close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Специальное предложение Термальный курорт;pdf

код для вставкиСкачать
РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ
(19)
RU
(11)
2 508 543
(13)
C1
(51) МПК
G01N 33/48
(2006.01)
ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ
(12) ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ
(21)(22) Заявка: 2012139991/15, 18.09.2012
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
18.09.2012
Приоритет(ы):
(22) Дата подачи заявки: 18.09.2012
C 1
2 5 0 8 5 4 3
R U
(54) СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РАЗВИТИЯ ТРОМБОЦИТОПЕНИИ В ТЕЧЕНИИ
ХРОНИЧЕСКОГО ЛИМФОЛЕЙКОЗА
(57) Реферат:
Изобретение
относится
к
области
медицинской
диагностики,
может
быть
использовано для прогнозирования риска
развития
тромбоцитопении
в
течение
хронического лимфолейкоза.
Способ прогнозирования риска развития
тромбоцитопении в течение хронического
лимфолейкоза включает выделение ДНК из
периферической венозной крови, анализ
полиморфизмов -889С/Т гена интерлейкина 1А
и
VNTR
антагониста
рецептора
интерлейкина 1. Прогнозируют повышенный
риск развития тромбоцитопении в течение
хронического
лимфолейкоза
в
случае
выявления аллеля -889Т IL-1A и/или аллеля ILIRa∗1. 1 табл., 4 ил.
(56) (продолжение):
and cytokine gene polymorphisms in chronic lymphocytic leukemia: correlation with prognostic parameters. //
Haematologica. 2000 Jun - V.85(6) - P.600-606. WU K.H. et.al. Interleukin-1 beta exon 5 and interleukin-1
receptor antagonist in children with immune thrombocytopenic purpura. // J Pediatr Hematol Oncol. 2007 May V.29(5) - P.305-308. БАКИРОВ Б.А. и др. Полиморфизм генов регуляторов апоптоза и факторов
роста у больных хроническим лимфолейкозом // Саратовский научно-медицинский журнал, 2011, т.7,
№4, с.827-831. Rocha A.M. et.al. IL1RN VNTR and IL2-330 polymorphic genes are independently associated
with chronic immune thrombocytopenia. // Br J Haematol. 2010 Sep - V.150(6) - P.679-684.
Ñòð.: 1
ru
C 1
Адрес для переписки:
308015, г.Белгород, ул. Победы, 85, БелГУ,
отдел интеллектуальной собственности, Т.М.
Токтаревой
2 5 0 8 5 4 3
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: RU 2248574 C1, 20.03.2005. RU 2256921 C1,
20.07.2005. ВОЛКОВА М.А. Хронический
лимфолейкоз и его лечение // Лечащий Врач,
2007, №4. [он-лайн] [найдено 28.05.2013].
Найдено в Интернет <URL: http://www.
lvrach.ru /2007/04/4535099/>. HULKKONEN J.
et.al. Interleukin-1 beta, interleukin-1 receptor
antagonist and interleukin-6 plasma levels (см.
прод.)
(73) Патентообладатель(и):
Федеральное государственное автономное
образовательное учреждение высшего
профессионального образования
"Белгородский государственный
национальный исследовательский
университет" (RU)
R U
(45) Опубликовано: 27.02.2014 Бюл. № 6
(72) Автор(ы):
Чурносов Михаил Иванович (RU),
Сиротина Светлана Сергеевна (RU),
Тикунова Татьяна Сергеевна (RU),
Полоников Алексей Валерьевич (RU)
RUSSIAN FEDERATION
(19)
RU
(11)
2 508 543
(13)
C1
(51) Int. Cl.
G01N 33/48
(2006.01)
FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY
(12) ABSTRACT
OF INVENTION
(21)(22) Application: 2012139991/15, 18.09.2012
(72) Inventor(s):
Churnosov Mikhail Ivanovich (RU),
Sirotina Svetlana Sergeevna (RU),
Tikunova Tat'jana Sergeevna (RU),
Polonikov Aleksej Valer'evich (RU)
(24) Effective date for property rights:
18.09.2012
Priority:
(22) Date of filing: 18.09.2012
(57) Abstract:
FIELD: medicine.
SUBSTANCE: method for the prediction of a risk
of the thrombocytopenia development accompanying
the clinical course of chronic lymphatic leukaemia
involves the DNA recovery from peripheral venous
blood, the analysis of interleukin 1A - 889C/T gene
R U
2 5 0 8 5 4 3
and interleukin 1 receptor antagonist VNTR
polymorphisms.
EFFECT: high risk of the thrombocytopenia
development accompanying the clinical course of
chronic lymphatic leukaemia is predicted if an allele
has been detected.
1 tbl, 4 dwg
Ñòð.: 2
en
C 1
C 1
(54) METHOD FOR PREDICTION OF RISK OF THROMBOCYTOPENIA DEVELOPMENT
ACCOMPANYING CLINICAL COURSE OF CHRONIC LYMPHATIC LEUKAEMIA
2 5 0 8 5 4 3
Mail address:
308015, g.Belgorod, ul. Pobedy, 85, BelGU, otdel
intellektual'noj sobstvennosti, T.M. Toktarevoj
R U
(45) Date of publication: 27.02.2014 Bull. 6
(73) Proprietor(s):
Federal'noe gosudarstvennoe avtonomnoe
obrazovatel'noe uchrezhdenie vysshego
professional'nogo obrazovanija "Belgorodskij
gosudarstvennyj natsional'nyj issledovatel'skij
universitet" (RU)
RU 2 508 543 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть
использовано для прогнозирования риска развития тромбоцитопении в течение
хронического лимфолейкоза.
Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) представляет собой доброкачественную опухоль,
ее субстрат составляют преимущественно морфологически зрелые лимфоциты.
Болезнь проявляется лимфатическим лейкоцитозом, диффузной лимфоцитарной
пролиферацией в костном мозге, увеличением лимфатических узлов, селезенки и
печени [1].
Течение хронического лимфолейкоза характеризуется развитием различных
осложнений [2]. Наиболее частыми его осложнениями являются цитопенические
синдромы, такие как анемия и тромбоцитопения. Цитопенические осложнения при
ХЛЛ чаще обусловлены нарушениями иммунной системы, при которых иммунная
система больного атакует и разрушает собственные клетки крови. Связь между
продолжительностью жизни пациентов и цитопеническими осложнениями очевидна.
При тромбоцитопении (13-15% случаев) возникают кровотечения и или кровоизлияния
в головной мозг, становящихся причиной смерти больных [3].
Как свидетельствуют результаты ряда исследований, значимую роль в развитии
цитопенических осложнений хронического лимфолейкоза играют генетические
факторы. Среди генов-кандидатов, регулирующих, преимущественно, процессы
неспецифической защиты организма, клеточной пролиферации, гемопоэза и апоптоза
важное значение имеют гены интерлейкинов, в частности интерлейкин 1A и
антагонист рецептора интерлейкина 1 [4].
Интерлейкин 1A или IL-1A - цитокин с широким диапазоном биологических и
физиологических эффектов. Этот цитокин полифункционален и выполняет не менее 50
различных функций, мишенями которых служат клетки практически всех органов и
тканей. IL-1A состоит из 271 аминокислотного остатка с молекулярной массой 17 кДа.
Ген, кодирующий IL-1A, картирован на длинном плече хромосомы 2, в промоторной
части которого в положении -889 находится однонуклеотидная замена (-889C/T) [5].
Антагонист рецептора интерлейкина 1 или IL-1Ra был впервые выделен из
культуральной среды стимулированных моноцитов и обладал способностью
ингибировать действие IL-1 на лимфоциты и фибробласты путем блокирования
связывания IL-1 с клеточными рецепторами. Ген, кодирующий IL-1Ra, картирован на
длинном плече хромосомы 2 в области q14. В гене IL-1Ra известен минисателлитный
полиморфизм - вариабельность по числу 86-членных тандемных повторов VNTR во 2м интроне, который предполагает существование пяти аллелей, каждому из которых
соответствует определенное число повторов. Наиболее часто встречаются аллель IL1Ra∗1, содержащий 4 повтора у 71% населения, и аллель IL-1Ra∗2, содержащий 286членных повтора у 23% населения. Оставшиеся же аллели встречаются менее чем в 5%
случаев [6].
Известен метод для диагностики и прогнозирования онкологических заболеваний,
основанный на изучении соматических мутаций в гене многофункционального
опухолевого супрессора (MTS) в случае неоплазий человека. Патент США №2164419,
27.03.2001. «Ген MTS, Мутации данного гена и способы диагностики
злокаческтвенных опухолей с использованием последовательности гена MTS»
(Мириад Дженетикс, инк. (US) и др). Изобретение относится к мутациям гена MTS в
зародышевой линии и использованию данных мутаций для диагностики
предрасположенности к таким формам рака, как меланома, окулярная меланома,
лейкоз, астроцитома, глиобластома, лимфома, глиома, лимфома Ходжкина,
Ñòð.: 3
DE
RU 2 508 543 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
множественная миелома, саркома, миосаркома, хлоангиосаркома, чешуеклеточная
карцинома, хронический лимфойдный лимфолейкоз, а также опухоли поджелудочной
железы, яичников, матки, семенников, почек, желудка, ободочной и прямой кишки.
Изобретение также имеет отношение к терапии тех неоплазий человека, при которых
произошла мутация в гене MTS, включая генотерапию, заменяющую белковую
терапию и использование миметиков. Техническим результатом изобретения является
расширение арсенала средств диагностики и терапии опухолей.
Недостаток метода заключается в сложности анализа, его длительности и
дороговизне.
За прототип выбран патент РФ №2248574 по заявке РФ №2003123171/15, 22.07.2003
«Способ прогнозирования развития и течения хронического лимфолейкоза» (Бакиров
А.Б. (RU), Бакиров Б.A. (RU), где предложен способ прогнозирования развития и
течения хронического лимфолейкоза, путем типирования полиморфизма ДНК
лимфоцитов, выделенных из крови больного, генов TNF-alfa и TNF-beta, включающий
забор периферической венозной крови, из лимфоцитов которой выделяют ДНК
методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК, проводят генотипирование
полиморфизма промоторных областей генов TNF- α и β, и при выявлении генотипа
LT∗22, характеризующегося наличием мутации гена TNF- β в гомозиготном состоянии,
выявляют лиц, предрасположенных к развитию хронического лимфолейкоза, а при
определении комбинаций генотипов TNF∗22/LT∗22 и TNF∗12/LT∗11 у больных
хроническим лимфолейкозом прогнозируют агрессивное течение заболевания.
Недостаток прототипа заключается в том, что он не дает возможность
спрогнозировать склонность больного к тромбоцитопении.
Задачей настоящего исследования является расширение арсенала способов
диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития
тромбоцитопении в течение хронического лимфолейкоза по данным о генетических
полиморфизмах -889C/T гена интерлейкина 1A и VNTR антагониста рецептора
интерлейкина 1.
Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки
риска развития тромбоцитопении в течение хронического лимфолейкоза.
В соответствии с поставленной задачей был разработан способ прогнозирования
риска развития тромбоцитопении в течение хронического лимфолейкоза, включающий:
- выделение ДНК из периферической венозной крови;
- анализ полиморфизмов -889C/T гена интерлейкина 1A и VNTR антагониста
рецептора интерлейкина 1;
- прогнозирование развития тромбоцитопении у больных хроническим
лимфолейкозом в случае выявления аллеля -889Т IL-1A и/или аллеля IL-1Ra∗1.
Новизна и изобретательский уровень заключается в том, что из уровня техники не
известна возможность прогноза развития тромбоцитопении в течение хронического
лимфолейкоза по наличию аллеля -889T гена интерлейкина 1А (полиморфизм -889C/T
IL-1A) и/или аллеля IL-1Ra∗1 гена антагониста рецептора интерлейкина 1
(полиморфизм VNTR IL-1Ra).
Способ осуществляют следующим образом:
ДНК выделяют из образцов периферической венозной крови больных хроническим
лимфолейкозом в 2 этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляют 25 мл
лизирующего буфера, содержащего 320 мМ сахарозы, 1% тритон X-100, 5 мМ MgCl2,
10 мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при
4°C, 4000 об/мин в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную
Ñòð.: 4
RU 2 508 543 C1
5
10
жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (pH=
8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл
протеиназы К (10 мг/мл) и инкубируют образец при 37°C в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию
ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с
центрифугированием при 4000 об/мин в течение 10 минут. После каждого
центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора
двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяют в
бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°C.
Выделенную ДНК затем подвергают полимеразной цепной реакции с
использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (таблица 1).
Таблица 1
Структура праймеров и зондов, используемых для генотипирования исследуемых ДНК-маркеров
15
20
Ген
Полиморфизм и его
локализация в гене
Структура праймеров и зондов
IL1A
-889С/T
5'-aagcttgttctaccacctgaactaggc-3'
(промотор) (rs
1800587)
5'-ttacatatgagccttccatg-3'
VNTR
5'-ctcagcaacactcctat-3'
(2 интрон)
5'-tcctggtctgcaggtaa-3'
IL1Ra
25
30
35
40
45
50
Фермент
рестрикции
Литература
Bsp 19I
[8]
-
[9]
Изобретение характеризуется на следующих фигурах:
Фиг.1. Электрофоретическое разделение продуктов рестрикции гена -889 С/Т IL-1A,
где цифры 2, 3, 4 - гомозиготы - 889ТТ; цифры 5, 6, 10 - гомозигота -889СС, цифры 1, 79, 11-14 - гетерозиготы -889СТ.
Фиг.2. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации VNTR
полиморфизма IL-1Ra, где цифры 1, 2, 10-13 - гетерозиготы 2R/4R; цифры 3-7, 9, 14 гомозиготы 4R/4R, цифра 8 - гетерозигота 2R/5R.
Фиг3. Частота аллеля -889Т IL-1A среди больных ХЛЛ в зависимости от наличия
тромбоцитопении на момент обследования и в контрольной группе, %.
Фиг.4. Частота аллеля IL-1Ra∗1 среди больных ХЛЛ в зависимости от наличия
тромбоцитопении на момент обследования и в контрольной группе, %.
Изучение полиморфного локуса интерлейкина 1А (-889С/Т IL-1A) проводили
следующим образом. Реакция проводилась в 12,5 мкл общего объема смеси,
содержащей 33,5 мМ трис-HCl (pH=8,8), 1,25 мМ MgCl2, 0,5 мкг геномной ДНК, по 5
пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taqполимеразы.
После денатурации (3 мин при 95°C) выполняли 35 циклов амплификации по схеме:
денатурация - 1 мин при 95°C; отжиг праймеров - 1 мин при 55°C; элонгация -1 мин
при 72°C. Затем пробы выдерживали 5 мин при 72°C и охлаждали. После ПДРФанализа продукты рестрикции анализировали в 3%-ном агарозном геле, окрашенным
бромистым этидием, в течение 1 часа 30 минут при 80V. В качестве электрофорезного
буфера использовали 1×TAE (трис-ацетатный буфер). Затем пробы идентифицировали
в проходящем УФ-свете. Фрагменты длиной 99 пар нуклеотидов (п.н.)
соответствовали аллелю -889С гена -889Т/С IL-1A, 83 и 16 п.н. - аллелю -889Т,
фрагменты длиной 99, 83 и 16 п.н. наблюдались у гетерозигот -889СТ (фиг.1).
При анализе VNTR полиморфизма гена IL-1Ra реакция проводилась в 12,5 мкл
общего объема смеси, содержащей 33,5 мМ трис-HCl (pH=8,8), 1,25 мМ MgCl2, 0,5 мкг
Ñòð.: 5
RU 2 508 543 C1
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1
единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (4 мин при 95°C) выполняли 32
цикла амплификации по схеме: денатурация - 40 сек при 94°C; отжиг праймеров - 40 сек
при 60°C; элонгация - 1 мин при 72°C. Затем пробы выдерживали 5 мин при 72°C и
охлаждали. Продукты амплификации анализировали в 2%-ном агарозном геле,
окрашенном бромистым этидием, в течение 30 минут при 160V. В качестве
электрофорезного буфера использовали 1×TAE (трис-ацетатный буфер). Затем пробы
идентифицировали в проходящем УФ-свете. В результате амплификации
идентифицированы фрагменты ДНК длиной 240-595 п.н., с 2, 3, 4, 5 или 6 копиями
тандемных повторов. Эти аллели были обозначены как 2R, 3R, 4R, 5R и 6R и
соответствовали аллелям IL-1Ra 2, 3, 1, 4 и 5, соответственно (фиг.2).
Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с
использованием программы «STATISTICA 6.0». Ассоциации аллелей и генотипов
изученных ДНК-маркеров с развитием тромбоцитопении в течение хронического
лимфолейкоза оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2×2 с расчетом
критерия χ2 с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95%
доверительными интервалами (CI) [7].
Возможность использования предложенного способа для оценки риска развития
тромбоцитопении в течение хронического лимфолейкоза подтверждает анализ
результатов наблюдений 206 больных хроническим лимфолейкозом и 307 человек
популяционного контроля. Пациенты включались в соответствующую группу
больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с
помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования.
В исследуемую группу включались индивидуумы русской национальности,
являющиеся уроженцами Центрального Черноземья России и не имеющие родства
между собой.
Установлено, что пациенты с развившейся тромбоцитопенией на момент
обследования отличаются максимальной концентрацией молекулярно-генетического
маркера -889Т IL-1A (36,54%) (фиг.3), что статистически достоверно превышает
показатель контрольной группы (22,77%, χ2=4,26, р=0,03, OR=1,95, 95% CI 1,03-3,67).
Аналогичной направленности данные получены и при изучении распределения
аллеля IL-1Ra∗1 у пациентов с развившейся тромбоцитопенией на момент
обследования (84,62%) по сравнению с контролем (70,31%, χ2=4,11, р=0,04, OR=2,32,
95% CI 1,02-5,46) (фиг.4).
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что аллель -889Т
гена IL-1A и аллель IL-1Ra∗1 гена антагониста рецептора интерлейкина 1 являются
факторами риска развития тромбоцитопении в течение хронического
лимфолейкоза (OR=1,95 и OR=2,32, соответственно).
Применение данного способа позволит предпринять профилактические меры для
предупреждения возникновения тромбоцитопении в течение хронического
лимфолейкоза, а также подобрать индивидуальную тактику ведения больного
хроническим лимфолейкозом.
Литература
1. Воробьев А.И. Опухоли лимфатической системы / А.И. Воробьев, А.М.
Кременецкая, Д.В. Харазишвили // Гематология и трансфузиология. - 2000. - Т.45, №3. С.3-14.
2. Доронин В.А. Современные аспекты патогенеза и диагностики хронического
лимфолейкоза: обзор лит. / В.А. Доронин // Клиническая лабораторная
Ñòð.: 6
RU 2 508 543 C1
5
10
15
20
25
30
диагностика. - 2003. - №4. - С.24-25.
3. Никитин Е.А. Хронический лимфолейкоз / Е.А. Никитин // Клиническая
онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. - 2009. Т.2, №1. - С.87-91.
4. Аксенович Т.И. Картирование генов, детерминирующих распространенные
болезни человека / Т.И. Аксенович // Медицинская генетика. - 2006. - Т.5, №2. - С.11-15.
5. Genetic susceptibility variants for chronic lymphocytic leukemia / S.L. Slager, L.R.
Goldin, S.S. Strom [et al.] // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. - 2010. - Vol.19, №4. - P.10981102.
6. Ассоциации полиморфных генов интерлейкинов с иммунопатологией у телеутов /
А.В. Шабалдин, А.В. Остапцева, А.Н. Глушков [и др.] // Иммунология. - 2007. - Т.28,
№1. - С.3-7.
7. Боровиков В. Statistica: искусство анализа данных на компьютере / В. Боровиков.
- 2-е изд. - СПб.: Питер, 2003. - 688 с.: ил. - (Для профессионалов).
8. Polymorphisms in the IL-1a and IL-1b Genes Are Not Associated with Susceptibility to
Chronic Periodontitis in a Brazilian Population / P.C. Trevilatto, R.M. Scarel-Caminaga, R.B.
Brito [et al.] // Braz. J. Oral. Sci. - 2003. - Vol.2, №7. - P.348-352.
9. Interleukin-1 receptor antagonist gene polymorphism is associated with increased risk of
epithelial ovarian cancer / J. Sehouli, A. Mustea, D. Koensgen [et al.] // Ann. Oncol. - 2003. Vol.14, №10. - P.1501-1504.
Формула изобретения
Способ прогнозирования риска развития тромбоцитопении в течении хронического
лимфолейкоза, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови и
анализ полиморфизмов - 889С/Т гена интерлейкина 1А и VNTR антагониста рецептора
интерлейкина 1, где прогнозируют повышенный риск развития тромбоцитопении в
течении хронического лимфолейкоза в случае выявления аллеля - 889Т IL-1A и/или
аллеля IL-1 Ra ∗1.
35
40
45
50
Ñòð.: 7
CL
RU 2 508 543 C1
Ñòð.: 8
DR
RU 2 508 543 C1
Ñòð.: 9
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа