close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

;docx

код для вставкиСкачать
УДК 577.15
КАТАЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННОГО
ПОЛИФЕРМЕНТНОГО КОМПЛЕКСА ГЛИКОЗИДАЗ
ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕБИОТИКОВ
Е.В. Ожимкова, Э.М. Сульман, В.Ю. Долуда
Тверской государственный технический университет
Е.И. Мартиросова
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, г. Москва
И.В. Ущаповский
ГНУ ВНИИМЛ Россельхозакадемии, г. Тверь
Термин «пребиотик» был введен не так давно и впервые был использован для
определения «неусваиваемого пищевого ингредиента, который благотворно влияет на
организм человека, выборочно стимулируя рост и/или активность бактерий в толстой
кишке, и таким образом улучшает здоровье хозяина» [1]. Соответственно, пребиотик
должен выдерживать переваривание и всасывание в желудке и тонком кишечнике и
достигать толстой кишки без изменений, где он ферментируется микрофлорой
желудочно-кишечного тракта. В толстой кишке пребиотик избирательно стимулирует
рост или активность бактерий, особенно бифидобактерий и лактобактерий, что в свою
очередь приводит к снижению числа факультативных анаэробных микроорганизмов,
таких как кишечная палочка и клостридии [2, 3]. Хотя неперевариваемые азот- и
липидсодержащие соединения также могут оказывать пребиотический эффект, наиболее
широкое коммерческое использование в качестве пребиотиков нашли неперевариваемые
углеводы. В частности, довольно широко используют олигосахариды – углеводные
молекулы, содержащие небольшое количество моносахаридных остатков, соединенных
гликозидными связями. На сегодняшний день основными пребиотиками можно назвать
фруктоолигосахариды, лактулозу и галактоолигосахариды. В качестве перспективных
пребиотиков многие авторы рассматривают ксилоолигосахариды и глюкоолигосахариды
[4, 5].
Таким образом, олигосахариды представляют собой крупнейший класс пребиотиков.
Существует несколько основных способов получения олигосахаридов, при этом особого
внимания заслуживает энзиматическая деградация гетерополисахаридных субстратов
иммобилизованными ферментативными комплексами.
Представленная работа посвящена иммобилизации гликолитического ферментного
комплекса гриба Trichoderma viride на полимерном носителе SEPABEADS EC-НА 403.
Тrichoderma viride способна продуцировать несколько гидролитических ферментов:
β – глюкозидазу [6, 7], пектинэстеразу [8] и ксиланазу [9, 10]. Основным ферментом
Тrichoderma viride ряд исследователей считает ксиланазу.
Ксиланаза Тrichoderma viride (эндо-1,4-D-ксиланаза; 1,4-D-ксиланогидролаза, КФ
3.2.1.8) является истинной ксиланогидролазой, то есть не обладает целлюлозолитической
активностью; представляет собой низкомолекулярный пептид с молекулярной массой 18
кДа, pI 9,3 [9]. Структура фермента может быть охарактеризована как «глубокая чаша», в
которой противоположные концы существенно различаются по диаметру (45 Å и 35 Å
соответственно). В структуре ксиланазы Тrichoderma viride различают каталитический
домен (находится внутри «чаши»), а также домены, отвечающие за термостабильность
фермента и такие, которые обеспечивают образование «фермент-субстратного» комплекса
[11].
Основные гидролитические свойства ксиланазы Trichoderma viride зависят
от условий, при которых проводят ферментативный гидролиз, при этом необходимо
учитывать время реакции и концентрацию субстрата. Ксиланаза Trichoderma viride
способна гидролизовать ксиланы и их производные из различных источников.
Чаще всего продуктами гидролиза являются олигоксиланы, ксилобиозы и ксилоза,
при этом ксилоза – не основной продукт действия ксиланазы, чаще всего
в гидролизатах преобладают олигоксиланы. Очевидно, что ксиланаза Trichoderma viride
сначала удаляет заместители в арабиногалактанах, а затем гидролизует производные
ксилана [9].
Узкая субстратная специфичность ферментативного катализа и уникальная
способность ускорять реакции в десятки и сотни раз в условиях нормального давления и
температур позволяют получать высокие выходы продуктов и реализовывать на практике
экономически выгодные процессы. Однако при использовании свободных ферментов
возникает ряд трудностей, большинство из которых возможно устранить с помощью
иммобилизации. Иммобилизация – один из наиболее распространенных подходов к
стабилизации фермента [12]. Иммобилизация достигается нанесением ферментов на
твердую подложку, в результате чего получаются гетерогенные ферментные системы. При
иммобилизации ферментов происходит стабилизация каталитической активности, так как
этот процесс, как правило, препятствует денатурации белков. Иммобилизованные
ферменты приобретают, помимо стабильности, отдельные свойства, не характерные для
их свободного состояния, например, возможность функционировать в неводной среде,
более широкие зоны оптимума по температуре и рН [13]. С технологической точки зрения
важно то, что разнородность иммобилизованных систем позволяет легко разделять
фермент и продукт, повторно использовать фермент, вести непрерывные ферментативные
процессы [12, 14].
При выполнении работы были синтезированы гетерогенные катализаторы,
активный компонент которых – ферментный комплекс Trichoderma viride – присоединен к
поверхности модифицированного нерастворимого органического носителя – полимерного
носителя SEPABEADS – методом молекулярной сшивки полифункциональными
реагентами (рис. 1).
Рис. 1. Схема закрепления фермента на SEPABEADS EC-НА 403
Экспериментально определено оптимальное соотношение компонентов системы
«носитель – модификатор-фермент», а также обосновано время синтеза каталитической
системы.
Стабильность катализаторов является одним из важнейших показателей при
внедрении каталитических систем в промышленность. Для исследования стабильности
полученная каталитическая система была использована в последовательных опытах по
гидролизу гетерополисахаридов. Полученные результаты показали, что активность
разработанной каталитической системы при последовательных реакциях остается
практически постоянной (за 10 циклов теряется около 8 % активности) (рис. 2),
в то время как описанные в литературных источниках катализаторы на основе
иммобилизованных гидролаз способны сохранять свою активность на 73 % после
8 циклов использования [15], на 94 % после 13 циклов [16], а также на 70 %
после 7 циклов [17].
Специфическая активность,
ед/мг белка
66
65
64
63
62
61
60
59
0
2
4
6
8
10
Операционный цикл
Рис. 2. Зависимость активности каталитической системы
от числа операционных циклов
Таким образом, была доказана эффективность синтезированной каталитической
системы при гидролизе растительных гетерополисахаридов, что делает возможным ее
многократное использование в промышленности как в непрерывных, так и периодических
процессах.
Физико-химические свойства полученной биокаталитической системы установлены
методами определения полимолекулярной адсорбции с интерпретацией по теории С.
Брунауэра, П. Эммета и Э. Теллера (теория БЭТ), инфракрасной Фурье-спектроскопии и
рентгенофотоэлектронной спектроскопии.
Синтезированная биокаталитическая система была использована для гидролиза
растительных гетерополисахаридов (ксилана, гликанов льна обыкновенного и валерианы
лекарственной). Пробы, содержащие олигосахариды, анализировались методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии. В ходе анализа была использована
хроматографичекая система «Dionex, Ultimate 3000 USA», снабженная рефрактометром
сравнения и жидкостным хромато-масс-спектрометром. В качестве неподвижной фазы
был
использован
полимерный
носитель
Reprogel-H,
являющийся
слабым
катионообменником. Скорость подачи элюента 0,5 мл/мин, давление на входе колонки 24
атм. Хроматографический анализ проводился при температуре 30,5 °С. Хроматограммы
обрабатывались методом исправленной нормировки площадей пиков.
На основании экспериментальных данных определены кинетические параметры
процессов. Подобраны оптимальные условия реакций гидролиза гетерополисахаридов для
накопления максимального количества три- и пентаолигосахаридов в реакционной среде.
Библиографический список
1. Gibson, G. Dietary modulation of the human colonic microflora: introducing the
concept of prebiotics / G. Gibson, М. Roberfroid // J Nutr. 1995. Vol. 12. Р. 1401–1412.
2. Roberfroid, M. Functional food concept and its application to prebiotics /
М. Roberfroid // Dig Liver Dis. 2002. Vol. 43. Р. 105–110.
3. Priebe, M. The physiology of colonic metabolism: possibilities for intervention with
pre- and probiotics / М. Priebe // Eur J Nutr. 2002. Vol. 41 (Suppl 1). Р. 2–10.
4. Gibson, G . Prebiotics: new developments in functional foods. Chandos Publishing
2000.
5. Van Loo, J. Prebiotics promote good health: the basis, the potential and the emerging
evidence / J. Van Loo // Clin Gastroenterol. 2004. Vol. 38 ( Suppl 6). Р. 70–75.
6. Voragen, A. Cellulases of a mutant strain of Trichoderma viride QM 9414
/ A. Voragen, G. Beldman, F. Rombouts // Methods Enzymol. 1988. Vol. 160. P. 243–251.
7. Production of beta-glucosidase, exo-beta-1,4-glucanase and endo-beta-1,4-glucanase
by selected microscopic fungi / J. Augustin, J. Zemek, B. Kuniak, O. Fassatiova // Folia
Microbiol. (Praha). 1981. Vol. 26. Р. 14–18.
8. Versteeg, C. Pectinesterases from the orange fruit – their purification, general
characteristics and juice cloud destabilizating properties / C. Versteeg // Versl. Landbouwkd.
Onderz. (Agric. Res. Rep.). 1979. Vol. 892. Р. 1–109.
9. Trichoderma xylanases: their properties and application / Y. Kenk A. Wong,
N. John, A. Saddler // Critical reviews in biotechnology. 2008. Vol. 12 (5). Р. 413–435.
10. Ujiie, M. Low-Molecular-Weight Xylanase from Trichoderma viride / M. Ujiie,
C. Roy, M. Yaguchi // Applied and environmental microbiology. 1991. Vol. 4. Р. 1860–1862.
11. Collins, T. Xylanases, xylanase families and extremophilic xylanases / T. Collins, C.
Gerday, G. Feller // FEMS Microbiology Reviews. 2005. Vol. 29, Р. 3–23.
12. Short recursive procedure for evaluating effectiveness factors for immobilized
enzymes with reversible Michaelis – Menten kinetics / C. Gоmez, A. Santoyo, E. Gоmez,
J. Rodríguez, M. Máximo Martín, M. Gómez //, Biochemical Engineering Journal. 2008.
Vol. 39(1). Р. 58–65.
13. Thomas, S.M. Biocatalysis: applications and potentials for the chemical industry /
S.M. Thomas, R. DiCosimo, V. Nagarajan // Trends Biotechnol. 2002 . Vol. 20. Р. 238–242.
14. Padma, V. Enzyme stability and stabilization – Aqueous and non-aqueous
environment / V. Padma, L. Ananthanarayan // Process Biochemistry. 2008. Vol. 43.
Р. 1019–1032.
15. Mona, K. Catalytic properties of the immobilized Aspergillus tamarii xylanase
/ K. Mona, A. Abdel-Naby // Microbiological Research. 2002. Vol. 157 (4). Р. 275–281.
16. Production of xylo-oligosaccharides from agro-industrial residues using immobilized
Talaromyces
thermophilus
xylanase
/
I.
Maalej-Achouri,
M.
Guerfali,
A. Gargouri, H. Belghith.// Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2009. Vol. 59 (1–3). Р.
145–152.
17. Simultaneous purification and immobilization of Aspergillus niger xylanase on the
reversibly soluble polymer EudragitTM L-100 / S. Merya, R. Ipsita, N. Munishwar // Enzyme
and Microbial Technology. 2000. Vol. 27 (9). Р. 672–679.
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа