close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

По книге А.Левитаса «Больше денег от Вашего бизнеса»;pdf

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Юрченко Антон Николаевич
Биологически активные метаболиты факультативных морских грибов,
выделенных из грунтов дальневосточных морей
02.00.10 – биоорганическая химия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Владивосток – 2014
2
Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г. Б. Елякова
ДВО РАН
Научные руководители:
кандидат химических наук
Афиятуллов Шамил Шерибзянович
доктор химических наук,
старший научный сотрудник
Калиновский Анатолий Иванович
Официальные оппоненты:
Имбс Андрей Борисович
доктор биологических наук, зав. лабораторией сравнительной биохимии,
Институт биологии моря им. А.М. Жирмунского ДВО РАН
Чибиряев Андрей Михайлович
кандидат химических наук, доцент, с.н.с.,
Институт катализа им. Г.К. Борескова СО
РАН
Ведушая организация:
Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН, г. Новосибирск
Защита состоится 26 декабря 2014 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г. Б. Елякова
ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159,
ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки
ДВО РАН (г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).
Текст диссертации и автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru
Автореферат разослан «__» ноября 2014 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат биологических наук
Черников О.В.
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Исследование метаболитов микроскопических грибов
оказало существенное влияние на развитие химии и медицины. После открытия пенициллина в 1929 году началось интенсивное изучение наземных микроскопических грибов, которые оказались богатыми источниками биологически активных соединений. За 70 с лишним лет было исследовано более 100 тысяч метаболитов из этих микроорганизмов. Более
10 тысяч из них были биологически активными и более восьми тысяч проявляли антибиотические и антиопухолевые свойства. Хотя исследования наземных грибов интенсивно
продолжаются и в настоящее время, число новых метаболитов, выделяемых из них, снижается, так как около 90% культур синтезируют уже известные соединения. Поэтому закономерен интерес к изучению метаболитов грибов из других мест обитания, в том числе
и из морских. Несмотря на то, что изучение морских грибов как источников биологически
активных соединений было начато еще в 50-х годах прошлого столетия, они остаются еще
мало изученными объектами по сравнению с наземными экоформами.
Физические факторы, воздействующие на морские грибы – высокое содержание ионов натрия, низкие температуры, олиготрофный тип питания, высокое гидростатическое
давление – обуславливают способность морских грибов к синтезу необычных по структуре метаболитов с разнообразной биологической активностью. Так, из морских грибов были выделены уникальные по структуре биологически активные соединения, которые не
были обнаружены у наземных экоформ, несмотря на более чем 70-летнюю историю таких
исследований. К таким соединениям относятся большое количество хлорсодержащих метаболитов, макролиды и пептиды с высокой антивирусной активностью. Среди морских
грибов были найдены продуценты соединений с фермент-ингибирующей, противовоспалительной, антифунгальной и антибактериальной активностью, в том числе в отношении
лекарственно-устойчивых штаммов бактерий. Целый ряд метаболитов морских грибов находятся в настоящее время на различных стадиях клинических испытаний как потенциальные противоопухолевые препараты.
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось выделение и установление строения вторичных метаболитов факультативных морских грибов, изолированных из образцов грунта, собранных в Охотском и Южно-Китайском морях.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
1) провести отбор новых перспективных грибов-продуцентов, выделенных из образцов грунта, собранных в Охотском и Южно-Китайском морях;
2) выделить индивидуальные природные соединения из экстрактов изолятов отобранных грибов;
3) установить строение новых метаболитов и идентифицировать ранее известные соединения;
4) исследовать биологическую активность выделенных соединений.
Научная новизна и практическая ценность работы. Из экстрактов восьми штаммов морских грибов, выделенных из образцов грунта, собранных в Охотском и ЮжноКитайском морях (Isaria felina, Aspergillus carneus, Myceliophthora lutea, A. versicolor,
Curvularia inaequalis, Wardomyces inflatus, Penicillium citrinum и Acremonium roseum) в результате хроматографического разделения были выделены 40 индивидуальных соединений различной химической природы. При помощи спектральных методов анализа и химических превращений установлено строение 18 новых соединений: десяти хроменов, двух
бензопиранов, двух пирановых поликетидов, одного фенольного поликетида, одного дифенилового эфира, одного меротерпеноида, одного изопреноида. Идентифицированы
структуры 22 ранее описанных соединений. Установлено строение двух спироциклических артефактных продуктов хроматографического разделения экстракта Myceliophthora
lutea.
4
Впервые исследована цитотоксическая активность и влияние на рост колоний опухолевых клеток ряда метаболитов морских грибов. Впервые изучена способность некоторых грибных метаболитов индуцировать экспрессию белка теплового шока Hsp70.
Практическое значение данного исследования состоит в развитии методов выделения и установления строения новых природных низкомолекулярных метаболитов из морских грибов.
Положения, выносимые на защиту.
1) Морские грибы Isaria felina KMM 4639, Aspergillus carneus, Myceliophthora lutea, A.
versicolor КММ 4647 и Curvularia inaequalis являются богатыми источниками хроменов, бензофурановых и пирановых поликетидов и меротерпеноидов.
2) В морском грибе Isaria felina найдены новые высокоокисленные хромены оксирапентины B–J с редкой для природных соединений метилбутенинильной боковой цепью, а также новые пирановые поликетиды исарикетиды A и B.
3) Предложена возможная схема биосинтеза оксирапентинов A–K и акремина S из общего пренилфенольного предшественника, а также исарикетидов A и B из предполагаемого пентакетидного предшественника.
4) В экстракте гриба Aspergillus carneus обнаружены новые поликетиды варатерпол B и
глицерилдиорциновая кислота, а также новое декалиновое производное декумбенон
D. Глицерилдиорциновая кислота является первым описанным глицериновым производным орциновых эфиров.
5) В морском грибе Myceliophthora lutea найдено новое бензофурановое производное
изоакремин D.
6) В морском грибе A. versicolor обнаружен новый меротерпеноид аспердемин.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на XIV Всероссийской
молодежной школе-конференции по актуальным проблемам химии и биологии (Владивосток, 2012), IV Annual Russian-Korean Conference «Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology» (Новосибирск, 2012), 2nd International workshop on marine
bioresources of Vietnam (Ханой, 2013), 2nd International Symposium on Life Sciences (Владивосток, 2013).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ.
Личный вклад автора в проведение исследования. Автором был выполнен анализ
литературных данных по теме исследования, планирование экспериментов, получена основная часть результатов, написаны статьи и сделаны доклады на конференциях. На защиту вынесены только те положения и результаты, в получении которых роль автора была определяющей.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного
обзора, посвященного некоторым классам вторичных метаболитов морских грибов, выделенных из донных осадков, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов,
списка литературы, включающего 228 цитируемых работ. Работа изложена на 177 страницах, содержит 21 таблицу и 33 рисунка.
Автор выражает глубокую признательность своим научным руководителям к.х.н.
Афиятуллову Ш.Ш. и д.х.н. Калиновскому А.И. Также автор благодарит Сметанину О.Ф.
за бесценную помощь в работе, д.б.н. Пивкина М.В., к.б.н. Худякову Ю.В., к.б.н. Киричук
Н.Н. за наращивание исследованных штаммов грибов и определение антибактериальной
активности выделенных соединений, к.х.н. Дмитренка П.С. и Моисеенко О.П. – за получение масс-спектров, к.ф.-м.н. Глазунова В.П. и Ким Н.Ю. – за получение ИК и УФспектров, к.х.н. Ермакову С.П., к.б.н. Юрченко Е.А., к.х.н. Дышлового С.А. – за проведение испытаний биологической активности выделенных нами веществ.
Некоторые используемые сокращения: HRMALDIMS – масс-спектрометрия высокого разрешения с лазерной десорбцией/ионизацией; HREIMS – масс-спектрометрия
высокого разрешения с ионизацией электронным ударом; HRESIMS – масс-спектрометрия
5
высокого разрешения с электро-распылительной ионизацией; COSY – корреляционная
спектроскопия; DEPT – неискаженное улучшение переносом поляризации; HMBC – гетероядерная корреляция через несколько связей; HSQC – гетероядерная одноквантовая когерентность; NOE – ядерный эффект Оверхаузера; NOESY – двумерная спектроскопия
ядерного эффекта Оверхаузера; ROESY – двумерная спектроскопия ядерного эффекта
Оверхаузера во вращающейся системе координат; РСА – рентгеноструктурный анализ;
(R)-MTPA-Cl – хлорангидрид (R)-α-метокси-α-(трифторметил)фенилуксусной кислоты.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Скрининг
Для поиска перспективных источников биологически активных соединений были
выделены более 1000 изолятов грибов из донных осадков, собранных в Охотском и Южно-Китайском морях. Этилацетатные экстракты всех выделенных грибов исследовались
методом ТСХ, изучалась их антимикробная активность в отношении грамположительных
и грамотрицательных бактерий, а также дрожжевых грибов. На основании полученных
результатов были отобраны для дальнейшей работы восемь штаммов грибовмикромицетов: Isaria felina, Aspergillus carneus, Myceliophthora lutea, A. versicolor,
Curvularia inaequalis, Wardomyces inflatus, Penicillium citrinum и Acremonium roseum.
Из этилацетатных экстрактов выбранных грибных штаммов было выделено 40 индивидуальных метаболитов, из которых 18 являются новыми.
2. Установление строения индивидуальных соединений из гриба
Isaria felina КММ 4639
Гриб I. felina был выделен из образца донных осадков, собранных в заливе Ванфонг
(Южно-Китайское море).
Из этилацетатного экстракта I. felina при культивировании на агаризованном пивном
сусле были получены новые оксирапентины B (1), D–H (3–7) и J (9), известный оксирапентин A (11), а также известные циклодепсипептиды исаридин E (327) и изоисариин B
(328). На модифицированной среде с добавлением антибиотиков (пенициллин и стрептомицин) дополнительно продуцировались новые оксирапентины C (2), I (8) и K (10), а также новый поликетид исарикетид A (12) и бензофуран акремин S (326). При этом продукция оксирапентинов G и H и пептидов не была зафиксирована. На рисовой среде были
получены только шесть оксирапентинов (A, B, D–G) и акремин S. Самым бедным по продукции метаболитов оказалась культивирование на рисовой среде с добавление бромида
калия. На этой среде продуцировались три основных оксирапентина (B, E и F), а также
исарикетиды A и B (13), последний из которых на других средах не продуцировался.
Брутто-формула соединения 1 была определена как C18H22O6 на основании данных
HRESIMS (m/z 334.1429 [M]+) и подтверждена данными спектров 13C ЯМР. Анализ 1H и
13
C ЯМР-данных соединения 1 при помощи DEPT и HSQC выявил наличие трех метильных групп, одной метиленовой, пяти окисленных метиновых групп, а также трех четвертичных sp3-гибридизованных атомов углерода, связанных с кислородными функциями.
Оставшиеся сигналы в углеродном спектре при C 170.3 (C), 125.3 (C), 124.3 (CH2), 86.6
(C) и 83.8 (C) были отнесены к карбонильной группе, дизамещенной терминальной двойной и тройной связям.
6
Прямое сравнение спектров 1H и 13C ЯМР соединения 1 и известного оксирапентина A (11) выявило ряд сходств, включая сигналы трех метильных (H 1.26, 1.43, 1.90; C
25.4, 21.6, 23.0), одной ацетильной (H 2.13; C 170.9, 20.9) и двух метиленовых групп (H
2.50, 1.50, C 32.4; H 5.41, 5.33, C 124.3), подтверждающих, что соединение 1 содержит
кольцо А и боковую цепь, идентичные таковым в оксирапентине A.
Наблюдаемые HMBC-взаимодействия H-4'a с C-1' (δC 83.8), C-2' (δC 86.6) и C-5' (δC
23.0) и H-5' с C-2', C-3' (δC 125.4) и C-4' (δC 124.3) совместно с взаимными дальними
COSY-корреляциями между H-4'a,b и H3-5' указывают на наличие 3-метилбут-3-ен-1инильной боковой цепи в соединении 1. HMBC-корреляции от синглетных сигналов H3-10
и H3-11 к C-1 (δC 74.5) и C-2 (δC 73.7), от H-2 к C-1, C-3 (δC 32.4), C-4 (δC 53.0) и карбонильному углероду C-1'' (δC 170.3), от H-3 к C-1, C-2, C-4 и C-9 (δC 63.8), а также дальние
COSY-взаимодействия между H3-11 и H-9 позволяют установить структуру кольца A и
положение ацетатной группы при C-2. Разница в две единицы в молекулярной массе соединений 11 и 1 указывает на наличие гидроксильной группы в 1 вместо карбонильной
группы в 11. HMBC-корреляции от H-3, к C-5 (δC 60.0), от 6-OH к C-5 (δC 60.0) и C-6 (δC
64.6) и от H-8 к C-6, C-7 (δC 51.7) и C-1' (δC 83.8) устанавливают положение гидроксильной группы при C-6 и присоединение боковой цепи к C-7. COSY-45 и HSQC-спектры соединения 1 выявляют системы спин-спинового взаимодействия протонов в кольце B –
(CHO(6)CHO(5)) и (>CH(9)CHO(8)). Спектры 1H и 13C ЯМР показывают сигналы,
относящиеся к тризамещенным эпокси-метинам C-5 (H 3.01, 1H, уш.с; C 60.0, 1JCH 184
Гц) и C-8 (H 3.40, 1H, уш.с; C 60.1, 1JCH 180 Гц). Эти данные и HMBC-взаимодействия H2 с C-4, H-5 с C-3, C-4 и C-7 (δC 51.7), H-9 с C-7 и C-8 (δC 60.1) показывают положение
эпокси-групп при C-4, С-5 и C-7, C-8.
А
Б
Рисунок 1 – А. Ключевые NOE-корреляции в молекуле оксирапентина B (1).
Б. Общий вид молекулы оксирапентина B (1) по данным РСА.
1D NOE-взаимодействия 6-OH/H3-2'', H-5; H-3/H-5 и H-3/H-9, H3-11 указывают
на цис-сочленение колец A и B, а также β-ориентацию ацетата и гидроксильной группы и
α-ориентацию 4,5-эпоксида в соединении 1 (рис. 1А). Структура и относительные конфигурации стереоцентров соединения 1 были подтверждены рентгеноструктурным анализом
монокристалла, полученного перекристаллизацией из смеси н-гексан–этилацетат (рис.
1Б).
Рисунок 2 – Значения ∆δ (δSδR) (м.д.) для MTPA-эфиров оксирапентина B (1).
7
Абсолютные конфигурации стереоцентров соединения 1 установлены модифицированным методом Мошера. Этерификация (R)- и (S)-MTPA-хлоридами гидроксильной
группы при С-6 привела к образованию (S)- и (R)-MTPA-эфиров 1a и 1b, соответственно.
Разница химических сдвигов Δδ(δS-δR) (рис. 2) указывает на 6S конфигурацию и, таким
образом, позволяет определить абсолютную стереоструктуру соедиения 1 с 2R, 4S, 5S, 6S,
7R, 8S конфигурациями. Соединение 1 было названо оксирапентином B.
Брутто-формула соединения 2 была определена как C18H22O6, согласно HRESIMS
пику m/z 334.1427 [M]+ и 13C ЯМР анализу.
А
Б
Рисунок 3 – Ключевые HMBC- (A) и NOE-корреляции
(Б) в соединении 2.
Основные пики в спектрах 1H и 13C ЯМР соединения 2 соответствовали пикам оксирапентина B за исключением сигналов, относящихся к кольцу B. Структуры кольца A и
боковой цепи в соединении 2 были установлены на основании HMBC- и дальних COSYвзаимодействий, подобных наблюдаемым для оксирапентина B (рис. 3A). COSYкорреляции H-8 с H-9 и 8-OH и HMBC-корреляция от 8-OH к C-8 (δC 70.32) указывают на
положение OH-группы при C-8. Спектр 13C ЯМР соединения 2 содержал сигналы при δс
58.8 (д, 1JCH = 185.6 Гц) и 57.5 (д, 1JCH = 183.6 Гц), характерные для эпоксидных атомов
углерода. Спектр 1H ЯМР выявил наличие двух эпокси-протонов при δH 3.35 (уш.д, J = 2.5
Гц) и 3.77 (уш.д, J = 2.5 Гц). Эти данные совместно с HMBC-корреляциями от H-3α,β и H9 к C-4 (δC 56.7) и C-5 (δC 58.8), от H-5 к C-6 (δC 57.5) и C-7 (δC 52.8) и от H-8 к C-6, C-7 и
C-1' (C 84.4) показывают положение эпоксигрупп в соединении 2 при C-4–С-5 и C-6–C-7.
Относительная конфигурация стереоцентров соединения 2 была установлена на основании данных экспериментов разностного NOE и констант взаимодействия 2JCH. 1D NOEвзаимодействия H-5/H-3, H-6; H3-10, H3-11/H-2; H-3/H-9, H3-11 и H-8/H-9 (рис. 3Б), а
также значения констант взаимодействия 2JC5H6 (+ 8.1 Гц) и 2JC6H5 (+ 7.4 Гц) указывали
на цис-сочленение колец A и B, -ориентацию боковой цепи, ацетатной и гидроксильной
групп и -ориентацию эпокси-групп в соединении 2. Таким образом была установлена
структура соединения 2, которое было названо оксирапентином C. Абсолютная конфигурация стереоцентров оксирапентина C была предложена в соответствии с предполагаемым
путем биосинтеза оксирапентинов (рис. 12).
Брутто-формула соединения 3 была определена как C18H24O7 на основании данных
HRESIMS и 13C ЯМР. Сравнение спектров ЯМР соединения 3 со спектрами оксирапентинов B (1) и C (2) показало ряд сходств, включая три метильные (H 1.30, 1.39, 1.91; C 21.9,
26.3, 23.1) и две метиленовые группы (H 2.51, 1.78, C 31.4; H 5.39, 5.33, C 123.8).
Структура боковой цепи соединения 3 была установлена на основании HMBC- и
дальних COSY-корреляций и является идентичной боковым цепям оксирапентинов B и C.
HMBC-взаимодействия от синглетов H3-10 и H3-11 к C-1 (C 76.5) и C-2 (C 71.0), от H-2 к
C-1, C-3 (C 31.4) и C-4 (C 73.9), от H-3 к C-1, C-2, C-4 и C-9 (C 60.1), от 2-OH к C-2 и C3 позволили установить структуру кольца A и гидроксильной группы при C-2. Метильная
группа при H 1.51 (с) взаимодействует в HMBC-эксперименте только с четвертичным углеродом при C 108.8 (C-12), что показывает наличие ортоацетатного фрагмента в струк-
8
туре соединения 3. Ключевые HMBC-взаимодействия от 7-OH к C-6 (C 72.7), C-7 (C
68.6), C-8 (C 75.8) и C-1' (C 86.7), от 5-OH к C-5 (C 70.8) и C-6 и от H-5 к C-3, C-4, C-6,
C-7 и C-9 выявляют положение боковой цепи при C-7 и двух гидроксильных групп при C7 и C-5. Оставшиеся сигналы двух окисленных третичных углеродов и одного окисленного четвертичного атома углерода связаны с ортоэфирной группой. Это предположение
подтверждается HMBC-корреляциями от H-6 и H-8 к C-12.
O
O
O
H
OH
H
O
H
H
H H
OH
OH
H
Рисунок 4 – Ключевые NOEвзаимодействия в молекуле оксирапентина
D (3).
Относительная конфигурация стереоцентров соединения 3 была установлена на основании NOESY-корреляций между H-3 и 5-OH, H-9, H3-11, между 5-OH и H-6, 7-OH и
между H-9 и 7-OH (рис. 4). Взаимодействия NOE наблюдались между 2-OH и H-3, H3-10,
H3-13 и между H-5 и H-3. Все эти данные и HMBC-корреляция H-5 с C-1' (W-тип) позволяют установить хроменовый скелет с -аксиальным гидроксилом при C-2, аксиальными гидроксилами при C-5 и C-7, а также 4,6,8-ортоацетатной группой и боковой
цепью в -ориентации. Соединение 3 было названо оксирапентином D. Абсолютная конфигурация стереоцентров оксирапентина D была определена на основании биогенетического родства с остальными оксирапентинами (рис. 10).
Брутто-формула соединения 4 была определена как С16H20O5 на основании данных
ESIMS высокого разрешения и была подтверждена анализом ЯМР 13С спектров.
В ЯМР-спектрах соединения 4 сигналы протонов и атомов углерода практически
совпадают с соответствующими сигналами в спектрах оксирапентина В (1), за исключением сигналов С-1, С-2, С-3 и H-2, H-10, H-11 в кольце А. Разница в 42 единицы массы
между соединением 4 и оксирапентином В и отсутствие сигнала карбонильного углерода
в 13С ЯМР-спектре соединения 4 позволяет предположить наличие гидроксильной группы
в соединении 4 вместо ацетатной функции оксирапентина B. Данные COSY-45 спектра и
HMBC-корреляции H-3β/C-1 (C 76.1), C-2 (C 72.5), C-4 (C 52.7); H-9/C-4 и H3-10,11/C-1,
C-2 позволяют установить положение гидроксильной группы при С-2 и строение кольца
А. Таким образом была установлена плоская структура соединения 4, названного оксирапентином E.
Строение оксирапентина E было подтверждено ацетилированием его и оксирапентина В уксусным ангидридом в пиридине. В результате были получены два соединения, которые по данным масс- и ЯМР-спектров имели одинаковую структуру, соответствующую
9
формуле 4a. Полученное соединение можно назвать ацетатом оксирапентина В или диацетатом оксирапентина Е.
Абсолютная конфигурация стереоцентров оксирапентина E была установлена соответственно определенной ранее для оксирапентина B, как 2R, 4S, 5S, 6S, 7R, 8S.
HRESIMS-пик [M+Na]+ при m/z 375.1418 указывает для соединения 5 на бруттоформулу C18H24O7, которая соответствует семи степеням ненасыщености.
O
O
O
H
O
OH
OH
OH
5
Сравнение спектров 1H и 13C ЯМР соединения 5 и оксирапентина B (1) показало ряд
сходств, включая сигналы трех метильных (δH 1.23, C 25.2; δH 1.44, C 21.1; δH 1.91, C
23.3), ацетатной (δH 2.11, C 20.7; C 169.7) и двух метиленовых (δH 1.65, 2.56, C 32.0; δH
5.28, 5.38, C 123.3) групп. Боковая цепь соединения 5 была идентична боковой цепи оксирапентина B, что подтверждается HMBC-корреляциями H-6, H-8/C-1' (C 87.3); H2-4'/C-2'
(C 86.2), C-3' (C 125.8), C-5' (C 23.3) и H3-5'/C-2', C-3', C-4' (C 123.3). Спектр 13C ЯМР
содержит сигналы при C 56.8 и 63.4 (д, 1JCH = 180.4 Гц), характерные для эпоксидных
атомов углерода. 1H ЯМР-спектр также показывает наличие одного эпокси-протона при H
3.05. Вместе с HMBC-корреляциями от H-3α,β и H-9 к C-4 (C 56.8) и C-5 (C 63.4) эти
данные указывают на локализацию эпокси-группы при C-4–C-5. COSY-корреляции H-5 с
H-6, 6-OH с H-6, H-9 с H-8 и 8-OH с H-8 показывают наличие гидроксильных групп в 6 и 8
положениях, что подтверждается HMBC-корреляциями от 6-OH к C-6 (C 69.5) и от 8-OH
к C-8 (C 72.4). Дальние HMBC-взаимодействия от 7-OH к C-7 (C 70.8), C-8 и C-1' (C
87.3) указывают локализацию гидроксила при C-7.
А
Б
Рисунок 5 – A. Значения ∆δ (δSδR) (м.д.) для MTPA-эфиров оксирапентина F (5)
Б. Ключевые NOE-взаимодействия в молекуле оксирапентина F (5)
Этерификация (R)- и (S)-MTPA-хлоридами гидроксильных групп при C-6 и C-8 привела к (S)- и (R)-MTPA-диэфирам 5a и 5b, соответственно. Разница химических сдвигов
Δδ(δS-δR) (рис. 5А) указывала на 6S и 8S конфигурации, соответственно. Константы взаимодействия 2JH6-C5 (-4.23 Гц) и 2JH9-C8 (-4.05 Гц), а также 1D NOE-корреляции (рис. 5Б) H2/H3-10, H3-11; H-3α/H-9 и H-3β/H-5 свидетельствуют об α-ориентации эпоксида и гидроксильной группы при C-8 и β-ориентации ацетатной группы и гидроксильной группы при
C-6. Эти данные позволяют определить абсолютные конфигурации стереоцентров соединения 5 как 2R, 4S, 5S, 6S, 8S, 9S. S-конфигурация хирального центра C-7 была предложена
на основании биогенетических соображений (рис. 11). Соединение 5 было названо оксирапентином F.
Пик HRESIMS [M–H]+ при m/z 309.1349 указывал на брутто-формулу соединения 6
как C16H22O6. Разница в молекулярной массе (42 единицы массы) между соединениями 6 и
10
5, а также данные ЯМР предполагают наличие гидроксильной группы в соединении 6
вместо ацетата в соединении 5. Это предположение подтверждается HMBCвзаимодействиями от 2-OH к C-1 (C 75.2), C-2 (C 70.3) и C-3 (C 34.6). Соединение 6 было названо оксирапентином G.
Брутто-формула соединения 7 была определена как C18H26O8 на основании пика
HRESIMS при m/z 393.1515 [M+Na]+ и данных 13C ЯМР. Основные сигналы спектров 1H и
13
C ЯМР (табл. 5) соединения 7 соответствовали оксирапентину F (5) за исключением
протонных и углеродных сигналов кольца B. Химические сдвиги C-4 (C 72.3) и C-5 (C
73.3), а также разница в молекулярной массе в 18 единиц массы между 7 и 5 указывали на
наличие виц диола вместо эпокси-группы в соединении 5. HMBC-взаимодействия от 4-OH
к C-4 и C-5, от 5-OH (δH 4.75) к C-4, C-5 и C-6 (C 75.2), от 6-OH к C-5 и C-6, от 7-OH к C1', C-6, C-7 и C-8 и от 8-OH к C-7, C-8 и C-9 (C 69.9) позволили установить положение
всех гидроксильных групп в молекуле соединения 7. Структура и относительные конфигурации стереоцентров соединения 7 были подтверждены рентгеноструктурным анализом
монокристалла, полученного перекристаллизацией из этилацетата (рис. 6).
Рисунок 6 – Общий вид молекулы оксирапентина H (7) по данным РСА.
Абсолютные конфигурации соединения 7 были определены как 2R, 4R, 5S, 6S, 7R,
8S, 9S на основании биогенетического родства с оксирапентинами B, F и G (рис. 11). Соединение 7 было названо оксирапентином H.
Брутто-формула соединения 8 была определена как C18H26O8 (подобно 7) на основании HRESIMS-пика при m/z 393.1508 [M+Na]+ и данных 13C ЯМР. Значительные отличия
данных 1H и 13C ЯМР по сравнению с оксирапентином H (7) наблюдались для C-2 (C
69.2), C-3 (C 28.8), C-4 (C 79.8), C-5 (C 68.9) и C-6 (C 74.3) атомов.
Рисунок 7 – Ключевые NOESY-корреляции
в оксирапентине I (8).
11
HMBC-корреляции от 2-OH к C-1 (C 75.0), C-2 и C-3, сдвиг сигнала ЯМР C-4 в слабое поле позволяют сделать вывод наличии ацетатной группы в соединении 7 при C-4,
вместо С-2, как в оксирапентине H.
NOESY-корреляции (рис. 7) H-2/H3-10, H3-11; H-6/5-OH; 2-OH/H3-10; H-9/H-3α, H311, 5-OH и 7-OH, а также КССВ протонов H-8 (H 3.95, дд, J = 6.4, 9.7 Гц) и H-9 (H 3.78, д,
J = 9.8 Гц) позволяют установить, что относительные конфигурации стереоцентров соединения 8 идентичны таковым в структуре оксирапентина H (7). Абсолютные конфигурации
стереоцентров соединения 8 предложены на основании биогенетических соображений
(рис. 11). Соединение 8 было названо оксирапентином I.
Брутто-формула соединения 9 была определена как C18H24O7 (идентично оксирапентину F (5)) на основании пика HRESIMS при m/z 375.1418 [M+Na]+ и данных 13C ЯМР.
Основные различия в спектрах ЯМР по сравнению с оксирапентином F наблюдались в
сигналах, относящихся к кольцу B. Спектры 1H и 13C ЯМР соединения 9 указывали на наличие одного четвертичного атома углерода при C 55.4 (C) и одного тризамещенного
эпокси-метина при H 3.60 и C 64.3 (д, 1JCH = 185.6 Гц).
COSY- и HSQC-спектры соединения 9 позволили выявить последовательности взаимодействующих протонов в кольце B: (–CHO (5)–CHO (6)–) и (–CHO (8)–CH (9)<). Эти
данные, а также HMBC-корреляции от H-2, H2-3 и H-9 к C-4 (C 71.1), от H2-3 к C-5 (C
72.1), от H-6 к C-4, C-5, C-7 (C 55.4), C-8 (C 64.3) и C-1' (C 83.0) и от H-8 к C-7, C-9 (C
72.7) и C-1' позволяют установить углеродный скелет соединения 9. Эти данные также
указывают на положение гидроксильных групп при C-4, C-5 и C-6 и позволяют определить положение эпоксида при C-7 и C-8. NOE-корреляции H-2 с H3-10 и H3-11 указывают
на β-ориентацию ацетата при C-2. Константа взаимодействия 2JH6-C5 (-2.3 Гц) указывает на
β-ориентацию H-5, в силу цис-взаиморасположения H-6 и 5-OH. α-Ориентации H-9 и
эпокси-группы и β-ориентации 4-OH, 6-OH и боковой цепи были предложены на основании биогенетического родства с оксирапентинами A–I (рис. 10). Соединение 9 было названо оксирапентином J.
Брутто-формула соединения 10 была определена как C18H24O7 на основании
HRESIMS-пика при m/z 375.1414 [M+Na]+ и данных 13C NMR. Сравнение спектров ЯМР
соединения 10 со спектрами оксирапентинов B и F позволяет обнаружить некоторые
сходства, включая две метильные (H 1.11, 1.43; C 21.8, 25.3), метиленовую (H 2.75, 1.59,
C 32.2) и ацетатную (H 2.08, C 169.8, 20.8) группы, подтверждающие, что соединение 10
содержит в своей структуре кольцо А идентичное таковому в структурах соединений 1 и
5. Анализ данных DEPT и HSQC выявил наличие двух третичных оксигенированных атомов углерода (C 62.5, 82.3), двух четвертичных метильных (H 1.42, 1.53; C 24.4, 27.9) и
двух оксигенированных метиновых (H 3.20, 4.70; C 56.7, 64.2) групп. Оставшиеся функциональности соответствуют сигналам при C 190.1 (C), 165.6 (C) и 111.0 (C), свидетельствуя о наличии тетразамещенного енонового хромофора.
Данные COSY и взаимные корреляции HMBC между метинами C-8 (C 64.2) и C-9
(C 69.9) и корреляции от H-2 (H 4.99) к C-4 (C 62.5) и H-3α (H 2.75) к C-4 и C-5 (C 56.7,
д, 1JCH = 184.2 Гц) позволяют определить положение гидроксильной группы при C-8 и
эпоксида при C-4–C-5. HMBC-взаимодействия от H3-4' (H 1.53) и H3-5' (H 1.42) к C-2' (C
47.3) и C-3' (C 82.3), от H2-2' к C-1' (C 190.1) и C-3', от H-2'β (H 1.59) к C-7 (C 111.0) и от
12
H-9 (H 4.25) к C-7, а также сдвиг в слабое поле сигнала C-6 (C 165.6) указывает на 6(7)ен-1'-оновое расположение тетразамещенного енона и позволяет полностью установить
структуру соединения 10. NOE-корреляции H-2/H3-10 (H 1.11) и H3-11 (H 1.43); H-3α (H
2.75) /H-9 и H-3β /H-5 (H 3.20) указывают на цис-сочленение колец A и B, β-ориентацию
ацетата и α-ориентацию эпокси-группы.
Рисунок 8 – Значения ∆δ (δSδR) (м.д.) для MTPA-эфиров оксирапентина K (10)
Обработка соединения 10 (R)- и (S)-MTPA-хлоридами привела к этерификации гидроксильной группы при C-8 и образованию (S)- и (R)-MTPA-эфиров 10a и 10b, соответственно. Разница в химических сдвигах Δδ(δS-δR) (рис. 8) указывает на 8R конфигурацию и
позволяет установить абсолютные конфигурации остальных стереоцентров соединения 10
как 2R, 4R, 5S, 9S. Эта стереоструктура не противоречит структурам биогенетической серии оксирапентинов (рис. 10). Соединение 10 было названо оксирапентином K.
Стоит отметить, что кроме новых оксирапентинов B–K (1–10) из гриба Isaria felina
также был выделен известный оксирапентин A (11), ранее выделявшийся японской группой из наземного изолята Beauveria felina (= I. felina). Структура оксирапентина A была
определена нами на основании данных РСА.
Брутто-формула соединения 12 была определена как C14H16O8 на основании пика
HRESIMS при m/z 335.0730 [M+Na]+. Анализ данных 1H и 13C ЯМР выявил наличие одной
метильной (H 2.05, C 20.7), двух метоксильных (H 3.81, 4.13; C 52.7, 63.6) и двух оксигенированных метиленовых групп (H 4.54 s, 2H, 5.06 s, 2H; C 54.4, 58.0), а также двух
четвертичных sp2-гибридизованных атома углерода (C 110.6, 120.5) и одной дизамещенной двойной связи (C 132.4, CH, 125.7, CH). Оставшиеся функциональности соответствуют углеродным сигналам при C 155.8 (C), 164.5 (C), 167.6 (C), 171.7 (C) и 172.4 (C), что
позволяет предположить наличие сложноэфирных или sp2-гибридизованных атомов углерода, связанных с кислородом. HMBC-взаимодействия от H-7 к C-4 (C 120.5), C-6 (C
155.8), C-8 (C 125.7) и C-9 (C 167.6), от H-8 к C-6, C-7 (C 132.4) и C-9, от H3-10 к C-9 и
от H2-5 к C-4 и C-6 выявляют положение основной боковой цепи. КССВ протонов H-7 (H
7.71, д, J = 15.5 Гц) и H-8 (H 6.70, д, J = 15.5 Гц) указывают на E-конфигурацию двойной
связи C-7–C-8. E-конфигурация была также установлена для двойной связи C-4–C-6 на
основании NOESY-корреляции между H-5 и H-7. HMBC-корреляции от H2-1 и H2-5 к C-1'
(C 171.7) (W-тип), от H2-1 к C-2 (C 164.5) и C-3 (C 110.6), от H3-2' к C-1' и от H3-2'' к C-1''
(C 172.4), а также слабопольные химические сдвиги C-1 (C 58.0) и C-5 (C 54.4) позволяют определить положение в пирановом кольце ацетатной и карбоксиметильной групп при
C-2 и C-3, соответственно, и установить структуру соединения 12. Соединение 12 было
названо исарикетидом A.
13
HO
2'
1''
4
3a 3
6
7a
O
2
1'
OH
3'
14
Пик HRESIMS при m/z 270.0743 [M+Na]+ позволил установить брутто-формулу соединения 13 как C12H14O7. Данные спектров 1H и 13C ЯМР соединения 13 были близки таковым для исарикетида A (12) за исключением отсутствия сигналов ацетата. На основании
этого структура соединения 13 была определена как деацетилированное производное исарикетида A. Соединение 13 получило название исарикетид B.
Брутто-формула соединения 14 была установлена как C12H14O3 на основании пика
HRESIMS с m/z 229.0840 [M+Na]+. 1H и 13C ЯМР-спектры соединения 14 содержат сигналы 1,2,4-тризамещенного бензольного кольца (H 7.53, 7.43, 7.28; C 119.7, 111.2, 123.5),
двух метильных (H 1.68 s, 6H; C 28.7) и гидроксиметильной (H 4.76; C 65.7) групп, четырех sp2-гибридизованных четвертичных атомов углерода (C 128.6, 135.6, 154.3, 163.7),
включая два оксигенированных атома, одного sp2-гибридизованного метинового атома углерода (H 6.57, C 100.3) и одного оксигенированного sp3-гибридизованного атома углерода (C 69.3). HMBC-взаимодействия (рис. 9) от H-3 к C-2 (C 163.7), C-3a (C 128.6) и C7a (C 154.3); от H-4 к C-3 (C 100.3), C-6 (C 123.5), C-3a и C-7a; и от H-6 к C-7a указывают на наличие в структуре соединения 14 бензофуранового ядра. Корреляции от H3-2' и
H3-3' к четвертичным атомам углерода при C 69.3 (C-1') и 163.7 (C-2) и от H-3 к C-1', а
также взаимные корреляции от H-4 и H-6 к C-1'' позволяют установить структуры и положение 2-гидроксиизопропильной и гидроксиметильной групп при C-2 и C-5, соответственно.
Рисунок 9 – Основные HMBC-взаимодействия в молекуле акремина S (14).
Эти данные выявили, что соединение 14 является структурным изомером бензофурана изоакремина D (18). Соединение 14 было названо акремином S.
Кроме соединений 1–14 из экстракта гриба Isaria felina были выделены известные
циклодепсипептиды исаридин E и изоисариин B. Эти пептиды ранее были описаны в наземном изоляте Isaria felina.
Предполагаемый путь биосинтеза
Ранее было показано, что многие грибные бензофураны образуются из ортопренилированных фенолов, которые могут являться продуктами как шикиматного, так и
полиацетатного пути биосинтеза. Мы предполагаем, что в случае оксирапентинов ортопренилированный фенольный предшественник i-1 окисляется и пренилируется с образованием дипренилгидрохинона i-2. Модификация одного из пренильных остатков происходит через окисленный интермедиат i-3, который под действием дегидрогеназы (DHG) и
ацетиленазы превращается в метилбутенинильную боковую цепь i-4. Хиноновое производное i-5, полученное из i-4, подвергается окислению монооксигеназой (MOG) с образованием триэпоксида i-6. Гидролиз эпоксида боковой цепи в i-7 с последующей циклизацией в пирановый цикл приводит к образованию оксирапентинового скелета в i-8. Ацилирование кетона i-8 приводит к оксирапентину A (11), а восстановление дает оксирапентин E
(4), который при при ацилировании образует оксирапентин B (1), а при селективном гидролизе эпоксидгидролазой (EHL) и ацилировании – оксирапентин J (9). Гидролиз обоих
эпоксидных циклов оксирапентина E через менее устойчивый карбокатион при C-8 при-
14
водит к полиолу i-9. В результате ацилирования i-9 по 4-OH, 6-OH или 8-OH с дальнейшей циклизацией ацетата на две других гидроксильных группы образуется оксирапентин
D (3). Согласно нашему предположению, последовательное действие EHL и редуктазы на
эпоксид при С-7–С-8 в i-8 приводит к интермедиату i-10, боковая цепь которого после
гидратации тройной связи циклизуется на гидроксил при С-6 с образованием оксирапентина K (10) (рис. 10). Предшественником оксирапентина K равновероятно может выступать пероксид i-11, образующийся при действии диоксигеназы (DOG) на двойную связь
С-7–С-8 (рис. 11). Оксирапентины с цис-диолами при С-7 и С-8 могут быть образованы
действием редуктазы на пероксид в i-11. Образующийся при этом оксирапентин G (6) является прямым предшественником оксирапентинов F (5) и I (8), а гидролиз EHL эпоксида
оксирапентина F приводит к образованию оксирапентина H (7).
OH
окисление
HO
пренилирование
HO
HO
H
OH
i-1
O
O
R
O
O
редуктаза
O
HO
R
O
i-3
i-6
O
O
HO
AcO
O
R
O
O
i-8
OH
OH
оксирапентин J (9)
OH
OH
O
HO
O
R
O
OH
O
i-10
гидрирование
циклизация
AcO
O
O
оксирапентин A (11)
O
O
EHL
i-4
1. EHL
R 2. диол-редуктаза
редуктаза
H
OH
O
i-5
EHL
DHG
ацетиленаза
HO
O
MOG
O
O
O
i-7
O
OH
i-2
O
O
R
OH O
O
R
HO
HO
OH
O
оксирапентин E (4)
AcO
OH
O
оксирапентин B (1)
O
O
оксирапентин K (10)
EHL
O
HO
H
OH
OH
R
OH
i-9
OH
OH
O
HO
H
OH
O
O
O
OH
оксирапентин D (3)
Рисунок 10 – Предполагаемая схема биосинтеза оксирапентинов A (11), B (1), D (3), E (4),
J (9) и K (10).
Образование оксирапентина C (2) также предполагается из предшественника i-1,
окисление которого происходит в орто-положение (относительно имеющегося гидроксила) с образованием дипренилированного о-резорцина i-12. Образование метилбутенинильной боковой цепи происходит сходным с описанным на рис. 15 путем. Кето-таутамер
i-14 под действием EHL превращается в триэпоксид i-15, который после частичного восстановления редуктазой дает диол i-16. Гидролиз i-16 EHL c образованием фуранового
кольца A и дальнейшее ацилирование приводит к образованию оксирапентина C (рис. 12).
15
Рисунок 11 – Предполагаемая схема биосинтеза оксирапентинов F–I (5–8).
Рисунок 12 – Предполагаемая схема биосинтеза оксирапентина C (2).
3.3. Установление строения индивидуальных соединений из гриба Aspergillus carneus
Гриб Aspergillus carneus был выделен из образца песчаного грунта, собранного в
Охотском море (восточно-сахалинский шельф).
Из гриба A. carneus были получены три новых соединения - варатерпол B (15), глицерилдиорциновая кислота (16) и декумбенон D (17). Совместо с ними также были выделены семь известных соединений: декумбенон B, версиол, этилаверантин, 6,8диметилаверуфин, стеригматоцистин, аверсин и радиклоновая кислота.
Брутто-формула соединения 15 была определена как C15H20O5 на основании пика
HRESIMS 281.1391 ([M–H]+), а также подтверждена данными 13C ЯМР. Спектр 1H ЯМР
соединения 15 содержит сигналы тризамещенного бензольного кольца (δH 7.24, 7.35, 7.42),
девяти алифатических протонов (δH 1.03, 1.15, 1.36, 1.40, 1.51, 1.78, 1.95, 3.25, 3.34) и двух
метильных групп (δH 0,82, 1.59). Данные 13C ЯМР указывают на наличие двух метильных
(δС 16.9, 28.8), четырех метиленовых групп (δС 22.5, 34.6, 43.7, 68.4), в том числе одной
оксигенированной (δС 68.4), одного sp3-гибридизованного метинового атома углерода (δС
36.8), трех метиновых (δС 118.6, 121.5, 127.6) и трех четвертичных ароматических атома
углерода (δС 133.2, 137.3, 156.8), оксигенированного четвертичного атома углерода (δС
77.9) и карбоксильной группы (δС 171.3).
Взаимодействия HMBC (рис. 13) от H-3 (δH 7.24) к С-1 (δС 156.8) и С-5 (δС 133.2), от
H-4 (δH 7.42) к С-2 (δС 137.3) и С-6 (δС 118.6) и от H-6 (δH 7.35) к C-2 и С-4 (δС 121.5), совместно с орто-КССВ между H-3 и H-4 (J3,4 = 8.0 Гц) устанавливают 1,2,5-тризамещенное
бензольное кольцо в структуре 15. HMBC-корреляции от H2-8 (δH 1.78, 1.95) к С-7 (δС
77.9), С-9 (δС 22.5) и С-14 (δС 28.8), от H2-10 (δH 1.03, 1.36) к С-8 (δС 43.7), С-9, С-11 (δС
36.8), С-12 (δС 68.4) и С-13 (δС 16.9), от H3-13 (δH 0.82) к С-10 (δС 34.6), С-11 и С-12 и от
H3-14 (δH 1.59) к C-7 и С-8 устанавливают структуру боковой цепи, метилированной по С7 и С-11. Присоединение боковой цепи при С-2 однозначно определяют HMBC-кросспики H-3/C-7 и H3-14/C-2. HMBC-взаимодействия от H-4 и H-6 к карбоксилу С-15 (δС
171.3) указывают на его положение при С-5. Сдвиг значений сигналов С-1, С-7 и СH2-12 в
слабое поле указывает на наличие в этих положениях гидроксильных групп.
16
Рисунок 13 – Основные HMBC-корреляции
в структуре варатерпола B (15).
Таким образом, плоская структура соединения 15 была установлена. Структура 15
очень близка структуре известного метаболита наземного Penicillium sp. варатерпола, содержащей гидроксиметиленовую группу вместо карбоксильной. Соединение 15 было названо варатерпол B.
(–)HRESIMS-пик (m/z 347.1136) соединения 16 соответствует брутто-формуле
C18H20O7, что подтверждается данными 13C ЯМР. Анализ спектра 1H ЯМР выявил наличие
пяти ароматических (δH 6.35, 6.36, 6.38, 6.45, 6.49), пяти алифатических протонов (δH 3.70,
3.80, 4.10, 4.43, 4.48), двух метильных (δH 2.30, 2.53) и одной карбоксильной группы (δH
11.4). В спектре 13C ЯМР также был обнаружен сигнал карбоксильной группы (δС 171.6), а
также сигналы двух метильных (δС 21.4, 24.5), двух метиленовых (δС 63.5, 66.0), алифатической (δС 70.1) и пяти ароматических метинов (δС 103.3, 105.1, 112.7, 113.1, 113.7) групп
и семи sp2-гибридизованных четвертичных атомов углерода (δС 106.6, 141.3, 143.6, 155.8,
156.6, 162.7, 165.3).
OH
HO
O
O
OH
COOH
Рисунок 14 – Ключевые HMBC-корреляции в
структуре глицерилдиорциновой кислоты (16)
Расщепление протонов H-2 (δH 6.36, т, J = 2.1 Гц), H-2' (δH 6.25, д, J = 2.3 Гц) и H-6'
(δH 6.38, д, J = 2.6 Гц) указывает на мета-расположение протонов H-2, H-4 и H-6 и H-2' и
H-6'. HMBC-корреляции (рис. 14) от H-2 к С-1 (δС 155.8), С-3 (δС 156.6), C-4 (δС 112.7) и C6 (δС 113.7), от H-4 к C-3 и C-5 (δС 141.3), от H-6 к C-1, C-5 и C-7 и от H3-7 к С-4 и С-6 позволили установить орциновый фрагмент молекулы 16. Остаток о-орселлиновой кислоты
в структуре 16 был установлен на основании HMBC-взаимодействий H-2' с C-1' (δС 162.7),
C-3' (δС 165.3), C-4' (δС 106.6) и C-6' (δС 113.1), H-6' с C-1' и C-4', H3-7' с C-4', C-5' (δС
143.6), C-6' и С-8' (δС 171.6) и 8'-COOH с C-3' и C-4'. Корреляции от H2-1'' к C-2'' (δС 70.1) и
от H-2'' к C-3'' (δС 66.0) позволили определить глицериновый фрагмент в структуре молекулы 16. Присоединение орцина и глицерина к о-орселлиновой кислоте через C-1–O–C-1'
и C-1''–O–C-3', соответственно, однозначно устанавливается HMBC-кросс-пиками H-2/C1', H-2'/C-1 и H2-1''/C-8'.
Таким образом была установлена структура соединения 16, которое было названо
глицерилдиорциновой кислотой.
Брутто-формула соединения 17 была определена как C18H28O4 на основании
HRESIMS-пика m/z 331.1883 [M+Na]+ и подтверждена данными спектра 13C ЯМР.
Спектральные характеристики соединения 17, а также HMBC-корреляции (рис. 15)
практически полностью соответствовали известному декумбенону A за исключением протонных и углеродных сигналов CH2-1 (δС 67.8, δH 3.65, 3.95) и CH2-2 (δС 40.5, δH 2.33,
3.37). Данные COSY-спектра указывают на наличие системы спин-спинового взаимодействия протонов (–СH2O(1')–CH3(2')). Положение этоксила при С-1 определяется взаимными HMBC-корреляциями между метиленами C-1 и С-1'. Таким образом, структура соеди-
17
нения 17 соответствовала 1-O-этилдекумбенону A. Соединение было названо декумбеноном D.
Рисунок 15 – Основные HMBC-корреляции
в структуре декумбенона D (17).
Остальные метаболиты A. carneus согласно полученным ЯМР-данным идентифицированы с известными грибными терпеноидами декумбеноном B и версиолом и поликетидами этилаверантином, 6,8-диметилаверуфином, стеригматоцистином, аверсином и радиклоновой кислотой. Радиклоновая кислота ранее не описывалась для грибов рода
Aspergillus.
3.4. Установление строения индивидуальных соединений из гриба
Myceliophthora lutea
Штамм гриба Myceliophthora lutea был выделен из образца грунта, собранного в Сахалинском заливе Охотского моря.
Из гриба M. lutea при культивировании на агаризованном пивном сусле был выделен
новый изоакремин D (18) и известный акремин A (19). Также были получены два новых
продукта самоциклизации акремина A – спироакремины A (19-1) и B (19-2), являющиеся
артефактами выделения.
Брутто-формула изоакремина D (18) была определена как C12H14O3 на основании
EIMS высокого разрешения и подтверждена данными спектров 13C ЯМР.
Спектр 1Н ЯМР соединения 18 содержит три 3Н-синглетных сигнала в области
δH 1.55-2.27 м.д., что указывает на присутствие в его структуре трех четвертичных метильных групп. Присутствующие в спектре синглетные сигналы при δH 6.45, 6.92, 7.15
м.д., интенсивностью один протон каждый, были отнесены сигналам ароматических протонов.
Данные DEPT и HSQC-спектров подтверждают наличие трех метильных групп (δС
17.6, 31.0, 31.0), а также указывают на присутствие трех метиновых групп (δС 101.2, 106.5,
113.4). Остальные шесть атомов углерода были отнесены к четвертичным атомам (δС
165.9, 153.0, 150.8, 128.6, 123.1, 69.7).
Положение метильной группы 1'' (δС 17.6, δН 2.27) при С-6 было установлено
НМВС-взаимодействиями H3-1'' с С-5 (δС 153.0 м.д.), С-6 (δС 123.1) и С-7 (δС 113.4). Синглеты H3-2' и H3-3' были отнесены к геминальным метильным группам на основании взаимных НМВС-корреляций друг с другом и корреляций от метильных протонов к четвертичному углероду С-1' (δС 69.7 м.д.), связанному с кислородом. Значения сигналов углеродных атомов С-2 (δС 165.9) и С-7а (δС 150.8) в 13С ЯМР-спектре соединения 18 указывают на связь этих атомов с атомом кислорода. Положение двух гидроксильных групп при
С-1' и С-5 однозначно устанавливается НМВС-взаимодействиями от протонов гидро-
18
ксильных групп к соответствующим атомам углерода. Эти данные позволяют сделать вывод, что соединение 18 является 2-(1'-гидрокси-1'-метилэтил)-6-метилбензофуран-5-олом.
Анализ литературных данных, выявил, что спектральные характеристики соединения 339 близки к таковым известного акремина D (спектры 1H ЯМР полностью совпадают), выделенного итальянскими учеными из гриба Acremonium bissoides. Более того
структурная формула, приписываемая итальянскими авторами для акремина D полностью
совпадает со структурой соединения 18. Тем не менее, значительные отличия данных
спектров 13C ЯМР для соединения 18 и акремина D, а также существенная разница в температурах плавления этих веществ (соединение 18 – 260–262 oC, акремин D – 142–145 oC)
позволяют утверждать, что соединение 18 является новым, и оно было названо изоакремином D.
По данным масс-спектрометрии высокого разрешения (HREIMS), молекулярный
ион соединения 19 имеет массу 226.1221, что соответствует брутто-формуле C12H18O4.
1''
HO
6
1
O
5
OH
4
3
2'
2
1'
19
4'
3'
OH
5'
Близкие значения сигналов протонов и углеродных атомов в 1H и 13C ЯМР спектрах соединения 19 и акремина А из Acremonium bissoides, а также данные рентгеноструктурного анализа для соединения 19 указывали на идентичность этих соединений.
Следует отметить, что при хранении акремина А (19) в хлороформе на свету происходит образование двух новых соединений – спироакреминов А (19-1) и В (19-2). В то
же время при хранении акремина A в хлороформе в темноте подобного превращения не
происходит. По-видимому, под действием света происходит фотохимическая реакция,
приводящая к изменению конфигурации двойной связи, что делает возможным дальнейшую циклизацию. Хлороформ является донором протонов, необходимых для циклизации.
Гидроксильный кислород боковой цепи атакует электрон-дефицитный енонный углерод
С-5 с образованием спиросоединений 19-1 и 19-2.
Брутто-формула соединения 19-1 была определена на основании данных массспектра высокого разрешения и спектров ЯМР 1H и 13C. Анализ 1H и 13C и DEPT-спектров
соединения 19-1 доказывают существование карбонильной группы (δС 211.2), трех четвертичных атомов углерода, связанных с кислородными функциями (δС 90.0, 95.7, 76.5), двух
метиленовых (δС 49.2, 44.6), одной оксиметиленовой (δС 70.4) и трех метильных групп (δС
25.9, δН 1.39; δС 28.6, δН 1.31; δС 29.9, δН 1.30). Спектральные данные указывают на присутствие в структуре соединения 19-1 одной дизамещенной двойной связи (δС 138.4, δН
5.88; δС 128.9, δН 5.61) и соответствуют бициклической структуре соединения.
1
H-1H COSY ЯМР-спектр позволил идентифицировать две спин-спиновые системы,
соответствующие C-11/C-3/C-4 и C-13/C-9/C-10 фрагментам в соединении 19-1. HMBCкорреляции H3-13/C-7, С-8 и С-9; H2-6/C-5, C-7 и C-10 устанавливают структуру циклогексанонового фрагмента 19-1 и положение гидроксильной и карбонильной групп при C-7 и
C-8, соответственно. Корреляции от Н-3 к C-5 (δС 95.7), от H-6β к C-8 (δС 76.5), и от H2-6 к
C-4 подтверждают существование спироциклической системы в соединении 19-1. Константа спин-спинового взаимодействия между H-3 и H-4 (J3,4 = 5.9 Гц) является типичной
для цис-двойной связи в пятичленном цикле.
Относительные конфигурации асимметрических атомов углерода в 19-1 были определены на основании NOESY-экспериментов и значений констант спин-спинового взаимодействия соответствующих протонов. NOESY-корреляции H-3/H-4, H3-11, H3-12; H4/H-6α, H-10; H-10/H3-13, а также значение КССВ протонов Н-10 и Н-9 (2J9,10 = 4.7 Гц)
19
подтверждают, что шестичленный цикл в 19-1 существует в конформации псевдо-кресла,
в котором H-6α, H-10 и H3-13 находятся в аксиальном положении.
–0.01
–0.21
–0.07
OR
+0.28
+0.51
HO
O
+0.02
+0.05
+0.08
O
+0.20
19-1a R = (S)-MTPA
19-1b R = (R)-MTPA
А
Б
Рисунок 16 – Разница в химических сдвигах между (S)-и (R)-MTPA эфирами
(А) спироакремина А (19-1) и (Б) спироакремина B (19-2).
Абсолютная конфигурация стереоцентров соединения 19-1 была установлена по методу Мошера. Этерификация 19-1 (R)- и (S)-MTPA-хлоридами по гидроксильной группе
при С-10 привела к образованию (S)- и (R)-MTPA эфиров, 19-1а и 19-1b, соответственно.
Разница в химических сдвигах (ΔδS-δR) в протонных спектрах эфиров (рис. 16А) указывает
на 10S конфигурацию, а, следовательно, с учетом указанных ранее NOESYвзаимодействий, углеродные атомы С-5 и С-8 должны иметь S и R конфигурации, соответственно. Cоединение 19-1 было названо спироакремином A.
Соединение 19-2 подобно спироакремину A (19-1) имело брутто-формулу C12H18O4,
рассчитанную на основании данных HREIMS. Анализ спектральных данных соединения
19-2 и сравнение их с данными для спироакремина A указывает на присутствие в 19-1 такого же спиро[4,5]деценового скелета.
Абсолютная конфигурация хиральных центров соединения 19-2 подобно спироакремину A установлена на основании метода Мошера (рис. 16Б). NOE-взаимодействие между Н-4 и H-9β в эфирах 19-2a и 19-2b указывает на R конфигурацию С-5. Таким образом,
было установлено, что соединение 19-2 является эпимером спироакремина A по спиростереоцентру. Соединение 19-2 получило название спироакремин B.
3.5. Установление строения индивидуальных соединений из гриба
Aspergillus versicolor
Изолят гриба Aspergillus versicolor был выделен из образца донных осадков, собранного в Сахалинском заливе Охотского моря.
При культивировании гриба A. versicolor на рисовой и кукурузной средах был выделен новый меротерпеноид аспердемин (20).
Брутто-формула соединения 20 была определена как C21H28O7 на основании данных
HRESIMS и была подтверждена анализом спектров ЯМР 13С.
Данные 1Н и 13C ЯМР, DEPT и HSQC-спектров 20 указывают на наличие пяти метильных (δС 15.4, 19.0, 21.7, 25.9, 33.1 м.д.), трех метиленовых (δС 16.1, 39.2, 46.3 м.д.) и
пяти метиновых групп (δС 43.2, 49.1, 67.5, 68.0, 99.9 м.д.). Остальные восемь атомов углерода были отнесены к четвертичным (δС 171.3, 163.6, 161.9, 159.9, 97.0, 84.8, 80.0, 43.9
м.д.).
Частичные структуры a и b для 20 были определены в результате анализа данных
1
Н-1Н COSY и НМВС-экспериментов (рис. 17).
НМВС-корреляции метиленового протона H2-11α к С-8, С-9 (δС 43.2), С-12 (δС 97.0)
и С-16 (δС 161.9) указывают на то, что С-11 (δС 16.1) является связующим атомом между
фрагментами a и b.
Между C-8 и C-16 располагается пирановый кислород, что подтверждается сигналами двух атомов углерода в области слабого поля (δС 80.0 и 161.9 м.д., соответственно). Таким образом, была получена полная плоская структура соединения 20.
20
Относительная стереохимия соединения 20 была определена на основании данных
COSY- и ROESY-экспериментов (рис. 18).
O
O
13
12
OH 19
O
2
3
O
4
10
5
21
H
6
H
20
18
9
1
A
11
D
15
16
O
8
7
OH
20
17
14
Рисунок 17 – Фрагменты структуры аспердемина (20).
Ключевые HMBC- (стрелки) и COSY-взаимодействия
(жирные линии).
ROESY-корреляции от Н3-19 к Н2-2β и Н3-21 и от Н3-20 к Н-5 устанавливают транссочленение колец А и В. Это подтверждается дальними COSY-взаимодействиями от Н-5 к
Н3-19 и Н3-21.
Кросс-пики Н3-19/6-ОН и Н3-19/Н3-18 указывают на то, что эти группы находятся по
одну сторону молекулы. На основании этих данных, а также корреляций от Н-5 к Н-9, и
дальних COSY-взаимодействий между Н-9 и Н3-18, Н3-19 сочленение колец В и С было
установлено как транс.
Рисунок 18 – А. Основные ROESY-взаимодействия в молекуле аспердемина (20)
Б. Значения Δδ (δS – δR) (Гц) для MTPA-эфиров аспердемина (20)
Абсолютная конфигурация соединения 20 была установлена с помощью модифицированного метода Мошера. Взаимодействие с (R)- и (S)-MTPA-хлорангидридами привело
к этерификация гидроксильной группы при С-1 с образованием (S)- и (R)-MTPA-эфиров,
соответственно. Разница значений химических сдвигов для S- и R-МТРА эфиров
(рис. 18Б) позволила определить конфигурацию C-1, как S. Учитывая данные ROESYэкспериментов, конфигурации остальных асимметрических центров были установлены
как 5(S), 6(R), 8(R), 9(R), 10(R). Соединение 20 было названо аспердемином.
Кроме аспердемина (20) из гриба Aspergillus versicolor были выделены два известных соединения – диорцин и виридикатол. Оба метаболита ранее были описаны для многих грибов рода Aspergillus, в том числе Aspergillus versicolor.
3.6. Установление строения индивидуальных соединений из гриба Curvularia
inaequalis
Изолят гриба Curvularia inaequalis был выделен из образца грунта, собранного в
Охотском море у побережья о. Шикотан.
21
Из этилацетатного экстракта гриба C. inaequalis, культивированного на среде агризованном пивном сусле были выделены шесть известных соединений – (+)-фомалактон,
курвулапирон, радицинин, (–)-асперпентин и цинодонтин.
Структурная индентификация соединений была проведена на основании данных одно- и двумерной ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Абсолютная конфигурация
стереоцентров (–)-асперпентина была подтверждена методом Мошера.
3.7 Установление строения индивидуальных соединений из гриба Wardomyces inflatus
Штамм гриба Wardomyces inflatus был изолирован из образца грунта, собранного в
Сахалинском заливе Охотского моря.
Из гриба W. inflatus при культивировании на агаризованном пивном сусле было
выделено одно известное соединение – эуяваникол A.
Структурная индентификация эуяваникола А была проведена на основании данных
одно- и двумерной ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Абсолютная конфигурация всех хиральных центров эуяваникола А была подтверждена методом Мошера.
3.8. Установление строения индивидуальных соединений из гриба Penicillium citrinum
Изолят гриба Penicillium citrinum был выделен из образца грунта, собранного при
кернении метановых газогидратных залежей в Охотском море.
Из гриба P. citrinum был выделен один известный метаболит – 3,5-диметил-8метокси-3,4-дигидро-1Н-изохромен-6-ол.
Структурная индентификация соединения была проведена на основании данных одно- и двумерной ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.
3.9. Установление строения индивидуальных соединений из гриба
Acremonium roseum
Изолят гриба Acremonium roseum был выделен из образца грунта, собранного в заливе Пильтун Охотского моря.
Из гриба A. roseum, культивированного на рисовой среде, были получены два известных стероида – пероксид эргостерина и эргост-6,8,22-триен-3β-ол.
Структурная индентификация соединений была проведена на основании данных
одно- и двумерной ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии.
3.10 Биологическая активность выделенных соединений
Биологическая активность метаболитов Isaria felina.
Показано, что оксирапентины A и D ингибируют рост грамположительных бактерий
(Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis) с МИК 150 и 140 мкМ, соответственно.
Исарикетид A проявил цитотоксическое действие на клетки THL-1 и HL-60 с ИК50
37.4 и 4.3 мкМ, что сравнимо с активностью цисплатина, использованного в качестве положительного контроля.
Оксирапентин A проявил умеренное цитотоксическое действие против клеток SKMel-5, SK-Mel-28, T-47D с ИК50 19, 17 и 25 мкМ, соответственно, что в 7-15 раз ниже, чем
показано для цисплатина.
Оксирапентины A, D, F и J на 100% ингибировали образование колоний клеток SKMel-28 в субцитотоксических концентрациях (10, 200, 200 и 100 мкМ, соответственно).
Вещество сравнения дакарбазин в концентрации 200 мкМ не показал значительного влияния на образование колоний клеток.
Для оксирапентина J показана способность индуцировать экспрессию белка теплового шока Hsp70 в концентрации 100 мкМ.
Биологическая активность метаболитов Aspergillus carneus.
Показано, что этилаверантин и 6,8-ди-O-метилаверуфин ингибируют рост клеток
карциномы Эрлиха с ЭД50 15.8 и 47.8 мкМ, соответственно.
22
Для стеригматоцистина показано цитостатическое действие на яйцеклетки морских
ежей. В концентрации от 71.0 мкМ стеригматоцистин на 100% останавливал развитие оплодотворенных яйцеклеток на стадии 4 бластомера.
Биологическая активность метаболитов Myceliophthora lutea.
Показано, что изоакремин D токсичен в отношении бактерии Staphylococcus aureus с
МИК 970.9 мкМ).
Впервые показано ингибирующее влияние изоакремина D, акремина А и спироакреминов A и B на оплодотворяющую способность сперматозоидов морского ежа (ИК50 =
194.2, 221.2, 66.4 и 132.7 мкМ, соответственно).
Цитостатическую активность в отношении яйцеклеток Strongylocentrotus intermedius
показал изоакремин D. При действии его в концентрации 242.7 мкМ только 35-50 % эмбрионов проходили стадию бластулы.
Биологическая активность метаболитов Aspergillus versicolor.
Показано ингибирующее влияние диорцина (ИК50 0.078 мМ) на оплодотворяющую
способность сперматозоидов морских ежей Strongylocentrotus intermedius.
Для диорцина была также определена цитотоксическая активность в отношении клеток селезенки мышей линии CD-1 с МИК 0.11 мМ.
Биологическая активность метаболитов Curvularia inaequalis.
(+)-Фомалактон, курвулапирон и радицинин проявили цитотоксическое действие
против клеток карциномы Эрлиха при ЭД50 138, 264 и 198 мкМ, соответственно.
Биологическая активность метаболитов Wardomyces inflatus.
Эуяваникол А проявил слабое цитотоксическое действие на развивающиеся эмбрионы морских ежей Strongylocentrotus intermedius, в концентрации 13.9 мкМ оказав 100 %
ингибирование деления оплодотворенных яйцеклеток ежа на стадии 4-х бластомеров.
ВЫВОДЫ
1. Из грибов-микромицетов, выделенных из образцов грунта, собранных в Охотском
и Южно-Китайском морях отобраны восемь перспективных штаммов-продуцентов
вторичных метаболитов: Isaria felina КММ 4639, Aspergillus carneus,
Myceliophthora lutea, A. versicolor КММ 4647, Curvularia inaequalis, Wardomyces
inflatus, Penicillium citrinum и Acremonium roseum.
2. Выделено 40 индивидуальных соединений различной химической природы. Установлено строение 18 новых низкомолекулярных вторичных метаболитов. Проведена структурная идентификация 22 метаболитов с известными веществами.
3. Установлено строение 10 новых хроменовых производных оксирапентинов B–K,
двух пирановых поликетидов исарикетидов A и B и бензофурана акремина S из
гриба I. felina. Показано наличие редкой для природных соединений 4,6,8ортоацетатной группы в структуре оксирапентина D. Предложена возможная схема
биосинтеза оксирапентинов A–K и акремина S из общего пренилфенольного предшественника, а также исарикетидов A и B из предполагаемого пентакетидного
предшественника.
4. Установлено строение двух новых поликетидов варатерпола B и глицерилдиорциновой кислоты и нового декалинового производного декумбенона D из гриба
Aspergillus carneus. Глицерилдиорциновая кислота является первым глицериновым
производным орциновых эфиров.
5. Установлено строение нового бензофуранового производного изоакремина D из
гриба M. lutea.
6. Установлено строение нового меротерпеноида аспердемина из гриба A. versicolor.
7. Показано, что метаболит I. felina исарикетид A обладает цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток HL-60 и THP-1, сопоставимой с активностью
цисплатина.
23
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Основные публикации по теме диссертации
Сметанина О.Ф., Калиновский А.И., Кича А.А., Юрченко А.Н., Пивкин М.В., Кузнецова Т.А. Производное дегидродекалина из морского изолята гриба Wardomyces
inflatus // Химия природ. соединений. 2009. № 5. С. 621–631.
Юрченко А.Н., Сметанина О.Ф., Калиновский А.И., Пивкин М. В., Дмитренок П.
С., Кузнецова Т. А. Новый меротерпеноид из морского гриба Aspergillus versicolor
(Vuill.) Tirab. // Изв. АН Сер. хим. 2010. № 4. С. 834–838
Сметанина О.Ф., Юрченко А.Н., Пивкин М.В., Юрченко Е.А., Афиятуллов Ш.Ш.
Изохроменовый метаболит факультативного морского гриба Penicillium citrinum //
Химия природ. соединений. 2011. № 1. С. 106
Сметанина О.Ф., Юрченко А.Н., Калиновский А.И., Бердышев Д.В., Герасименко
А.В., Пивкин М. В., Слинкина Н.Н., Дмитренок П. С., Мензорова Н.И., Кузнецова
Т. А. Биологически активные метаболиты морского изолята гриба Myceliophthora
lutea // Химия природ. соединений. 2011. № 3. С. 345–349.
Smetanina O.F., Yurchenko A.N., Afiyatullov Sh.Sh., Kalinovsky A.I., Pushilin M.A.,
Khudyakova Yu.V., Slinkina N.N., Ermakova S.P., Yurchenko E.A. Oxirapentyns B-D
produced by a marine sediment-derived fungus Isaria felina (DC.) Fr. // Phytochem. Lett.
2012. V. 5. P. 165–169.
Юрченко А.Н., Сметанина О.Ф., Худякова Ю.В., Киричук Н.Н., Афиятуллов
Ш.Ш. Тритерпеноидные метаболиты морского изолята гриба Acremonium roseum
Petch. // Химия природ. соединений. 2012. № 6. С. 982–983
Юрченко А.Н., Сметанина О.Ф., Худякова Ю.В., Киричук Н.Н., Юрченко Е.А.,
Афиятуллов Ш.Ш. Метаболиты морского изолята гриба Curvularia inaequalis //
Химия природ. соединений. 2013. № 1. С. 144–145
Юрченко А.Н., Сметанина О.Ф., Худякова Ю.В., Киричук Н.Н., Чайкина Е.Л.,
Анисимов М.М., Афиятуллов Ш.Ш. Новый оксирапентин E из морского изолята
гриба Isaria felina // Химия природ. соединений. 2013. № 5. С. 738–740
Yurchenko A.N., Smetanina O.F., Kalinovsky A.I., Pushilin M.A., Glazunov V.P.,
Khudyakova Y.V., Kirichuk N.N., Ermakova S.P., Dyshlovoy S.A., Yurchenko E.A.,
Afiyatullov S.S. Oxirapentyns F-K from the Marine-Sediment-Derived Fungus Isaria
felina KMM 4639 // J. Nat. Prod. 2014. V. 77, No. 6. P. 1321–1328.
Тезисы докладов
1. Юрченко А.Н., Сметанина О.Ф. Новые оксирапентины B-G из факультативного
морского гриба Isaria felina KMM 4639 // XIV Всероссийская молодежная школаконференция по актуальным проблемам химии и биологии. МЭС ТИБОХ, 11-18
сентября 2012 г.: сборник трудов. Владивосток: ДВО РАН, 2012. С. 68.
2. Yurchenko A.N., Smetanina O.F., Kalinovsky A.I., Ermakova S.P., Afiyatullov Sh.Sh.
New oxirapentyns B-G from marine-derived fungus Isaria felina KMM 4639 // IV Annual Russian-Korean Conference “Current Issues of Natural Products Chemistry and Biotechnology”, Novosibirsk, 18-21 of September, 2012: book of abstracts. Novosibirsk,
2012. P. 68
3. Yurchenko A.N., Smetanina O.F., Kalinovsky A.I., Ermakova S.P., Afiyatullov Sh.Sh.
Biologically active compounds from marine-derived fungi from the South China Sea //
2nd International workshop on marine bioresources of Vietnam, Hanoi, 5-6 of June,
2013: book of abstracts. Hanoi, 2013. P. 82–86
4. Yurchenko A.N., Smetanina O.F., Kalinovsky A.I., Kirichuk N.N., Afiyatullov Sh.Sh.
Biologically active substances from marine-derived fungi from far eastern seas // 2nd International Symposium on Life Sciences, Vladivostok, September 4-9, 2013:
Programm&Abstracts. Vladivostok: Dalnauka, 2013. P. 34.
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа