0,14 п. л.).
63. Сазыкина М.А., Кхатаб З.С., Сазыкин И.С., Костина Н.В., Сазыкина М.И.,
Хаммами И.Х. Исследование санитарно–микробиологических показателей в
воде родников г. Ростова-на-Дону. Материалы V Международной научно–
практической
конференции
«Актуальные
проблемы
биологии,
нанотехнологий и медицины», г. Ростов-на-Дону, 3–5 октября 2013 г. Ростов
н/Д: Изд-во Южного Федерального Университета, 2013. – С. 412–414
(30 % личн. вк., 0,11 п. л.).
Перечень использованных сокращений
АФК – активные формы кислорода
ВКПМ – Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов
ДО – донные отложения
ДСН – додецил сульфат натрия
ПАУ – полиароматические углеводороды
ПДК – предельно допустимая концентрация
ПХБ – полихлорбифенилы
DSMZ - Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур
MNNG – N-метил-N'-нитро-N-нитрозогуанидин
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа