close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

ҰБТ-ға қатысушылардың аудандар бойынша конкурс;pdf

код для вставкиСкачать
Федеральное государственное бюджетное образовательное
учреждение высшего профессионального образования
«Санкт-Петербургский государственный университет»
ФИЗИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Кафедра молекулярной биофизики
На правах рукописи
СОКОЛОВ Петр Александрович
РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ФИКСАЦИИ ДНК НА РАЗЛИЧНЫХ
ПОВЕРХНОСТЯХ И ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ
СФОРМИРОВАННЫХ СТРУКТУР.
02.00.06 – высокомолекулярные соединения
Диссертация на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук
Научный
руководитель:
д.ф.-м.н, профессор Касьяненко Н.А.
Санкт-Петербург – 2014
2
Оглавление
Введение............................................................................................................................................4
ГЛАВА 1..............................................................................................................................................9
1.1. Сопряжение ДНК с твердотельной электроникой.......................................................10
1.1.1. Подготовка поверхности кремния............................................................................10
1.1.2. Взаимодействие протравленной поверхности кремния с компонентами
раствора...................................................................................................................................15
1.1.3. Поверхностные электронные состояния монокристаллов кремния................23
1.1.4. Исследования электронных свойств интерфейса ДНК-кремний с помощью
контактов металл-полупроводник....................................................................................27
1.2. Соединения фенантролина и их свойства.....................................................................32
1.2.1. Противоопухолевая активность фенантролиновых соединений.....................32
1.2.2. Хемосенсоры на основе фенантролина..................................................................37
1.2.3. Потенциальное применение соединений фенантролина..................................40
1.2.4.
Взаимодействие
фенантролиновых
соединений
с
различными
поверхностями......................................................................................................................46
1.3. Иммобилизация ДНК на различных поверхностях....................................................54
1.3.1. Иммобилизация ДНК на подложке из кремния в присутствии ионов магния
..................................................................................................................................................54
1.3.2. Фиксация ДНК на поверхность слюды...................................................................57
1.3.3. Ориентация ДНК на поверхности подложки........................................................61
1.3.4. Фиксация ДНК на поверхность золота...................................................................64
ГЛАВА 2...........................................................................................................................................68
2.1. Материалы...........................................................................................................................69
2.2. Методика фиксации ДНК на подложки........................................................................70
2.3. Создание диодов Шоттки..................................................................................................71
2.4. Метод поверхностного плазмонного резонанса..........................................................72
2.5. Метод атомной силовой микроскопии..........................................................................75
2.6. Исследование электрофизических свойств интерфейса ДНК-кремний.................77
2.6.1. Обоснование методики эксперимента....................................................................77
2.6.2. Идеальный шоттки-контакт....................................................................................78
2.6.3. Вольт-амперная характеристика барьера Шоттки..............................................82
2.6.4. Вольт-фарадная характеристика барьера Шоттки..............................................84
2.7. Вискозиметрия...................................................................................................................86
3
2.8. Программное обеспечение..............................................................................................88
ГЛАВА 3...........................................................................................................................................89
3.1. Светоуправляемая фиксация ДНК на поверхность кремния....................................90
3.2. Исследование электрофизических свойств интерфейса ДНК-кремний...............101
3.2.1. Результаты измерений вольт-амперных характеристик (ВАХ)......................102
3.2.2. Результаты измерений вольт-фарадных характеристики (ВФХ)...................105
3.3. Фиксация ДНК при помощи серосодержащего производного фенантролина. . .109
3.3.1. Фиксация на золотую поверхность........................................................................110
3.3.2. Фиксация на поверхность слюды..........................................................................134
3.3.3. Фиксация на поверхность кремния.......................................................................141
3.3.4. Взаимодействие соединения фенантролина с молекулой ДНК в растворе..148
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.............................................................................................................................158
Список литературы......................................................................................................................159
4
Введение
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности.
Уменьшение размеров электрических схем до нанометрового масштаба ставит перед
исследователями задачу по поиску новых способов создания их различных элементов.
В частности, для производства миниатюрных контактов некоторое время назад было
предложено использовать ДНК [1, 2]. Благодаря способности этой макромолекулы к
самоорганизации, стало возможным создавать наноструктуры с заранее определенной
геометрией и разрешением до 6 нм, которые можно использовать как составные части
электрических наносхем [3]. Исследование проводимости ДНК проводится достаточно
широко [4], хотя в этом вопросе остается еще много неясного. Возможность
сопряжения ДНК с твердотельной электроникой позволяет создавать различные
полупроводниковые
использования
ДНК
устройства,
для
в
нужд
том
числе
биодатчики
твердотельной
[5-7].
электроники
Перспектива
при
создании
электрических схем и биосенсоров требует более тщательного изучения вопросов
фиксации макромолекулы на поверхность кремния, который является основой
современных электрических микросхем. В частности, необходимо найти способы
размещения ДНК в определенном месте наносхемы [8] и установить условия, при
которых полимер образует различные упорядоченные структуры на поверхности
полупроводника.
Одной из важных задач является изучение влияния заряженной молекулы ДНК
при
ее
фиксации
на
электрические
свойства
приповерхностной
области
полупроводниковой подложки [9, 10]. Это позволит создавать воспроизводимые
элементы схем, а также управлять их электрическими свойствами. Собственный заряд
биополимера и захват носителей из полупроводника на поверхностные состояния,
обусловленные присутствием молекулы, будут менять
потенциал поверхности
полупроводника, что приведёт к изменению проводимости приповерхностного слоя
кристалла кремния. Это может повлечь за собой нарушение работы электронных
компонентов (транзисторов и диодов), которые были включены в схему посредством
ДНК. С другой сторон, с помощью изменения заряда молекулы, являющейся
соединительным проводником, может быть осуществлено управление режимом работы
5
активных компонентов схемы. В связи с этим возникает задача исследований как
электронных свойств собственно молекулы, зафиксированной на поверхности, так и
свойств интерфейса структуры ДНК-кремний.
Зондовая
конформации,
микроскопия
механических
дает
и
возможность
электрических
визуализации
свойств,
и
упругости
изучения
[11,
12],
проводимости [4] отдельных молекул ДНК и ее комплексов с разными лигандами. В
связи с этим актуален вопрос о степени возмущения, которое претерпевает
макромолекула в процессе иммобилизации на поверхности при проведении измерений
[13]. Ответ на данный вопрос позволит экстраполировать данные эксперимента на
случай невозмущенной конформации макромолекулы в растворе, что имеет особое
значение для биофизических исследований. Поиск способа фиксации, при котором
биологический полимер испытывает минимальные возмущения, является важной
задачей зондовой микроскопии.
С развитием в последние годы метода поверхностного плазмонного резонанса
(ППР) применительно к исследованию взаимодействия ДНК с белками [14, 15] и
различными лигандами [16, 17] возникла потребность в простом и надежном способе
подготовки чипов, содержащих на золотой поверхности ДНК. Зафиксировать ДНК на
золотой поверхности было предложено с помощью 11-меркаптоундекановой кислоты в
присутствии двухвалентных ионов [18], которые, однако, затрудняют интерпретацию
данных об интеркаляции [19]. Альтернативный способ – фиксация путем химической
модификации олигонуклеотидов различными группами [20]. Вместе с тем, такой
способ не годится для решения целого ряда задач. Кроме того,
это удорожает и
усложняет эксперимент, в то время как методы фиксации высокомолекулярной ДНК
на золотую поверхность практически не развиты. Похожие затруднения возникают при
создании биочипов [21, 22] и подготовке образцов ДНК для микроскопии на
поверхности слюды, стекла, кремния [23]. При этом исследования позволили бы
осознанно подойти к созданию и проектированию новых биосенсоров [24, 25] и
управляемых супрамолекулярных структур на основе ДНК-оригами [26, 27] в будущем.
Сказанное выше свидетельствует об актуальности проведенных в работе
исследований и практической значимости полученных результатов.
Цели и задачи работы. Целью диссертационной работы является разработка
новых способов фиксации высокомолекулярной ДНК на поверхности слюды, кремния
и золота, а также изучение сформированных на подложке структур.
6
В диссертации решаются следующие задачи:
1. Подбор оптимального способа фиксации ДНК на поверхности кремния для
дальнейшей металлизации.
2. Осуществление металлизации зафиксированных молекул ДНК
на слюде,
стекле, кремнии.
3. Изучение электрофизических свойств интерфейса ДНК-кремний
(вольт-
амперные и амплитудно-частотные характеристики).
4. Рассмотрение
взаимодействия
ДНК
с
серосодержащим
производным
фенантролина.
5. Исследование
процесса
адсорбции
серосодержащего
производного
фенантролина на поверхность золота, кремния, слюды и стекла.
6. Разработка
способа
фиксации
молекул
ДНК
на
модифицированные
серосодержащим производным фенантролина поверхности золота, кремния,
слюды и стекла.
7. Подобор условий для исследования формируемых систем методом плазмонного
резонанса.
8. Сравнительный анализ различных способов фиксации ДНК на поверхности.
Научная новизна. В работе впервые предложены способы фиксации ДНК на
поверхность кремния в зависимости от облучения. Впервые показана возможность
формирования протяженных упорядоченных фибрилл ДНК на поверхности кремния и
проведена их металлизация. Впервые проведена оценка плотности поверхностных
состояний кремния после фиксации ДНК. Предложен новый способ размещения на
поверхности золота, кремния, слюды серосодержащего производного фенантролина,
обеспечивающий последующую фиксацию ДНК на модифицированные поверхности.
Положения, выносимые на защиту:
•
Характер фиксации ДНК из раствора на поверхность кремния в присутствии
ионов магния зависит от облучения образца.
•
Участие ДНК в формировании интерфейса Au-кремний существенно изменяет
его электрофизические свойства.
7
•
Качество металлизации ДНК на подложке зависит от свойств сформированных
биополимером структур.
•
Адсорбционные свойства фенантролина на поверхности золота, кремния, слюды
могут быть значительно улучшены путем введения серосодержащей группы.
•
Модифицированные серосодержащим фенантролином поверхности слюды,
золота и кремния способны фиксировать ДНК.
Степень
достоверности
и
апробацию
результатов.
Достоверность
полученных результатов подтверждается согласованностью данных, полученных
различными методами и воспроизводимостью результатов.
Результаты работы были доложены на всероссийских и международных
конференциях:
•
X International Conference on “Nanostructured Materials”, 2011.
•
11th Internatioal Conference on Atomically Controlled Surfaces, Interfaces and
Nanostructures, 2009.
•
17th IUPAB International Biophysics Congress, 2013.
•
The 8-th International Symposium “Molecular Order and Mobility in Polymer
Systems”, 2014.
•
6 Всероссийская Каргинская конференция «Полимеры — 2014», 2014.
Основные результаты диссертации опубликованы в статьях:
•
N.V. Bazlov, O.F. Vyvenko, P.A. Sokolov, N.A. Kas’yanenko, Yu V. Petrov Chargecontrolled fixation of DNA molecules on silicon surface and electro-physical properties
of Au–DNA–Si interface // Applied Surface Science. 2013. Volume 267. PP. 224–228.
•
V. N. Demidov, N. A. Kas’yanenko, V. S. Antonov, I. L. Volkov, P. A. Sokolov, T. B.
Pakhomova, S. A. Simanova Reaction with DNA and pharmacologic activity of 1,10phenanthroline and electron-rich 1,10-phenanthrocyanine complexes of d-elements //
Russian Journal of General Chemistry. 2012. Volume 82, Issue 3. PP. 602-620.
•
P. A. Sokolov, N. V. Bazlov, A. O.Puchkova, O. F. Vyvenko, and N.A. Kasyanenko DNA
Immobilization on n-Type Silicon Surface and Electrophysical Properties of Au/DNA/
(n-Si) Structures // Protection of metals and physical chemistry of surfaces. 2011. Volume 47. Issue 5. PP. 566-571.
8
•
Puchkova A. O., Sokolov P. A., Kasyanenko N. A. Metallization of DNA on the
surface // Journal of Structural Chemistry. 2011. Volume 52. Issue 6. PP. 1195-1201.
•
Puchkova A. O., Sokolov P. A., Petrov. Y. V., Kasyanenko N. A. Metallization of DNA on
silicon surface // Journal of Nanoparticle Research. 2011. Volume 13. Issue 9. PP.
3633-3641.
•
Пучкова А. О., Соколов П. А., Лопатько К. Г., Касьяненко Н. А. Фиксация ДНК на
поверхности
кремния
для
создания
матрицы
при
нанопроволок // Труды МФТИ. 2011. Том 3. № 2. стр. 43-47.
формировании
9
ГЛАВА 1
10
1.1. Сопряжение ДНК с твердотельной электроникой
1.1.1. Подготовка поверхности кремния
Перед
использованием
кремния
в
качестве
подложки
для
зондовой
микроскопии или электроники его поверхность необходимо очистить, чтобы убрать
как образовавшийся в процессе хранения оксид кремния, так и адсорбировавшиеся из
окружающей среды соединения. Таким образом можно исключить появление
артефактов. В работе [28] описан процесс травления кремния в плавиковой кислоте.
Контроль
поверхности
проводили
с
помощью
методов
фотоэлектронной
спектроскопии и дифракции электронов низкой энергии (LEED). Авторы использовали
пластины кремния p- и n-типа проводимости с ориентаций (100), (111) и (211).
Сопротивление образцов варьировалось от 0.005 до 35 Ом·см. В работе отмечается, что
после травления проводить сушку образцов не требуется, так как их поверхность
становится абсолютно гидрофобной. Независимо от конкретных условий травления в
HF и типа образцов, формируется H-терминированная поверхность. Как видно из рис.
1.1.1, после травления образцов с естественным слоем окисла образуется Hтерминированная поверхность с примесями углерода, фтора и кислорода. Авторы
отмечают, что фтор быстро замещается на OH-группу, последующие превращения
которой приводят к образованию оксида. Количество кислорода можно уменьшить,
если использовать смесь плавиковой кислоты с этанолом. С течением времени при
выдержке на воздухе или в воде, как следует из рис. 1.1.2, поверхность окисляется до
нескольких монослоев оксида кремния. При окислении в воде также образуется слой
субоксида, которой впоследствии переходит непосредственно в оксид.
11
Рис. 1.1.2. Увеличение толщины
оксида
Рис. 1.1.1. Изменение уровня
загрязнения подложки кислородом,
от
времени
протравленной
выдержки
поверхности
на
углеродом и фтором от концентрации воздухе и в бидистиллированной воде
HF [28].
[28].
Авторы работы [29] предлагают новый способ измерения концентрации
силанольных групп (Si-OH) на поверхности кремния при помощи вещества
tridecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrooctyl
хлороформе.
Этим
соединением
dimethylchlorosilane
обрабатывали
(FOCS),
образцы
растворенного
перед
в
проведением
рентгеноструктурного анализа, при помощи которого определяли концентрацию
фтора на поверхности, которая, по мнению авторов, пропорциональна концентрации
Si-OH (рис. 1.1.3).
12
Рис. 1.1.3. Концентрация фтора на соответствующих подложках кремния,
содержащих Н, Н/ОН и ОН группы на поверхности [29].
Для приготовления H-терминированной поверхности пластинки кремния с
ориентацией (100) были протравлены в 0.5% водном растворе HF. В дальнейшем эти
образцы использовали для создания H/OH-терминированной поверхности путем
непродолжительной выдержки в воде и OH-терминированной поверхности при
травлении в H2SO 4:H2O2 (1:4), при этом обеспечивается высокая степень окисления.
Надо отметить, что авторы [29] не приводят данных о температуре, при которой
осуществляли подготовку поверхности. Так, например, в работе [30] показано, что при
температуре выше 200o C происходит полное замещение OH групп на используемый в
работе реагент (характерное время замещения порядка 20 минут).
На реактивность поверхности кремния можно влиять светом подходящей длины
волны. Авторы работы [31] использовали образцы кремния n-типа проводимости с
ориентацией
(111)
и
сопротивлением
порядка
30
Ом·см.
Подложки
были
предварительно очищены и протравлены в течение 15 минут в 40% NH 4F для
получения H-терминированной поверхности. Образцы облучали светом с длиной
волны 800 нм. Измерение скорости роста оксида проводили при помощи метода
генерации второй гармоники - Second harmonic generation-RA (RA-SHG). Было
показано (рис. 1.1.4), что скорость окисления изменялась на порядок при облучении.
Авторы отмечают, что в воде оксид растёт быстрее, чем на воздухе. В работе
предполагается, что изменение скорости роста оксида связано с генерацией светом
электрон-дырочных пар. Под действием поля в ОПЗ электроны попадают на
поверхность полупроводника, где реагируют с кислородом или водой, катализируя
рост оксида.
13
Рис. 1.1.4. Зависимость начальной скорости окисления от освещения (в количестве
фотонов на квадратный сантиметр в сек) [31].
В работе [32] использовали кремний n-типа проводимости с ориентацией (111) и
(100) с сопротивлением от 1 до 10 Ом·см. Изначально образцы были очищены в 30%
H2O2:H2SO4 (1:2) в течение 15 минут при температуре 80 oC, потом промыты водой и
помещены во взвешенный в аргоне 40% раствор NH 4F на 15 минут, после чего снова
промыты. Измерения при облучении образцов различными длинами волн проводили
методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии. По приведенным в работе
графикам (рис. 1.1.5) нельзя сделать вывод о степени окисления образцов в темноте без
облучения. Результат свидетельствует только о том, что некоторое количество
кислорода присутствует на поверхности. Найденный максимум степени окисления при
использовании облучении с длиной волны 250 нм во влажном и сухом воздухе авторы
связывают с двухэтапным процессом окисления поверхности кристалла. На первом
этапе за счёт энергии фотонов связь Si-H дестабилизируется или разрушается, что
приводит к реакции атомов кремния с кислородом. Второй этап соответствует росту на
этой части поверхности оксида за счет поступления неравновесных носителей заряда
из объема полупроводника.
14
Рис 1.1.5. Светоиндуцированное окисление поверхности, выраженное в отношении
O(1s)/Si(2p) для Hx-Si(100) и H-Si(111)(1X1). Энергия падающего света составляла 2KJ.
Опыт проводили при разных длинах волн при сухом и влажном воздухе [32].
15
1.1.2. Взаимодействие протравленной поверхности кремния с
компонентами раствора
В литературе присутствуют данные о взаимодействии поверхности кремния с
различными соединениями. Нас интересуют, в первую очередь, MgCl 2, NaCl, HCl, ДНК,
H2O, используемые в настоящей работе.
В работе [33] было исследовано взаимодействие поверхности кремния с водой.
Еще раз подчеркнем, что без специальной обработки поверхность кремния, покрытая
слоем окисла, проявляет гидрофильные свойства. После травления в HF и
терминирования поверхности водородом поверхность становится гидрофобной.
Последующее окисление приводит к появлению на поверхности кислорода, что
переводит ее в гидрофильное состояние, способствующее взаимодействию поверхности
с водой. При помощи метода FTIR- спектроскопии ("frustrated" total internal reflection)
было показано, что вблизи поверхности кремния вода организуется в структуру,
сходную со структурой льда, которая разрушается по мере удаления от поверхности.
Таким образом, вода координируется поверхностью кремния.
Авторы работы [34] провели опыты по определению степени загрязнения
натрием поверхности кристалла кремния и поиску способов ее очистки. Использовали
p-тип кремния с ориентацией (100), поверхность которого была покрыта окислом
после травления в H2O2:H2SO4. В работе показано, что в присутствии калия или смеси
калия и алюминия (а также при повышении температуры с 20 до 80 o C) сорбция натрия
из раствора на поверхность понижается на порядок. Также было установлено, что
концентрация натрия на поверхности выходит на стационарный уровень через 5
секунд после начала экспозиции. Наличие в растворе 0.01% HCl приводит к
значительному снижению сорбции натрия (рис. 1.1.6), а выдержка поверхности с
сорбированным натрием в 0.01% HCl приводит к снижению его концентрации на
порядок.
16
Рис. 1.1.6 а. Сорбция натрия при
выдержке
подложки
в
водном
растворе и в растворе, содержащем
0.01% HCl [34].
Рис.
1.1.6
погружения
б
Влияние
подложки
в
времени
воду
на
сорбцию натрия на подложку [34].
Методом компьютерного моделирования [35] было показано, что NaCl может
взаимодействовать с кремнием с образованием структуры, представленной на рис. 1.1.7.
Рис. 1.1.7. Адсорбция NaCl на Si4H9 [35].
Авторы работы [36] изучали взаимодействие H-терминированной поверхности
кремния n-типа с ориентацией (111) и сопротивлением 500 и 10-15 Ом·см c кислотами
типа HX, где X= Cl, Br, или I. Используемые вещества были взвешены в естественной
атмосфере. Перед проведением измерений была проведена чистка поверхности по
методике RCA [37] с последующей обработкой в 5% HF, а затем 40% NH 4F в течение 5 и
1 минуты соответственно для получения H-терминированной поверхности. При
помощи FTIR и рентгеновской спектроскопии было показано, что присутствие таких
оксидантов, как кислород, способствует замене водорода в группе Si-H на X. Без
оксидантов связь Si-H практически не разрушалась, и ее концентрация на поверхности
за 10 минут падала лишь на 6%. Возможно, подобные реакции может катализировать и
ДНК. Авторы работы отмечают также, что промывание водой исследуемых образцов
после реакции с HCl приводит к замещению хлора на OH-группу. Подобные данные по
17
взаимодействию кремния с HCl можно найти и в работе [38].
В работе [39] представлены результаты исследования взаимодействия ДНК с
кристаллическим кварцем (min-U-sil 5 a-quartz) чистотой свыше 99%, представляющим
собой частицы от 0.5 до 3 мкм, растворенные в буфере. На основе данных FTIS (FourierTransform Infrared Spectroscopy) была предложена модель их взаимодействия. Модель
предполагает, что молекула ДНК связывается с силанольными группами на
поверхности кварца путем образования водородной связи (Рис. 1.1.8). Эти данные
требуют уточнения. До настоящего времени они не подтверждены.
Рис 1.1.8. Возможная модель связывания ДНК с силанольными группами на
поверхности кремния [39].
Остановимся на рассмотрении роли магния в процессе фиксации ДНК. Ранее
методами дифракции рентгеновских лучей, ЯМР и рамановской спектроскопии было
показано, что гидратированные ионы магния в водном растворе представляют собой
октаэдрические комплексы с шестью молекулами воды [40].
Взаимодействие водного раствора хлорида магния с окисленной поверхностью
кремния изучалось в работе [41]. Использовали кремний p-типа проводимости,
очищенный в смеси H2O–H2O2–NH4OH (5:1:1) при 80o C. Для повышения концентрации
гидроксильных групп на поверхности кристалла образцы были обработаны в кипящей
воде. Водный 0.05 M раствор MgCl 2·6H2O (pH=6) наносили на подложки методом
«spin-coating method», после чего был проведен XPS анализ (X-ray Photoelectron
Spectroscopy). Измерения показали, что на отрицательно заряженной за счёт
гидроксильных групп поверхности оксида кремния присутствуют положительно
заряженные комплексы магния (MgCl) + и [MgCl(H2O)m]+.
В работе [42] была предложена модель взаимодействия гидратированного иона
18
магния с молекулой ДНК. В процессе связывания в результате электростатического
притяжения происходит образование водородной связи между молекулой воды из
гидратной сферы иона и атомом кислорода фосфатной группы, рис. 1.1.9. Комплексы
ионов магния с фосфатными группами ДНК, образованные без промежуточной
молекулы воды, составляют не более 6%.
Рис. 1.1.9. Связывание гидратированного иона магния с фосфатными группами
ДНК с участием молекул воды (А, С) и с образованием солевой связи (В) [42].
Авторы работы [43] провели исследование по фиксации ДНК на поверхность
кремния p-типа проводимости с ориентацией (111) в присутствии ионов магния. В
эксперименте использовали окисленную до диоксида кремния и неокисленную (Hтерминированную) поверхность. Слой SiO 2 толщиной около 50 нм был получен
отжигом образца кремния в среде кислорода при температуре 800˚С. Другая часть
образца,
подвергшегося
термическому
окислению,
была
обработана
методом
активного ионного травления (reactive ion etching) и выдержана затем в 3% растворе HF
для получения H-терминированной поверхности. Для приготовления образцов авторы
использовали растворы poly(dG–dC)·poly(dG–dC) с длиной фрагментов около 600 пар
оснований (около 200 нм); концентрация MgCl2 в зависимости от условий
эксперимента составляла 0.1 мМ, 1.0 мМ или 5.0 мМ. Капля приготовленного раствора
наносилась на образец и через 1, 5 или 10 минут в зависимости от условий опыта
сдувалась с него. Таким образом, промывка образца водой после процедуры фиксации
не проводилась. Результат фиксации контролировался методом АСМ, а также методом
флюоресцентной
микроскопии.
Было
показано,
что
ДНК
преимущественно
фиксируется на поверхности SiO2. При этом увеличение концентрации MgCl 2 может
приводить к «слипанию» ДНК (рис. 1.1.10 c, e). На поверхности H-Si молекулы ДНК
были обнаружены при концентрациях соли магния более 1 mM (рис. 1.1.10 d, f ). При
этом данные флюоресцентной микроскопии показывают, что плотность молекул ДНК,
19
зафиксированных на H-терминированной поверхности, гораздо меньше, чем на
окисленной поверхности кремниевой подложки (рис. 1.1.11). По мнению авторов,
представленные различия в эффективности фиксации макромолекул объясняются
различием в химических свойствах поверхностей SiO 2 и H-Si и не связаны с влиянием
времени экспозиции. Так, авторы полагают, что фиксация ДНК на поверхность
диоксида кремния происходит за счет координации связанного с макромолекулой
магния с атомом кислорода на поверхности кремния. Координационная связь между
магнием и водородом образоваться не может, что является причиной слабой фиксации
на H-терминированной поверхности кремния. На данный момент известно, что
поверхность кремния быстро окисляется в водном растворе, поэтому авторы ошибочно
считают,
что
поверхность
H-терминирована
в
процессе
фиксации.
Поэтому
представленные в работе [43] выводы требуют дополнительного экспериментального
подтверждения и анализа.
В работе [44] из анализа изображений, полученных методом зонда Кельвина,
было высказано мнение, что молекула ДНК сохраняет при фиксации на кремний шубу
из противоионов. В работе плазмидную линеаризованную ДНК (3 kbp) фиксировали на
поверхность кремния, рис. 1.1.12. Хотя авторы не описывают сам способ фиксации, из
рисунков видно, что молекулы вытягиваются в процессе иммобилизации и собираются
вместе.
20
Рис. 1.1.10. АСМ изображения ДНК на поверхности SiO 2 (a, c, e) и на поверхности HSi (b, d, f). Концентрация MgCl2 0.1 мМ (a, b), 1.0 мМ (c, d), 5.0 мМ (e, f) [43].
21
Рис. 1.1.11. Данные флюоресцентной микроскопии образца с ДНК на подложке SiO2
и H-Si. Фотография образца (×2000) в флюоресцентном режиме. Свечение ДНК
происходит за счет обработки молекул красителем Yo-Pro (1 mM) после процесса
фиксации (a). Фотография этого же места образца в оптическом режиме микроскопа
(b) [43].
22
Рис. 1.1.12. Результаты исследования плазмидной ДНК на кремниевой подложке
методом зонда Кельвина. АСМ топография (a) и соответствующее KPFM сканирование
той же поверхности (b). Увеличенные АСМ (c) и KFPM (d) изображения, на рисунках (e)
- AFM и (f) - KPFM видна цепь ДНК с отрицательным потенциалом и обнаруживается
присутствие соли, располагающейся вокруг цепи (положительный потенциал). Ниже
даны профили высоты и потенциала (g), (h) [44].
23
1.1.3. Поверхностные электронные состояния монокристаллов кремния.
Фиксация макромолекулы на поверхности кристалла обуславливается ее
взаимодействием с поверхностью. Со стороны полупроводника это взаимодействие
определяется поверхностными электронными состояниями.
Одной из причин возникновения поверхностных состояний является обрыв
периодического потенциала кристалла на поверхности (поверхностные состояния
Тамма), другая причина - наличие оборванных связей на поверхности из-за обрыва
решетки (поверхностные состояния Шокли). Кроме того, естественные поверхности
полупроводников всегда покрыты слоем окисла с адсорбированными на нем из
окружающей
среды
дополнительные
молекулами
поверхностные
различных
электронные
веществ,
уровни
что
энергии
также
[45].
создает
Наличие
локальных поверхностных уровней энергии приводит к тому, что электроны и дырки
могут «прилипать» к поверхности, образуя поверхностный электрический заряд. В
зависимости от знака поверхностного заряда свободные носители в полупроводнике
притягиваются к поверхности или отталкиваются от нее, образуя обогащенные или
обедненные слои и, тем самым, изменяя величину проводимости приповерхностной
области кристалла.
Исследованию поверхностных электронных состояний монокристаллов кремния
посвящено огромное количество работ, выполненных за последние десятилетия.
Остановимся на результатах работы [46], где изучались поверхности подложек,
полученных в условиях, подобных условиям наших экспериментов. Исследовались
поверхностные состояния кремния c ориентацией (111) и (100). Изначально была
проведена RCA очистка образцов. Для придания поверхности гидрофобных свойств
одна часть образцов была протравлена в 40% NH 4F (pH=7.8) в течение 6.5 минут, затем
в 48% HF в течение 3 минут. Для получения естественного окисного слоя другая часть
подложек выдерживалась на воздухе при влажности 50% и температуре 25С.
На рис. 1.1.15а представлены результаты эллипсометрических измерений
величины диэлектрической проницаемости образцов, которые были протравлены в
H2SO4:H2O2, затем выдержаны в воде и обработаны в NH 4F. После проведения
измерений образцы были протравлены в HF и снова подвергнуты анализу.
24
Рис. 1.1.15. Мнимая составляющая эффективной диэлектрической проницаемости
(a) и энергетическое распределение плотности поверхностных состояний (b) для Hтерминированной, NH4F- и HF-обработанной поверхности Si(111) и Si(100) [46].
Величина мнимой компоненты диэлектрической проницаемости отражает
шероховатость поверхности подложки [46]. Как следует из графиков, неровность
поверхности после применения указанных процедур не превышает 10А. На рис. 1.1.15b
приведены энергетические распределения плотности состояний H-терминированной
поверхности образцов Ds в зависимости от способа ее получения. Величина Ds
рассчитывалась из измерений величины поверхностной фото-эдс. Как видно из
рисунка, плотность поверхностных состояний имеет U-образную форму с минимумом в
центре запрещенной зоны кремния. В зависимости от используемого при обработке
поверхности вещества (NH4F или HF) ее величина может изменяться от 10 10 до 1013 см2
эВ-1.
На рис. 1.1.16a приведены графики зависимости относительного количества Si-H
связей на поверхности подложек в зависимости от времени выдержки на воздухе.
Оценки сделаны из эллипсометрических измерений, проведенных в инфракрасном
диапазоне. Рис. 1.1.16b показывает изменение толщины естественного окисла на тех же
образцах. Как следует из этих данных, быстрый рост окисного слоя на поверхности
(100) начинается при временах экспозиции, превышающих 200 минут, а для
поверхности (111) – при временах больших 2000 минут. Важный вывод из результатов
этих экспериментов состоит в том, что в любом случае толщина естественного окисного
25
слоя на поверхности кремния не превышает 1нм.
Рис. 1.1.16. Относительное число Si-H связей (a) и толщина естественного окисного
слоя (b) в зависимости от времени экспозиции H-терминированной поверхности на
воздухе для подложек (100) и (111) [46].
Авторы работы [6] провели эксперимент по модификации H-терминированной
поверхности кремния p- и n-типа проводимости с ориентациями (111), (001) и
сопротивлением от 1 до 25 Ом·см одноцепочечными молекулами ДНК с последующей
гибридизацией комплементарными цепочками. Олигонуклеотиды 12bp с линкерной
акрилатной группой прикреплялись к поверхности кремния, модифицированной
соединением
3-mercaptopropyl-trimethoxysilane.
Для
оценки
изменения
поверхности использовался метод поверхностной фото-эдс, рис. 1.1.17.
заряда
26
Рис. 1.1.17. Эксперимент с ДНК. SPV сигнал для кремния, терминированного ОНгруппами (а), с функциональными группами после модификации 3-mercaptopropyltrimethoxysilane (b), поверхность кремния с 12-мерными олигонуклеотидами (c), та же
поверхность после прикрепления комплементарных цепочек (d), тот же эксперимент с
использованием некомплементарных цепочек – несовпадение одной пары (e) [6].
Как следует из рис. 1.1.17, в присутствии ДНК величина сигнала фото-эдс
уменьшается (d) по сравнению с исходным образцом (a), что может быть вызвано
уменьшением абсолютной величины потенциала поверхности вследствие размещения
на
ней
дополнительного
заряда
при
фиксации
молекул.
Гибридизация
с
комплементарной цепочкой приводит к увеличению заряда молекулы (e), благодаря
чему сигнал усиливается. Последнее свойство может быть использовано при создании
биосенсора для определения нужной последовательности ДНК.
27
1.1.4. Исследования электронных свойств интерфейса ДНК-кремний с
помощью контактов металл-полупроводник.
Для исследования электронных свойств интерфейсов ДНК-полупроводник
можно
формировать
контакты
металл-полупроводник
(диоды
Шоттки)
с
использованием модифицированных подложек с предварительно зафиксированными
макромолекулами.
В работе [47] изучались вольт-фарадные и вольт-амперные характеристики
шоттки-диодов Al/p-InP, на интерфейсе которых находилась пленка ДНК. Толщина
пленки, определенная из вольт-фарадных (CV) характеристик, составляла величину
порядка 60 нм. Оптический спектр поглощения пленки А (рис. 1.1.18, врезка) авторы
работы анализировали, используя следующее соотношение:
A ×hν =B ( hν −Eg ) m ,
где B – постоянная, Eg – предполагаемая ширина запрещенной зоны материала, m
– показатель степени, зависящий от природы оптического перехода: m = 1/2, 2, 3/2 или
3 для разрешенного прямого, разрешенного непрямого, запрещенного прямого и
запрещенного непрямого переходов соответственно.
2
Рис. 1.1.18. График ( Ahν ) (hν ) , полученный обработкой спектра поглощения пленки
ДНК, размещенного на врезке [47].
Как показали полученные данные, участок резкого роста величины поглощения
28
2
спрямлялся в координатах ( Ahν ) , hν , что авторы связали с наличием запрещенной
зоны и прямых оптических переходов в пленке. Ширина запрещенной зоны,
определенная по отсечке прямой на оси абсцисс, составила 3.95эВ.
На рис. 1.1.19 приведены вольт-амперные характеристики шотки-диодов,
измеренные авторами обсуждаемой работы. Из обработки представленных данных
авторы находят, что величина барьера шоттки-диода, равная для контрольного
образца Φb = 0.60 eV , в случае наличия пленки ДНК на интерфейсе диода возрастает
до величины Φb = 0.76 eV. Коэффициент неидеальности модифицированного диода
равен n = 2,86.
Рис. 1.1.19. Вольт-амперные характеристики диода, содержащего пленку ДНК на
интерфейсном слое, и контрольного диода [47].
На рис. 1.1.20 представлены вольт-фарадные (CV) характеристики шоттки-диода,
содержащего пленку ДНК на интерфейсном слое, полученные при различных частотах
тестирующего сигнала [47]. Из графиков видно, что величина емкости для прямых
напряжений смещения возрастает в десятки раз с понижением частоты тестирующего
сигнала и приближается к насыщению при частотах выше 100 кГц. Такое поведение
емкости характерно для структуры с большой плотностью поверхностных состояний на
интерфейсе [48].
29
Рис. 1.1.20. Вольт-фарадные (CV) характеристики шоттки-диода, содержащего
пленку ДНК на интерфейсном слое, полученные при различных частотах
тестирующего сигнала [48].
В работе [10] исследовалось влияние на электрические свойства интерфейса
Au/ДНК/n-Si толщины пленки из ДНК и степени покрытия ею поверхности
исследуемых образцов для кремния n-типа проводимости с ориентацией (100) и
сопротивлением 2.00 Ом·см. Образцы были очищены последовательно в кипящих
трихлороэтилене, ацетоне и этаноле в течение 10 минут. Потом в H2SO4, H2O2, HF: H2O
(1:20), HNO3:HF:H2O (6:1:35) и HF:H2O (1:20). До и после каждой стадии очистки
образцы промывали в воде. Исходный водный раствор ДНК из спермы лосося (1000
mg/L) был приготовлен и заморожен. Последующие растворы готовились в 0.05 M
ацетатном буфере, содержащим 20 mM NaCl (ABS, pH 4.80). Растворы ДНК различной
концентрации наносили на образцы при помощи метода «drop casting method», после
чего высушивали в течение 12 часов. В результате были получены пленки толщиной 3
и 4 нм, причём 40% и 96% процентов поверхности занято ДНК соответственно. Золотой
контакт толщиной порядка 200 нм был создан путем термического напыления металла
поверх пленки. Было показано, что толщина пленки ДНК и степень покрытия
биополимером
поверхности
подложек
существенно
влияют
поверхностных состояний, величина которой составляла порядка
на
плотность
~ 1012 eV ×cm−2
и
падала при уменьшении толщины пленки.
В работе [9] предложен новый способ фиксации ДНК на поверхность кремния pтипа с ориентацией (100) в присутствии ионов магния. Перед иммобилизацией
поверхность кристалла протравливалась в 10% HF в течение 1 минуты, после чего
30
выдерживалась в течение 25 минут в вакууме. Фиксация проходила либо в темноте,
либо при освещении светом с длиной волны 890 нм. Было показано, что свет
способствует фиксации ДНК преимущественно в виде отдельных нитей. Фиксация
молекул в темноте приводит к образованию «жгутов», состоящих из нескольких
молекул ДНК. Так же в работе были проведены измерения вольт-амперных и вольтфарадных характеристик шоттки-диода с ДНК на интерфейсе (Ti/ДНК/p-Si). Авторами
установлено, что присутствие молекул ДНК на интерфейсе контакта Ti-(p-Si) приводит
к изменению вольт-амперных характеристик диодов и увеличению величины барьера
примерно на 0.15 В, независимо от способа приготовления образцов (с освещением в
процессе фиксации или без него). Оценка величины плотности поверхностных
состояний для шоттки-диода с молекулами ДНК на интерфейсе, полученная из прямой
ветви
вольт-амперной
характеристики,
составляла
7·10 12
см-2
и
примерно
соответствовала оценке, полученной по AFM-изображениям поверхности образца с
учетом плотности фосфатных групп ДНК, 5·1012 см-2 [9].
Надо отметить, что молекула ДНК содержит мономеры, отличающиеся по своим
электрофизическим
характеристикам.
Благодаря
этому,
например,
была
секвинирована одноцепочечная ДНК [49]. При интерпретации данных измерений
поверхностных состояний стоит учитывать тот факт, что разные азотистые основания
могут создавать различные электронные состояния на поверхности кремния.
Рис. 1.1.21. АСМ (слева) и СТМ изображения ДНК на поверхности меди. Гуанин
имеет отличные от других оснований электронные состояния (он появляется как яркие
точки на цепи) [49].
Приведенные выше результаты исследований разных авторов показывают, что
вопросу сопряжения ДНК с твердотельной электроникой в последнее время уделяется
повышенное внимание.
В рамках совместных исследований, проводимых кафедрами биофизики и
31
кафедры
электроники
твердого
тела
физического
факультета
СПбГУ,
были
исследованы особенности фиксации молекул на поверхности кремния p-типа
проводимости и электрофизические свойства интерфейса структуры Ti-(ДНК)-(p-Si)
[9]. Настоящая работа частично является продолжением этих исследований на
подложках n-типа проводимости.
Решение поставленных в работе задач подбора оптимальных условий фиксации
ДНК на поверхности кремния n-типа и исследования электрофизических свойств
сформированного интерфейса требует привлечения как биофизических методов
исследования (для изучения условий фиксации молекул на поверхности подложки),
так и методов, развитых в физике твердого тела (для изучения электронных свойств
получаемых структур).
32
1.2. Соединения фенантролина и их свойства
1.2.1. Противоопухолевая активность фенантролиновых соединений
По данным Федеральной Службы Государственной Статистики в 2012 году от
злокачественных новообразований в России умерло 309 226 человек [50], что делает
этот вид заболеваний одним из самых опасных. На сегодняшний день во всем мире
разрабатывается
и
проходит
испытания
огромное
количество
различных
противоопухолевых препаратов. При этом лечебные свойства последних не отвечают
современным требованиям, причиняя большой вред организму в целом. Так, один из
наиболее активных препаратов циплатин обладает нефротоксичностью, вызывает
миелодепрессию и ряд других побочных эффектов, что ограничивает его широкое
использование. В связи с наличием серьезных побочных эффектов у современных
препаратов в настоящее время
ведутся поиски новых более эффективных и менее
опасных
них
соединений.
Среди
есть
препараты,
содержащие
производные
фенантролина. Структура фенантролина показана на рис. 1.2.1.
Рис. 1.2.1. Структура фенантролина.
В работе [51] было показано, что производные ванадия с координированными
молекулами 4,7-диметил-1,10-фенантролина оказывают более сильное биологическое
воздействие по сравнению 1,10-фенантролином, 2-2*-бипуридином и 5'-бромо-2'гидроксиацетофеноном. При этом лучшие результаты показало соединение бис-(4,7диметил-1,10-фенантролин)сульфатооксованадиум (IV), которое имеет следующие
показатели IC50 (мкМ): для клеток лейкемии (NALM-6, MOL Т-3 и HL-60) — 0.2, 0.19,
0.98; для лимфомы Ходжкина (HS445) — 0.5; для множественной миеломы (U266BL,
ARH77 и УГ-Султан) — 0.5, 0.81, 0.8; для рака яичка (833K, 64cp, TERA-2, и NT2D1) —
33
0.85,0.75,19.5, 10.8; для глиобластомы (U373) — 1.8; для рака молочной железы (BT-20)
— 1.4; для рака предстательной железы (PC3) — 1.7. Это превосходит показатели
некоторых современных лекарств.
В работе [52] был проведен сравнительный анализ препаратов, структура
которых
изображена
на
рис.
1.2.2.
Они
показали
себя
как
перспективные
противоопухолевые агенты (см. рис. 1.2.3). При этом препарат L1 оказался самым
лучшим из известных на тот момент антибиотиков против бактерий streptomyces
coelicolor.
Рис. 1.2.2. Структура препаратов, изучаемых в работе [52].
Рис. 1.2.3.
Таблица, приведенная в работе [52] для значений
IC 50 in vitro для
лигандов и комплексов платины по отношению к нескольким опухолевым клеточных
линиям.
В работе [53] было проведено сравнение действия препаратов на основе 1,10-
34
фенантролина и используемых в медицине противораковых препаратов. Эксперимент
показал высокую эффективность соединения под номером 7 (рис. 1.2.4).
Рис. 1.2.4. Таблица из работы [53]. Цитотоксическая активность производных 2,4диарил-5,6-дигидро-1,10-фенантролина с фурилом или тиенилом в 4-позиции против
различных линий раковых клеток в сравнении с другими препаратами. Приведена
структура соединения под номером 7.
Оценка противоопухолевой активности 1,10-фенантролина и его комплексов с
лорноксикамом (противовоспалительный препарат LOR) и различными металлами по
отношению к клеткам рака молочной железы MCF7 показала интересный результат
[54]. Эффект 1,10-фенантролина по показателю IC50 (мкг/мл) оказался в несколько раз
выше:
4.73
против
13.7
для
[Cr(LOR)(Phen).Cl 2]Cl.2H2O,
12.7
для
[Mn(LOR)2(Phen)]Cl2·2H2O, 17.2 для [Fe(LOR)2(Phen).]Cl3, 17.2 для [Fe(LOR)(Phen).2H2O]
(BF4)2, 23.1 для [Ni(LOR)(Phen).Cl2].H2O и 9 для [Zn(LOR)(Phen)(H2O)2](BF4)2. Это
указывает на самостоятельную роль этого соединения в механизме цитооксичности.
Таким образом,
можно говорить о том, что препараты на основе 1,10-
фенантролина являются перспективными и востребованными в терапевтической
практике. К сожалению, биологическая активность противораковых соединений на
основе фенантролина изучена недостаточно.
Условно можно выделить три основных механизма действия противоопухолевых
препаратов, содержащих металлы (это типично и для препаратов, содержащих 1,10фенантролин): генерация реактивных форм кислорода (например, H 2O2, ОН•, O2•-),
которые повреждают хромосомную ДНК, изменение метаболизма и гомеостаза ионов
металлов (таких, как Fe, Cu и Zn), и, наконец,
ингибирование синтеза ДНК [55].
35
Последнее
дает
возможность
исследовать
потенциальные
противоопухолевые
препараты на уровне простых систем — водно-солевых растворов ДНК с изучаемым
препаратом. Действительно, практически любые соединения, связывающиеся с
данным биополимером (по азотистым основаниям), могут нарушать процессы
транскрипции и трансляции ДНК в раковой клетке. В качестве примера можно
привести работу [56], где была показана не только цитооксичность препарата цис
хлородиметилсульфоксид-S-би(1,10-фенантролин) рутения (II), но и
определено
наличие взаимодействия препарата с ДНК тимуса теленка in vitro методами
спектрофотометрии,
флуоресценции
и
гель-электрофореза.
Множество
статей
посвящено данной тематике. В целом отмечается, что 1,10-фенантролин в составе
комплексов металлов может частично интеркалировать в ДНК, при определенных
условиях вызывая ее расщепление [57]. Последнее нашло применение в изучении
взаимодействия белков с ДНК методом футпринтинга [58]. Метод основан на
расщеплении ДНК в местах, где она не связана с белком. Что дает возможность
определить участки ДНК, взаимодействующие с белком. За последние годы было
синтезировано множество производных 1,10-фенантролина для повышения выхода
реакций расщепления ДНК.
Стоит остановиться работах, посвященных синтезу нуклеаз на основе 1,10фенантролина, проявляющих специфичность к определенным последовательностям
ДНК. Так, было предложено модифицировать по 5'-позиции последовательность
d(TTTCCTCCTCT) 1,10-фенантролином. В эксперименте использовалась ДНК вируса,
содержащая лишь один комплементарный к модифицированной фенантролином
последовательности участок. В присутствии ионов меди и восстановителя при
температуре 20o С эффективность расщепления составила более 70%. При более
низких
температурах
происходило
неспецифичное
расщепление,
связанное
с
образованием частично некомплементарного дуплекса.
Другой подход к разработке специфических нуклеаз был предложен в работе
[59]. Используя сложные комплексы родия, авторам работы удалось добиться
расщепления ДНК по определенным последовательностям. Фоторасщепительные
реакции под действием облучения с длиной волны 313 нм проводились с
использованием
5'-меченых
представлены на рис. 1.2.5.
76/77-мерных
олигонуклеотидов.
Результаты
36
Рис. 1.2.5. Относительная интенсивность фоторасщепления на различных участках
ДНК комплексами родия. Самый сильный участок фоторасщепления нормализован до
100, а остальные интенсивности приведены по отношению к нему.
37
1.2.2. Хемосенсоры на основе фенантролина
Хемосенсоры
—
это
соединения,
измеряемые
характеристики
которых
значительно меняются в присутствии определенных веществ. Являясь классическим
хелатным бидентантным лигандом для ионов переходных металлов [60, 61], 1,10фенантролин
обладает
свойством
значительно
изменять
свои
оптические
и
химические свойства при координации различными металлами. Самым известным
окислительно-восстановительным индикатором химических растворов на основе 1,10фенантролина является ферроин, химическая формула которого [Fe(1,10-phen)3]SO4.
Но потенциал данного уникального соединения существенно шире. Так, в работе [62]
производное
1,10-фенантролина
универсального
детектора
(рис.
ионов
в
1.2.6)
было
ацетонитриле
использовано
(MeCN).
осуществляется при помощи набора взаимодополняющих методов,
в
качестве
Детектирование
карта которых
представлена на рис. 1.2.7. Такие металлы, как Pb2+,Hg2+,Cu2+,Ca2+ регистрируются
однозначно, а чтобы отличить Cd2+ от K+ или Mg2+ от Na+ придется прибегнуть к
дополнительным исследованиям.
Рис. 1.2.6. N=3
38
Рис.1.2.7. График относительных изменений в УФ спектрах, при измерении
окислительно-восстановительного потнециала, электрохемилюминесценции и
люминесценции соединения [Ru(phen) 2 (phenрис. 1.2.6)]2+ в присутствии ионов различных
металлов.
Еще
несколько
соединений,
содержащих
коронарные
структуры,
были
предложены для детектирования ионов Hg 2+ и Pb2+ [63, 64]. Как видно из рис. 1.2.8,
«короны»
однозначно
сильно
меняют
разделить
комплементарных
ионы
методов
оптические
Hg2+ и
свойства
Pb2+
1,10-фенантролина,
методом
позволяя
люминесценции
электрохемилюминесценции
и
вместо
люминесценции,
предложенных предыдущими авторами.
В работе [65] были проведены не только эксперименты, показывающие
специфическую реакцию производного 1,10-фенантролина на ионы Co 2+ (рис. 1.2.9)., но
и исследования, которые показали, что добавление к комплесу Co2Phen4+ EDTA
полностью восстанавливает падение флюоресценции и поглощения, вызванное
добавлением Co2+ к исследуемому соединению. Это позволяет в будущем создать
многоразовый хемосенсор.
39
Рис. 1.2.8. Различия в эмиссионных спектрах [Ru(bpy)2(Phenслева)]2+ (a) [63] и
[Re(CO)3(Phenсправа)(py)]+ (py = pyridine) (b) [64] при добавлении ионов различных
металлов в растворе MeCN.
Рис. 1.2.9. Влияние различных ионов металлов (5x10-5 М) на интенсивность
флуоресценции производного 1,10-фенантролина (5x10-6 М).
40
1.2.3. Потенциальное применение соединений фенантролина
Кроме
применения
в
противоопухолевой
терапии,
футпринтинге
и
хемосенсорике 1,10-фенантролин может быть востребован и в других областях. Так, в
работе [66] был применен метод циклических вольтамперограмм для регистрации
гибридизации
пришитых
к
cтеклоуглеродным
электродам
олигомеров
с
комплементарными цепочками. Суть идеи состоит в том, что комплекс Co(phen) 33+
обратимо электроактивен, то есть его присутствие на поверхности электрода
значительно увеличивает ток через электроды. В свою очередь, Co(phen)33+ сам не
связывается с поверхностью электродов, и может это делать только через ассоциацию с
двойной спиралью ДНК. Таким образом, значительное увеличение тока наблюдается
только при добавлении комплекса 1,10-фенантролина при гибридизации проб ДНК,
пришитых к электродам, с исследуемыми цепочками. Это позволяет определить
наличие нужной последовательности оснований в ДНК по последовательности
пришитых проб.
Идею подхватили другие ученые [67], которые успешно провели эксперимент по
определению наличия в растворе ДНК вируса гепатита B (HBV), см. рис. 1.2.10. Таким
образом, комплементарная последовательность в присутствии Co(phen) 33+ увеличивает
сигнал, в то время как некомплементарная — уменьшает.
Рис. 1.2.10. Дифференциально-импульсные вольтамперограммы для Co(phen)33+ как
электроиндикатора активности 10 пропромилле 21-мерной пробы ДНК HBV
(последовательность В, пунктирная линия) с использованием а) 15 пропромилле 21-мерной
комплементарной ДНК HBV (последовательность A) и б) 15 пропромилле 21-мерной
некомплементарных ДНК HBV (последовательность С).
41
Уникальный подход к созданию биосенсоров для распознавания ДНК-мутаций был
разработан на основе влияния окружения на флуоресценцию 1,10-фенантролина [68]
путем модификации 19-мерного олигомера, изображенного на рис. 1.2.11 под номером
9. Также были синтезированы полностью комплементарный олигомер (номер 10) и
олигомеры с одной ошибкой (номера 11, 12 и 13).
Рис. 1.2.11. Последовательности олигомеров, использованные для создания
биосенсоров на основе свойств фененатролина [68].
Далее производилась гибридизация последовательностей 9+10, 9+11, 9+12 и
9+13. Затем каждая пара подвергалась тепловой денатурации, в течение которой
снимался спектр эмиссии (рис. 1.2.12). Спектры показали, что каждое из оснований,
находящееся
напротив
модифицированного
урацила,
по-разному
влияет
на
оптические свойства 1,10-фенантролина. Благодаря чему стало возможно определить
не только наличие мутации в последовательности, но и определить ошибочное
основание.
Рис. 1.2.12. Зависимость отношения интенсивности флюоресценции на длинах волн 407 нм
и 387 нм от температуры (изучение тепловой денатурации). Комплементарные
последовательности: 9,10 (зеленый треугольники), ошибочный G: 9,11 (черные круги),
ошибочный Т: 9,12 (синие квадраты) и ошибочный С: 9,13 (красные ромбы).
42
Позже был предложен аналогичный способ определения мутации в геноме [69],
но в нем применялся несколько другой механизм изменения окружения 1,10фенантролина. Были синтезированы 2 последовательности ДНК WT27 и Mut27,
различающиеся одной мутацией. К ним были синтезированы комплементарные
последовательности Cwt7, Cmut7 и S20, как это показано на рис. 1.2.13. К растворам
Cwt7 и Cmut7 были добавлены ионы Tb3+ и Eu3+ соответственно. Потом эти растворы
были смешаны (смесь Cwt7+Tb3+ с Cmut7+Ue3+ обозначена как Mix).
Рис. 1.2.13 Модифицированные последовательности ДНК, использованные для
определения мутаций [69].
Уникальность метода заключается в том, что после смешивания Mix, S20 и WT27
полученный раствор начинал флюоресцировать на длине волны 546 нм, что было
видно невооруженным глазом (зеленый цвет). Аналогично после смешивания Mix, S20
и Mut27 наблюдалась флюоресценция на 617.5 нм (красный цвет). Таким образом,
были разработаны пробы, позволяющие без специальных приборов в клинических
условиях диагностировать наличие мутации в геноме.
В последние большой интерес вызывает так называемая супромолекулярная
организация ДНК [70]. При этом используют соединение 1,10-фенантролин (dpp),
структура которого изображена на рис. 1.2.14 слева. В
модифицировали
работе [26] ученые
короткие комплементарные последовательности ДНК по 3' и 5'
позициям данным соединением. Далее провели гибридизацию, получив дуплексы,
которые исследовали методами тепловой денатурации, спектроскопии УФ/В и
43
кругового дихроизма и гель-электрофореза в присутствии ионов Cu, Ag, Zn, Cu, Co и Fe.
Исследования показали, что атомы металлов координируются 1,10-фенатролином, как
это показано на рис. 1.2.14 справа,что позволяет использовать такие структуры в
качестве контейнеров для металлов. Это также расширяет набор средств для создания
различных наноустройств.
Рис. 1.2.14.
Для создания наноструктур к молекулам dpp были пришиты две разные пары
олигонуклеотидов [27], как это показано на рис. 1.2.15, а. В результате при добавлении
ионов CuI образуются определенные наноструктуры, формой которых можно управлять
путем добавления комплементарных цепочек ДНК. В итоге получается «четырехрукая»
структура, из которой можно собирать трехмерные образования, как это показано на
рис. 1.2.15, б.
Рис. 1.2.15. Самосборка последовательностей ДНК в супрамолекулярные структуры с
использованием координационных свойств фенантролина [27].
Такие системы можно использовать как контейнеры для переноса лекарств,
44
которые будут раскрываться при наличии определенных ионов металлов или
комплементарных цепочек ДНК, к примеру, вирусных. Следующая работа [71]
посвящена применению придуманной технологии и различных интеркаляторов для
контроля сборки ДНК-оригами. Было показано, что этидиум бромид значительно
улучшает качество и выход самосборки за счет стабилизации дуплекса.
Хочется отметить, что способность к самоорганизации производных 1,10фенантролина в присутствии ионов металлов нашла применение безотносительно
ДНК. Так, в работе [72] были синтезированы соединения, образующие после
самосборки структуры размером 4 нм на 5 нм, сходные с молекулой ДНК, см. рис.
1.2.16. Авторы работы предлагают использовать данные образования как контейнеры
для различных соединений, а также в качестве блоков для создания наноустройств.
Рис. 1.2.16. ДНК-подобные супрамолекулярные структуры на основе производных
фенантролина [72].
Управляемая ионами Zn2+ и Cu+ самоорганизующаяся система была создана на
основе соединения 1, изображенного на рис. 1.2.17 вместе с соединениями 4, 5, 6 и 7
[73]. Используя тот факт, что Cu + координирует соединения 4, 5 и 6, в то время как Zn2+
связывает преимущественно соединения 7 и 6, можно управлять в растворе
образованием различных структур. Так, исследователи показали, что соединение 1 при
45
добавлении ионов Cu+ образует треугольные структуры T1 (рис. 1.2.18). При добавлении
же ионов Zn2+ к раствору соединения 1 образуются структуры треугольные
и
четырехугольные (T2 и S2 соответственно, в пропорции 2:1). Было установлено, что
система переходит из состояния T1 в состояние T2 + S2 при добавлении ионов Zn 2+ к T1.
Обратный переход можно осуществить, добавив соединение 7, которое вытесняет из
координационной сферы Zn2+ соединение 1. Такие системы могут найти применение
при создании как биосенсоров, так и супрамолекулярных устройств.
Рис. 1.2.17.
Рис. 1.2.18 Управляемая ионами Zn2+ и Cu+ самосборка производных фенантролина
в квадратные и треугольные супрамолекулярные структуры [73].
46
1.2.4. Взаимодействие фенантролиновых соединений с различными
поверхностями
Самоорганизованный рост и самосборка различных соединений на поверхности
может служить эффективным и универсальным подходом к созданию двумерных
наноустройств. Преимуществами такого подхода являются контроль над размером,
варьируемым от атомных до мезоскопических масштабов длины, и возможность
обеспечения
высокой
плотности
структур
на
поверхности,
что
важно
для
нанофабрикации, которая направлена на миниатюризацию в микроэлектронике и
других областях [74, 75]. Самоорганизация производных 1,10-фенантролина на
различных поверхностях была исследована, частности, в работе [76]. Исследовалась
самоорганизация молекул 1,10-фенантролина на поверхности Au (111).Было показано,
что молекулы соединения при адсорбции на поверхность золота из NaClO 4 в течение
нескольких минут в зависимости от потенциала, поданного на поверхность, могут
образовывать упорядоченные и неупорядоченные структуры. Надо отметить, что
измерения при помощи СТМ проводились прямо в растворе, из которого шла
адсорбция. При этом подвижность молекул на поверхности сохранялась и, изменяя
потенциал, можно было переводить систему из упорядоченного состояния в
неупорядоченное и обратно, как это показано на рис. 1.2.19. Молекулы 1,10фенантролина, взаимодействуя азотами с поверхностью, образуют стопки, уложенные
набок. Упорядочивание достигается за счет ориентации молекул вдоль полос
реконструкции атомов на поверхности золота.
В работе [77], посвященной аналогичным измерениям производного 1,10фенантролина в присутствии ионов Eu3+, было проведено сравнение адсорбции на
поверхности графита (HOPG) и Au (111). Оказалось, что соединение и его комплекс с
европием по-разному адсорбируется на поверхность графита и одинаково -
на
поверхность золота. Предполагая сходную с предложенной в работе [76] модель
взаимодействия соединения с золотой поверхностью через атомы азота, авторами
работы было высказано предположение, что золото вытесняет евпропий из
координационной сферы 1,10-фенантролина, а графит - нет. Это объясняет одинаковые
результаты на золоте (рис. 1.2.20) и разные на графите.
47
Рис.
1.2.19.
Индуцированный
потенциалом
обратимый
фазовый
переход
беспорядок-порядок в монослоях 1,10-фенантролина на Au (111) в 0.02 mM растворе
1,10-фенантролина и 0,1 М NaClO4. Изображения (A-F) были получены при
потенциалах 0,11 V (A), 0,04 V (B), - 0,14 V (C), -0,16 V (D), -0,17 V (E), 0,08 V (F), 0,13 V
(G) и 0,23 V (H). Каждое изображение было получено через ~1 минуту после перехода
на новое значение потенциала.
Надо отметить, что координационные комплексы производного 1,10-фенатролина с
Cu+ напротив оказались настолько прочны, что стало возможным их нанесение на Au
(111) методом вакуумного напыления [78]. Сродство золота к 1,10-фенантролину было
48
успешно применено в экспериментах по фиксации фулерена [79]. Подробно процесс
адсорбции 1,10-фенантролина на поверхность Au(111) в зависимости от ее состояния и
типа растворителя был разобран в работе [80].Было высказано предположение, что
существует
два
типа
адсорбции.
Первый
тип
подразумевает
взаимодействие
соединения с планарной золотой поверхностью как целого. Второй и наиболее
стабильный во времени — координацию отдельным атомом золота на поверхности
1,10-фенантролина по азотам. Роль растворителя оказалась не столь критичной.
Рис. 1.2.20. СТМ-изображения соединения (a - 42 нм × 42 нм, b - 73 нм × 73 нм, и c 47 нм × 47 нм) и его комплекса с европием (d - 81 нм × 81 нм) в растворе н-тетрадекана
на Au (111). Туннельный ток составил 15 пкА, смещение 800 мВ для (a, b, d) и 19 пкА и
600 мВ для (c). Изображения были сняты после ~18 ч экспозиции подложек в
растворе.
Упорядоченные структуры возможно получать не только на Au(111), но и на
HOPG, что продемонстрировано в следующей работе [81]. Используя производное 1,10фенантролина и его комплекс с рением, который показан на рис. 1.2.21, авторами была
показана
возможность
формирования
упорядоченных
линейных
структур
на
поверхности HOPG в 1,2,4-трихлорбензоле и октановой кислоте. В работе отмечается,
что наноструктуры, полученные из производных 1,10-фенантролина, под действием
температуры становятся менее стабильными по сравнению с
комплексами c рением.
аналогичными
49
Рис. 1.2.21. Комплекс рения с производным фенантролина [81].
Способность соединений фенантролина играть
определенную роль при образовании наноструктур в
растворе была исследована в работе [82]. Указанное на
рис. 1.2.22 (а) соединение, растворенное в метаноле с
конечной
концентрацией
62.5
мкM
при
разном
соотношении вода/метанол, образовывало нитевидные
структуры при соотношении 1:1 и кристаллы при
соотношении 9:1, что было установлено методом
дифракции электронов с выбранной области (SAED).
Далее авторам удалось декорировать данные структуры
золотыми наночастицами диаметром порядка 15 нм,
TEM изображения которых даны на рис. 1.2.22 (b —
нити, c — кристаллы).
Также
были
самоорганизации
исследованы
другие
на
производные
предмет
1,10-
фенантролина, структура которых показана на рис.
1.2.23 [83]. Было показано, что сам 1,10-фенантролин не
может при соотношении 9:1 образовывать подобные
наноструктуры, в то время как соединение 1 имеет
тенденцию к образованию нитевидных структур, а
соединение 2 их образует при соотношении 9:1.
Рис. 1.2.22. Соединение фенантролина (a), образующее нитевидные (b) и
кристаллические (с) структуры, декарированные наночастицами.
50
Рис. 1.2.23. Серия производных фенанролина [83].
Обращаясь к теме хемосенсоров, стоит обратить внимание на работу по
модификации cтеклоуглеродных (GC) электродов путем приложения положительного
напряжения [84], как это показано на рис. 1.2.24. В результате атомы азота могут
свободно координировать ионы металлов, что было продемонстрировано авторами на
примере Zn2+ и Cu2+ методом циклических вольтамперограмм.
Рис. 1.2.24. Модификация стеклоуглеродных контактов производным фенанролина
[84].
В последние годы набирает популярность метод усиленной рамановской
спектроскопии (SERS) для исследования процессов адсорбции на подходящие
поверхности различных молекул и изучения их свойств [85]. Метод позволяет также
исследовать наноструктуры и создавать сенсоры различных веществ [86].
Рамановские
спектры
для
1,10-фенатролина
хорошо
изучены
и
интерпретированы [87]. В том числе проведены теоретические расчеты методом
функционала плотности [88], которые хорошо согласуются с экспериментальными
данными.
51
Существует несколько способов получения эффекта усиления рамановских
спектров. Так, в работе [89] был использован раствор коллоидного серебра, в котором
наблюдался SERS. В качестве возбуждающего излучателя использовали аргоновый
лазер (длина волны излучения 476.5 nm, 514.5 nm) и криптоновый лазер (длина волны
излучения 514.5 nm, с мощностью 20 mW). Спектры были сняты с использованием
коллоидного раствора серебра возрастом 2 дня и 2 месяца, см. рис. 1.2.25. Оказалось,
что старый коллоид вызывает разрушение молекулы 1,10-фенантролина по позициям
азотов с образованием связи с серебром, что было установлено по исчезновению
спектральной полосы с волновым числом 3076 см-1.
Рис. 1.2.25. 2-й, 50-й, 100-й, 150-й и 200-й спектры SERS
1,10-фенантролина, адсорбированного на двухмесячном коллоиде серебра. Номера
спектров отвечают разному времени облучения систем лазером: 3.48 × 10 -5, 2.09 × 10-3,
1.49 × 10-1, 9.05 и 96.5 секунд соответсвенно.
Надо отметить, что в другой работе [90] фотодиссоциации не наблюдалось при
использовании лазера мощностью 50 mW, при этом данные по перпендикулярной
ориентации плоскости молекулы к поверхности серебра согласуются.
В
другой
работе
авторы
исследовали
методом
SERS
адсорбцию
1,10-
фенантролина на поверхность кристалла меди, предварительно протравленную в
растворе 0.2 M CuSO4 + 0.4 M H2SO4 при приложенном напряжении +0.5 В в течение 40
секунд
[91].
Такие
измерения
были
проведены
впервые.
Было установлено
взаимодействие фенантролина с поверхностью по атомам азота и показано, что при
изменении pH раствора для соединений со 2 до 7 плоскость 1,10-фенантролина
начинает ориентироваться, образуя угол с поверхностью электрода.
52
Исследования SERS 1,10-фенантролина на поликристаллическом золотом
электроде, протравленном в
водном растворе 2 M HCl при напряжении 0.92 V в
течение 85 секунд, показали сильное изменение спектров соединения в растворе 0.1 M
KСl, 0.1 M HClO4 или 0.1 M KBr по сравнению с кристаллическим состоянием [92].
Авторы предполагают, что на поверхности может идти образование комплексов 1,10phenAu2X6 (X = Cl-, Br-) с участием атомов азота.
Так же были проведены измерения 1,10-фенантролина методом SERS на
железном, кобальтовом и никелевых электродах, а также его комплексов с Fe, Co и Ni
на серебряном [93]. Было установлено, что рамановские спектры Fe(phen 3)2+ на
серебряном электроде схожи со спектрами 1,10 -фенантролина на железном электроде,
и отличаются от спектров 1,10 -фенантролина на серебряном электроде. Откуда авторы
заключили, что адсорбция соединения на поверхность железа похожа на процесс
образования
комплекса
Fe(phen3)2+,
то
есть
происходит
координация
1,10-
фенантролина по азотам атомом железа на поверхности.
Новый способ получения усиления рамановского сигнала был предложен в
работе [94], а также [95]. Суть метода заключается в обработке ровной поверхности, не
вызывающей усиления сигнала, 1,10-фенантролином с последующим осаждением на
поверхность коллоидного серебра, как это показано на рис. 1.2.26.
Рис. 1.2.26. Схема системы для получения SERS фенантролина [94, 95].
Преимуществами метода является то, что нет необходимости смешивать растворы
коллоидного серебра и исследуемого соединения, что поможет избежать образования
побочных комплексов. Известно, что слой соединения может быть нанесен на любую
поверхность, и,
вместе с тем, защищен от разрушительного воздействия лазера
частицами серебра, что предотвращает фотодиссоциацию.
Интерес научного сообщества к данному кругу вопросов говорит о том, что развитие
методик
модификации
поверхностей
фенантролином
и
исследование
его
53
взаимодействия с ДНК может быть востребовано для решения широкого круга задач.
54
1.3. Иммобилизация ДНК на различных поверхностях
1.3.1. Иммобилизация ДНК на подложке из кремния в присутствии ионов
магния
За последние годы был накоплен огромный материал по способам фиксации
ДНК на подложки из различных материалов. Для каждой технологии иммобилизации
характерна различная сила сцепления биополимера с поверхностью, на которую
происходит фиксация. Существуют способы фиксации, при которых биополимер
настолько прочно связывается с подложкой, что дальнейшие его конформационные
изменения под действием внешних сил (сила трения, центробежная сила или
поверхностное натяжение) становятся невозможными. При других способах фиксации
макромолекула остается относительно подвижной и может менять размеры и форму на
поверхности после иммобилизации. Надо отметить, что в процессе фиксации
биополимер претерпевает различного рода воздействия, которые могут привести к
изменению конформации, диаметра, длины, проводимости полимера и т.д. Для
решения различных задач используют
биофизических
возмущения.
исследований
Для
важно,
разные способы фиксации. Так, для
чтобы
наноэлектроники
ДНК
необходимо
испытывала
минимальные
прочно
зафиксировать
бионаноструктуры или создать условия для их сборки прямо на поверхности
полупроводника.
Постоянно
растущий
инструментарий
современных
супрамолекулярных
нанотехнологий на основе ДНК [1, 96] и РНК [97, 98] требует многостороннего
изучения явлений, связанных с предполагаемыми областями их применения. В
частности,
получаемые
по
технологии
РНК
и
ДНК-оригами
стуктуры
с
пространственным разрешением до 6 нм могут быть применены как части
электрических наносхем [98, 99]. Таким образом, встают вопросы об электрических
свойствах данных структур, а также о характере их взаимодействия с различными
поверхностями,
на
которых
эти
схемы
будут
располагаться.
Исследование
электрофизических свойств ДНК проводится с высокой интенсивностью, при этом
проводимость
этого
биополимера
претерпевает
значительные
изменения
в
зависимости от условий эксперимента [100]. Таким образом, вопрос фундаментальных
55
механизмах электропроводности остается открытым.
Взаимодействие ДНК и РНК с поверхностями можно рассматривать в разрезе
методик фиксации биополимеров на подложки различных типов.
Это актуально при
исследовании нуклеиновых кислот и их комплексов с различными лигандами
методами микроскопии [101, 102], а также при изготовлении биочипов [103]. С
развитием в последние годы метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР)
применительно к исследованию взаимодействия ДНК с белками [104, 105] и
различными лигандами [106, 107] также возникла потребность в простом и надежном
способе подготовки чипов, содержащих ДНК на золотой поверхности. Развитие
методик фиксации позволили бы осознанно подойти к созданию и проектированию
новых биосенсоров [108, 109] и управляемых супрамолекулярных структур на основе
ДНК-оригами [110, 111] в будущем.
Существует целый ряд способов химической модификации поверхностей и
фиксируемых на них олигонуклеотидов
группами, которые могут образовывать
прочные связи между собой [112-114]. Часто используемые схемы
фиксации
олигомеров на стекле изображены на рис. 1.3.1. Надо отметить, что модификация ДНК
тиоловой группой является универсальным способом и подходит не только для стекла,
но и для практически любой поверхности.
Рис. 1.3.1. Таблица различных способов иммобилизации ДНК на поверхность стекла
[113], которые подходят и для кремния, а часть из них для золота.
Отметим, что данные методики подходят для узкого круга задач, таких как
56
создание биосенсоров или определенных наноструктур. Они являются частным
решением задачи по фиксации ДНК, зачастую приводящей к дорогостоящим
манипуляциям,
усложняющим
универсальным подходам.
эксперимент.
Поэтому
обратимся
к
более
57
1.3.2. Фиксация ДНК на поверхность слюды
Первые изображения ДНК на поверхности слюды были получены при помощи
ионов Mg2+[115, 116]. Слюду скалывали при помощи лезвия или липкой ленты, далее
подложки выдерживали в течение ночи в растворе 33 mM ацетата магния. После чего
подложки промывали и наносили раствор 10-100 мкг/мл ДНК на 2 минуты, затем
еще раз промывали водой. Это позволяло получить хорошо воспроизводимые
изображения ДНК при помощи АСМ, см. рис. 1.3.2.
Рис. 1.3.2. АСМ-изображение слюды с зафиксированной при помощи ионов магния
молекулой ДНК.
После чего были проделаны эксперименты по возможности фиксации ДНК при
помощи Ca2+, Ba2+, Co2+, Ni2+, Zn2+, Cr2+, La3+ и Zr+4, которые оказались успешными [117].
При этом разные ионы с разной силой связывают ДНК с поверхностью. Например, для
измерения ДНК методом АСМ в жидкости используют Ni 2+, так как Mg2+ в растворе
фиксирует ДНК недостаточно статично [101]. Так, авторы работы [117] связывают силу
фиксации ДНК с ионным радиусом металлов. На рис. 1.3.3 приведены АСМизображения раствора ДНК, высаженной из раствора 0.5 нг/мкл, содержащего 1 mM
MCl2 (M — соответствующий металл). Было показано, что чем больше ионный радиус
используемого металла, тем хуже он подходит для фиксации ДНК и сканирования
методом АСМ в жидкости. Магний является исключением: имея ионный радиус 0.65 А,
он все же плохо подходит для жидкостных измерений
58
Рис. 1.3.3. АСМ-изображения молекул ДНК в растворе, содержащем ионы разных
металлов.
Следует отметить, что, помимо выполнения функции иммобилизации ДНК,
ионы металлов взаимодействуют с этим биополимером, вызывая изменения его
конформации. Обратили на это внимание следующие авторы [118]. Ими были
проведены исследования по измерению расстояния между концами цепи ДНК и ее
контурной длины в зависимости от используемых для фиксации ионов. Образцы
готовили путем экспозиции свежесколотой слюды в течение 3 минут
в растворе,
содержащем 0.75 нг/мкл ДНК pBR322 и 2 mM ионов Sr2+, Ba2+, Ca2+ или Mg2+ и 0,10 или
20% этанола с последующим промыванием и высушиванием. Измерения показали, см.
рис. 1.3.4, что конформация ДНК значительно изменяется в присутствии различных
59
ионов. Авторы связывают это с изменением персистентной длины цепи и A-B
переходом, индуцированным этанолом.
Рис. 1.3.4.
Расстояние между концами цепи и контурная длина молекулы ДНК,
измеренная по АСМ-изображениям, в зависимости от типов ионов, используемых для
ее фиксации.
Подобные измерения показывают, что подходить к интерпретации результатов
микроскопических измерений надо с осторожностью, учитывая взаимодействие ионов
с молекулой ДНК. Метод иммобилизации ДНК при помощи магния подходит также
для поверхности кремния [119], что связано с наличием на его поверхности кислорода,
способного связывать ионы данного металла, который уже, в свою очередь,
связывается с ДНК. Минусом такого способа является то, что молекулы биополимера
не прочно крепятся к поверхности и могут двигаться вдоль нее, что вызывает их
агрегацию.
Чтобы добиться более стабильных результатов при сканировании и исключить
возможное взаимодействие ионов металлов с ДНК в растворе, был предложен метод
химической модификации поверхности слюды 3-аминопропилтриэтоксисиланом
(APTES) [120]. Данный метод отличается тем, что позволяет проводить измерения при
pH вплоть до 10, а также при различных ионных силах, сохраняя суперспиральную
структуру ДНК, что затруднительно при использовании катионов металлов [101].
Минусами данного метода является полимеризация APTES, приводящая к частичному
загрязнению подложки. Стоит отметить, что многие способы модификации слюды
подходят для стекла и кремния, так как подразумевают реакцию силанольных групп,
которые есть на этих типах поверхностей, с модифицирующими реагентами.
Вместе с тем, помимо большого количество реактивов для модификации
поверхности, которые были разработаны за последнее время, и которые имеют свои
плюсы и минусы, существует возможность не использовать их вовсе. Так, было
60
предложено высушивать каплю ДНК на подложке в потоке азота [121]. Такой способ
сильно деформирует конформацию ДНК, что хорошо видно на рис. 1.3.5. При этом
авторы утверждают, что контурная длина молекул составляет 89% от ожидаемой, что
сопоставимо с контурной длиной, полученной при использовании стандартных
методик фиксации ДНК. Изменение видимой длины молекул ученые связывают с
недостаточной разрешающей способностью микроскопа.
Рис. 1.3.5. АСМ-изображения ДНК, растянутой в потоке газа, как это показано сверху.
a) короткие фрагменты b-e) длинные фрагменты
61
1.3.3. Ориентация ДНК на поверхности подложки.
Методы растягивания ДНК были предложены несколькими группами ученых и
получили названия «Air-flowing method» [122], «Spin-stretching method»[123] и «Moving
interface technique»[124]. В них используется воздух, центробежная сила или мениск
капли наносимого на подложку раствора для растягивания молекул.
Формирование ориентированных цепей ДНК на поверхности подложки является
важной задачей. Используется несколько способов вытягивания макромолекул на
подложке. Одним из способов является метод свободного потока «Free-flowing method»
[125, 126]. В этом методе один конец макромолекулы закрепляется на подложке, после
чего ДНК растягивается потоком буфера в одном направлении. В результате полимер
фиксируется в виде отдельных вытянутых в одном направлении молекул (рис. 1.3.6).
Рис. 1.3.6. Изображения фиксируют растяжение ДНК в ламинарном потоке на покрытом
полилизином стекле. Между изображениями B и C прошло 33 мс, между C и D- 66 мс
[126].
Альтернативный метод воздушного потока («аir-flowing method»)[122] позволяет
создавать двумерные сетки из ДНК. На подложку наносится раствор ДНК. Затем капля
сдувается потоком азота в одном направлении, потом наносится новый раствор ДНК,
молекулы которого аналогично вытягиваются потоком газа в поперечном направлении
62
(рис. 1.3.7). После растяжения и фиксации молекула прочно связывается с
поверхностью и не меняет свою конформацию при повторном продувании, что
отмечается также авторами работы [126].
Рис. 1.3.7. АСМ изображения сетки ДНК, полученной методом «аir-flowing method»
[122].
Следующий метод - «Spin-stretching method» [123] состоит в том, что
закрепленные
на
поверхности
макромолекулы
ориентируются
под
действием
центрифуги. Этот способ очень удобен, так как, подбирая подходящую скорость
вращения, можно ориентировать как длинные, так и короткие молекулы ДНК, а также
учитывать различные силы сцепления ДНК с подложкой.
В работе [13] рассматривается еще один метод - «Moving interface technique». Это
способ вытягивания макромолекул в заданном направлении, причём подразумевается,
что растягивание происходит за счёт движения границы раздела раствор-воздухподложка. Авторами было установлено, что молекула ДНК при иммобилизации
претерпевает конформационные изменения, которые приводят к изменению длины
одного витка спирали на 0.72 нм.
Отдельно стоит отметить
уникальную
технологию контроля положения
макромолекул ДНК λ-фага длиной 16.5 мкм и T4 длиной 56.4 мкм на чипе,
изготовленном методом трехступенчатой литографии [127]. Исследователи изготовили
на кварцевой подложке туннель глубиной 50/100 нм, на дне которого располагаются
квадратные ямки глубиной 100 нм со стороной от 100 до 500 нм, расположенные в
виде матрицы, см. рис. 1.3.8. Таким образом, получено устройство, позволяющее
закреплять ДНК на подложке в заранее известных местах с высокой степенью
воспроизводимости и не требующее модификации ДНК или подложки.
63
Рис. 1.3.8. A) Схема подвода каналов к туннелю для обеспечения протока раствора ДНК
B) увеличенная схема туннеля C) СЭМ-изображения ямок на дне туннеля D-G)
Флуоресцентные изображения ДНК, окрашенной YOYO-1, попавшей в ямки (риска 5
мкм).
64
1.3.4. Фиксация ДНК на поверхность золота
В
следствие
гидрофобности
золотых
поверхностей,
иммобилизация
гидрофильной ДНК на них представляет определенную трудность. Основной стратегий
является модификация золота при помощи соединений, содержащих тиоловые
группы, которые образует прочную связь с поверхностью [128]. Впервые подобные
эксперименты при помощи 11-меркаптоундекановой кислоты (MUDA) провели в
работе [129]. Поверхность золота сначала была обработана MUDA, а затем раствором 2
нг/мкл ДНК, содержащим 2 mM Mg(OAc)2, Zn(OAc)2 или Cu(OAc)2, как это показано на
рис. 1.3.9.
Результаты фиксации приведены на риc. 1.3.10. Они показывают
принципиальную возможность данного метода фиксации ДНК.
Рис. 1.3.9. Протокол фиксации ДНК на поверхность кристаллического золота [129].
65
Рис. 1.3.10. АСМ-изображения ДНК pBR 322
при использовании ионов Mg2+ (a), Cu2+ (b) и Zn2+ (c).
В
работе
[130]
было
предложено
использовать
интеркаляционное
взаимодействие производного этидиума с ДНК, как это показано на рис. 1.3.11.
Рис. 1.3.11. Модель иммобилизации ДНК за счет интеркалляционного
взаимодействия с поверхностью.
Визуализация
фиксации
проводилась
косвенным
методом:
синтетические
олигонуклеотиды модифицировали наночастицами, потом ими обрабатывалась
66
подложка, которую затем изучали при помощи СЭМ. Однако это не позволило сделать
выводов о характере фиксации.
При приготовлении чипов для измерения методом плазмонного резонанса
используются методы ковалентной пришивки ДНК к поверхности золота. Одним из
широко применяемых подходов является применение коммерчески доступных
модифицированных
декстраном
чипов
и
специально
модифицированных
олигонукледтидов, рис. 1.3.12 [131]. В частности, такой способ позволяет использовать
связывание
биотин-стрептавидин,
при
котором
поверхность
модифицируется
стрептавидином, а ДНК - биотином. Кроме роли химического реагента, декстран
представляет собой барьер между исследуемым соединением и золотой поверхностью,
так как, к примеру, белки могут денатурировать при таком взаимодействии.
Альтернативой является стандартная методика иммобилизации олигонуклеотидов,
содержащих тиоловую группу (-SH) в 5' или 3' позиции. Также было показано, что
использование модификации фосфатной группы ДНК серой лучше подходит для
измерений. Такие олигонуклеотиды менее подвержены ферментативному разложению
эндонуклеазами и не окисляются, а также не образуют дисульфидных связей, хотя при
этом дают более слабый ППР-сигнал в некоторых случаях [132]. Таким образом,
исследователям
необходимо
приобретать
либо
специальные
чипы,
либо
модифицированные олигонуклеотиды, что оставляет вопрос поиска альтернативных
путей иммобилизации ДНК открытым.
67
Рис. 1.3.12. Примеры методов иммобилизации на основе амино- и тиоловой химии с
использованием чипов, покрытых карбоксиметилированным слоем декстрина. (a):
аминофункционализированные лиганды, (b): альдегидные лиганды, (c):
дисульфидный обмен, (d): пришивка тиоловых производных к малеимидами, (e):
нативная химическая лигация.
68
ГЛАВА 2
69
2.1. Материалы
Во всех экспериментах использовалась бидистиллированная вода. Использовали
коммерческий препарат ДНК тимуса теленка фирмы «Sigma», молекулярная масса
которой M = 10·106 Да была определена по значению характеристической вязкости в
0.15 M NaCl. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически по разнице
поглощения гидролизованных в 6% HClO4 растворов при длинах волн 270 и 290 нм.
Нативность ДНК контролировали по величине коэффициента молярной экстинкции
на длине волны 260 нм. В зависимости от условий эксперимента растворы ДНК
содержали от 5·10-4 до 5·10-3 M NaCl и от 5·10-4 до 5·10-2 M MgCl2.
В работе использовали неокупроин (Neo) фирмы «Sigma» и серосодержащее
соединение 1,10-фенантролина (PhenSH), синтезированное Демидовым В. Н. Структура
соединений приводится в соответствующем разделе.
В качестве подложек использовали:
•
слюду (мусковит).
•
монокрисалллы кремния n-/p-типа проводимости, выращенные по методу
Чихральского с ориентацией (100) и концентрацией свободных носителей
порядка 7∙1014 cм-3.
•
Стекло
•
Термонапыленное на поверхность стекла золото, толщина слоя - 45 нм.
Все подложки из слюды предварительно скалывали с помощью липкой ленты.
Подложки из монокристаллов кремния изначально промывали 3 мкл воды,
потом часть протравливали в смеси H 2O2 + H2SO4 в течение 1 минуты при комнатной
температуре для удаления с поверхности окисла и снова промывали 3 мкл воды. Часть
приготовленных таким образом подложек подвергали химическому окислению в
кипящем растворе (1:1) в течение 20 секунд с последующим промыванием в воде.
Подложки из стекла и золота не подвергались дополнительной очистке перед
использованием.
70
2.2. Методика фиксации ДНК на подложки.
В экспериментах использовались как необработанные подложки, так и подложки,
выдержанные некоторое время в растворах MgCl 2, PhenSH или Neo. Далее на подложки
наносился раствор ДНК различной концентрации объемом ~15 мкл. Время экспозиции
подложек в растворах ДНК варьировалось от 1 минуты до 1 часа. Удалялись растворы
ДНК с поверхности путем промывания в воде или потоком воздуха. Процесс
иммобилизации ДНК проводился в темноте, при естественном освещении или при
направленном облучении. В качестве источника света использовали светодиод
TSHA5200 с длиной волны 890 нм и током 40мА. Светодиод располагали на
расстоянии 5 мм от поверхности непосредственно над каплей раствора. Для получения
плёнки ДНК на поверхность кремния наносили раствор ДНК объёмом ~50 мкл. После
чего образец выдерживали 1 сутки при комнатных условиях до полного высыхания
раствора.
71
2.3. Создание диодов Шоттки.
Для создания шоттки-диодовов на модифицированную поверхность кремния
термическим напылением в вакууме наносили металлические золотые контакты.
Толщина напыления составляла 30 нм, диаметр — 1.5 мм. Омические контакты на
тыльной стороне создавались втиранием галлия.
Рис. 2.3.1. Диод Шоттки с ДНК на интерфейсе.
72
2.4. Метод поверхностного плазмонного резонанса.
Установка NanoSPR8-481, которая использовалась для измерения поверхностного
плазмонного резонанса (ППР), изображена на рис. 2.4.1. Линейно поляризованный
свет лазера проходит через призму, отражается от золотой поверхности чипа, затем от
стенки призмы и попадает на фотодетектор. Призма может вращаться, изменяя угол
падения луча лазера на золотую поверхность. В процессе эксперимента измеряется
зависимость интенсивности отраженного света от угла поворота призмы.
Рис. 2.4.1. Установка для измерения ППР состоит из лазера (1) и фотодитектора (5),
призмы (2), золотого чипа (3) и механизма для поворота призмы (6). На поверхность
чипа наносится исследуемый раствор (4).
Явление поверхностного плазмонного резонанса заключается в том, что при
определенном угле падения луча лазера на золотую поверхность свет перестает
отражаться, рис. 2.4.2. Это обуславливается тем, что коллективные колебания
электронов вдоль поверхности золота имеют собственную частоту, по аналогии с
плазменной частотой продольных колебания пространственного заряда в однородной
плазме. Таким образом, вдоль поверхности могут распространяться поперечные
колебания электронной плотности с определенным волновым числом. Когда последнее
совпадает с проекцией волнового вектора падающей линейно поляризованной волны
(плоскость поляризации перпендикулярна поверхности), энергия световой волны
переходит в коллективные колебания электронов, и вдоль поверхности начинает
распространяться описанная выше волна. Соответственно, возникает поверхностный
плазмонный резонанс, энергия отраженного света значительно снижается, что
73
регистрируется прибором.
Рис. 2.4.2. Зависимость интенсивности отраженного света от угла поворота призмы.
Электромагнитные колебания света проникают внутрь золотой поверхности на
незначительную глубину порядка нескольких сот нм (так называемый скин-эффект). В
приборе используются чипы с толщиной золотого слоя 45 нм, что приводит к тому, что
свет лазера частично проходит через него. В то же время, такая толщина позволяет
вовлечь в коллективные колебания все электроны с обоих сторон слоя. Таким образом,
изменяя подвижность электронов на любой из поверхностей слоя, можно значительно
повлиять на волновое число распространяющейся вдоль поверхности возбужденной
светом лазера волны. Так, при нанесении на поверхность золота исследуемого раствора
подвижность электронов меняется, что приводит к изменению угла, на котором
наблюдается ППР. Сдвиг угла пропорционален массе вещества, находящегося на
расстоянии до 150 нм от поверхности, и его оптическим свойствам (показателю
преломления). Используемый прибор
NanoSPR8-481 работал в двух режимах.
«Multiple mode» - угол ППР определятся путем поворота призмы для определения
минимума интенсивности для каждой точки во времени. Данный режим позволяет
следить за формой сигнала, но поворот призмы занимает значительное время. Для
измерений с высоким временным разрешением используется режим «Slope mode», при
котором
снимается
соответствующий
интенсивность
минимуму
при
одном
интенсивности,
положении
определяется
призмы,
а
численно
угол,
по
74
предварительно снятой форме кривой ППР.
75
2.5. Метод атомной силовой микроскопии
Главное
назначение
атомно-силового
микроскопа
(АСМ)
—
получение
топографических изображений поверхностей различного рода: металлов, керамики,
полимеров, биомолекул и живых клеток. Кроме того, АСМ дает возможность изучать
механические, магнитные и электрические свойства материалов.
Для создания изображений поверхности образца в методе АСМ используют острую
иглу, которая может быть сделана из различных материалов. В данной работе
использовались, в основном, иглы SCANASYST-AIR треугольной формы, сделанные из
нитрида кремния с радиусом 2-12 нм. Игла прикреплена к гибкому кантилеверу —
планке с известной константой жесткости (в нашем случае порядка 0.4 Н/м). При
помощи пьезоманипулятора игла приводится в контакт с поверхностью образца и
двигается вдоль нее. АСМ могут работать в различных режимах, которые разделяют на
контактные, полуконтактные и бесконтактные. В большинстве случаев в данной работе
использовали полуконтактный режим SCANASYST, суть которого состоит в следующем.
Как и для других режимов, поверхность разбивается на ячейки и представляет собой
матрицу (например, 512x512 или 256x256). Далее, в каждой ячейке матрицы иголка
подводится и отводится от поверхности, при этом изгиб иголки в результате
взаимодействия с поверхностью регистрируется прибором. Сигнал обратной связи
настроен так, что как только при сближении с поверхностью иголка перестает
притягиваться к поверхности и начинает отталкиваться, иголка отводиться от
поверхности. Сигнал фиксирует, на какой высоте это происходит. Это и будет нести
информацию
о
топографии
поверхности.
В
большинстве
атомных
силовых
микроскопов для фиксации силы, как правило, используют оптические датчики изгиба
кантилевера, реализованные по следующей схеме (рис. 2.5.1): луч лазерного диода
падает
под
углом
на
поверхность
кантилевера
и
отражается
в
центр
четырехсекционного фотодиода; при изгибе кантилевера в нормальном или торсионном
направлении
возникает
разница
между
сигналами
соответствующих
участков
фотодиода: верхний/нижний сегменты или правый/левый сегменты соответственно.
Разностный сигнал правых и левых сегментов фотодиода, отображающий величину
тангенциальных сил (сил трения), действующих на зонд при сканировании, выводится
в компьютер и отображается на экране монитора. Разностный сигнал верхних и нижних
сегментов фотодиода используется для определения изгиба иглы.
76
Рис. 2.5.1. Основные узлы механической части атомного силового микроскопа и
система обратной связи.
Для обеспечения высокой разрешающей способности прибора интенсивность
взаимодействия между зондом и образцом должна достаточно сильно зависеть от
расстояния между ними. В случае исследования незаряженных поверхностей силовое
взаимодействие образца и зонда состоит из электростатического отталкивания и Вандер-Ваальсова притяжения, капиллярных сил и сил трения. Диапазон возникающих в
АСМ сил: 10-7 Н для кулоновских сил и 10-11 Н для сил Ван-дер-Ваальса.
В работе измерения проводили с помощью атомного силового микроскопа
NanoScope V (Veeco).
77
2.6. Исследование электрофизических свойств интерфейса ДНК-кремний
2.6.1. Обоснование методики эксперимента
Заряд молекул ДНК, зафиксированных на поверхности кремния, оказывает
влияние на электрический потенциал поверхности кристалла и электрическое поле в
приповерхностной области кристалла. Как следствие, в зависимости от величины и
знака заряда молекул будет изменяться величина концентрации свободных носителей
заряда в приповерхностной области. Изменение проводимости поверхностного слоя
непосредственно может проявляться в величине сквозного тока через поверхность. Для
осуществления возможности токовых измерений поверх осажденных на поверхности
кристалла молекул может быть нанесена пленка металла. При соответствующем
выборе
металла
получаемый
контакт
металл-полупроводник
может
обладать
вентильными (диодными) свойствами. В таком случае количественные оценки
величины плотности электронных состояний на интерфейсе и их энергетическое
распределение могут быть получены из измерений вольт-амперных и вольт-фарадных
характеристик структуры.
78
2.6.2. Идеальный шоттки-контакт
Контакт металл-полупроводник, обладающий диодными свойствами,
называется контактом Шоттки. Рассмотрим процесс образования идеального шотткиконтакта (барьера Шоттки) золота с кремнием n-типа проводимости. Работой выхода
называется разность энергий между уровнем вакуума и уровнем Ферми. Ток
термоэлектронной эмиссии с поверхности любого твердого тела определяется
уравнением Ричардсона:
J T = AT e
2
−
Φ
kT
(1)
, где Ф — работа выхода электрона, T — абсолюная температура, k — константа
Больцмана и A — постоянная Ричардсона.
Работа выхода из кремния Фп/п меньше, чем работа выхода из золота ФМе. В этом
случае, согласно уравнению (1), ток термоэлектронной эмиссии с поверхности
полупроводника jп/п будет больше, чем ток термоэлектронной эмиссии с поверхности
металла jме. В начальный момент времени соприкосновения материалов ток из
полупроводника в металл будет превышать обратный ток из металла в полупроводник,
и в приповерхностных областях полупроводника и металла будут накапливаться
объемные заряды – отрицательные в металле и положительные в полупроводнике,
рис. 2.6.2.1. В области контакта возникнет электрическое поле, в результате чего
произойдет изгиб энергетических зон.
Термодинамическая работа выхода на поверхности полупроводника будет расти.
Этот процесс будет проходить до тех пор, пока в области контакта не сравняются токи
термоэлектронной эмиссии и, соответственно, значения термодинамических работ
выхода
на
поверхности.
В
условиях
равновесия
в
области
контакта
токи
термоэлектронной эмиссии выравниваются. Вследствие перераспределения зарядов
возникает потенциальный барьер, высота которого равна разности термодинамических
работ выхода:
Δφms = (ФМе – Фп/п)
79
Рис 2.6.2.1. Зонная диаграмма, иллюстрирующая образование барьера Шоттки для
контакта Au/n-Si. Ec — дно зоны проводимоти, Ev — верхняя граница валентной зоны, Ei энергия середины запрещенной зоны, Fме и Fп/п — уровни Ферми металла и кремния
соответственно, W — ширина области пространственного заряда (ОПЗ).
Рассмотрим, как меняется зонная диаграмма контакта металл – полупроводник
при приложении внешнего напряжения VG, знак которого соответствует знаку
напряжения на металлическом электроде. На рис. 2.6.2.2 приведены соответствующие
зонные
диаграммы
при
положительном
и
отрицательном
напряжениях
на
металлическом электроде барьеров Шоттки. Из приведенного рисунка видно, что роль
внешнего напряжения в барьере Шоттки сводится только к регулированию высоты
потенциального барьера и величины электрического поля в ОПЗ полупроводника.
Знак поверхностного потенциала на всех зонных диаграммах – отрицательный. На
рисунках указана величина потенциального барьера (изгиба энергетических зон),
соответствующая модулю значения поверхностного потенциала ψ s = Δφms – VG.
80
Рис 2.6.2.2. Зонная диаграмма барьера Шоттки при различных напряжениях на
затворе: а) VG = 0; б) VG > 0, прямое смещение; в) VG < 0, обратное смещение.
Вне зависимости от полярности напряжения для барьерных структур все
внешнее напряжение будет приложено к области пространственного заряда, поскольку
в этой области концентрация свободных носителей существенно меньше, чем в других
частях структуры.
Связь
электрического
поля
пространственно-распределенным
и
потенциала
объемным
для
зарядом
любых
материалов
описывается
с
уравнением
Пуассона. В одномерном приближении это уравнение имеет вид:
d 2ψ
ρ
=−
2
εε 0 (2)
dx
, где ψ(x) – зависимость потенциала от координаты, ρ(x) – плотность объемного
заряда, ε – диэлектрическая проницаемость полупроводника, ε 0 – диэлектрическая
постоянная.
Заряд в области пространственного заряда барьера Шоттки для полупроводника
n-типа обусловлен зарядом ионизованных доноров с плотностью N D . Поэтому:
ρ ( x) = eN d
, где e - заряд электрона.
При интегрировании уравнения Пуассона учтем, что величина электрического
81
поля
E ( x) = − grad x (ψ ) ,
и проведем интегрирование уравнения (2). Выберем
константу интегрирования из расчета, что при x = W электрическое поле E равно нулю,
как следствие, получим:
W=
2εε 0
(∆ϕms - VG )
eN d
Необходимо заметить, что слой объемного заряда противоположного знака
возникает и в приповерхностной области металла. Но из-за высокой концентрации
свободных электронов его толщина оказывается очень малой (менее 10 Ǻ). Такой
туннельно-прозрачный слой обладает низким сопротивлением протекающему току и
не оказывает заметного влияния на электрические характеристики контакта.
82
2.6.3. Вольт-амперная характеристика барьера Шоттки
Вольт-амперная характеристика идеального контакта металл-полупроводник
описывается формулой
J = J 0 [exp(eVG / kT ) − 1] [133], где e - заряд электрона, VG -
напряжение на контакте, k - постоянная Больцмана, T - абсолютная температура, J 0 ток насыщения.
Рис. 2.6.3.1 Вольт-амперная характеристика барьера Шоттки.
Вольт-амперная характеристика имеет ярко выраженный несимметричный вид,
рис.2.6.3.1. В области прямых смещений ток экспоненциально растет с ростом
приложенного напряжения. В области обратных смещений ток от напряжения не
зависит. В обоих случаях при прямом и обратном смещении ток в барьере Шоттки
обусловлен основными носителями – электронами. По этой причине диоды на основе
барьера Шоттки являются быстродействующими приборами, поскольку в них
отсутствуют рекомбинационные и диффузионные процессы. Несимметричность вольтамперной характеристики барьера Шоттки
типична для барьерных структур.
Зависимость тока от напряжения в таких структурах обусловлена изменением числа
носителей, принимающих участие в процессах переноса заряда. Роль внешнего
напряжения заключается в изменении числа электронов, переходящих из одной части
барьерной структуры в другую.
Вольт-амперная характеристика идеального контакта металл-полупроводник
описывается формулой J = J 0 [exp(eVG / kT ) − 1] [133], где e - заряд электрона, VG -
83
напряжение на контакте, k - постоянная Больцмана, T - абсолютная температура, J 0 ток насыщения. Для шоттки-диодов с интерфейсным слоем изменения угла наклона
ВАХ
в
области
положительных смещений могут быть описаны введением
коэффициента неидеальности n [134], характеризующего распределение внешнего
напряжения в структуре: J ≅ J 0 exp(eVG / nkT ) . В соответствии с работой [134], отличие n
от единицы может обуславливаться как самим присутствием интерфейсного слоя
конечной толщины
δi
, так и наличием в нем электронных состояний, способных
обмениваться носителями заряда с полупроводником и металлом:
n = 1+
CD + eDss
Ci + eDsm
(3)
, где CD , Ci - емкость области пространственного заряда (ОПЗ) полупроводника и
геометрическая емкость интерфейсного слоя в расчете на единицу площади контакта,
Dsm Dss
,
- плотности интерфейсных состояний, обменивающихся носителями заряда с
металлом и полупроводником соответственно, в расчете на единичный интервал
энергий и единичную площадь. В отсутствие электронных состояний на интерфейсе
коэффициент неидеальности принимает предельное значение
длина
экранирования
диэлектрические
заряда
проницаемости
в
ε s,εi
полупроводнике,
полупроводника
n0 = 1 +
и
-
δ iε s
LDε i
, где LD относительные
интерфейсного
слоя
соответственно. Таким образом, по отклонению коэффициента неидеальности можно в
соответствии с рассматриваемой в данном конкретном случае моделью дать оценку
плотности поверхностных состояний на интерфейсе. Например, количество состояний,
обменивающихся зарядом с полупроводником в диапазоне приложенных напряжений
∆VG
, можно оценить по формуле:
N is ≈ Dss ∆VG ≈
∆nε i ε 0
∆VG
eδ i
(4)
84
2.6.4. Вольт-фарадная характеристика барьера Шоттки
Наличие слоя, лишенного свободных носителей заряда в приповерхностной
области полупроводника, приводит к тому, что при пропускании переменного тока
диод Шоттки ведет себя как конденсатор, емкость которого определяется толщиной
ОПЗ и величиной диэлектрической проницаемости кристалла. В отличие от емкости
плоского конденсатора, величина этой емкости зависит от приложенного внешнего
напряжения:
Cd =
εε 0 S
εε 0eN d
=S×
W
2(∆ϕms - VG )
(5)
где S - площадь металлического контакта. Эту емкость называют барьерной, так
как она связана с образованием потенциального барьера между областями металла и
полупроводника.
Формула (5) может быть переписана в виде:
2( ∆ϕ ms - VG )
1
=
2
Cd
eεε 0 N d
(6)
Если концентрация Nd постоянна во всей области пространственного заряда, то
на графике 1/С2 от V мы получим прямую, из тангенса угла наклона которой
вычисляют значение Nd. При этом отсечка графика на горизонтальной оси дает
величину ∆φms.
Рис. 2.6.4.4 Эквивалентная электрическая схема шоттки-диода без
интерфейсного слоя. Rd – сопротивление обедненного слоя, Cd – емкость обедненного
слоя, r – объемное сопротивление нейтральной области кристалла.
На рис. 2.6.4.4 изображена эквивалентная схема шоттки-диода без учета
интерфейсного слоя. Наличие сопротивления Rd связано с активной компонентой тока
через барьер. Для умеренно легированного кремния при комнатных температурах
основной вклад в обратный ток вносят краевые токи утечки, обусловленные
85
концентрацией электрического поля на краю металлического электрода, а также токи,
вызванные
тепловой
генерацией
свободных
носителей
заряда
в
пределах
диффузионной длины от границы ОПЗ. При прямых смещениях величина тока диода
определяется током основных носителей, преодолевающих потенциальный барьер на
границе.
В реальном полупроводнике присутствуют дополнительные поверхностные
электронные уровни энергии, которые меняют термодинамическую работу выхода
электрона с его поверхности. В результате разница работ выхода полупроводника и
металла ∆ϕ ms на границе отклоняется от идеального значения. Реальную разницу работ
выхода принято обозначать через
UD
(диффузионное напряжение). Диффузионный
ток насыщения для такого диода принято обозначать
Is .
Таким образом, можно
переписать формулу, отображающую вольт-амперную характеристику диода в виде
I = I s [exp( eU / kT ) − 1] (7), а формулу (6) в виде
C D −2 ≅
2(U + U d 0 )
ε sε 0 eN D (8).
Оценка плотности поверхностных электронных состояний проводилась с
помощью измерений вольт-амперных характеристик диодов на постоянном токе и
измерений зависимостей их емкости от напряжения смещения. Измерения на
переменном токе проводились с помощью анализатора импеданса Agilent 4294A на
частоте 1 МГц при амплитуде синусоидального тестирующего сигнала 15 мВ. Для
измерений
вольт-амперных
характеристик
использовался
построенный
на
операционном усилителе преобразователь ток-напряжение. Установка напряжения на
образце и измерение величин напряжения и тока осуществлялись автоматически с
помощью компьютера. Измерения электрофизических характеристик проводились
при комнатной температуре.
86
2.7. Вискозиметрия
Внутреннее трение или вязкость жидкости проявляется в тех случаях,
когда она течет со скоростью U. Если течение жидкости направлено вдоль оси X, и
при этом имеется отличный от нуля градиент скорости потока вдоль направления,
перпендикулярного оси X, он равен:
g=
dU x
dy
Количественно вязкость определяется из уравнения Ньютона: τ = ηg, где τ напряжение сдвига, а η - коэффициент пропорциональности, который называется
вязкостью. Для характеристики раствора вводится относительная вязкость
ηr =
η
η0 ,
где η - вязкость раствора, η 0 - вязкость растворителя.
Для поддержания течения вязкой жидкости с постоянным градиентом
скорости необходима затрата энергии. Величина энергии, затрачиваемой на
пр еодолени е сил в ну треннего т рени я в еди ни цу вр ем ени в еди ни це
объема
E = ηg . Величину
вязкостью, а -
2
η r − 1 = η уд
называют удельной (специфической)
ηr −1
c
приведенной вязкостью.
Характеристическая вязкость полимеров определяется по формуле:
 η −1 
[η ] = lim  r 
c →o
 c 
Величину [η] используют для определения размеров макромолекул в растворе и
молекулярной массы М, хотя это и не абсолютный метод (для определения М
необходима градуировка). Определение М полимера по значению [η] основано на
эмпирическом уравнении Марка-Куна-Хаувинка :
[η ] = Kη M α
, где Kη и α- величины, постоянные для данной системы полимер-растворитель. Они
определяются
из независимых измерений [η] и М, причем М определяется
абсолютным методом (например, из светорассеяния).
87
Независимо от модели растворенной частицы, величина [η] пропорциональна её
удельному объему в растворе. Для полимерных клубков, у которых за линейный
размер принимается среднеквадратичное расстояние между концами цепи <h2>1/2,
удобно пользоваться формулой Флори:
[η ] =
, где Ф-константа Флори.
3
2 2
Ф( h
M
)
Величина<h2>1/2 =α<h02>1/2, где α – коэффициент
линейного набухания, <h02>1/2 – среднеквадратичное расстояние между концами цепи в
идеальном растворе.
Величина [η] определяется из экстраполяцией концентрационной зависимости
приведенной вязкости к С = 0. Для описания этой зависимости используется степенной
ряд:
ηr −1
= [η ] + k1C[η ]2 + k 2 C 2 [η ]3 + ...
C
Обычно ограничиваются областью линейной зависимости (ήr-1)/C от С. Это так
называемая экстраполяция по Хаггинсу : где k1 - константа Хаггинса. Альтернативный
способ- экстраполяция по Кремеру:
ln η r
= [η ] − k 2C[η ]2
C
где k2 -константа Кремера.
Для определения вязкости раствора используют капиллярный и ротационный
вискозиметры.
Относительная
вязкость,
определяемая
в
ротационных
вискозиметрах по относительному изменению скорости вращения ротора
(среднего времени одного оборота ротора) в растворе и растворителе: ηr =
t/t0, где t и t0 – время оборота ротора в растворе и растворителе соответственно, дает
возможность определить удельную и приведенную вязкость раствора. В данной работе
использовали ротационный вискозиметр типа Зима-Крозерса.
88
2.8. Программное обеспечение
Структура производного фенантролина моделировалась в программе Avogadro,
данные обрабатывались в программе MagicPlot, моделирование кинетики реакций
проводилось при помощи программы Tenua.
Измерения
систем методами атомно-силовой микроскопии, поверхностного
плазмонного резонанса,
вискозиметрии и спектрофотометрии были проведены на
кафедре молекулярной биофизики СпбГУ.
Измерения электрофизических характеристик образцов производились на
кафедре
электроники
твердого
тела
в
лаборатории
физики
дефектов
в
полупроводниках (группа профессора О.Ф. Вывенко), совместно с инженером
Базловым Н.В.
Электронно-микроскопические
исследования
поверхности
образцов
были
проведены в Междисциплинарном Ресурсном Центре СПбГУ по направлению
«Нанотехнология» СПбГУ, а спектральные фотоэлектронные - по направлению
«Физические методы исследования поверхности».
89
ГЛАВА 3
90
3.1. Светоуправляемая фиксация ДНК на поверхность
кремния
Поверхности подложек, подготовленных для фиксации ДНК, представлены на
рис.
3.1.1.
Шероховатость
поверхности
можно
оценить
по
величине
RMS
(среднеквадратичного значения размера неровности Sq). Уровень поверхности µ
фиксируется как среднее значение высоты поверхности:
,
где
Для используемых образцов величина Sq составила 0.15-0.30 и 0.10-0.20 нм для
подложек из кремния и слюды
соответственно. Таким образом, неровность
поверхности кремния значительно ниже толщины ДНК в B-форме (2 нм) и чуть выше
неровности поверхности слюды.
(а)
(б)
Рис 3.1.1. АСМ изображения поверхности кремния после травления в HF (слева),
свежесколотой поверхности слюды (справа).
Фиксация молекул ДНК на подложке из кремния в присутствии ионов Mg ++ (рис.
3.1.2 б) идёт более эффективно, нежели при его отсутствии (рис. 3.1.2 а). Можно видеть,
91
что в отсутствии ионов магния молекулы ДНК вытягиваются на подложке, причем
наблюдается
формирование
разветвленных
структур.
Присутствие
магния
обеспечивает более плотную посадку макромолекул, при этом видно формирование
фрактальных
структур,
состоящих
из
разветвляющихся
«жгутов».
Последние
представляют собой несколько параллельно уложенных молекул, собранных вместе.
Рассмотренный результат свидетельствует о том, что магний не является необходимым
компонентом раствора для фиксации ДНК, но он провоцирует образование фибрилл
или «жгутов», по-видимому, в результате электростатического взаимодействия с
соседними молекулами ДНК. Без магния промывка образца в одном направлении
струе дистиллированной воды после выдержки капли раствора в течение 10 минут
приводит к ориентации макромолекул. В некоторых случаях также наблюдается
образование структур, содержащих несколько молекул ДНК. Вероятно, в этом случае
гидрофобная поверхность кремния [123] провоцирует собирание макромолекул вместе.
Эта же причина может проявляться и в присутствии магния, который дополнительно
обеспечивает
«скрепление»
макромолекул
с
помощью
электростатического
взаимодействия с фосфатными группами разных цепей.
(а)
(б)
Рис 3.1.2. АСМ изображения ДНК на поверхности кремния при концентрации
магния 0 (a) и 5·10-3 (б) M в растворе, из которого производилась фиксация полимера.
Если
предварительно
обработать
протравленную
поверхность
кремния
раствором MgCl2 (каплю 5·10-3 M раствора наносили на 10 минут, после чего ее сдували
92
потоком воздуха), можно также видеть последующую фиксацию ДНК из раствора без
магния с формированием «жгутов» (рис. 3.1.3 а). Отсюда можно сделать вывод, что
магний в первую очередь модифицирует поверхность кремния, так как после
промывания такой подложки водой перед иммобилизацией ДНК поверхность остается
практически свободной от макромолекул после процедуры фиксации (рис. 3.1.3 б) и
имеет такой же вид, как при фиксации ДНК из раствора без магния (рис. 3.1.2 а). Повидимому, магний не очень прочно (вероятно, электростатически) связывается с
подложкой и может быть смыт с неё потоком воды. Присутствие соляной кислоты в
растворе MgCl2, используемом для обработки поверхности кремния перед фиксацией
ДНК, препятствует закреплению макромолекул на подложке (рис. 3.1.3 в), что может
быть связано с конкуренцией между H+ и Mg2+ при связывании с поверхностью
кремния.
(а)
(б)
(в)
Рис 3.1.3. АСМ изображения ДНК, зафиксированных на модифицированной
магнием подложке кремния. Подложки (а) и (б) выдерживались 10 мин. в 5 mM MgCl 2 ,
а подложка (в) - в смеси 5 mM MgCl 2 и 10% HCl в течение 10 минут. Затем образцы (а) и
(в) высушивали направленной струей воздуха, а подложка (б) промыта водой. После
описанной обработки на подложки наносили раствор 2.5∙10 -3 % ДНК, не содержащий
ионов магния.
Надо отметить, что после выдержки в течение 30 минут иммобилизованных на
подложке кремния молекул в воде или 10% соляной кислоте и последующего
промывания водой в одном направлении макромолекулы не меняли свою ориентацию,
несмотря на то, что промывание было осуществлено в направлении отличном от
изначальной ориентации макромолекул на подложке. Отсюда можно сделать вывод,
что после фиксации ДНК достаточно прочно закреплена на подложке и не меняет свою
93
конформацию под действием гидродинамических сил, что согласуется с данными
работ [122, 126].
Описанный способ создания образцов с ориентированными на поверхности
кремния фибриллами может найти применение при конструировании электронных
устройств. Например, их можно использовать в качестве шаблонов для создания
нанопроволок или элементов биодатчиков.
На рис. 3.1.4 (а, б) приведен пример таких нанопроволок, приготовленных
совместно с Анастасией Пучковой путем восстановления ионов серебра. Металлизацию
предварительно зафиксированных в виде фибрилл ДНК на поверхности кремния nтипа проводили путем нанесения раствора AgNO 3 в концентрации 5 mМ. В течение 15
минут образец выдерживали в темноте и промывали водой. Затем образец
экспонировали в 4 mМ растворе гидрохинона в течение 15 минут, так же в темноте.
После чего образец промывали водой и высушивали. После проведения процесса
металлизации по алгоритму, описанному выше, наблюдалось образование по большей
части однородных кластеров серебра, равномерно расположенных на макромолекуле.
Анализируя АСМ-изображения можно заключить, что диаметр кластеров составляет
примерно 30 нм . Использованный в методе гидрохинон проявил себя как агент,
придающий структурам большую однородности, а не как восстановитель серебра.
Такой вывод можно сделать, так как фибриллы ДНК обрастали наночастицами
частицами серебра и до обработки гидрохиноном. Но в этом случае их размер был
гораздо больше. Исходя из этого механизм металлизации ДНК допустимо представить
следующим образом. Ионы серебра связываются в растворе c отрицательно
заряженными молекулами ДНК. Учитывая, что поверхность кремния n-типа, которая
использовалась для иммобилизации молекул ДНК, является полупроводником с
основными носителями заряда - электронами, то процесс восстановления серебра идет
за счет туннелирования электронов через биополимер из кремния. Таким образом,
восстановление серебра носит электрохимический характер.
94
(а)
(б)
(в)
(г)
Рис 3.1.4. АСМ (а) и СТМ (б) изображения металлизированных восстановлением
серебра фибрилл ДНК. СЭМ (в, риска 200 нм) и СИМ (г, риска 100 нм) изображение
поверхности кремния, обработанной ДНК, а затем раствором, содержащим серебряные
наночастицы.
Декорирование созданных на окисленной поверхности кремния n-типа ДНКфибрилл возможно провести при помощи уже готовых наночастиц серебра. Так,
образец сначала обрабатывали раствором ДНК, а затем наночастиц. Анализируя
изображения, полученных с помощью сканирующих электронного (рис. 3.1.4, в) и
гелиевого микроскопов (рис. 3.1.4, г), можно предположить, что наночастицы серебра
кубической формы, закрепились вдоль молекул ДНК . В то же время биополимер мог
95
быть лишь отправной точкой начала роста агрегатов наночастиц. В связи с тем, что на
окисленной поверхности кремния ДНК фиксируется преимущественно в виде сеток,
такой механизм также вполне вероятен.
Как правило, макромолекулы ДНК ориентированы в направлении промывания.
Из анализа АСМ снимков видно также, что отдельные нити полимера изгибаются по
направлению потока. Это даёт основание полагать, что именно поток воды растягивает
ДНК вдоль направления промывания.
На рис. 3.1.5 приведены результаты эксперимента по растягиванию ДНК на
слюде по описанной в разделе «Материалы и методы» методике: на свежесколотую
поверхность слюды наносили каплю раствора ДНК объемом ~ 5 мкл и через 3 минуты
накрывали сверху второй свежесколотой подложкой слюды (поверхности были
прижаты одна к другой). Затем подложки сдвигали друг относительно друга в одн ом
направлении, промывали 3 мкл дистиллированной воды в направлении параллельном
направляющей сдвига для удаления незафиксированных макромолекул, а затем
сушили в вакууме в течение 10 минут. Видно (рис. 3.1.5 б), что после первой процедуры
растягивания и фиксации часть макромолекул прочно связалась с подложкой и
сохранила свою первоначальную ориентацию после повторного растяжения.
(а)
(б)
Рис 3.1.5. АСМ изображения ДНК на слюде после растягивания второй подложкой в
одном направлении (а). Потом на образец наносился новый раствор и проводили
растяжение в перпендикулярном направлении (б).
96
Из рис 3.1.6а видно, что высота полимера на слюде колеблется в пределах от 0.3
до 1 нм. Для кремния оценка профиля высоты для ориентированных молекул ДНК
дает значения в пределах 0.7 и 1.5 нм, рис. 3.1.6б. Отметим, что на слюде невозможно за
счет промывания столь же эффективно, как на кремнии, растянуть ДНК. Таким
образом, логично предположить, что сила связывания макромолекулы со слюдой
больше, чем с кремнием.
(а)
(б)
Рис. 3.1.6. АСМ изображение ДНК, зафиксированной на слюде (а) и кремнии (б).
Обратимся к рассмотрению влияния освещения образцов на процесс фиксации
ДНК. Если при ее иммобилизации на поверхности кремния из раствора, содержащего
MgCl2, производить облучения светом с длиной волны 890 нм, макромолекулы
фиксируются на подложке в виде «молекулярной сетки» (рис. 3.1.7 а), тогда как без
97
освещения молекулы собираются в жгуты. Оценивая высотные профили, можно
сказать, что под действием облучения образуются структуры, высота которых не
превышает 4 нм, в то время как при фиксации без облучения светом их высота
достигает 10 нм. Длина «жгутов» при фиксации без дополнительного освещения
составляет не менее 20 мкм (рис. 3.1.8), а при освещении трудно выделить отдельные
молекулы.
(б)
(а)
Рис. 3.1.7. АСМ снимки молекул ДНК, зафиксированных на поверхности кремния nтипа под действием облучения (а, верхнее изображение) и при обычных условиях (б,
верхнее изображение). Внизу представлены соответствующие высотные профили.
98
Рис. 3.1.8. СЭМ снимок зафиксированных на поверхности кремния молекул ДНК.
Рассмотренные
выше
результаты
относятся
к
Н-терминированным
поверхностям кремния. При иммобилизации на подложку из кремния после
травления, обеспечивающего покрытие поверхности слоем окисла, ДНК фиксируется в
несколько ином виде (рис 3.1.9 в). Такая фиксация близка к результату, наблюдаемому
при фиксации ДНК на слюду по традиционной методике при использовании той же
концентрации магния, что и для кремния (рис. 3.1.9 б). Заметим, что окисленная
поверхность кремния является гидрофильной (в отличие от гидрофобной Нтерминированной поверхности), что делает возможным создание пленки из ДНК
путем высушивания нанесенной капли раствора (рис 3.1.9 г).
99
(а)
(б)
(г)
(в)
Рис 3.1.9. АСМ (а-в) и СЭМ (г) изображения ДНК на слюде при концентрации
магния 5·10-4 М (а), 5·10-3 М (б) и слое окисла (в-г) при концентрации магния 5·10-4 М (в)
и 0 (г). При промывании (а-в) и высушивании с последующим нанесением золотого
контакта (г, контакт - светлая область слева).
Можно предположить, что реализуется следующая модель связывания. После
травления в плавиковой кислоте и нанесения раствора ДНК H-терминированная
поверхность кремния начинает быстро окисляться [28], в результате чего на ней
образуются силанольные группы (Si-OH) [29, 30]. Гидратированный ионы магния
электростатически связываются с ДНК [42] по фосфатным группам и с силанольными
группами на поверхности подложки [33, 41], образуя, таким образом, мостики для
закрепления биополимера. Связывание слабое, и при промывании молекулы ДНК под
действием гидродинамических сил вытягиваются в направлении промывания, подобно
[43].
100
Так как поверхность кремния окисляется медленно [28, 46] и за время
эксперимента плотность групп, содержащих кислород, не успевает достичь своего
максимального значения, свойственного оксиду кремния [29], она продолжает
проявлять гидрофобные свойства. В таких условиях гидрофильным макромолекулам
ДНК более выгодно взаимодействовать между собой, нежели с гидрофобной
подложкой [123] (если учитывать, что отрицательный заряд молекулы частично
скомпенсирован взаимодействием с Na + и Mg++). Это и может служить причиной
образования жгутов (рис 3.1.10).
Система стремиться к минимуму энергии. Следовательно,
поверхность капли сокращается, что приводит
к образованию жгутов из одиночных молекул ДНК.
ДНК
ДНК
Si
ДНК ДНК
Si
Рис. 3.1.10 Иллюстрация предполагаемого механизма образованию «жгутов».
Окисленная в смеси H2O2 и H2SO4 поверхность кремния содержит более высокую
концентрацию силанольных групп [29] и является гидрофильной [33], что приводит к
более высокой силе связывания с ней ДНК и не создаёт условий к образованию жгутов.
Облучение светом в процессе фиксации протравленных в HF (Н- терминированных)
образцов повышает скорость роста оксида [31, 32], что делает поверхность кремния
более гидрофильной. Вероятно, количество силанольных групп для таких образцов
соизмеримо с их концентрацией на необлученных, что и обеспечивает более слабое
связывание макромолекулы с подложкой. Так как поверхность гидрофильна, в этом
случае «жгуты» не образуются. – макромолекулам более выгодно взаимодействие с
подложкой, чем друг с другом.
101
3.2. Исследование электрофизических свойств интерфейса
ДНК-кремний
Поскольку используемый для фиксации молекул раствор имел сложный состав, то
для выявления электрических свойств поверхности после фиксацией ДНК, были
приготовлены дополнительные образцы, которые были созданы нанесением раствора
NaCl и MgCl2 с концентрациями 0.005М без биополимера. Они били использованы в
качестве
образцов
сравнения
для
выявления
влияния
иммобилизованных
макромолекул на электрические характеристики диода. Все дополнительные образцы
готовились
согласно
модифицированных
приготовлены
процедуре,
ДНК.
Кроме
шоттки-диоды,
описанной
того,
для
полученные
выше
для
сравнительного
при
напылении
шоттки-диодов,
анализа
были
золота
на
свежепротравленную в водном растворе плавиковой кислоты поверхность подложек.
Проведенные измерения показали, что при отсутствии молекул ДНК на
интерфейсе электрофизические характеристики дополнительных шоттки-диодов слабо
отличались друг от друга, независимо от условий экспозиции. В качестве образца для
сравнения (исходного образца) был выбран шоттки-диод, полученный при выдержке
на свету капли рабочего раствора без ДНК, который имел наименьший уровень шума.
102
3.2.1. Результаты измерений вольт-амперных характеристик
(ВАХ)
На рис. 3.2.1 представлены прямые ветви ВАХ образцов на подложках кремния
n-типа проводимости с молекулами ДНК на интерфейсе, полученных при экспозиции
капли раствора в темноте и на свету. Также показана ВАХ идеального контакта металл−9
полупроводник в соответствии с формулой (7) для тока насыщения I s = 3 ×10 A .
10-2
Dark DNA diode
Initial diode
Ideal diode
Light DNA diode
10-3
10-4
I, A
10-5
10-6
10-7
10-8
10-9
0
100
200
300
400
U, mV
Рис. 3.2.1 ВАХ шоттки-диодов Au-(n-Si) с молекулами ДНК на интерфейсе,
зафиксированными в темноте и на свету. Показаны также ВАХ исходного образца и
−9
идеального шоттки-диода для тока насыщения I s = 3 ×10 A .
Как следует из представленных результатов, присутствие молекул ДНК на
интерфейсе контакта Au-Si заметно изменяло вид ВАХ. Однако эти изменения имели
различный характер в зависимости от того, освещалась или нет капля раствора на
поверхности подложки при экспозиции. Выделить особенности экспериментальных
кривых, обусловленные молекулами, можно путем сравнения их с ВАХ исходного
диода, также показанной на рисунке. Как видно из графиков, для прямых напряжений
U > 3kT / e ВАХ исходного диода, построенная в полулогарифмическом масштабе,
представляла собой прямую, наклон которой заметно меньше, чем наклон прямой для
103
идеального диода. Толщина окисного слоя, определенная из измерений емкости
структур на высокой частоте, составляла δ i ≈ 1нм , характерная для двуокиси кремния
величина диэлектрической проницаемости окисного слоя
порядка 4.
Таким
образом, для
ε i составляет величину
модельного диода величина коэффициента
неидеальности n0 ≈ 1.03 .
Величины коэффициентов неидеальности исследуемых образцов, вычисленные
из измеренных ВАХ, приведены на рис. 3.2.2. Как следует из графиков, для исходного
образца в интервале напряжений (75 ÷ 200)мВ наблюдалось превышение предельного
значения
состояний
n0
на величину ∆n ≈ 0.2 , что соответствовало поверхностной плотности
N is ≈ Dss ∆U ≈
∆nε iε 0
∆Uсм
≈ 4 ×1010
eδ i
−2
.
1.6
Dark DNA diode
Light DNA diode
Initial diode
Model diode
n, a.u.
1.4
1.2
1.0
0.8
50
100
150
200
250
300
350
U, mV
Рис. 3.2.2. Вычисленные из ВАХ значения коэффициента неидеальности
исходного шоттки-диода и шоттки-диодов с молекулами ДНК на интерфейсе,
зафиксированными в темноте и на свету. Отмечена величина
n0 = 1.03
,
соответствующая предельному значению для шоттки-диода с интерфейсным окисным
слоем толщиной 1нм без поверхностных состояний.
Фиксация
молекул,
проведенная
при
освещении,
уменьшала
величину
104
коэффициента неидеальности до значений, близких к n0 , рис. 3.2.2. Как следует из
формулы (3), уменьшение n могло быть связано как с уменьшением величины Dss , так
и с ростом величины Dsm . Малая толщина отдельных молекул делает их туннельно
прозрачными для электронов из металла, что может привести к увеличению
относительной доли Dsm в суммарной плотности состояний. Максимальная величина
поверхностной плотности заряда, которую могли бы создать закрепленные молекулы, с
учетом размера ячейки сетки 100 нм и плотности заряда фосфатных групп одиночной
молекулы QDNA = 6·107 см-1 , составляет величину порядка N DNA = 1·1013 см-2, что
значительно превышает величину
N is
исходного диода и может обеспечить
уменьшение коэффициента неидеальности до значений, близких к n0 .
Для образца, полученного при фиксации молекул в темноте, коэффициент n
превышал соответствующую величину для исходного диода на ∆n ≈ 0.3 , рис. 3.2.2.
Представляя жгуты, в виде диэлектрических нитей
с толщиной, туннельно
непрозрачной для электронов из металла, можно предположить, что в этом случае
должны
появиться
состояния,
обменивающиеся
носителями
заряда
с
полупроводником. Увеличение суммарной плотности Dss в этом случае должно
приводить к возрастанию коэффициента n . Принимая толщину жгутов δ i ≈ 10нм и
величину диэлектрической проницаемости ε i ≈ 2 , характерную для диэлектриков,
усредненная
по
поверхности
контакта
плотность
состояний,
обусловленных
присутствием жгутов на интерфейсе, может быть оценена величиной N rs = 3·1010 см-2.
Тогда при среднем расстоянии между жгутами порядка 1 мкм на единицу длины жгута
должно приходиться порядка Qr = 3·106 см-1 электронных состояний, перезарядка
которых могла бы приводить к наблюдаемым изменениям ВАХ. Эта величина
составляет примерно одну двадцатую линейной плотности заряда QDNA фосфатных
групп отдельной молекулы ДНК. Поскольку жгуты содержат до 10 и более молекул, это
означает, что наблюдаемые изменения ВАХ могли обуславливаться изменением заряда
менее чем одной сотой части электронных состояний фосфатных групп закрепленных
на поверхности молекул.
105
3.2.2. Результаты измерений вольт-фарадных характеристики
(ВФХ)
На рис. 3.2.3. представлены зависимости величины обратного квадрата емкости
от напряжения смещения для исследуемых образцов в расчете на единицу площади
контакта. В указанных координатах график для исходного диода представлял собой
прямую, хорошо совпадающую с прямой для идеального шоттки-диода, которая
описывается формулой (8) при величине диффузионного напряжения диода
U d 0 = −0.52V .
Dark DNA diode
Initial diode
Light DNA diode
Ideal diode
C-2, (F/cm2)-2
2.0e+16
1.5e+16
Ut = - 0.22V
1.0e+16
5.0e+15
Ud0 = - 0.52V
0.0
-0.6
-0.4
-0.2
0.0
0.2
0.4
U, V
−2
Рис. 3.2.3. Графики зависимостей C (U ) в расчете на единицу площади
контакта, рассчитанные из измеренных вольт-фарадных характеристик образцов с
молекулами ДНК на интерфейсе, зафиксированными на свету и в темноте. Для
сравнения показаны графики исходного образца и идеального шоттки-диода.
U d 0 = −0.52V
доноров
- диффузионное напряжение идеального шоттки-диода при концентрации
N D = 6.7 ×1014 cm−3 , U t = −0.22V
- напряжение, соответствующее середине
«ступеньки» на кривой для образца с молекулами на интерфейсе, зафиксированными
в темноте.
106
График для образца с молекулами ДНК на интерфейсе, зафиксированными при
освещении, слабо отличался от прямой для исходного
диода: наблюдаемое
уменьшение емкости при обратных смещениях составляло порядка 2% от абсолютной
величины. Наиболее сильные отличия от ВФХ исходного диода отмечались для ВФХ
образца, полученного при фиксации ДНК в темноте. В этом случае наблюдалось
значительное увеличение угла наклона прямой, причем величина напряжения отсечки
на горизонтальной оси совпадала с диффузионным напряжением исходного диода
U d 0 ≅ −0.52V , рис. 3.2.3. Согласно [135] такое поведение ВФХ характерно для контактов
металл-полупроводник с электронными состояниями на интерфейсе, заселенность
которых частично или полностью управляется металлом, но скорость изменения
заряда которых оказывается меньше скорости изменения тестирующего переменного
напряжения. Тангенс угла наклона характеристики в этом случае должен превышать
(1 +
тангенс угла наклона прямой для идеального шоттки-диода в
eDsmδ i
)
ε iε 0
раз [135].
Принимая δ i ≈ 10нм , ε i ≈ 2 и учитывая интервал напряжений, в котором происходит
изменение заряда состояний,
(−0.15 ÷ −0.25)V , оценка величины поверхностной
плотности состояний, заряд которых приводит к уменьшению барьерной емкости
диода при обратных смещениях, будет составлять NrsC = 2·1010 см-2 - величина, близкая к
I
значению N rs , полученному из измерений на постоянном токе для прямых смещений.
Наблюдаемое уменьшение величины барьерной емкости шоттки-диодов могло
быть вызвано появлением на интерфейсе структуры дополнительного отрицательного
заряда,
обусловленного
молекулами
и
увеличивающего
величину
потенциала
поверхности полупроводника. Такой заряд не мог обеспечиваться захватом электронов
из полупроводника из-за существования отталкивающего электрического поля в ОПЗ
при обратных смещениях. Источником электронов мог быть металлический электрод.
Однако для изменения величины связанного на интерфейсе заряда необходимо
относительное смещение уровней Ферми металла и интерфейсных состояний при
изменении внешнего напряжения. Как известно [134], для шоттки-контактов с
диэлектрическим слоем такие смещения оказываются возможными благодаря
изменениям падения напряжения на слое изолятора: для полупроводника n-типа
возрастание напряжения обратного смещения приводит к уменьшению величины
107
потенциального барьера со стороны металла, в результате чего уровень Ферми металла
поднимается. При наличии электронных состояний в интерфейсном слое подъем
уровня Ферми металла будет способствовать их заполнению электронами. На рис.
3.2.4. представлена зонная диаграмма контакта Au-(n-Si) с интерфейсным слоем,
поясняющая механизм появления отрицательного заряда на интерфейсе при
изменении величины напряжения смещения.
Рис. 3.2.4. Зонные диаграммы контакта Au-(n-Si) с интерфейсным слоем. При
прямом смещении a) интерфейсные состояния располагаются выше уровня Ферми
металла Efm и пусты. При обратном смещении b) возрастает падение напряжения на
интерфейсе Ui, уменьшается высота барьера
ϕb , интерфейсные состояния оказываются
ниже уровня Ферми Efm и заполняются электронами. E c - дно зоны проводимости, Ev потолок валентной зоны,
E fs
- уровень Ферми полупроводника, Et
- уровень
интерфейсных состояний, ϕm - работа выхода металла, χ - сродство к электрону
полупроводника, δi
- толщина интерфейсного слоя, U d
- величина падения
напряжения на области пространственного заряда в полупроводнике, U - величина
внешнего напряжения смещения, e - заряд электрона.
108
Как отмечено выше, наиболее значительные изменения емкости наблюдались
для образца с молекулами ДНК, зафиксированными на поверхности полупроводника в
темноте. По-видимому, сравнительно большая толщина получающихся при этом
жгутов приводит к затруднению обмена носителями заряда между металлом и
электронными состояниями, расположенными во внутренних частях жгутов. В таком
случае частичное заполнение этих состояний носителями заряда будет управляться
уровнем Ферми полупроводника, о чем свидетельствуют повышенные значения
показателя неидеальности диода. Частично их заряд определится положением уровня
Ферми металла, о чем говорят уменьшенные значения барьерной емкости диода при
обратных смещениях. Судя по графику рис. 3.2.3, полное изменение заряда состояний
происходит в узком диапазоне напряжений смещения ∆U ≈ 0.1V , что при комнатной
температуре соответствует энергетическому интервалу порядка 4kT , характерному для
моноэнергетического распределения. Положение середины ступеньки на графике
емкости U t ≈ −0.22V в этом случае будет соответствовать ситуации, когда интерфейсный
уровень совпадает с уровнем Ферми металла. С учетом этих соображений его
положение
Et
на зонной диаграмме, рис. 3.2.4, может быть определено как
( Ec − Et ) ≈ eU d + ( E c − E fs ) + eU t
U t ≈ −0.22V
. Величина изгиба зон в ОПЗ при напряжении смещения
и глубина уровня Ферми в нейтральной области, вычисленные из
( Ec − E fs ) ≅ 0.2eV
измеренной ВФХ [133], составили U d ≅ 0.35V и
. Таким образом Et
лежит ниже дна зоны проводимости кремния на 0.77eV .
109
3.3. Фиксация ДНК при помощи серосодержащего производного
фенантролина
Рис. 3.3.1. Химическая структура исследуемого соединения (PhenSH) с учетом
возможной таутомерии. Азот обозначен синим, а сера — желтым цветом. В некоторых
экспериментах использовалось соединение, в котором сера заменена на метильную
группу (Neo).
110
3.3.1. Фиксация на золотую поверхность
Оценка динамики адсорбции PhenSH и ДНК на золотую поверхность
проводилась при помощи метода поверхностного плазмонного резонанса. На рис. 3.3.2
представлен сигнал, который использовался для дальнейшего определения изменения
угла, на котором наблюдается SPR (рис. 3.3.3).
Эксперимент, представленный на рис. 3.3.3, проводился с использованием 10 -6 M
PhenSH в 1 % DMSO следующим образом:
1. В течение 1 минуты чип промывался раствором PhenSH.
2. Затем 7 минут чип находился в растворе PhenSH без промывания.
3. С 7 по 8 минуту чип промывался раствором PhenSH.
4. С 8 по 15 минуту чип находился в растворе PhenSH без промывания.
5. С 15 по 42 минуту чип промывался раствором PhenSH.
6. С 42 по 44 минуту чип промывался 1 % DMSO.
Рис. 3.3.2. Зависимость интенсивности отраженного света от угла падения на
поверхность чипа в 1 % DMSO.
111
Рис. 3.3.3. Изменение угла, на котором наблюдается минимум интенсивности
отраженного света, от времени при обработке поверхности чипа 10 -4 M PhenSH в 1 %
DMSO в режиме «slope mode».
Анализируя данную зависимость, можно обозначить следующие важные
особенности:
•
Скорость изменения сигнала зависит от того, ведется промывание или нет. Это
говорит о том, что в данный процесс вовлечен механизм массообмена, при
котором PhenSH доставляется из объема раствора или приповерхностной
области к местам связывания.
•
Промывание 1 % DMSO не приводит к значительному изменению сигнала. Этот
факт указывает на то, что весь провзаимодействовавший PhenSH, вносящий
вклад в изменение сигнала, прочно связался с поверхностью.
Обратимся к следующему эксперименту, результаты которого представлены на
рис. 3.3.4. В данном случае разные чипы были промыты разными концентрациями
PhenSH со 2 по 3 минуты опыта. Далее промывка был остановлена, и чипы находились
в покоящихся растворах PhenSH до 23 минуты, после чего были промыты растворами
DMSO соответствующих концентраций.
112
.
Рис. 3.3.4. Изменение угла, на котором наблюдается минимум интенсивности
отраженного света от времени экспозиции чипов в растворах PhenSH различных
концентраций в режиме «slope mode». В канале с концентрацией 10 -5 M PhenSH
произошел приборный сбой при промывании 0.1 % DMSO на 22 минуте, поэтому эти
данные не представлены.
Во-первых, отметим, что скорость изменения сигнала после 6 минуты для
концентраций PhenSH 10-4, 10-5 и 10-6 M перестала меняться и сравнялась. Это говорит о
том, что скорость сорбции PhenSH на поверхность практически не зависит от его
объемной концентрации. Для концентрации PhenSH 10 -3 M скорость изменения
сигнала
превышает скорости изменения сигнала для предыдущих концентраций.
Можно предположить, что для таких высоких концентраций начинает действовать
дополнительный механизм сорбции молекул PhenSH.
Во-вторых, для концентрации 10-6 M PhenSH после промывания раствором 0.01
% DMSO сигнал не изменился. А для концентраций 10 -3 и 10-4 M PhenSH незначительно
упал. Таким образом, в этих условиях практически все молекулы прочно связаны с
поверхностью.
Чтобы оценить роль DMSO, обратимся к измерениям, представленным на рис.
3.3.5.
113
Рис.3.3.5. Изменение угла, на котором наблюдается максимум плазмонного
резонанса, от времени экспозиции чипа в растворах 5·10-5 M Phen-SH в 5 % DMSO (1),
5·10-6 M Phen-SH в 0.5 % DMSO (2), 5·10-7 M Phen-SH в 0.05 % DMSO (3), 5 % DMSO (4),
Вода (5) в режиме «multiple mode».
В данном опыте чипы выдерживались в покоящихся растворах PhenSH
различных концентраций порядка 60 минут. Затем промывались водой. Потом снова
выдерживались в покоящихся растворах PhenSH и промывались водой. Из данной
зависимости видно, что при добавлении DMSO (обозначено на графике цифрой 4)
сигнал скачкообразно меняется, а при промывании водой так же скачкообразно
возвращается на изначальный уровень, что говорит о том, что DMSO непрочно связан с
поверхностью. Этот эффект известен, и он объясняется тем, что показатели
преломления DMSO и воды различаются. Также можно заметить, что для
концентрации PhenSH
5·10 -5 M (1) на 40 минуте сигнал перестает меняться, т. е.
достигается максимум концентрации адсорбированных на поверхности молекул. При
повторной экспозиции в растворе PhenSH после промывания водой по сравнению с
первичной экспозицией отсутствует плавное насыщение, что может быть связано с тем,
что все позиции связывания для молекул PhenSH уже заняты. При более низких
114
концентрациях изменение сигнала имеет место до и после промывания, что говорит о
том, что на поверхности еще есть свободные для связывания PhenSH позиции.
Было проведено сравнение действия двух соединений фенантролина -PhenSH и
Neo. Так как они различаются всего лишь одной группой, то данный опыт может
пролить свет на ее роль.
Рис. 3.3.6. Изменение угла, на котором наблюдается максимум плазмонного
резонанса, от времени экспозиции чипа в растворах PhenSH в 5 % DMSO и Neo в воде
равной концентрации 10-5 M в режиме «slope mode»
В один канал (на рис. 3.3.6 обозначен цифрой 2) сначала заводился раствор PhenSH,
затем канал промывался водой, потом в него заводился раствор Neo той же
концентрации, что и PhenSH. В другой канал (на рис. 3.3.6 обозначен цифрой 1)
сначала заводился раствор Neo, затем канал промывался водой, потом в него заводился
раствор PhenSH той же концентрации. При экспозиции поверхности в растворе Neo
практически на наблюдалось роста сигнала со временем после первоначального
скачка. После промывания водой сигнал падал практически до начального значения.
Для раствора PhenSH, напротив, наблюдался выход рассматриваемой зависимости на
линейный рост, при этом наблюдался
значительный остаточный уровень сигнала
115
после промывания водой. Таким образом, можно говорить, что Neo не связывается
прочно с поверхностью и легко смывается водой. Это указывает на тот факт, что SHгруппа в PhenSH отвечает за прочное связывание этого соединения с поверхностью.
Также важно отметить, что при экспозициии модифицированного PhenSH чипа в
растворе Neo (рис. 3.3.6 (1), 36 минута) уровень сигнала выходит
практически на
уровень до смывания PhenSH. Это говорит о том, что Neo и PhenSH накапливаются
около поверхности в схожих концентрациях, что вносит вклад в изменение сигнала
SPR.
Чтобы уточнить механизм
адсорбции молекул
PhenSH, был поставлен
дополнительный эксперимент, результаты которого представлены на рис. 3.3.7. Все
растворы содержали 1 % DMSO и различные концентрации PhenSH. Ход эксперимента:
•
Со 2 по 12 минуты чип промывался 10-6 M PhenSH.
•
На 12 минуте промывание останавливалось.
•
С 15 по 17 минуты чип промывался 1 % DMSO.
•
На 17 минуте промывание останавливалось.
•
Далее аналогичные действия последовательно проводились с концентарциями
PhenSH равными 2·10-6, 5·10-6, 1·10-5, 5·10-5 и 1·10-4 M.
116
Рис. 3.3.7. Изменение угла, на котором наблюдается максимум плазмонного
резонанса, от времени экспозиции чипа в растворах PhenSH различной концентрации
в режиме «slope mode».
Заметим, что изменения сигнала после остановки промывания растворами
PhenSH или чистым DMSO являются приборной особенностью и не зависят от
концентраций. Сигналы в покоящемся и прокачиваемом растворе всегда отличаются
на величину 2-4 миллиградуса.
По данному графику было определено изменение сигнала, связанное с общей
адсорбцией PhenSH различной концентрации (величина ∆Θ до промывания DMSO для
каждой концентрации, на рис. 3.3.8 обозначено цифрой 2) и изменение сигнала,
связанное с прочно связавшимися молекулами PhenSH (величина ∆Θ после
промывания DMSO для каждой концентрации, на рис. 3.3.8 обозначено цифрой 1). На
рис. 3.3.8 оставлены только промежутки времени, когда чип промывался растворами
PhenSH. Время составило примерно по 10 минут на каждую концентрацию.
117
Рис. 3.3.8. Изменение угла, на котором наблюдается максимум плазмонного
резонанса, от времени экспозиции чипа в растворах PhenSH различной концентрации.
Анализируя данный график, можно сказать, что скорость роста прочно
связанных молекул PhenSH (2) не зависит от концентрации PhenSH в растворе,
которым промывался чип, если откинуть изменение при первой и последней
промывке, которое несколько больше, чем при остальных. Также практически не
зависит от
концентрации
количество непрочно связанных молекул, которые
смываются при промывке DMSO (разность 2 и 1). Это проиллюстрировано на рис. 3.3.9,
где сигнал скорректирован по формуле ∆Θi = ∆Θисходный — ki·(Time-1). Коэффициент ki
рассчитан из предположения линейного роста количества прочно связанных молекул
при промывке с использованием
соединяющих точки на рис. 3.3.8 (1).
концентрации c i как угол наклона отрезков,
118
Рис. 3.3.9. Изменение угла ∆Θ = ∆Θисходный — k·(Time-1), на котором наблюдается
максимум плазмонного резонанса, от времени экспозиции чипа в растворах PhenSH
различной концентрации.
Как видно из графика 3.3.9, все зависимости имеют схожую форму и достигают
значений 60-70 миллиградусов, а на 8 минуте рост прекращается. Это говорит о том,
что к этому времени все места обратимого связывания заняты. Исключение составляют
кривые для концентраций PhenSH 1·10 -6 и 1·10-4 M. Можно предположить, что рост
прочно связанных молекул не был линеен в этих случаях, т. е. связывание шло вначале
этих циклов промывки несколько более эффективно, а затем замедлилось. В целом
схожесть формы кривых и отсутствие принципиальных отличий до 6 минуты для всех
кривых (кроме первой) говорит о том, что имеет место процесс физической адсорбции,
который отвечает за обратимое связывания phenSH с поверхностью и вызывает
изменение сигнала, представленное на рис. 3.3.9. Этот процесс существенно не зависит
от концентрации, что можно объяснить тем, что количество мест связывания у
поверхности ограничено, и данные места полностью заполняются при любой
концентрации. Отсутствие зависимости скорости роста сигнала от концентрации
соединения может быть связано с механизмом транспорта phenSH из объема раствора
к поверхности.
119
Более интенсивный рост сигнала при первой промывке наводит на мысль, что
изначально имеет место более быстрый процесс, которым может быть образование
монослоя PhenSH. Дальнейшая скорость роста сигнала в среднем в 2 раза ниже и
составляет около 30 миллиградусов за 10 минут, что может означать образование
новых слоев или «островков» поверх первого.
На основании этих и предыдущих данных можно предположить следующий
механизм связывания:
1. Молекулы доставляются к поверхности из раствора при помощи массообмена.
2. На поверхности существует ограниченное количество мест связывания, которые
практически полностью заполняются.
3. Из приповерхностного слоя раствора молекулы соединения продолжают
мигрировать к местам связывания, сначала образуя монослой, а затем и
последующие слои.
4. Так как количество молекул около поверхности постоянно, то скорость роста
количества прочно связанных молекул тоже постоянна, что согласуется с
экспериментом.
В целях проверки данного предположения было проведено компьютерное
моделирование процесса адсорбции молекул PhenSH на поверхность в соответствии с
моделью, предложенной выше. Использовались следующие обозначения и константы:
•
k(+n) — константа скорости ассоциации в реакции n.
•
k(-n) — константа скорости диссоциация в реакции n.
•
PhenSH — молярная концентрация соединения, доступная в приповерхностном
слое. Так как концентрационной зависимости выявлено не было, то была
выбрана концентрация соединения, равная 10 -6 M.
•
Surface — количество мест для реализации обратимого связывания соединения с
поверхностью. Выбрана с учетом примерной оценки размера молекулы
соединения
(10 на 5 ангстрем), т. е. 5·10 -15 см2. Это делает потенциально
возможным
при
ориентации
плоскости
молекулы
вдоль
поверхности
разместить порядка 5·1014 молекул на 1 см2 поверхности. Так как площадь
поверхности чипа составляет около 8·10 -2 см2, то в сумме на ее поверхности
существует около 4·10 13 мест. Если учесть неровность поверхность чипа, т. е.
120
увеличение эффективной поверхности, то можно дать верхнюю оценку в 10 14
мест связывания, что составляет около 10-10 моль.
•
PhenSH_surface — молярная концентрация соединения, доставленная к
поверхности. Задается соотношением:
•
PhenSH + Surface <-> PhenSH_Surface;
•
•
k(+1) = 2e2, k(-1) = 3e-2;
GoldSites — кол-во мест на поверхности, с которыми соединение может вступать
в необратимые реакции. Выбрана равной 3e-13 и составляет меньшую величину,
чем Surface, так как в силу геометрических причин не вся поверхность может
быть доступна для взаимодействия.
•
PhenSH_bound
—
кол-во
прочно
связанных
с
поверхностью
молекул,
определяется соотношением:
PhenSH_Surface+GoldSites <-> PhenSH_ bound+Surface+PhenSites;
k(+2) = 1e11,k(-2) = 0;
•
PhenSites — кол-во мест на поверхности, с которыми соединение может вступать
в необратимые реакции (для необратимо связавшейся с GoldSites молекулой
PhenSH). То есть места посадки для следующего слоя на предыдущем. Динамика
связывания определяется соотношением:
PhenSH_Surface+PhenSites <-> PhenSH_ bound+Surface+PhenSites;
k(+3) = 1.8e9, k(-3) = 0;
При моделировании отклика предполагалось, что сигнал от прочно и не прочно
связанных молекул одинаков, как это уже было сказано ранее. Результат представлен
на рис. 3.3.10.
121
Рис. 3.3.10. Результат компьютерного моделирования процесса адсорбциия PhenSH
на поверхность золота.
Как видно из графика, данная модель адсорбции лишь в общих чертах
характеризует реальный процесс. Прежде всего, это связано с тем, что, конечно, рост
количества прочно связанных молекул не описывается в полной мере предложенной
простой моделью реакции псевдо-первого порядка. Также имеет место погрешность
измерений, связанная с нестабильностью скорости прокачки растворов (порядка 20%).
Обратимся к данным, полученным методом рентгеновской фотоэлектронной
спектроскопии. Выдержанный в течение 60 минут в растворе 10 -5 M PhenSH в 1 %
DMSO чип был промыт водой и высушен, после чего были проведены измерения.
Проанализируем спектр углерода, рис. 3.3.11 и рис. 3.3.12.
122
Рис. 3.3.11. XPS спектр углерода (1s).
Рис. 3.3.12. Обработанный XPS спектр углерода (1s), накопленный за 31 мин. 42 сек.,
приведенный к нулю интенсивности путем вычитания базовой лини; разложенные на
спектральные составляющие формы Гауссиана.
Как видно из рис. 3.3.12, спектр раскладывается на 4 составляющие,
123
интенсивности которых соотносятся как 19.7 : 6.0 : 1.2 : 1 (285.0 eV : 285.8 eV : 288.2 eV :
289.3 eV). Отметим, что углерод в соединении PhenSH находится в следующих четырех
окружениях: 6 атомов связаны с 2 углеродами, 2 атома с 3 углеродами, 2 атома с 2
углеродами и 1 азотом, 2 атома с 1 углеродом 1 азотом и 1 серой (при этом может иметь
место таутомерия С-S и C=S, рис. 3.3.1). При этом надо учитывать, что существует
ограничение разрешающей способности прибора, которые не позволяют полностью
различить все спектральные линии. Углерод в составе DMSO мы не рассматриваем, так
как по данный ППР он практически не связывается с поверхностью, а также потому,
что на образцах не наблюдается характерных спектральных линий [136, 140] на 165.5
eV S2p и 530.8 eV O1s. Пик 285 eV соотносится с углеродом в окружении углерода и
водорода [137-141], т. е. С-H, C=C, C-C=C. Следующие полосы отражают наличие
углерода в окружении электроотрицательных
атомов азота, серы и кислорода
[139,141,142]. Так, пик 285.75 eV можно соотнести с углеродом в окружении углерода и
азота (С=С-N) [143,144,147], а 288.2 eV - с S=C-N [147]. Следующий пик 289.3 eV
отражает наличие COx, в частности O-C=O и -СO3, [140, 145, 146, 148], так как такой
большой химический сдвиг как +4.3 eV не характерен для C=С-N или N-С=S.
Перейдем к рассмотрению спектра кислорода, рис. 3.3.13.
Рис. 3.3.13. Обработанный XPS спектр кислорода (1s), накопленный за 33 мин. 24
сек., приведенный к нулю интенсивности путем вычитания базовой лини;
разложенные на спектральные составляющие формы Гауссиана.
124
Как видно из рис. 3.3.13, спектр раскладывается в области 532 eV на 2
составляющие, интенсивности которых соотносятся как 4.6 : 1 (531.9 eV : 533.5 eV ). Это
коррелирует с полосой углерода 289.3 eV. Это может быть O-C, O=C , а также H 2O [148,
149] или S-O [141]. Больший интерес представляет спектр азота, рис. 3.3.14.
Рис. 3.3.14. Обработанный XPS спектр азота (1s), накопленный за 105 минут,
приведенный к нулю интенсивности путем вычитания базовой лини; разложенные на
спектральные составляющие формы Лоренциана.
Как видно из рис. 3.3.14. Спектр раскладывается на 2 составляющие,
интенсивности которых соотносятся как 0.44 : 1 (398.9 eV : 399.9 eV ). Это указывает на
то, что азот находится в двух состояниях, подтверждая возможную таутомерию N-C=S и
N=C-S [143,144,147]. Надо отметить, что разделение спектральных линий может
свидетельствовать о наличии взаимодействия азота с водой [149] или подложкой [141].
Наиболее ценной информацией является наличие серы на подложке, которая не может
попасть из воздуха или воды и есть только в составе PhenSH, рис. 3.3.15.
125
Рис. 3.3.15. Обработанный XPS спектр серы (2p), накопленный за 30 мин. 4 сек.,
приведенный к нулю интенсивности путем вычитания базовой лини; разложенные на
спектральные составляющие формы Лоренциана.
Спектр серы разделяется приблизительно на пять спектральных линий. Пик
161.1 eV можно соотнести с атомарной серой [141, 151], а 161.9 eV - с образованием связи
S-Au [141,149-151]. Следующий пик 163.2 eV относится к свободной -SH/=S группе [139151], таким образом допуская наличие на поверхности несвязанных с ней через серу
молекул PhenSH или связанных лишь по одной из двух групп, содержащих серу.
Следующие 2 пика 168.1 eV и 169.0 eV отражают наличие серы в окружении кислорода
[141, 151]. Ранее было показано, что часть -SH групп может окисляться [152, 153].
Рассмотрим химический состав слоев на поверхности, рис. 3.3.16. Первое, что
стоит отметить — наличие азота, серы и кислорода на исходной поверхности золота.
Скорее всего, это адсорбированные из воздуха загрязнения. Так, после выдерживания
исходной поверхности в 1 % растворе DMSO мы видим падение количества углерода на
14 %, что связано с тем, что DMSO - хороший растворитель и, возможно, растворяет
часть органики на поверхности. Это объясняет рост пика золота. В том числе при
обработке поверхности Neo концентрацией, в 10 раз превышающей используемую
концентрацию PhenSH. При наличии в растворе DMSO рост адсорбированного азота
126
составил 20 % против 53 % в отсутствии DMSO. Это говорит о том, что DMSO несколько
препятствует фиксации Neo на поверхности. В то же время, для всех образцов
наблюдается рост количества кислорода после обработки. Так, после 30 минут
обработки количество кислорода выросло с 10.7 до 12.9 % независимо от наличия
DMSO, Neo или PhenSH. Таким образом, можно предположить, что это, главным
образом, адсорбированные молекулы воды или O 2, нежели кислород в составе DMSO.
Количество азота на поверхности значительно возрастает при обработке PhenSH: на
107, 149 и 228 процентов за 10, 20 и 30 минут экспозиции золота в растворе соединения
соответственно. Таким образом, можно утверждать, что этот адсорбированный азот
находится именно в составе PhenSH.
1 % DMSO
Исходн
30
ое золото
мин. В
30
30 мин.
мин.
в
10-5 M
10-5 M
Neo
C1s
60,76
56,94
0.01 % DMSO
20
30
мин.
мин.
мин.
в 10-6
в 10-6
в 10-6
M
M
M
PhenSH
PhenSH
PhenSH
63,38
60,03
56,93
57,69
20,92
23,74
24,56
21,57
12,85
11,28
12,56
12,9
Neo
52,4
10
8
Au4f
26,14
26,42
33,2
2
O1s
10,71
N1s
2,39
Рис. 3.3.16.
12,98
12
3,66
2,3
2,86
4,95
5,95
7,84
Химический состав в процентном соотношении на поверхности
золотого чипа в зависимости от использованной обработки.
Сравнивая спектр азота на рис. 3.3.14 (поверхность обработана 60 минут в 10 -5 M
PhenSH) и рис. 3.3.17 (поверхность обработана 30 минут в 10 -6 M PhenSH), можно
отметить, что на первом рисунке спектр имеет два пика на 398.9 eV и 399.9 eV, а на
втором рисунке спектр имеет один пик на 399.9 eV. Допустимо предположить, что пик
на 398.9 eV является следствием образования поверх первичного слоя с пиком на
399.9 eV последующих слоев, в которых преобладает таутомер N-C=S, тогда как в
первом слое соединение находится в форме N=C-S-Au и сильнее взаимодействует с
поверхностью. Также появление второго пика может быть связано с более плотной
упаковкой
PhenSH
на
поверхности
со
временем,
включающей
стэкинговое
127
взаимодействие молекул соединения.
Рис. 3.3.17. Обработанный XPS спектр азота (1s), накопленный за 60 минут, на
подложке, обработанной 10-6 M PhenSH в течение 30 минут, приведенный к нулю
интенсивности путем вычитания базовой лини; разложенные на спектральные
составляющие формы Лоренциана.
Таким образом, мы видим сложную картину образования слоев PhenSH на
поверхности чипа, при которой азот и сера находятся в нескольких состояниях. Так,
сера присутствует как в связанном с золотой поверхностью состоянии N-S-Au, так и в
окисленном N-SOx или N=S. Спектр азота с ростом слоя раздваивается, как это было
сказано выше. Мы можем предположить рост структур, где первый слой образуется за
счет образования S-Au связи. При этом, исходя из литературных данных [73, 76, 77],
можно предполагать ортогональную ориентацию плоскости соединения относительно
поверхности, при этом связь С-S-Au может иметь разный угол [156, 157], рис. 3.3.18.
Далее за счет взаимодействия азотов с серой, в том числе в окисленном состоянии,
путем образования водородных связей, на данный слой адсорбируются последующие
молекулы. Возможно, в процесс формирования слоев вовлечены молекулы воды.
128
Рис. 3.3.18. Качественная модель связывания PhenSH с золотой поверхностью (111).
Рассмотрим данные по иммобилизации ДНК на поверхности чипа из 5 mM NaCl
раствора. Чтобы охарактеризовать реакцию чипа на раствор NaCl, был проделан
дополнительный эксперимент, представленный на рис. 3.3.19. Все три канала
исходного чипа обрабатывались абсолютно одинаково, путем заведения в них сначала
возрастающих концентраций NaCl, а затем убывающих.
Рис. 3.3.19. Зависимость угла, на котором наблюдается максимум плазмонного
резонанса, от времени экспозиции чипа в растворах NaCl различной молярной
концентрации, обозначенной на графике цифрами. Измерения проводились в
«multiple mode».
129
На рис. 3.3.20 представлены результаты изучения влияния концентрации NaCl
на SPR. Видно, что в каждом из трех каналов сигнал прямо пропорционален
содержанию NaCl в растворах. Коэффициент пропорциональности составляет 450 +/10 [миллиградус/M]. При этом отсутствует гистерезис. Это означает, что можно
ожидать обратимого изменения сигнала по сравнению с водой при заведении в канал 5
mM NaCl на величину порядка 450*0,005 = 2,25 миллиградуса, что, в свою очередь,
меньше погрешности измерений. Таким образом, влиянием NaCl можно пренебречь.
Аналогичные измерения были проделаны для MgCl 2, рис. 3.3.21 Коэффициент
зависимости сигнала составил 1120+/-20 [миллиградус/M].
Рис. 3.3.20. Зависимость угла, на котором наблюдается максимум плазмонного
резонанса, от концентрации NaCl при прямом и обратом проходе.
Рис. 3.3.21. Зависимость угла, на котором наблюдается максимум плазмонного
резонанса, от концентрации MgCl2 при прямом и обратом проходе.
130
Сравним эти данным с зависимостью показателя преломления растворов MgCl 2 и
NaCl от их молярной концентрации, рис. 3.3.22. Коэффициент наклона прямых
составляет 0,01045 и 0,02544 M-1 для NaCl и MgCl2 соответственно. А их отношение
составляет 0,4108, в то время как отношение коэффициентов зависимости сигнала
ППР от концентрации данных солей равно 0,4017+/-0,016. Таким образом, можно
говорить о том, что с учетом погрешности существует прямая зависимость между
показателем преломления раствора и сигналом ППР, изменение которого можно
рассчитать по формуле ΔΘППР = 28.5·Δn(C).
Рис. 3.3.22. Зависимость показателя преломления на длине волны 589 нм при 20° C
от концентрации растворов солей. Для сравнения измерения ППР проводились на
длине волны 650 нм. [158]
На рис. 3.3.23 представлены данные по модификации золотой поверхности чипа
раствором ДНК: 2, 4 и 6 каналы были обработаны 10 -5 M раствором PhenSH. Каждый
канал проверялся на реакцию на 5 mM NaCl, а также все каналы, кроме 6, на реакцию
на 1 mM MgCl2. Значительного изменения сигнала относительно начального после
промывки водой не наблюдалось. Сравним изменения на 55 минуте в каналах при
заведении растворов ДНК в 5 mM NaCl, содержащих MgCl 2 (4 канал) и без него (1, 2 и 6
каналы). Абсолютные значения сигналов сравнивать некорректно, так как отклик
каналов уникален, что видно по реакции на одинаковую концентрацию PhenSH. При
131
этом динамика представляет более ценную информацию.
Рис.
3.3.23. Изменение угла, на котором наблюдается ППР, при последовательном заводе в
каналы следующих растворов: 1 канал (вода, 5 mM NaCl, вода, 1 mM MgCl 2, вода, 10-3 %
ДНК, вода), 2 канал (вода, 10-5 M PhenSH, вода, NaCl, вода, 1 mM MgCl 2, вода, 10-3 %
ДНК, вода), 4 канал (вода, 10-5 M PhenSH, вода, NaCl, вода, 1 mM MgCl2, вода, 10-3 % ДНК
в 1 mM MgCl2, вода) и 6 канал (вода, 10-5 M PhenSH, вода, NaCl, вода, 10-3 % ДНК, вода).
Таким образом, можно говорить, что предварительная обработка PhenSH вносит
значительный вклад в отклик канала при заведении в
н
его ДНК. Канал 1, не
обработанный PhenSH, претерпевает резкий скачок, что говорит о том, что его отклик в
первую очередь связан с разницей в показателе преломления раствора ДНК и воды, а
также с потенциальной физадсорбцией биомолекул на поверхность чипа. Каналы 2, 4 и
6 имеет более выраженный отклик, что указывает на более значительное количество
макромолекул ДНК, находящихся на поверхности чипа. При этом наблюдается рост
сигнала в течение 3 первых минут. Это говорит о том, что на модифицированной
PhenSH поверхности протекают реакции иного рода, нежели на исходной золотой
поверхности. Отметим, что наличие MgCl2 в растворе ДНК (канал 4), или
132
предварительная обработка этим соединением поверхности (1 и 2 каналы),
сказываются значительно на отклике каналов.
не
Это может свидетельствовать об
отсутствии механизмов иммобилизации, характерных для поверхности слюды, в
котором ионы магния играют роль мостиков между отрицательно заряженными
поверхностью и макромолекулой. Обратимся к 67 минуте эксперимента, где было
проведено промывание всех каналов водой. Как видно из графика, сигнал в 1 канале
возвращается к исходному значению, в то время как сигнал в остальных канал лишь
незначительно
снижается.
Таким
образом,
макромолекулы
ДНК
необратимо
связываются с поверхностью, модифицированной PhenSH, а с исходной поверхности
смываются водой.
На рис. 3.3.24 и 3.3.25 представлены АСМ-изображения золотой поверхности
чипа после иммобилизации на них ДНК без и с использованием предварительной
модификации поверхности соединением PhenSH. Как видно по высотным профилям,
поверхность чипа не является в достаточной мере ровной и имеет перепады
микрорельефа в несколько нанометров. Это делает невозможным дать оценку
результата фиксации макромолекул ДНК, так как микронеровности превышают
толщину полимера, которая составляет 2 нм, а при иммобилизации может падать до 1
нм в результате взаимодействия с поверхностью и иголкой микроскопа.
Рис. 3.3.24. АСМ-изображение золотой поверхности чипа, использовавшегося в
экспериментах SPR, после экспозиции в растворе 10-4 PhenSH в течение 72 часов, затем
в растворе 10-3 % ДНК в течение 10 минут (справа) и его высотный профиль (слева),
соответствующий линии на изображении справа.
133
Рис. 3.3.25. АСМ-изображение золотой поверхности чипа, использовавшегося в
экспериментах SPR, после экспозиции в растворе 10-3 % ДНК (справа) в течение 10
минут и его высотный профиль (слева), соответствующий линии на изображении
справа.
134
3.3.2. Фиксация на поверхность слюды
Свежесколотую слюду выдерживали в
течение 60 минут в растворе 10 -5 M
PhenSH в 1 % DMSO, затем промывали водой, сушили, после чего проводили
измерения методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии. Мусковит имеет
химическую формулу KAl2(AlSi3O10)(F,OH)2, в связи с чем доступны для анализа только
линии азота и углерода, так как малое количество PhenSH на поверхности
неразличимо от элементов в составе слюды. Также невозможно различить спектр S2p
вследствие особенности поверхности. Обратимся к спектрам углерода, рис 3.3.26.
Рис. 3.3.26. Обработанный XPS спектр углерода (1s), накопленный за 43 мин. 34
сек., приведенный к нулю интенсивности путем вычитания базовой лини;
разложенные на спектральные составляющие формы Гауссиана.
Как видно из рис. 3.3.26, спектр раскладывается на 3 составляющие,
интенсивности которых соотносятся как 11.3 : 5.3 : 1 (284.4 eV : 285.7 eV : 288.7 eV). В
целом при сопоставимых условиях эксперимента интенсивность основного пика в 24
раза меньше, чем аналогичный пик C1s на золотой поверхности. Можно соотнести
135
первый пик 284.4 eV с углеродом, сопряженным с кремнием, который есть в составе
слюды [154]. Таким образом, в отличие от взаимодействия с золотой поверхностью, где
мы не нашли отклонений стандартного пика углерода ~285 eV, на слюде большая его
часть взаимодействует с подложкой, предположительно по Si. Широкую полосу 285.7
eV допустимо соотнести с группами C-С=N, N-C=S. Интересно, что интенсивности
первых двух пиков относятся как 10 к 2, что сопоставимо с отношением суммы групп
С-С, С=С и С-N к S=С-N в PhenSH. Последнюю полосу 288.65 eV, отличающуюся от
первой на +4.3 eV, как и в случае золотой поверхности, соотнесем с окисленной формой
углерода. Далее рассмотрим спектр азота, рис. 3.3.27.
Рис. 3.3.27. Обработанный XPS спектр азота (1s), накопленный за 105 минут,
приведенный к нулю интенсивности путем вычитания базовых лини и Гауссиана;
разложенные на спектральные составляющие формы Гауссиана.
Спектр раскладывается на 2 составляющие, интенсивности которых соотносятся
как 2.5 : 1 (399.7 eV : 400.9 eV), и в целом в 17 раз менее интенсивен, чем на золоте. Как
и в первом случае, можно отнести эти две полосы к азоту в N-C=S и N=C-S. По данным
XPS можно говорить о том, что на поверхности слюды гораздо меньше PhenSH нежели
на золоте. Это может быть связано с тем фактом, что вся золотая поверхность не
заряжена и является потенциальным местом связывания, в то время как свежесколотая
136
слюда заряжена отрицательно и имеет меньшее количество мест посадки.
Далее
был
проведен
ряд
экспериментов
по
фиксации
ДНК
на
модифицированную PhenSH поверхность слюды. По рис. 3.3.28 можно оценить
характер изменения топографии поверхности слюды. Не наблюдается образования
слоев, при этом на образце присутствует значительное количество артефакатов,
связанных
с
загрязнением
образца.
Подавляющее
количество
артефактов
представляют собой островки размером порядка 50 нм и высотой не более 2 нм. Также
видно некоторое количество зародышей роста островков и образований размерами
100-200 нм и высотой до 6 нм. Источником загрязнений может служить DMSO. Чтобы
обозначить роль данного соединения были проведены опыты по высаживанию ДНК на
поверхность слюды из раствора, содержащего DMSO. Так, слюда, выдержанная сутки в
100% DMSO, становиться непригодной для АСМ-исследований, так как имеет очень
сильно загрязненную поверхность. Также образцы, выдержанные в 10 -3 % ДНК в 50%
DMSO в течение часа значительно загрязнены и не содержат макромолекул ДНК, рис.
3.3.29.
Рис. 3.3.28. АСМ-изображение свежесколотой слюды, выдержанной 10 мин в 4·10 -4
M PhenSH в 4% DMSO, затем промытой водой и высушенной (слева) и
соответствующий высотный профиль (справа).
137
Рис. 3.3.29. АСМ-изображенние свежесколотой слюды, выдержанной сутки в
растворе 10-3 % ДНК в 50% DMSO.
Величину адсорбции ДНК на модифицированную PhenSH поверхность можно
оценить методом АСМ. Так, например, с ростом концентрации PhenSH в растворе,
которым обрабатывались подложки, наблюдается небольшой рост количества
адсорбированных
макромолекул
(рис.
3.3.30).
Вместе
с
этим
увеличивается
загрязнение поверхности (рис. 3.3.20, снимок 3). Видно, что макромолекулы имеют
некоторую ориентацию на подложке. Часть из них слиплась, с ростом количества
зафиксированных молекул этот эффект усиливается. Это говорит, о том, что
макромолекула сохраняет подвижность в процессе промывания подложек водой.
138
(2)
(1)
Рис. 3.3.30. АСМ-изображения слюды
после экспозиции в растворе Phen-SH
концентрации 10-6 M в 0.01 DMSO (1), 10-5
M в 0.1 % DMSO (2), 10-4 M в 1 % DMSO (3)
в течение 24 часов. После чего они были
промыты водой с последующей
экспозицией в растворе 10-3 % ДНК в
течение 10 минут и опять промыты
водой.
(3)
Также был поставлен опыт по определению зависимости поверхностной
плотности иммобилизованных макромолекул ДНК от концентрации биополимера в
растворе, которым обрабатывались подложки, рис. 3.3.31. На подложке, обработанной
раствором 10-4 % ДНК (2), зафиксировалось на порядок меньше макромолекул, чем при
обработке раствором 10-2 % ДНК (1). Таким образом, концентрация ДНК определяет
плотность покрытия поверхности этим биополимеров в значительно большей степени,
чем подготовка подложек в различных концентрациях PhenSH. Интересно, что в
присутствии
ионов
магния
иммобилизация
ДНК
идет
более
интенсивно,
макромолекулы образуют сетку без выраженного направления на поверхности (3), что
может говорить о том, что PhenSH покрывает незначительную часть поверхности и
реализуется стандартный механизм фиксации ДНК на слюду в присутствии ионов
139
магния.
(1)
(2)
Рис. 3.3.31. АСМ-изображения
свежесколотой слюды после экспозиции
в растворе Phen-SH концентрации 10 -4 M
в 1 % DMSO в течение 24 часов,
промывания водой с последующей
экспозицией в растворе 10-2 % ДНК (1),
10-4 % ДНК (2) и 10-3 % ДНК c 10-2 M MgCl2
(3) в течение 10 минут, и последующего
промывания водой.
(3)
Дополнительно была проверена возможность фиксации ДНК на необработанную
предварительно поверхность слюды из раствора с PhenSH, рис. 3.3.32. Как следует из
эксперимента, имеет место уверенная иммобилизация макромолекул на подложке, при
этом
реализуется
связывание
достаточно
сильное,
и
эффект
растягивания
биополимера при промывании подложки отсутствует. Таким образом, можно
заключить, что связывание PhenSH с макромолеклой ДНК происходит в растворе,
после чего PhenSH связывается с подложкой. В случае, если подложка предварительно
модифицирована PhenSH,
биополимеру значительно сложнее связаться с данным
соединением, что приводит к более слабому связыванию и растягиванию ДНК вдоль
подложки.
140
Рис. 3.3.32. АСМ-изображения поверхности свежесколотой слюды, выдержанной 1
час в растворе 5·10 -5 M PhenSH в 0.5 % DMSO, содержащего 0.001 % (слева) и 0.005 %
(справа) ДНК, затем промытой водой.
(2)
(1)
Рис. 3.3.33. АСМ изображения слюды после экспозиции в растворе Phen-SH
концентрации 10-4 M в течение 2 часов с последующей экспозицией в растворе 10-3 %
ДНК в течение 1 (1) и 100 (2) минут.
С увеличением времени экспозиции одинаково подготовленных подложек в
растворе ДНК, рост количества адсорбированных макромолекул не наблюдался, при
этом
увеличивалось
загрязнение
поверхности,
рис.
3.3.33.
Косвенно
это
свидетельствует о том, что ДНК не накапливается около поверхности с течением
времени.
141
3.3.3. Фиксация на поверхность кремния
В
первом
эксперименте
образцы
кремния
p-типа
промывали
водой,
выдерживали в течение суток в растворе Neo и PhenSH различной концентрации, затем
снова промывали водой, сушили и проводили измерения
фотоэлектронной
спектроскопии.
Результат,
методом рентгеновской
представленный
на
рис.
3.3.34,
показывает, что Neo не фиксируется на подложке, в отличие от PhenSH. Наблюдается
зависимость количества адсорбированного PhenSH от концентрации раствора, в
котором выдерживались образцы: пики (за вычетом базовой линии) соотносятся как
1.65 : 1.25 : 1. Таким образом, разница в концентрации в 100 раз увеличивает
количество PhenSH на поверхности только в 1.65 раза. Это коррелирует с данными ППР
для золота, где мы предположили отсутствие линейной зависимости роста количества
прочно связанных с поверхностью молекул от концентрации растворов, которыми
промывался чип.
Рис. 3.3.34. XPS спектр азота (1s), накопленный за 9 мин. 1 сек подложек кремния pтипа после их экспозиции в растворах Neo (врезка слева) и Phen-SH в течение 24 часов.
Изучение спектра углерода, рис. 3.3.35, показывает, что данного химического
элемента на поверхности присутствует значительно больше, чем азота. Как и в случае
со слюдой, наличие пика 284.7 eV соотнесем с углеродом, связанным с кремнием [155],
142
широкую полосу 285.0 eV можно отнести к углероду в ароматическом кольце phenSH, а
также в загрязнениях подложки. Пик 288.7 eV можно соотнести с углеродом,
связанным с кислородом, серой и/или азотом. Таким образом, большая часть
адсорбированного на поверхность углерода взаимодействует с кремнием, что логично.
Рис. 3.3.35. Обработанный XPS спектр углерода (1s), накопленный за 31 мин. 44 сек.,
приведенный к нулю интенсивности путем вычитания базовых линий и Гауссиана;
разложенные на спектральные составляющие формы Гауссиана.
Рассмотрим детальный спектр азота (1s), представленный на рис. 3.3.36. Как для
слюды и золота мы видим два пика, интенсивности которых относятся как 1.6 : 1 (399.3
eV : 399.8 eV). Это может говорить о том, что имеет место таутомерия С-N/С=N, а также
о наличии взаимодействия с подложкой части атомов азота.
143
Рис. 3.3.36. Обработанный XPS спектр азота (1s), накопленный за 105 минут,
приведенный к нулю интенсивности путем вычитания базовых лини и Гауссиана,
разложенные на спектральные составляющие формы Гауссиана.
Обратимся к данным АСМ. Подложки кремния n-/p-типа протравливались в
растворе HF:H2O (1:10) в течение 1 минуты для удаления оксида кремния, затем
промывались в воде. Образцы выдерживались в течение 10 минут в растворе 10 -6 M
PhenSH в 0.01 % DMSO, после опять промывались водой и сушились в потоке воздуха.
Как можно видеть из рис. 3.3.37 и 3.3.38, на поверхности присутствуют слои. Высоту
каждого слоя относительно предыдущего можно оценить по представленным
высотным профилям (в). Для обоих типов кремния она составила порядка 2 нм. При
этом, судя по изображениям крупного масштаба (б), первый слой практически ровно
покрывает поверхность, что затрудняет определение его толщины. Интересен тот факт,
что во время сканирования топография поверхности несколько меняется.
144
(б)
(а)
Рис.
кремния
3.3.37.
АСМ-изображение
n-типа,
обработанного
в
PhenSH. Линия на изображении (а)
относится к высотному профилю (в), а
квадрат
(в)
означает
область
на
изображении (б).
Так, выделенная область на изображении (а) отличается от (б), рис. 3.3.38. Как
видно, третий из наблюдаемых слоев, имеющий высоту около 6 нм, разрушился в тех
областях, где, по всей видимости, под ним не было второго слоя. Отметим, что
вероятность того, что последний слой является жидкостью, крайне мала, так как
поверхностное натяжение должно было бы придать данным слоям более правильные
формы, чем мы видим на (а). Таким образом, мы допускаем образование слоев,
висящих над дефектами в предыдущих слоях, которые могут быть разрушены иголкой
микроскопа при сканировании ввиду хрупкости такой конструкции. При этом, так как
на подложке не видно остатков от этих слоев, то можно предположить наличие
процесса испарения или перераспределения вещества в другие слои. Так как
поверхность такого типа не представляет интерес для использования ее в качестве
подложки для исследования ДНК, то для опытов с биополимером травление в HF:H 2O
не проводилось, использовались исходные подложки и дополнительно окисленные.
145
(б)
(а)
Рис.
кремния
3.3.38.
АСМ-изображение
p-типа,
обработанного
в
PhenSH. Линия на изображении (а)
относится к высотному профилю (в), а
квадрат
(в)
означает
область
на
изображении (б).
Так, на рис. 3.3.39 представлены результаты по иммобилизации ДНК на
поверхность кремния. К сожалению, молекулы ДНК плохо различимы в связи с
неровностью поверхности. Тем не менее, можно говорить о том, что молекулы
ориентированы на подложке, как это наблюдалось для слюды, что говорит о слабом
связывании
макромолекул с поверхностью. При этом не наблюдается слипания
биополимеров.
146
(а)
(б)
(в)
(г)
Рис. 3.3.39. АСМ-изображение подложек из кремния n (а, б) и p (в, г) типа после
экспозиции в течение 72 часов в растворе 10 -4 М PhenSH в 1 % DMSO с последующей
промывкой водой и экспозицией в течение 1 часа в растворе 0.026% ДНК с
последующей промывкой водой.
Для прояснения возможности фиксации ДНК в присутствии ионов магния был
поставлен опыт, результат которого представлен на рис. 3.3.40. Как можно видеть, в
присутствии низких концентраций магния на подложке фиксируется крайне малое
количество макромолекул, в то время как на обработанной PhenSH поверхности их
значительно больше, а их слабая ориентация в одном направлении говорит о более
сильном связывании с поверхностью. Таким образом, PhenSH, связанный с
147
поверхностью, способствует фиксации на ней макромолекул ДНК.
Рис. 3.3.40. АСМ-изображение подложек из исходного (слева) и обработанного в
течение 15 минут в 10-5 M PhenSH в 1 % DMSO (справа) кремния, выдержанных в
течение 10 минут в растворе 4·10 -4 % ДНК, содержащем 5·10-5 M MgCl2, затем промытого
водой.
148
3.3.4. Взаимодействие соединения фенантролина с молекулой ДНК в
растворе
Используемое
в
работе
соединение
представляет
собой
фенантролин,
модифицированный серой. Поскольку предназначение этого соединения в изучаемых
системах заключается в связывании с ДНК, в работе было изучено его взаимодействие
с
высокомолекулярной
тимусной
ДНК.
На
рис.
3.3.40
показано
влияние
низкомолекулярной соли (NaCl) на спектральные свойства соединения. Препарат
растворяли в DMSO, затем осуществляли перевод в водно-солевой раствор. Как
свидетельствуют полученные данные, наблюдается гипохромный эффект во всей
наблюдаемой спектральной УФ-области, причем меняется и форма спектра. Причиной
наблюдаемых спектральных изменений может быть образование ассоциатов в растворе
(димеров, стопок). Возможно также изменение концентрации соединения в растворе,
но видимого осадка
не наблюдалось. Разложим спектр PhenSH на спектральные
составляющие, рис. 3.3.41, и построим график их изменений в результате досаливания
раствора, рис. 3.3.42. Как видно из рис. 3.3.42, основные максимумы 238 нм и 267 нм не
сдвигаются, при этом их интенсивность падает на 36 и 27 % соответственно.
Рис. 3.3.40. Результат досаливания растворов PhenSH в 0.8 % DMSO, досаливание
производилось путем добавлением 0.15 M NaCl в 2 этапа.
149
Рис. 3.3.41. Спектры поглощения PhenSH до (сверху) и после (снизу) досаливания.
Спектры разложены на спектральные полосы в форме Гауссиана (G) и Лоренциана (L).
150
Рис. 3.3.42. Изменение спектральных полос PhenSH после досаливания: Δλ — сдвиг
длины волны максимума спектральной линии, ΔD — изменение ее интенсивности, в %.
Другие спектральные пики, за исключением полосы 355 нм, также в рамках
погрешности не сдвигаются, но при этом их интенсивность падает на 45-59 % (за
исключением последней полосы 470 нм), что почти вдвое превышает падение
интенсивности основных пиков. Такая картина дает основание полагать, что
изменение спектров связано с образованием новых комплексов в растворе, нежели с
выпадением PhenSH в осадок, так как в последнем случае следовало бы ожидать
равномерного падения интенсивностей спектральных составляющих. Также сдвиг
максимума полосы на 355 нм, которого нет в спектре немодифицированного серой
фенантролина, говорит о том, что имеет место взаимодействие, которое затрагивает
серосодержащую группу.
Следующий эксперимент был связан с изучением кислотно-основных свойств
соединения. Титрование проводили в 1,2 mM NaCl. На рис. 3.3.43 приведены спектры
поглощения соединения при разных рН. Изобестическая точка свидетельствует о
переходе соединения из одного состояния в другое.
151
Рис. 3.3.43. Перевод PhenSH в более кислую среду путем добавления 0.01 M HCl.
Эти данные позволили определить рК соединения (рис. 3.3.44).
Так как
исследования, посвященные взаимодействию соединения с ДНК, проводили при рН от
5.7 до 6.4, то в изучаемых системах было протонировано 3-10 % молекул.
Рис. 3.3.44. Зависимость оптической плотности растворов на длинах волн 267 нм и
276 нм от расчетного показателя pH раствора.
152
Добавление в раствор соединения ДНК в различных концентрациях (при
постоянной концентрации препарата, рис. 3.3.45) привело к изменению спектра
поглощения соединения (рис. 3.3.46).
Рис. 3.3.45. Оптическая плотность раствора 3.1·10-5 M PheSH в 0.8 % DMSO и 5 mM
NaCl, содержащего различные концентрации ДНК, r = MphenSH/MbpDNA.
Из рис. 3.46 видно, что добавление ДНК к раствору PhenSH стабилизирует систему,
о чем говорит тот факт, что при отношении молярной концентрации соединения к
молярной концентрации пар оснований ДНК r < 1 за 5 дней спектры практически не
изменились, тогда как без ДНК изменения происходили. Для r > 1 видно падение
оптической плотности со временем. Отметим, что для малых r падение оптической
плотности на величину порядка 0.2 произошло непосредственно после приготовления
растворов. В то время как для больших r значительное падение наблюдалось лишь
через несколько дней.
153
Рис. 3.3.46. Зависимость оптической плотности на длинах волн 265 нм и 381 нм для
растворов, представленных на рис. 3.3.45, от соотношения r = M phenSH/MbpDNA. Индекс 2d
и 5d означают, что аналогичные измерения были повторены через 2 и 5 дней. D265 nm
expected
обозначает расчетную оптическую плотность, полученную суммированием
оптических плотностей соответсвующего раствора ДНК и PhenSH.
Рассмотрим более детально спектры поглощения растворов ДНК с PhenSH, рис.
3.3.47. Как видно из графиков (а), (б) и (в), сдвигов спектральных полос не происходит.
При этом наблюдается падение оптической плотности. Например, максимум на 265 нм
опускается с 0.53 до 0.46 (r = 1.58) и 0.43 (r = 0.34). Это может быть связано с тем, что
при
вычитании
спектра
ДНК
взаимодействия с препаратом.
была
взята
оптическая
плотность
без
учета
154
(а)
(в)
(б)
(г)
Рис. 3.3.47. Оптическая плотность растворов ДНК с фенантролином за вычетом
поглощения ДНК. Спектр разложен на полосы в форме Гауссиана (G) и Лоренциана
(L). Спектры поглощения раствора С(PheSH)= 3.1·10-5 M в 0.8 % DMSO и 5 mM NaCl (а),
раствора 3.1·10-5 M PheSH в 0.8 % DMSO и 5 mM NaCl, содержащего 1.85·10-4 Mbp ДНК
(б), раствора 3.1·10-5 M PheSH в 0.8 % DMSO и 5 mM NaCl, содержащего 3.7·10 -5 Mbp ДНК
(в) и растворов, содержащих компоненты при кислых рН (в)» (г).
Падение оптической плотности в длинноволновой области, где ДНК не поглощает,
прямо говорит о наличии взаимодействия. pH-титрование комплекса ДНК с PhenSH
было проведено в
5 mM NaCl при r=1.58, рис.
3.3.47 (г) и 3.3.48. Рассмотрение
спектров показывает, что при этом наблюдаются существенные изменения, но
изобестическая
точка
отсутствует.
Действительно,
помимо
фенантролинового
соединения, в данной системе происходит протонирование молекулы ДНК. Известно,
что в составе макромолекулы первой протонируется довольно слабая протонакцепторная группа-N7 гуанина. В 5 mM NaCl средняя точка перехода этой группы в
155
протонированное состояние соответствует рК = 4,75 – это и есть характеристика
протонирования двуспиральной ДНК при используемой концентрации NaCl. Таким
образом, cмещение величины pК (рис. 3.3.49) в кислую область относительно
титрования свободного фенантролина может быть следствием и этого процесса (ниже
рК наблюдается гиперхромный эффект, спровоцированный дестабилизацией ДНК изза протонирования).
Характер спектральных изменений позволяет заключить, что
связывание ДНК с фенантролином реализуется.
Рис. 3.3.48. Оптическая плотность раствора 3.1·10 -5 M PheSH в 0.8 % DMSO и 5 mM
NaCl, содержащего 3.7·10-5 Mbp ДНК, при добавлении HCl, разложенная на
спектральные составляющие формы Гауссиана (G) и Лоренциана (L).
Рис. 3.3.49. Зависимость оптической плотности на длинах волн 264 нм и 370 нм от
рН для растворов ДНК с PhenSH с r = 1.58 и r = 16.76
156
Рассмотрим данные гидродинамических исследований. Метод вискозиметрии
позволяет следить за изменение объема полимерного клубка. Так как в данной работе
невозможно подобрать условия, при которых соотношение связанный-свободный
лиганд в растворе ДНК остается неизменным при изменении концентрации ДНК, мы
не определяли значение характеристической вязкости, а ограничились рассмотрением
изменения приведенной вязкости раствора ДНК (при ее постоянной концентрации) в
зависимости от концентрации фенантролинового соединения в растворе.
Из графика 3.3.50 видно, что с увеличением величины r вязкость раствора (а,
значит, и объем молекулы ДНК) возрастает. Такое поведение макромолекулы в
растворе, содержащем гетероциклические лиганды, стерически
встраиванию
между
парами
оснований
ДНК,
обычно
и
подходящие к
свидетельствует
об
интеркаляционном способе связывания. Таким образом, можно полагать, что
фенантролиновое соединение связывается с ДНК в растворе именно таким способом
(происходит интеркаляция между основаниями).
Насыщение такого связывания
наблюдается при концентрации, примерно соответствующей 1 молекуле фенантролина
на 20 пар оснований.
Рис. 3.3.50. Зависимость приведенной вязкости раствора ДНК с фенантролином от
r в 5 mM NaCl 0.01 % ДНК (r = MphenSH/MbpDNA).
Заметим, что на следующий день характер изменения вязкости растворов ДНК с
157
фенантролином не изменился.
Таким
соединение
образом,
проведенное
фенантролина
исследование
взаимодействует
с
показало,
молекулой
что
ДНК
используемое
в
растворе,
интеркалируя между парами оснований. Такой способ связывания хорошо согласуется
с рассмотренными ранее данными по фиксации ДНК на поверхности после ее
модификации соединением фенантролина.
158
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Совокупность полученных в работе данных и их анализ позволяют сформулировать
следующие выводы.
•
Разработан новый способ светоуправляемый фиксации ДНК на поверхность
кремния n-/p-типа в присутсвии ионов магния.
•
Развит способ металлизации зафиксированных на кремнии в виде «жгутов»
молекул ДНК.
•
Исследованы электрофизические свойства интерфейса ДНК-кремний (получены
вольт-амперные и вольт-фарадные характеристики).
•
Проведена оценка поверхностной плотности состояний при различных способах
фиксации ДНК.
•
Показано, что электрофизические свойства модифицированного макромолекулами
ДНК приповерхностного слоя кремния зависят от способа
иммобилизации
биополимера.
•
Подобраны оптимальные условия для исследования систем ДНК-лиганд методом
плазмонного резонанса.
•
Проведен сравнительный анализ формирования слоев PhenSH на поверхностях
золота, слюды и кремния. Показана принципиальная роль –SH/=S группы при
адсорбции соединения.
•
Разработан новый способ фиксации тимусной ДНК на модифицированные PhenSH
поверхности золота, слюды и кремния.
•
Показано, что соединение PhenSH образует комплекс с молекулой ДНК в растворе
малой ионной силы, взаимодействуя с макромолекулой интеркаляционным
способом.
159
Список литературы
1. Seeman N.C. Design and Engineering of Nucleic Acid Nanoscale Assemblies // Current
Opinion in Structural Biology. 1996, 6, 4, 519-526.
2. Ben-Jacob E., Hermon Z., Caspi S. DNA transistor and quantum bit element:
Realization // Physics Letters A, 1999, 263, 3, 199–202.
3. Rothemund, Paul W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns //
Nature, 2006, 440, 7082, 297–302.
4. R. G. Endres, D. L. Cox, and R. R. P. Singh Colloquium: The quest for highconductance DNA // REVIEWS OF MODERN PHYSICS, 2004, 76, 195.
5. Estrela, P. Stewart, A.G. Migliorato, P. Maeda, H. Dept. of Eng., Cambridge Univ.
Label-free detection of DNA hybridization with Au/SiO2/Si diodes and poly-Si TFTs //
Electron Devices Meeting, 2004. IEDM Technical Digest. IEEE International, 2004,
1009 — 1012.
6. K. NAUKA, Z. LI, T.I. KAMINS Surface photovoltage in silicon. Novel applications for
chemical and biological sensing // Materials Science-Poland, 2005, 23, 3, 653-661.
7. Z. Li, Y. Chen, X. Li, T. I. Kamins, K. Nauka, and R. S. Williams Sequence-Specific
Label-Free DNA Sensors Based on Silicon Nanowires // Nano Letters. 2004, 4, 2,
245–247.
8. Bo Gao, Koshala Sarveswaran, Gary H. Bernstein and Marya Lieberman Guided
Deposition of Individual DNA Nanostructures on Silicon Substrates // Langmuir,
2010, 26, 15, 12680–12683.
9. I. L. Volkov, N. V. Bazlov, A. S. Bondarenko, O. F. Vyvenko and N. A. Kas’yanenko
Light-induced noncovalent fixation of DNA and synthetic polyions on the surface of
silicon single crystals // Journal of Structural Chemistry, 2009, 50, 5, 962-969.
10. Salih Okura, Fahrettin Yakuphanoglub, Mehmet Ozsozc and Pnar Kara Kadayifcilar
Electrical and interface properties of Au/DNA/n-Si organic-on-inorganic structures //
Microelectronic Engineering, 2009, 86, 11, 2305-2311.
11. Takashi Morii, Rika Mizuno, Hirotaka Haruta and Takao Okada, AFM study of the
elasticity of DNA molecules // Thin Solid Films, 2004, 464/465, 456-458.
12. Carlos Bustamante, Steven B Smith, Jan Liphardt and Doug Smith Single-molecule
studies of DNA mechanics // Curr Opin Struct Biol., 2000, 10, 3, 279-85.
13. Lintao Cai , Hitoshi Tabata and Tomoji Kawai Probing electrical properties of oriented
160
DNA by conducting atomic force microscop // Nanotechnology, 2001, 12, 211–216.
14. Majka J., Speck C. Analysis of protein-DNA interactions using surface plasmon
resonance // Adv Biochem Eng Biotechnol, 2007, 104, 13-36.
15. Stockley PG, Persson B. Surface plasmon resonance assays of DNA-protein
interactions // Methods Mol Biol., 2009, 543, 653-69.
16. Nguyen B., Tanious FA, Wilson WD Biosensor-surface plasmon resonance:
quantitative analysis of small molecule-nucleic acid interactions // Methods, 2007, 42,
2, 150-6.
17. Voula Kodoyianni Label-free analysis of biomolecular interactions using SPR
imaging // BioTechniques, 2011, 50, 32-40.
18. YONGHAI SONG, ZHUANG LI, ZHIGUO LIU, GANG WEI, LI WANG,ANDLANLAN
SUN Immobilization of DNA on 11-Mercaptoundecanoic Acid-Modified Gold (111)
Surface for Atomic Force Microscopy Imaging // MICROSCOPY RESEARCH AND
TECHNIQUE, 2005, 68, 59–64.
19. Bradford J. Taft, Melissa A. Lapierre-Devlin and Shana O. Kelley An intercalator film
as a DNA–electrode interface // Chem. Commun., 2006, 962–964.
20.Diana B Peckys, Niels de Jonge, Michael L Simpson and Timothy E McKnight Endspecific strategies of attachment of long double stranded DNA onto gold-coated
nanofiber arrays // Nanotechnology, 2008, 19, 435301.
21. Dalip Sethi, R. P. Gandhi, Pradeep Kumar and Kailash Chand Gupta Chemical
strategies for immobilization of oligonucleotides // Biotechnol. J., 2009, 4, 1513–1529.
22. Serge L. Beaucage Strategies in the Preparation of DNA Oligonucleotide Arrays for
Diagnostic Applications // Current Medicinal Chemistry, 2001, 8, 1213-1244.
23. Yuri L. Lyubchenko, Luda S. Shlyakhtenko and Toshio Ando Imaging of nucleic acids
with atomic force microscopy // Methods., 2011, 54, 2, 274–283.
24. Arzum Erdem, Kagan Kerman, Burcu Meric, Ulus Salih Akarca, and Mehmet Ozsoz
DNA Electrochemical Biosensor for the Detection of Short DNA Sequences Related to
the Hepatitis B Virus // Electroanalysis 1999, 11, 8, 586-588.
25. Kelly M. Millan and Susan R. Mikkelsen Sequence-Selective Bios Hybridization
Indicators // Anal. Chem. 1993, 65, 2317-2323.
26.H. Yang, A. Rys, C. K. McLaughlin and H. F. Sleiman Templated Ligand Environments
for the Selective Incorporation of Different Metals into DNA // Angew. Chem., Int.
Ed., 2009, 48, 9919–9923.
27. H. Yang, F. Altvater, A. D. de Bruijn, C. K. McLaughlin, P. K. Lo and H. F. Sleiman
161
Chiral Metal–DNA Four-Arm Junctions and Metalated Nanotubular Structures //
Angew. Chem. Int. Ed., 2011, 50, 4620–4623.
28.J.M. C Thornton and R.H. Williams A photoemission study of passivated silicon
surfaces produced by etching in solutions of HF // Semicond. Sci. Technol., 1989, 4,
847-851.
29. Naoko Takahashi, Analysis of Silanol by Derivatization XPS // R&D Review of Toyota
CRDL, 41, 1, 52.
30.A. M. Varvarin and L. A. Belyakova, Method for Determining the Concentration of
Isolated Silanol Groups on Silica Surface with Dimethylchlorosilane // Russian
Journal of Applied Chemistry, Vol. 76, No. 2, 2003, pp. 203!206. Translated from
Zhurnal Prikladnoi Khimii, 2003, 76, 2, 212-215.
31. D. Bodlaki and E. Borguet, Photoreactivity of Si(111)-H in Ambient // J. Phys. Chem. C
2007, 111, 234-239.
32. Kathleen A. Morse,Piero Pianetta Investigation of Light Initiated Oxidation of
Hydrogen Passivated Silicon Surfaces: Hx-Si(100) and H-Si(111)(1X1) // Mat. Res. Soc.
Symp. Proc., 2002, 716
33. G RANGA RAO, Analysis of Interfacial Water at a Hydrophilic Silicon Surface by inSitu FTIR/Internal Reflection Spectroscopy // Bull. Mater. Sci., 2004, 27, 6, 497–500.
34. I. Constant, F. Tardif and J. Derrien Deposition and removal of sodium contamination
on silicon wafers // Semicond. Sci. Technol., 2000, 15, 61–66.
35. Maximilian Amsler, S Alireza Ghasemi , Stefan Goedecker, Alexey Neelov and Luigi
Genovese. Adsorption of small NaCl clusters on surfaces of silicon nanostructures //
Nanotechnology, 2009, 20, 445301.
36. Xiaowen Zhou, Masaki Ishida, Akihito Imanishi, Yoshihiro Nakato Reactions of Si H to
Si X (X =halogen) bonds at H-terminated Si(111) surfaces in hydrogen halide solutions
in the presence of oxidants // Electrochimica Acta, 2000, 45, 4655– 4662.
37. W. Kern, Surf. Sci., 1970, 31, 207.
38.K. K. Popkov REACTION OF SILANOLS WITH HYDROGEN CHLORIDE // Журнал
прикладной спектроскопии, 1970, 13, 2, 318-321.
39. Yan Mao, Lambert N. Daniel, Noel Whittaker,2 and Umberto Saffiottil DNA Binding to
Crystalline Silica Characterized by Fourier-Transform Infrared Spectroscopy //
Environmental Health Perspectives, 1994, 102, 10, 165-171.
40.N. A. Matwiyoff, H. Taube // J. Am. Chem. Soc. 90, 1968, 2796. C. C. Pye, W. W.
Rudolph // J. Phys. Chem. A, 1998, 102 , 993.
162
41. Angeliki Siokou, Dimitrios Kefalas and Spyridon Ntais XPS study of hydrated MgCl2
impregnated on flat SiO2/Si(100) Mo and Au substrates // Surface Science, 2003,
532-535, 472-477.
42.Anastassopoulou Jane Metal–DNA interactions // Journal of Molecular Structure,
2003, 651–653, 19–26.
43. Shin-ichi TANAKA, Masateru TANIGUCHI and Tomoji K AWAI Selective Adsorption
of DNA onto SiO2 Surface in SiO2 /SiH Pattern // Japanese Journal of Applied
Physics, 2004, 43, 10, 7346–7349.
44.Carl Leung, Helen Kinns, Bart W. Hoogenboom, Stefan Howorka, and Patrick
Mesquida,Imaging Surface Charges of Individual Biomolecules // Nano Lett., 2009, 9,
7, 2769-2773.
45. В. Л. Бонч-Бруевич, С. Г. Калашников / Изд. «Наука», Москва // Физика
полупроводников. 1977, 317.
46.H. Angermann, W. Henrion, A. Roseler, M. Rebien Wet-chemical passivation of
Si(111)- and Si(100)-substrates // Materials Science and Engineering B, 2000, 73, 178
– 183.
47. O. Gullu, M. Cankaya, O. Barıs¸ M. Biber, H. Ozdemir, M. Gulluce, A. Turut DNAbased organic-on-inorganic semiconductor Schottky structures // Applied Surface
Science, 2008, 254, 5175–5180.
48.C.H. Seager and G. E. Pike Anomalous low-frequency grain-boundary capacitance in
silicon // Appl. Phys. Lett., 1980, 37, 8, 747-749.
49.Danny Porath DNA sequence scanned // Nature nanotechnology, 2009, 4 476 – 477.
50.http://www.gks.ru/free_doc/new_site/population/demo/demo24.xls
51. Rama Krishna Narla, Yanhong Dong, Osmond J. D’Cruz, Christopher Navara, and
Fatih M. Uckun Bis(4,7-dimethyl-1,10-phenanthroline) Sulfatooxovanadium(IV) as a
Novel Apoptosis-inducing Anticancer Agent, 2000, 6, 1546 –1556 ( Clinical Cancer
Research ).
52. Sudeshna Roy, Katharine D. Hagen, Palanisamy Uma Maheswari, Martin Lutz,
Anthony L. Spek, Jan Reedijk and Gilles P. van Wezel Phenanthroline Derivatives with
Improved Selectivity as DNA-Targeting Anticancer or Antimicrobial Drugs //
ChemMedChem 2008, 3, 1427 – 1434.
53. Pritam Thapa and Eung-Seok Lee 2,4-Diaryl-5,6-dihydro-1,10-phenanthrolines with
Furyl or Thienyl Moiety at 4-Position: Synthesis, Topoisomerase I and II Inhibitory
Activity, and Cytotoxicity // Bull. Korean Chem. Soc. 2012, 33, 5, 1769.
163
54. Walaa H. Mahmoud, Gehad G. Mohamed, Maher M.I. El-Dessouky Synthesis,
Characterization and in vitro Biological Activity of Mixed Transition Metal Complexes
of Lornoxicam with 1,10-phenanthroline // Int. J. Electrochem. Sci., 2014, 9, 1415 —
1438.
55. Oladipo Mary Adelaide and Olaoye Oluwabiyi James Antimicrobial, DNA Cleavage and
Antitumoral Properties of Some Transition Metal Complexes of 1, 10 –Phenanthroline
and 2, 2ʹ – Bipyridine: A Review // International Journal of Research in
Pharmaceutical and Biomedical Sciences, 2013, 4, 4, 1160-1171.
56. P. Hazarika, J. Deka, S. Bhola, R. K. Bhola, C. Medhi and O. K. Medhi Synthesis,
characterization,
DNA
binding
and
anticancer
property
of
cischlorodimethylsulphoxide(S)bis(1,10-phenanthroline) ruthenium(II) chloride //
Der Pharma Chemica, 2013, 5 ,2, 267-27.
57. Andrea Bencinia, Vito Lippolis 1,10-Phenanthroline: A versatile building block for the
construction of ligands for various purposes // Coordination Chemistry Reviews, 2010,
254, 17–18, 2096–2180.
58.Athanasios G. PAPAVASSILIOU Chemical nucleases as probes for studying DNAprotein interactions // Biochem. J., 1995, 305, 345-357.
59. Robert H. Terbrueggen, Timothy W. Johann, and Jacqueline K. Barton Functionalized
Rhodium Intercalators for DNA Recognition // Inorg. Chem. 1998, 37, 6874-6883.
60.L.A. Summers // Adv. Heterocycl. Chem., 1978, 22, 1.
61. P.G. Sammes, G. Yahioglu // Chem. Soc. Rev., 1994, 23, 327.
62.M. Schmittel, H.-W. Lin // Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 2007, 46, 893.
63. M.-J. Li, B.W.-K. Chu, N. Zhu, V.W.-W. Yam // Inorg. Chem., 2007, 46, 720.
64.M.-J. Li, C.-C. Ko, G.-P. Duan, N. Zhu, V.W.-W. Yam // Organometallics, 2007, 26,
6091.
65. Xiuli Wang *, Wenyan Zheng, Hongyan Lin, Guocheng Liu, Yongqiang Chen, Jiani
Fang A new selective phenanthroline-based fluorescent chemosensor for Co2+ //
Tetrahedron Letters, 2009, 50, 1536–1538.
66.Kelly M. Millan and Susan R. Mikkelsen Sequence-Selective Biosensor for DNA Based
on Electroactive Hybridization Indicator // Anal. Chem., 1993, 65, 2317-2323.
67. Arzum Erdem, Kagan Kerman, Burcu Meric, Ulus Salih Akarca, and Mehmet Ozsoz
DNA Electrochemical Biosensor for the Detection of Short DNA Sequences Related to
the Hepatitis B Virus // Electroanalysis 1999, 11, 8, 586-588.
68.Dennis J. Hurley, Susan E. Seaman, Jan C. Mazura, and Yitzhak Tor Fluorescent 1,10-
164
Phenanthroline-Containing
Oligonucleotides
Distinguish
between
Perfect
and
Mismatched Base Pairing // ORGANIC LETTERS, 2002, 4, 14, 2305-2308.
69. Kitamura Y, Ihara T, Tsujimura Y, Osawa Y, Jyo A. Colorimetric allele analysis based
on the DNA-directed cooperative formation of luminous lanthanide complexes //
Nucleic Acids Symp Ser (Oxf). 2006, 50, 105-6.
70. Christopher K. McLaughlin, Graham D. Hamblin and Hanadi F. Sleiman
Supramolecular DNA assembly // Chem. Soc. Rev., 2011, 40, 5647–5656.
71. Andrea A. Greschner, Katherine E. Bujold, and Hanadi F. Sleiman Intercalators as
Molecular Chaperones in DNA Self-Assembly // J. Am. Chem. Soc., 2013, 135,
11283−11288.
72. Michael Schmittel, Venkateshwarlu Kalsani, Christoph Michel,Prasenjit Mal, Horst
Ammon, Frank Jäckel, and Jürgen P. Rabe Towards Nanotubular Structures with
Large Voids: Dynamic Heteroleptic Oligophenanthroline Metallonanoscaffolds and
their Solution-State Properties // Chem. Eur. J., 2007, 13, 6223 – 6237.
73. Manik Lal Saha, Kingsuk Mahata, Debabrata Samanta, Venkateshwarlu Kalsani, Jian
Fan, Jan W. Batsb and Michael Schmittel A phenanthroline–terpyridine hybrid as a
chameleon-type ligand in a reversible metallosupramolecular rearrangement // Dalton
Trans., 2013, 42, 12840.
74. Johannes V. Barth, Giovanni Costantini & Klaus Kern Engineering atomic and
molecular nanostructures at surfaces // NATURE, 2005, 437, 671-679.
75. Johannes V. Barth Molecular Architectonic on Metal Surfaces // Annu. Rev. Phys.
Chem., 2007, 58, 375–407 .
76. F. Cunha, Q. Jin, N.J. Tao, C.Z. Li Structural phase transition in self-assembled 1,10'
phenanthroline monolayer on Au( 111 ) // Surface Science, 1997, 389, 19-28.
77. Francois Lux, Gilles Lemercier, Chantal Andraud, Guillaume Schull, and
Fabrice
Charra Self-Assembled Monolayers Based on Phenanthroline-Gold(111) Bonding //
Langmuir 2006, 22, 10874-10876.
78. Dietmar Payer, Stephan Rauschenbach, Nicola Malinowski, Mitsuharu Konuma,
Chariya Virojanadara, Ulrich Starke, Christiane Dietrich-Buchecker, Jean-Paul Collin,
Jean-Pierre Sauvage, Nian Lin and Klaus Kern Toward Mechanical Switching of
Surface-Adsorbed [2]Catenane by in Situ Copper Complexation // J. AM. CHEM. SOC.
2007, 129, 15662-15667.
79. Olaf Domınguez and Luis Echegoyen, Fred Cunha and Nongjian Tao Self-Assembled
Fullerene-Derivative Monolayers on a Gold
Substrate Using Phenanthroline-Au
165
Interactions // Langmuir, 1998, 14, 821-824.
80.Peter F. Cafe, Allan G. Larsen, Wenrong Yang, Ante Bilic, Iain M. Blake, Maxwell J.
Crossley, Jingdong Zhang, Hainer Wackerbarth, Jens Ulstrup, and Jeffrey R. Reimers
Chemisorbed and Physisorbed Structures for 1,10-Phenanthroline and Dipyrido[3,2a:2′,3′-c]phenazine on Au(111) // J. Phys. Chem. C, 2007, 111, 17285-17296.
81. Thomas Cardinaels, Jan Ramaekers, Peter Nockemann, Kris Driesen, Kristof Van
Hecke, Luc Van Meervelt, Guojie Wang, Steven De Feyter, Eva Fernandez Iglesias,
Daniel Guillon, Bertrand Donnio, Koen Binnemansa and Duncan W. Bruce Rigid
tetracatenar liquid crystals derived from 1,10-phenanthroline // Soft Matter, 2008, 4,
2172–2185.
82.Marek Grzelczak, Niksa Kulisic, Maurizio Prato and Aurelio Mateo-Alonso Multimode
assembly of phenanthroline nanowires decorated with gold nanoparticles // Chem.
Commun., 2010, 46, 9122–9124.
83.Marek Grzelczak, Niksa Kulisic, Maurizio Prato and Aurelio Mateo-Alonso The
Influence of Molecular Structure on the Self-Assembly of Phenanthroline Derivatives
into Crystalline Nanowires // Part. Part. Syst. Charact., 2014, 31, 121–125.
84.Yasemin Oztekin, Zafer Yazicigil, Ali Osman Solak, Zafer Ustundag, Zeynel Kilicc and
Selen Bilge Surface modification and characterization of phenanthroline nanofilms on
carbon substrate // Surf. Interface Anal., 2011, 43, 923–930.
85.Ping Gao and Michael J. Weaver Surface-Enhanced Raman Spectroscopy as a Probe of
Adsorbate-Surface Bonding: Benzene and Monosubstituted Benzenes Adsorbed at
Gold Electrodes // J . Phys. Chem., 1985, 89, 5040-5046.
86.Ujjal Kumar Sur, and Joydeep Chowdhury Surface-enhanced Raman scattering:
overview of a versatile technique used in electrochemistry and nanoscience //
CURRENT SCIENCE, 2013, 105, 7, 923.
87. D. A. THORNTON and G. M. WATKINS A full vibrational assignment (4000-50 cm-‘)
of 1,10-phenanthroline and its perdeuterated analogue // Sptctrorhimica Acm., 1991,
47, 8, 1085-1096.
88.Markus Reiher, Georg Brehm, and Siegfried Schneider Assignment of Vibrational
Spectra of 1,10-Phenanthroline by Comparison with Frequencies and Raman
Intensities from Density Functional Calculations // J. Phys. Chem. A, 2004, 108, 734742.
89.Nak Han Jang, Jung Sang Suh, and Martin Moskovits Effect of Surface Geometry on
the Photochemical Reaction of 1,10-Phenanthroline Adsorbed on Silver Colloid
166
Surfaces // J. Phys. Chem. B, 1997, 101, 8279-8285.
90.Maurizio Muniz-Miranda Surface Enhanced Raman Scattering and Normal Coordinate
Analysis of 1,10-Phenanthroline Adsorbed on Silver Sols // J. Phys. Chem. A, 2000,
104, 7803-7810.
91. K. Zawada, J. Bukowska An interaction of 1,10-phenantroline with the copper
electrode in neutral and acidic aqueous solutions: a surface enhanced Raman
scattering study // Journal of Molecular Structure, 2000, 555, 425–432.
92.Youdi Peng, Zhenjiang Niu, Wei Huang, Shu Chen, and Zelin Li Surface-Enhanced
Raman Scattering Studies of 1,10-Phenanthroline Adsorption and Its Surface
Complexes on a Gold Electrode // J. Phys. Chem. B, 2005, 109, 10880-10885.
93. Gustavo F. S. Andrade and Marcia L. A. Temperini 1,10-Phenanthroline Adsorption on
Iron
Electrode
Monitored
by
Surface-Enhanced
Raman
Scattering
(SERS).
Comparison to SERS of Phen and Its Transition Metal Complex on Silver Electrode //
J. Phys. Chem. C, 2007, 111, 13821-13830.
94.Maurizio Muniz-Miranda, Barbara Pergolese, Adriano Bigotto, Anna Giusti Stable and
efficient silver substrates for SERS spectroscopy // Journal of Colloid and Interface
Science, 207, 314, 540–544.
95. Maurizio Muniz-Miranda, Barbara Pergoleseb and Adriano Bigotto SERS and DFT
investigation on the adsorption of 1,10-phenanthroline on transition metal surfaces //
Phys. Chem. Chem. Phys., 2010, 12, 1145–1151.
96.Seeman NC. An Overview of Structural DNA Nanotechnology // Mol. Biotechnol.,
2007, 37, 246–257.
97. Peixuan Guo RNA nanotechnology: engineering, assembly and applications in
detection, gene delivery and therapy // J Nanosci Nanotechnol., 2005, 5, 12, 1964-82.
98.Peixuan Guo, The emerging field of rna nanotechnology // Nature Nanotechnology,
2010, 5, 833–842.
99.100.
Rothemund, Paul W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and
patterns // Nature, 2006, 440, 7082, 297–302.
101.
Yuri L. Lyubchenkoa, Luda S. Shlyakhtenkoa and Toshio Ando Imaging of
nucleic acids with atomic force microscopy // Methods. Author manuscript; available
in PMC 2012 June 1.
102.
Dalip Sethi, R. P. Gandhi, Pradeep Kumar and Kailash Chand Gupta Chemical
strategies for immobilization of oligonucleotides // Biotechnol. J., 2009, 4, 1513–1529.
167
103.
Serge L. Beaucage Strategies in the Preparation of DNA Oligonucleotide Arrays
for Diagnostic Applications // Current Medicinal Chemistry, 2001, 8, 1213-1244.
104.
Majka J., Speck C. Analysis of protein-DNA interactions using surface plasmon
resonance // Adv Biochem Eng Biotechnol, 2007, 104, 13-36.
105.
Stockley PG,Persson B. Surface plasmon resonance assays of DNA-protein
interactions // Methods Mol Biol., 2009, 543, 653-69.
106.
Nguyen B., Tanious FA, Wilson WD Biosensor-surface plasmon resonance:
quantitative analysis of small molecule-nucleic acid interactions // Methods, 2007, 42,
2, 150-6.
107.
Voula Kodoyianni Label-free analysis of biomolecular interactions using SPR
imaging // BioTechniques, 2011, 50, 32-40.
108.
Wang J, Cai X, Rivas G, Shiraishi H, Farias PA, Dontha N. DNA electrochemical
biosensor for the detection of short DNA sequences related to the human
immunodeficiency virus // 1996, 1, 68, 15, 2629-34.
109.
Kelly M. Millan and Susan R. Mikkelsen Sequence-Selective Bios Hybridization
Indicators // Anal. Chem. 1993, 65, 2317-2323.
110.
H. Yang, A. Rys, C. K. McLaughlin and H. F. Sleiman Templated Ligand
Environments for the Selective Incorporation of Different Metals into DNA // Angew.
Chem., Int. Ed., 2009, 48, 9919–9923.
111.
H. Yang, F. Altvater, A. D. de Bruijn, C. K. McLaughlin, P. K. Lo and H. F.
Sleiman Chiral Metal–DNA Four-Arm Junctions and Metalated Nanotubular
Structures // Angew. Chem. Int. Ed., 2011, 50, 4620–4623.
112.
Serge L. Beaucage Strategies in the Preparation of DNA Oligonucleotide Arrays
for Diagnostic Applications // Current Medicinal Chemistry, 2001, 8, 1213-1244.
113.
Dalip Sethi1, R. P. Gandhi1, Pradeep Kumar1 and Kailash Chand Gupta
Chemical strategies for immobilization of oligonucleotides // Biotechnol. J. 2009, 4,
1513–1529.
114.
Strategies for Attaching Oligonucleotides to Solid Supports / 2005, 2010, and
2011 Integrated DNA Technologies.
115.
J. Vesenkaa,M. Gutholda,C.L. Tanga,D. Kellerb,E. Delainec,C. Bustamante
Substrate preparation for reliable imaging of DNA molecules with the scanning force
microscope // Ultramicroscopy, 1992, 42–44, 2, 1243–1249.
116.
James Vesenka, Chun Lin Tang, William Rees, Martin Guthold and Rebecca
Keller Circular DNA Molecules Imaged in Air by Scanning Force Microscopy, Carlos
168
Bustamante // Biochemistry, 1992, 31, 22-26.
117.
Helen G. Hansma and Daniel E. Laney DNA Binding to Mica Correlates with
Cationic Radius: Assay by Atomic Force Microscopy // Biophysical Journal, 1996, 70,
1933-1939.
118.
Jianping Zheng, Zhuang Li, Aiguo Wu, Hualan Zhou AFM studies of DNA
structures on mica in the presence of alkaline earth metal ions // Biophysical
Chemistry, 2003, 104, 37–43.
119.
Shin-ichi TANAKA, Masateru TANIGUCHI and Tomoji K AWAI Selective
Adsorption of DNA onto SiO2 Surface in SiO2 /SiH Pattern // Japanese Journal of
Applied Physics, 2004, 43, 10, 7346–7349.
120.
YuRi LYUBCHENKO, LYUDA SHLYAKHTENKO, RODNEY HARRINGTON,
PATRICK ODEN AND STUART LINDSAY Atomic force microscopy of long DNA:
Imaging in air and under water // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90, 6, 2137–2140.
121.
Jianwei Li, Chunli Bai, Chen Wang, Chuanfeng Zhu, Zhang Lin, Qing Li and
Enhua Cao A convenient method of aligning large DNA molecules on bare mica
surfaces for atomic force microscopy // Nucleic Acids Research, 1998, 26, 20, 4785–
4786.
122.
Zhaoxiang Deng and Chengde Mao DNA-Templated Fabrication of 1D Parallel
and 2D Crossed Metallic Nanowire Arrays // Nano Lett., 2003, 3, 11,1545–1548.
123.
Hiroki Yokota, James Sunwoo, Mehmet Sarikaya, Ger van den Engh, Ruedi
Aebersold Spin-Stretching of DNA and Protein Molecules for Detection by
Fluorescence and Atomic Force Microscopy // Anal. Chem., 1999, 71, 19, 4418–4422.
124.
Takashi Morii, Rika Mizuno, Hirotaka Haruta and Takao Okada AFM study of
the elasticity of DNA molecules // Thin Solid Films, 2004, 464-465, 456-458.
125.
Zoher Gueroui Immobilization and stretching of DNA molecules above a
lithographed surface // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2004, 33, 53–56.
126.
William A. Lyon, Michelle M. Fang, William E. Haskins, and Shuming Nie A
Dual-Beam Optical Microscope for Observation and Cleavage of Single DNA Molecules
// Anal. Chem., 1998, 70, 9, 1743–1748.
127.
Walter Reisnera, Niels B. Larsend , Henrik Flyvbjerg , Jonas O. Tegenfeldtc and
Anders Kristensen Directed self-organization of single DNA molecules in a nanoslit
via embedded nanopit arrays // PNAS, 2009, 106, 1, 79–84.
128.
Hannu Häkkinen The gold–sulfur interface at the nanoscale // NATURE
CHEMISTRY, 2012, 4, 443-455.
169
129.
YONGHAI SONG, ZHUANG LI, ZHIGUO LIU, GANG WEI, LI WANG, AND
LANLAN SUN Immobilization of DNA on 11-Mercaptoundecanoic Acid-Modified Gold
(111) Surface for Atomic Force Microscopy Imaging // MICROSCOPY RESEARCH
AND TECHNIQUE, 2005, 68, 59–64.
130.
Bradford J. Taft, Melissa A. Lapierre-Devlin and Shana O. Kelley An
intercalator film as a DNA–electrode interface // Chem. Commun., 2006, 962–964.
131.
Markus Ritzefeld and Norbert Sewald Real-Time Analysis of Specific Protein-
DNA Interactions with Surface Plasmon Resonance // Journal of Amino Acids, 2012,
2012, Article ID 816032, 19 pages.
132.
K. L. Jimenez-Monroy , A. Kick , K. Eersels , B. van Grinsven , P. Wagner , and
M. Mertig Surface plasmon resonance-based DNA microarrays: Comparison of thiol
and phosphorothioate modified oligonucleotides // Phys. Status Solidi A, 2013, 210, 5,
918–925
133.
Sze S.M. Physics of semiconductor devices / 2edn. Wiley, New York, 1981.
134.
Rhoderick E.H. Metal-semiconductor contacts / Clarendon Press, Oxford, 1978.
135.
Fonash S.J. A reevalution of the meaning of capacitance plots for Schottky-
barrier-type diodes // J. Appl. Phys., 1983, 54, 4, 1956-1975.
136.
C. Schroter, B. Roelfs, T. Solomun The interaction of dimethylsulfoxide with a
gold surface // Surface Science, 1997, 380, L441-L445.
137.
Y. W. Yang, and L. J. Fan High-Resolution XPS Study of Decanethiol on
Au(111): Single Sulfur-Gold Bonding Interaction // Langmuir, 2002, 18, 1157-1164.
138.
Marie-Caroline Bourg, Antonella Badia, and R. Bruce Lennox Gold-Sulfur
Bonding in 2D and 3D Self-Assembled Monolayers: XPS Characterization // J. Phys.
Chem. B, 2000, 104, 6562-6567.
139.
Tooru Yoshida, Kiyoshi Yamasaki, Shigemasa Sawada An X-Ray Photoelectron
Spectroscopic Study of 2-Mercaptobenzothiazole Metal Complexes // Bulletin of the
Chemical Society of Japan, 1979, 52, 10, 2908-2912.
140.
Reza Younesi, Poul Norby, and Tejs Vegge A New Look at the Stability of
Dimethyl Sulfoxide and Acetonitrile in Li-O2 Batteries // ECS Electrochemistry
Letters, 2014, 3, A15-A18.
141.
Caroline M. Whelan, Malcolm R. Smyth, Colin J. Barnes, Norman M.D. Brown,
Colin A. Anderson An XPS study of heterocyclic thiol self-assembly on Au (111) //
Applied Surface Science, 1998, 134, 144–158.
142.
Nora Graf, Eda Yegen, Thomas Gross, Andreas Lippitz, Wilfried Weigel, Simone
170
Krakert, Andreas Terfort, Wolfgang E.S. Unger XPS and NEXAFS studies of aliphatic
and aromatic amine species on functionalized surfaces // Surface Science, 2009, 603,
2849–2860.
143.
Florina Truica-Marasescu, Michael R. Wertheimer Nitrogen-Rich Plasma-
Polymer Films for Biomedical Applications // Plasma Process. Polym., 2008, 5, 44–57.
144.
A.P. Dementjev, A. de Graaf, M.C.M. van de Sanden, K.I. Maslakov, A.V.
Naumkina , A.A. Serov X-Ray photoelectron spectroscopy reference data for
dentification of the C3N4 phase in carbon nitrogen films // Diamond and Related
Materials, 2000, 9, 1904-907.
145.
David Briggs and Graham Beamson Primary and Secondary Oxygen-Induced
C1s Binding Energy Shifts in X-ray Photoelectron Spectroscopy of Polymers // Anal.
Chem., 1992, 64, 15, 1729-1736.
146.
Maurice E. Schwartz and Jurgen D. Switalski Binding Energy Shifts for Carbon,
Nitrogen, Oxygen, and Sulfur Core Electrons from Extended Hiickel Theory Valence
Molecular Orbital Potentials at the Nuclei // Journul of’the American Chemical
Society, 1972, 94, 18.
147.
Nora Graf, Andreas Lippitz, Thomas Gross, Falko Pippig, Andreas Holländer,
Wolfgang E. S. Unger Determination of accessible amino groups on surfaces by
chemical derivatization with 3,5-bis(trifluoromethyl) phenyl isothiocyanate and
XPS/NEXAFS analysis // Anal Bioanal Chem, 2010, 396, 725–738.
148.
H.-J. Freund, M. W. Roberts Surface chemistry of carbon dioxide // Surface
Science Reports, 1996, 25, 225-273.
149.
Palraj Kalimuthu, Palanisamy Kalimuthu, and S. Abraham John Leaflike
Structured Multilayer Assembly of Dimercaptothiadiazole on Gold Surface // J. Phys.
Chem. C, 2009, 113, 10176–10184.
150.
David G. Castner X-ray Photoelectron Spectroscopy Sulfur 2p Study of Organic
Thiol and Disulfide Binding Interactions with Gold Surfaces // Langmuir 1996, 12,
5083-5086.
151.
Jonathan R. I. Lee, Trevor M. Willey, Joakim Nilsson, Louis J. Terminello,
James J. De Yoreo, and Tony van Buuren Effect of Ring Substitution Position on the
Structural Conformation of Mercaptobenzoic Acid Self-Assembled Monolayers on
Au(111) // Langmuir, 2006, 22, 11134-11141.
152.
Mong-Tung Lee, Chen-Chan Hsueh, Michael S. Freund, and Gregory S.
Ferguson Air Oxidation of Self-Assembled Monolayers on Polycrystalline Gold: The
171
Role of the Gold Substrate // Langmuir, 1998, 14, 6419-6423.
153.
Anne-Sophie Duwez Exploiting electron spectroscopies to probe the structure
and organization of self-assembled monolayers: a review // Journal of Electron
Spectroscopy and Related Phenomena, 2004, 134, 97–138.
154.
F. Pippig, A. Hollander Fluram labeling of high density NH 2 surfaces // Applied
Surface Science, 2007, 253, 6817–6823.
155.
Z.-W. Deng, R. Souda XPS studies on silicon carbonitride films prepared by
sequential implantation of nitrogen and carbon into silicon // Diamond and Related
Materials, 2002, 11, 1676–1682.
156.
Hannu Häkkinen The gold–sulfur interface at the nanoscale // Nature
Chemistry, 2012, 4, 443-455.
157.
Henrik Gronbeck, Alessandro Curioni, and Wanda Andreoni Thiols and
Disulfides on the Au(111) Surface: The Headgroup-Gold Interaction // J. Am. Chem.
Soc. 2000, 122, 3839-3842.
158.
http://us.mt.com/us/en/home/applications/Application_Browse_Laboratory_
Analytics/Refractometry_concentration_tables_browse.html
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа