close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Акт;docx

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
КРЕТЕНЧУК Оксана Федоровна
РАЗРАБОТКА НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ
МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРНЫХ
ВИБРИОНОВ О1, О139 СЕРОГРУПП УСКОРЕННЫМИ МЕТОДАМИ
03.01.06 – биотехнология
(в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Ставрополь – 2014
2
Работа выполнена в Федеральном казѐнном учреждении здравоохранения
«Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научноисследовательский противочумный институт» Федеральной службы по
надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
Алексеева Людмила Павловна
Официальные оппоненты:
Ляпустина Лариса Вениаминовна - доктор медицинских наук, Федеральное
казѐнное
учреждение
здравоохранения
«Ставропольский
научноисследовательский противочумный институт» Федеральной службы по
надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека,
заведующая лабораторией подготовки специалистов.
Марков Евгений Юрьевич – доктор биологических наук, Федеральное
казѐнное учреждение здравоохранения «Иркутский ордена Трудового
Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт
Сибири и Дальнего Востока» Федеральной службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей и благополучия человека, заведующий
биохимическим отделом.
Ведущая организация: Федеральное казѐнное учреждение здравоохранения
«Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт»
Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и
благополучия человека.
Защита состоится «18» апреля 2014 г. в 14-00 часов на заседании
диссертационного совета Д 208.109.01 при Федеральном казѐнном
учреждении здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский
противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты
прав потребителей и благополучия человека по адресу: 355035, г. Ставрополь,
ул. Советская, д.13-15.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФКУЗ Ставропольский
противочумный институт Роспотребнадзора.
Автореферат разослан «___» февраля 2014 г.
Ученый секретарь диссертационного
совета, доктор биологических наук
Жарникова Ирина Викторовна
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Трудность в борьбе с холерой, как
отмечалось на 64-ой сессии Всемирной ассамблеи здравоохранения, вызвана
недостаточным количеством диагностических экспресс-тестов для выявления
холерных вибрионов и своевременного принятия мер, что определяет
необходимость дальнейших научных исследований по разработке таких
тестов. К настоящему времени для диагностики возбудителя холеры
рекомендованы к практическому использованию препараты, в основе
которых поликлональные иммунные сыворотки лошадиного происхождения,
имеющие ряд недостатков: разнородность и гетерогенность популяции
антител, низкие титры специфических иммуноглобулинов и, как следствие,
наличие перекрестных реакций при их применении внутри вида и с
гетерологичными микроорганизмами. Предпринимались попытки улучшения
качества препаратов за счет получения кроличьих сывороток (Мазрухо Б.Л.,
Ишина Е.В., 1998; Абрамова Е.Г. с соавт., 2002; Аленкина Т.В. с соавт., 2010,
2012). Однако проблема обеспечения высокоспецифичными препаратами
остается актуальной. Привлечение МКА в лабораторную диагностику холеры
позволяет решить проблему качества реагентов. Так, первые публикации,
касающиеся использования МКА в серодиагностике холеры, появились за
рубежом еще в начале 80-х годов (Gustafsson B. et al., 1982; Robb M. et al.,
1982; Gustafsson B., 1984, 1985). Позже другие зарубежные авторы
сконструировали на основе МКА высокоэффективные тест-системы: для
слайд-агглютинации (Adams L.B. et al., 1988), набор CholeraeScreen для
реакции коагглютинации (Colwell R.R. et al.,1992), дот-блот-ИФА (Supawat K.
et al., 1994), флуоресцирующие иммуноглобулины (Hasan J.A. et al., 1994;
Castillo L. et al., 1995). В отечественной практике сведения о холерных
моноклональных препаратах, имеющих диагностическую значимость,
представлены в работах Л.П. Алексеевой с соавт. (1988), О.С. Бурлаковой
(1993), З.Л. Девдариани с соавт. (1999), Н.Е. Терешкиной (2004),
Н.А.Сыровой (2005), О.С. Чемисовой (2006), В.А. Федоровой с соавт. (2007),
О.В. Маркиной (2008). Начиная с 2000 г. в ГНЦ ФГУП «ГосНИИ
биологического приборостроения» (г. Москва) ведутся работы в области
создания отечественных иммунохроматографических (ИХ) тест-систем,
чувствительность и специфичность которых повышается, если используются
МКА (Шиленко И.В. с соавт., 2007; Ярков С.П. с соавт., 2008). В рамках
совместной темы нашего института с ГНЦ ПМБ (г. Оболенск) разработана
моноклональная ИХ тест-система для выявления V. сholerae О1 (Хомяков
А.Е. с соавт., 2009; Баранова Е.В. с соавт., 2010, 2013). Однако проблема
обеспечения
высокоспецифичными
диагностикумами
сохраняет
актуальность. В первую очередь это касается препаратов, широко
используемых в лабораторной практике, в частности для постановки слайд-
4
агглютинации и иммунофлуоресценции. Потребность в таких препаратах
диктуется и современной ситуацией. Так, в ходе мониторинга водных
объектов наблюдается увеличение числа штаммов холерных вибрионов
неО1/не О139, которые давали положительную слайд-агглютинацию на
стекле с О1 холерной сывороткой, причем у части штаммов зарегистрировано
образование агглютината при постановке развернутой реакции в пределах
титров от 1/100 до 1/200, у отдельных до 1/400 и типоспецифическими
сыворотками Инаба - от 1/50 до 1/100 (Григоренко Л.В. с соавт., 2011). Этот
факт не исключает возможности диагностических ошибок при проведении
исследований
на
наличие
возбудителя
холеры
лабораториями
территориального уровня, что подтверждает необходимость введения либо
дополнительного
теста
дифференциации,
например
реакции
иммунофлуоресценции (РИФ), либо высокоспецифичных диагностикумов.
Одновременно существует и проблема низкоагглютинабельных штаммов
холерных вибрионов О1 серогруппы, их идентификация на этом фоне
представляется возможной только при условии использования препаратов,
отличающихся высокой чувствительностью и специфичностью, применение
которых в перспективе позволит исключить постановку развернутой реакции
агглютинации, что сократит объем лабораторных исследований.
Цель исследования – совершенствование лабораторной диагностики
холеры путем конструирования диагностических препаратов на основе МКА
для идентификации холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в реакциях
прямой иммунофлуоресценции и слайд-агглютинации.
Задачи исследования:
1. Расширить спектр имеющихся гибридом за счет получения новых,
продуцирующих МКА к видоспецифическим эпитопам холерных
вибрионов О1 серогруппы, охарактеризовать их изотип, направленность,
аффинность, наличие перекрестной активности внутри вида, рода.
2. Получить в препаративных количествах видоспецифические МКА,
провести их очистку с помощью различных методов, оценить их
специфическую активность в реакциях непрямой иммунофлуоресценции,
слайд-агглютинации, преципитации и иммуноферментном анализе.
3. Разработать на основе охарактеризованных МКА биотехнологическую
схему получения флуоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов
для выявления V. сholerae О1 и О139 в реакции прямой
иммунофлуоресценции, наработать экспериментальные серии препаратов
в лиофилизированном виде.
4. Изучить агглютинирующие свойства видоспецифических МКА О1, МКА
О139, выделенных из культуральных и асцитических жидкостей, в
реакции слайд-агглютинации на наборе штаммов гомологичных и
5
гетерологичных микроорганизмов, отобрать диагностически значимые
агглютинирующие МКА.
5. Провести
лабораторные
испытания
экспериментальных
серий
видоспецифических флуоресцирующих и агглютинирующих МКА О1,
МКА О139, оформить нормативную документацию для их
государственной регистрации.
Научная новизна. Набор видоспецифических гибридом, которыми
располагает лаборатория, расширен за счет получения новых,
продуцирующих МКА, направленные к детерминантам О-антигена ЛПС
V. сholerae О1. На основании иммунохимического анализа штаммов
холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп установлены диагностически
значимые МКА, отличающиеся тем, что они выявляют консервативные
эпитопы ЛПС, с высокой плотностью представленные на клеточной
поверхности, пространственно расположенные так, что при взаимодействии с
антителами не возникает стерических помех. Установление эпитопов, в
меньшей степени подверженных модификации и утрате при воздействии
различных факторов, способствует повышению диагностической ценности
препаратов.
Впервые показана возможность использования в качестве
полноценного источника МКА для изготовления препаратов не только
асцитической, но и культуральной жидкости, которая в больших объемах
накапливается при пассировании гибридом-продуцентов in vitro.
Отработана
и
оптимизирована
технология
изготовления
моноклональных флуоресцирующих иммуноглобулинов к V. сholerae О1 и
О139, заключающаяся в выделении активной фракции иммуноглобулинов
сульфатом аммония, обессоливании диализом, выборе оптимального
соотношения флуорохрома и МКА, стабилизации конъюгатов путем
лиофильного высушивания.
Теоретическая и практическая значимость работы. Набор
гибридом, стабильно продуцирующих видоспецифические МКА О1 и О139,
является источником стандартных моноклональных иммуноглобулинов, на
основе которых сконструированы диагностические препараты нового
поколения.
Разработана
экспериментально-производственная
технология
изготовления моноклональных флуоресцирующих конъюгатов для
диагностики холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в реакции прямой
иммунофлуоресценции. Создан диагностический набор агглютинирующих
МКА для идентификации и дифференциации V. сholerae О1 и О139 в реакции
слайд-агглютинации. По результатам проведенных исследований оформлен
комплект нормативной документации, включающий в себя инструкцию по
применению, справку об изделии медицинского назначения и технические
6
условия на наборы реагентов «Иммуноглобулины моноклональные
диагностические
флуоресцирующие
сухие
для
серологической
идентификации V. cholerae О1 и О139 (in vitro) методом РИФ «Иг - V.
cholerae О1/О139 – РИФ» и «Иммуноглобулины моноклональные
диагностические cухие для серологической идентификации V. cholerae О1 и
О139 (in vitro) методом РА «ИГ –V.cholerae О1/О139 — РА», которые в
настоящее время находятся на регистрации в Росздравнадзоре.
На гибридомы, стабильно продуцирующие МКА к видоспецифическим
эпитопам возбудителя холеры О1 и О139, получены два патента на
изобретение №2425874 от 13.04.2010 «Штамм культивируемых гибридных
клеток животных Mus. musculus L-продуцент моноклональных антител,
специфичных к О-антигену холерных вибрионов О1 серогруппы» и
№2425875 от 07.06.2010 «Штамм культивируемых гибридных клеток
животных Mus. musculus L-продуцент моноклональных антител,
специфичных к ЛПС холерных вибрионов О139 серогруппы».
Экспериментальные серии флуоресцирующих МКА О1 и МКА О139
были использованы при выполнении кандидатской диссертационной работы
Куликаловой Е. С. на базе ФГУЗ «Иркутского научно-исследовательского
противочумного института». Разработанные наборы используются при
выполнении научно-исследовательских работ во ФКУЗ Ростовский-на-Дону
противочумный институт Роспотребнадзора, в работе СПЭБ, также для
оценки качества препараты в коммерческом виде переданы в Волгоградский
и Ставропольский противочумные институты, в ГНЦ ПМБ (г. Оболенск).
Методология и методы исследования. В работе использованы
различные методы исследования: микробиологические (культивирование
штаммов микроорганизмов), гибридомная технология, методы иммунохимии
(ИФА,
РИФ,
слайд-агглютинация,
преципитация,
иммуноблот),
биохимические и микроскопические.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Набор гибридом-продуцентов обеспечивает получение диагностически
значимых,
стандартных,
воспроизводимых
МКА,
узнающих
видоспецифические эпитопы О-антигена холерных вибрионов О1 и О139
серогрупп, позволяет конструировать диагностические препараты нового
поколения.
2. Видоспецифические МКА выявляют консервативные эпитопы ЛПС, с
высокой плотностью представленные на клеточной поверхности
вибрионов и в меньшей степени подверженные модификации или утрате
при воздействии различных факторов, что способствует повышению
диагностической ценности препаратов.
3. Для создания диагностических препаратов впервые использована
культуральная жидкость, являющаяся полноценным источником
7
иммуноглобулинов, получение которой не требует привлечения
лабораторных животных.
4. Разработанная
биотехнологическая
схема
экспериментальнопроизводственного изготовления холерных О1, О139 флуоресцирующих
иммуноглобулинов позволяет получать препараты, характеризующиеся
высокой специфичностью и чувствительностью.
5. Набор диагностических агглютинирующих МКА без дополнительной
постановки развернутой реакции агглютинации обеспечивает выявление
холерных вибрионов О1, О139 серогрупп.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на
научных конференциях: проблемная комиссия «Холера и патогенные для
человека вибрионы» (г. Ростов-на-Дону, 2009 - 2013); научно-практическая
конференция «Современные аспекты эпидемиологического надзора и
профилактики особо опасных природноочаговых болезней», посвященная 75летнему юбилею ФГУЗ Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока
(г. Иркутск, 2009); конференция молодых ученых ФГУЗ РостНИПЧИ
(г. Ростов-на-Дону, 2011); Всероссийская научно-практическая конференция
молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора с международным
участием: «Фундаментальные и прикладные аспекты анализа риска здоровью
населения» (г. Пермь, 2012).
Диссертационная работа выполнена в рамках государственной темы
№ 121-4-10 «Создание видоспецифических моноклональных препаратов для
идентификации холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп с помощью
тестов
слайд-агглютинации,
прямой
иммунофлуоресценции
и
иммунохроматографии (2010 – 2014)» (номер государственной регистрации
01200907528).
Личный вклад соискателя. Основные разделы диссертационной
работы выполнены Кретенчук О.Ф. самостоятельно на базе группы гибридом
Ростовского-на-Дону противочумного института. Разработка идей,
постановка научных задач, методическая часть работы, конструирование
препаратов, получение научных результатов и их обоснование были
выполнены автором под руководством д.б.н., профессора Л.П. Алексеевой.
Публикации результатов исследования. По теме диссертации
опубликовано 17 научных работ, 5 из них в периодических изданиях из
перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК РФ.
Получены 2 патента на изобретение № 2425874 (13.04.2010 г.) и №2425875
(07.06.2010 г.).
План диссертационной работы утвержден на заседании Ученого
совета
ФКУЗ
Ростовского-на-Дону
противочумного
института
Роспотребнадзора (протокол № 8 от 19.06.2012 г.)
8
Структура диссертации. Работа изложена на 134 страницах
машинописи, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и
методов исследования, результатов собственных исследований, заключения,
выводов и списка литературы. Библиография включает 156 источников, в том
числе зарубежных – 37. Диссертация иллюстрирована 21 рисунками и 19
таблицами.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы. Для получения перитонеальных макрофагов,
иммунных спленоцитов и асцитических жидкостей использовали инбредных
мышей линии Balb/c и беспородных белых мышей массой 16 - 20 грамм в
возрасте 6 – 10 недель.
В работе были использованы 90 штаммов V. cholerae О1, 40 штаммов
V. cholerae О139, 100 штаммов V. cholerae не О1/не О139, 10 штаммов
V. cholerae RO. С целью контроля специфичности препаратов МКА также
использовали 12 штаммов V. parahaemolyticus, 4 – E. coli, 4 – Brucella spp., 4 –
Salmonella spp., 108 – Aeromonas, 7 – Plesiomonas, 30 – Comamonas, 1 –
V. mimicus, 1 - V. vulnificus. Все штаммы микроорганизмов получены из Музея
живых культур Ростовского-на-Дону противочумного института.
Слияние иммунных спленоцитов мыши с миеломой проводили в
соответствии с методикой Fazekas de St. et al. (1980). В работе использовали
мышиные миеломные линии NS0 и P3-X63/Ag8.653, которые не синтезируют
собственные иммуноглобулины или их цепи, дефектны по ферменту
гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансфераза (ГГФРТ), резистентны к
8-азагуанину и погибают в селективной среде, содержащей гипоксантин,
аминоптерин и тимидин (ГАТ-среда). В качестве продуцентов специфических
иммуноглобулинов дополнительно использовали гибридому-продуцент МКА
О1 ГХ-F8/О1, депонированную ранее в «Специализированной коллекции
перевиваемых соматических клеток позвоночных» Института Цитологии
(г. Санкт-Петербург) под номером РККК (П) 386Д, и набор гибридомпродуцентов МКА О139, имеющийся в криохранилище Ростовского-на-Дону
противочумного института.
Миеломные и гибридомные клетки выращивали в CO2-инкубаторе
(Nuaire) на среде RPMI-1640 («Sigma») и DMEM («Sigma») с добавлением 10
- 15 % сыворотки плода коровы («HyClone»), 2 мМ глутамина («Serva»),
120 мкг/мл гентамицина. Среды готовили из сухого порошка на
деионизированной воде по инструкции изготовителя. Стерилизацию сред
проводили фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор
0,2 мкм.
В работе использовали химические реактивы отечественного и
импортного производства со степенью очистки – «х.ч.», «rein», «analytical
grade».
9
Культивирование гибридных клеток in vivo проводили в организме
беспородных и линейных мышей Balb/c, предварительно за 14 дней до
введения гибридом праймированных пристаном («Sigma») в дозе
0,5 мл/мышь. Гибридомы вводили в культуральной среде внутрибрюшинно в
количестве 107 клеток на мышь. Иммунную асцитическую жидкость собирали
по мере формирования опухолей через 2 – 4 недели.
Выделение иммуноглобулиновой фракции из культуральных
супернатантов гибридом и асцитических жидкостей мышей осуществляли
преципитацией сульфатом аммония. После проверки титра антител
препараты разливали по аликвотам и хранили при температуре –20 оС.
Для изучения свойств полученных МКА О1 и МКА О139 применяли
разнообразные серологические методы: иммуноферментный анализ (ИФА),
дот-иммуноанализ (ДИА), реакцию агглютинации (РА), реакцию непрямой
(РНИФ) и прямой иммунофлуоресценции (РПИФ), реакцию преципитации
(РП). Постановку иммуноблоттинга осуществляли, как описано H. Towbin et.
al. (1984). Электрофоретическое разделение клеточных лизатов бактерий
проводили по Laemmli U.K. (1970).
Конъюгацию МКА с ФИТЦ осуществляли с некоторыми
модификациями: концентрация белка не ниже 5 мг/мл, ФИТЦ - 5 мг на 100 мг
белка, 10% карбонат-бикарбонатного буфера (КББ), рН реакционной смеси
9,0. Процесс происходил при температуре 6 ± 2 °C в течение 18 ч или при
комнатной температуре в течение 4 ч при постоянном перемешивании на
магнитной мешалке.
Статистическую обработку полученных результатов проводили по
И.П. Ашмарину, А.А. Воробьѐву (1962).
Результаты исследований и их обсуждение
Для решения поставленных перед нами задач требовалось получить
набор гибридом, стабильно продуцирующих МКА О1 и О139, поэтому на
первом этапе исследований была проведена гибридизация, в результате
которой для работы отобрали гибридомы Е9, А5 и F11. Одновременно в этот
набор была включена гибридома ГХ-F8/О1, депонированная ранее в
Институте Цитологии. Что касается гибридом, продуцирующих
иммуноглобулины, узнающие антигенные детерминанты в составе
поверхностных структур V. cholerae О139, то в работе исследовали
полученные ранее гибридомы 3Е4, 3В5, 3А9, 2F6, 3E8. Для выбора
источников
специфических
иммуноглобулинов,
пригодных
для
конструирования диагностических препаратов, проводили целенаправленный
отбор клонов гибридом-продуцентов МКА, взаимодействующих с
антигенными детерминантами всех исследуемых штаммов V. cholerae О1 и
О139. Кроме того, учитывали данные о стабильности антителопродукции при
культивировании
и
после
криохранения
гибридом.
Результаты
10
специфической активности МКА в различных серологических реакциях
явились основанием для отбора продуцентов видоспецифических МКА О1 ГХ-F8/О1 и F11, МКА О139 - 3Е4 и 3В5.
Следующим этапом было получение МКА в препаративных
количествах. Пассирование гибридом in vitro позволило накопить не только
клетки для последующего введения мышам с целью получения асцитов
(таблица 1), но и культуральную жидкость, являющуюся источником МКА.
Таблица 1 – Сроки образования и активность АЖ в ТИФА
Срок
Процент
V
Название
Содержание
образования получения АЖ,
Титр Ат в ИФА
гибридомы
белка, мг/мл
АЖ
АЖ
мл
ГХ-F8/О1 2 - 4 недели
60 %
5 - 10
15
1:200 – 1:400 тыс.
F11
4 - 7 недель
20 %
2-4
7
1:10 – 1:40 тыс.
3E4
2 - 4 недели
50 %
5-7
10
1:100 – 1:200 тыс.
3В5
2 - 4 недели
50 %
5-7
10
1:100 – 1:200 тыс.
Данные таблицы 1 свидетельствуют о том, что из четырех испытуемых
гибридом F11 оказалась менее эффективной для получения препаративного
количества МКА в виде АЖ. Как было отмечено, при культивировании in
vitro происходит накопление КЖ, которая является полноценным источником
МКА при условии ее концентрирования преципитацией раствором сульфата
аммония. Далее такие препараты исследовали в различных серологических
реакциях для определения активности и специфичности иммуноглобулинов,
синтезируемых гибридомами ГХ-F8/О1, F11, 3Е4, 3В5. Наиболее высокая
антителопродукция МКА О1 наблюдалась у ГХ-F8/О1, так как титры
препаратов в ТИФА, ДИА, РНИФ, РА значительно превышали показатели
активности антител, синтезируемых F11. Кроме того, F11 не обладала
преципитирующей активностью в отличие от ГХ-F8/О1 (рис. 1) и в ДИА
(рис. 2) МКА, синтезируемые F11, только в титре не более 1/100
обеспечивали положительную реакцию со всеми исследуемыми штаммами
V. cholerae О1.
А
Б
В
Г
Рисунок 1 – Титры МКА, выделенных из КЖ гибридом, в реакции
преципитации: А – взаимодействие МКА ГХ-F11/О1 с V. cholerae О1 5879;
Б – взаимодействие МКА F11 с V. cholerae О1 5879; В - взаимодействие
МКА 3Е4 с V. cholerae О139 16064; Г - взаимодействие МКА 3В5 с
V. cholerae О139 16064
11
V. cholerae
eltor 15960↓
V. cholerae
eltor 13813↓
V. cholerae
eltor 14863
V. cholerae
eltor 5879
V. cholerae
cholerae 569B
Рисунок 2 – Результаты определения специфичности МКА гибридом в ДИА:
I ряд – МКА ГХ-F8/О1 (1/1000), II ряд – МКА F11 (1/100), III ряд – МКА 3Е4
(1/1000), IV ряд – МКА 3В5 (1/1000); 1 - V. cholerae cholerae 569B, 2 –
V. cholerae eltor 5879, 3 - V. cholerae eltor 14863, 4 - V. cholerae eltor 13813↓,
5 - V. cholerae eltor 15960↓, 6 - V. cholerae O139 Р-16064, 7 - V. cholerae O139
MO-45, 8 - V. cholerae O1 17905 RO, 9 - V. cholerae O1 17685 RO, 10 V. cholerae не O1/ не О139 5444, 11 - V. parahaemolyticus 17094, 12 - V.
mimicus 16466, 13 - V. vulnificus 17518, 14 - Comаmonas P-229, 15 - Aeromonas
P-143, 16 - Plesiomonas 101
На рис. 3 представлен ДИА, свидетельствующий о недостаточно
высокой активности МКА F11, которые в титре 1/1000 не обеспечивают
положительную реакцию с V. cholerae O1, характеризующимися сниженной
агглютинабельностью видовой О1 сывороткой.
Рисунок 3 – Оценка активности МКА гибридомы F11 (титр 1/1000) в ДИА
Активность и специфичность иммуноглобулинов, продуцируемых
гибридомами 3Е4 и 3В5 в отношении V. cholerae О139, была сопоставимой во
всех серологических реакциях (рис. 1, рис. 2).
Результаты ТИФА с препаратами ЛПС V. cholerae О1 (ЛПС О1) и
V. cholerae О139 (ЛПС О139) показывают, что МКА О1, синтезируемые
гибридомами ГХ-F8/О1 и F11, специфически взаимодействуют с ЛПС О1,
причем показатели ОП в случае ГХ-F8/О1 оказались выше, чем у F11.
Гибридомы 3Е4 и 3В5 продуцировали МКА О139, обеспечивающие
положительную реакцию с ЛПС О139. Ни один из препаратов
видоспецифических МКА не взаимодействовал с коммерческим ЛПС E. сoli
О55:В5 (Fluka, Израиль).
Тонкая характеристика МКА в реакциях конкурентного ИФА (рис. 4) и
иммуноблота (рис. 5) свидетельствует о пространственной разобщенности
детерминант, узнаваемых МКА О1 гибридом ГХ-F8/О1 и F11, а в случае 3Е4
и 3В5 эпитопы оказались пространственно сближенными на молекуле
антигена.
12
1,395 1,408
3Е4+3В5
3В5
1,314
3Е4
2,857
ГХ-F8/О1+F11
1,004
F11
1,994
ГХ-F8/О1
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Показатели ОП в Т ИФА
Рисунок 4 – Показатели ОП в ТИФА при совместной инкубации МКА
Результаты иммуноблота, представленного на рис. 5, также
показывают, что связывание МКА ГХ-F8/О1 с клеточными лизатами
холерных вибрионов происходило в области 35 - 40 кДа, МКА F11 - в районе
25 – 35 кДа. Данные литературы (Ткаченко В.В., 1982; Яровая Л.М. с соавт.,
1991; Книрель Ю.А. с соавт., 1994; Лобанов В.В. с соавт., 2002; Алешина
Ю.А. с соавт., 2013) и локализация в нижней трети блотограммы эпитопов,
узнаваемых видоспецифическими МКА, дают основание предполагать, что
последние принадлежат О-полисахаридной цепи ЛПС. Иммуноблот с МКА
О139 гибридом 3Е4 и 3В5 позволил выявить интенсивную полосу на уровне
ниже 14 кДа. В исследованиях K. Hisatsune et. al. (1993) было показано, что
ЛПС V. cholerae О139 имеет короткий О-полисахарид с небольшой
молекулярной массой, подобно R-формам V.cholerae О1.
5879
5879
2
3
16064
16064
16064
5879
116,0
66,2
45,0
35,0
25,0
18,4
14,4
1
4
5
6
7
Рисунок 5 – Иммуноблоттинг клеточных лизатов штаммов V. cholerae
О1 (5879) и V. cholerae О139 (Р-16064): 1 – маркеры молекулярных весов, 2 –
МКА ГХ-F8/О1, 3 – МКА F11, 4 – МКА О1 с V. cholerae О139 (Р-16064), 5 –
МКА 3Е4, 6 –МКА 3В5, 7 - МКА О139 с V. cholerae О1 (5879)
Для окончательного выбора диагностически ценных гибридом была
проведена оценка сохранности О-антигенных детерминант ЛПС холерных
вибрионов с помощью МКА при различных способах инактивации
(хлороформ, формалин, перекись, трипсин, кипячение, кислота, щелочь).
13
Установлено, что только действие высоких концентраций перекиси, щелочи и
кислоты приводило к снижению ОП, по сравнению с контролем. Если
сравнивать активность специфических иммуноглобулинов гибридом ГХF8/О1 и F11 в отношении инактивированных штаммов, то более высокие
показатели ОП отмечены в отношении ГХ-F8/О1. Поэтому для
конструирования препаратов решено было использовать в качестве основного
источника МКА О1 гибридому ГХ-F8/О1, из МКА О139 выбраны 3Е4 и 3В5.
Ставя
перед
собой
задачу
получения
флуоресцирующих
иммуноглобулинов, нами были подобраны оптимальные параметры
конъюгации. В таблице 2 представлены часто встречающиеся условия
получения флуоресцирующих препаратов, но оптимальными являются
следующие: концентрация МКА не ниже 5 мг/мл, ФИТЦ - 0,5 мг на 10 мг
белка, 10% КББ, рН реакционной смеси 9,0.
Таблица 2 – Основные параметры технологии получения моноклональных
флуоресцирующих препаратов
№
Параметры конъюгации
1 способ
2 способ
3 способ
п/п
1 Концентрация
2 – 4 мг/мл
≥5 мг/мл
≥5 мг/мл
специфических Ig
2 Предварительный этап диализ не
диализ
диализ не
диализ раствора МКА
проводят
проводят
проводят
против 0,05 М КББ рН 9,0
3 Концентрация КББ в
10%
10%
10%
реакционной смеси
4 Температура реакции
условия
комнатная
комнатная
холодильника
5 Количество ФИТЦ на 10 мг
0,3 мг
0,5 мг
0,5 мг
белка
6 Продолжительность
2 часа
18 часов
4 часа
реакции
Отмечено, что после добавления красителя происходит снижение рН и
значительная часть ФИТЦ не вступает в реакцию с МКА, поэтому
необходимо
проводить
либо
предварительный
диализ
раствора
иммуноглобулинов против КББ (2 способ), либо корректировку рН в течение
первых 30 минут раствором КББ (3 способ). Наилучшие серии конъюгатов
получены 2 и 3 способом, о чем свидетельствует положительная РИФ на «4+»
всех взятых в опыт штаммов возбудителя холеры. Предпочтительным, по
нашему мнению, является 3 вариант, так как в этом случае время реакции
сокращено до четырех часов.
14
По отработанной схеме мы приготовили экспериментальные образцы
флуоресцирующих моноклональных препаратов, которые укомплектовали в
набор реагентов «Иммуноглобулины моноклональные диагностические
флуоресцирующие сухие для серологической идентификации V. cholerae О1 и
О139 (in vitro) методом РИФ «Иг - V. cholerae О1/О139 – РИФ». Для оценки
диагностической значимости препаратов были проведены лабораторные
испытания на широком наборе штаммов (таблица 3), которые
продемонстрировали высокую специфичность набора и явились основанием
для оформления нормативной документации.
№
п/п
1
2
3
4
5
Штаммы
Количество
штаммов
Таблица 3 – Оценка специфичности иммуноглобулинов моноклональных
диагностических холерных О1 и О139 флуоресцирующих
Реакция иммунофлуоресценции
ФИТЦ-МКА О1 ФИТЦ-МКА О139
4+
15
14
8
4
3+
11
12
1
5
2+
1
1
4+
3+
2+
V. cholerae eltor Inaba
26
V. cholerae eltor Ogawa
27
отрицательная
реакция
V. cholerae cholerae Inaba
9
V. cholerae cholerae Ogawa
10
V. cholerae О139
17
8
7
2
(от человека)
6 V. cholerae О139 (из воды)
18
12
6
7 V. cholerae не О1/не О139,
46
в т. ч. V. cholerae О22
отрицательная
8 V.cholerae RO
9
реакция
9 V. parahaemolyticus
11
отрицательная
10 E. coli
4
реакция
9 Aeromonas
11
10 Brucella spp.
4
11 Salmonella spp.
4
На следующем этапе работы были приготовлены агглютинирующие
препараты. Их испытание на широком наборе штаммов показало отсутствие
перекрестных реакций с представителями близкородственных и
гетерологичных микроорганизмов, что свидетельствует о высокой
специфичности агглютинирующих иммуноглобулинов (таблица 4).
Полученные МКА О1 и О139 укомплектовали в набор реагентов
«Иммуноглобулины
моноклональные
диагностические
cухие
для
серологической идентификации V. cholerae О1 и О139 (in vitro) методом РА
15
«ИГ –V. cholerae О1/О139 — РА», на который оформили нормативную
документацию.
Количеств
о штаммов
Таблица 4 – Оценка специфичности набора «ИГ- V. cholerae О1/О139 – РА»
Количество штаммов,
агглютинирующихся МКА
№
Штаммы
Серия 1
Серия 2
Серия 3
МКА
О1
МКА
О139
МКА
О1
МКА
О139
МКА
О1
МКА
О139
1 V. cholerae О1
86
86
86
86
2 V. cholerae О139
29
29
29
29
3 V.cholerae не О1/не О139,
100
в т.ч. V. cholerae О22
4 V. cholerae RО
7
5 V. parahaemolyticus
12
6 E. coli
4
7 Aeromonas
108
8 Plesiomonas
7
9 Comamonas
30
В течение 2012 г. проведены технические и медицинские испытания
наборов реагентов на базе Федерального государственного бюджетного
учреждения здравоохранения «Головной центр гигиены и эпидемиологии
Федерального медико-биологического агентства» и ФКУЗ Волгоградский
научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, в
ходе которых отмечено полное соответствие свойств, заявленным в
нормативно-технической документации. Результаты изучения специфичности
флуоресцирующих и агглютинирующих моноклональных препаратов,
фотоизображение которых представлено на рис. 6, явились основанием для
подачи разработанных наборов реагентов на государственную регистрацию в
качестве изделий медицинского назначения.
1
2
Рисунок 6 – Фотоизображение наборов реагентов: 1 - «Иг - V. cholerae
О1/О139 – РИФ»; 2 - «ИГ - V.cholerae О1/О139 - РА»
16
Выводы
1. Получен и охарактеризован набор стабильных гибридом-продуцентов
МКА, которые взаимодействуют с видоспецифическими эпитопами
О-антигена V. cholerae О1 и О139, представленными на клеточной
поверхности с высокой частотой и в доступной для связывания форме. На
гибридомы получены два патента №2425874 от 13.04.2010 и №2425875 от
07.06.2010.
2. С помощью набора МКА и иммунологических методов установлено, что
эпитопы, узнаваемые гибридомами ГХ-F8/О1, 3Е4, 3В5, являются
устойчивыми к различного рода воздействиям (щелочь, кислота, перекись
водорода, хлороформ, формалин, трипсин, кипячение) и сохраняют свою
структурную организацию.
3. Источником МКА могут быть как асцитические, так и культуральные
жидкости, причем количество моноклональных иммуноглобулинов,
выделенных из определенных объемов культуральной жидкости, является
достаточным для приготовления диагностических препаратов, что исключает
привлечение лабораторных животных.
4. Разработана биотехнологическая схема изготовления флуоресцирующих
иммуноглобулинов, включающая в себя следующие этапы: получение и
очистка МКА; конъюгация МКА с флуорохромом; удаление избытка ФИТЦ;
лиофилизация. Результаты лабораторных испытаний ФИТЦ-МКА на
широком наборе штаммов позволили укомплектовать их в диагностический
набор реагентов «Иг - V. cholerae О1/О139 – РИФ».
5. На основе МКА сконструирован диагностический набор «ИГ V. cholerae О1/О139 - РА», который позволяет выявлять холерные вибрионы
О1 и О139 серогрупп в реакции слайд-агглютинации, обеспечивая отсутствие
перекрестных реакций с близкородственными и гетерологичными
микроорганизмами без дополнительной постановки ее развернутого варианта,
что существенно сокращает время постановки реакции и экономические
затраты.
6. Положительные реакции иммунофлуоресценции и агглютинации с
холерными вибрионами О1 и О139, выращенными в анаэробных условиях, в
присутствии глицерина (10% и 15%) и жѐлчи (1% и 5%), свидетельствуют о
сохранности антигенных детерминант ЛПС и диагностических возможностях
разработанных препаратов, пригодных для детекции V. cholerae О1 и О139 не
только после выделения чистой культуры, но и для обнаружения возбудителя
холеры в материале от больных и из объектов окружающей среды.
7. Диагностическая ценность разработанных препаратов подтверждена
техническими и медицинскими испытаниями, в ходе которых на разных
сериях была показана высокая специфичность и отмечено полное
соответствие физико-химических свойств заявленным в ТУ критериям
17
качества, на основании чего наборы реагентов «Иг - V. cholerae О1/О139 –
РИФ» и «ИГ - V.cholerae О1/О139 - РА» направлены на государственную
регистрацию в качестве изделий медицинского назначения.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
а) статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК
1. Алексеева, Л.П. Идентификация холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп
с помощью моноклональных антител и реакции слайд-агглютинации /
Л.П.Алексеева, В.Д. Кругликов, Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов,
В.В.Евдокимова, Е.П. Авдеева, О.Ф. Фатеева*, М.Э. Яговкин // Клиническая
лабораторная диагностика. – 2010. – № 11. – С. 53 - 56.
2. Алексеева, Л.П. Сравнительная оценка методов дот-иммуноанализа и
иммунохроматографии при выявлении холерных вибрионов О1 серогруппы /
Л.П. Алексеева, Н.Р. Телесманич, Ю.М. Ломов, М.В. Храмов, В.Д.Кругликов,
В.В. Агафонова, О.Ф. Фатеева*, Д.А. Чеботарѐв, А.В. Керманов // Журнал
микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – 2010. – № 6. – С. 88–93.
3. Алексеева, Л.П. Получение и свойства холерных Инаба-специфических
моноклональных антител / Л.П. Алексеева, В.Д. Кругликов, Ю.М. Ломов,
В.В. Евдокимова, О.Ф. Фатеева*, М.Э. Яговкин // Эпидемиология и
инфекционные болезни. – 2011. – № 1. – С. 28 –31.
4. Кретенчук, О.Ф. Оптимизация условий получения диагностических
флуоресцирующих моноклональных иммуноглобулинов для идентификации
холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп / О.Ф. Кретенчук, Л.П.Алексеева,
О.В. Маркина, Г.А. Козлова, М.Э. Яговкин, В.Д. Кругликов,
И.В.Архангельская // Клиническая лабораторная диагностика. – 2012. – № 12.
– С. 32 – 34.
5. Алексеева, Л.П. Использование моноклональных пероксидазных
конъюгатов для идентификации холерных вибрионов О1, О139 в реакции
дот-иммуноанализа / Л.П. Алексеева, Г.А. Козлова, О.В. Маркина,
О.Ф.Кретенчук, М.Э. Яговкин, О.С. Бурша // Клиническая лабораторная
диагностика. – 2013. – №3. – С.26 – 29.
б) тезисы научных конференций
6. Алексеева, Л.П. Идентификация холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп
в реакции слайд-агглютинации с использованием моноклональных антител /
Л.П. Алексеева, В.Д. Кругликов, В.В. Евдокимова, Е.П. Авдеева,
О.Ф.Фатеева*, М.Э. Яговкин, Э.Г. Цедова // Пробл. комиссия «Холера и
патоген. для человека вибрионы». – Ростов-на-Дону, 2009. – вып. 22.–С.66-68.
7. Алексеева, Л.П. Моноклональные антитела к антигену холерных
вибрионов эльтор серовара Инаба / Л.П. Алексеева, В.В. Евдокимова,
О.Ф.Фатеева*, Д.А. Чеботарев, М.Э. Яговкин, О.А. Татаренко // Пробл.
комиссия «Холера и патоген. для человека вибрионы». – Ростов-на-Дону,
2009. – вып. 22. – С. 68 - 70.
18
8. Евдокимова, В.В. Оценка агглютинирующей способности холерных
моноклональных иммуноглобулинов / В.В. Евдокимова, Л.П. Алексеева,
Е.П.Авдеева, В.Д. Кругликов, О.А. Татаренко, О.Ф. Фатеева* // Матер.
научно-практической конф. «Современные аспекты эпид. надзора и
профилактики особо опасных природноочаговых болезней», посвящ. 75летнему юбилею ФГУЗ Иркутского НИПЧИ Сибири и Д. Востока. – Иркутск,
2009. – С.105 - 106.
9. Алексеева, Л.П. Условия образования «ругозного» фенотипа вибрионов
эльтор и его свойства / Л.П. Алексеева, В.Д. Кругликов, О.А. Татаренко,
И.С.Шестиалтынова, Н.Н. Ускова, М.Э. Яговкин, О.Ф. Фатеева* // Пробл.
комиссия «Холера и патоген. для человека вибрионы». – Ростов-на-Дону,
2010. – вып. 23. – С. 68 – 70.
10. Фатеева,
О.Ф.*
Оценка
специфичности
флуоресцирующих
моноклональных иммуноглобулинов для детекции холерных вибрионов О1 и
О139 серогрупп
/ О.Ф. Фатеева*, Л.П. Алексеева, Г.А. Кузьмина,
М.Э.Яговкин, В.Д. Кругликов, И.В. Архангельская, Л.В. Григоренко // Пробл.
комиссия «Холера и патоген. для человека вибрионы». – Ростов-на-Дону,
2011.- вып. 24. – С. 180 – 183.
11. Кузьмина, Г.А. Использование моноклональных пероксидазных
конъюгатов для идентификации холерных вибрионов О1, О139 серогрупп в
реакции дот-иммуноанализа / Г.А. Кузьмина, Л.П. Алексеева, О.Ф.Фатеева*,
В.Д. Кругликов, М.Э. Яговкин, И.В. Архангельская, Л.В. Григоренко //
Пробл. комиссия «Холера и патоген. для человека вибрионы». – Ростов-наДону, 2011. – вып. 24. – С. 172 - 174.
12. Кретенчук, О.Ф. Моноклональные диагностические препараты для
идентификации холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп в реакциях слайдагглютинации и прямой иммунофлуоресценции / О.Ф. Кретенчук,
Л.П.Алексеева, О.В. Маркина, М.Э. Яговкин, О.С. Бурша // Фундаментальные
и прикладные аспекты анализа риска здоровью населения: Матер.
Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и
специалистов Роспотребнадзора. – Пермь, 2012. – Т.1. – С.334 – 338.
13. Григоренко, Л.В. Дифференциация водных штаммов V. cholerae non O1/
non O139 от холерных вибрионов О1 серогруппы / Л.В. Григоренко,
В.Д.Кругликов, Н.Р. Телесманич, Л.П. Алексеева, И.В. Архангельская,
М.И.Ежова, Н.Н. Ускова, И.С. Шестиалтынова, Д.А. Зубкова,
О.Ф.Кретенчук, О.В. Маркина // Пробл. комиссия «Холера и патоген. для
человека вибрионы». – Ростов-на-Дону, 2012. – вып. 25. – С. 72 – 74.
14. Кругликов, В.Д. Изучение циркуляции холерных вибрионов в водоемах
и стоках г. Ростова-на-Дону в период с 2008 по 2011 г. / В.Д. Кругликов,
Н.Р.Телесманич,
Ю.М.
Ломов,
А.Б.
Мазрухо,
М.И.
Ежова,
И.С.Шестиалтынова, Т.А. Кудрякова, Ю.Г. Киреев, Л.В. Григоренко,
19
И.В.Архангельская, О.А. Шалу, С.О. Водопьянов, А.С. Водопьянов,
Д.И.Каминский, К.К. Рожков, Н.Н. Ускова, Н.Б. Непомнящая, Г.В. Качкина,
Н.Е. Гаевская, Л.Д. Македонова, О.Ф. Кретенчук // Пробл. комиссия
«Холера и патоген. для человека вибрионы». – Ростов-на-Дону, 2012.- вып.
25. – С. 50 – 55.
15. Алексеева, Л.П. Оценка диагностической эффективности наборов
реагентов для серологической идентификации V. сholerae О1 и О139
методами РИФ и РА / Л.П. Алексеева, О.Ф. Кретенчук, О.В. Маркина,
М.Э. Яговкин, В.Д. Кругликов, И.В. Архангельская, Н.Р. Телесманич //
Пробл. комиссия «Холера и патоген. для человека вибрионы». – Ростов-наДону, 2013, вып. 26. – С. 211 – 215.
16. Баранова, Е.В. Разработка иммунохроматографических тестов для
выявления штаммов серогруппы О1 и токсинобразующих штаммов
холерного вибриона / Е.В. Баранова, Г.Н. Федюкина, П.В. Соловьев,
Н.В. Колосова, Л.В. Миронова, Е.С. Куликалова, Л.Я. Урбанович,
П.Г. Свешников, Т.А. Ягудин, Е.В. Морозкина, М.В. Храмов, С.Ф. Бикетов,
Л.П. Алексеева, О.Ф. Кретенчук // Пробл. комиссия «Холера и патоген. для
человека вибрионы». – Ростов-на-Дону, 2013, вып. 26. – С. 215 – 218.
17. Алексеева, Л.П. Видоспецифические моноклональные пероксидазные
конъюгаты в варинтах «сэндвич»-ИФА для детекции противохолерных
антител / Л.П. Алексеева, О.С. Бурша, О.Ф. Кретенчук, О.А. Татаренко,
М.Э.Яговкин, Н.Р. Телесманич // Пробл. комиссия «Холера и патоген. для
человека вибрионы». – Ростов-на-Дону, 2013. – вып. 26. – С. 218 – 220.
в) патенты на изобретение:
18. Пат. 2425874 Российская Федерация, МПК С12N 5/18, С12Р 21/08.
Штамм культивируемых гибридных клеток животных Mus. musculus L –
продуцент моноклональных антител, специфичных к О-антигену холерных
вибрионов О1 серогруппы / Алексеева Л.П., Евдокимова В.В., ФатееваО.Ф.*;
заявитель и патентообладатель Федеральное государственное учреждение
здравоохранения «Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени
научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. №2010114795/10; заявл. 13.04.10; опубл. 10.08.11, Бюл. №22. – 7 с.
19. Пат. 2425875 Российская Федерация, МПК С12N 5/18, С12Р 21/08,
G01N 33/569. Штамм культивируемых гибридных клеток животных Mus.
musculus L – продуцент моноклональных антител, специфичных к ЛПС
холерных вибрионов О139 серогруппы / Алексеева Л.П., Маркина О.В.,
Фатеева О.Ф.*, Яговкин М.Э.; заявитель и патентообладатель Федеральное
государственное учреждение здравоохранения «Ростовский-на-Дону ордена
Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный
институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав
20
потребителей и благополучия человека. – № 2010123205/10; заявл. 07.06.10;
опубл. 10.08.11, Бюл. № 22. – 7 с.
«*» - фамилия Фатеева О.Ф. изменена на Кретенчук О.Ф.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АЖ – асцитическая жидкость
БСА – бычий сывороточный альбумин
ГАТ – селективная среда, содержащая гипоксантин, аминоптерин и тимидин
ДАБ – диаминобензидин
ДИА – дот-иммуноферментный анализ
ДМСО – диметилсульфоксид
ИФА – иммуноферментный анализ
КББ – карбонат-бикарбонатный буфер
КЖ – культуральная жидкость
ЛПС - липополисахарид
МКА – моноклональные антитела
МФА – метод флуоресцирующих антител
НАФ – неполный адъювант Фрейнда
ОП – оптическая плотность
ПАФ – полный адъювант Фрейнда
ПЭГ – полиэтиленгликоль
РА – реакция агглютинации
РИФ – реакция иммунофлуоресценции
РПИФ – реакция прямой иммунофлуоресценции
РНИФ – реакция непрямой иммунофлуоресценции
РП – реакция преципитации
ТУ – технические условия
ФИТЦ – флуоресцеинизотиоцианат
ФСБ – фосфатно-солевой буфер
↓ - штаммы со сниженной агглютинабельностью видовой О1 сывороткой
Благодарности
Приношу искреннюю благодарность научному руководителю
кандидатской диссертации д.б.н., проф. Людмиле Павловне Алексеевой,
оказавшей помощь на всех этапах работы, моим соавторам, принимавшим
участие в проведении экспериментов.
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа