close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

;doc

код для вставкиСкачать
СЛЮНА
В полости рта пища смачивается слюной. Количество слюны, выделяющееся за
сутки, зависит от особенностей пищи. Однако можно считать, что у взрослого человека
за сутки выделяется в среднем около 1500 мл. слюны. Она содержит 99,0 – 99,5 % воды
и только 0,5 – 1 % сухого остатка. Слюна имеет рН близкий к нейтральному (6,8 – 7,4).
Слюна, находящаяся в полости рта (смешанная слюна или ротовая жидкость), содержит секрет больших и малых слюнных желез, слущенный эпителий, лейкоциты, бактерии и продукты их обмена. Поэтому смешанная слюна очень отличается по биохимическим параметрам от слюны из протоков слюнных желез (собственно слюна).
Слюна в полости рта выполняет несколько функций.
1. Защитная – слюна увлажняет и очищает ткани ротовой полости, поддерживает видовой состав микрофлоры полости рта, формирует защитный барьер из муцина, антител и ферментов желез, лейкоцитов, формирует пелликулу зубов, предотвращает
осаждение из слюны перенасыщенного раствора фосфата кальция.
2. Пищеварительная – слюна смачивает пищу, обволакивает пищевые частицы муцином, облегчает проглатывание, вызывает растворение солей, сахаров, расщепление
поли- и олигосахаридов.
3. Регуляторная – регулирует образование пищеварительных соков в желудочнокишечном тракте, выделение гормоноидов и гормонов, регулирующих процессы
минерализации эмали зуба, и поддержание гомеостаза полости рта (содержит паротин, эритропоэтин, фактор роста нервов, фактор роста эпителия и др.).
4. Минерализационная – участвует в формировании апатитов эмали.
5. Выделительная. Со слюной выделяются низкомолекулярные азотосодержащие соединения (мочевина и др.), катионы и анионы, метаболиты гормонов, лекарств и др.
Смешанная слюна содержит органические и неорганические компоненты (табл. 1).
В ней присутствуют многие макро- и микроэлементы, но особенностью данной биологической жидкости является высокое содержание неорганического фосфата и кальция,
что связано с ее минерализующей функцией.
Таблица 1.
Химический состав слюны
Вещества
Азот небелковый
Мочевина
Белок
Калий
Натрий
Кальций
Магний
Хлор
Фосфор неорганический
Роданиды
Лактат
Пируват
Глюкоза
г/л
0,1 – 0,2
0,1 – 0,2
0,8 – 4,0
0,21 – 1,29
0,28 – 0,83
0,04 – 0,10
0,01
0,50 – 2,0
0,05 – 0,15
0,03 – 0,07
0,03 – 0,05
0,02 – 0,03
0,01 – 0,03
Моль/л
0,75 – 2,0
1,7 – 3,3
1,0 – 2,5
1,6 – 5,0
0,5 – 1,2
0,3 – 0,6
0,06 – 0,17
Всего методом электрофореза в смешанной слюне получают до 17 белковых
фракций, важнейшими являются муцин, альбумины, иммуноглобулины, ферменты. В
смешанной слюне определяется активность более 100 ферментов, различных по происхождению и выполнению биологических функций (табл. 2).
Активность ряда ферментов в слюне крайне низка (протеиназы, гликозидазы и
др.). Это связано с тем, что они находятся в комплексе с белками-ингибиторами. Так, в
слюне определяется α1 – ингибитор протеиназ (α1 – антитрипсин), α2 – макроглобулин,
низкомолекулярные кислотостабильные ингибиторы трипсиноподобных протеиназ
(КСИ), ингибиторы цистеиновых протеиназ (цистатины S, SA, SN), антилейкопротеиназа и возможно другие. Повышение активности протеиназ, освобождение их из комплексов с ингибиторами способствует развитию воспаления пародонта.
Таблица 2.
Ферменты
α – амилаза
Мальтаза
Сахараза
Гиалуронидаза
Лизоцим
Кислая фосфатаза
Щелочная фосфатаза
Липаза
Протеиназы
Пептидазы
Уреаза
Каталаза
Лактопероксидаза
Миелопероксидаза
Гексокиназа
Альдолаза
Лактатдегидрогеназа
Некоторые ферменты слюны
Источники фермента
Биологическое действие
Железы
Микроорга- Лейкоциты
низмы
Пищеварит., защитное
0
0
+
Пищеварительное
+
+
0
Пищеварительное
+
+
0
Повреждающее
0
+
0
Защитное
+
0
+
Деминерализующее
+
+
+
Минерализующее
+
+
+
Пищеварительное
+
+
+
Повреждающее
+
+
0
Повреждающее
+
+
0
Защелачивающее
0
+
0
Защитное
0
+
0
Защитное
+
0
+
Защитное
+
0
0
Утилизация микроорган.
0
+
0
сахаров с образованием
+
+
+
+
+
0
органических кислот
Слюна содержит мочевину, лактат, пируват и другие органические кислоты, витамины, гормоны, нитраты и нитриты, роданиды (тиоцианаты) и другие соединения. В
осадке слюны в 2 – 4 раза больше содержится лактата, чем в жидкой ее части, в то время как пируват определяется больше в надосадочной жидкости. Увеличение содержания органических кислот, в частности, лактата в слюне, зубном налете способствует
очаговой деминерализации эмали и развитию кариеса. С пищей, табачным дымом, водой в слюну поступают нитраты и нитриты. Нитраты при участии нитратредуктазы бактерий превращаются в нитриты, они в свою очередь могут вступить в реакцию со вторичными аминами (аминокислоты, лекарства) с образованием канцерогенных нитрозосоединений или превратиться в аммиак (NH3)
Тиоцианаты (SCN-, роданиды) поступают в слюну из сыворотки крови и образуются
при участии роданезы из синильной кислоты. В слюне они окисляются до гипотиоциа-
натов и других производных, участвующих совместно с лактопероксидазой в защитных
реакциях слюны. К факторам местной защиты также относятся иммуноглобулины Ig A,
Ig G, Ig M, муцин, ингибиторы протеиназ и β – глюкуронидазы, лизоцим, РНК–аза и
ДНК-аза, амилаза и через слизистую оболочку полости рта мигрирующие лейкоциты.
Состав слюны колеблется в течение суток, зависит от приема пищи и состояния организма и, в частности, зубочелюстной системы. Обычно во время сна слюноотделение
падает в десятки раз.
Клинико-диагностическое исследование слюны.
Исследование в слюне минеральных веществ, белков, фрагментов, а также метаболитов используется как для оценки физиологического состояния организма, так и в диагностике общих заболеваний и болезней тканей полости рта. Вместе с тем, изучение
состава смешанной слюны, интерпретация полученных сведений из-за многокомпонентности данной жидкости, является достаточно сложным и требует соблюдения
стандартных условий получения и хранения слюны, методов исследования. В смешанной и проточной слюне определяют рН, буферную емкость, количество макро- и микроэлементов, таких как калий, фосфор, натрий, кальций и др., белки слюны, ферменты,
гормоны, метаболиты углеводного и белкового обмена. Исследуется как цельная слюна,
так и раздельно надосадочная жидкость и осадок.
Количественный состав слюны зависит от физиологического статуса, в частности от
возраста, поэтому слюна грудного ребенка отличается от таковой взрослого человека.
Например, в слюне грудных детей до 6 месяцев ионов натрия содержится в 2 раза
больше по сравнению со слюной взрослого, что связано с процессами реабсорбции в
слюнных железах. С возрастом также в слюне увеличивается количество иммуноглобулина А, тиоцианатов, быстро мигрирующих форм изоферментов амилазы.
слюна является источником генетических маркеров. Полиморфизм белков, наличие
водорастворимых гликопротеинов, обладающих антигенной специфичностью, отражает
число локусов и аллелей, а также частоту аллелей у различных человеческих рас, что
имеет большое значение в антропологии, популяционной генетике, судебной медицине.
Измерение концентрации гормонов в слюне позволяет оценить состояние надпочечников, гонадотропную функцию, ритмы образования и выделения гормонов. Слюну используют для оценки метаболизма лекарственных веществ, например, этанола, фенобарбитала, препаратов лития, салицилатов, диазепама и др. Существует корреляционная
связь между количеством ряда лекарств в крови и слюне, как в смешанной, так и из
протоков.
Ряд заболеваний сопровождается определенными сдвигами в составе слюны, как
смешанной, так и из протоков. При уремии, возникающей при почечной недостаточности, в слюне, как и в сыворотке крови, увеличивается количество остаточного азота за
счет увеличения мочевины. Показано, что при артериальной гипертензии в паротидной
слюне увеличивается уровень цАМФ, уровень общего кальция, калия, но снижается
концентрация ионизированного кальция. При поликистозе яичка, сопровождающегося
бесплодием, в слюне повышается количество свободного тестостерона, при поражении
надпочечников и при использовании заместительной терапии кортизола в слюне увеличивается содержание 17 α-гидрокситестостерона.
Поражение слюнных желез ведет к определенным сдвигам в составе слюны. При
опухолях слюнных желез в слюне появляются дополнительные фракции белков, преимущественно сывороточного происхождения, меняется количество секрета. При хроническом паротите также возрастает транссудация сывороточных белков, в частности,
альбумина, увеличивается секреция калликреина, мураминидазы. В период обострения
сдвиги нарастают и остаются в течение 2 месяцев. Для синдрома Съегрена характерно
угнетение слюнообразования и слюноотделения, что связано с поражением малых и
больших слюнных желез. В слюне этих больных увеличивается количество иммуногло-
булинов А и М, активность кислых протеиназ и кислой фосфатазы, меняется количество кальция и фосфора.
Хотя и не выявлено значительных отклонений в составе слюны при кариесе зубов и
сведения эти крайне противоречивы, все-таки показано, что у кариесрезистентных лиц
содержание амилазы значительно выше, чем у кариесвосприимчивых. Имеются также
данные, что при кариесе увеличивается активность кислой фосфатазы, меняется активность лактатдегидрогеназы.
Воспаление пародонта сопровождается повышением активности в слюне катепсинов
Д и В и слабощелочных протеиназ. При этом меняется активность ингибиторов протеиназ, снижается антитриптическая активность, но увеличивается в 1,5 раза активность
местно вырабатываемых кислотостабильных протеиназ (КСИ), большая часть которых
находится в комплексе с протеиназами. Меняются и свойства самих КСИ, что возможно,
связано с образованием их частично расщепленных форм под действием различных
протеиназ.
При пародонтите меняется активность нитратредуктазы и содержание нитритов.
При легкой и средней тяжести пародонтита отмечается снижение активности нитратредуктазы, однако, в случае обострения процесса, при пародонтите тяжелой степени активность фермента возрастает по сравнению с нормой вдвое, а количество нитритов
уменьшается в 4 раза.
Для пародонтита характерно повышение активности гиалуронидазы и βглюкуронидазы, при этом повышается и количество ингибитора β-глюкуронидазы. Активность пероксидизы возрастает в 1,5 – 1,6 раза, а содержание лизоцима снижается на
20 – 40 %. Изменения в защитной системе сочетаются с увеличением количества тиоцианатов в 2-3 раза. Иммуноглобулины меняются неоднозначно, но увеличивается количество плазменных иммуноглобулинов G и М.
Теоретические вопросы по теме «Биохимия слюны».
1.Понятие о слюне и ротовой жидкости. Компоненты ротовой жидкости (смешанная
слюна).
2.Содержание основных органических и неорганических компонентов смешанной
слюны. Значение слюны для зубочелюстной системы и организма в целом.
3.Ферменты слюны. Происхождение и роль в пищеварении и минерализации эмали
зубов.
4.Изменение состава слюны в зависимости от времени суток, питания, возраста, состояния организма.
5.Отличие в составе осадка и надосадочной жидкости.
6.Местные факторы защиты в полости рта.
Учебные материалы и литература.
1.Лекционный материал, задания к практическим занятиям.
2.Леонтьев В.К., Петрович Ю.А. «Биохимические методы исследования в экспериментальной и клинической стоматологии». Омск, 1976
3.Петрович Ю.А., Томилин В.В. «Слюна», Большая медицинская энциклопедия,
1983, том 23, С. 703 – 707.
4.Стенд «Биохимия слюны».
5.Учебно-методические указания по биохимии, ММСИ, 1977, стр. 87-89.
6.Уайт А. и соавт. «Основы биохимии», 1981, том 3, стр. 1350 – 1351.
ДЕСНЕВАЯ (ГИНГИВАЛЬНАЯ) ЖИДКОСТЬ (ДЖ).
Это жидкость, находящаяся в десневой щели. Механизм выделения десневой жидкости окончательно не выяснен, однако, существует мнение, что при интактном пародонте десневая жидкость представляет собой транссудат сыворотки крови.
Образование ДЖ, в основном связывают с морфологическими особенностями сосудов и эпителия. Количество ДЖ колеблется в течение суток, утром оно уменьшается, в
вечерние часы максимально, зависит также от местоположения зуба. Появление патологических зубодесневых карманов (при пародонтите) сопровождается увеличением количества и изменением состава ДЖ. Собирают ДЖ путем введения в десневую щель на
1 – 3 мин. стандартных полосок фильтровальной бумаги, микропипеток или с помощью
специальных приспособлений. Дальнейшее увеличение времени получения ДЖ нецелесообразно.
Состав ДЖ. Десневая борозда является основным источником поступления лейкоцитов в слюну. Установлено, что увеличение числа лейкоцитов в ДЖ и слюне находится в прямой зависимости от степени воспаления в тканях пародонта. В ДЖ присутствуют также эпителиальные клетки и микроорганизмы, преимущественно стрептококки и
стафилококки. Хорошо исследован электролитный состав ДЖ. В ней определяются такие элементы, как натрий, калий, кальций, фосфор, магний, фтор. Предполагают, что
ДЖ может служить из источников фтора в полости рта. ДЖ содержит нитриты, количество которых не изменяется при пародонтите. Содержание общего белка в ДЖ составляет 61 – 68 г/л. и не зависит от воспалительно-дистрофических изменений в пародонте.
В ДЖ определяются альбумины, трансферрин, иммуноглобулины IgF, IgG, IgM. Иммуноглобулины в ДЖ поступают из сыворотки крови и лейкоцитов десневого желобка.
Считается, что ДЖ является важным источником антител для ротовой полости. Помимо
иммуноглобулинов в ДЖ определяются все 9 компонентов системы комплемента, играющей важную роль в фагоцитозе, хемотаксисе, освобождении вазоактивных веществ.
ДЖ содержит фибриноген, а также она обладает фибринолитической активностью. В
ДЖ определяется активность ряда ферментов: щелочной и кислой фосфатаз, лактатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы, нитратредуктазы, β-глюкуронидазы, лизоцима, гиалуронидазы, катепсина А и Д, эластазы, аминопептидазы трансаминаз, а также ингибиторов протеиназ – α1-ингибитора протеиназ (α1-антитрипсина), α1-антихимотрипсина,
α2-макроглобулина.
В ДЖ обнаружены глюкоза, гексозамины, лактат, мочевины, аммиак, брадикинин и
др. низкомолекулярные соединения.
Клинико-диагностическое значение исследования ДЖ.
Исследование количества и состава ДЖ проводится при заболеваниях пародонта. В
зависимости от развития гингивита и пародонтита количество ДЖ увеличивается. При
этом возрастает количество эмигрировавших лейкоцитов, в ней появляется слущенный
эпителий с явлениями дегенерации, увеличивается количество разрушенных клеток.
При воспалении пародонта в ДЖ увеличивается количество молочной кислоты, а
вследствие нарушения коллагена – гидроксипролина. Возрастает активность щелочной
и кислой фосфатаз, лактатдегидрогеназы, β - глюкуронидазы, гиалуронидазы, слабощелочных протеиназ, катепсина D, меняется соотношение активностей ингибиторов протеиназ и протеолитических ферментов.
Теоретические вопросы.
1.Понятие о десневой (гингивальной) жидкости. Способы ее получения.
2.Особенности клеточного состава ДЖ.
3.Компоненты ДЖ (органические и неорганические).
4.Белки и ферменты ДЖ.
Литература.
1.Барер Г.М., Кочержинский В.В., Халитова Э.С. «Десневая жидкость, состав и
свойства» Стоматология, 1986, № 4, стр. 86 – 90.
2.Барер Г.М., Кочержинский В.В., Халитова Э.С. «Использование параметров десневой жидкости в клинике болезней пародонта». Методические рекомендации.
ММСИ ,1989.
3.Ерина С.В. «Цитограмма десневой жидкости у больных воспалительными заболеваниями пародонта». В кн.: «Болезни пародонта и слизистой оболочки полости рта» М.
1988. стр. 39 - 42
4.Жяконис И.М. «Содержание иммуноглобулинов в десневой жидкости при пародонтите». Стоматология, 1985, № 1, стр. 22 – 24.
Тесты для самоподготовки по темам «Слюна»,
«Десневая жидкость».
Для ответа используйте нижеприведенную таб. № 1 или буквенные обозначения,
приведенные в текстах.
Таблица 1.
В качестве ответа выберите букву:
А, если 1,2,3 верно.
В, если 1,3 верно.
С, если 2,4 верно.
Д, если 4 верно.
Е, если все верно.
Тесты по теме «Слюна».
I. Выберите компоненты, входящие в состав смешанной слюны:
1.
2.
3.
4.
Секрет больших слюнных желез.
Секрет малых слюнных желез.
Лейкоциты.
Слущенный эпителий.
Ответ по таблице 1
II. При кариесе зубов в смешанной слюне можно обнаружить следующее:
1.
2.
3.
4.
Увеличение количества белка.
Уменьшение секреции слюнных желез.
Увеличение уровня глюкозы.
Увеличение содержания органических кислот.
Ответ по таблице 1
III. Подберите к перечисленным биохимическим изменениям в слюне соответствующий
буквенный ответ:
1. Увеличение активности протеиназ.
А – кариес
2. Снижение уровня хлоридов.
В – парадонтит
3. Увеличение концентрации кальция.
С – при обеих болезнях
4. Увеличение содержания неорганического
Д – ни при одной
фосфата.
5. Увеличение количества белка.
6. Увеличение активности щелочной фосфатазы.
болезни
IV. Подберите к соответствующим показателям соответствующую жидкость:
1. Мочевина 30 г/сутки.
2. Фосфор неорганический.
1,1 – 2,2 ммоль/л.
3. Кальций 2,2 – 2,8 ммоль/л.
4. Белок 0,8 – 4,0 г/л.
5. Белок 65 – 85 г/л.
6. Фосфор неорганический 0,05 – 0,15 г/л (моль/л).
7. Кальций 0,04 – 0,05 г/л (моль/л).
8. Мочевина 0,1 г/л.
А – смешанная слюна
В – сыворотка крови
С - моча
V. Какие иммуноглобулины, входящие в состав слюны, преобладают?
1. Иммуноглобулин А секреторный.
2. Иммуноглобулин С.
3. Иммуноглобулин М.
4. Иммуноглобулин Е.
Ответ в таблице 1
VI. Подберите к пронумерованным белкам слюны соответствующую функцию, обозначенную буквой:
1. α-амилаза.
А – каталитическая
2. Муцин.
В – защитная
3. Са-связывающие белки.
С – регуляторная
4. Лизоцим.
Д – минерализующая
5. Пероксидаза.
6. Паротин.
7. Иммуноглобулин А, G, М.
8. ДНК-аза, РНК-аза.
9. Фосфатазы.
VII. Патогенетическими звеньями пародонтита могут быть:
1. Увеличение миграции лейкоцитов в ротовую полость.
2. Увеличение активности протеиназ.
3. Снижение количества хлоридов.
4. Изменение количества иммуноглобулинов.
Ответ по таблице 1.
VIII. Какие из перечисленных ингибиторов протеиназ присутствуют в смешанной слюне?
1. Местносинтезируемые термокислотостабильные ингибиторы протеиназ.
2. α1-ингибитор протеиназ (трипсина).
3. Ингибиторы цистеиновых протеиназ (цистатины S, SA, SN).
4. α2-макроглобулин.
Ответ по таблице 1.
Тесты по теме «Десневая жидкость» (ДЖ)
I. Выберите факторы, влияющие на количество ДЖ:
1. Глубина зубо-десневого кармана.
2. Врем суток.
3. Положение зуба в челюсти.
4. Время получения ДЖ и поверхность зуба.
II. Источником эмигрировавших лейкоцитов является следующее:
1. Большие слюнные железы.
2. Десневой желобок.
3. Малые слюнные железы.
4. Слизистая оболочка полости рта.
Ответ по таблице 1.
III. Выберите компоненты, входящие в состав ДЖ:
1. Лейкоциты.
2. Микроорганизмы.
3. Слущенный эпителий.
4. Белки и электролиты сыворотки крови.
Ответ по таблице 1.
IV. Подберите к перечисленным показателям в ДЖ, характеризующих воспаление в пародонте, соответствующий буквенный ответ:
1. Количество ДЖ.
А – увеличивается
2. Количество белка.
В – не меняется
3. Содержание нитритов.
4. Активность протеиназ.
5. Активность нитратредуктазы
6. Содержание лизоцима.
7. Количество лактата, гидроксипролина.
8. Активность β-глюкуронидазы
9. Активность гиалуронидазы.
10. Активность мальтатдегидрогеназы.
Лабораторные работы по теме:
«БИОХИМИЯ ЖИДКОСТЕЙ ПОЛОСТИ РТА»
Работа № 1 – ОПРЕДЕЛЕНИЕ рН СЛЮНЫ
Каплю слюны наносят на универсальную индикаторную бумажку и немедленно
сравнивают полученную окраску со шкалой.
Работа № 2 – КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА α -АМИЛАЗУ СЛЮНЫ
На предметное стекло нанести 1 каплю 0,5 % раствора крахмала и 1 каплю слюны. Оставить при комнатной температуре на 5 мин. и добавить 1 каплю раствора Люголя.
Работа № 3 – ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ СЛАБОЩЕЛОЧНОЙ
ПРОТЕИНАЗЫ СЛЮНЫ (метод Anson, 1938).
Принцип метода: определение количества тирозина и других циклических аминокислот, образовавшихся после гидролиза протеиназами слюны денатурированного
гемоглобина. В щелочной среде образуются комплексные соединения аминокислот с
реактивом Фолина и медью, дающие голубое окрашивание.
Ход работы: (ставить в мерных центрифужных пробирках)
Реагенты
Опыт
Контроль
Гемоглобин денатурированный 2%, рН=7,5
0,5 мл
0,5 мл
Слюна
0,25 мл
Инкубация в термостате при 37 °С в течение 60 минут
Трихлоруксусная кислота 5 %
1,25 мл
1,25 мл
Стандарт
-
Слюна
0,25 мл
Центрифугировать при 3000 об/мин в течение 20 минут
1 мл
1 мл
Супернатант
1мл
Раствор тирозина
2 мл
2 мл
2 мл
NaOH 0,5 н. раствор
0,5 мл
0,5 мл
0,5 мл
Реактив Фолина
Через 15 минут интенсивность окраски замерить на фотоэлектроколориметре
при 550 нм.
Расчет по формуле:
0,16 · ЕОП · 1000
А= ────────────
ЕСТ · 60 · 0,125
где А – активность в мкмоль/мин · л -1; 0,16 – количество мкмоль тирозина в 1
мл; ЕОП – экстинкция опыта; ЕСТ – экстинкция стандарта; 60 – время инкубации; 0,125 количество слюны, взятой в опыт; 1000 – пересчет на 1 л. слюны.
Работа № 4 – ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ИГИБИТОРОВ ПРОТЕИНАЗ В
СЛЮНЕ
Принцип метода основан на уменьшении скорости гидролиза комплексом трипсина – слюнный ингибитор субстрата бензоиларгининпаранитроанилина (БАПНА), из которого освобождается паранитроанилин, окрашивающий раствор в желтый цвет.
Ход работы: к 0,1 мл смешанной слюны прибавляют 0,1 мл трипсина (10мкг) и
оставляют при комнатной температуре при небольшом покачивании на 5 мин для образования комплекса трипсин-ингибитор. Затем приливают 2,7 мл фосфатного буфера,
рН=7,8 и 0,1 мл БАПНА. Перемешивают и измеряют оптическую плотность против воды при λ=405 нм в течение 5 мин. Контрольная проба трипсина содержит 0,1 мл фермента (10 мкг), 2,8 мл буфера и 0,1 мл БАПНА и замеряется так же, как опытная.
Расчет активности:
СК · ЕО
СК ─ ──────
ЕК
А = ─────────── ,
V
где А – мкг трипсина, заингибированного 1 мл слюны; СК – количество трипсина
в пробе, в мкг; ЕО – оптическая плотность опытной пробы; ЕК – оптическая плотность
контрольной пробы; V – объем внесенной слюны.
Работа № 5 – ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В
СЛЮНЕ (по методу Bessey et al.)
Принцип метода: Субстрат паранитрофенилфосфат гидролизуется в присутствии
щелочной фосфатазы с образованием паранитрофенола, дающего в щелочной среде
желтое окрашивание.
Ход определения: В опытную и контрольную пробы вносят по 0,5 мл субстратно-буферной смеси. В опытную пробу приливают 0,1 мл слюны и обе пробы помещают
на 30 мин в водяную баню при 37°С. По окончании инкубации обе пробы переносят в
ледяную баню и приливают по 5 мл 0,02 н. раствора NaOH, а в контрольную пробу еще
добавляют 0,1 мл слюны. Интенсивность окрашиванию пробы измеряют против контроля (λ=405 нм) на фотоэлектроколориметре или спектрофотометре.
Активность фермента рассчитывают по формуле:
А = Е · 101 ,
где А – активность фермента в мкмоль/мин на 1 л слюны; Е – оптическая плотность; 101 – коэффициент пересчета в мкмоль/л.
Работа № 6 – ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПЕРОКСИДАЗЫ В СЛЮНЕ ПО
ПОПОВУ, НЕЙКОВСКОЙ (1971) в нашей модификации (1987).
Принцип метода: в присутствии перекиси водорода Пероксидаза окисляет индигокармин, который при этом обесцвечивается.
Ход определения: В опытную и контрольную пробы вносят по 0,5 мл ацетатного
буфера, 0,5 мл индигокармина. В опытную пробу добавляют 0,25 мл смешанной слюны
и помещают обе пробы в водяную баню при 30 °С на 5 мин. По окончании инкубации в
опытную пробу вносят 0,25 мл раствора перекиси водорода, а в контроль 0,5 мл дистиллированной воды. Включают секундомер и останавливают реакцию через 2 мин после
добавления в обе пробы по 1,5 мо 20 %-го раствора серной кислоты. Пробы интенсивно
встряхивают и колориметрируют в кюветах толщиной 1 см на фотоэлектроколориметре
(λ=610 нм) против дистиллированной воды.
Активность пероксидазы рассчитывают по формуле:
А = (ЕК – ЕО) · 1142,9 ,
где А – активность в мкмоль/мин на 1л; ЕК – экстинкция контроля; ЕО – экстинкция опыта; 1142,9 – расчетный коэффициент, полученный на основе формулы Вебера и
Рихтериха.
Работа № 7 –КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФОСФАТОВ В СЛЮНЕ
Принцип метода: Неорганический фосфор с молибденовой кислотой образует
комплекс, который при соответствующих условия может восстанавливаться аскорбиновой кислотой или эйкогеном. При этом появляется окрашивание, интенсивность которого пропорциональна количеству неорганического фосфора, присутствующего в растворе.
Ход работы: К 0,1 мл слюны прибавляют 2,4 мл 5%-го ТХУ для осаждения белка,
перемешивают и центрифугируют 20 мин. Надосадок сливают.
Реактивы
Супернатант
Дистиллированная вода
Стандартный раствор фосфора
Молибденовый реактив с аскорбиновой кислотой
Опыт
2 мл
2 мл
Контроль
2 мл
2 мл
Стандарт
1 мл
1 мл
2 мл
Перемешать и инкубировать в термостате при 37 °С в течение 20 мин. После охлаждения измеряют оптическую плотность опыта и стандарта при 635 нм против контрольной пробы (светофильтр 9) на фотоэлектроколориметре.
При расчете пользоваться следующей формулой:
0,05 · ЕОП · 1000 мг
С = ───────────────,
ЕСТ · 1000 мл · 0,1
где С – содержание фосфора в г/л; ЕОП – экстинкция опыта; 0,05 – мг/мл фосфора; ЕСТ – экстинкция стандарта.
Работа 8.1 – КАЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛОЧНОЙ КИСЛОТЫ В
ОСАДКЕ И НАДОСАДОЧНОЙ ЖИДКОСТИ СЛЮНЫ.
Слюну (1,5 мл) отцентрифугировать при 3000 об/мин в течение 15 мин. Слить
надосадочную жидкость. Осадок растворить в 0,5 мл воды, проделать в обеих пробирках реакцию Уфельмана. Для этого к 20 каплям 1 %-го раствора фенола добавляют 2
капли 1 %-го раствор хлорного железа. Получают фенолят железа, окрашенный в фиолетовый цвет. В две пробирки с фенолятом приливают полученные надосадок и раство-
ренный осадок. Фиолетовая окраска переходит в желто-зеленую, вследствие образования молочно-кислого железа.
Работа 8.2 – КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛАКТАТА В СЛЮНЕ.
Принцип метода: Лактат в присутствии серной кислоты превращается в ацетальдегид.
Ход определения: К 0,2 мл слюны добавляют 2 мл 10 %-го раствора ТХУ и центрифугируют 7 мин при 1500 об/мин. В другую пробирку отбирают 3 мл концентрированной серной кислоты, добавляют 0,5 мл центрифугата и 2 капли 12 %-го раствора
сульфата меди, перемешивают и нагревают 5 мин в кипящей водяной бане. После охлаждения добавляют 1 каплю 1,5 %-го раствора параоксидифенила и оставляют на 30
мин, периодически встряхивая, помещают в кипящую водяную баню на 90 с. После охлаждения колориметрируют на ФЭКе против контроля, который вместо центрифугата
содержит 0,5 мл ТХУ. Длина волны равна 582 нм (светофильтр оранжевый).
Расчет содержания лактата по формуле:
А
С = ────── · 11,3 ,
0,045
где С – количество лактата в мкмоль на 1 л слюны; А – количество лактата в
мг/мл, найденные по калибровочному графику; 0,045 – количество слюны в мл, внесенное в пробу.
Работа № 9 – ОПРЕДЕЛЕНИЕ РОДАНИДОВ (ТИОЦИАНАТОВ) В СЛЮНЕ
Принцип метода: Роданиды (SCN -) в кислой среде образуют комплексное соединение красного цвета с трехвалентным железом.
Качественная реакция: К 5 каплям слюны добавляют 2 капли 2 %-го раствора соляной кислоты и 2 капли 0,01 %-го раствора хлорного железа. Развивается красное окрашивание.
Ход количественного определения роданидов: В центрифужную пробирку вносят 0,2 мл слюны, 1,3 мл дистиллированной воды, 0,5 мл 20 %-го раствора ТХУ, перемешивают и оставляют на 10 мин при комнатной температуре, после чего центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин. Далее центрифугат переносят в темную склянку (пузырек), добавляют 1,5 мл 24 %-го раствора хлорного железа, закрывают пробкой
и колориметрируют против контроля, содержащего 2 мл дистиллированной воды и 1,5
мл раствора хлорного железа на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм.
Стандартная проба содержит 2 мл (0,2 мг) раствора тиоцианата аммония и 1,5 мл раствора FeCl3.
Расчет по формуле:
ЕО · ЕСТ
С = ─────── ,
ЕСТ · 0,2
где С – содержание роданидов в мг/мл; ССТ – концентрация тиоцианатов в стандартной пробе; ЕО – экстинкция опыта; ЕСТ – экстинкция стандарта; 0,2 – количество
слюны.
Работа № 10 – КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХЛОРИДОВ В СЛЮНЕ
Принцип метода: Хлориды экстрагируют 96 %-м спиртом. Хлор оттитровывают
нитратом серебра в присутствии K2Cr2O7. Хлористое серебро (AgCl), как менее растворимое, выпадает в первую очередь:
AgNO3 + NaCl = AgCl + NaNO3
Следующая капля раствора AgNO3, введенная после выпадения всего хлора реагирует с K2Cr2O7, причем образуется AgCrO4 коричневого цвета (конец реакции).
Ход работы: 0,2 мл слюны и 2,0 мл спирта тщательно перемешивают, оставляют
на 15 мин при комнатной температуре, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 мин. Сливают надосадок и добавляют к нему одну каплю 7 %-го раствора
K2Cr2O7, появляется желтое окрашивание. Затем раствор оттитровывают 0,01 н. раствором AgNO3 из мерной пипетки на 1 мл по каплям до появления коричневой окраски.
Расчет по формуле:
0,355 · Е · 1000 мл
С = ───────────── ,
0,2 · 1000 мг
где С – концентрация в г/л; 0,355 – мг хлора соответствует 1 мл 0,01 н. раствора
AgNO3; Е – количество 0,01 н. раствора AgNO3, израсходованное на титрование; 0,2 –
количество слюны в пробе.
Работа № 11 – ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА НИТРИТОВ В СЛЮНЕ
Принцип метода: В присутствии сульфаниловой кислоты и N-этилендиамина
нитриты образуют диазосоединения красного цвета.
Ход определения: К 0,1 мл слюны в центрифужную пробирку приливают 2 мл
дистиллированной воды, 0,5 мл сульфаниловой кислоты и 0,5 мл 0,05 %-го Nэтилендиамина. Оставляют на 10 мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют при 300 об/мин в течение 10 мин для осаждения белков. Оптическая плотность
надосадочной жидкости определяется на фотоэлектроколориметре при длине волны 540
– 550 нм против контроля, содержащего 2,1 мл воды, 0,5 мл сульфаниловой кислоты и
0,5 мл N-этилендиамина.
Расчет по формуле:
ЕОП · 711 ,
где С – концентрация в мкмоль/л; ЕОП – экстинкция опытной пробы; 711 - коэффициент пересчета NO2.
Работа № 12 – ПОЛУЧЕНИЕ ДЕСНЕВОЙ ЖИДКОСТИ (ДЖ)
Десневую жидкость получают путем введения в десневую щель стеклянного капилляра или стандартной полоски хроматографической бумаги. Высушивается поверхность зуба, он изолируется от попадания слюны, а затем в десневую щель в области
верхних 3, 4, 5 зубов заостренным концом вводится полоска хроматографической бумаги на 1 – 5 минут. Предлагаемые стандартные полоски имеют следующие размеры:
3 мм
4 мм
15 мм
2 мм
Работа № 13 – ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ДЖ ПО ПЛОЩАДИ
Полученные полоски с ДЖ пропитывают 0,02 %-м спиртовым раствором нингидрина. Окрашенную площадь в сине-фиолетовый цвет замеряют и рассчитывают в
мм2.
Работа № 14 – ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО БЕЛКА (по Lowry et al. (1951)
Принцип метода: В основе метода лежит образование окрашенных продуктов
ароматических аминокислот в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи.
Ход определения: К 0,4 мл буфера, содержащего белок, экстрагируемый из полоски с ДЖ, прибавляют 2 мл реактива «С» и оставляют стоять на 10 мин при комнатной температуре, затем приливают 0,2 мл реактива Фолина, разведенного в 2 раза, перемешивают и через 30 мин колориметрируют на ФЭКе или спектрофотометре (λ=750
нм) против контроля, содержащего только реактивы.
Расчет содержания белка в пробе проводят по калибровочной кривой, используя
ряд разведений лиофилизированного сывороточного альбумина известной концентрации (от 25 до 150 мкг белка в пробе).
Диагностическое значение: При выраженном воспалении количество белка в
ДЖ повышается. Данные могут быть использованы для расчета активности ферментов
в ДЖ.
Работа № 15 – ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ
(Andersch et al.)
В десневой жидкости определяется активность ряда ферментов, но при воспалении пародонта наибольшим изменениям подвержены лизосомные гидролазы (катепсин
D, кислая фосфатаза и др.).
Принцип метода: В кислой среде паранитрофенилфосфат гидролизуется ферментом до паранитрофенола, дающего в щелочной среде желтое окрашивание.
Ход определения: В опытную и контрольную пробу вносят по 0,5 мл субстратно-буферной смеси. В опытную пробу приливают 0,4 мл экстракта из полоски с ДЖ,
перемешивают и помещают обе пробы на 30 мин в водяную баню при 37 °С. По окончании инкубации пробы переносят в ледяную баню и приливают по 5 мл 0,1 н. раствора NaOH. В контрольную пробу добавляют 0,4 мл ДЖ. Интенсивность окраски опытной пробы замеряют против контроля при длине волны 405 – 410 нм. Для расчета используют калибровочный график, построенный с использованием различных количеств паранитрофенола.
Активность фермента рассчитывают по формуле:
С
А = ───── ,
30 · а
где А – активность кислой фосфатазы в мкмоль/мин на мг белка; С - концентрация паранитрофенола, найденная по калибровочному графику; 30 – время инкубации в
минутах; а – количество белка в мг в пробе, соответствующее 0,4 мл ДЖ.
Приготовление реактивов
К работе № 3:
1. 2 %-й раствор гемоглобина. рН=7,5. 2,2 г гемоглобина развести в бюксе в 10 мл воды, по мере растворения сливать в цилиндра на 100 мл до половины объема. Затем добавить 36 г мочевины и 8 мл 1 н. раствора NaOH. Довести водой до 100 мл и выдержать 30 мин в термостате при температуре 55°С. Охладить и добавить 10 мл 1 М
KH2PO4 и 4 г мочевины.
2. Реактив Фолина. В круглодонную колбу на 1,5 – 2 л внести 100 г вольфрамата натрия (NaWO4), 25 г молибдата натрия (NaMoO4·2H2O) и растворить их в 700 мл воды.
К раствору добавить 50 мл 80 %-го раствора фосфорной кислоты и 100 мл концентрированной HCl. В колбе с обратным холодильником кипятить в течение 10 ч, затем прибавить 150 г LiSO4, 59 мл воды и 3 – 4 капли брома. Кипятят без холодильника 15 мин.
Для удаления избытка брома раствор охлаждают до комнатной температуры, доводят
его объем до 1 л и фильтруют. Перед употреблением разбавляют дистиллированной
водой 1:1.
К работе № 4:
1. 0,01 %-й раствор трипсина. 5 мг кристаллического трипсина растворить в 5 мл
1х10-3 раствора HCl с 0,035 М CaCl2 (основной раствор). Хранится в замороженном состоянии 7 дней. Из него готовится рабочий раствор в разведении 1:10 (1 мл содержит
100 мкг трипсина).
2. Раствор L-бензоиларгининпаранитроанилина (БАПНА). 39 мг БАПНА растворить в
1 мл диметилформамида при нагревании и добавить 1 мл буфера.
К работе № 5
1. 5х10-2 М глициновый буфер, рН = 10,5, содержащий 0,5·10-3 М MgCl2, 0,2 М раствор глицина – 1,5014 г глицина растворяют в 100 мл дистиллированной воды, 0,2 М
раствор NaOH – 0,8 г NaOH растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Смешивают
50 мл 0,2 М раствора глицина, 45 мл 0,2 М раствора NaOH и доводят объем до 200 мл
дистиллированной водой. В 200 мл готового буфера прибавляют 9,52 мг хлористого
магния.
2. 5,5·10-3 М раствор паранитрофенилфосфата динатриевая соль. 16,5 мг субстрата
растворяют в 10 мл 5·10-2 М глицинового буфера, содержащего 0,5 ·10-3 М MgCl2 (субстратно-буферная смесь). Хранится в темной склянке при минус 4°С в течение 7 дней.
К работе № 6
1. 0,2 М ацетатный буфер, рН=4,9. 0,2 М раствор уксусной кислоты 11,2 мл ледяной
СН3СООН доводят до 1 л дистиллированной водой, 0,2 М раствор уксусно-кислого натрия (CH3COONa · 6H2O) или 27,2 г СН3СООNa·3H2O растворяют в 1 л дистиллированной воды. Смешивают 0,2 М раствор СН3СООН и 0,2 М раствор CH3COONa в соотношении 3,5 : 6,5.
2. 0,5 ·10-3 М раствор индигокармина. 0,0233 г индигокармина растворить в 100 мл
дистиллированной воды. Хранить в темной склянке, при экстинкции пробы ниже 0,7
следует приготовить свежий реактив.
3. 3 ·10-2 М раствор перекиси водорода. 0,33 мл 30 %-го Н2О2 довести до 100 мл дистиллированной водой. Готовить ежедневно и хранить в склянке с притертой пробкой.
К работе № 7
Молибденовый реактив с аскорбиновой кислотой. Готовят отдельно:
а) Молибдат аммония 0,42 %-й раствор, приготовленный на 1 н. растворе H2SO4.
б) 10 %-й раствор аскорбиновой кислоты (в холодильнике хранится около 1 месяца.)
Непосредственно перед работой смешивают 6 объемов раствора «а» и 1 объем раствора «б». Хранится в течение дня в ледяной бане.
К работе № 8
1. Раствор сернокислой меди. 3 г CuSO4 растворяют в 9 мл ортофосфорной кислоты.
Должен образоваться гомогенный раствор, на что уходит некоторое время.
2. 1,5 %-й раствор параоксифенила в диметилформамиде или 2 %-м растворе натриевой щелочи.
3. Стандартный раствор молочной кислоты (100 мг/100мл).
К работе № 14
1. Реактив «А». 1 %-й раствор Na2CO3, приготовленный на 0,1 н. растворе NaOH.
2. Реактив «Б». 0,5 %-й раствор CuSO4·5H2O в 1 %-м растворе трехзамещенного цитрата натрия.
3. Реактив «С» готовится в день определения путем смешивания 50 частей реактива
«А» и одной части реактива «Б».
К работе № 15
1. 0,1 М цитратный буфер, рН=4,8. Реактив «А» - 0,1 М лимонная кислота – 2,1014 г
кислоты растворяют в 100 мл дистиллированной воды; реактив «Б» - 0,1 М раствор
трехзамещенного цитрата натрия – 2,9412 г растворяют в 100 мл дистиллированной
воды. Смешивают 80 мл реактива «А» и 120 мл реактива «Б».
2. Субстратно-буферный раствор – 5,5·10-3 М. Раствор паранитрофенилфосфата в буфере (16,5 мг динатриевой соли паранитрофенилфосфата растворяют в 10 мл буфера.
Хранится в темной склянке при 4 °С в течение 7 дней).
3. Стандартный 1,0 ·10-7 М раствор паранитрофенола. 69,56 мг паранитрофенола растворяют в 100 мл 0,02 М раствора NaOH; 10 мл этого раствора доводят до 1 л 0,02 н.
NaOH. Для построения калибровочного графика используют различные разведения
этого раствора.
К работе № 11
1. 0,6 %-й раствор сульфаниловой кислоты в 20 %-м растворе HCl.
2. 0,05 %-й раствор 1- N-этилендиамина. 50 мг НЭДА растворить в 100 мл дистиллированной воды.
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа