close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Объявление об электронных закупках способом запрос;pdf

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
БАСАЛАЕВА НАДЕЖДА ЛЬВОВНА
ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ГИПОФИЗАРНО-ТИРЕОИДНОЙ И
ГИПОФИЗАРНО-ГОНАДНОЙ СИСТЕМ САМОК-КРЫС ПРИ ВЛИЯНИИ
ИОД-ИНДУЦИРОВАННОЙ БЛОКАДЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
03.03.01 – физиология
Диссертация на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Научный консультант –
заслуженный деятель науки
РФ, доктор биологических наук,
профессор
А.П.Исаев
Челябинск - 2014
1
Список сокращений
АТФ – аденозинтрифосфорная кислота
БЩЖ – блокада щитовидной железы
ВДС – волновой дисперсионный спектрометр
ЙПТ – йод-позитивные точки
КЙ – калия йодид
ЛГ – лютеинизирующий гормон
МКАТ – моноклональные антитела
НИС – натрий-йодный симпортер
РМА – рентгеноспектральный микроанализ
РФА – рентген-флюоресцентный микроанализ
ПКАТ – поликлональные антитела
СеПТ – селен-позитивные точки
Т3 – трийодтиронин
Т4 – тироксин
ТТГ – тиреотропный гормон
ФСГ – фолликулостимулирующий гормон
ЭДС – энергодисперсионный спектрометр
% ЙПТ – процент йод-позитивных точек
% Се ПТ- процент селен-позитивных точек
2
СОДЕРЖАНИЕ…………………………………………………………………....3
Введение………………………………….…………………………......................9
Глава 1 Обзор литературы.
1.1.
Основные сведения о блокаде щитовидной железы при угрозе
радиационного заражения. Физиологические механизмы влияния йодида
калия на функциональную активность гипофизарно-тиреоидной системы.
Сравнительный
анализ
йод-содержащих
лекарственных
препаратов.…………………………………………………………………….…21
Физиологические
1.2.
функциональную
Взаимодействие
механизмы
активность
влияния
йодида
гипофизарно-гонадной
гипофизарно-тиреоидной
и
калия
на
системы.
гипофизарно-гонадных
систем………………………………………………………………………........33
1.3. Натрий – йодный симпортер щитовидной железы и влияние йодида
калия на его функцию..Натрий – йодный симпортер в экстратиреоидных
тканях.....................................................................................................................37
1.4. Влияние йодида калия на апоптоз……….…………………….....................................40
1.5. Характеристика микроэлементов йода и селена и их функциональная
взаимосвязь в животных организмах. Содержание йода и селена в тканях
людей и крыс……….………………………………………………………….....44
1.6. Современные методы микроанализа йода и селена в биологических
тканях. Теоретические основы ренгенфлюоресцентных методов (РФА и
РМА).
Виды
рентгеновских
спектрометров
и
их
сравнение
……….……………………………………………………………………………54
1.7.
Особенности
пробоподготовки
при
аналитическом
определении
йода и селена …………….……………………………………………………....59
1.8. Применение ренгенфлюоресцентных методов для определения йода и
селена в тканях человека и крыс………………………………….…………….62
Глава 2 Материалы и методы исследования
3
2.1.
Принципы
группировки
материала
(дизайн
исследования)……………………..……………………………….….………..65
Методы исследования………………….....……………………..…….…….....70
2.2. Взвешивание образцов...……………………………………………………70
2.3. Термометрия у крыс……….…………………….………………….………70
2.4. Цитологическое исследование вагинальных мазков самок – крыс…......71
2.5. Иммуноферментный анализ гормонального статуса экспериментальных
животных ……………………………………….………………………..……...71
2.6. Морфологические методы: морфологическое исследование тканевых
образцов (световая микроскопия) и иммуногистохимическое исследование
фрагментов органов …..………………………………………………………..74
2.7.
Количественный
микроанализ:
количественный
рентген-
флюоресцентный микроанализ и количественный рентгеноспектральный
микроанализ (РМА) образцов тканей с помощью спектрометра волновой
дисперсии ………………………………………………………………………..78
2.8. Статистические методы……………………………………………………82
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ
ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 3. Разработка метода дегидратации образцов биологических тканей с
помощью комбинации вакуумного и термального подсушивания……..……84
Глава 4. Определение содержания йода и селена в эндокринных органах крыс
с
помощью
количественного
рентгеноспектрального
микроанализа…...……………………………………………………………..…89
4
Глава 5. Определение содержания йода в некоторых эндокринных тканях
женщин и самок-крыс с помощью количественного рентгеноспектрального
микроанализа…………………………………………………………………….94
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЙОДИДА
КАЛИЯ НА ГИПОФИЗАРНО-ТИРЕОИДНУЮ И ГИПОФИЗАРНОГОНАДНУЮ СИСТЕМЫ САМОК-КРЫС ………………………………..99
Глава 6. Исследование воздействия йодида калия на гипофизарно –
тиреоидную и гипофизарно – гонадную системы самок – крыс при
однократном
введении
в
дозировке
4
мкг
/100
г
массы
животного……………………………………………...………………………..100
6.1. Исследование терморегуляции у самок крыс при однократном введении
йодида калия в дозировке 4 мкг /100 г массы животного…………….……102
6.2.
Исследование
функциональной
активности
тиреоидной
и
репродуктивной систем при однократном введении йодида калия в
дозировке 4 мкг /100 г массы животного………………...…………………102
6.3. Морфологическое исследование яичников самок-крыс при однократном
введении
йодида
калия
в
дозировке
4
мкг
/100
г
массы
животного………………………………………………………………………106
6.4. Определение маркеров апоптоза в щитовидных железах, гипофизах и
яичниках самок-крыс при однократном введении йодида калия в дозировке 4
мкг /100 г массы животного………………………………………………...…106
Глава 7. Исследование воздействия йодида калия на гипофизарно–
тиреоидную и гипофизарно–гонадную системы самок–крыс при однократном
введении в различных дозировках……………………………………………114
7.1. Исследование терморегуляции у самок крыс при при однократном
введении йодида калия в различных дозировках……………………………115
5
7.2. Определение гормонов гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно гонадной систем в сыворотке крови самок – крыс при однократном введении
йодида калия в различных дозировках………………………………………113
7.3. Определение экспрессии тиреотропного, фолликуло-стимулирующего и
лютеинизирующего гормонов в гипофизах самок–крыс при однократном
введении йодида калия в различных дозировках……………………………120
7.4. Определение экспрессии натрий-йодного симпортера в щитовидных
железах, гипофизах и яичниках самок–крыс при однократном введении
йодида калия в различных дозировках………………………………………124
7.5. Определение экспрессии каспазы 3 и каспазы 8 в щитовидных железах,
гипофизах и яичниках самок–крыс при однократном введении йодида калия в
различных дозировках………………………………………….……………...129
7.6. Количественный рентгенспектральный анализ содержания йода
в
щитовидных железах, гипофизах и яичниках самок–крыс при однократном
введении йодида калия в различных дозировках……………………………134
Глава
8.
Исследование
воздействия
йод-индуцированной
блокады
щитовидной железы на гипофизарно–тиреоидную и гипофизарно–гонадную
системы самок– крыс………………………………………………………..…145
8.1. Региональная точечная термометрия ………………………………………..….…146
8.2.Определение гормонов гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно
-
гонадной систем в сыворотке крови самок – крыс при йод-индуцированной
блокаде щитовидной железы……………………………………………….…151
8.3. Определение экспрессии тироидстимулирующего гормона в гипофизе
при йод-индуцированной блокаде щитовидной железы………………….…159
6
8.4. Определение экспрессии натрий-йодного симпортера в щитовидной
железе, гипофизе и яичниках при йод-индуцированной блокаде щитовидной
железы…………………………………………………………………………..159
8.5. Определение экспрессии каспазы 3 в щитовидной железе, гипофизе и
яичниках при йод-индуцированной блокаде щитовидной железы…………166
8.6. Количественный рентгеноспектральный микроанализ йода и селена в
щитовидной железе и гипофизе самок-крыс при йод-индуцированной
блокаде щитовидной железы…………………………………………………..173
ЗАКЛЮЧЕНИЕ………….…………………..………………………...……...184
Разработка метода дегидратации образцов биологических тканей с помощью
комбинации вакуумного и термального подсушивания……………………..184
Определение содержания йода и селена в эндокринных органах крыс с
помощью количественного рентгенспектрального микроанализа………….187
Количественный рентгенспектральный микроанализ содержания йода в
щитовидных
железах,
гипофизах
и
яичниках
женщин
и
самок
–
крыс…………………………………………………………………………...…189
Физиологические
механизмы
влияния
йод-индуцированной
блокады
щитовидной железы на гипофизарно-тиреоидную и гипофзарно-гонадную
системы самок-крыс……………………………………………………………191
Физиологические механизмы влияния йодида калия на гипофизарно–
тиреоидную
и
однократном
гипофизарно–гонадную
введении
в
дозировке
системы
4
самок
мкг
–
/100
крыс
г
при
массы
животного………………………………………………………………….…...194
Физиологические механизмы влияния йодида калия на гипофизарно–
тиреоидную
однократном
и
гипофизарно–гонадную
введении
системы
в
самок
–
крыс
при
различных
дозировках………………………………………………………………………196
7
Физиологические
механизмы
влияния
йод-индуцированной
блокады
щитовидной железы на гипофизарно–тиреоидную и гипофизарно–гонадную
системы самок – крыс ……………………………………………………...….209
ВЫВОДЫ….……………………………………………………………...…....226
Практическое использование полученных результатов……….……....….....230
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………………...231
8
ВВЕДЕНИЕ
В связи с аварией на атомной станции в г. Фукусима в 2011 году (Япония)
вновь возник интерес к изучению патогенетических механизмов влияния на
организмы
человека
и
животных
основного
средства
блокировки
щитовидной железы (БЩЖ) при угрозе радиационного заражения – калия
йодида (КЙ) (Hänscheid H,2011).
Основную опасность для биологических организмов при авариях на
атомных электростанциях или после ядерных взрывов представляют
радиоизотопы
(в
основном
131
I).
Даже
минимальное
количество
радиоактивного йода при попадании в щитовидную железу может
обеспечить дозу облучения (свыше 25 рад), приводящую к малигнизации
органа (Meck RA, 1985).
Эффективность КЙ в качестве средства профилактики поражения
щитовидной
железы
физиологическим
обусловлена
торможением
эффектом
функции
Вольфа–Чайкова
щитовидной
железы
при
воздействии высоких концентраций йодидов в крови. По общепринятой
версии КЙ насыщает тиреоциты стабильным нерадиоактивным йодом, и
радиоактивные изотопы не поглощаются щитовидной железой.(Dayem
M, 2006 )..
Исследования прошлых лет не выявили серьезных побочных эффектов
йодистого
калия.
По
заключениям
многочисленных
комитетов
и
организаций, исследующих данный вопрос, основное осложнение при
назначении КЙ – гипертиреоз (йод – Базедов), который наблюдается у людей
с гиперчувствительностью к йоду (International basic safety standards for
protection against ionizing radiation and for the safety of radiation sources., 1996).
Но при появлении как клинических, так и экспериментальных данных о
роли избытка йода в возникновении и прогрессировании рака щитовидной
железы (Kanno J, 1992), применение БЩЖ было ограничено. Например, у
9
людей после 40 – 45 лет БЩЖ проводится или после лучевой нагрузки
свыше 500 Гр (Guidance Potassium Iodide as a Thyroid Blocking Agent in
Radiation
Emergencies
U.S.,
2001)
или
не
проводится
вообще
(Recommendation of the German Commission on Radiological Protection (Use of
Iodine Tablets for Thyroid Blocking in the Event of a Nuclear Accident), 2011).
Не теряет актуальности и изучение возможных побочных эффектов БЩЖ
в экстратиреоидных органах. По заключению FDA (Управление по контролю
за продуктами и лекарствами (США)) использование КЙ в Польше после
аварии на Чернобыльской АЭС, когда около 10 500 000 детей в возрасте до
16 лет и 7 миллионов взрослых получили по крайней мере, одну дозу КЙ,
дало полезную информацию о его безопасности и переносимости в общей
популяции: наблюдавшиеся побочные эффекты у детей и взрослых были
мягкие и не клинически значимые (Guidance Potassium Iodide as a Thyroid
Blocking Agent in Radiation. Emergencies U.S. Department of Health and Human
Services Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research
(CDER),
2001)
(желудочно-кишечные
расстройства
у
детей,
сыпь,
аллергические реакции у взрослых с гиперчувствительностью к йоду
(Nauman J, 1993).
Однако по мнению некоторых экспертов, возможные побочные эффекты
КЙ систематически не исследованы до сих пор, хотя исследования по этой
теме, казалось бы, должны были получить развитие после аварии на
Чернобыльской АЭС. Авторы считают, что при научных исследованиях
побочные эффекты редки и, следовательно, доказательная база слаба (L.
Spallek, 2011), а оценка неблагоприятных последствий БЩЖ опирается на
косвенные данные из смежных областей (Bacher K, 2002, Meck RA, 1985 ).
Например,
общепризнано,
что
гипотиреоз
связан
с
нарушениями
менструального цикла (ановуляцией) (Poppe K. 2007). Однако результаты
исследования влияния антитиреоидных препаратов на репродуктивную
10
функцию разноречивы – имеются данные как о наличии негативного
воздействия (Hapon MB. , 2003, Hapon MB.2010), так и о безопасности
антитиреоидной терапии (Armada-Dias L. 2001). Аналогичные вопросы
вызывает и влияние йод-индуцированной блокады щитовидной железы на
репродуктивную функцию.
Все вышеизложенные проблемы применения йодида калия при угрозе
радиоактивного поражения тесно связаны с нерешенными до сих пор
вопросами физиологических механизмов влияния йод-индуцированной
БЩЖ.
При йод – индуцированной блокаде щитовидной железы активно
исследовались изменения содержания йода в щитовидной железе (Hänscheid
H,2011), однако эти данные опирались, в основном, на косвенные показатели
– исследования проводились чаще всего с помощью радиоизотопных
методов, с ориентировкой на скорость накопления элемента. Однако сам
Wolff J. в 1969 году, в обзорной статье, посвященной двадцатилетию
исследований
эффекта
Вольфа-Чайкова,
отмечал,
что
достоверность
гипотезам о физиологических механизмах влияния йода на щитовидную
железу может дать только непосредственное определение йода в щитовидной
железе. Он же отмечал трудности при аналитическом определении йода,
связанные с его малой концентрацией в биологических объектах.
По тем же причинам не уделялось особого внимания изменениям
содержания йода в экстратиреоидных органах. Хотя в литературе имелись
сведения о накоплении йода в экстратиреоидных органах при йодной
нагрузке, например в гипофизе, надпочечниках и половых железах так же
может накапливаться йодид, и, по мнению некоторых авторов, эти ткани
могут быть легко повреждены радиоактивным йодом (Trunnell J.B., 1950 ) .
Взаимосвязь йода и селена определяется ролью селена в синтезе,
метаболизме и активации тиреоидных гормонов - как компонента дейодиназ
11
и глутатионпероксидаз (Ko.hrle J., 2005). Однако сложности в определении
содержания селена, как и йода, определяются их малыми концентрациями в
биологических тканях.
В последние годы с помощью новых аналитических методов уточняются
концентрации йода в некоторых органах. Например, E. Andrasi (2007) с
помощью индуктивно связанной плазменной масс-спектрометрии определил,
что содержание йода в коре головного мозга двукратно отличается от уровня
йода в подкорковых структурах.
Количественный рентгеноспектральный микроанализ (РМА) образцов
тканей с помощью спектрометра волновой дисперсии является одним из
наиболее чувствительных современных методов микроанализа, однако
требует дегидратации образцов.
Традиционно для дегидратации использовалась длительное термальное
подсушивание, несмотря на возможные потери йода при пробоподготовке
(20 – 60 % потеря йода в биологических субстратах при предварительной
термической обработке образцов) (Покровский А.А., 1981). Оптимизация
пробоподготовки биологических препаратов для РМА могла бы позволить
применить этот метод для исследования содержания йода и селена как в
щитовидной железе, так и в экстратиреоидных органах.
Сопоставление функциональных изменений эндокринных органов при
йод-индуцированной блокаде щитовидной железы с количественным
микроанализом внутриорганного содержания йода и селена возможно,
позволило бы уточнить некоторые физиологические механизмы йодингдуцированной блокады щитовидной железы.
В литературе имеются данные о том, что йодиды стимулируют процессы
апоптоза в щитовидной железе (LangerR.,2003; Lenvann P.,2006; Burikhanov
RB, 2000; Matsuzaki S., 2000). Однако физиологические механизмы действия
йодидов на апоптоз в щитовидной железе остаются дискутабельными.
12
Разнятся данные и по путям йодиндуцированного апоптоза (Mutaku J F,
2002).
Особую
актуальность
этому
аспекту
физиологического
механизма
действия йодидов дали исследования, посвященные влиянию йода на апоптоз
в экстратиреоидных малигнизированных тканях, например, в тканях
молочной железы (Shrivastava, A., 2006.) и легких (Zhang L., 2003). Но
единого мнения по поводу механизма воздействия йода на раковые клетки
так же отсутствует. Shrivastava A, 2006 считает, что индуцированный йодом
апоптоз в тканях рака молочной железы каспазо – независим, и развивается
по митохондриальному пути. Zhang L., 2003 не выявил изменения каспаз в
генетически модифицированных тканях рака легких при инкубации с
йодидом калия.
Таким образом, физиологические механизмы влияния йодида калия на
апоптоз
как
в
тканях
щитовидной
железы,
так
и
в
тканях
экстратиреоидальных органов до сих пор остается дискутабельным.
Внимание исследователей было посвящено исследованию культур раковых
клеток экстратиреоидных органов. Однако данные о воздействии йодидов на
апоптоз в физиологических тканях, особенно экстратиреоидной локализации
и in vivo, очень скудны.
Указанные предпосылки послужили основанием для целенаправленного
исследования физиологического механизма влияния йод - индуцированной
блокады щитовидной железы на функциональные параметры гипофизарнотиреоидной и гипофизарно-гонадной систем с изучением внутриорганных
йода, селена и маркеров апоптоза.
Целью
исследования
функционального
явилось
состояния
изучение
в
эксперименте
гипофизарно-тиреоидной
и
гипофизарно-гонадной систем при влиянии йод-индуцированной
13
блокады щитовидной железы с определением интраорганного
содержания йода, селена и маркеров апоптоза.
Задачи исследования:
1.
Разработать методику пробоподготовки биологических тканей ,
позволяющую применить для исследования микроэлементов
рентгенспектральный микроанализ
2.
Определить с помощью рентгеспектрального микроанализа
содержание йода и селена в эндокринных органах у крыс
(щитовидная
железа,
гипофиз,
яичники,
семенники,
гипоталамус, поджелудочная железа)
3.
Определить с помощью рентгеспектрального микроанализа
содержание йода в щитовидной железе, гипофизе и яичниках у
женщин и сравнить их с показателями у самок – крыс.
4.
Выявить
особенности
функционального
состояния
гипофизарно–тиреоидной (ТТГ, Т3 и Т4 в крови) и гипофизарно–
репродуктивной систем (ФСГ, ЛГ, эстрадиол, прогестерон в
крови) и экспрессию тканевого натрий – йодного симпортера в
щитовидной железе, гипофизе и яичниках самок – крыс при
влиянии однократного применения йодида калия в дозировке 4
мкг/100г веса животного.
5.
Исследовать
возможность
воздействия
йодида
калия
в
дозировке 4 мкг/100 г веса животного на проапоптические
факторы (каспаза 3, 8 и Bcl) в щитовидной железе, гипофизе и
яичниках у самок – крыс.
6.
Изучить особенности влияния однократного применения йодида
калия при различных дозировках (1, 4, 8 и 25 мкг/100г веса
животного)
на
изучаемые
функциональные
параметры
гипофизарно – тиреоидной и гипофизарно – репродуктивной
систем самок – крыс (с исследованием экспрессии ТТГ, ФСГ и
14
ЛГ в гипофизе), уровни экспрессии каспаз и натрий – йодного
симпортера в щитовидной железе, гипофизе и яичниках.
7.
Определить с помощью рентгенспектрального анализа уровень
интраорганного йода
в щитовидной железе, гипофизе и
яичниках;
значимость
выяснить
дозозависимости
для
физиологических механизмов действия однократных доз йодида
калия.
8.
Изучить
динамические
особенности
влияния
йод-
индуцированной блокады щитовидной железы при дозе йодида
калия 8 мкг/100г веса животного на функциональные параметры
гипофизарно – тиреоидной и гипофизарно – репродуктивной
систем самок – крыс (с исследованием изменений экспрессии
ТТГ в гипофизе), уровни экспрессии каспазы 3 и натриййодного симпортера в щитовидной железе, гипофизе и
яичниках.
9.
Определить с помощью рентгенспектрального анализа уровень
интраорганного йода и селена (щитовидная железа, гипофиз);
выяснить роль интраорганного йода и селена в физиологических
механизмах йод-индуцированной блокады щитовидной железы.
Научная новизна исследования.
Впервые
разработана
методика
пробоподготовки
биологических
субстратов для РМА (комбинация вакуумной и термальной сушки)
позволяющая минимизировать потерю микроэлементов в исследуемых
тканях (патент № 2366952, 2009).
Впервые проведено с помощью РМА определение уровня йода и селена в
щитовидной железе и большинстве эндокринных органов крыс; в
щитовидной железе, гипофизах и яичниках женщин. Сформулировано
понятие «базисного уровня» йода - уровня йода в йод-позитивных точках
большинства экстратиреоидных эндокринных органов крыс. Выявлено, что
15
видовое различие в содержании йода характерно не только для щитовидных
желез, но и для гипофизов и яичников.
Впервые
проведена
дифференциация
физиологических
механизмов
воздействия «малых фармакологических доз» йодидов в зависимости от
соотношения их с «базисным уровнем» йода в щитовидной железе: при дозе,
соответствующей «базисному уровню» щитовидная железа накапливает йод,
при превышении – теряет.
Впервые выявлено, что в физиологических механизмах воздействия
йодида калия активно участвует гипофиз: выявлено, что при дозах йодида
калия, превышающих уровень йода в щитовидной железе, происходит
накопление йода в йодпозитивных точках гипофиза. Этот процесс
сопровождается изменением функциональной активности гипофиза как в
отношении тиреоидной, так и гонадной систем: снижается уровень ТТГ (как
в крови, так и экспрессии в гипофизе) и повышается уровень ФСГ и ЛГ (как
в крови, так и экспрессии в гипофизе).
Впервые выявлено, что гипофиз играет значимую роль в физиологических
механизмах воздействия йод-индуцированной блокады щитовидной железы:
на фоне нормальных показателей тиреоидных гормонов происходит рост
уровня йода в йод-позитивных точках гипофиза, экспрессии НИС,
экспрессии каспазы 3 и снижение экспрессии ТТГ. Эти изменения
наблюдаются на день раньше уменьшения уровня йода, роста экспрессии
НИС и экспрессии каспаз в щитовидной железе.
Впервые установлено, что «критический уровень йода» в щитовидной
железе, при достижении которого начинается ребаунд-эффект, соответствует
«базисному уровню йода». Скачкообразный рост экспрессии ТТГ в гипофизе
за день до ребаунд-эффекта синхронен с падением йода в щитовидной
железе до «базисного уровня».
Впервые выявлена взаимосвязь уровня интраорганного йода и экспрессии
каспаз, установлена органозависимость направления этой взаимосвязи – в
16
щитовидной железе - обратная, в гипофизе - прямая. Впервые выявлена
обратная взаимосвязь уровней селена и экспрессии каспаз в гипофизе.
Впервые выявлено, что йод – индуцированная блокада щитовидной
железы оказывает тормозящее влияние на гипофизарно - гонадную системы
самок – крыс с участием активации каспазозависимого апоптоза в яичниках.
Теоретическая и практическая значимость
В теоретическом аспекте нами была подтверждена гипотеза, что при
блокаде щитовидной железы интратиреоидальный йод снижается до
критического уровня. Было установлено, что «критический уровень
снижения интратиреоидального йода» соответствует «базисному уровню»
йода в йод-позитивных точках экстратиреоидных эндокринных органов
самок-крыс.
По
результатам
дозозависимости
исследования
влияния
малых
была
выдвинута
фармакологических
гипотеза
доз
о
йодидов:
накопление щитовидной железой йода происходит при дозировках, не
превышающих «базисный уровень». При увеличении дозировок щитовидная
железа йод не накапливает, однако йод аккумулируется в йод-позитивных
точках гипофиза: этот процесс сопровождается активацией местного
каспазозависимого апоптоза и снижением функциональной активности
гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно – гонадной систем самок-крыс.
Были выявлены изменения содержания селена в гипофизе при йодиндуцированной блокаде щитовидной железы: было установлено, что
снижению уровня селена в селен-позитивных точках гипофиза в пределах
чувствительности РМА соответствуют максимальные подъемы экспрессии
гипофизарных каспаз самок-крыс.
Было установлено, что у женщин по сравнению с самками - крысами
уровень йода выше как в щитовидной железе, так и в яичниках и гипофизах,
видозависимо и соотношение уровней йода в вышеназванных органах.
17
Полученные результаты необходимо учитывать при экстраполяции «крыса –
человек» в исследованиях, посвященных воздействию йода на гипофизаро тиреоидную и гипофизарно-гонадную системы.
В практическом аспекте полученные знания физиологических механизмов
йод-индуцированной блокады щитовидной железы обосновывают новые
возможности оптимизации доз йодида калия, применяемых
при угрозе
радиационного заражения и оценки возможных осложнений со стороны
репродуктивной
системы
при
проведении
вышеназванных
мер
профилактики.
Предложенный нами метод пробоподготовки биосубстратов для РМА дает
новые
возможности
исследования
микроэлементов
с
минимальными
потерями в процессе аналитических процедур и повышением точности
определения микроэлементов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Уровень
йода в йод-позитивных
точках
(РМА) большинства
экстратиреоидных эндокринных органов одинаков (« базисный уровень») и
видоспецифичен. При блокаде щитовидной железы критический уровень
снижения йода соответствует « базисному уровню»
2. Механизмы воздействия йодида калия на щитовидную железу, гипофиз и
яичники органоспецифичны и дозозависимы.
При воздействии доз йодидов, аналогичных «базисному уровню»
щитовидная железа накапливает йод, при увеличении дозы – теряет.
Гипофиз при повышении дозы свыше «базисного уровня» аккумулирует
йод в ЙПТ. В яичниках накопления йода не выявлено.
3. Процесс аккумуляции йода в ЙПТ гипофиза сопровождается снижением
функциональной
активности
как
гипофизарно-тиреоидной,
так
и
гипофизарно-гонадной систем.
4. Уровень интраорганного йода взаимосвязан с каспазо-зависимым
апоптозом: в щитовидной железе эта зависимость обратная, в гипофизе –
18
прямая. Максимальный рост каспаз в гипофизе сопровождается снижением
уровня селена в СеПТ гипофиза.
Внедрение результатов исследования
Методика
пробоподготовки
биологических
субстратов
для
РМА
(комбинация вакуумной и термальной сушки) позволяющая минимизировать
потерю микроэлементов в исследуемых тканях внедрена в работу научноисследовательского
центра
«Нанотехнологии»
Южно-Уральского
государственного университета (заведующий докт. хим. наук Авдин В.В.) и
лаборатории электронной микроскопии Южно-Уральского государственного
университета (заведующий кафедрой – профессор, докт. техн. наук Михайлов
Г.Г.). Положительные результаты внедрения методов, соответственно, 63,1%
и 95,0%.
Результаты диссертации используются в научной и педагогической
практике: лекционном курсе и на практических занятиях кафедры анатомии и
гистологии и кафедры физиологии и фармакологии животных и человека
Уральской академии ветеринарной медицины Минсельхоза России ( Троицк).
Апробация работы
Основные положения диссертации представлены на:
XXΙΙ
Российской
конференции
по
электронной
микроскопии,
г.Черноголовка, 2–3 июня 2008г.
Юбилейной научно-практической конференции к 50-летию факультета
ветеринарной медицины АГАУ, 100-летию со дня рождения И.С.
Ржанициной, г.Барнаул, 11 октября 2012.
19
Международной
научно-практической
интернет-конференции,
посвященной 65-летию кафедры паразитологии Ставропольского ГАУ
«Современные тенденции в ветеринарной медицине», Ставрополь, 21
ноября 2013 г.
5 интернациональном конгрессе федерации европейского общества
микроэлементологов «Fifth International Congress of FESTEM», Авиньон,
Франция, 22–24мая 2013 г.
Структура и объем диссертации состоит из введения, 8 глав, заключения,
выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 265
страницах,
содержат
13
таблиц,
иллюстрированы
45
рисунками.
Библиография включает 271 источников, из них 232 зарубежных.
20
ГЛАВА
1.
ОБЗОР
ЛИТЕРАТУРЫ.
ВЛИЯНИЕ
ЙОД-
ИНДУЦИРОВАННОЙ БЛОКАДЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ НА
ГИПОФИЗАРНО-ТИРЕОИДНУЮ
СИСТЕМЫ:
ВОПРОСЫ
И
ГИПОФИЗАРНО-ГОНАДНЫЕ
ЭТИОЛОГИИ,
ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ
МЕХАНИЗМОВ, РОЛИ МИКРОЭЛЕМЕНТОВ ЙОДА И СЕЛЕНА И
ПРИМЕНЕНИЯ РЕНГЕНСПЕКТРАЛЬНОГО АНАЛИЗА ПРИ ИХ
ОПРЕДЕЛЕНИИ
1.1.
Основные сведения о блокаде щитовидной железы при угрозе
радиационного
заражения.
Физиологические
механизмы
влияния
йодида калия на функциональную активность гипофизарно-тиреоидной
системы.
Сравнительный
анализ
йод-содержащих
лекарственных
препаратов.
Основные сведения о
блокаде щитовидной железы при угрозе
радиационного заражения
Авария на Чернобыльской АЭС показала, насколько серьезную угрозу для
здоровья населения представляет подобная чрезвычайная ситуация. Одно из
её тяжелых последствий – значительный рост больных раком щитовидной
железы, особенно среди детей (Шилин Д.Е., 2000). По мнению экспертов,
причиной явилось избирательное накопление изотопов радиоактивного йода
в ткани щитовидной железы (Kazakov V.S. et al.,1992). Из-за высоких
уровней загрязнения этими изотопами некоторых территорий специалисты
МАГАТЭ характеризовали первую неделю после Чернобыльской аварии как
«период йодного удара».
Особенностью радиационных аварий на АЭС или других предприятиях,
имеющих ядерно-энергетические установки и использующих обогащенный
уран-235, является наличие в выбросе, наряду с другими бета- и гаммаизлучателями, радиоактивных изотопов йода (131I,
132
I ,
133
I ,
135
I),
составляющих 23% от общей активности продуктов атомного реактора. Эти
21
изотопы
представляют наибольшую опасность в течение первого месяца,
хотя максимально долгоживущий из них
131
I имеет период полураспада
около 8 суток (Verger P.,2001).
Радиоактивные изотопы йода могут поступать в организм через органы
дыхания, пищеварения, раневые и ожоговые поверхности. В ранний период
после аварии опасность представляет ингаляционный путь, при котором
радиоизотопы быстрее, чем при пероральном, проникают в кровь и в течение
первых
суток
максимально
накапливаются
в
щитовидной
железе.
Избирательная и быстрая концентрация радиоизотопов йода в щитовидной
железе обусловливает относительно высокие дозы облучения как самой
железы, так и всего организма (Ron E. et al., 1995).
По мнению некоторых исследователей, большее влияние имеет так же
поступление радиоактивного йода с молоком от животных, выпасаемых на
загрязнённых пастбищах, и с загрязнёнными овощами и фруктами (Buglova
E. et al.,1997).
В условиях дефицита йода щитовидная железа обладает повышенной
способностью накапливать радиоактивный йод: в эксперименте при 50%
дефиците йода в рационе животных (75 мкг/сут.) уровень накопления
радиоизотопов возрастает в 2,7 раза. Следовательно, радиационные
поражения щитовидной железы в таких условиях будут протекать более
тяжело и проявляться в более ранние сроки. Этот вывод был подтвержден
клиническими исследованиями (Шилин Д.Е., 1994).
Величина поглощённой дозы зависит также от функционального состояния
щитовидной железы:
нормально функционирующая щитовидная железа
взрослого человека накапливает около 30%; при гиперфункции щитовидной
железы накопление происходит быстрее и достигает 50%; при гипофункции
– медленнее и в меньшем количестве (до 15 – 25% ) (Герасимов Г.А.. 2003).
22
Накопление радиоизотопов йода зависит от возраста: у детей вследствие
малых размеров железы и её повышенной функциональной активности
поглощённые дозы в несколько раз выше, чем у взрослых (Jacob P. Et al.,
1998).
Поглощение радиоактивного йода щитовидной железой беременной
женщины на 35-50 % выше, чем у женщины вне беременности.
Радиоактивный йод с высокой скоростью переходит из организма матери к
плоду через плацентарный барьер; накопление радиоактивного йода в
щитовидной железе плода начинается с 12-13 недели беременности и
достигает 50 – 60 % от количества, поступившего в организм беременной.
Критический возраст для накопления радиоактивного йода в щитовидной
железе плода - 5 – 7 месяцы беременности.
У новорождённых и детей первого года жизни на единицу поступившей
активности поглощённые дозы в 25 раз выше, чем у взрослого человека, в
связи с меньшей массой щитовидной железы. Особую опасность для
новорожденных
представляет
ингаляционный
путь
радиоактивного йода в связи с большей частотой дыхания.
поступления
У кормящей
женщины в течение 24 часов в молоко переходит 1/4 часть поступившего
радионуклида йода, поэтому лактация является как одним из механизмов
выведения радиоактивного йода из организма женщины, так и фактором
дополнительной опасности для ребёнка (Morreale de Escobar G , 1990)
Таким образом, радиочувствительность щитовидной железы относительно
невелика у взрослых людей, минимальна у пожилых и наиболее высока у
детей младенческого возраста (от 0 до 3 лет) (Герасимов Г.А.. 2003).
Основными последствиями облучения щитовидной железы являются
детерминированные
эффекты
(гипотиреоз
и
острый
тиреоидит)
и
стохастические эффекты (рак щитовидной железы и доброкачественные
узлы) (Kazakov V.S. et al.,1992). Проблема рака щитовидной железы остаётся
23
актуальной и более чем через 20 лет после аварии, так как в период 20-25 лет
после облучения возможен максимальный рост числа заболевших, после чего
наступает спад.
По мнению специалистов, число заболевших раком щитовидной железы
могло было быть уменьшено при проведении своевременной йодной
профилактики - применения препаратов стабильного йода в достаточно
больших дозах. Этот метод фармакологической защиты щитовидной железы
заключается в торможении или временном прекращении её функции
образования гормонов до начала поступления радиоактивного йода.
Возникающая при этом блокада железы препятствует накоплению в ней
радиоактивного
йода
и
дальнейшего
его
участия
в
синтезе
тиреоидных гормонов (Nauman J., Wolff J.,1993).
Наибольший защитный эффект достигается при использовании препаратов
стабильного йода за 68 часов до угрозы радиоактивного поражения. Через 2
часа степень защиты составляет 80 %, через 8 часов 40 %; через 24 часа
около 7 %. Таким образом, опоздание в проведении йодной профилактики
больше чем на 6 часов после выпадения радиоактивных осадков резко
снижает её эффективность, а через сутки она сомнительна по своей
целесообразности (Rubery E.D., 1990)
Однако
по
мнению
экспертов,
йодная
профилактика
должна
использоваться не только для уменьшения последствий ингаляционного
поступления радиоактивного йода в организм, но и перорального – с пищей,
водой, молоком и молочными продуктами, загрязнёнными радионуклидами.
Риск облучения от употребления таких продуктов и воды может сохраняться
в течение 2-3 недель (Buglova E. et al.,1997).
Риск негативных последствий от блокады щитовидной железы различен в
разных возрастных группах населения, как и риск развития у них
радиационно индуцированной патологии щитовидной железы. Поэтому в
24
рекомендациях по йодной профилактике учитывается каждая группа
населения в отдельности (Guidance Potassium Iodide as a Thyroid Blocking
Agent in Radiation Emergencies U.S. Department of Health and Human Services
Food and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER)
November 2001Procedural).
По данным исследователей, последствия йодной профилактики так же
различаются в зависимости от возраста. У детей до 2 лет в связи с
интенсивным развитием головного мозга при блокаде щитовидной железы
возможен риск задержки интеллектуального и физического развития. У детей
в возрасте от 3 до 12 лет последствия проявляются в виде задержки
физического развития, которая прекращается с восстановлением функции
щитовидной железы (Calacura F. et al., 1995)
У взрослых репродуктивного возраста (моложе 45 лет) риск тяжёлых
радиационных поражений щитовидной железы (рак, гипотиреоз) невелик, а у
лиц старше 45 лет риск радиационно индуцированного рака щитовидной
железы практически равен нулю. Однако у вышеназванного контингента
возрастает риск последствий фармакологической блокады щитовидной
железы в связи с ростом её патологии.
В России в качестве препарата стабильного йода применяют йодистый
калий (Герасимов Г.А.. 2003). Считается, что своевременный приём
препарата обеспечивает снижение дозы облучения щитовидной железы на 97
– 99 %, а всего организма – в десятки раз . Разработаны стабилизированные
таблетки
йодистого
калия
в
дозировках,
учитывающих
возрастные
потребности: 0,125 г для взрослых и детей старше 2 лет; 0,04 г для детей до
2 лет. В настоящее время нет убедительных данных, подтверждающих
безопасность длительного приёма больших доз йодида калия, в связи с чем
рекомендуют его однократное применение (некоторые авторы рекомендуют
– до 10 дней, но в случаях необходимости многократного приёма препаратов
25
стабильного йода дозировка должна быть дифференцированной для разных
групп населения).
Однако по заключению FDA (Управление по контролю за продуктами и
лекарствами (США)) (Guidance Potassium Iodide as a Thyroid Blocking Agent
in Radiation. Emergencies U.S. Department of Health and Human Services Food
and Drug Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER), 2001
) использование йодида калия в Польше после аварии на Чернобыльской
АЭС дало информацию о его безопасности и переносимости в общей
популяции (около 10 500 000 детей в возрасте до 16 лет и 7 миллионов
взрослых получили по крайней мере, одну дозу KI).
По мнению комиссии FDA , наблюдающиеся побочные эффекты у детей и
взрослых были, как правило, мягкие и не клинически значимые. Были
выявлены желудочно-кишечные расстройства у детей (до 2 %) и сыпь (менее
1 % детей и взрослых). У двух взрослых с гиперчувствительностью к йоду
наблюдались аллергические реакции (Nauman J, 1993).
Побочные эффекты применения КЙ со стороны тиреоидной системы
отмечались в виде йод – индуцированного тиреотоксикоза, который чаще
встречался у пожилых людей, но после многократного приема КЙ. (Rubery
ED., 1990). Вопрос, сколько раз должен быть применен КЙ для развития
тиреотоксикоза, в заключении комиссии не упоминался. Однако людям с
многоузловым зобом, болезнью Грейвса и аутоиммунным тиреоидитом было
рекомендовано ограничить прием йодидов несколькими днями.
У 0,37 % (12 из 3214) новорожденных, получивших КЙ, в течение месяца
после приема наблюдался переходный гипотиреоз (Bongers-Schokking JJ,
2000; Fisher DA. , 2000; Calaciura F, 1995), в связи с чем комиссия FDA в
2001 году рекомендовала снизить дозы KI для новорожденных, младенцев и
детей с 65 до 13 мг. Однако в заключении комиссии не были приведены
26
какие – либо экспериментальные обоснования для снижения дозы ЙК для
детей.
За последнее десятилетие
радиационного
поражения
изложенные выше принципы профилактики
щитовидной
железы
начали
активно
критиковаться: появились наблюдения о том, что повышенное потребление
йода может увеличить частоту тиреоидита у людей (Rose NR, 2002; Duntas
LH.,
2008).
Эти
данные
были
подтверждены
многочисленными
экспериментами (Teng XC, 2008; Marković L.,2010).
Некоторые исследователи считают, что оптимизация доз йодидов при
БЩЖ может повлиять на наличие и выраженность побочных эффектов.
Экспериментальные данные свидетельствуют о дозозависимости изменений
щитовидной железы при воздействии фармакологических доз КЙ. Так, по
данным Marković L (2010) реакция тиреоидной системы крыс на введение
225 и 675мкг / г веса животного в течение 26 дней значительно отличалась
выраженностью воспалительных изменений в щитовидной железе.
Другие исследователи активно предлагают использовать при угрозе
радиационного заражения антириреоидные препараты (Harris C.A. 2009;
Abraham P.,2005; Wolff J., 1998;).
Основные лекарственные средства, блокирующие синтез гормонов
щитовидной железы
- перхлорат натрия и тиоамиды (метимазол и
пропилтиоурацил) отличаются разными механизмами действия. Перхлорат
натрия
ингибирует
захват
йода
щитовидной
железой,
тиоамиды
воздействуют на синтез и дейодирование тиреоидных гормонов, не влияя на
транспорт
йодидов.
Основной
принцип
их
действия
–
принцип
конкурентного замещения: перхлорат натрия действует на уровне Na/I –
симпортера, а тионамиды – на уровне тирозильных остатков.
Несмотря на то, что эти соединения являются наиболее популярными
препаратами при лечении гипертиреоза, детальный механизм их действия до
27
сих пор неизвестен (Roy G., 2006). Некоторые исследователи считали
Halmi N.S.(1960), что действие тионциата, перхлората и больших доз
йодидов имеют общие черты – все три аниона ингибируют количество йода в
щитовидной железе в основном через снижение однонаправленного клиренса
йода из плазмы крови, и в меньшей степени за счет повышения скорости
выхода йода из щитовидной железы.
Каждое из этих лекарственных средств рекомендуется как альтернатива
йодистому
калию
для
блокады
щитовидной
железы
при
угрозе
радиоактивного заражения (при непереносимости препаратов йода или в
качестве аналога) (Hänscheid H., 2011; Tochner Z., 2008).)
антитиреоидные препараты токсичны (Trotter W.R., 1962):
и все
побочные
реакции антитиреоидных препаратов могут наблюдаться как в виде
незначительных кожных реакций, лекарственной лихорадки, увеличения
лимфатических узлов и
тошноты, так и в виде агранулоцитоза,
нефротического синдрома и апластической анемии.
Авария на атомной станции в г. Фукусима (Япония) значительно повысила
актуальность
радиоактивного
проблемы
блокады
заражения
щитовидной
(Hänscheid
железы
H., 2011).
при
угрозе
Многочисленными
экспертами было отмечено отсутствие систематического исследования
побочных эффектов йодида калия, в том числе и в эксперименте ( Spallek L.,
2011). Таким образом, несмотря на длительные исследования, посвященные
методам
профилактики
поражения
щитовидной
железы
при
угрозе
радиационного поражения, вопрос возникновения осложнений при приеме
йодида калия и возможной оптимизации его доз остается актуальным.
Физиологические
механизмы
влияния
йодида
калия
на
функциональную активность гипофизарно-тиреоидной системы.
Йод
является
функционирования
необходимым
щитовидной
элементом
железы.
Однако
для
резкое
правильного
увеличение
28
циркулирующего йода приводит к антитироидальному эффекту у крыс
(эффект Вольфа-Чайкова) и человека (йод – индуцированная микседема)
(Fumarola A, 2010 ).
Общепринятая гипотеза антитиреоидного действия больших доз йодидов
была выдвинута A Taurog. в 1970 году: избыток йода блокирует действие
тиреопероксидаз со снижением окисления и органификации катиона йода и,
следовательно,
приводит
к
быстрой
блокаде
выработки
гормонов
щитовидной железы. Хотя сам автор исследования утверждал, что
молекулярный йод не является активным йодирующим агентом в системе
пероксидаз
и,
следовательно,
вызванное
им
торможение
функции
щитовидной железы нельзя просто отнести к снижению I2 с образованием I3.
(Taurog A., 1970).
Изменения щитовидной железы при лечении йодидом хорошо описаны:
снижается ее васкуляризация, железа становится более плотной, размеры
клеток уменьшаются, коллоид накапливается в фолликулах, возрастает
содержание органического йода. (Emerson et al., 1975).
Однако описан и зобогенный эффект при
йодиде калия как у людей
(Namba H. 1993), так и у крыс (Wynford-Thomas D.,1982; Penel C.,1987).
Авторы объясняют этот эффект нарушением функции щитовидной железы
(Smerdely P., 1993; Castillo V. A. ,2001), когда торможение фагоцитоза /
пиноцитоза коллоида, который содержит тиреоглобулин, приводит к его
накоплению в фолликулярной просвете, увеличивая тем самым диаметр
фолликула (Wollman S.H. ,1990).
Другие исследователи считают, что препараты йодида калия обладают и
гипертиреоидным действием (Braverman L.E., 1973; Roti E., 1990): на фоне
применения йод-содержащих препаратов были зафиксированы случаи
болезни Грейвса.
29
В механизме действия йодида калия есть еще одно не выясненное до
настоящего времени обстоятельство – временной интервал блокирующего
влияния на щитовидную железу. Тормозящее действие йодидов длится 10 –
14 дней ( в эксперименте, например, у крыс – до недели), затем наблюдается
ребаунд- эффект («ускользание щитовидной железы»): несмотря на
продолжающийся
прием
йодидов,
блокада
щитовидной
железы
прекращается. Вследствие этого свойства, эти лекарственные средства не
считаются терапией выбора при лечении гипертиреоза. В настоящее время
йодиды
могут
используются
в
клинической
практике
в
качестве
предварительной подготовки перед тиреоидэктомией, поскольку снижают
васкуляризацию тканей щитовидной железы (обычно в сочетании с другими
антитиреоидными средствами, например, пропилтиоурацилом); в лечении
тяжелых форм тиреотоксикоза ( при тиреотоксическом кризе, так как быстро
блокируют выработку гормонов щитовидной железы), а также в качестве
адъювантной терапии при радиометаболическом лечении (Fumarola A, 2010) .
Кроме вышеописанного влияния на функцию щитовидной железы, йодид
калия по мнению многих исследователей, принимает
участие и в
фармакологических эффектах. Были опубликованы данные о том, что йодид
калия обладает воздействием на иммунную систему: в дозировке 60 мг
препарат значительно повышает уровень антител
активность
В-лимфоцитов,
вероятно,
через
к рецептору ТТГ и
повышение
иммуноглобулина лимфоцитами периферической крови. Этот
продукции
механизм
считается наиболее вероятным для возникновения йодид - индуцированной
дисфункции щитовидной железы у предрасположенных лиц. (Wilson
R, 1990).
Другими авторами было показано, что йодид калия обладает способностью
подавлять образование токсичных кислородных полиморфных клеток и
таким образом оказывает противовоспалительное действие (Miyachi Y.,
1982).
30
KI также ингибирует хемотаксис нейтрофилов, который наблюдается в
естественных условиях в периферической крови (при дозировке KI 15
мг/кг/день в течение трех дней) (Honma K.,1990). Йод участвует в реакциях
галогенирования миелопероксидаз, которые являются основополагающими
для действия фагоцитов (Torres-Mendonza BM.,1997). Этот механизм также
считается одним из эффектов фармакологического воздействия йодидов, в
частности, при инфекционных заболеваниях.
Таким образом, йодид калия функционирует не только в качестве
субстрата для биосинтеза тиреоидных гормонов, но и принимает участие во
многих
фармакологических
эффектах. Поэтому
в
настоящее
время
воздействие йодида на щитовидную железу рассматривается как сочетание
фармакологического действия и эффекта йода в качестве субстрата для
гормонов щитовидной железы ( Nagataki S., 1977).
Сравнительный анализ йод-содержащих лекарственных препаратов.
Однако арсенал современных фармакологических препаратов содержит и
другие йод-содержащие соединения с широким применением в клинической
практике, и их патогенез и возможные осложнения до сих пор является
дискуссионным.
йодсодержащего
Особенно
препарата
острую
дискуссию
амиодарона,
вызвал
патогенез
получившего
широкое
распространение в качестве антиаритмического средства, которому нет
аналогов. Препарат блокирует ионные каналы (главным образом, калиевые,
в меньшей степени – кальциевые и натриевые) клеточных мембран
кардиомиоцитов, оказывает тормозящее влияние на альфа и бетта
адренорецепторы. Структурная формула амиодарона близка к структуре
человеческого тироксина, 37% его массы составляет йод. Суточная доза
препарата в клинической практике колеблется от 200 до 600 мг. Так как за
сутки около 10% молекулы амиодарона дейодируются, то ежедневная доза
31
йодида составляет примерно 7–21 мг, что приводит к заметному увеличению
экскреции йодида (Rao R., McReady V., 1986).
Если учесть, что оптимальная суточная доза потребления йода составляет
150 – 200 мкг, то при лечении амиодароном происходит 50 – 100-кратное
превышение суточной дозы йода ежедневно (Braverman L.E., 2000).
Кроме
того, амиодарон накапливается во многих тканях, в том числе жировой
ткани, печени, легких, и, в меньшей степени, почек, сердца, скелетной
мышцах, щитовидной железы и мозга, из которых медленно выделяется (
Holt DW, Tucker GT 1983). Однако гипертиреоидная реакция наблюдается
далеко не у всех пациентов, принимающих амиодарон.
По общепринятому в настоящее время мнению, амиодарон может
обострять
аутоиммунные
нерегулируемый
синтез
заболевания
гормонов
щитовидной
(эффект
железы
Йод-Базедова
или
и
йод-
индуцированного тиреотоксикоза) у восприимчивых лиц, со скрытой
патологией щитовидной железы - многоузловым зобом, аутоиммунным
тиреоидитом,
ТТГ-независимой
стимуляцией
щитовидной
железы
(функциональной автономией щитовидной железы либо при наличии антител
к рецептору ТТГ в плазме крови)( Ierbasi G., 1987).
Аналогичная дискуссия посвящена и ренген-контрастным веществам,
применяемым
в рентгенологии, содержание йода в которых превышает
суточную дозу йода в сотни раз. Однако в отсутствие предстоящих
заболеваний
щитовидной
железы
люди
почти
всегда
сохраняют
эутиреоидное состояние (Braverman L.E., 2000).
По мнению одного из ведущих авторов в этой области Braverman L.E.
(1994), за десятилетия работы исследователей в данной области достоверно
установлено, что препараты йода вызывают как гипотиреоз, так и
гипертиреоз, но этиология гипертиреоза остается неизвестной.
32
Постоянно выдвигаются гипотезы о влиянии йод-содержащих препаратов
на активность тиреотропного гормона. Имеются экспериментальные данные
как в подтверждение этой гипотезы (исследование воздействия йодида калия
Wilson R.(1990) и Li Jin-ru (2007)), так и опровергающие её (так же при
йодиде калия (Valenta L.J. ,1982)). Однако не вызывает сомнения, что ТТГ
является первым гормоном, претерпевающим значительные изменения в
процессе терапии амиодароном, даже в первый день применения (Safran M.,
1986). Затем ТТГ постепенно возвращается к исходным концентрациям, или
даже чуть ниже, в течение последующих трех месяцев (Sanmarti A.,1984).
По мнению некоторых авторов, ранний подъем в плазме ТТГ происходил в
основном в связи с падением интратиреоидной концентрации T3 с
последующим снижением 5'-дейодирования Т4 в T3, особенно в гипофизе.
Однако возможно, что дезетиламиодарон, главный метаболит амиодарона,
связывается с внутриклеточной Т3 рецепторов и действует как антагонист T3
(Vanbeeren H., 1995). Окончательное мнение о влиянии механизмах влияния
амиодарона на гипофиз на настоящее время не сформулировано.
Таким
образом,
несмотря
на
успехи,
достигнутые
в
изучении
физиологических механизмов воздействия йод-содержащих препаратов, и
йодида калия в частности, остается актуальной проблема исследования
некоторых вопросов, ответ на которые, возможно, позволит оптимизировать
применение
вышеназванных
препаратов
и
избежать
возникновения
побочных эффектов.
1.2. Физиологические
функциональную
Взаимодействие
механизмы
активность
влияния
йодида
калия
гипофизарно-гонадной
гипофизарно-тиреоидной
и
на
системы.
гипофизарно-гонадных
систем.
Физиологические
механизмы
влияния
йодида
калия
на
функциональную активность гипофизарно-гонадной системы.
33
Литературные данные о воздействии йодида калия на репродуктивную
систему в основном относятся к первой половине 20 века и отличаются
дифференцированностью мнений авторов.
Так, Брауде И.Л.(1957) приводит данные о том, что в эксперименте
фармакологические дозы йодидов в яичниках лабораторных животных
вызывают дистрофические и деструктивные изменения фолликулярного
аппарата с обратимым прекращением овариальной функции.
Однако высокие дозы калия йодида в СССР широко применяли в
середине ХХ – го века при консервативном лечении миомы матки по так
называемой «прописи Шерешевского». Курсовая доза йодида калия согласно
прописям Шерешевского составляла 300 000 мкг: суточная – 15000 мкг, при
продолжительности лечения в течение 20 дней. Рекомендовалось проводить
3 курса с перерывом в 10 дней. (Козуб Н.И.,2002).
В эксперименте Смирновой О.(1964) у крыс с персистирующим эструсом в
результате рентгеновского облучения или субтотальной кастрации была
предпринята попытка стимулировать производство лютеинизирующего
гормона микродозами йодида калия. Ежедневным введением KI в дозе 500
мкг
в
течение
2
недель
авторы
спровоцировали
лютеинизацию
фолликулярных кист и превращение их в желтое тело. Лютеинизация кисты
сопровождалась
заметным
снижением
уровня
эстрогена,
что
свидетельствовало о прекращение персистирующего эструса с последующей
нормализацией эстрального цикла (Smirnova O, 1964) .
Однако такие исследования были немногочисленны. В зарубежной и
отечественной литературе полнее представлены исследования по влиянию
тиреоидных гормонов на репродуктивную систему. Активно исследовалось
взаимозависимость тиреоидной дисфункции и нарушений гонадной системы.
В эксперименте было установлено, что снижение или полное выключение
тиреоидной активности, как правило, сопровождается падением уровня
34
гонадотропинов в гипофизе (Peppler R.D.,1975). При этом уменьшилось
количество клеток, продуцирующих ФСГ и ЛГ у самцов-крыс (Amin S.O.,
1977). В яичниках наряду с этим эффектом наблюдалось повышение
чувствительности гипотиреоидных животных к экзогенным гонадотропинам,
что сделало этих животных непригодными для стандартизации этих
гормонов (Бабичев В.Н.. 1983).
В 1983 г Бабичев В.Н. описал эффект стимуляции уровня ЛГ тироксином
у тироидэктомированных самок крыс. В 1988 году были опубликованы
данные о лечебном эффекте тиреоидина у эутиреоидных женщин,
страдающих анавуляторным бесплодием (Алипов В.И., 1988).
Экспериментальные работы подтвердили наличие рецепторов к ТТГ и Т3
в яичниках, что определяло возможность прямого влияния дисфункции
щитовидной железы на стероидогегез, овуляцию и функцию желтого тела
(Oravec S., 2000).
По мнению некоторых исследователей, возможности взаимовлияния
гипофизарных гормонов – ТТГ, ФСГ и ЛГ вероятно обуславливает их
структурное сходство: ТТГ, ФСГ, ЛГ и чХЧ (хориогонин) представляют
собой сложные гликопротеины, состоящие из α– и β – субъединиц;
Структура α–субъединицы ТТГ, ФСГ , ЛГ и чХЧ идентична, а β –
субъединицы
специфична
лютеинизирующую,
для
каждого
гормона
фолликулостимулирующую
и
или
определяет
его
тиреотропную
функцию ( Yen S.S.,1999).
Еще более многочисленны работы о стимулирующем влиянии половых
гормонов на щитовидную железу. Было выявлено, что при введении
тестостерона ускоряетcя поглощение
131
I щитовидной железой, причем это
ускорение наблюдалось только при введении небольших доз препарата (1 –
10 мг/кг). При повышении дозы до 25 мг/кг интенсивность поглощения йода
снижалась. Кастрация крыс-самцов снижала уровень ТТГ в крови и его
35
реакцию
ни
тиреолиберин;
заместительная
терапия
тестостероном
восстанавливало эти показатели, введение эстрадиола было неэффективным.
Был сделан вывод о том, что основной половой стероид, влияющий на
реактивность ТТГ – тестостерон (Christianson D., 1981).
Однако имеются и данные о возможной стимуляции эстрогенами функции
щитовидной железы за счет интенсификации синтеза тироксинсвязывающего
глобулина в печени (Redmond G.P., 2004).
Наиболее активно велись исследования по влиянии кастрации и
заместительной терапии на активность щитовидной железы самок (Fortier
C.,1970) и самцов (van Rees G.R.,1968). По мнению многочисленных авторов
кастрация
значительно
заместительная
терапия
снижает
скорость
стероидными
секреции
гормонами
тироксина,
нормализует
а
этот
показатель. Однако имеются исследования, авторы которых не обнаружили
влияния овариэктомии на функцию щитовидной железы у людей (Дерябина
Е.Г., 2008).
Несмотря на противоречия, большинство авторов считают, что кастрация
снижает
функциональную
активность
щитовидной
железы:
основная
гипотеза (Алешин Б.В., 1965) заключается в том, что кастрация, по крайней
мере у самок, устраняет постоянные стимулы (эстрогены), которые требуют
повышения секреции ТТГ. Снижение гипофизарной активности после
кастрации свидетельствует, по мнению автора, не о торможении, а об
отсутствии стимуляторов.
Однако
механизмы
взаимодействия
гипофизарно-тиреоидной
и
гипофизарно- гонадной системы выяснены недостаточно как в эксперименте,
так и в клинической практике. Так, не объясняется, почему теоретически
обоснованные эффекты нарушения функции гипофизарно-гонадной системы
не наблюдаются во всех случаях гипо- или гипертиреоза. Например,
гипотиреоидная гиперпролактинемия (повышение уровня пролактина в
36
крови больных гипотиреозом, связанная со способностью тиреотропинрелизинг гормона стимулировать гипофизарную секрецию не только ТТГ, но
и пролактина) наблюдается только у 4-5% женщин с гипотиреозом
(Айламазян Э.К.. 2006).
Таким образом, механизмы взаимодействия гипофизарно- тиреоидной и
гипофизарно – гонадной системы, и в частности, влияние йодида калия на
функциональную активность гипофизарно – гонадной системы, несмотря на
длительные исследования, изучены недостаточно. Остается открытым
вопрос, опосредованно ли (через изменение функциональной активности
щитовидной железы) или напрямую влияют йодиды и тиреоидные гормоны
на функциональную активность гипофизарно- гонадной системы.
1.3. Натрий – йодный симпортер щитовидной железы и влияние йодида
калия на его функцию. Натрий – йодный симпортер в экстратиреоидных
тканях.
Натрий – йодный симпортер щитовидной железы и влияние йодида
калия на его функцию.
Натрий – йодный симпортер (НИС) – гликопротеин плазматической
(базолатеральной, контактирующей с кровью) мембраны, осуществляющий
активный транспорт йода в клетку.
В настоящее время общепризнано, что при воздействии йодида калия
происходит снижение уровня НИС в тканях щитовидной железы, что
обуславливает
уменьшение
уровня
интратиреоидального
йода.
Этот
механизм, по мнению Spitzweg C, (2002) и Eng P.H.K.(1999) позволяет
возобновить органификацию йода при феномене « ускользания» щитовидной
железы при эффекте Вольфа – Чайкова .
37
Причем этот эффект выражен и на уровне транскрипции, так как
снижается и месседжер рибонуклеиновой кислоты НИС (мРНК НИС)(. Eng
PHK, 1999).
Однако в последнее время появились работы, опровергающие это мнение.
Так, Leoni S, 2011, отмечает, что уменьшение поглощения йода щитовидной
железой начинается гораздо раньше, чем снижение мРНК НИС (Leoni
S.G., 2011)
Повышение НИС в щитовидной железе, причем и на уровне мРНК
наблюдается при гипертиреозе (болезни Грейвса) (Saito T, 1997) и в
автономно функционирующих узлах щитовидной железы (Joba W, 1999).
Dohan О. и соавт.(2001) показал увеличение уровня экспрессии НИС в
малигнизированной ткани щитовидной железы. Кроме того, НИС был
локализован не только в плазматической мембране, но и в значительной
степени
во
внутриклеточных
структурах.
Эти
данные
позволяют
предположить, что злокачественная трансформация клеток щитовидной
железы связана либо с миграцией НИС в плазму, либо с нарушением
функции НИС в мембране, так как накопление йодида при малигнизации
уменьшается, несмотря на повышение уровня экспрессии НИС ( Dohan O,
2001).
Натрий – йодный симпортер в экстратиреоидных тканях
НИС также является посредником активного транспорта йода и в других
тканях, в том числе слюнных железах (Jhiang SM, 1998), слизистой оболочки
желудка, молочной железы (. Spitzweg C, 1998))., почках ( Spitzweg C, 2001),
коже (Slominski A., 2002). Методом иммуногистохимии наличие НИС
выявлено в надпочечниках, поджелудочной железе, передней доле гипофиза,
в головном и спинном мозге (Mitsuma T., 1997).
38
В последнее время роль йодида в экстратиреоидных тканях неоднократно
и широко обсуждалась (Cann S. A., et al. .1999; Cann S. A., et al. 2006 года).
Йодид не может органифицироваться в экстратиреоидных тканях, однако
выраженный рост экспрессии NIS был найден в слюнных железах,
околоушных железах, подчелюстных железах, гипофизе, поджелудочной
железе, семенниках, молочной железе, слизистой оболочке желудка,
предстательной железе, яичниках, надпочечниках, сердце, тимусе и легких
(Spitzweg E.T. et al.,1998). В молочной железе увеличение НИС происходит
при лактации (Tazebay UH, 2000)
По мнению исследователей, органифицированный йод в экстратиреоидных
тканях может выполнять множество функций, таких как антимикробная
защита поверхности ткани, например, слизистой желудочно-кишечного
тракта, роговицы или кожи (Majerus P., et al.,1992): обеспечение йодом
новорожденных (в молочной железе) (Rillema J. et al.,1997) и репродуктивная
функция (в матке, яйцеводах) (Brown-Grant K. et al.,1972).
Вполне вероятно, что формирование определенных йодопротеинов
(например iйодолактонов, йодоальдегидов) (Dugrillon A, 1996) как в
щитовидной железе, так и в экстратиреоидных тканях может дать
антипролиферативный и антиоксидантный эффект, влияя на целостность
клеток, их пролиферацию и онкогенез (Eskin BA, 1970; Kato N, et al., 1994).
Снижение внутриорганного йода в сочетании с ростом НИС наблюдается и
при раке молочной железы (Kilbane M, 2000). Возможно, этот феномен
снижает восприимчивость малигнизированных тканей молочной железы к
радиоактивному йоду при терапевтическом лечении рака.
В последнее десятилетие появилось множество экспериментальных работ,
посвященных исследованию НИС в злокачественно перерожденных тканях
различной локализации: кожи, печени, толстой кишки и яичников ( Mandell
RB, 1999); шейки матки, предстательной железы, молочной железы, легкого
39
и толстой кишки (Boland A, 2000); эпителиальной карциномы и раке мозга (
Liu Z, 2012).
Одновременно ведутся исследования по индукции экспрессии генов НИС
и увеличению поглощения тканями радиоактивного йода.( Kogai T, 2006).
Например, Kogai T (2000) предложил использовать ретиноевую кислоту
(РК) для индукции экспрессии генов НИС и увеличения поглощения
радиоактивного йода при раке молочной железы. Следует отметить, что этот
эффект РК сопровождался стимуляцией процессов апоптоза (Kogai T, 2000).
Таким образом, рост экспрессии НИС в малигнизированных тканях
различной органной принадлежности дал стимул к появлению научного
направления
повышения
–
терапевтического
эффективности
применения
радиационной
индукторов
терапии
НИС
тиреоидальных
для
и
экстратиреоидальных опухолей. (Spitzweg C., 2002).
Однако, в связи с тем, что в экстратиреоидных тканях не происходит
органификации йода, функция НИС в экстратиреоидных тканях и влияние на
нее йодидов по-прежнему остается невыясненной (Cann S. A., 1999).
1.4. Влияние йодида калия на апоптоз
Смерть биологической клетки как естественный запрограммированный
природой процесс, не связанный с патологией, впервые был описан почти
полвека назад, а термин "апоптоз" предложили Y.Kerr и соавт в 1975 году (
Kerr JFK, 1972).
Основное предназначение апоптоза как физиологического процесса –
поддержание постоянного количества клеточных элементов в органах и
тканях организма и удаление клеток, прошедших свой жизненный цикл. В
отличие от гибели клеток, вызываемой патологической ситуацией, процессы
апоптоза происходят в ядре и цитоплазме при сохранении целостности
клеточной оболочки.
40
Апоптоз является физиологическим явлением, но может быть так же
вызван внешним воздействием – факторами, которые ведут к повреждению
ДНК. Имеются данные об индукции апоптоза радиацией, гормонами, или
вирусной инфекцией (Waterhouse NJ, 1998).
Существуют два основных пути апоптоза в клетке: митохондриальный
путь и путь через рецепторы апоптоза. Оба пути приводят к активации каспаз
и запуску каскада реакций приводящих к гибели клетки. (Thornberry
NA,.1998). Имеются так же данные о каспазо–независимой индукции
апоптоза.
(Monney
L.,1998).
Например,
при
индукции
апоптоза
стауроспорином и лактацистином, не было выявлено активации каспаз (
Andersson M., 2000).
Каспазы (caspase) – ферменты расщепляющие белки по остаткам
аспартата. Каспазы синтезируются в виде неактивных проэнзимов, но
активируются либо автокаталитически, либо другими протеазами. (Martin SJ,
1995). Известно 14 каспаз, которые подразделяются на инициаторы и
эффекторы. При этом одни каспазы активируют другие – происходит
амплификация сигнала. Инициаторы (каспаза – 8 и – 9) расщепляют и
активируют каспазы – эффекторы (каспаза – 3). Эффекторы расщепляют
различные белки, что и ведет к гибели клетки ( Cryns V, 1998; Thornberry
NA, 1998).
Каспазы могут быть активированы двумя путями: через рецепторы
апоптоза и митохондрии (Ashkenazi A, 1998).
1. Рецепторы апоптоза – семейства белков CD95 (Apo-1 или Fas) и TNFR (фактор опухолевого некроза). Активация рецепторов апоптоза лигандами
(например, CD–95L и TNF–альфа) приводит к активации инициаторной
каспазы – 8, запуская каскад реакций ведущих к апоптозу.
41
2. Митохондриальный путь. Дисбаланс между про – и анти –
апоптозными членами семейства Bcl–2 (bcl–2, bcl–XL – противоапоптозные;
Bad, Bax – проапоптозные) меняет проницаемость митохондриальной
мембраны и приводит к выходу про – апоптозных веществ (AIF,
эндонуклеаза G, Smac/DIABLO и цитохром C) из митохондрий. Утечка
цитохрома – С приводит к активации цитозольной прокаспазы – 9,
находящейся в апоптосоме, в инициаторную каспазу – 9, и запускает процесс
клеточной смерти. .( Hakem R, 1998).
Апоптоз состоит из следующих этапов:
1.
Фрагментация хромосомной ДНК ( расщепляется каспазой – 3)
2.
Инактивация ферментов вовлеченных в репарацию ДНК
3.
Инактивация белков вовлеченных в репликацию.
4.
Разрушение структурных ядерных белков: каспаза – 6 разрушает ядро,
что приводит к конденсации хромосом.
5.
Распад клетки на везикулы, уменьшение объема клетки, сморщивание
цитоплазматической мембраны, конденсация ядра, фрагментация
клетки
на
апоптозные
тельца,
фагоцитоз
апоптозных
телец
макрофагами и клетками – соседями. (Thornberry NA.,1998).
В литературе имеются данные о том, что йодиды стимулируют процессы
апоптоза в щитовидной железе (LangerR.,2003; Lehmann P., 2006). В
перечисленных работах рост интенсивности апоптоза был установлен
подсчетом апоптических клеток при электронной микроскопии. К таким же
выводам пришли исследователи, определявшие фрагментацию ДНК при
проточной цитометрии (Burikhanov RB, 2000; Matsuzaki S., 2000) и
активность эффекторной каспазы 3 (Mutaku J F, 2002).
Однако механизмы действия йодидов на апоптоз в щитовидной железе
остаются
дискутабельными.
Разнятся
данные
и
по
путям
йодиндуцированного апоптоза.
42
Часть авторов считают, что йодиды влияют только на митохондриальный
путь программированной гибели клеток (Boechat L., 2002). По мнению
других исследователей (Vitale M., 2000) белки семейства Bcl-2 не участвуют
в активации йод – индуцированного апоптоза. M. Vitale, 2000, считает, что
ведущая роль принадлежит ингибиторам клеточного цикла, таким как
антионкоген (супрессор опухолей) белок p53, рост экспрессии которого
приводит к остановке клеточного цикла в G1 и G2 периоде (G от англ. gap —
промежуток) (G1 – фаза начального роста, во время которой идет синтез
мРНК, белков, других клеточных компонентов; G2 – фаза, во время которой
идет подготовка к митозу). p53 является одним из факторов транскрипции,
который инициирует синтез белка p21, являющегося ингибитором комплекса
циклин – зависимая киназа (CDK) / циклин и ингибирует клеточный цикл в
G1/G2 фазах.
В последние годы появились работы, посвященные влиянию йода на
апоптоз в малигнизированных тканях. Например, в тканях молочной железы
( Shrivastava, A., 2006.) и легких (Zhang L., 2003).
Однако единое мнение по поводу механизма воздействия йода на раковые
клетки так же отсутствует. Shrivastava A, 2006 считает, что индуцированный
йодом апоптоз в тканях рака молочной железы каспазо – независим, и
развивается по митохондриальному пути (не были выявлены изменения
инициаторных каспаз 8 и 9 при обработке клеточных культур рака молочной
железы различными препаратами йода).
Zhang L., 2003 связывает активность йод – индуцированного апоптоза в
НИС/ТПО модифицированных клетках рака легких с гиперэкспрессией
ингибитора 1 циклин – зависимой киназы CDKN1A (p21/Waf1) (Chang, B. D.,
2002.), который является одним из ключевых белков, участвующих в
ингибировании клеточного цикла в G2/M фазе (M фаза – период клеточного
деления )(el-Deiry W.S., 1993). Zhang L.(2003) не выявил изменения каспаз и
43
белков семейства Bcl–2 в генетически модифицированных тканях рака
легких при инкубации с йодидом калия.
Таким образом, влияние йодида калия на апоптоз как в тканях
щитовидной железы, так и в тканях экстратиреоидальных органов до сих пор
остается дискутабельным. Наличие апоптических телец в щитовидной железе
после применения КЙ подтверждает влияние йодидов на процессы апоптоза,
но механизм этого воздействия не выяснен. Так же остается открытым
вопрос – не изменяются ли пути йод – зависимого апоптоза при
малигнизации тканей различной локализации. Внимание исследователей
было посвящено исследованию культур раковых клеток экстратиреоидных
органов.
Однако
данные
о
воздействии
йодидов
на
апоптоз
в
физиологических тканях экстратиреоидной локализации, особенно in vivo,
очень скудны.
1.5.
Характеристика
функциональная
микроэлементов
йода
и
селена
и
их
взаимосвязь в животных организмах. Содержание
йода и селена в тканях людей и крыс.
Характеристика микроэлементов йода и селена и их функциональная
взаимосвязь в животных организмах.
Йод – элемент 17–й группы периодической таблицы химических
элементов с атомным номером 53. Химически активный неметалл, относится
к группе галогенов.
Основным источником йода для человеческих и животных организмов
является пища, главным образом растительная. Биосинтез тиреоидных
гормонов происходит в несколько этапов: захват и накопление йода в
тиреоцитах; окисление йодида до молекулярного йода внутри тиреоцита;
44
органификация йода; окислительная конденсация; секреция. ( Leung A,
2010,).
Йод поступает из кишечника в кровь в неорганической (йодиды) или
органической
(йодированные
жирные
кислоты,
йодсодержащие
аминокислоты) формах (Carrasco N, 1993).
Захват
йодидов
тиреоцитами
против
электрохимического
и
концентрационного градиентов происходит благодаря мембранному белку –
натрий – йодному симпортеру (НИС), локализующемся на базолатеральной
мембране клеток щитовидной железы. НИС транспортирует 2 иона натрия и
один йодид – ион. Градиент трансмембранного натрия выступает в виде
движущей силы при поглощении йодида, обеспечение энергией этого
процесса происходит за счет уабаин – чувствительной Na
+
/ K +–АТФазы (
Dai G, 1996 , Smanik PA, 1996). Активность НИС блокируется ингибиторами
Na + / K +–АТФазы уабаином и перхлоратом. (Dai G, 1996).
Тиреотропный гормон (ТТГ), рецепторы которого локализуются в
базальной мембране тироцитов, через цАМФ пути стимулирует активность
транспорта йодида и экспрессию НИС в тироцитах. (Kogai T, 1997 , Saito T,
1997). В отсутствие ТТГ НИС перераспределяется из плазматической
мембраны во внутренние структуры клеток, и, следовательно, теряет
способность транспортировать йодиды через плазматическую мембрану
(Riedel C, 2001)
Абсорбция йодидов регулируется через механизм, известный как эффект
Вольфа-Чайкова – при повышении уровня неорганического йода в плазме
крови образование органического йода в щитовидной железе блокируется
(Wolff J, Chaikoff IL, 1948.)
Далее
йодид
достигает
апикальной
мембраны,
окисляется
и
органифицируется, присоединяясь к тирозильным остаткам тиреоглобулина
под действием пероксидазы тироцитов. После йодирования тирозильных
45
остатков
структура
тиреоглобулина
претерпевает
пространственное
изменение, в результате которого происходит конденсация йодированных
тирозинов с образованием тиреоидных гормонов.
Тиреоидные гормоны
обладают широким спектром действия, но больше всего их влияние
сказывается на клеточном ядре. Они могут так же непосредственно
воздействовать на процессы, протекающие в митохондриях и в клеточной
мембране (Дедов И.И.. 2006).
Физиологическое действие тиреоидных гормонов чрезвычайно широко:
они повышают потребность тканей в кислороде, захват и утилизацию
глюкозы клетками, повышая активность ключевых ферментов гликолиза;
усиливают
липолиз.
В
малых
концентрациях
они
оказывают
анаболическое действие на обмен белков, повышают синтез белков и
тормозят их распад, вызывая положительный азотистый баланс. В больших
концентрациях тиреоидные гормоны оказывают сильное катаболическое
действие на белковый обмен, вызывая усиленный распад белков и
торможение их синтеза.
Давно известно стимулирующее действие этих гормонов на скорость
потребления кислорода всем организмом (калоригенный эффект), а также
отдельными тканями и субклеточными фракциями. Существенную роль в
механизме физиологического калоригенного эффекта Т4 и Т3 может играть
стимуляция синтеза ферментных белков, которые в процессе своего
функционирования
используют
энергию
аденозинтрифосфата
(АТФ),
например, чувствительной к оубаину мембранной натрий-калий-АТФазы,
препятствующей внутриклеточному накоплению ионов натрия (Теппермен
Дж., 1989).
Селен – элемент 4 группы главной подгруппы периодической системы
Менделеева с атомным номером 34, во многом повторяющий химические
свойства серы. Большая часть селена в животных тканях присутствует в виде
селенометионина и селеноцистеина. Селен поступает в организм человека из
46
почвы
с
продуктами
растениеводства
и
животноводства;
общей
регулируемой формой селена в организме является селенид, который
образуется из селеноцистеина под действием Sec-β-лиазы (Shennan DB,
1988).
Абсорбирование селена организмом происходит в тонкой
кишке.
Поскольку селеновый статус экспериментальных животных почти не влияет
на величину абсорбирования вводимого селенита, следует предположить, что
для этого соединения регуляторный механизм абсорбции отсутствует. .(
Wolffram S, 1985).
При введении высоких доз селена уровень СБ превышает уровень,
соответствующий
ведет
к
адекватному потреблению - рост потребления селена
повышению
доказательств
СБ
в
виде
селенометионина. Не
существует
насыщения этого процесса или существенного изменения
функции или метаболизма СБ при селеновой нагрузке (Thorlacius-Ussing
O, 1988)..
Селеновый «насос» у человека и ряда животных находится в эритроцитах.
(MCConnel K. 1950)
Селенит чрезвычайно быстро, в пределах нескольких секунд проникает
через мембраны эритроцитов. Уже через 1–2 минуты в эритроцитах
концентрируется 50–70% всего селена крови.( Lopes P, 1994)
Под влиянием системы глутатион – глутатионпероксидаза селенит
подвергается превращению с образованием комплекса селена с глутатионом.
(Cohen H., 1985). Затем в течение 15–20 мин почти весь селен выходит из
эритроцитов, связываясь сначала с альбуминами, а затем с глобулинами
плазмы крови.
Селен выводится из организма в основном с мочой,
фекалиями и выдыхаемым воздухом.
47
Большинство авторов сходятся во мнении, что йод и селен совместно
обуславливают нормальное функционирование щитовидной железы.
Роль йода была известна давно, важность селена была открыта в 90-х годах
прошлого века. В настоящее время проводится много исследований по
изучению характера взаимосвязи между ними (J. Köhrle, 2005; J. Köhrle,
2009).
Общепризнанна только одна функция йода в организме – йод входит в
состав молекулы тиреоидных гормонов, и, соответственно играет роль в
деятельности щитовидной железы (Preedy V., 2011). Селен выполняет много
функций (Schomburg L.,2008; Schmutzler C., 2007).
Биохимические функции селена определяют селенсодержащие белки (СБ).
К настоящему времени охарактеризованы 12 СБ, содержащих в активном
центре селен. Данные изотопного анализа и результаты теоретических
исследований позволяют предполагать, что в организме млекопитающих
может насчитываться от 20 до 100 СБ (Ko.hrle J, 2000 ; Gladyshev VN, 1999;
Kryukov GV, 2003; Birringer M, 2002).
В начале 1990-х годов было обнаружено, что селен входит в состав
молекулы дейодиназ 1, 2 и 3 – семейства ферментов, которые участвуют в
активации и инактивации гормонов щитовидной железы: превращают
тироксин (Т4, прогормон щитовидной железы) в трийодтиронин (Т3, клеточно
– активный гормон), а также конвертируют Т3 в Т2 при его деградации. (
Behne D, 1990 ; Arthur JR, 1990 ; Berry MJ, 1991)
Селен также выполняет другие функции в организме. Наиболее важной из
них, вероятно, является его роль антиоксиданта.
Синтез гормонов щитовидной железы проходит с участием перекиси
водорода (H2O2), которая окисляет йодид, способствует йодированию
тирозина
и соединения йодированных остатков тирозина в йодтиронин
48
.(Corvilain B, 1991; Corvilain B, 1994). Избыточное количество H2O2 приводит
к повышению производства тироксина (Т4) и повреждению клеток
щитовидной
железы.
Селен
входит
в
состав
молекул
семейств
глутатионпероксидазы (GPX или GSHPx) и тиоредоксин редуктазы (TxnRd),
которые
инактивируют
H2O2,
ограничивая
выработку
гормонов
и
предотвращая повреждение клеток щитовидной железы ( Rotruck JT, 1973;
Flohe. L, 1973; Flohe L. 1998.)
Селен также может регулировать функции многих белков за счет
реактивного окисления остатков цистеина в белках. (Handel M. L., 1995; Kim
I. Y.1997; Gopalakrishna R.,1997). Селениты влияют через окислительновосстановительный механизм на активность Na,K–АТФазы, простагландин –
синтетазы и других ферментов (Matsumura H.,1991) . Таким образом, селен,
видимо, регулирует функции различных белков, многие из которых связаны
с внутриклеточными сигнальными системами. (McKeehan W. L., 1976; Bosl
M. R., 1997).
Многие исследования посвящены способности соединений селена играть
роль в защите клеток от факторов, инициирующих апоптоз, таких как
ультрафиолетовое и ионизирующее излучения (Rafferty T. 1998; Emonet
N,1997). Описано прямое инактивирующее действие селенитов на каспазу 3
через окислительно-восстановительный механизм .( Park H., 2000 ).
Таким
образом,
йод
и
селен,
являясь
биологически
важными
эссенциальными микроэлементами для человека и животных, принимают
активное участие в метаболических, биофизических и энергетических
реакциях организма.
Содержание йода и селена в тканях людей и крыс.
Несмотря на тот факт, что определение йода в биологических тканях имеет
большое
значение,
аналитические
данные
о
концентрации
йода
в
биологических тканях, помимо исследований щитовидной железы в норме и
49
при патологии, малочисленны из – за аналитических трудностей, связанных с
определением элементов на особенно низких уровнях .(Andrasi E., 2007) .
Йод присутствует во всех тканях и жидкостях организмов. Общее
содержание йода в организме взрослого человека составляет 20 – 30 мг, до
80% от общего фонда йода сосредоточено в щитовидной железе.
Согласно данным отечественной литературы, среднее содержание йода в
щитовидной железе у человека составляет 35 мг% (0,35 мг/г)( Капланский
С.Я., 1938). В зарубежной литературе приводятся данные о том, что
концентрация йода в щитовидной железе широко варьируется : 0,6 – 2 мг/г
при определении йода с помощью хроматографии (Taurog A., 1951), 0,02 –
3,12 мг/г при использовании рентгенспектральных методов
(Tadros TG,
1981). Значения концентрации йода в других органах и тканях тела скудны и
зачастую ненадежны. В связи с тем, что экстратиреоидальные ткани не могут
органифицировать йодиды, данному направлению не уделялось особого
внимания. (Cann S. A, 2006.)
По данным отечественной литературы в печени человека, скелетных и
сердечной мышце, коже и яичниках содержание йода колеблется в пределах
90 – 100 мкг% (мкг/100г), в почках и костной ткани – 30 мкг%, в мозгу – 10
мкг%, в крови – 8,5 мкг% (Капланский С.Я., 1938). Другие авторы
определяли иные пропорции содержания йода в экстратиреоидных тканях:
так, по данным A Costa (1978) в головном мозге содержалось 0,85 мкг/100г, в
печени 9,78 мкг/100г, в большинство других тканей – 2 – 4 мкг/100г.
Расхождения в показателях у различных авторов были объяснены
диетарными особенностями обследованного контингента. Вариабельность
содержания йода в экстратиреоидных тканях в зависимости от диеты была
доказана при экспериментальных исследованиях (Heninger R., 1963; Downer
J. V., 1981). Общепризнано накопление йода в тканях молочных желез,
желудка, слюнных желез, матке и яйцеводах крыс (Cann,S. 1999). Описана
50
аккумуляция йода в печени и скелетных мышцах у крупного рогатого скота (;
Downer J. V., 1981.)
В последние годы с помощью новых аналитических методов уточняются
концентрации йода в некоторых органах. Например, E. Andrasi ( 2007) с
помощью индуктивно связанной плазменной масс-спектрометрии определил,
что содержание йода в коре головного мозга двукратно отличается от уровня
йода в подкорковых структурах: 300 и 750 нг/г соответственно.
У
млекопитающих
концентрация
йода
в организме
варьирует
в
зависимости от содержания йода в рационах. Уровень йода в тканях зависит
так же от возраста (при старении организма происходит уменьшение
содержания йода в связи со снижением функциональной активности
щитовидной железы) и видовой принадлежности (по данным Георгиевского
В.И. (1979) концентрация йода выше у мелких видов животных с большей
интенсивностью обмена веществ и у животных, обитающих в более суровых
климатических условиях). При обычном режиме кормления фонд йода в
экстратиреоидных тканях распределяется следующим образом: в мышцах –
10 – 12 %, в коже – 3 – 4%, в скелете – 3 %, в прочих органах – 5 – 10 %
(Георгиевский В.И., 1979).
Распределение йода в тканях крыс было выяснено при фундаментальных
исследованиях еще в прошлом веке: в щитовидной железе содержится 44
мкг/г, в желудке – 3,4 мкг/г, в легких – 1,2 мкг/г, в остальных органах – от
0,3 до 0,7 мкг/г. (Stevens C. D., 1949)
Не отмечалось половых различий в распределении йодидов по тканям.
Однако было отмечено, что йод активно накапливается в молочной железе
как у женщин, так и у самок – крыс (Strum JM, 1983; Strum JM. 1978).
Таким образом, при сравнении уровня йода в тканях человека и крыс, был
сделан вывод о том, что содержание йода в щитовидных железах крыс
соответствует нижнему пределу соответственного показателя у человека, а
51
остальные органы сопоставимы по концентрации. Функциональные аспекты
оси гипоталамус–гипофиз–щитовидная железа активно исследовались на
крысах.
Однако в последние годы начал дискутироваться вопрос о возможности
экстраполирования на человека данных, полученных при исследованиях на
крысах – выраженность некоторых эффектов у человека и крыс не были
адекватны. Например, реакция на биологически обоснованные дозы
перхлората у людей и крыс была различной. ( Fisher J. a2012),
Определение содержания селена в биологических тканях сталкивается с
общими для микроэлементов трудностями, и, следовательно, широко
варьирует.
В организме человека общее количество селена колеблется от 3 мг ( в
Новой Зеландии ) до 14 мг ( США). (Arthur JR, 1994). Считается, что уровень
селена в организмах зависит от диетарных доз микроэлемента (Ge K, 1993).
Общепризнано, что у человека 30 % от общего объема селена содержится в
печени, 30 % – в скелетных мышцах, 15 % – в почках и 10% в плазме крови.(
Levander OA, 1986).
Ранее считалось, что концентрация селена максимальна в щитовидной
железе (Dickson R.C.,1967),однако при последующих исследованиях было
выявлено, что наибольшее содержание селена на грамм ткани определяется в
печени – 1.73 ±0.24 мкг/г сухой ткани (McConnell K.P., 1975).
Концентрация селена в щитовидной железе варьирует от 505 + 51 нг/г до
1495 +204 нг/г. Таким образом, диапазон уровня селена в щитовидной железе
несколько меньше, чем у йода (0,02 – 3,12 мг/г) (Carrión M, 2005)
Среднее содержание селена в тканях миокарда составляет 0,0114 мг/100г,
легких – 0,0100 мг/100г, селезенки – 0,0078 мг/100г, почек – 0,016 мг/100г,
скелетных мышцах – 0,022 мг/100г, коже – 0,0124 мг/100г, жире – 0,024
52
мг/100г ( Ермаков В.В., 1965) в поджелудочной железе – 0,63 ±0,07 мкг/г
сухой ткани (McConnell KP, 1975) , в крови – 1,49 ±0.06 мкг/г сухой ткани
(McConnell KP, 1975) или 0,5–2,5 ммоль/л (Versieck J, 1989.)
Однако имеются и другие данные – некоторые авторы считают, что первое
место по содержанию селена принадлежит почкам (Chunying C.,2005).
По мнению Thorlacius-Ussing O.(1988) уровень селена в передней доле
гипофиза в 1,5–2 раза превышает показатели всех других эндокринных
органов.
Исследования содержания селена в тканях продолжают детализироваться
при помощи новых аналитических методов. Посредством атомно –
абсорбционной спектрометрии было установлено, что среднее содержание
селена в коре головного мозга в 2 раза ниже, чем в белом веществе (115–155
и 206–222 нг / г сырого веса соответственно) (Ejima A. , 1996). При помощи
вышеназванного метода
был определен относительно высокий уровень
селена в семенной жидкости человека –33,4 ± 14,1 мкг/л (Saaranen M. ,,1986).
Вопрос,
можно
лабораторных
ли
исследования
животных
биологической
экстраполировать
на
роли
человека,
селена
на
постоянно
поднимается в литературе. Так, M. Saaranen,(1986) выявил более чем 10 –
кратное
различие
соотношения
селена
в
человеческих
и
бычьих
репродуктивных органах, семенной жидкости и сыворотке крови, и сделал
вывод о том, что селен может иметь различную роль и значение в
воспроизводстве различных видов .
У крыс с помощью рентген – спектральных методов были определены
следующие
показатели
содержания
селена
в
тканях:
в
печени
–
приблизительно 2,1 мкг/г сухой ткани; в плаценте и гипофизе – 1,7; в
семенниках и плодном яйце – 1,3; в яичниках и щитовидной железе – 0,8; в
плазме крови, мозге и матке – 0,5; в шкуре и коричневом жире – 0,3. (Bates J.,
2000).
53
Таким образом, содержание селена и йода в большинстве тканей крыс и
людей было признано сопоставимым по уровню. Было установлено, что
различие концентраций микроэлементов органозависимо: относительное
содержание йода выше в щитовидной железе, а селена – в печени,
семенниках
и
гипофизе.
Однако
вопрос
об
экстраполяции
экспериментальных данных на человека остается открытым, так как при
сравнительно равных диапазонах селена в тканях крысы и человека выявлено
различное видовое соотношение семейств селенпротеинов (Dreher I, 1997).
1.6.
Современные
биологических
методы
микроанализа
тканях.
йода
и
Теоретические
селена
в
основы
ренгенфлюоресцентных методов (РФА и РМА). Виды рентгеновских
спектрометров и их сравнение.
Современные методы микроанализа йода и селена в биологических
тканях.
Существует широкий арсенал методов количественного определения
йода и селена в различных пищевых продуктах, воде и биологических
объектах:
титриметрический,
вольтамперометрический,
фотометрический,
полярографический,
люминесцентный,
ионселективный,
газожидкостной и жидкостной хроматографии, изотопного разбавления.
Большинство из указанных выше методов не являются достаточно
чувствительным для определения йода на низком уровне (0,1 мкг/г -1), и
страдают от различных помех. (Andrasi E., 2007).
В
последние
десятилетия
для
количественного
определения
микроэлементов применяются методы нейтронно – активационного анализа,
атомной адсорбции с пламенной или электротермической атомизацией
элементов, масс–спектрометрия с индуктивно–связанной плазмой и атомноэмиссионная спектрометрия с индуктивно–связанной плазмой. Менее
54
распространены нейтронно – активационный анализ, рентгеноспектральный
анализ с протонным возбуждением (РМА) и ренгенфлуоресцентный анализ (
РФА).
Каждый из них обладает своими достоинствами и недостатками.
Большинства перечисленных методов ориентировано на анализ растворов
после разложения органической матрицы. (Пашкова Г.В.,2010). Отмечено,
что этап разложения занимает около 60% времени, затраченного на анализ, и
его вклад в суммарную погрешность анализа составляет примерно 30%
(Nollet L., 2009).
Теоретические основы ренгенфлюоресцентных методов (РФА и РМА)
Ренгенфлюоресцентные
методы
относятся
к
недеструктивным,
позволяющим анализировать образцы без химической обработки. Другими
достоинствами являются многоэлементность и относительно короткое время
пробоподготовки.
В
рентгеновском
анализируемый
микроанализаторе
микрообъем
облучаются
исследуемая
тонко
область
или
сфокусированным
электронным пучком (при РМА) или ионизирующим излучением от
радиоактивного источника (при РФА). При взаимодействии электронного
пучка или ионизирующего излучения с поверхностью образца происходит
передача энергии твердому телу, приводящая к появлению вторичных
электронов, отраженных электронов, оже – электронов, фотонов различных
энергий, характеристического и непрерывного рентгеновских излучений. Эти
сигналы исходят из эмиссионных областей внутри образца и используются
для изучений характеристик объекта, в том числе – элементного состава.
Генерация рентгеновского излучения при бомбардировке электронами
возникает за счет двух различных процессов:
1. торможение электронов пучка в кулоновском поле атома, приводящее к
возникновению непрерывного спектра рентгеновского излучения
55
2. взаимодействие электронов пучка с электронами внутренних оболочек
атома, при котором последние выбиваются из атома в возбужденном
состоянии, образуя вакансии на электронной оболочке. При возвращении
атомов в стационарное состояние происходит электронный переход с
внешних оболочек для заполнения этой вакансии, сопровождающийся
освобождением энергии атома. Энергия проявляется или в форме
рентгеновского
кванта
(излучательные
переходы),
или
в
форме
испускания (оже) электрона (безизлучательные переходы). Энергия
испускаемого рентгеновского кванта определяется разностью энергии
между оболочками, на которых происходят переходы. Энергетические
уровни оболочек меняются дискретно с изменением атомного номера
элемента – это явление было открыто Мозли и выражается в виде
λ= B/(Z - C)2
где В и С являются константами, которые различны для каждой серии, λ –
длина волны характеристического рентгеновского излучения, Z – атомный
номер элемента. Закон Мозли является основой качественного микроанализа.
Рентгеновское излучение, испускаемое при излучательных переходах,
называется характеристическим, так как его энергия и длина волны
характеризуют конкретный возбуждаемый элемент.
Процесс возникновения характеристического рентгеновского излучения
называется флуоресценцией, или вторичным излучением, в отличие от
первичного, обусловленного непосредственно электронной ионизацией.
Рентгеновский квант, как фотон электромагнитного излучения, имеет
соответствующую длину волны λ, которая связана с энергией кванта
λ = ђc /eE = 1,2398/E нм,
где ђ – постоянная Планка, c – скорость света, e – заряд электрона, E –
энергия в кэВ.
56
Характеристическое рентгеновское излучение определяется как в единицах
длины
волны
(кристалл
–
дифракционными
спектрометрами
или
спектрометрами с дисперсией по длине волны) – нм или Å, так и в единицах
энергии (спектрометрами с дисперсией по энергии) – кэВ.
Наличие непрерывного рентгеновского излучения играет важную роль в
определении минимально обнаружимого уровня элементов, так как
непрерывный спектр образует фон, на котором должны быть измерены
сигналы характеристического рентгеновского излучения. Следовательно,
непрерывное рентгеновское излучение рассматривается как помеха. Однако
непрерывный спектр содержит информацию о среднем атомном номере и,
следовательно, о составе образца.
Отношение интенсивности характеристического рентгеновского излучения
к непрерывному (или отношение пик/фон) показывает наличие элемента в
исследуемом объекте.
В рентгеновском микроанализаторе, который часто называют электронным
микрозондом, анализируется характеристическое рентгеновское излучение.
Измерение его энергии и интенсивности дает информацию о качественном и
количественном содержании химических элементов в объекте диаметром до
нескольких микрометров (Гоулдстейн Дж.,1984).
Виды рентгеновских спектрометров и их сравнение.
Детектор рентгеновского излучения должен собирать большую часть
рентгеновского излучения, испускаемого из образца, иметь разрешение
лучшее, чем собственная ширина измеряемой линии и обеспечивать быструю
скорость набора спектральных данных без потерь информации. Ни кристалл
– дифракционные спектрометры, ни спектрометры с дисперсией по энергии
не обладают всеми этими свойствами, но при совместном использовании они
взаимно дополняют друг друга.
57
Принцип действия спектрометра с дисперсией по длинам волн (кристалл –
дифракционный
спектрометр)
следующий:
длины
волн
максимумов
рентгеновского излучения отражают наличие элементов в образце. Часть
рентгеновского излучения, генерируемая образцом, выходит из электронно –
оптической камеры, падает на поверхность кристалла-анализатора и
диффрагирует. Детектор собирает полный заряд, создаваемый каждым
рентгеновским фотоном и преображает его в импульс напряжения, который
далее обрабатывается для последующего подсчета. Распределение пиков
рентгеновского излучения преобразуются в длины волн (в соответствии с
законом Брэгга) для связи длин волн максимумов рентгеновского излучения
с наличием определенных элементов в образце.
Принцип действия спектрометра с дисперсией по энергии (твердотельного
детектора) заключается в пропорциональном преобразовании энергии фотона
в электрический сигнал, так как энергия входящего рентгеновского кванта
пропорциональна
амплитудам
импульсов,
производимых
детектором.
Рентгеновское излучение от образца проходит через тонкое бериллиевое
окно в криостат, где находится охлаждаемый кремниевый детектор,
лигированный литием. При поглощении каждого фотона рентгеновского
излучения образуется фотоэлектрон, который большую часть своей энергии
расходует на образование электронно – дырочных пар. Они в свою очередь
разделяются приложенным напряжением и формируют импульс заряда,
который преобразуется в импульс напряжения, усиливается в главном
усилителе и поступает в многоканальный анализатор, где происходит
разделение импульсов по амплитуде.( Grieken Van R., 1986).
Из
сравнительных
характеристик
кристалл
–
дифракционных
спектрометров и спектрометров с дисперсией по энергии следует отметить
геометрическую эффективность сбора (0,2% и 2 % соответственно),
максимальную скорость счета ( 50 000 и 2 000 имп/с), разрешение ( 5 эВ и
150 эВ). Главным достоинством спектрометров по длине волны является
58
отсутствие спектральных артефактов. У энергетических спектрометров
наблюдаются пики потерь, наложение пиков, рассеяние электронного зонда и
перекрытие пиков.
Таким образом, точность измерения концентрации микроэлементов при
помощи волнового дисперсионного спектрометра (ВДС) на порядок
превышает параметры энергодисперсионного спектрометра (ЭДС). Однако
предварительный качественный микроанализ удобнее проводить с помощью
ЭДС, так как типовое время набора данных у ЭДС на порядок меньше, чем
при ВДС. (Гоулдстейн Дж., 1984).
При рентренфлюоресцентном методе (РФА) используются оба типа
спектрометров, однако точность измерений на порядок отстает от РМА.
Достоинством РФА является тот факт, что измерения можно проводить без
обезвоживания объекта исследования. Однако определение элементов
вследствие этого проводится не в глубоком, а в низком вакууме, что
значительно снижает чувствительность метода. В ряде работ отмечено, что
недостатками
РФА
являются
высокие
пределы
обнаружения
для
микроэлементов (Uson S.,2006; Khan A.H., 1989).
1.7.Особенности пробоподготовки при аналитическом определении
йода и селена.
Практически
все
методы
анализа
йода
требуют
предварительной
подготовки проб, которая является одним из ответственных этапов анализа.
В большинстве способов детектирования йода органическая составляющая
биологического материала мешает проведению анализа. С целью устранения
влияния органических веществ и перевода всех форм йода в одну
используется техника щелочного сухого сжигания («сухое» озоление) в
муфельной печи при температуре от 400 до 500°С либо обработка сильными
кислотами в присутствии окислителей («мокрое» озоление). В ряде работ
проводится щелочное окислительное разложение пробы с последующей
59
нейтрализацией и восстановлением окисленных форм йода (Бок Р., 1984) .
Недостатком «сухого» способа является 20 – 60 % потеря йода в
биологических субстратах при предварительной термической обработке
образцов (Покровский А.А., 1981), так как температура плавления йода - 114
о
С, температура кипения – 184 оС, а пары могут образовываться и при
комнатной температуре. В.Е. Зайчик (1994) с помощью метода нейтронноактивационного
анализа
получил
данные
о
100%
потери
йода
в
биологических образцах при сухом озолении.
При подготовке пробы «мокрым» окислением ионный сигнал неустойчив и
ошибочное возмещение достигает 750%. (Vanhoe H, 1993 )
Пробоподготовка при определении селена заключается в переводе всех
соединений селена в одну форму, чаще всего – в гидридную («мокрое»
озоление). Сложность усугубляется неустойчивостью гидридных форм
селена ( Ермаков В.В..2001) .
Количественный рентгеновский микроанализ (РМА) позволяет определять
концентрацию
микроэлементов
без
разрушения
тканей,
однако
пробоподготовка заключается в удалении или иммобилизации воды
(Goldstein J., 2003). Степень обезвоживания образцов обуславливает точность
количественного
определения
микроэлементов.
При
более
щадящем
обезвоживании объекта снижается вносимая в образец энергия вследствие
худшего вакуума в колонне микроскопа. Глубокое обезвоживание позволяет
использовать волновой дисперсионный спектрометр (ВДС), у которого
отсутствуют спектральные артефакты, а точность измерения на порядок
превышает РФА и ЭДС . (Гоулдстейн Дж.,1984).
Обезвоживание может быть химическим (пропускание фиксированных
тканей через несколько смен этилового или метилового спирта или ацетона).
Используется
сушка
в
критической
точке
(перенесение
тканей
из
обезвоживающих жидкостей (метанол, этанол, ацетон) через промежуточные
60
жидкости (амилацетат, фрион) в переходную жидкость (двуокись углерода )
с последующей сушкой в критической точке ( для двуокиси углерода –
304К). Применяется лиофильная сушка (сублимация льда из клеток и тканей
в вакууме).
Перечисленные виды пробоподготовки для количественного определения
йода дискутабельны. Химическое обезвоживание образца приводит к
потерям йода в связи с его способностью растворяться в органических
растворителях, в том числе, в спиртах и альдегидах.( Rognoni J.,1974).
Замораживание образца (обычно при температуре жидкого азота) чревато
повреждением его структуры кристаллами льда. При лиофильной сушке
проводится замещение воды проникающими криопротектантами, такими как
глицерин или диметилсульфоксил, что приводит к некоторому уменьшению
деформации образца, но возникают другие проблемы – криопротектанты
остаются в тканях после сушки и могут повлиять на точность измерений.
Метод более применим к клеточным монослоям и тонким жидким образцам
(с толщиной не более 2 мкр, когда толщина образца сопоставима с глубиной
зонда) (Гоулдстейн Дж.,1984).
Для анализа массивных объектов (с толщиной более 2 мкр) высушивание в
замороженном состоянии не рекомендуется из-за возрастания размера
области генерации рентгеновского излучения (Echlin P., 1979) .
Однако в работах последних лет появились данные о том, что температуры
порядка – 20оС не приводят к снижению концентрации йода в биологических
образцах . (Hansson M., 2008).
Таким
образом,
микроэлементов,
аналитической
в
пробоподготовка
том
проблемой,
числе
при
йода
значительно
и
аналитическом
селена,
влияющей
определении
является
на
серьезной
достоверность
результатов.
61
1.8. Применение ренгенфлюоресцентных методов для определения йода
и селена в тканях человека и крыс
Методы идентификации и количественного определения йода и селена в
биологических тканях – одна из трудных процедур в аналитической химии в
связи с низким содержанием этих микроэлементов в исследуемых объектах.
Сложность при аналитическом исследовании содержания йода связана с
его поливалентностью и летучестью, возможностью вступать в окислительно
– восстановительные реакции с компонентами анализируемого продукта.
Определение селена затруднено в связи с тем, что он присутствует в
биоматериалах в различной степени окисления, следовательно, возникают
трудности при переводе всех соединений селена в одну форму (Ермаков
В.В.,2010).
Большинство результатов РМА в биологии получают простым сравнением
различных рентгеновских спектров в виде карты распределения элементов по
образцу при ЭДС. Такие полуколичественные методы позволяют лишь
обнаружить возможное присутствие отдельных элементов и установить, что
в некоторых областях образца содержание элемента выше, чем в других.
Термин «концентрация» при РМА трактуется как локальная массовая доля
(масса элемента в анализируемом микрообъеме, деленная на общую массу
образца в том же микрообъеме – вес/вес).
Эта особенность РМА ограничила применение метода для определения
микроэлементов
в
биологических
исследователей
интересовали
тканях,
так
абсолютные
как
большинство
величины
содержания
микроэлементов. Так, фундаментальные работы по определению содержания
селена
в
тканях
крыс
были
выполнены
с
помощью
нейтронно–
активационного анализа ( Bates J.,2000). Этот же метод активно применяется
62
и при исследовании содержания йода в биологических тканях (Zaichick V.
Ye.,1996).
Однако ряд работ посвящен и детализации распределения микроэлементов
в тканевых структурах. Например, методом РМА(ЭДС) было исследовано
распределение йода в различного размера фолликулах щитовидной железы
крыс ( Robinson W., 1969).
Определенное внимание уделялось определениям «карты распределения»
йода в щитовидной железе у человека с помощью РФА (Fragu P., 1988;
Hansson M.,2007). Исследовалось и содержание йода в щитовидной железе
при различных видах патологии – например, при гипертиреозе (Aubert B.,
1981)
По
мнению
экспертов,
методы
РФА
получили
наибольшее
распространение при исследовании содержания йода в щитовидной железе и
крови (Börjessonand J., 2007).
В последнее время появились работы, посвященные применению РМА
(ЭДС) для сравнительного исследования микроэлементного состава и в
других органах, например, в матке и лейомиоме матки (Ekincia N., 2008).
Детализации распределения йода в тканях щитовидной железы был дан
новый импульс, когда исследования показали, что дефицит и избыток йода
играет определенную роль в возникновении и прогрессировании рака
щитовидной железы (Kanno J,1992) и выявили изменение (снижение) уровня
НИС в малигинизированных тканях как щитовидной (Smanik P.A., 1996), так
и молочной желез (Kilbane M.,2000).
Механизмы,
неизвестны
и
стимулирующие
опухолевую
исследователями
были
трансформацию,
предприняты
попытки
были
вновь
использовать РФА для определения содержания йода в злокачественных
тканях щитовидной железы, аналогично исследованию Tadros T. (1981).
63
Появились работы, посвященные оптимизации методики и пробоподготовки
для исследований по данному вопросу (Hansson M.,2008).
В настоящее время для детализации распределения йода в тканях
предложено совмещение рентгенофлуоресцентного метода и вторичной
ионной масс-спектрометрии ( Hansson M.,2012). Однако результаты
вышеприведенной комбинации дискутабельны: РФА позволяет провести
количественное определение йода в тканях без пробоподготовки, но в низком
вакууме
и,
следовательно,
с
высокими
пределами
обнаружения
микроэлемента; вторичная ионная масс-спектрометрия дает возможность
определить
при
электронной
микроскопии
структуры
клеток,
но
пробоподготовка агрессивными химическими средами может привести к
потерям йода.
Метод РМА (ВДС) в исследованиях биологических объектов применялся
ограничено.
В
основном,
органоминеральных
агрегатов
он
применялся
биогенного
при
исследовании
происхождения,
например,
почечных камней ( Нигматулина Е.Н., 2004), не требовавших обезвоживания.
В литературе имеются работы, посвященные исследованию мягких
биологических тканей с помощью РМА (ВДС), однако при пробоподготовке
образцы подвергались «мокрому озолению», и следовательно, терялся один
из положительных моментов метода ВДС – возможность исследовать ткани
без их деструкции. (Pavel J., 1988).
Таким образом, в последние годы у исследователей появился интерес к
детализации распределения йода и селена в тканях эндокринной системы
людей и животных. Однако возможности систематического исследования
при
наиболее
точном
методе
рентгенспектрального
количественного
микроанализа РМА (ВДС) ограничивались методологией пробоподготовки.
Возможность
исследовать
распределение
йода
и
селена
наиболее
чувствительным методом микроанализа, вероятно, позволит не только
64
составить «карты распределения» йода и селена в эндокринных органах
человека и экспериментальных животных (крыс), но и выявить возможные
изменения
распределения
микроэлементов
после
воздействия
фармакологических препаратов или при развитии патологии.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1.Принципы группировки материала (дизайн исследования)
Постановка
проблемы,
цель
и
задачи
исследований,
разработка
программы исследований и её методологии, экспериментальные работы,
анализ и обобщение полученных результатов выполнены автором лично, в
качестве соискателя Центра оперативной оценки состояния человека
(руководитель центра, зав. кафедрой
технологии спорта и системного
анализа, профессор докт. биол. наук Исаев А.П.).
Отдельные разделы
диссертации выполнены в сотрудничестве (доля участия автора не менее
75%) с сотрудниками кафедры фармакологии (зав. кафедрой проф. докт.
биол. наук Самородова И.М.), кафедры анатомии и гистологии (зав.
кафедрой проф. докт. вет. наук Стрижиков В.К.) ФГБОУ ВПО «Уральская
академия ветеринарной медицины МСХР РФ», лаборатории электронной
микроскопии
Южно-Уральского
государственного
университета
(заведующий кафедрой – профессор докт. техн. наук Михайлов Г.Г.), научноисследовательского
центра
«Нанотехнологии»
Южно-Уральского
государственного университета (заведующий докт. хим. наук Авдин В.В.),
иммунологической лаборатории НУЗ «Дорожная клиническая больница ОАО
«РЖД» на ст. Челябинск» (заведующая отделением Малахова Е.Г.),
областном
патологоанатомическом
бюро
МЗ
Челябинской
области
(начальник – канд. мед. наук Г.В. Сычугов).
В период с 2008 по 2012 было выполнено 4 серии опытов.
65
I-я серия опытов состояла в разработке метода дегидратации образцов
биологических тканей, позволяющего достигнуть постоянной массы образца
при минимальной потере йода (комбинация вакуумного и термального
подсушивания
образцов).
Использовались
образцы
человеческой
щитовидной железы. Применялся метод рентгенфлюоресцентного анализа (в
низком вакууме).
2-я серия экспериментов состояла в определении содержания йода и
селена в эндокринных органах крыс (щитовидных железах, гипофизах,
яичниках, семенниках, надпочечниках, гипоталамусах, поджелудочных
железах). Применялся метод рентгеноспектрального микроанализа (в
глубоком вакууме – «метод точек»).
3-я серия опытов состояла в определении содержания йода в тканях
человека - в щитовидных железах, гипофизе и яичниках у женщин.
Применялся метод рентгеноспектрального микроанализа в глубоком вакууме
(метод точек).
4-я серия опытов проводилась в 3 этапа:
I-й этап – экспериментальное исследование воздействия однократного
применения йодида калия в дозировке, соответствующей содержанию йода в
щитовидной железе – 4 мкг/100 гр веса животного
II-й этап – экспериментальное исследование воздействия однократного
применения йодида калия в различных дозировках (от 1 мкг до 25 мкг/100 гр
веса животного) на гипофизарно – тиреоидную и гипофизарно – гонадную
системы самок – крыс
III-й этап – экспериментальное исследование воздействия йод индуцированной блокады щитовидной железы (8 мкг/100 гр веса животного
в течение 5 дней) на гипофизарно – тиреоидную и гипофизарно – гонадную
системы самок - крыс
В
2008
при
разработке
пробоподготовки
биосубстратов,
было
использовано 6 человеческих щитовидных желез (3 мужчины и 3 женщины,
средний возраст 57,6 лет). В 2011 году было проведено исследование тканей
66
человека - щитовидных желез, гипофизов и яичников у 2–х женщин (средний
возраст женщин составил 42,5 года). Фатальный исход во всех случаях не
был связан с патологией щитовидной железы, гипофиза или яичников. Забор
тканей производился при ранних патологоанатомических вскрытиях,
выполненных в Челябинском областном патологоанатомическом бюро
(начальник – канд. мед. наук Г.В. Сычугов) и патологоанатомическом
отделении Дорожной клинической больницы на ст. Челябинск (заведующая
отделением – Чубатова Н.А.). Все исследования проводились в строгом
соответствии и с соблюдением биоэтических норм.
В период с 2008 по 2012 год в условиях вивариев ФГБОУ ВПО
«Уральская академия ветеринарной медицины Минсельхоза России» (г.
Троицк) и МУБК «Зоопарк» г.Челябинска – согласно договору о научно –
практическом сотрудничестве с ФГБОУ ВПО «Уральская академия
ветеринарной медицины МСХР РФ» (г. Троицк) (от 18,04.2007) было
проведено 3 серии опытов на 311 беспородных крысах (308 самки 6месячного возраста массой 250 + 30г и 3 самца 6-месячного возраста массой
320 + 40г). Животные содержались в виварии со стандартным световым
режимом (12 ч света: 12 ч темноты (дневная фаза – с 7:00 до 19:00 летнего
времени)) и температурой (24±1oC); получали стандартный корм и воду.
Эксперимент проводился в соответствии с «Правилами проведения работ с
использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу
Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 года № 775) и
Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для
экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г.European Community Directive 86/609/EC). Самки были взяты в опыт в фазы
диэструса и метаэструса. Анализ цикличности функционирования гонад
проводился на основании исследовании вагинальных мазков.
Схема проведения опытов представлена в таблице 1.
67
Таблица 1.Схема проведения экспериментальных опытов
Количество
животных
Группы животных
2-я серия опытов: определение содержания йода и селена в
эндокринных органах крыс
3-я серия опытов: определение содержания йода в некоторых
в группе
6
6
эндокринных тканях женщин и самок - крыс
4-я серия опытов
I-й этап – экспериментальное исследование воздействия
однократного применения йодида калия в дозировке 4
53
мкг/100 гр веса животного
контроль
I-я – однократное применения йодида калия в дозировке 4
мкг/100 гр веса животного, эвтаназия через 48 часов
II-я – однократное применения йодида калия в дозировке 4
мкг/100 гр веса животного, эвтаназия через 120 часов
16
18
19
II -й этап – экспериментальное исследование воздействия
однократного применения йодида калия в различных
121
дозировках (от 1 мкг до 50 мкг/100 гр веса животного);
68
эвтаназия через 48 часов
контроль
37
I-я – 1 мкг /100 гр веса животного
21
II-я – 4 мкг /100 гр веса животного
23
III-я – 8 мкг /100 гр веса животного
20
IV-я – 25 мкг /100 гр веса животного
20
III-й этап – экспериментальное исследование йод индуцированной блокады щитовидной железы (8 мкг/100 гр
125
веса животного в течение 5 дней)
I-я – контроль
I-я – 2 день БЩЖ (эвтаназия через 24 часа после
однократного введения йодида калия)
II-я – 3 день БЩЖ (эвтаназия через 48 часов после
однократного введения йодида калия)
III-я – 4 день БЩЖ (эвтаназия через 48 часов после
двукратного введения йодида калия)
IV-я – 5 день БЩЖ (эвтаназия через 48 часов после
трехкратного введения йодида калия)
V-я - 6 день БЩЖ (эвтаназия через 48 часов после
четырехкратного введения йодида калия)
VI-я - 7 день БЩЖ (эвтаназия через 48 часов после
пятикратного введения йодида калия)
35
12
20
15
14
15
14
69
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исходя из целей и задачей исследования использовались следующие
методы:
2.2. Взвешивание образцов.
Исследования
«Нанотехнологии»
проводились
в
Южно-Уральского
научно-исследовательском
государственного
центре
университета
(заведующий докт. хим. наук Авдин В.В.). Взвешивание образцов
проводилось на высокоточных аналитических весах Sartorius MSA225S-100DI (Германия). Технические характеристики прибора: дискретность отсчета
– 0,01 мг; диапазон взвешивания – 200 г; наименьший предел взвешивания –
20 мг; калибровка – внутренняя линия равной теплотворной способности;
выравнивание – автоматическое; ветровая защита – автоматическая с
ионизатором; дисплей – цветной сенсорный экран TFT с высоким
разрешением.
2.3. Термометрия у самок - крыс.
Исследование ректальной термометрии у самок – крыс (1 и 2 этап 4 серии
опытов) проводились электронным термометром OMRON Eco TEM CMC –
203-E (Япония).
Исследования региональной термометрии (3 этап 4 серии опытов)
проводились на базе кафедры «Теория и методика физической культуры и
спорта» (НИУ) (Институт спорта туризма и сервиса ФГБОУ ВПО ЮУрГУ
(зав. кафедрой проф. Исаев А.П.). Термометрия проводилась компьютерным
многоточечным термометром с датчиками DS18B20 (USA) в 5 различных
регионах: правое ухо, левое ухо, влагалище, верхняя треть хвоста, средняя
треть хвоста, нижняя треть хвоста.
70
2.4. Цитологическое исследование вагинальных мазков самок – крыс
Исследования проводились на кафедре анатомии и гистологии (зав.
кафедрой проф. докт. вет. наук Стрижиков В.К.) ФГБОУ ВПО «Уральская
академия ветеринарной медицины МСХР РФ». Для определения стадии
эстрального цикла у экспериментальных животных глазной пипеткой в 12
час дня брали влагалищные мазки (Кабак Я.М.,1968). Мазки окрашивали по
Романовскому — Гимзе: фиксировали в метиловом спирте, окрашивали
красящим раствором в течение 20 — 25 минут при 37°C во влажной камере
(закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После
окрашивания мазки промывали в дистиллированной воде, сушили на воздухе
и исследовали при масляной иммерсии при увеличении в 300 раз в слегка
затемненном поле.
В
фазе
проэструса
(предтечки)
мазки
содержали
округлые
или
многоугольные эпителиальные клетки с зернистой цитоплазмой и крупным
ядром, расположенные по одиночке или группами.
В фазе эструса (течки) мазок состоял из крупных ороговевающих
безъядерных клеток, в виде чешуек неправильной формы.
В
фазе
метаэструса
(послетечки)
мазок
содержал
одновременно
ороговевающие чешуйки, эпителиальные клетки и лейкоциты.
В фазе диэструса (межтечки или стадии покоя) мазок характеризовался
значительным
количеством
лейкоцитов
и
слизи,
с
единичными
эпителиальными клетками
2.5.
Иммуноферментный
анализ
гормонального
статуса
экспериментальных животных
Исследование
гормонального
статуса
было
проведено
в
иммунологической лаборатории НУЗ «Дорожная клиническая больница
71
ОАО « РЖД» на ст. Челябинск» (главный врач канд. мед. наук Дубачинский
Л.Я., заведующая отделением Малахова Е.Г.).
Определение концентрации гормонов в сыворотке крови самок - крыс
проводилась в иммунологической лаборатории НУЗ «Дорожная клиническая
больница
ОАО«РЖД»
иммуноферментного
на
ст.
анализа
Челябинск»
на
методом
иммуноферментном
твердофазного
автоматическом
анализаторе (фотометр «BIO – RAD model 680 MR 12726», США),
оснащенным программным обеспечением Microplate Maneger (США)
(каталожный номер №170-9529) через встроенный двунаправленный
последовательный интерфейс RS-230.
В сыворотке крови животных определяли содержание тиреоидных
гормонов – общего 3,5,3'–трийодтиронина (оТ3), свободного тироксина (сТ4),
тиреотропного гормона (ТТГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ),
лютеинизирующего гормона (ЛГ) и прогестерона с использованием
стандартных наборов тест–систем ОАО «Алкор–Био» (Санкт–Петербург,
Россия), эстрадиола - с использованием тест – систем «GmbH» (Германия).
При
твердофазном
иммобилизованными
иммуноферментном
антителами
анализе
добавляют
к
раствор,
носителю
с
содержащий
анализируемый антиген. В процессе инкубации на первой стадии на твердой
фазе образуется комплекс антиген-антитело. Затем носитель отмывают от
несвязавшихся
компонентов
и
добавляют
меченные
ферментом
специфические антитела.
После вторичной инкубации и удаления избытка конъюгата антител с
ферментом определяют ферментативную активность носителя, которая
пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.
На
стадии
выявления
специфического
иммунокомплекса
антиген
оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и
меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения
72
названия
«сэндвич»-метод. Ферментативная реакция
(цветная
реакция)
проходит в присутствии перекиси водорода и субстрата, представленного
неокрашенным соединением, которое в процессе пероксидазной реакции
окисляется до окрашенного продукта реакции на заключительном этапе
проведения
исследования.
количества
выявленных
Интенсивность
окрашивания
специфических
зависит
антител.
от
Результат
оценивается спектрофотометрически .
С учетом инструкций фирмы – производителя при твердофазном
иммуноферментном анализе содержания гормонов в крови самок – крыс
нами использовались 2 моноклональных антитела с различной этиотропной
специфичностью
к
исследуемому
гормону
–
одно
из
антител
иммобилизовано на твердой фазе (внутренней поверхности лунок) второе –
конъюгировано
с
пероксидазой
хрена.
В
лунках,
при
добавлении
исследуемой сыворотки крови и конъюгата анти – гормон – пероксидаза, во
время инкубации одновременно происходила иммобилизация гормона,
содержащегося в исследуемом образце, и связывание образовавшегося
комплекса с конъюгатом. Несвязавшиеся компоненты удалялись промывкой.
Количество
связавшегося
конъюгата
было
прямо
пропорционально
количеству гормона в исследуемом образце.
Во
время
инкубации
с
раствором
тетраметилбензидина
(ТМБ)
происходило окрашивание раствора в лунках; степень окраски была прямо
пропорциональна концентрации гормона в анализируемых пробах. После
измерения оптической плотности на основании калибровочного графика
определяли уровень гормона в образцах.
Все реагенты перед проведением анализа были тщательно перемешаны
и доведены до комнатной температуры (18…25 оС). Составлялся протокол
маркировки лунок: отдельно маркировались лунки для измерения величины
оптической плотности раствора тетраметилбензидина (ТМБ), калибровочных
проб, и контрольной сыворотки. В оставшиеся лунки вносились по 50 мкл
73
исследуемой сыворотки крови. Затем во все лунки, кроме содержащих ТМБ,
вносили конъюгат гормона и пероксидазы. Стрипы инкубировали в течение
часа в термостатированном шейкере при температуре 37оС при встряхивании
со скоростью 500-800 об/мин.
По окончании инкубации содержимое лунок удаляли декантированием,
лунки промывали четыре раза с помощью промывочного буфера (при
каждой промывке во все лунки добавляли по 300 мкл промывочного буфера
и встряхивали рамку на шейкере в течение 5-10 секунд с последующим
декантированием). Затем во все лунки немедленно вносили по 100 мкл
раствора ТМБ и инкубировали стрипы в темноте при комнатной температуре
в течение 15-30 минут в зависимости от степени развития окраски.
Затем во все лунки вводили по 100 мкл стоп-реагента для остановки
ферментной реакции. На фотометре вертикального сканирования измеряли
оптическую плотность в лунках при длине волны 450 нм и с помощью
программного обеспечения рассчитывали концентрацию гормона в образцах.
2.6.
Морфологические
методы:
Морфологическое
исследование
тканевых образцов (световая микроскопия). Иммуногистохимическое
исследование тканевых образцов.
Морфологические методы были выполнены на кафедре анатомии и
гистологии (зав. кафедрой проф. докт. вет. наук Стрижиков В.К.) ФГБОУ
ВПО «Уральская академия ветеринарной медицины Минсельхоза России»,
областном
патологоанатомическом
бюро
МЗ
Челябинской
области
(начальник – канд. мед. наук Г.В. Сычугов).
Морфологическое
исследование
тканевых
образцов
(световая
микроскопия).
Фрагменты материала, не отмывая водой, помещали в 10 % раствор
формалина на 24 часа. Затем материал обезвоживали, обезжиривали
и
74
заливали в парафин в гистологическом автомате по общепринятой методике
(Меркулов Г.А., 1961г.). С парафиновых блоков готовили срезы толщиной 5
мкм по несколько (2 – 3) на 2 – 3 предметных стеклах. Для окраски
депарафинированных срезов для световой микроскопии использовались
гематоксилин и эозин. Растворы красителей были приготовлены по
общепринятым прописям (Пирс Э., 1962 , Саркисов Д.С., Перов Ю.Л.. 1996).
Иммуногистохимическое исследование тканевых образцов
Для
иммуногистохимического
исследования
тканевые
образцы
фиксировали в 10 % растворе нейтрального забуференного формалина в
течение 18 – 24 часов, заливали в парафин по общепринятым стандартам.
Затем готовили гистологические срезы толщиной 5 мкм. Срезы помещали на
покрытые силаном предметные стекла («DAKO», Дания), тщательно
высушивали, депарафинировали, обезвоживали и отмывали в растворе трисбуфера при рН 7,2 – 7,4.
Мы применяли моноклональные (МКАТ) или поликлональные (ПКАТ)
антитела, предназначенные для работы с парафиновыми срезами. Варианты
обработки депарафинированных срезов соотвтествовали виду антител с
учетом инструкций фирмы – производителя. Для восстановления структуры
антигенов на поверхности клеток, изменившихся в процессе фиксации ткани,
гистологические срезы подвергали термической обработке в СВЧ печи при
95оС в течение 30 минут в цитратном буферном растворе при рН 6,0. После
отмывки в буфере наносили пероксидазный блок в течение 5 минут, вновь
промывали в буфере, наносили на препарат МКАТ/ПКАТ в рабочих
разведениях (таблица 2) и продолжали инкубацию в течение 60 минут при 37
о
С. Для визуализации антигенреактивных клеток использовали тест –
систему « Novostain Universal Detection Kit» («Novocastra», Newcastle upon
Tyne, Великобритания). После окончания инкубации с первичными
антителами препараты отмывали и обрабатывали сначала вторичными
75
Рисунок1. Процедура извлечения гипофиза крысы.
биотилированными атителами (при рабочем разведении 1:50 в течение 5
минут при комнатной температуре в 50 mmol Tris HCl (0.01 % H2O2, pH
8.0)), затем третичными стрептавидиновыми антителами в течение 30 минут
(разведение 1:100 в блокирующем буфере).
Препараты исследовались с помощью светового микроскопа Axiostar plus
(Carl Zeiss Jena, Germany), оснащенного 35 мм фотоаппаратом (Cannon Power
Shot
A520).
Подсчет
числа
клеток
с
позитивным
(коричневым)
иммуногистохимическим окрашиванием проводился при увеличении х 400
по проценту окрашенных клеток (positive area % (PA%). Результаты
подвергались
автоматизированному
количественному
анализу
с
использованием программного обеспечения BioVision Professional 3.0 (West
Medica Handels GmbH, Vienna, Austria).
76
Таблица 2. Характеристика моноклональных и поликлональных антител для иммуногистохимического исследования
МКАТ/ ПКАТ
Клон
Рабочее
Фирма – изготовитель
разведение
TSH
QB2/6
1:200
«Novocastra», Newcastle upon Tyne, Великобритания
FSH
INN-hFSH-60
1:2500
«Novocastra», Newcastle upon Tyne, Великобритания
LG
C93
1:75
«Novocastra», Newcastle upon Tyne, Великобритания
Caspase-3(CPP3)
GHM62
1:50
«Novocastra», Newcastle upon Tyne, Великобритания
Caspase-8(CPP8)
11B6
1:30
«Novocastra», Newcastle upon Tyne, Великобритания
1:100
«Abbiotec», San Diego, США
NIS
Bcl-2
bcl-2/100
Ready to use
«BioGenex», San Ramon, California, США
« Novostain
NCL - D
Ready to use
«Novocastra», Newcastle upon Tyne, Великобритания
Universal
Detection Kit»
77
2.7. Количественный
микроанализ.
Количественный
рентген-
флюоресцентный микроанализ. Количественный рентгенспектральный
микроанализ (РМА) образцов тканей с помощью спектрометра волновой
дисперсии.
Количественный
рентген-флюоресцентный
микроанализ
(XRF
spectrometry quantitative analysis).
Рентгенфлюоресцентный
исследовательском
центре
микроанализ
был
выполнен
«Нанотехнологии»
в
научно-
Южно-Уральского
государственного университета (заведующий докт. хим. наук Авдин В.В.).
Количественный рентген-флюоресцентный микроанализ был проведен с
помощью рентген – флюоресцентного спектрометра
Supermini (Rigaku,
Япония).
Рисунок 2. Рентген – флюоресцентный спектрометр Supermini (Rigaku,
Япония).
Измерения проводились при полной мощности рентгеновской трубки (50
кВ и 4,0 мА), с использованием стандартных кристаллов LiF (200), PET, и
RX25.
78
Рисунок.
4.
Спектрограмма
йода
при
рентген-флюоресцентной
спектрометрии.
Общее время анализа для всех пиков и фоновых линий составляло около 4
мин на образец. Исследования проводились на воздухе и в вакууме (3 Pa).
Результаты выражались как миллиграмм/грамм (мг/г).
Система была откалибрована с помощью калия йодида в различных
концентрациях на воздухе и в вакууме (3 Pa).
Количественный рентгенспектральный микроанализ (РМА) образцов
тканей с помощью спектрометра волновой дисперсии (electron probe
microanalysis
(EPMA)
Wavelength
dispersive
spectrometry
(WDs)
quantitative analysis)
Количественный рентгеноспектральный микроанализ был проведен в
лаборатории электронной микроскопии Южно-Уральского государственного
университета (заведующий кафедрой – профессор, докт. техн. наук
Михайлов Г.Г.).
79
Так как перед EPMA на исследуемый образец проводится напыление
платины в вакууме
(3Pa), то
во избежание двойного
вакуумного
подсушивания, было решено поменять этапность пробоподготовки: образцы
сначала подвергались термальному подсушиванию, а затем – вакуумному.
Для определения содержания йода и селена в эндокринных органах крыс с
помощью EPMA фрагменты тканей были высушены при 100оС в течение 45
минут. После подсушивания проводилось напыление платины на образцы в
напылителе JFC-1600 Auto Fine Coater (JEOL, Tokyo, Japan) при достижении
глубины вакуума 3 Pa (этот процесс соответствовал этапу вакуумной сушки).
После
напыления
образцы
исследовались
с помощью
растрового
электронного микроскопа JEOL JSM – 6460LV (JEOL, Tokyo, Япония)
оснащенного спектрометром волновой дисперсии (ВДС - WDS) Inca 500
(Oxford
Instruments,
High
Wycombe,
UK)
и
энергодисперсионным
спектрометром (ЭДС - EDS) Inca 7574 (Oxford Instruments, High Wycombe,
UK) при 20 кВ, 2,5 нА, в высоком вакууме.
Рисунок 5. Растровый электронный микроскоп JEOL JSM – 6460LV (JEOL,
Tokyo, Япония)
80
Время исследования каждой анализируемой точки при ВДС составило 20
секунд. С помощью мультиспектральной аналитической Oxford Inca Energy
Wave Crystal EWC453 (Oxford Instruments, High Wycombe, UK, 2003)
определялось отношение пик/фон для изучаемого элемента в анализируемой
точке. В каждом образце исследовалось не менее 5 точек на элемент.
Анализируемые точки, в которых определялся йод, были определены как
йод положительные точки (ЙПТ). Определялся уровень йода в ЙПТ и
процентное соотношение йод позитивных точек к числу всех анализируемых
на содержание йода точек в данном образце (% ЙПТ). Аналогично
оценивалось содержание селена в образцах – определялся уровень селена в
селен-позитивных точках и процентное соотношение селен-позитивных
точек ко всем исследуемым на содержание селена точкам в образце
Рисунок 6. Спектрограмма микроэлементов при рентгенспектральном
анализе.
81
.
Рисунок 7. Микрофотография человеческой щитовидной железы после
зондового микроанализа (ВДС – анализ точек).
Результаты выражались как масс% (1г/100г)х10-2 сухого веса.
Йодид серебра в виде тонкого слоя и 1,5% сплав олова с селеном
использовались в качестве стандартов. Каждый стандарт был исследован
дважды с помощью энергодисперсионного спектрометра и спектрометра
волновой дисперсии перед каждой серией исследований.
2.8. Статистические методы
Для
выявления
использован
взаимосвязей
комплексный
между
статистический
изучаемыми
анализ.
факторами
был
Сравнение уровня
показателей, выражающихся непрерывными значениями, проводили после
проверки
нормальности
распределения
этих
признаков
по
тесту
Колмогорова82
Смирнова. При нормальном типе распределения (отличия между средней
арифметической (М) и медианой (Ме) менее 10 %) применялись следующие
методы вариационного анализа: определение средней арифметической (М),
ее
стандартной
ошибки
(m),
среднего
квадратичного
отклонения,
отражающего центральную тенденцию и вариабельность значений выборки,
оценка распределения величин (Платонов А.Е., 2000 ).
С целью преодоления эффекта множественных сравнений при числе
сравниваемых
групп
больше
двух
при
нормальном
распределении
использовался дисперсионный анализ (анализ суммы квадратов или анализ
вариации, но в силу традиции употребляется термин дисперсионный анализ).
Основной целью дисперсионного анализа является исследование значимости
различия между средними.
Наиболее широко нами применялся однофакторный дисперсионный
анализ и
многоранговый тест Дункана (для парных сравнений средних
значений признаков) (Литтл, Хиллз, 1981). При значимом результате
дисперсионного анализа этот тест показывает, какие именно группы значимо
отличаются друг от друга. Если значения критерия превышали критическое,
нулевую гипотезу отвергали и различия считали статистически значимыми
при р (уровне значимости) < 0,05
Справедливость нулевой гипотезы в некоторых сериях опытов оценивали с
помощью t–критерия Стьюдента (различие средних) (Гланц С.М., 1998).
Пороговая величина вероятности ошибки традиционно устанавливалась на
уровне равном 0,05.
Обработку данных выполняли в среде StatSoft. Inc. STATISTICA (data
analysis software system), version 6.0 и Exel из пакета Micrisoft Office 2007.
83
РЕЗУЛЬТАТЫ
СОБСТВЕННЫХ
ИССЛЕДОВАНИЙ
И
ИХ
ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 3. Разработка метода дегидратации образцов биологических
тканей
с
помощью
комбинации
вакуумного
и
термального
подсушивания
Разработка метода дегидратации образцов биологических тканей,
позволяющего достигнуть постоянной массы образца при минимальной
потере йода (комбинация вакуумного и термального подсушивания образцов)
проводилась в научно-исследовательском центре «Нанотехнологии» ЮжноУральского государственного университета (заведующий докт. хим. наук
Авдин В.В.). Использовались образцы человеческой щитовидной железы.
Взвешивание образцов проводилось на высокоточных аналитических весах
Sartorius
MSA225S-100-DI
(Германия).
Количественный
рентген-
флюоресцентный микроанализ был произведен с помощью рентген –
флюоресцентного спектрометра Supermini (Rigaku, Япония).
Ткани щитовидной железы были забраны путем стандартных процедур.
При заборе образцов исключался их контакт с какими – либо растворами.
Образцы щитовидной железы хранились в пластиковых контейнерах при – 20
о
С.
6 влажных фрагментов человеческой щитовидной железы (средний вес
18.5±2.0 мг) были исследованы с помощью рентген – флюоресцентного
спектрометра на воздухе, затем в вакууме (3 Pa). Затем фрагменты были
высушены при 100оС: 3 образца в течение 45 минут и 3 образца – в течение
90 минут. После подсушивания образцы были вновь исследованы в вакууме
(3 Pa). На каждом этапе проводилось взвешивание образцов. Соотношение
сухого и влажного веса было определено для каждого образца.
Таблица 3 показывает соотношение сухого и влажного веса человеческой
щитовидной железы после вакуумного и термального высушивания. Потеря
веса после вакуумного высушивания составила примерно 60 %, дальнейшее
84
подсушивание при 100оС в течение 45 минут привело к потере 70% веса, в
течение 90 минут – 80% (достигнув постоянной массы, в соответствии с
данными литературы (Frisch RE, 1977).
Динамика изменений уровня йода и веса щитовидной железы после
вакуумного и термального высушивания представлена в рисунках 8 и 9.
После вакуумного подсушивания уровень йода в образцах повысился на 22 %
(на фоне 60% снижения веса). При дальнейшем подсушивании образцов при
100оС в течение 45 минут уровень йода повысился на 44 % от исходного (при
70% потере веса). При подсушивании образцов при 100 оС в течение 90 минут
уровень йода снизился до исходного (при потере веса более 80%).
Таким
образом,
можно
было
сделать
заключение
о
том,
что
пробоподготовка методом комбинации вакуумного (3Pa) и термального
подсушивания (100оС в течение 45 минут) оптимальна для сохранения йода в
образцах щитовидной железы при их обезвоживании. Разработанная
пробоподготовка биологических образцов была оформлена в виде патента на
метод исследования «Метод определения содержания йода в биосубстратах
организмов», RU Patent 2366952 (Басалаева Н.Л., 2009).
Однако попытка аналогичного исследования эндокринных органов у крыс
оказалась неудачной, вероятно, в связи с малыми уровнями йода в органах.
Поэтому было решено для дальнейших исследований использовать более
чувствительный метод микроанализа.
85
Таблица 3.Соотношение сухого и влажного веса человеческой щитовидной
железы после вакуумного и термального высушивания (М±m)
Щитовидная
железа человека
Влажный вес
фрагмента
(мг)
Соотношение
сухого и
влажного веса
после
вакуумного
подсушивания
Соотношение
сухого и
влажного веса
после
вакуумного и
термального
подсушивания
Щитовидная
железа
(подсушивание в
течение 45 минут)
19.4±3.3
0.43±0.03
0.34±0.02
Щитовидная
железа
(подсушивание в
течение 90 минут)
16.7±2.7
0.41±0.02
0.22±0.01
86
20
18
18.1± 2.1
16
14
12
10
7.7±1.1*
8
6.5±1.2*
6
4
1.8±0.2
2.2±0.3*
2.6±0.5*
3.6±0.6*
2
1.7±0.0
0
влажная ткань
вакуумное подсушивание
вес фрагментов ( мг)
подсушивание 45 минут
подсушивание 90 минут
содержание йода (мг/г)
Рисунок 8. Изменения уровня йода в щитовидных железах и их веса после вакуумного и термального подсушивания
Примечание. * p ≤ 0,05 – различия с показателями влажной ткани щитовидной железы (тест Дункана).
87
Рисунок 9. Изменения уровня йода в щитовидной железе при рентгенфлюоресцентном микроанализе.
Примечания: a – уровень йода в щитовидных железах на воздухе; b – после
вакуумной подсушки; c – после подсушивания при 100оС в течение 45
минут (рост уровня йода); d– после подсушивания при 100оС в течение 90
минут (снижение уровня йода)
88
Глава 4. Определение содержания йода и селена в эндокринных органах
крыс
с
помощью
количественного
рентгеноспектрального
микроанализа
Количественный рентгеноспектральный микроанализ (РМА) образцов
тканей с помощью спектрометра волновой дисперсии (electron probe
microanalysis (EPMA) Wavelength dispersive spectrometry (WDs) quantitative
analysis) был проведен в лаборатории электронной микроскопии ЮжноУральского государственного университета (заведующий кафедрой –
профессор, докт. техн. наук Михайлов Г.Г.). Взвешивание образцов
проводилось в научно-исследовательском центре «Нанотехнологии» ЮжноУральского государственного университета (заведующий докт. хим. наук
Авдин В.В.).
Так как перед PMA на исследуемый образец проводится напыление
платины в вакууме
(3Pa), то
во избежание двойного
вакуумного
подсушивания, было решено поменять этапность пробоподготовки: образцы
сначала подвергались термальному подсушиванию, а затем – вакуумному.
Для определения нормативов содержания йода и селена в эндокринных
органах крыс с помощью PMA (ВДС – метод точек) использовались 6
интактных беспородных крыс (3 самки и 3 самца) весом 250-300 грам. Самки
были взяты в эксперимент в стадиях диэструса и метаэструса. Животные
были подвержены эвтаназии под эфирным наркозом в период с 11 ч до 13 ч
дневной фазы экспериментальных суток. Фрагменты 2 щитовидных желез, 2
гипофизов, 2 яичников, 3 семенников, 2 поджелудочных желез и 2
гипоталамусов были высушены при 100оС в течение 45 минут. Затем образцы
были высушены при вакууме
3 Pa. На каждом этапе проводилось
взвешивание образцов. Соотношение сухого и влажного веса определялось
для каждого образца.
89
Йод был определен в каждом образце (2 образца от различных органов),
селен – в 2 щитовидных железах и 2 гипоталамусах, и в одном образце из
остальных органов. Каждый образец был исследован в среднем 5.8 раз (для I)
и 5.6 раз (для Se) (Рисунок 10).
Анализируемые точки, в которых определялся йод или селен, были
определены как йод или селен положительные точки (ЙПТ или СеПТ). Так
же было определено процентное соотношение йод - позитивных точек ко
всем анализируемым по йоду точкам (%ЙПТ). Аналогично определялись
%СеПТ.
Рисунок 10. Микрофотография РМА (ВДС – анализ точек) щитовидной
железы (высокий вакуум, 20 кВ, 2,5 нА)
Потери
веса
образцов
органов
крыс
при
различных
этапах
пробоподготовки приведены в таблице 4. Постоянная масса фрагментов
органов весом в несколько микрограмм была достигнута уже при
высушивании при 100оС в течение 45 минут. Вакуумное подсушивание не
оказало влияние на соотношение сухого и влажного веса образцов. Все
цитируемые в дальнейшем уровни микроэлементов относились к сухому весу
образцов (с.в.).
90
137 точек были изучены рандомизировано (79 – I, и 58 – Se). Результаты
PMA (анализ точек) для йода и селена в эндокринных органах крыс
продемонстрированы в таблице 5. Было установлено, что в большинстве
эндокринных органов крыс уровень йода в позитивных точках одинаков
(исключая щитовидную железу и семенники) и может быть определен как
«базисный уровень». Уровень селена в позитивных точках был одинаков во
всех эндокринных органах.
Следует отметить, что в различных эндокринных органах изменялся и
процент йод-позитивных точек (от 100% в щитовидной железе до 37% в
поджелудочной железе). Процент селен-позитивных точек так же варьировал
в разных органах (от 80% в поджелудочной железе до 50% в яичниках).
Таким образом, при исследовании содержания йода в различных
эндокринных органах методом PMA (анализ точек) было выявлено, что в
зависимости от вида органа изменялся как уровень йода в йод-позитивных
точках, так и процент йод-позитивных точек. При аналогичном исследовании
селена было установлено, что в различных органах изменялся только процент
селен-позитивных точек. Интересно, что в органах с минимальным
процентом йод-позитивных точек наблюдался максимальный процент селенпозитивных точек (семенники, поджелудочная железа).
Таким образом, в результате исследования был установлен «базисный
уровень» йода в ЙПТ для большинства эндокринных экстратиреоидных
органов. При проведении следующих этапов эксперимента этот показатель
явился основанием для выбора доз йодида калия (по аналогии с
экспериментами Wolff J, Chaikoff IL (1948), использовавшими дозировку
йодида калия, 5 – кратно превышающую уровень йода в щитовидной железе
крыс.
91
Таблица 4. Соотношение сухого и влажного веса эндокринных желез крыс после вакуумного и термального
высушивания (М±m)
Соотношение сухого и
влажного веса после
термального и вакуумного
подсушивания
Орган
Влажный вес фрагментов
(мг)
Соотношение сухого и
влажного веса после
термального подсушивания
Щитовидная железа
15.4 ±0.3
0.32±0.05
0.30±0.07
Гипофиз
12.9±0.6
0.24±0.03
0.22±0.03
Гипоталамус
10.2±1.9
0.34±0.01
0.26±0.00
Яичник
8.3±0.7
0.30±0.09
0.29±0.09
Семенник
12.0±2.2
0.31±0.05
0.30±0.04
Поджелудочная железа
9.0±0.6
0.34±0.02
0.33±0.02
92
Таблица 5. Количественный рентгеноспектральный микроанализ (анализ точек) для йода и селена в эндокринных
органах крыс
Йод
Селен
ЙПТ (масс% x 10-2 с.в.)
Орган
(М±m)
% ЙПТ
Минима Максим
льное
альное
значение значение
СеПТ (масс% x 10-2 с.в.)
(М±m)
Минима
льное
значени
е
Максима
льное
значение
% СеПТ
Щитовидная железа
21.4±0.4*
0.9
59.0
100
2.8±1.5
0.4
6.3
62.5
Гипофиз
2.5±0.6
0.5
6.3
64.2
1.7±0.6
1.8
6.3
57.1
Гипоталамус
2.5±0.6
1.2
4.2
62.5
2.9±0.9
0.4
6.3
55.5
Яичник
2.5±0.6
0.9
4.9
46.1
1.9±0.9
0.4
5.6
50
Семенник
5.2±1.6*
3.0
8.4
46.2
1.6±0.4
0.4
2.4
80
Поджелудочная железа
1.8±1.2
0.6
4.2
37.5
3.9±0.4
2.5
5.2
83.3
Примечание. * p ≤ 0,05 – достоверные различия между органами (тест Дункана).
93
Глава 5. Определение содержания йода в некоторых эндокринных
тканях
женщин
и
самок-крыс
с
помощью
количественного
рентгеноспектрального микроанализа
Большинство экспериментальных исследований, посвященных тиреоидной
и репродуктивной системам было выполнено с использованием крыс (Pedraza
P, 2006). Однако экстраполяция научных данных отчасти затруднена –
например, демонстрация эффекта Вольфа-Чайкова (неорганический йод в
плазме крови, в дозировке, 5 – кратно превышающей уровень общего йода в
щитовидной железе, временно ингибирует транспорт йодида и образование
йодтирозинов в щитовидной железе) у человека остается предположительной
(Wolff J., 1969).
В связи с вышеизложенным целью следующей серии опытов стало
изучение и сравнение содержания йода в щитовидных железах, гипофизах и
яичниках у женщин и самок крыс с помощью РМА.
Были использованы 6 беспородных крыс – самок 6–месячного возраста со
средней массой 250 ± 40г. Животные содержались в виварии со стандартным
световым режимом (12 ч света: 12 ч темноты (дневная фаза – с 7:00 до 19:00
летнего времени)) и получали стандартный корм и воду. Самки были взяты в
опыт
в
фазы
диэструса
функционирования
гонад
и
метаэструса.
проводился
на
Анализ
цикличности
основании
исследования
вагинальных мазков.
Все животные были подвержены эвтаназии под эфирным наркозом в
период с 11 ч до 13 ч дневной фазы экспериментальных суток. У всех крыс
были изъяты щитовидные железы, гипофизы и яичники. Органы были
подвержены замораживанию при -20оС.
У 2 умерших женщин так же был произведен забор тканей щитовидной
железы, гипофизов и яичников. Ранние патологоанатомические вскрытия
выполнялись в Челябинском областном патологоанатомическом бюро
94
(начальник – канд. мед. наук Г.В. Сычугов) и патологоанатомическом
отделении Дорожной клинической больницы на ст. Челябинск ( заведующая
отделением – Чубатова Н.А.). Средний возраст женщин составил 42,5 года.
Фатальный исход не был связан с патологией щитовидной железы, гипофиза
или яичников. Ткани без контакта с жидкостями были заморожены в
пластиковых контейнерах при -20о С.
В
лаборатории
государственного
электронной
университета
микроскопии
(заведующий
Южно-Уральского
кафедрой
–
профессор
Михайлов Г.Г.) был проведен количественный рентгеноспектральный
микроанализ образцов тканей.
Было проведено 134 определения содержания йода в образцах тканей.
Результаты исследования уровней йода в тканях человека и крыс
приведены в таблице 6 и рисунке 11. В щитовидных железах у женщин и
самок–крыс йод определялся при всех измерениях (во всех точках). Средний
уровень йода у женщин составил 33,2±3,4 10-2масс% (минимальный уровень
– 15,8 10-2масс%, максимальный уровень – 69,8 10-2масс%). У самок–крыс
показатели соответственно составили 16,7±3,0 10-2масс% (минимум – 2,5 102
масс%, максимум – 56,4 10-2масс%).
При исследовании гипофизов было выявлено, что у женщин йод
определялся в большем числе измерений (80%) , чем у крыс (65%). Средний
уровень йода при всех измерениях составил у женщин – 5,2±1,1 10-2масс%, в
йод-позитивных точках – 6,5±0,1 10-2масс% ; минимальный уровень йода в
йод–позитивных точках был 1,3 10-2масс%, максимальный – 16,5 10-2масс% .
У самок – крыс средний уровень йода при всех измерениях был
определен как 1,4±0,3 10-2масс%, в йод позитивных точках – 2,2±0,3 102
масс%; минимальный уровень – 1,7 10-2масс%, максимальный – 6,3 10-
2
масс%.
95
При анализе данных было определено, что соотношение уровня йода у
самок – крыс и женщин по щитовидной железе и яичникам составило 1:2
(причем как по йод–позитивным точкам, так и по общему числу
определений), а соотношение уровней йода в гипофизах составило 1:4 по
общему числу точек и 1:3 по йод – позитивным точкам.
Сравнение уровня йода по всем точкам в оси щитовидная железа –
гипофиз – яичники составило у самок – крыс 11,9:1:1,2; у женщин – 6,3:1:0,6.
Соотношение уровня йода в йод–позитивных точках аналогично составило у
самок – крыс 7,7:1:1,4, у женщин – 5,1:1:0,9.
Таким образом, по результатам проведенного исследования было
выявлено:
-
видовая пропорция содержания йода 2:1 у женщин и самок – крыс
характерна не только для щитовидной железы, но и для экстратиреоидных
органов (гипофиз, яичники)
- содержание йода в йод-позитивных точках в гипофизах у самок – крыс и
женщин различается более выражено ( в 4 раза), чем в щитовидных железах и
яичниках ( в 2 раза).
По – видимому, в эндокринологии при исследованиях, посвященных
воздействию йода на гипофизаро - тиреоидную и гипофизарно-гонадную
системы, экстраполяцию «крыса – человек» предпочтительно проводить с
учетом соотношения уровней йода в ЙПТ гипофиза. Полученные данные по
нашему
менению,
необходимо
учитывать
в
экстраполяции
экспериментальных данных на человека: доза йодида калия в эксперименте
Вольфа-Чайкова рассчитывалась из пропорции дозы йодида к уровню йода в
щитовидной железе крысы, а не человека.
96
Таблица 6.Сравнительная характеристика уровня йода в щитовидных железах,
гипофизах и яичниках у женщин и самок – крыс (М ± m)
Щитовидная
Самки –
крысы
( во всех точках)
железа
Гипофиз
Яичники
10 -2 масс%
10 -2 масс%
10 -2 масс%
16,7±3,0
1,4±0,3
1,7± 0,4
(18)
(32)
(33)
Женщины
33,2±3,4*
5,2±1,1*
3,2± 1,2
( во всех точках)
(16)
(20)
(15)
16,7±3,0
2,2±0,3
3,1±0,8
(18)
(32)
(33)
33,2±3,4*
6,5±0,1*
6,1±1,7*
(16)
(16)
(8)
Самки – крысы
( в йод –
позитивных
точках)
Женщины
( в йод –
позитивных
точках)
Примечание. * p ≤ 0,05 различия между женщинами и самками крыс (критерий
Стьюдента). В скобках – число исследований.
97
120
100
100
100
80
80
66
65
54
60
40
20
0
женщины
крысы - самки
процент йод - позитивных точек
щитовидная железа
гипофиз
яичники
Рисунок 11 . Процент йод - позитивных точек в щитовидной железе, гипофизе и яичниках у женщин и самок – крыс
98
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЙОДИДА
КАЛИЯ НА ГИПОФИЗАРНО-ТИРЕОИДНУЮ И ГИПОФИЗАРНОГОНАДНУЮ СИСТЕМЫ САМОК-КРЫС
Аналогом для данного исследования послужили эксперименты Wolff J,
Chaikoff IL, 1948 при открытии феномена Вольфа-Чайкова. В этом
эксперименте феномен Вольфа-Чайкова (повышение уровня неорганического
йода в плазме крови блокирует образование органического йода в
щитовидной железе) проявлялся начиная с дозы йодида калия 25 мкг/100 г
в.ж., которая была приблизительно в 5 раз выше количества йода в
щитовидной железе крыс. Доза йодида калия, соответствующая уровню йода
в щитовидной железе крыс составила бы приблизительно 5 мкг/100 г в.ж.
Таким
образом,
аналогично
приведенной
схеме,
доза
йода,
соответствующая «базисному уровню» йода в йод – позитивных точках
большинства эндокринных органов крыс была определена как - 0,6 мкг/100 г
в.ж.
Исходя из приведенных расчетов для экспериментального исследования
были выбраны следующие дозы йодида калия:
- 1 мкг KI/100г в.ж. (как соответствующая «базисному уровню» йода в йодпозитивных точках большинства экстратиреоидных эндокринных органов
крыс)
- 4 мкг KI/100 г в.ж. (доза примерно в 5 раз превышала «базисный уровень»,
приблизительно соответствующая уровню йода в щитовидной железе)
- 8 мкг KI/100 г в.ж. (доза, в 2 раза превышающая уровень йода в щитовидной
железе крысы, соответствующая уровню йода в человеческой щитовидной
железе)
- 25 мкг KI/100 г в.ж. (доза, в 5 раз превышающая уровень йода в
щитовидной железе) – дозировка, при которой проявляется феномен Вольфа
– Чайкова) (Basalaeva N.L., 2011,1)
В последнее время в области экспериментальной и клинической
тиреоидологии
появились
новые
гипотезы,
уточняющие
механизм
99
воздействия йодидов на тиреоидную систему. Ряд авторов полагают, что йодиндуцированная инволюция щитовидной железы вызвана преимущественно
процессами апоптоза, а не некроза (Langer R. et al.2003). По мнению авторов,
данный механизм объясняет, почему воздействие больших дозировок
йодидов нормализует размеры щитовидной железы, не вызывая её атрофии.
Исходя
из
вышеизложенного,
оценка
функциональной
активности
гипофизарно – тиреоидной и гипофизарно – гонадной систем была
дополнена исследованием маркеров апоптоза – как каспазозависимого
(каспазы 3 и 8), так и митохондриального (bcl-2) .
Глава 6. Исследование воздействия йодида калия на гипофизарно –
тиреоидную и гипофизарно – гонадную системы самок – крыс при
однократном введении в дозировке 4 мкг /100 г массы животного
В эксперименте, выполненном на кафедре фармакологии ФГОУ ВПО
«Уральская академия ветеринарной медицины Минсельхоза России» (зав.
кафедрой проф. Самородова И.М.) были использованы 53 беспородных крыс
- самок 6-месячного возраста со средней массой 250 + 30г. Животные
содержались в виварии со стандартным световым режимом (12 ч света: 12 ч
темноты (дневная фаза – с 7:00 до 19:00 летнего времени)) и получали
стандартный корм и воду. 16 животных составили контрольную группу, 18 –
первую и 19 – вторую. Анализ цикличности функционирования гонад
проводился на основании определения гормонов репродуктивной сферы в
сыворотке крови и исследования вагинальных мазков.
Крысам 1 и 2 групп однократно через желудочный зонд вводили йодид
калия из расчета 4 мкг /100 г массы животного.
Все животные были подвержены эвтаназии под эфирным наркозом в
период с 11 ч до 13 ч дневной фазы экспериментальных суток; крысы первой
группы – через 48 часов после введения йодида калия, крысы второй
100
Рисунок 12. Зонд для инстилляций растворов.
Рисунок 13. Процедура инстилляций йодида калия.
группы–через 120 часов. Предварительно у животных проводились
термометрия (до наркоза) и забор крови из яремной вены. После забоя у
крыс извлекали щитовидные железы, гипофизы и яичники.
101
6.1. Исследование терморегуляции у самок крыс при однократном
введении йодида калия в дозировке 4 мкг /100 г массы животного
В контрольной группе показатели ректальной температуры 27,5±0,7 оС
соответствовали эутиреоидному состоянию животных, не отличаясь от
литературных данных на 12
00
- 1300 часов экспериментальных суток (Козлов,
В.Н.2008). В первой группе, через 48 часов после введения йодида калия,
данный показатель составил 27,3±0,2. Во второй группе (через 120 часов
после введения йодида калия) – 26,9±0,2.
Таким образом, при сравнении результатов исследования ректальной
температуры у животных всех групп не было выявлено достоверных
изменений.
6.2.
Исследование
функциональной
активности
тиреоидной
и
репродуктивной систем при однократном введении йодида калия в
дозировке 4 мкг /100 г массы животного
В сыворотке крови животных определяли
содержание тиреоидных
гормонов – общего 3,5,3'-трийодтиронина (оТ3), свободного тироксина (сТ4),
тиреотропного гормона (ТТГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ),
лютеинизирующего
гормона
(ЛГ)
и
прогестерона
методом
иммуноферментного анализа с использованием стандартных наборов тест–
систем ОАО «Алкор-Био» (Санкт-Петербург, Россия), эстрадиола методом
иммуноферментного анализа с использованием тест – систем «GmbH»
(Германия) на иммуноферментном автоматическом анализаторе (фотометр
«BIO – RAD model 680 MR 12726», США) в иммунологической лаборатории
НУЗ «Дорожная клиническая больница ОАО « РЖД» на ст. Челябинск».
Результаты исследования гормонов гипофизарно – тиреоидной системы в
сыворотке крови приведены в таблице 7. В контрольной группе ТТГ, оТ3 и сТ4
соответствовали
эутиреоидному состоянию животных, не отличаясь от
литературных данных (Козлов, В.Н.2008). В первой группе, через 48 часов
102
после введения йодида калия, изменение уровня тиреоидных гормонов и ТТГ
было характерно для легкой формы гипертиреоза (Козлов, В.Н.2008).
Во
второй группе (через 120 часов после введения йодида калия) концентрация
тиреоидных гормонов нормализовалась, уровень ТТГ оставался низким.
При анализе результатов исследования гормонов репродуктивной
системы (таблица 8) было выявлено, что воздействие калия йодида приводит к
развитию персистирующего эструса через 48 часов после введения.
Наблюдалось двукратное снижение уровня прогестерона на фоне низкого
уровня эстрадиола, в сочетании с повышенной, но недостаточной для
овуляции, секрецией ЛГ и ФСГ, с преимущественным ростом последнего
(Анисимов, В.Н. 2006). Через 120 часов после введения йодида калия уровень
гипофизарных гонадотропинов нормализовался, концентрация прогестерона
оставалась низкой.
До настоящего времени отсутствует однозначный ответ на вопрос, каким
действием обладают фармакологические дозы йодидов – гипертиреоидным
или гипотиреоидным. Большинство исследователей сходятся во мнении, что
развитие гипотиреоза и тиреотоксикоза при хронической и острой нагрузке
йодом обусловлено наличием предшествующей патологии щитовидной
железы (Дедов И.И., 2006).
В доступной нам литературе не удалось обнаружить данных о роли
йодидов в регуляции секреции гипофизарных гонадотропинов.
По результатам проведенного исследования можно было предположить,
что у крыс однократное применение малых фармакологических доз йодидов
провоцировало краткосрочную (до 120 часов) легкую гиперфункцию
гипофизарно – тиреоидной системы; причем реакция гипофиза на нагрузку
йодом
была
более
репродуктивную
длительная,
систему
крыс
чем
у
щитовидной
вышеуказанные
дозы
железы.
калия
На
йодида
оказывали подавляющее влияние, которое было так же краткосрочно и не
103
превышало длительность одного эстрального цикла, однако уровень
гипофизарных гонадотропинов восстанавливался быстрее, чем концентрация
гормонов, продуцируемых яичниками
Таблица
7.
Сравнительная
характеристика
содержания
гормонов
гипофизарно – тиреоидной системы в сыворотке крови экспериментальных
животных (М ± m)
Контрольная
группа
ТТГ
оТ3
сТ4
мкМЕ/мл
нмоль/л
пмоль/л
1,74±0,07
20,35±1,2
(8)
(8)
2,4±0,1*
15,4±1,4*
(10)
(10)
1,9±0,08
18,5±1,8
(11)
(10)
0,120±0,03
(8)
1 группа
(через 48 часов)
2 группа
(через 120
0,06±0,02*
(10)
0,06±0,02**
(11)
часов)
Примечание. * p ≤ 0,05 различия между контрольной и 1 группами; ** p ≤
0,05 различия между контрольной и 2 группами (критерий Стьюдента). В
скобках – число исследований
104
Таблица
8.
Сравнительная
характеристика
содержания
репродуктивной системы в сыворотке крови
гормонов
экспериментальных
животных (М ± m) .
Контрольн
ая группа
1 группа
(через 48
ФСГ
ЛГ
мМЕ/мл
мМЕ/мл
0,11±0,05
0,05±0,04
(7)
0,44±0,13*
(8)
часов)
( 7)
0,35±0,14
*
Прогестерон
Эстрадиол
нмоль/л
пмоль/л
103±7,7
3,3±1,7
(7)
(7)
57,8±8,9*
4,9±3,0
(8)
(6)
44,7±10,0**
7,2 ±3,3
(7)
(7)
(8)
2 группа
0,09±0,05
(через 120
(7)
0,05±0,01
(7)
часов)
Примечание. * p ≤ 0,05 различия между контрольной и 1 группами; ** p ≤
0,05 различия между контрольной и 2 группами (критерий Стьюдента). В
скобках – число исследований
105
6.3.
Морфологическое
исследование
яичников
самок-крыс
при
однократном введении йодида калия в дозировке 4 мкг /100 г массы
животного
Морфологический
раздел
работы
был
выполнен
в
Областном
патологоанатомическом бюро МЗ Челябинской области (начальник – канд.
мед. наук Г.В. Сычугов) и кафедре анатомии и гистологии ГОУ ВПО
«Уральская академия ветеринарной медицины Минсельхоза России» (зав.
кафедрой – профессор В.К. Стрижиков). Образцы яичников (16 – от
животных контрольной группы, 18 – первой и 19 – второй) фиксировали 12
% нейтральным формалином и подвергали парафиновой проводке. С
каждого
парафинового
блока
изготавливались
серийные
плоскопараллельные срезы, которые окрашивались гематоксилином и
эозином, с последующим проведением световой микроскопии.
При гистологическом исследовании фрагментов яичников животных всех
групп каких – либо микроскопических признаков некроза (соответственных
изменений
ядер
клеток,
цитоплазмы,
внеклеточного
матрикса,
демаркационного воспаления) выявлено не было.
6.4. Определение маркеров апоптоза в щитовидных железах, гипофизах
и яичниках самок-крыс при однократном введении йодида калия в
дозировке 4 мкг /100 г массы животного
Иммуногистохимическое
исследование
маркеров
апоптоза
было
проведено в Областном патологоанатомическом бюро МЗ Челябинской
области (начальник – канд. мед. наук Г.В. Сычугов) и кафедре анатомии и
гистологии ГОУ ВПО «Уральская академия ветеринарной медицины
Минсельхоза России» (зав. кафедрой – профессор В.К. Стрижиков). В
образцах щитовидных желез, гипофизов и яичников крыс (8 – от животных
контрольной группы, 8 – первой и 8 – второй) определялись экспрессия
эффекторной каспазы 3, инициаторной каспазы 8 и антиапопточеского белка
106
Bcl-2. Результаты исследований приведены в рисунках 14, 15, 16,
иллюстрированы рисунком 17.
Контрольные показатели по тканям достоверно не отличались:
экспрессия каспазы 3 в тканях щитовидной железы составила 2,9±0,6 PA(%),
в гипофизе – 1,4±0.6 PA(%), в яичниках - 1,5±0,5 PA(%). Соответственно
экспрессия каспазы 8 составила 3,5±0,5 PA(%), 1,9±0,9 PA(%) и 1,6±0,8
PA(%). Экспрессия Bcl-2 так же на выявляла достоверных отличий: в
щитовидной железе - 9,9±1,1 PA(%), в гипофизе - 9,5±1,0 PA(%), в яичнике9,9±2,1 PA(%).
Йодид калия в дозировке 4 мкг /100г индуцировал активность апоптоза
через рост экспрессии эффекторной каспазы 3 в клетках гипофизов и
яичников у животных через 48 часов (соответственно до 4,7±0,6 PA(%) и
3,9±1,2 PA(%)) и 120 часов (соответственно до 5,5±2,0 PA(%) и 4,5±1,2
PA(%)) после однократного введения йодида калия.
Рост инициаторной каспазы 8 отмечался в яичниках крыс через 120
часов после инстилляции калия йодида (до 4,9±1,1 PA(%)). В гипофизе
достоверных изменений каспазы 8 не было зафиксировано.
В щитовидной железе при воздействии вышеназванной дозы йодида
было выявлено снижение активности апоптоза через снижение каспзаз 3 и 8
через 120 часов после введения йодида калия.
Bcl-2 изменился только в яичниках, снизившись через 120 часов после
введения йодида калия (до 4,2±1,1 PA(%)).
107
Щитовидная железа
12
9,9+1.1
10
7,9+1,9
PA (%)
8
8,4+1,9
6
4
2,9+0,6
3,5+0,5
3,4+0,8
2
3,9+0,8
1,1+0,4*
0,8+0,3*
0
00 часов
48 часов
каспаза 3
120 часов
00 часов
48 часов
каспаза 8
120 часов
00 часов
48 часов
120 часов
Bcl-2
Рисунок 14. Изменения маркеров апоптоза в щитовидной железе после однократного введения йодида калия в дозировке
4 мкг/100г в.ж. (снижение экспрессии каспаз 3 и 8 через 120 часов ). * p ≤ 0,05 различия по сравнению с контролем
(критерий Стьюдента).
108
Гипофиз
12
10,7+2,9
9,5+1,0
10
9,1+2,5
PA(%)
8
5,5+2,0*
6
4,7+0,6*
3,8+0,9
4
2
3,1+1,1
1,9+0,9
1,4+0,6
0
00 часов
48 часов
каспаза 3
120 часов
00 часов
48 часов
каспаза 8
120 часов
00 часов
48 часов
120 часов
Bcl-2
Рисунок 15. Изменения маркеров апоптоза в гипофизе после однократного введения йодида калия в дозировке 4 мкг/100г
в.ж. (рост экспрессии каспазы 3 через 120 часов ). * p ≤ 0,05 различия по сравнению с контролем (критерий Стьюдента).
109
Яичники
12
9,9+2,1
10
9,4+1,5
PA(%)
8
6
4,9+1,1*
4,5+1,2*
4,2+1,1*
3,9+1,2*
4
2,4+0,7
2
1,6+0,8
1,5+0,5
0
00 часов
48 часов
120 часов
каспаза 3
00 часов
48 часов
каспаза 8
120 часов
00 часов
48 часов
120 часов
Bcl-2
Рисунок 16. Изменения маркеров апоптоза в яичниках после однократного введения йодида калия в дозировке 4 мкг/100г
в.ж. (рост экспрессии каспазы 8 и снижение Bcl-2 через 120 часов ). * p ≤ 0,05 различия по сравнению с контролем (критерий
Стьюдента).
110
Рисунок 17. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов: экспрессия
каспазы 3 в щитовидной железе (А и В) , гипофизе (C и D) и яичниках (E и F)
самок – крыс ( увеличение x 200).
Щитовидная железа: снижение экспрессии каспазы 3 через 120 часов после
йодида калия (B) по сравнению с контролем (A).
Гипофиз: рост экспрессии каспазы 3 через 120 часов после йодида калия (D)
по сравнению с контролем (C).
Яичники: рост экспрессии каспазы 3 через 120 часов после йодида калия (F)
по сравнению с контролем (E).
111
Таким образом, по результатам проведенного исследования было
выявлено, что у самок-крыс однократное применение йодида калия в
дозировке 4 мкг/100гр в.ж. (доза, 5 – кратно превышающая «базисный
уровень»)
провоцировало
краткосрочную
(до
120
часов)
легкую
гиперфункцию гипофизарно–тиреоидной системы; причем реакция гипофиза
на нагрузку йодом была более длительная, чем у щитовидной железы. На
репродуктивную систему крыс вышеуказанная доза калия йодида оказывала
подавляющее влияние, которое было так же краткосрочно и не превышало
длительность одного эстрального цикла, однако уровень гипофизарных
гонадотропинов восстанавливался быстрее, чем концентрация гормонов,
продуцируемых
яичниками.
Изменений
физиологических
параметров
(ректальной температуры) у исследуемых животных выявлено не было.
Длительное время на основании экспериментальных данных считалось,
что фармакологические дозы йодидов вызывают в яичниках лабораторных
животных дистрофические и деструктивные изменения фолликулярного
аппарата с обратимым прекращением овариальной функции (Брауде И.Л.,
1957). Однако при нашем эксперименте при гистологическом исследовании
фрагментов яичников у крыс, получавших однократно йодид калия в
дозировке 4 мкг/100 г массы животного, микроскопических признаков
некроза не было обнаружено на всем протяжении последующего эстрального
цикла (через 48 часов и 120 часов после приема калия йодида).
Несмотря на обширное число публикаций, посвященных влиянию
йодидов на активность апоптоза в тканях, до настоящего времени не
получили окончательного решения вопросы о путях программированной
гибели клеток при воздействии йодидов. Так, Bоechat L.H.B et al. (2002)
выявили, что йодид калия модулировал в клетках щитовидной железы оба
пути апоптоза, как митохондриальный, так и через рецепторы апоптоза, По
мнению других авторов (Shrivastava A., et al, 2006), йод-индуцированный
апоптоз каспазо-независим. Следует отметить, что Shrivastava A., et al
112
предположили,
что
молекулярный
йод
индуцирует
только
митохондриальный путь апоптоза в результате эксперимента на культуре
человеческих клеток рака молочной железы.
В результате проведенного нами исследования было выявлено, что
реакция щитовидной железы, гипофиза и яичников на дозу йодида калия, 5 –
кратно превышающую «базисный уровень» йода, не только каспазозависима,
но и органоспецифична. Так, щитовидная железа реагировала снижением
активности процессов апоптоза через снижение каспаз, гипофиз и яичники –
повышением активности апоптоза через рост каспаз, но у яичника, в отличие
от гипофиза, реагировали оба пути апоптоза – и рецепторный, и
митохондриальный.
Возможно, наличие каспазного ответа на вышеназванную дозу йодида
калия было характерно для нормальных тканей, а при раковом перерождении
каспазный ответ на йодиды исчезает, так как в исследованиях Shrivastava A.,
et al, 2006 исследовалось воздействие йодидов на малигнизированные ткани
молочной железы.
Результаты исследования так же давали возможность предположить, что
реакция органов на йодиды еще и дозозависима, так как в эксперименте
Bоechat L. H. B et al. (2002), при 100 – кратном превышении примененной
нами дозировки йодидов, в клетках щитовидной железы определялась
активация апоптоза.
Полученные нами данные обусловили цель следующего эксперимента –
исследовать воздействие однократного введения йодида калия в различных
дозировках: начиная с 1 мкг/100 гр в.ж. до 25 мкг/100гр в.ж..
113
Глава 7. Исследование воздействия йодида калия на гипофизарно–
тиреоидную
и
гипофизарно–гонадную
системы
самок–крыс
при
однократном введении в различных дозировках
При изучении воздействия однократного введения йодида калия в
различных дозировках на самок–крыс было решено расширить объем
исследований – оценить изменения уровня йода в изучаемых тканях с
помощью количественного рентгеноспектрального микроанализа и маркера
присутствия йода в тканях - экспрессии натрий-йодного симпортера.
Исследование функциональной активности гипофиза было решено углубить
определением экспрессии тиреотропного, фолликулостимулирующего и
лютеинизирующего гормонов в гипофизе.
В эксперименте, выполненном на кафедре фармакологии ФГОУ ВПО
«Уральская академия ветеринарной медицины Минсельхоза России» (зав.
кафедрой проф. Самородова И.М.) были использованы 121 беспородная
крыса – самка 6–месячного возраста со средней массой 250 ± 30г. Животные
содержались в виварии со стандартным световым режимом (12 ч света: 12 ч
темноты (дневная фаза – с 7:00 до 19:00 летнего времени)) и получали
стандартный корм и воду.
Самки были взяты в опыт в фазы диэструса и метаэструса. 37 животных
составили контрольную группу, 21 – первую, 23 – вторую, 20 – третью и 20 –
четвертую. Анализ цикличности функционирования гонад проводился на
основании определения гормонов репродуктивной сферы в сыворотке крови
и исследования вагинальных мазков.
Крысам 1, 2, 3 и 4 групп однократно через желудочный зонд вводили
йодид калия из расчета соответственно 1 мкг /100 г массы животного, 4 мкг
/100 г, 8 мкг /100 г и 25 мкг /100 г.
Все животные были подвержены эвтаназии под эфирным наркозом в
период с 11 ч до 13 ч дневной фазы экспериментальных суток через 48 часов
114
после введения йодида калия. Предварительно у животных проводился забор
крови из яремной вены. После забоя у крыс извлекали щитовидные железы,
гипофизы и яичники.
7.1. Исследование терморегуляции у самок крыс при при однократном
введении йодида калия в различных дозировках
В контрольной группе показатели ректальной температуры составили
26,8±0,8 оС (в соответствии с эутиреоидным состоянием животных, не
отличаясь от литературных данных на 12
00
- 1300 часов экспериментальных
суток (Козлов, В.Н.2008). Через 48 часов после введения йодида калия у
всех крыс данные измерения температуры достоверно не различались с
контрольной группой (после 1 мкг/100 г – 27,2±0,5; после 4 мкг/100 г 27,1±0,2; после 8 мкг/100г - 26,8±0,3; после 25 мкг/100г - 26,8±0,5).
Таким образом, при сравнении результатов исследования ректальной
температуры у животных всех групп не было выявлено достоверных
изменений, аналогично первому этапу эксперимента.
7.2. Определение гормонов гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно гонадной систем в сыворотке крови самок – крыс при однократном
введении йодида калия в различных дозировках
Гормональные профили был исследован у 32 самок крыс (по 7 крыс из
контрольной и второй группы, и по 6 крыс из остальных групп).
В сыворотке крови животных определяли содержание тиреоидных
гормонов – общего 3,5,3'–трийодтиронина (оТ3), свободного тироксина (сТ4),
тиреотропного гормона (ТТГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ),
лютеинизирующего
гормона
(ЛГ)
и
прогестерона
методом
иммуноферментного анализа с использованием стандартных наборов тест–
систем ОАО «Алкор–Био» (Санкт–Петербург, Россия), эстрадиола методом
иммуноферментного анализа с использованием тест – систем «GmbH»
115
(Германия) на иммуноферментном автоматическом анализаторе (фотометр
«BIO – RAD model 680 MR 12726», США) в иммунологической лаборатории
НУЗ «Дорожная клиническая больница ОАО « РЖД» на ст. Челябинск».
Результаты исследования гормонов гипофизарно–тиреоидной системы в
сыворотке крови приведены в таблице 9. В контрольной группе ТТГ, оТ3 и
сТ4 соответствовали эутиреоидному состоянию животных, не отличаясь от
литературных данных (Козлов, В.Н.2008). После введения йодида калия у
всех крыс наблюдался гипофизарный гипотиреоз (снижение уровней ТТГ и
сТ4). Снижение ТТГ начиналось при воздействии 1 мкг/100 г. Величина
введенной дозы не влияла на уровень ТТГ – достоверных различий между
показателями ТТГ после воздействия дозировок от 1 мкг/100г до 25 мкг на
100/г выявлено не было.
Т4 значимо снижался после введения 1 мкг/100г. Уровень Т4 при дозах 4
и 8 мкг/100г
достоверно не отличался от показателя при 1 мкг/100г,
дальнейшие снижение наблюдалось при максимальной дозе йодида калия –
25 мкг/100г.
При всех дозах йодида калия изменений оТ3 зарегистрировано не было.
При анализе результатов исследования гормонов репродуктивной
системы (таблица 10) было выявлено, что воздействие различных доз йодида
калия специфично для каждого гормона. ФСГ повышался при воздействии 1
мкг/100г, ЛГ – при 1 и 25 мкг/100г, прогестерон снижался при 4 и 8 мкг/100г,
эстрадиол – при всех концентрациях йодида калия.
Было
определено,
что
реакции
гипофизарно-гонадной
системы
однотипны на дозах 4 и 8 мкг/100г (снижение прогестерона и эстрадиола при
тенденции к росту гипофизарных гонадотропинов («персистирующий эструс»)
(Анисимов, В.Н. 2006) и на дозах 1 и 25 мкг (при достоверном росте
гипофизарных гонадотропинов снижался только эстрадиол; достоверных
изменений прогестерона не наблюдалось).
116
Таблица
9.
Сравнительная
характеристика
содержания
гормонов
гипофизарно– тиреоидной системы в сыворотке крови экспериментальных
животных (М ± m)
Контрольная
группа
1 группа
(1 мкг /100 г)
2 группа
(4 мкг /100 г)
3группа
(8 мкг /100 г)
4 группа
(25 мкг /100 г)
ТТГ
оТ3
сТ4
мкМЕ/мл
нмоль/л
пмоль/л
0,13±0,03
1,71±0,07
20,3±1,4
(7)
(7)
(7)
1,5±0,2
14,2±0,8*
(6)
(6)
1,9±0,4
16,4±1,5**
(7)
(7)
1,4±0,2
15,1±1,5***
(6)
(7)
1,6±0,2
11,8±0,9****
(6)
(6)
0,03±0,01*
(6)
0,01±0,01**
(7)
0,01±0,004***
(6)
0,02±0,01****
(6)
Примечание. * p ≤ 0,05 различия между контрольной и 1 группами; ** p ≤
0,05 различия между контрольной и 2 группами,*** p ≤ 0,05 различия
между контрольной и 3 группами, **** p ≤ 0,05 различия между
контрольной
и 4 группами (критерий Стьюдента). В скобках – число
исследований.
117
Таблица
10.
Сравнительная
характеристика
содержания
гормонов
гипофизарно–гонадной системы в сыворотке крови экспериментальных
животных (М ± m)
Контрольн
ая группа
1
группа
(1 мкг
2 /100
г)
группа
3группа
(4 мкг
/100
г)
(8 мкг /100
г)
4
группа
(25 мкг /100
ФСГ
ЛГ
мМЕ/мл
мМЕ/мл
0,11±0,05
0,05±0,04
(7)
0,33±0,0
8*
(6)
0,38±0,15
(7)
0,54±0,2
7
(6)
0,35±0,23
(6)
(7)
0,32±0,07*
(6)
0,29±0,15
(7)
0,42±0,32
(6)
0,20±0,07***
*
Прогестерон
Эстрадиол
нмоль/л
пмоль/л
103±7,7
3,3±1,7
(7)
(7)
90,8±19,2
0*
(6)
(6)
51,4±14,9**
0**
(7)
(7)
45,9±10,6***
(6)
70,9±6,9
(6)
0***
(6)
0****
(6)
(6)
г)
Примечание.
* p ≤ 0,05 различия между контрольной и 1 группами; ** p ≤
0,05 различия между контрольной и 2 группами,*** p ≤ 0,05 различия между
контрольной и 3 группами, **** p ≤ 0,05 различия между контрольной и 4
группами (критерий Стьюдента). В скобках – число исследований.
118
В 1968 году была описана особенность однократного применения
антитиреоидных препаратов (Langer P., 1968) – выраженность и длительность
возникающего гипотиреоза не зависели
от дозы и химической природы
препарата. По результатам проведенного исследования можно предположить,
что данная особенность справедлива и для воздействия йода калия в малых
фармацевтических дозах.
Однако ситуация с гипофизарно – тиреоидными гормонами при
применении йодида калия была не столь однозначна, как при введении
тиоцината, тапазола, перхлората и др. (Langer P., 1968) Так, возникший
гипотриреоз имел некоторые особенности – был гипофизарным (уровень
ТТГ снизился начиная с дозы 1 мкг/100г и не менялся в зависимости от дозы
йодида калия), а реакция собственно тиреоидных гормонов отличалась
разнообразием – уровень оТ3 не понизился даже при 25 мкг/100г, а уровень
сТ4 , наоборот, уменьшился начиная с дозировки 1 мкг/100г и достоверно на
менялся при нарастании дозы в 8 раз, продолжив снижение только при 25
мкг/100г.
Похожая
ситуация
наблюдалась
и
при
исследовании
гормонов
гипофизарно-гонадной системы – реакция гипофизарных гонадотропинов и
эстрадиола началась с дозы 1 мкг/100 г, приближаясь к показателям
персистирующего эструса, и не зависела от нарастания дозы йодида калия.
Прогестерон же достоверно снизился при дозах 4 и 8 мкг/100г и не
отреагировал на дозы 1 и 25 мкг/100 г.
Таким образом, йодид калия в различных дозах дифференцированно
воздействовал на уровни гормонов гипофизарно–тиреоидной и гипофизарно
– гонадной систем в сыворотке крови эутиреоидных самок крыс.
Изменения гормонов щитовидной железы и яичников были сложные –
одни гормоны не реагировали введение йодида (оТ3), другие – снижались
при всех дозах йодида калия и глубина их снижения не зависела от дозы
119
(эстрадиол), у третьих – наблюдалось «плато» снижения уровня при
нарастании дозы (сТ4 и прогестерон), однако при дозе 25мкг/100 г
вышеназванные гормоны вели себя различно – сТ4 продолжил снижение,
прогестерон – поднялся к показателям контрольной группы.
По результатам проведенного исследования можно было предположить,
что однозначно на введение различных дозировок йодида калия отвечают
снижением функции гормоны гипофиза – ТТГ, ФСГ и ЛГ, причем реакция их
не зависит от дозы KI. Однако изменения уровня гипофизарных
гонадотропинов в крови были недостоверны. Это обстоятельство обусловило
более углубленное исследование функции гормонов гипофиза.
7.3.
Определение
экспрессии
тиреотропного,
фолликуло-
стимулирующего и лютеинизирующего гормонов в гипофизах самок–
крыс при однократном введении йодида калия в различных дозировках
Исходя из вышеизложенного закономерно появился вопрос – реагирует
ли на введение йодидов морфологические структуры гипофиза – изменяется
ли экспрессия гипофизарных гормонов в клеточных структурах гипофиза?
Совпадают ли эти изменения с колебаниями уровней гормонов в крови?
Таким образом, целью следующего исследования стало изучение
влияния различных доз йодида калия на экспрессию ТТГ и гипофизарных
гонадотропинов в тканях гипофиза у эутиреоидных самок крыс.
В эксперименте, выполненном на кафедре анатомии и гистологии ФГОУ
ВПО «Уральская академия ветеринарной медицины Минсельхоза России»
(зав. кафедрой проф. Стрижиков В.К.) были использованы 34 беспородные
крысы – самки 6–месячного возраста со средней массой 250 ± 30г. Животные
содержались в виварии со стандартным световым режимом (12 ч света: 12 ч
темноты (дневная фаза – с 7:00 до 19:00 летнего времени)) и получали
стандартный корм и воду. Самки были взяты в опыт в фазы диэструса и
метаэструса. 9 животных составили контрольную группу, 7 – первую. По 6
120
крыс вошло во вторую, третью и четвертую группы. Анализ цикличности
функционирования
гонад
проводился
на
основании
исследования
вагинальных мазков.
Крысам 1, 2, 3 и 4 групп однократно через желудочный зонд вводили
йодид калия из расчета соответственно 1 мкг /100 г массы животного, 4 мкг
/100 г, 8 мкг /100 г и 25 мкг /100 г.
Все животные были подвержены эвтаназии под эфирным наркозом в
период с 11 ч до 13 ч дневной фазы экспериментальных суток через 48 часов
после введения йодида калия. У всех крыс были изъяты гипофизы.
Морфологический
раздел
работы
был
выполнен
в
Областном
патологоанатомическом бюро МЗ Челябинской области (начальник – канд.
мед. наук Г.В. Сычугов) и кафедре анатомии и гистологии ГОУ ВПО
«Уральская академия ветеринарной медицины Минсельхоза России» (зав. –
профессор В.К. Стрижиков).
Определение экспрессии
осуществляли
ТТГ, ФСГ
стрептавидин-биотиновым
и
ЛГ в тканях
методом
с
гипофиза
помощью
моноклональных антител (таблица 2).
Иммуногистохимическому исследованию были подвергнуты 34 образца
ткани. Результаты исследований иллюстрированы рисунком 18.
Динамика изменений экспрессии ТТГ, ФСГ И ЛГ в гипофизе несколько
отличалась от динамики изменений параметров гормонов в крови. Так,
достоверное снижение уровня экспрессии ТТГ (более, чем в 2 раза)
начиналось с дозы 4 мкг/100г в.ж.. При нарастании дозы йодида калия
выраженность снижения экспрессии ТТГ уменьшалась.
121
16
14
13.7+0.9
12
10.6+1.3
9.6+0.8*
9.2+0.6*
10
PA (%)
8,5+0.9*
8
4.1+0.3
4
5.6+0.9
5.1+0.8*
6
8.6+0.6*
7.8+1.1*
5.6+0.5
4.3+0.8
3.6+0.7
3.3+0.7
3.1+0.4
2
0
контроль
1 мкг/100 г в.ж..
4 мкг/100 г в.ж.
ТТГ
ФСГ
8 мкг/100г в.ж..
25 мкг/100 г в.ж.
ЛГ
Рисунок 18. Изменения экспрессии ТТГ, ФСГ и ЛГ в гипофизе через 48 часов после однократного введения йодида калия
при различных дозировках * p ≤ 0,05 различия по сравнению с контролем (критерий Стьюдента).
122
Экспрессия ФСГ и ЛГ в тканях гипофиза максимально (более, чем в 2
раза) возрастала так же при дозе 4 мкг/100г. При увеличении дозы KI
сохранялось повышение экспрессии ФСГ, а показатели ЛГ достоверно не
отличались от уровня контрольной группы.
При анализе результатов проведенного нами исследования можно было
предположить,
что
воздействие
доз
йодида
калия,
соответствующих
содержанию йода эндокринных органах и щитовидной железе привело к
снижению функции гипофиза у самок крыс – гипофизарному гипотиреозу и
персистирующему эструсу.
Было установлено, что ФСГ и ЛГ реагировали на йодид калия сочетано с
изменениями ТТГ. Реакция происходила как на уровне показателей в крови,
так и на уровне морфологических структур. Однако, если изменения уровня
гормонов в крови наблюдались при всех исследуемых дозах йодида калия, то
одновременная вариабельность экспрессии гормонов в гипофизе – только при
дозе KI, 5 – кратно превышающей «базисный уровень» и соответствующей
уровню йода в щитовидной железе (4мкг/100 г в.ж.).
Уровень гипофизарных гормонов в крови изменялся начиная с дозы
йодида калия, соответствующей «базисному уровню»
(1 мкг/100 г в.ж.).
Экспрессия гипофизарных гормонов в тканях гипофиза начинала варьировать
при дозе KI, 5 – кратно превышающей «базисный уровень» (4мкг/100 г в.ж.).
При дозе йодида, превышавшей средний уровень йода в щитовидной
железе (8 мкг/100 г в.ж.) достоверно менялась только экспрессия ТТГ.
При воздействии 25 мкг/100 г в.ж. наблюдался интересный феномен –
изменилась экспрессия не только ТТГ, но и ФСГ, однако экспрессия ЛГ
достоверно
не
отличалась
от
показателей
контроля.
Эти
данные
соответствовали полученным ранее результатам – при дозе 25 мкг/100 г в.ж.
прогестерон, в отличие от эстрадиола, не отличался от уровня контрольной
123
группы. Можно было предположить, что гипофизарные гонадотропины
индивидуально чувствительны к различным дозам йода.
Ранее исследователями проводились попытки оценить экспрессию ТТГ в
гипофизе при воздействии различных доз йодидов. Однако авторы
применяли значительно большие дозы препаратов, и оценка экспрессии ТТГ
была затруднена выраженными явлениями гипертрофии в гипофизе (Li Jinru, 2007).
При анализе результатов проведенного нами исследования, было
выявлено, что калий йодид в дозах, кратных содержанию йода в гипофизе и
щитовидной железе, влиял на экспрессию гипофизарных гормонов в
клеточных структурах гипофиза, причем – дозозависимо. Одновременно
гуморальные и местные иммуногистохимические параметры ТТГ, ФСГ и ЛГ
изменялись, начиная с концентраций KI, 5 - кратно превышающих «базисный
уровень» (4 мкг/100 г в.ж.).
7.4. Определение экспрессии натрий-йодного симпортера в щитовидных
железах, гипофизах и яичниках самок–крыс при однократном введении
йодида калия в различных дозировках
В эксперименте, выполненном на кафедре анатомии и гистологии ФГОУ
ВПО «Уральская академия ветеринарной медицины Минсельхоза России»
(зав. кафедрой проф. Стрижиков В.К.) были использованы 41 беспородная
крыса – самка 6–месячного возраста со средней массой 250 ± 30г. Животные
содержались в виварии со стандартным световым режимом (12 ч света: 12 ч
темноты (дневная фаза – с 7:00 до 19:00 летнего времени)) и получали
стандартный корм и воду. Самки были взяты в опыт в фазы диэструса и
метаэструса. 15 животных составили контрольную группу, 6 – первую, 8 –
вторую; по 6 крыс вошло в третью и четвертую группы. Анализ цикличности
функционирования
гонад
проводился
на
основании
исследования
вагинальных мазков.
124
Крысам 1, 2, 3 и 4 групп однократно через желудочный зонд вводили
йодид калия из расчета соответственно 1 мкг /100 г массы животного, 4 мкг
/100 г, 8 мкг /100 г и 25 мкг /100 г.
Все животные были подвержены эвтаназии под эфирным наркозом в
период с 11 ч до 13 ч дневной фазы экспериментальных суток через 48 часов
после введения йодида калия. У всех крыс были изъяты щитовидные железы,
гипофизы и яичники.
Определение экспрессии натрий-йодного симпортера (НИС) в тканях
осуществляли
стрептавидин-биотиновым
методом
с
помощью
моноклональных антител (таблица 2).
Иммуногистохимическому
исследованию
были
подвергнуты
123
образца ткани (41 щитовидная железа, 41 гипофиз и 41 яичник). Результаты
исследований приведены в рисунках 19 и 20, и иллюстрированы рисунком
21.
Из приведенных данных следует, что в контроле не было достоверных
различий между уровнями экспрессии НИС в органах, несмотря на то, что
показатель в яичниках (4.3±0.0 %PA) превышал уровни в щитовидной железе
(3.7±1.2 % PA) и гипофизе (1.8±0.7 %PA).
В щитовидных железах достоверный рост экспрессии НИС по
сравнению с контролем был выявлен после дозировок 8 и 25 мкг/100г в.ж.
(соответственно 9.1±2.0% PA и 11.9±2.8% PA), то есть при превышении
дозировок Соответствующих уровню йода в щитовидной железе..
В гипофизах достоверный рост экспрессии НИС по сравнению с
контролем наблюдался после дозировок 4, 8 и 25 мкг/100г в.ж.
(соответственно 12.9±1.0% PA, 11.4±1.0% PA и 13.9±1.5% PA), то есть при
превышении у дозировок «базисного уровня»..
125
16
13.9+1.5*
14
12.9+1.0*
12
PA(%)
11.9+2.8*
11.4+1.0*
10
9.1+2.0*
8
6
4
2
3.7+1.2
3.5+1.0
2.6+0.9
1.8+0.7
0.8+0.1
0
контроль
1 мкг/100 г
4 мкг/100 г
8 мкг/100 г
25 мкг/100 г
НИС
щитовидная железа
гипофиз
Рисунок 19. Изменения экспрессии НИС в щитовидной железе и гипофизе через 48 часов после однократного введения
йодида калия при различных дозировках * p ≤ 0,05 различия по сравнению с контролем (критерий Дункана)
126
10
9.0+2.4*
9
8
PA (%)
7
5.8+1.5
6
5
4.9+1.0
4.3+ 0.0
4
3
1.8+0.7
2
1
0
контроль
1 мкг/100 г
4 мкг/100 г
8 мкг/100 г
25 мкг/100 г
НИС
яичники
Рисунок 20. Изменения экспрессии НИС в яичниках через 48 часов после однократного введения йодида калия при
различных дозировках * p ≤ 0,05 различия по сравнению с контролем (критерий Дункана)
127
Рисунок 21. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов: экспрессия
антител к НИС в гипофизах самок-крыс через 48 часов после однократного
введения йодида калия в дозировке 4 мкг/100 г в.ж. (нижняя панель) в
сравнении с контролем (верхняя панель)(увеличение x 400).
128
В яичниках экспрессия НИС достоверно повысилась в 2 раза при
сравнении с контролем (4.3±0.1% PA) после 8 мкг/100 г (9.9±2.4% PA)
(p<0.05). После 1 мкг/100 г экспрессия НИС снизилась до 1.8±0.7 % PA
(p>0.05), после 4 и 25 мкг/100 г повысилась до 4.9±1.0 % PA (p>0.05) и
5.8±1.5 % PA (p>0.05). Таким образом, в яичниках экспрессия НИС
реагировала только на дозу, ориентировочно соотносимую с уровнем йода в
щитовидной железе. На остальные дозировки реакции экспрессии НИС не
было выявлено.
7.5. Определение экспрессии каспазы 3 и каспазы 8 в щитовидных
железах, гипофизах и яичниках самок–крыс при однократном введении
йодида калия в различных дозировках
Параллельно с изучением экспрессии НИС, в материале, описанном в
главе 7.4. проводилось и исследование экспрессии каспазы 3 и каспазы 8.
Экспрессия каспаз в тканях была определена стрептавидин-биотиновым
методом с помощью моноклональных антител (таблица 2).
Иммуногистохимическому
исследованию
были
подвергнуты
123
образца ткани (41 щитовидная железа, 41 гипофиз и 41 яичник). Результаты
исследований иллюстрированы рисунками 22, 23 и 24.
В щитовидных железах экспрессия каспазы 8 не изменялась при всех
исследуемых дозировках. Экспрессия каспазы 3 выросла после 8 мкг/100г (
6.4±1.6) по сравнению с контролем (2.9 ±1.5).
В гипофизах экспрессия эффекторной каспазы 3 достоверно выросла при
всех дозировках йодида калия по сравнению у контролем (1.4 ±1.6): при 1
мкг/100г -5.3 ±1.8, при 4 мкг/100г – 4.7±0.6, при 8 мкг/100г – 11.1±1.1, при 25
мкг/100г – 5.3±0.2. Экспрессия каспазы 8 увеличилась достоверно после
1мкг/100 г (6.6±0.6), 8 мкг/100г ( 9.2±1.5) и 25 мкг/100г (4.7±0.9) по
129
сравнению с контролем (1.8±0.8). Таким образом, пик экспрессии обеих
каспаз в гипофизе был выявлен после воздействия 8 мкг/100 г йодида калия.
В яичниках уровень экспрессии инициаторной каспазы 8 достоверно
повышался с 1.7±0.8 %PA в контроле до 4.0±0.9 %PA после дозы йодида
калия 8 мкг/100г (p<0.05) и до 4.2±0.3 %PA после 25 мкг/100г (p<0.05).
Повышение экспрессии каспазы 3 было недостоверным при всех дозах
йодида калия : от 1.5±0.5 %PA в контроле до 3.0±0.7 %PA (p>0.05), 3.9±1.2 %
PA(p>0.05), 2.5±0.2 %PA (p>0.05), 3.4±0.6 % PA(p>0.05) после доз йодида
калия 1, 4, 8 и 25 мкг/100г соответственно. Однако пик экспрессии каспазы
32 наблюдался после дозы 4 мкг/100 г.
Таким образом, было выявлено, что при воздействии различных доз
йодида
калия
максимально
активизируется
выраженная
каспазозовисимый
стимуляция
апоптоз.
каспазозависимого
Однако
апоптоза
происходит не в щитовидной железе, а в экстратиреоидных органах гипофизе и яичнике.
Причем рост активности апоптоза в гипофизе наблюдается уже при
воздействии 1 мкг/100 г KI. Следует отметить, что только активность
апоптоза в гипофизе изменилась при воздействии йодида в дозировке1
мкг/100 г. Другие иммуногистохимические показатели как в гипофизе, так и
в щитовидных железах и яичниках от контрольных показателей не
отличались.
Максимальный рост экспрессии обеих каспаз в гипофизе наблюдался
при 8 мкг KI/100г. При нарастании дозы йодида калия активность апоптоза в
тканях гипофиза была менее выраженной, чем при 8 мкг/100г.
130
10
9.2+1.5*
9
8
6.6+0.6*
PA (%)
7
6.3+1.8
6.0+2.3
6
3.9+0.8
5
4
5.3+0.8
4.7+0.9*
3.8+0.8
3.2+0.6
3
2
1,8+0.8
1
0
контроль
1 мкг/100 г
4 мкг/100 г
8 мкг/100 г
25 мкг/100 г
каспаза 8
щитовидная железа
гипофиз
Рисунок 22. Изменения экспрессии каспазы 8 в щитовидной железе и гипофизе через 48 часов после однократного
введения йодида калия при различных дозировках.* p≤0,05 различия по сравнению с контролем (критерий Дункана)
131
12
11.0+1.1*
10
PA (%)
8
6.4+1.6*
5.3+0.8*
6
5.3+0.7*
4.7+0.6*
4
2
4.4+1.1
3.4+0.9
3.4+0.6
2.9+0.5
1,4+0.6
0
контроль
1 мкг/100 г.
4 мкг/100 г
8 мкг/100 г
25 мкг/100 г
каспаза 3
щитовидная железа
гипофиз
Рис. 23. Изменения экспрессии каспазы 3 в щитовидной железе и гипофизе через 48 часов после однократного введения
йодида калия при различных дозировках. * p≤0,05 различия по сравнению с контролем (критерий Дункана)
132
4.2+0.3*
4,5
3.9+1.2
4
3.4+0.6
3.0+0.7
3,5
PA (%)
4.0+0.9*
2.9+0.6
3
2.4+1.2
2.5+0.2
2,5
2
1.7+0.8
1.5+0.5
1,5
1
0,5
0
контроль
1 мкг/100 г
4 мкг/100 г
8 мкг/100 г
25 мкг/100 г
яичники
каспаза 8
каспаза 3
Рис. 24. Изменения экспрессии каспазы 3 и каспазы 8 в яичниках через 48 часов после однократного введения
йодида калия при различных дозировках * p ≤ 0,05 различия по сравнению с контролем (критерий Дункана)
133
При сравнении влияния различных доз йодида калия на экспрессию
каспаз 3 и 8 в тканях щитовидной железы, гипофиза и яичника было
определено, что реакция яичника на KI ближе к изменениям в щитовидной
железе, чем к гипофизу. В гипофизе экспрессия каспаз 3 и 8 достоверно
вырастает при всех исследуемых дозах йодида калия (с 1 до 25 мкг/ 100 г). В
щитовидной железе, как и в яичнике – при некоторых дозах.
Было выявлено и отличие в реакции каспаз между щитовидной железой
и яичником – в тканях щитовидной железы повышалась экспрессия
эффекторной каспазы 3 , а в тканях яичника – инициаторной каспазы 8. Так
же можно отметить, что экспрессия каспазы 3 в щитовидной железе
изменялась только при 8 мкг /100 г. В яичнике реакция каспазы 8 была с
более широким диапазоном – достоверный рост был после 8 и 25 мкг/100г
в.ж..
По
результатам
проведенного
нами
исследования
можно
было
предположить, что реакция каспаз на введение йодида калия не только
дозозависима,
но
и
органоспецифична,
причем
каспазы
в
тканях
экстратиреоидных органов ( особенно гипофиза) изменяются активнее, чем в
тканях щитовидной железы.
7.6. Количественный рентгенспектральный анализ содержания йода в
щитовидных
железах,
гипофизах
и
яичниках
самок–крыс
при
однократном введении йодида калия в различных дозировках
В эксперименте, выполненном на кафедре анатомии и гистологии ФГОУ
ВПО «Уральская академия ветеринарной медицины Минсельхоза России»
(зав. кафедрой проф. Стрижиков В.К.) были использованы 14 беспородных
крыс – самок 6–месячного возраста со средней массой 250 ± 30г. Животные
содержались в виварии со стандартным световым режимом (12 ч света: 12 ч
темноты (дневная фаза – с 7:00 до 19:00 летнего времени)) и получали
134
стандартный корм и воду. Самки были взяты в опыт в фазы диэструса и
метаэструса. 6 животных составили контрольную группу, по 2 крысы вошли
в остальные 4 группы. Анализ цикличности функционирования гонад
проводился на основании исследования вагинальных мазков.
Крысам 1, 2, 3 и 4 групп однократно через желудочный зонд вводили
йодид калия из расчета соответственно 1 мкг /100 г массы животного, 4 мкг
/100 г, 8 мкг /100 г и 25 мкг /100 г.
Все животные были подвержены эвтаназии под эфирным наркозом в
период с 11 ч до 13 ч дневной фазы экспериментальных суток через 48 часов
после введения йодида калия. У всех крыс были изъяты щитовидные железы,
гипофизы и яичники.
Количественный рентгеноспектральный микроанализ образцов тканей
был произведен в лаборатории электронной микроскопии Южно-Уральского
государственного
университета
(заведующий
кафедрой
–
профессор
Михайлов Г.Г.).
Было проведено исследование 42 образцов (14 щитовидных желез,14
гипофизов, 14 яичников), в каждом образце проводилось исследование 5
точек. Число определений содержания йода в образцах тканей составило 210.
Результаты
количественного
рентгенспектрального
микроанализа
приведены в рисунках 25, 26 (щитовидная железа и гипофиз) и 27,28
(яичники).
135
45
38.6+6.7*
масс% х10-2 сухого веса
40
35
30
25
20
18.9+1.5
16.7+3.0
15
10
7.2+1.2*
4.3+0.5
5
12.8+1.8
11.9+2.4*
2,2+0.3
5.1+1.1
3.9+0.1
0
контроль
1 мкг/100 г
4 мкг/100 г
8 мкг/100 г
25 мкг/100 г
йод в иод-позитивных точках
щитовидная железа
гипофиз
Рисунок 25. Количественный рентгенспектральный микроанализ содержания йода в йод-позитивных точках щитовидной
железы и гипофиза через 48 часов после однократного введения йодида калия при различных дозировках * p ≤ 0,05
различия по сравнению с контролем (критерий Дункана)
136
120
100
100
100
100
100
86,6
80
65
58
60
53
48
40
28
20
0
контроль
1 мкг/100 г
4 мкг/100 г
8 мкг/100 г
25 мкг/100 г
процент йод-позитивных точек
щитовидная железа
гипофиз
Рисунок 26. Процент йод-позитивных точек щитовидной железы и гипофиза через 48 часов после однократного введения
йодида калия при различных дозировках.
137
4.6+0.7
5
4.2+0.8
масс% х10
-2
с. в.
4,5
4.0+0.5
3.9+1.1
4
3,5
3.1+0.5
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
контроль
1 мкг/100г
4 мкг/100г
8 мкг/100г
25 мкг/100 г
йод в иод-позитивных точках
яичники
Рисунок 27. Количественный рентгенспектральный микроанализ содержания йода в йод-позитивных точках яичников
через 48 часов после однократного введения йодида калия при различных дозировках * p ≤ 0,05 различия по сравнению с
контролем (критерий Дункана)
138
80
71
70
60
60
57
54
50
40
28
30
20
10
0
контроль
1мкг/100 г
4 мкг/100 г
8 мкг/100 г
25 мкг/100 г
процент йод-позитивных точек
яичники
Рисунок 28. Процент йод-позитивных точек яичников через 48 часов после однократного введения йодида калия при
различных дозировках.
139
При рентгенспектральном анализе щитовидных желез было выявлено, что
уровень йода в ЙПТ достоверно повысился после дозы 1 мкг/100 г.: с
16.7±3.0 10-2масс% в контроле до 38.6±6.7 10-2масс%.
После 8 мкг/100 г отмечалось достоверное снижение уровня йода в ЙПТ до 11.9±2.4 10-2масс%. После 25 мкг/100 г так же имелась тенденция к
снижению уровня йода в ЙПТ (12.8±1.8 10-2масс%).
Следует отметить, что только при дозе йодида калия, провоцирующей
эффект Вольфа-Чайкова (25 мкг/100 г), в щитовидной железе появились
точки, в которых не определялся йод.
В гипофизе было выявлено повышение уровня йода в ЙПТ в сравнении с
контролем (2.2±0.3 10-2масс%) – недостоверное после дозировок 1, 4 25
мкг/100 г (4.3±0.5 10-2масс%, 3.9±0.1 10-2масс% и 5.1±1.1 10-2масс%
соответственно), и достоверное – после 8 мкг/100 г - 7.2±1.2 10-2масс%.
Более, чем 2 –х кратное повышение уровня йода в ЙПТ гипофиза
сопровождалось двукратным снижением числа йод- позитивных точек (%
ЙПТ снизился после 8 мкг/100г с 65 % (в контроле) до 28%.
При рентгенспектральном анализе яичников было определено, что уровень
йода в йод – позитивных точках яичников (3.1±0.5 10-2масс%) в контрольной
группе достоверно не отличался от уровня йода в йод – позитивных точках
гипофиза (2.2±0.3 10-2масс%). При всех дозах йодида калия этот показатель
достоверно не менялся : 4.6±0.7 10-2масс% после 1 мкг/100 г (p>0.05), 4.0±0.5
10-2масс% (p>0.05) после 4 мкг/100 г, 3.9±1.1 10-2масс% (p>0.05) после 8
мкг/100 г (p>0.05) и 4.2±0.8 10-2масс% после 25 мкг /100 г (p>0.05).
Число йод – позитивных точек в яичниках в контрольной группе (54 %)
было несколько меньше, чем в гипофизе (65,6%). При воздействии йодидов
количество йод – позитивных точек в яичниках снизилось по сравнению с
контролем до 28% после 4 мкг/100 г, и повысилось до 71% после 25 мкг/100
г.
140
При анализе результатов проведенного нами исследования было
определено, что экстратиреоидные органы (гипофиз и яичники), как и
щитовидная железа, реагируют на введение йодида калия. Было так же
выявлено, что яичники обладают как общими с гипофизом особенностями
реакции на йодную нагрузку, так и индивидуальными.
В щитовидной железе после 1 мкг/ 100г в.ж. уровень йода поднялся в 2
раза, после 8 и 25 мкг\100г в.ж. – снизился на 30 %. Гипофизы и яичники, в
отличие от щитовидной железы, не реагировали на дозу йодида,
соответствующую их собственному внутриорганному содержанию йода (1
мкг/ 100 г в.ж.) и дозу, 5-кратно превышающую уровень йода в щитовидной
железе ( 25 мкг/100г в.ж.).
Изменения
исследуемых
показателей
у
яичников
и
гипофизов
наблюдались при дозе 4 мкг/100 г ( 5 кратное превышение «базального
уровня» или приблизительно – « уровня йода в щитовидной железе») и 8
мкг/100 г в.ж. (при 10 – кратном превышении уровня собственного
внутриорганного йода и 1,5 – кратном – уровня йода в щитовидной железе)
В гипофизе уровень йода в йод–позитивных точках вырос в 2 раза после
8 мкг/100 г в.ж. То есть, гипофиз, как и щитовидная железа, оказался
способным накапливать йод, но при других воздействующих дозах йодида
калия. Следует отметить, что рост уровня йода в ЙПТ гипофиза
сопровождался снижение числа ЙПТ в гипофизе. Вероятно, этот механизм
способствует сохранению уровня йода в гипофизе постоянным. В отличие от
гипофиза, в яичнике не менялся уровень йода в йод – позитивных точках.
Общей чертой реакции экстратиреоидных органов на йодид калия
явилось изменение количества йод – позитивных точек, но эта вариативность
была органоспецифичной – при дозе 4 мкг/100 г в.ж. отмечалось 2 – х
кратное снижение данного показателя в яичниках, при 8 мкг/100г – в
гипофизе.
141
По результатам проведенного исследования было установлено, что
особенности реакции гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадной
системы самок – крыс на йодид калия в диапазоне дозировок « базисный
уровень» – «5 – кратное превышение уровня йода в щитовидной железе»
значительно различаются внутри указанного диапазона.
При дозе йодида калия 1 мкг/100г, соответствующей «базисному
уровню», наблюдались 2–х кратный рост йода в щитовидной железе без
изменений экспрессии тиреоидного НИС, снижение уровня ТТГ и рост ФСГ
и ЛГ в крови без изменений экспрессии гипофизарных гормонов в гипофизе.
Однако в гипофизе отмечался достоверный трехкратный рост маркеров
апоптоза – экспрессии каспазы 3 и каспазы 8 и двукратный (недостоверный)
рост йода в ЙПТ и экспрессии НИС. В крови отмечалось снижение сТ4.
При воздействии 4 мкг/100г йодида калия (при дозе, соответствующей
уровню йода в щитовидной железе или в 5 раз превышающей «базисный
уровень»), было выявлено, что в щитовидной железе не происходило ни
накопления
йода,
ни
изменений
экспрессии
НИС,
ни
какой-либо
вариативности экспрессии каспаз. В гипофизе отмечался достоверный рост
каспазы 3, 7- кратный достоверный рост экспрессии НИС и недостоверный 2х кратный рост йода в ЙПТ. В крови достоверно снизился только уровень
ТТГ, но экспрессия вышеназванных гормонов в гипофизе изменилась
выражено: экспрессия ТТГ снизилась в 2 раза, экспрессия ФСГ и ЛГ в 2 раза
поднялась. В яичниках наблюдалось снижение процента ЙПТ в 2 раза и
недостоверный 2-х кратный рост каспазы 3. В крови отмечалось достоверные
снижение сТ4 (на 30%) и прогестерона (двукратно).
После введения йодида калия в дозировке 8 мкг/100 г (доза, в 1,5 раза
превышающая уровень йода в щитовидной железе) было выявлено
достоверное снижение йода в ЙПТ щитовидной железы и рост йода в ЙПТ
142
гипофиза (сопровождающееся снижением числа ЙПТ). Этот процесс
сопровождался ростом экспрессии НИС в обоих органах: в щитовидной
железе – более, чем двукратно, в гипофизе – шестикратно). При данной дозе
отмечался и рост экспрессии НИС в яичнике (двукратно). Только после 8
мкг/100г выросла экспрессия каспазы 3 в щитовидной железе и каспазы 8
яичнике; в гипофизе активность апоптоза была максимальной - рост каспазы
3 был 7- кратный, каспазы 8 – пятикратный. Уменьшению уровня ТТГ в
крови соответствовало снижение экспрессии ТТГ в гипофизе. Достоверных
изменений по сравнению с контролем уровня гипофизарных гонадотропинов
в крови и их экспрессии в гипофизе выявлено не было. Изменения
яичниковых и тиреоидных гормонов в крови не отличались от предыдущей
группы: отмечалось достоверные снижение сТ4 и прогестерона .
25 мкг KI/100 г в.ж. - дозировка, при которой проявляется феномен Вольфа
– Чайкова (доза, пятикратно превышающая уровень йода в щитовидной
железе) характеризовалась следующими изменениями: уменьшение йода в
ЙПТ щитовидной железы сопровождалось снижением процента ЙПТ (со
100% в контроле до 86%). Наблюдался максимальный рост экспрессии НИС
в щитовидной железе и гипофизе, но каких либо изменений уровня йода в
ЙПТ гипофиза или % ЙПТ по сравнению с контролем выявлено не было.
Достоверно снизились в сравнении с контролем как экспрессия ТТГ в
гипофизе, так и уровень ТТГ в крови. Достоверно повысилась экспрессия
ФСГ в гипофизе, однако в крови отмечался только достоверный рост ЛГ. Был
выявлен рост экспрессии каспаз 3 и 8 в гипофизе и каспазы 8 в яичнике, но
выраженность этих показателей была в 2 раза ниже чем при воздействии
калия йодида в дозировке 8 мкг/100г. В щитовидной железе экспрессия обеих
каспаз не отличалась от контрольных показателей. В крови снизился уровень
сТ4., показатель прогестерона не отличался от контроля.
Трийодтиронин не изменялся при всех дозах йодида калия. Эстрадиол
определялся в крови только у крыс контрольной группы.
143
Таким образом, по результатам проведенного исследования можно было
заключить, что реакция гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадной
систем на йодид калия дозозависима, органоспецифична и связана с
каспазозависимым апоптозом.
Широко известен следующий факт – накопление йода в щитовидной
железе
происходит
при
малых
фармакологических
дозах
йодидов,
подавление накопления – большими фармакологическими дозами. В нашем
эксперименте накопление йода щитовидной железой происходило при дозе
йодида калия, не превышающей «базисный уровень» (1 мкг/100г). При
превышении вышеназванной концентрации йодида наблюдалось подавление
функции щитовидной железы.
Интересно, что процесс накопления йода щитовидной железой при 1
мкг/100г не сопровождался изменением экспрессии тиреоидного НИС и
экспрессии ТТГ в гипофизе. Эти показатели изменились при увеличении
дозы йодида калия свыше «базисного уровня» когда щитовидная железа йод
не накапливала. Заслуживал внимание и тот факт, что аккумуляция йода
щитовидной железой сопровождается изменениями активности апоптоза в
гипофизе, но не в щитовидной железе.
Было установлено, что на 4 мкг/100г йодида калия более активно
реагировала гипофизарно-гонадная система, а на 8 мкг /100г – гипофизарнотиреоидная. Причем реакция гипофиза и щитовидной железы на дозу йодида
калия, в 1,5 раза превышающую уровень йода в щитовидной железе
оказалась не менее выраженной, чем при 25 мкг/100г (дозе эффекта
«Вольфа-Чайкова»). Следует отметить, что на активность апоптоза как в
гипофизе, так и в щитовидной железе, 8 мкг /100г KI оказывали более
выраженное действие, чем 25 мкг/100г.
Описание процесса накопления йода в ЙПТ гипофиза, наиболее
активное при 8 мкг/100г KI, так же требовало дальнейшей детализации.
144
Все вышеизложенное явилось основанием выбора дозировки 8 мкг/100 г
KI для проведения следующего эксперимента.
Общепризнано, что интратиреоидные йод и селен взаимосвязаны в
синтезе и деградации тиреоидных гормонов (селен входит в состав
дейодиназ
и
глютатионпероксидаз).
Уточнение
характера
этого
взаимодействия при йод-индуцированой блокаде щитовидной железы было
решено провести с помощью ренгенспектрального определения йода и
селена в щитовидной железе и гипофизе.
Глава 8. Исследование воздействия йод-индуцированной блокады
щитовидной железы на гипофизарно–тиреоидную и гипофизарно–
гонадную системы самок–крыс
В эксперименте, выполненном на кафедре анатомии и гистологии ФГОУ
ВПО «Уральская академия ветеринарной медицины Минсельхоза России»
(зав. кафедрой проф. Стрижиков В.К.) были использованы 125 беспородных
крыс – самок 6–месячного возраста со средней массой 250±30г. Животные
содержались в виварии со стандартным световым режимом (12 ч света: 12 ч
темноты (дневная фаза – с 7:00 до 19:00 летнего времени)) и получали
стандартный корм и воду. Самки были взяты в опыт в фазы диэструса и
метаэструса. 35 животных составили контрольную группу, 12 – первую, 20–
вторую, 15 – третью, 14 – четвертую, 15 – пятую и 14 – шестую. Анализ
цикличности
функционирования
гонад
проводился
на
основании
определения гормонов репродуктивной сферы в сыворотке крови и
исследования вагинальных мазков.
Крысам 1 группы однократно через желудочный зонд вводили йодид
калия в дозировке 8 мкг /100 г массы животного на 0,5 мл физиологического
раствора (забой был проведен через 24 часа после введения препарата).
Животным из 2, 3, 4, 5 и 6 групп введение KI было проведено
соответственно в течение 1, 2, 3, 4 и 5 дней. Эвтаназия была проведена через
145
48 часов после введения препарата. Кратность введения препарата- 5 дней
была обусловлена предыдущим исследованием: при однократном введении
йодида калия в дозировке 4 мкг/100г в.ж длительность персистирующего
эструса не превышала 1 эстрального цикла. Возник вопрос – какова будет
реакция гипофизарно-гонадной системы, если введение йодида калия будет
проведено в течение всего эстрального цикла?
В
соответствии
с
различными
временными
периодами
блокады
щитовидной железы, экспериментальные животные были разделены на
следующие группы: крысы, забитые через 24 часа после однократного
введения йодида калия, составили группу «второй день блокады щитовидной
железы» (2 день БЩЖ). Соответственно, крысы, забитые через 48 часов
после однократного введения йодида калия, составили группу « третий день
блокады щитовидной железы» (3 день БЩЖ). Животные, получавшие йодид
калия в течение двух дней
и забитые через 48 часов после последнего
введения, составили группу « четвертый день блокады щитовидной железы»
(4 день БЩЖ). Остальные крысы, получавшие йодид калия в течение трех,
четырех и пяти дней и забитые через 48 часов после последнего введения
йодида калия, соответственно составили группы: пятый, шестой и седьмой
день блокады щитовидной железы (5, 6 и 7 день БЩЖ).
Животные были подвержены эвтаназии под эфирным наркозом в период
с 11 ч до 13 ч дневной фазы экспериментальных суток.
8.1. Региональная точечная термометрия
В эксперименте, выполненном на кафедре «Теория и методика
физической культуры и спорта» (НИУ) (Институт спорта туризма и сервиса
ФГБОУ ВПО ЮУрГУ (НИУ) (зав. кафедрой проф. Исаев А.П.) (НИУ) и
кафедре анатомии и гистологии ФГОУ ВПО «Уральская академия
ветеринарной медицины Минсельхоза России» (зав. кафедрой проф.
Стрижиков В.К.) были использованы 35 беспородных крыс – самок 6–
146
месячного возраста со средней массой 250±30г. Животные содержались в
виварии со стандартным световым режимом (12 ч света: 12 ч темноты
(дневная фаза – с 7:00 до 19:00 летнего времени)) и получали стандартный
корм и воду.
Самки были взяты в опыт в фазы диэструса и метаэструса. 5 животных
составили контрольную группу. По 5 крыс вошло в остальные шесть групп,
получавших йодид калия.
Крысам 1 группы однократно через желудочный зонд вводили йодид
калия в дозировке 8 мкг /100 г массы животного на 0,5 мл физиологического
раствора (забой был проведен через 24 часа после введения препарата).
Животным из 2, 3, 4, 5 и 6 групп введение KI было проведено соответственно
в течение 1, 2, 3, 4 и 5 дней.
Крысам контрольной группы термометрия проводилась ежедневно в
течение недели, с 1200 до 1300 часов экспериментальных суток. Крысам
остальных групп измерение температуры проводилось до и после первого
введения йодида калия, и перед забоем, так же с 1200 до 1300. Параллельно
измерениям температуры брались влагалищные мазки для определения
цикличности функционирования гонад.
Термометрия проводилась компьютерным многоточечным термометром
с датчиками DS18B20 (USA) в 5 различных регионах: правое ухо, левое ухо,
влагалище, верхняя треть хвоста, средняя треть хвоста, нижняя треть хвоста.
Результаты
исследования
региональной
точечной
термометрии
у
контрольных крыс и у животных при блокаде щитовидной железы
приведены в рисунках 29 и 30.
Следует отметить, что при исследовании не было выявлено достоверных
различий температуры при различных локализациях точечных измерений в
каком-либо одном регионе: температуры правого и левого ушей и различных
147
отделов хвоста были примерно одинаковы. И, следовательно, для
сравнительного анализа и были выбраны следующие точки: влагалищная
температура, правое ухо и верхняя треть хвоста.
В контрольной группе при сравнительном анализе данных исследования
был выявлен достоверный подъем влагалищной температуры на 5 и 6 дни
исследования. Этот подъем можно было объяснить вступлением самок –
крыс в период эструса (согласно данным влагалищных мазков). Интересно,
что аналогично с влагалищной температурой изменилась температура ушей,
причем температура этого региона выросла на 2 дня раньше влагалищной
температуры. По завершении стадии эструса температура обоих регионов
снизилась до исходных данных. Изменений температуры хвостового региона
за период наблюдений выявлено не было.
Следует отметить, что региональная гипертермия двух регионов
(влагалище и уши) как физиологическое отражение эстрального цикла у крыс
– интересный аспект проведенного исследования, и терморегулирующий
эффект гормонов гипофизарно- гонадной системы нуждается в дальнейшей
разработке.
148
контрольная группа
32
29,6+0,9
31
30
30,2+0,7
30,2+0,3
30,1+0,8
30,8+1,4
29,2+0,5
29,5+0,5
28,4+0,6*
29
o
C
28,3+0,3*
27,9+0,1*
26,9+0,4
28
29,1+1,2*
26,7+0,5
28,1+0,3
27,9+1,1*
27
26,9+0,5
26,3+0,5
26
25
29,5+0,9*
25,4+0,4
25,7+0,4
24,8+0,4
24
1 день
2 день
3 день
влагалище
4 день
правое ухо
5 день
6 день
7 день
верхняя треть хвоста
Рисунок 29. Динамика изменений региональной температуры самок – крыс в контрольной группе.Примечание. * p ≤
0,05–различия с исходными данными ( критерий Дункана).
149
БЩЖ
31
30,4+0,6
29,6+0,7
29
27,1+0,5
C
29,3+0,3
29,8+0,4
29,1+0,3
30
o
30,5+0,4
30,2+0,7
30,3+0,4
28,4+0,2
28,3+0,1*
28
28,4+0,2*
27,8+0,3
28,6+0,1*
28,8+0,3*
28,1+0,3
27
27,1+0,3*,**
26
26,6+0,1**
26,9+0,8*
25,1+0,5
25
24,9+0,1
26,6+0,8*
25,6+0,1**
25,1+0,3
24
исходно
после
введения
2 день БЩЖ
влагалище
3 день
БЩЖ
правое ухо
4 день БЩЖ 5 день БЩЖ 6 день БЩЖ 7 день БЩЖ
верхняя треть хврста
Рисунок 30. Динамика изменений региональной температуры самок – крыс при блокаде щитовидной железы.
Примечание. * p ≤ 0,05–различия с исходными данными, ** p ≤ 0,05–различия с данными контрольной группы ( критерий
Дункана).
150
При анализе результатов термометрии при БЩЖ не было достоверных
изменений региональной температуры на саму процедуру введения йодида
калия (при сравнении показателей до и после первого введения йодида
калия).
Влагалищная температура достоверно возрастала на 2 и 3 дни БЩЖ, но
затем, не достигнув показателей контрольной группы, снизилась. На 5 и 6
дни наблюдений мезор температур групп контроля и БЩЖ достигал 2 и 3 оС
соответственно. Аналогично изменялась и температура ушей. Термометрия
хвостового региона соответствовала показателям контрольной группы.
Таким образом, при проведении региональной точечной термометрии
была выявлено наличие региональной гипертермии (регионы влагалища и
ушей) при эструсе в контрольной группе.
У самок – крыс при БЩЖ
вышеописанного эффекта не наблюдалось .
8.2. Определение гормонов гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно гонадной систем в сыворотке крови самок – крыс при йодиндуцированной блокаде щитовидной железы
В эксперименте, выполненном на кафедре анатомии и гистологии ФГОУ
ВПО «Уральская академия ветеринарной медицины Минсельхоза России»
(зав. кафедрой проф. Стрижиков В.К.) были использованы 47 беспородных
крыс – самок 6–месячного возраста со средней массой 250±30г. Животные
содержались в виварии со стандартным световым режимом (12 ч света: 12 ч
темноты (дневная фаза – с 7:00 до 19:00 летнего времени)) и получали
стандартный корм и воду. Эксперимент проводился в соответствии с «
Правилами проведения работ
с использованием экспериментальных
животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от
12.08.1977 года № 775).Самки были взяты в опыт в фазы диэструса и
метаэструса. 9 животных составили контрольную группу, 4 – первую, 8 –
вторую. По 7 крыс вошло в третью и пятую группы; по 6 крыс – в четвертую
151
и шестую. Анализ цикличности функционирования гонад проводился на
основании определения гормонов репродуктивной сферы в сыворотке крови
и исследования вагинальных мазков.
Крысам 1 группы однократно через желудочный зонд вводили йодид
калия в дозировке 8 мкг /100 г массы животного ( забой был проведен через
24 часа после введения препарата). Крысам 2, 3, 4 , 5 и 6 групп введение KI
было проведено соответственно в течение 1, 2, 3, 4 и 5 дней (забой был
проведен через 48 часов после введения препарата).
Животные были подвержены эвтаназии под эфирным наркозом в
период с 11 ч до
13 ч дневной фазы экспериментальных суток.
Предварительно у животных проводился забор крови из яремной вены.
В сыворотке крови животных определяли содержание тиреоидных
гормонов – общего 3,5,3'–трийодтиронина (оТ3), свободного тироксина (сТ4),
тиреотропного гормона (ТТГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ),
лютеинизирующего
гормона
(ЛГ)
и
прогестерона
методом
иммуноферментного анализа с использованием стандартных наборов тест–
систем ОАО «Алкор–Био» (Санкт–Петербург, Россия), эстрадиола - методом
иммуноферментного анализа с использованием тест – систем «GmbH»
(Германия) на иммуноферментном автоматическом анализаторе (фотометр
«BIO – RAD model 680 MR 12726», США) в иммунологической лаборатории
НУЗ «Дорожная клиническая больница ОАО « РЖД» на ст. Челябинск».
Результаты исследования гормонов гипофизарно–тиреоидной системы
в сыворотке крови приведены в таблице 11.
Динамика
изменений
гормонов
гипофизарно-гонадной
системы
представлены в рисунках 31 и 32.
152
В контрольной группе ТТГ, оТ3 и сТ4 соответствовали эутиреоидному
состоянию животных, не отличаясь от литературных данных (Козлов,
В.Н.2008).
Тиреотропный гормон снизился в 10 раз при однократном введении
йодида калия, причем снижение регистрировалось как через 24 часа, так и
через 48 часов после введения. Снижение ТТГ сохранялось при двух, трех и
четырех – кратных введениях KI. После пятикратных инстилляций йодида
калия ТТГ поднимался до уровня контрольных показателей
Достоверный подъем оТ3 наблюдался только при четырехкратном
введении йодида, перед нормализацией ТТГ.
Достоверное снижение сТ4 было зарегистрировано через 48 часов после
однократного введения KI.
Таким образом, при воздействии калия йодида в дозировке 8 мкг/100 гр
веса животного наблюдалось снижение ТТГ, длившееся в течение недели.
Длительность реакции гипофизарно – тиреоидной системы соответствует
литературным данным: еще в 1966 году был описан ребаунд – эффект при
введении йодида калия (кратковременный гипотиреоз, сменяющийся
гипертиреозом, длящимся в течение недели) (Hall R., 1966)
153
Таблица 11 Сравнительная
характеристика содержания гормонов
гипофизарно– тиреоидной системы в сыворотке крови экспериментальных
животных (М ± m)
Группы
животных
Контрольная
группа
1 группа
(2 день БЩЖ)
2 группа
( 3 день БЩЖ )
3 группа
(4день БЩЖ)
4группа
(5 день БЩЖ)
5 группа
(6 день БЩЖ)
6 группа
(7 день БЩЖ)
ТТГ
оТ3
сТ4
мкМЕ/мл
нмоль/л
пмоль/л
0,117±0,030
2,09±0,27
18,5±1,7
(9)
(9)
2,45±0,32
16,6±1,6
(4)
(4)
2,03±0,54
13,8±1,4*
(8)
(8)
2,90±0,45
16,7±1,1
(7)
(7)
2,94±0,57
17,5±1,9
(6)
(6)
3,01±0,46*
17,9±1,7
(7)
(7)
2,78±0,41
18,2±1,8
(6)
(6)
(8)
0,014±0,007*
(4)
0,014±0,007*
(8)
0,038±0,015*
(7)
0,024±0,012*
(6)
0,026±0,015*
(7)
0,073±0,035
(6)
Примечание. * p ≤ 0,05 – достоверность различий с контрольной группой (
критерий Дункана). В скобках – количество исследований.
154
0,65+0.25
0,8
0.76+0.34*
0.65+0.25*
0.66+0.26
0,7
0.68+0.45
0,71+0,30
мМЕ/мл
0,6
0,5
0.54+0.29
0.27+0.12
0,4
0.54+0.21
0,3
0.23+0.13
0,2
0.14+0.11
0,1
0.15+0.07
0.13+0.12
0.10+0.07
0
контроль
2 день БЩЖ
3 день БЩЖ
ФСГ
4 день БЩЖ
5 день БЩЖ
6 день БЩЖ
7 день БЩЖ
ЛГ
Рисунок 31. Динамика изменений ФСГ И ЛГ в крови самок – крыс при блокаде щитовидной железы.* p ≤ 0,05– различия с
контрольными данными ( критерий Дункана).
155
94.5+10.7
100
90
80
70
62.4+14.1
60
30.7+6.9*
50
48.0+11.9*
37.1+9.3*
33.1+11.9*
38.3+12.9*
40
30
20
17.5+10.5*
4.9+2.2
10
16.3+4.8*
9.4+4.2
3.7+3.7
16.6+3.6*
3.7+1.9
0
контроль
2 день БЩЖ
3 день БЩЖ
4 день БЩЖ
эстрадиол нмоль/л
5 день БЩЖ
6 день БЩЖ
7 день БЩЖ
прогестерон пг/мл
Рисунок 32. Динамика изменений эстрадиола и прогестерона в крови самок – крыс при блокаде щитовидной железы.* p
≤ 0,05 – различия с контрольными данными (критерий Дункана).
156
Однако при нашем исследовании было выявлено, что реакция
щитовидной железы (гипертиреоз) присоединилась к гипофункции гипофиза
только после
четырехкратного введения йодида. Сочетанная реакция
гипофиза и щитовидной железы предшествовала нормализации уровня ТТГ и
тиреоидных гормонов при пятикратном введении KI.
Следует обратить внимание на то, что изменения уровня ТТГ
происходили на фоне монотонного уровня тиреоидных гормонов в течение
первых трех суток, и следовательно вряд ли могли быть вторичными.
Исходя из динамики изменения гормонов гипофизарно –тиреоидной оси,
можно предположить, что первично на введение йодида калия отреагировал
гипофиз. Реакция щитовидной железы наступила лишь на 4 – е сутки после
начала введения препарата. Вероятно, присоединение реакции щитовидной
железы к реакции гипофиза на продолжающееся введение йодида и явилось
триггером для нормализации функции гипофизарно – тиреоидной системы.
Динамика изменений гормонов гипофизарно–гонадной системы показала,
что при блокаде щитовидной железы наблюдался персистирующий эструс
(ПЭ): со второго дня БЩЖ в 3 раза снижался уровень прогестерона, с
третьего дня БЩЖ отмечался рост ФСГ и ЛГ, с четвертого дня в 3 раза
возрастал эстрадиол.
Особенностью ПЭ при йодиндуцированной БЩЖ явились синхронное
изменение ЛГ и прогестерона на 5 день БЩЖ – ЛГ снизился, а прогестерон –
поднялся до уровня контрольных показателей. То есть, после 3–х кратного
введения йодида калия наблюдался эффект «ускользания» гипофизарно–
гонадной
системы,
однако
последующее
введение
йодида
вновь
спровоцировало подъем ЛГ и снижение прогестерона. ФСГ и эстрадиол
оставались монотонно высокими в течение 3–7 и 4–7 дней блокады
соответственно.
157
При ребаунд–эффекте (7 день БЩЖ), в отличие от гипофизарно–
тиреоидной системы, полноценной скачкообразной нормализации йод –
индуцированного персистирующего эструса не наблюдалось: определялась
нормализация только одного гормона – снизился уровень ЛГ. Вероятно,
нормализация эстрального цикла после БЩЖ требует более длительного
временного периода, чем восстановление функции тиреоидной системы.
При анализе результатов эксперимента были так же выявлены некоторые
различия реакции тиреоидной и гонадной систем на ЙК: изменения уровня
гормонов гипофизарно–тиреоидной системы начались с гипофизарного
уровня (снижение ТТГ наблюдалось на второй день БЩЖ, после
однократного введения КЙ), реакция гормонов щитовидной железы
(кратковременный
однодневный
гипертиреоз)
присоединилась
к
гипофункции гипофиза только после четырехкратного введения йодида и
нивелировалась при ребаунд–эффекте.
Изменения гормонов гипофизарно–гонадной системы, в отличие от
гипофизарно–тиреоидной, начались со снижения уровня прогестерона на 2
день БЩЖ (после однократного введения КЙ), гормоны гипофиза имели
тенденцию к повышению только с 3 дня блокады, эстрадиол повысился на
четвертый. Исходя из изложенных данных, можно было бы предположить,
что изменения ФСГ и ЛГ при БЩЖ вторичны, однако единственным
гормоном гипофизарно–гонадной системы, нормализующимся при ребаунд–
эффекте, был лютеинизирующий гормон.
Таким образом, можно было сделать вывод о том, что йод–
индуцированная блокада щитовидной железы оказывает подавляющее
влияние на репродуктивную систему самок–крыс. Однако вопрос об уровне
первичного воздействия КЙ (гипофиз или/и яичники) оставылся открытым.
158
Определение
8.3.
экспрессии
тироидстимулирующего
гормона
в
гипофизе при йод-индуцированной блокаде щитовидной железы
Определение экспрессии ТТГ в тканях гипофиза осуществляли
стрептавидин-биотиновым методом с помощью моноклональных антител
(таблица 2).
Иммуногистохимическому исследованию был 31 образец ткани (9 – в
контрольной группе, 7 – в группе «3 день БЩЖ», и по 3 образца из
остальных групп). Результаты исследований иллюстрированы рисунками 33
и 34.
По результатам проведенного исследования было выявлено, что
экспрессия
ТТГ в гипофизе постепенно снижалась по сравнению с
контролем (13,7± 0,9 РА%) со второго(10,3± 4,6 РА%) до пятого дня блокады
щитовидной железы (6,0±1,1 РА%) (достоверно – с третьего дня БЩЖ
(7,7±0,9 РА%),затем скачкообразно выросла до уровня контроля на шестой
день БЩЖ (13,5±1,9 РА%).
Таким
образом,
блокада
щитовидной
железы
сопровождалась
постепенным снижением экспрессии ТТГ в гипофизе. Скачкообразный рост
экспрессии ТТГ произошел за день до ребаунд-эффекта.
6.3.4.
Определение
экспрессии
натрий-йодного
симпортера
в
щитовидной железе, гипофизе и яичниках при йод-индуцированной
блокаде щитовидной железы
Следует подчеркнуть еще раз, что исследование экспрессии НИС
проводилось на тех же фрагментах гипофизов, в которых была определена
экспрессия ТТГ. Определение экспрессии НИС в тканях осуществляли
стрептавидин-биотиновым методом с помощью моноклональных антител
(таблица 2).
159
Иммуногистохимическое исследование было проведено в 93 срезах (27 – в
контрольной группе, 21 – в группе «3 день БЩЖ», и по 9 образцов из
остальных групп). Результаты исследований щитовидных желез и гипофизов
иллюстрированы рисунками 35 и 37, яичников – рисунком 36.
По результатам проведенного исследования экспрессия НИС
в
щитовидной железе выросла достоверно в 2 раза по сравнению с контролем
(3,7±1,2) на 3 и 4 дни блокады щитовидной железы (соответственно 8,3±1,9 и
8,2±1,7). Затем экспрессия НИС снизилась до контрольного уровня на пятый
день блокады и достоверно ниже контрольных показателей - на шестой день
(2,6±0,6). При ребаунд эффекте на седьмой день экспрессия НИС поднялась
до уровня контроля.
Экспрессия НИС в гипофизе достоверно выросла скачкообразно на
второй день блокады (13,7±1,2) - более чем в 7 раз по сравнению с контролем
(1,8±0,7). Снижение экспрессии НИС наблюдалось только на пятый день
блокады (5,0±0,9), однако более чем двукратное превышение уровня
контроля сохранялось до ребаунд эффекта.
160
16
14
13.5+1.9
13.7+0.9
12.8+3.1
PA(%)
12
10.3+4.6
10
7.7+0.9*
8
6.5+0.6*
6
6.0+1.1*
4
2
0
контроль
2 день БЩЖ
3 день БЩЖ
4 день БЩЖ
5 день БЩЖ
6 дегь БЩЖ
7 день БЩЖ
ТТГ
Рисунок 33 . Динамика изменений экспрессии ТТГ в гипофизе самок – крыс при блокаде щитовидной железы.* p ≤
0,05–различия с контрольными данными (критерий Дункана).
161
Рисунок 34. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов: экспрессия
ТТГ в гипофизах самок-крыс в контроле (верхняя панель) и на 5 день БЩЖ (
нижняя панель) (увеличение x 400).
162
16
13.7+1.2*
11.6+0.8*
14
13.7+1.8*
PA(%)
12
10
8.2+1.7
8
8.3+1.9*
6.2+0.6*
6
5.0+0.9
5.5+0.2
3.7+1.2
4
2
5.1+0.9
3.3+0.3
3.9+1.3
2.6+0.6*
1.8+0.7
0
контроль
2 день БЩЖ
3 день БЩЖ
4 день БЩЖ
5 день БЩЖ
6 день БЩЖ
7 дегь БЩЖ
НИС
щитовидная железа
гипофиз
Рисунок 35. Изменения экспрессии НИС в щитовидной железе и гипофизе в различные дни блокады щитовидной
железы * p ≤ 0,05 различия по сравнению с контролем (критерий Дункана)
163
10
8.8+2.1*
7.6+2.2
PA(%)
8
6
4.3+0.9
4.4+1.2
4.7+0.3
4
2.7+0.5*
3.5+0.9
2
0
контроль
2 день БЩЖ
3 день БЩЖ
4 день БЩЖ
5 день БЩЖ
6 день БЩЖ
7 день БЩЖ
яичники
НИС
Рисунок 36. Изменения экспрессии НИС в щитовидной железе и гипофизе в различные дни блокады щитовидной
железы.* p ≤ 0,05 различия по сравнению с контролем (критерий Дункана)
164
Рисунок 37. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов: экспрессия
антител к НИС в гипофизах самок-крыс в контроле (верхняя панель) и на 5
день БЩЖ ( нижняя панель) (увеличение x 200).
165
Экспрессия НИС в яичниках достоверно поднималась на 3 день БЩЖ
(8,8±2,1) , снижаясь до уровня контроля (4,3±0,9)на 4 и 5 дни (
соответственно 4,4±1,2 и 3,5±0,9), имела тенденцию к росту на 6 день БЩЖ (
7,6±2,2) и достоверно снижалась на седьмой, при ребаунд–эффекте (2,7±0,5).
Таким образом, при йод – индуцированной блокаде щитовидной железы
наблюдались изменения экспрессии НИС во всех органах, причем изменения
экспрессии НИС в гипофизе начинались раньше, чем в щитовидной железе, и
были более выраженными. Характер изменений экспрессии НИС в яичниках
отличался от вариабельности экспрессии НИС в гипофизе.
8.5. Определение экспрессии каспазы 3 в щитовидной железе, гипофизе и
яичниках при йод-индуцированной блокаде щитовидной железы
Исследование экспрессии каспазы 3 проводилось на тех же фрагментах
гипофизов, в которых была определена экспрессия ТТГ и НИС. Определение
экспрессии каспазы 3 в тканях осуществляли стрептавидин-биотиновым
методом с помощью моноклональных антител (таблица 2).
Иммуногистохимическому исследованию были подвергнуты 93 среза с
образцов (27 – в контрольной группе, 21 – в группе «3 день БЩЖ», и по 9
образцов из остальных групп). (в соответствии с определением экспрессии
НИС).
Результаты
исследований
щитовидных
желез
и
гипофизов
иллюстрированы рисунками 38 и 40, яичников – рисунком 39.
Экспрессия каспазы 3 в щитовидной железе постепенно выросла в течение
первых пяти дней блокады (достоверные различия с контролем (2,9±0,5) были
зарегистрированы на четвертый и пятый дни блокады (соответственно 8,5±1,8
и 10,1±4,9)), затем снизилась до контрольного уровня при ребаунд эффекте (7
день блокады) ( 5,5±1,5).
В гипофизе экспрессия каспазы 3 на второй и пятый дни блокады
скачкообразно выросла в 14 и 13 раз ( соответственно 18,0±5,5 и 15,6±0,5) по
166
сравнению с контролем (1.3±0,6). На третий – четвертый и шестой – седьмой
дни блокады наблюдалось снижение показателя соответственно в 2 (до
8,8±1.7 и 8,5±1,8 – выше уровня контроля)) и 3 раза (до 5,5±2,6 и 7,0±0,9 – до
уровня контроля).
В яичниках экспрессия каспазы 3 была достоверно выше контрольного
показателя (1.5±0,5) почти на всем протяжении БЩЖ, поднимаясь со второго
дня; однако на третий день БЩЖ наблюдалось кратковременное снижение до
норматива (3.3±0,8). Эти данные совпадают с описанной Silva J. (2013)
активацией апоптоза в желтом теле яичников самок – крыс при гипертиреозе,
так
как
йод–индуцированная
БЩЖ
сопровождалась
снижением
тиреотропного гормона на всем протяжении блокады и кратковременным
повышением трийодтиронина на 6 день блокады, перед ребаунд-эффектом.
Таким образом, при йод – индуцированной блокаде щитовидной железы
наблюдались изменения экспрессии каспазы 3 в обоих органах, причем
изменения в гипофизе начинались раньше, чем в щитовидной железе, и были
более выраженными (аналогично с изменениями экспрессии НИС). Характер
изменений экспрессии каспазы 3 в яичниках отличался от вариабельности
экспрессии каспазы 3 в гипофизе.
Таким образом, в результате иммуногистохимического исследования
определились следующие особенности реакции гипофизарно - тиреоидной и
гипофизарно - гонадной систем на йод-индуцированную блокаду щитовидной
железы:
-
во всех трех изучаемых органах при блокаде щитовидной железы
изменялись однонаправлено (ростом) экспрессии НИС и каспазы 3
- в щитовидной железе изменения экспрессии НИС и каспазы 3 наблюдались
соответственно на 1 день и 2 дня позже, чем в гипофизе
167
-
вариативность экспрессии ТТГ в гипофизе совпадала с изменениями
уровня ТТГ в крови до пятого дня блокады, на 6 день блокады щитовидной
железы (за день до ребаунд-эффекта) происходит скачкообразный рост
экспрессии ТТГ в гипофизе на фоне низкого уровня ТТГ в крови. Рост уровня
ТТГ в крови наблюдается только на 7 день блокады.
- снижение экспрессии ТТГ в гипофизе сопровождались синхронным
скачкообразным ростом экспрессии НИС и каспазы 3 в гипофизе
- скачкообразная нормализация экспрессии ТТГ в гипофизе на 6 день БЩЖ
была синхронна с нормализацией экспрессии гипофизарной каспазы 3. Этому
процессу предшествовало снижение экспрессии НИС в гипофизе (на 5 день
БЩЖ)
- реакция экспрессии НИС и каспазы 3 в экстратиреоидных органах (гипофиз
и яичник) не была идентичной
При сопоставлении изменений экспрессии НИС и каспазы 3 в гипофизе,
щитовидной железе и яичниках при БЩЖ можно суммировать, что в первые
дни БЩЖ динамика изменений НИС в яичнике была идентична с
щитовидной железой (уровень НИС в щитовидной железе так же
увеличивался только на 3 день БЩЖ), а вариабельность экспрессии каспазы 3
– с гипофизом (в гипофизе так же наблюдался скачкообразный рост
экспрессии каспазы 3 на 2 день БЩЖ).
Но в последующем такой идентичности не наблюдалось – в гипофизе
экспрессия каспазы 3 снижалась однократно на 4 день БЩЖ, а в яичнике – на
3 день. Экспрессия НИС в щитовидной железе снижалась на 5 день блокады
и опускалась ниже нормального уровня на 6 день блокады, нормализуясь на 7
день при ребаунд–эффекте. В яичнике экспрессия НИС понижалась до
норматива на 4 и 5 дни БЩЖ, вырастала на 6 день и снижалась ниже
норматива на 7 день блокады.
168
Таким образом, иммуногистохимическое исследование щитовидных желез,
гипофизов и яичников самок – крыс выявило активную роль гипофиза в
развитии йод-индуцированной блокады щитовидной железы (реакция
экспрессии НИС в экстратиреоидном органе - гипофизе на 2 дня опережала
изменения экспрессии НИС в щитовидной железе). Встал вопрос – играет ли
вышеописанное изменение НИС в экстратиреоидном органе какую-либо роль
в развитии БЩЖ?
В связи с вышеизложенным, целью дальнейшего исследования явился
количественный рентгенспектральный анализ йода и селена (микроэлемента,
ассоциированного с синтезом тиреоидных гормонов) в щитовидной железе и
гипофизе самок – крыс при йод-индуцированной БЩЖ.
169
20
18
18.0+5.5*
16
15.6+0.5*
PA(%)
14
12.3+1.6*
12
8.8+1.7
8.9+0.4
10
8
6
8.5+1.8*
2.9+0.5
4
2
10.1+4.9*
7.0+0.9*
7.3+1.6
5.5+2.6
4.8+1.3
5.5+1.5
1.3+0.6
0
контроль
2 день БЩЖ
3 день БЩЖ
4 день БЩЖ
5 день БЩЖ
6 день БЩЖ
7 день БЩЖ
каспаза 3
щитовидная железа
гипофиз
Рисунок 38. .Изменения экспрессии каспазы 3 в щитовидной железе и гипофизе в различные дни блокады
щитовидной железы * p ≤ 0,05 различия по сравнению с контролем (критерий Дункана)
170
12
10.7+3.5*
PA(%)
10
9.7+1.9*
8.3+2.2*
7.6+0.7*
8
6.5+1.1*
6
4
2
3.3+0.8
1.5+0.5
0
контроль
2 день БЩЖ
3 день БЩЖ
4 день БЩЖ
5 день БЩЖ
6 день БЩЖ
7 день БЩЖ
яичники
каспаза 3
Рисунок 39. Изменения экспрессии НИС в щитовидной железе и гипофизе в различные дни блокады щитовидной
железы.* p ≤ 0,05 различия по сравнению с контролем (критерий Дункана)
171
Рисунок 40. Иммуногистохимическое окрашивание препаратов: экспрессия
каспазы 3 в гипофизах самок-крыс в контроле (верхняя панель) и на 3 день
БЩЖ ( нижняя панель) (увеличение x 200).
172
8.6. Количественный рентгеноспектральный микроанализ йода и селена
в щитовидной железе и гипофизе самок-крыс при йод-индуцированной
блокаде щитовидной железы
Количественный рентгеноспектральный микроанализ образцов тканей
был проведен в лаборатории электронной микроскопии Южно-Уральского
государственного
университета
(заведующий
кафедрой
–
профессор
Михайлов Г.Г.).
Для исследования йода и селена в щитовидных железах и гипофизах крыс в
различные дни блокады щитовидной железы аналогично были исследованы
15 щитовидных желез и 17 гипофизов. В контрольной группе были
исследованы 2 щитовидные железы и 4 гипофиза, в остальных – по 2
щитовидных железы и гипофиза в каждой группе. Каждый образец был
исследован в среднем 11.4 раз (7.9 для I и 3.5 для Se).
365 точек было рандомизировано исследовано во всех органах: 176 – в
щитовидных железах, 189 – в гипофизах. Йод анализировался в 254 точках
(102 – в щитовидных железах и 152 – в гипофизах), селен – в 111 точках (74 –
в щитовидных железах и 37 – в гипофизах).
Количественный рентгеноспектральный микроанализ йода
Результаты количественного рентгеноспектрального микроанализа йода
иллюстрированы таблицей 12.
Достоверные различия между уровнями йода в йод позитивных точках
щитовидной железы и гипофиза были зарегистрированы в контрольной
группе (уровень йода в ЙПТ щитовидной железы был в 8 раз выше, чем в
гипофизе), в группе «6 день БЩЖ» (уровень йода в ЙПТ щитовидной железы
был в 2 раза ниже, чем в гипофизе, снизившись до базального уровня йода в
ЙПТ) и в группе «7 день БЩЖ» (уровень йода в ЙПТ щитовидной железы
173
Щитовидная железа
Гипофиз
ЙПТ (масс% x 10-2 с.в.)
Группы
М±m
ЙПТ (масс% x 10-2 с.в.)
Минима
льное
значение
Максима
М±m
льное
значение
% ЙПТ
Минима
Максима
льное
значение
льное
значение
% ЙПТ
Контроль
16.7±3.0
2.6
59.0
100
2.2±0.3
0.2
6.3
65
2 день БЩЖ
11.6±2.9
2.7
32.9
100
4.7±0.6
3.2
6.3
83,3
3 день БЩЖ
9.3±1.9
0.5
40.2
100
7.2±1.2 *
4.2
12.0
28
4 день БЩЖ
4.3±0.9 *
0.9
11.5
100
5.6±0.9 *
0.7
12.6
43.4
5 день БЩЖ
6.7±1.1*
1.6
12.6
83,3
6.2±1.7 *
1.4
17.5
41.6
6 день БЩЖ
3.6±0.6 *
0.9
7.7
73,3
6.4±0.8 *
0.4
11.9
42.8
7 день БЩЖ
23.7±5.9
0.1
57.2
91,6
3.6±0.7
2.1
9.8
62.5
Таблица 12. Количественный ренгеноспектральный микроанализ (анализ точек) йода в щитовидной железе и
гипофизе в различные дни блокады щитовидной железы. * p ≤ 0,05 – достоверные различия с контролем (тест
Дункана).
174
был в 6 раз выше, чем в гипофизе; соотношение уровней йода в обоих органах
вернулось к контрольным при ребаунд эффекте).
Таким образом, было выявлено, что при йод – индуцированной блокаде
щитовидной железы изменения уровня йода в ЙПТ наблюдались в обоих
органах: в щитовидной железе этот показатель снижался, а в гипофизе повышался. Интересно отметить, что изменения
уровня йода в гипофизе
начинались раньше, чем в щитовидной железе: уровень йода в ЙПТ гипофиза
достоверно повысился на 3 день блокады, а в щитовидной железе достоверно
снизился на 4 день блокады.
Важно
отметить,
что
повышение
уровня
йода
в
ЙПТ
гипофиза
сопровождалось снижением процента гипофизарных ЙПТ.
Количественный рентгеноспектральный микроанализ селена
Результаты количественного рентгеноспектрального микроанализа селена
представлены в таблице 13.
В контрольной группе уровень селена в селенпозитивных точках и процент
селенпозитивных точек в щитовидной железе и гипофизе
достоверно не
различались. Эти данные соответствуют литературным данным о содержании
селена в щитовидной железе и гипофизе крыс (Chanoine J, 1993, ThorlaciusUssing O,, 1988). При блокаде щитовидной железы изменения содержания
селена наблюдались только в гипофизе – на 2 и 5 день блокады уровень
селена в селенпозитивных точках гипофиза снижался до нуля.
175
Щитовидная железа
Группы
Гипофиз
СеПТ (масс% x 10-2 с.в.)
М±m
СеПТ (масс% x 10-2 с.в.)
%
Минимальное Максимальное
СеПТ
значение
значение
М±m
%
Минимальное Максимальное
СеПТ
значение
значение
Контроль
2.2±0.3
0.4
10.5
42.8
1.8±0.8
0.7
3.5
57.1
2 день БЩЖ
1.8±0.6
0.4
4.2
44.4
0*
0
0
0*
3 день БЩЖ
2.3±0.1
1.1
5.2
57.1
3.5±1.4
2.1
4.9
50.0
4 день БЩЖ
3.0±0.7
0.7
4.5
45.4
2.1±0.4
1.4
2.5
60.0
5 день БЩЖ
2.5±0.5
1.1
4.7
58.4
0*
0
0
0a
6 день БЩЖ
1.9±0.7
0.3
5.2
63.6
3.2±0.7
1.5
4.5
60.0
7 день БЩЖ
3.1±0.5
1.0
5.6
66.6
1.9±0.6
1.1
3.2
50.0
Таблица 13. Количественный ренгеноспектральный микроанализ (анализ точек) селена в щитовидной железе и
гипофизе в различные дни блокады щитовидной железы. * p ≤ 0,05 – достоверные различия с контролем (тест
Дункана).
176
При анализе изменений йода и селена в щитовидной железе и гипофизе в
комплексе с динамикой экспрессий ТТГ, НИС и каспазы 3на протяжении йод
– индуцированной блокады щитовидной железы были выделены следующие
периоды (рисунок 41 и рисунок 42):
Период 1. Старт блокады щитовидной железы – дестабилизация
физиологических соотношений йода и селена в щитовидной железе и
гипофизе (2 день БЩЖ). Снижение уровня йода в ЙПТ в щитовидной железе
сопровождалось изменениями соотношения микроэлементов в гипофизе:
повышением уровня йода в ЙПТ и первым снижением до нуля уровня селена
в селен-позитивных точках. Так же в гипофизе повышались экспрессия НИС
и экспрессия каспазы 3 и появляется тенденция к снижению экспрессии ТТГ.
Период 2. Период плато одинаковых уровней йода в ЙПТ щитовидной
железы и гипофиза (3 – 4 дни БЩЖ). Плато одинаковых уровней йода в ЙПТ
щитовидной
железы
и
гипофиза
сопровождалось
плато
повышения
экспрессии НИС в обоих органах.
В гипофизе уровень селена в селенпозитивных точках на третий день
блокады скачкообразно двукратно повысился по отношению к уровню
контроля, а затем снизился до контрольного уровня. Интересно, что эти
изменения селена в гипофизе сопровождались двукратным снижением
экспрессии каспазы 3 в гипофизе. Экспрессия каспазы 3 в щитовидной железе
несколько повысилась, но эти изменения не отразились на уровне селена в
щитовидной железе.
Экспрессия ТТГ в гипофизе постепенно снижалась, и к четвертому дню
блокады это снижение стало достоверным по отношению к контролю.
Период 3. Начало дестабилизации плато одинаковых уровней йода в
ЙПТ щитовидной железы и гипофиза (5 день БЩЖ). Плато одинаковых
177
уровней йода в ЙПТ щитовидной железы и гипофиза сохранилось, однако в
обоих органах снизилась экспрессия НИС.
В гипофизе наблюдалось второе снижение до нуля уровня селена в селенпозитивных точках, которое сопровождалось вторым скачкообразным ростом
экспрессии каспазы 3 в гипофизе. В щитовидной железе экспрессия каспазы 3
выросла двукратно по сравнению с контролем, но уровень селена в селенпозитивных точках щитовидной железы не изменился. Однако процент селенпозитивных точек увеличился с 40% до 60 %. Это увеличение процента СеПТ
в щитовидной железе сохранится на всем протяжении блокады, включая
ребаунд эффект.
Экспрессия ТТГ в гипофизе снизилась двукратно по сравнению с
контролем, достигнув минимального значения на всем протяжении блокады
щитовидной железы.
Период 4. Дестабилизация плато одинаковых уровней йода в ЙПТ
щитовидной железы и гипофиза (6 день БЩЖ). Уровень йода в ЙПТ
щитовидной железы снизился ниже уровня йода в ЙПТ гипофиза, достигнув
базисного уровня йода в ЙПТ. Экспрессия НИС в щитовидной железе
снизилась ниже контрольного уровня.
В гипофизе наблюдалось повторное сочетание двукратного роста уровня
селена в селенпозитивных точках и снижения экспрессии каспазы 3.
Экспрессия каспазы 3 снизилась и в щитовидной железе.
Экспрессия ТТГ в гипофизе скачкообразно выросла до контрольного
уровня.
178
25
20
23.7+5.9*,
**
16.7+3.0**
13.5+1.9
15
13.7+0.9
11.6+2.9
12.8+3.1
9.3+1.9
10
7.7+0.9*
10.3+4.6
6.5+0.6*
5.6+0.9*
6.2+1.7*
6.0+1.1*
6.4+0.8*
7.2+1.3*
5
4.7+0.6
5.6+1.2*
4.3+0.9*
2.2+0.3
3.6+0.7
3.6+0.6
*,**
0
контроль
2 день БЩЖ
3 день БЩЖ
ЙПТЩ
4 день БЩЖ
ЙПТГ
5 день БЩЖ
6 день БЩЖ
7 день БЩЖ
ТТГ
Рисунок 41. Динамика изменений уровня йода в ЙПТ щитовидной железы (ЙПТЩ), ЙПТ гипофиза (ЙПТГ) ( масс%
х10-2 с.в.) и экспрессии ТТГ в гипофизе (PA(%)) на протяжении блокады щитовидной железы. * = p<0.05 по
сравнению с контролем , **= p<0.05 по сравнению между ЙПТ щитовидной железы и гипофиза (критерий Дункана).
179
18.0+5.5*
20
18
16
15.6+0.5*
12.3+1.6*
14
12
8.8+1.7*
10
7.0+0.9*
8
5.5+2.6
6
4
2
1.8+0.6
1.3+0.6
3.5+1.4
3.2+0.7
2.1+0.4
0*
0*
1.9+0.6
0
контроль
2 день БЩЖ
3 день БЩЖ
СеПТГ
4 день БЩЖ
5 день БЩЖ
6 день БЩЖ
7 дегь БЩЖ
каспаза 32
Рисунок 42. Динамика изменений уровня селена в СеПТ гипофиза (СеПТГ) ( масс% х10 -2 с.в.) и экспрессии каспазы
32 в гипофизе (РА%) на протяжении блокады щитовидной железы. * = p<0.05 по сравнению с контролем ( критерий
Дункана),
180
Период 5. Ребаунд-эффект (7 день БЩЖ). Наблюдалась скачкообразная
одновременная нормализация исследуемых показателей: уровень йода в
ЙПТ и экспрессия НИС повысились в щитовидной железе и понизились в
гипофизе до контрольных показателей.
Уровень селена в СеПТ гипофиза снизился до контроля. Экспрессия
каспазы 3 в гипофизе осталась повышенной по сравнению с контролем. В
щитовидной железе этот показатель от контроля не отличался.
Экспрессия ТТГ в гипофизе так же соответствовала контрольному
уровню.
Таким образом, при йод - индуцированной блокаде щитовидной железы
наблюдалась периодичность изменений уровня йода в йод – позитивных
точках как щитовидной железы, так и гипофиза. Однако, эти изменения были
разнонаправлены – в гипофизе этот показатель постепенно возрастал, затем
скачкообразно снизился. В щитовидной железе постепенно снижался, затем
скачкообразно вырос.
Следует отметить, что в щитовидной железе снижению уровня йода в
ЙПТЩ соответствовало и снижение процента ЙПТЩ и, следовательно,
содержание йода в органе уменьшалось; в гипофизе повышению уровня йода
в ЙПТГ соответствовало снижение процента ЙПТГ, и вероятно, содержание
йода в гипофизе оставалось постоянным.
Интересно, что соответствие изменений экспрессии НИС изменениям
уровня йода было различно для щитовидной железы и гипофиза и менялось в
различные периоды блокады. В гипофизе изменения экспрессии НИС
соответствовали изменениям уровня йода в ЙПТГ в течение первых двух
периодов (при начале блокады и при плато одинаковых уровней йода в ЙПТ
щитовидной железы и гипофиза); в щитовидной железе - в течение
четвертого периода (при дестабилизации плато одинаковых уровней йода в
181
ЙПТ щитовидной железы и гипофиза); и в обоих органах - при ребаунд
эффекте.
В отличие от изменений экспрессии НИС в щитовидной железе,
изменения экспрессии ТТГ в гипофизе были синхронны и однонаправлены с
изменениями уровня йода в ЙПТЩ щитовидной железы на протяжении
периодов плато (первый – третий периоды). Ключевым моментом в ребаунд
эффекте, по – видимому. является четвертый период, когда на фоне
одновременного максимального снижения уровня йода и экспрессии НИС в
щитовидной железе, наблюдался скачкообразный рост экспрессии ТТГ в
гипофизе.
Изменения уровня селена при блокаде щитовидной железы наблюдались
только в гипофизе и сочетались с изменениями экспрессии каспазы 3:
снижение уровня селена сочеталось с ростом экспрессии каспазы 3. Причем
этот феномен наблюдался дважды – в первом и четвертом периодах блокады
(при дестабилизация физиологических соотношений йода и селена в
щитовидной железе и гипофизе и при дестабилизации плато одинаковых
уровней йода в ЙПТ щитовидной железы и гипофиза при блокаде).
В щитовидной железе этот эффект не наблюдался, однако одновременно
с ростом экспрессии каспазы 3 в щитовидной железе процент селен позитивных точек в щитовидной железе повышался на 50%.
Анализ амплитуды изменений йода и селена так же показал их
органозависимость: максимальный подъем уровня йода в ЙПТ щитовидной
железы был двукратный по сравнения с контролем, в гипофизе –
трехкратным;
минимальное
снижение
в
щитовидной
железе
было
восьмикратным, в гипофизе уровень йода не снижался ниже контрольного
уровня. Уровень селена в СеПТ щитовидной железы был постоянным, а в
гипофизе изменялся от нуля до двукратного превышения контрольного
уровня.
182
Скорость изменений йода и селена при блокаде щитовидной железы так
же была различной: изменения уровня йода в обоих органах были
постепенными, скачкообразность наблюдалась только при ребаунд эффекте;
напротив, изменения
селена
в гипофизе были
скачкообразными и
наблюдались в периоды плато.
Таким образом, йод – индуцированная блокада щитовидной железы
вызывала изменения уровня йода в йод – позитивных точках как в
щитовидной железе, так и в гипофизе, а уровня селена в селен позитивных
точках – только в гипофизе. Изменения уровня йода в щитовидной железе
более гармонировали с изменениями экспрессии ТТГ в гипофизе, чем с
экспрессией НИС в щитовидной железе. Вариабельность экспрессии каспазы
3 наблюдалась в обоих органах, но была более выражена в гипофизе и
ассоциировала с изменениями гипофизарного селена.
При анализе реакции гипофизарно- гонадной системы на БЩЖ можно
сделать вывод о том, что наличие персистирующего эструса при йодной
нагрузке, выявленное в первых двух этапах опытов с йодидом калия, было
подтверждено и при моделировании блокады щитовидной железы. Однако
при ребаунд–эффекте, в отличие от гипофизарно–тиреоидной системы, не
наблюдалось
полноценной
скачкообразной
нормализации
йод
–
индуцированного персистирующего эструса: определялась нормализация
только одного гормона – ЛГ (снижение). Показатели ФСГ, эстрадиола и
прогестерона не отреагировали на ребаунд-эффект. Вероятно, нормализация
эстрального цикла после БЩЖ требует более длительного временного
периода, чем восстановление функции тиреоидной системы.
Первичная реакция яичника на БЩЖ, вероятно, присутствовала – в виде
активации местного апоптоза. Этот эффект имел как общие с щитовидной
железой и гипофизом, так и индивидуальные особенности: в яичниках на
начальных этапах развития БЩЖ активация апоптоза не была синхронна с
изменениями маркера содержания йода в тканях – рост экспрессии каспазы 3
183
(2 день БЩЖ) предшествовал росту экспрессии НИС (3 день БЩЖ). В
гипофизе и щитовидной железе активация апоптоза была синхронизирована
с ростом НИС, но в гипофизе этот эффект наблюдался на 2 день БЩЖ, а в
щитовидной железе – на третий.
Вариабельность вышеназванных показателей в яичниках на протяжении
БЩЖ так же отличалась индивидуальностью. Основной индивидуальной
особенностью реакции яичников на БЩЖ явилась длительная активация
апоптоза, не прекратившаяся при ребаунд–эффекте при снижении экспрессии
НИС. В гипофизе и щитовидной железе при ребаунд –эффекте экспрессия
НИС и каспазы 3 нормализовались.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Разработка метода дегидратации образцов биологических тканей с
помощью комбинации вакуумного и термального подсушивания
Количественное определения йода и селена в биологических тканях – одна
из трудных процедур в аналитической химии в связи с низким содержанием
этих микроэлементов в исследуемых объектах. Химические свойства
вышеназванных
микроэлементов
так
же
затрудняют
аналитическое
исследование: микроэлемент йод обладает поливалентностью и летучестью, а
так же активно вступает в окислительно – восстановительные реакции с
компонентами анализируемого продукта (Бок Р., 1984). Микроэлемент селен
присутствует
в
биоматериалах
в
различной
степени
окисления,
следовательно, возникают трудности при переводе всех соединений селена в
одну форму (Ермаков В.В.,2010).
При количественном определении йода органическая составляющая
биологических объектов затрудняет проведение анализа. Для исключения
влияния органических веществ и перевода всех форм йода в одну
общеприменимо щелочное сухое сжигание («сухое» озоление в муфельной
184
печи при температуре от 400 до 500°С) и обработка сильными кислотами в
присутствии
окислителей
(«мокрое»
озоление).
Описано
щелочное
окислительное разложение пробы с последующей нейтрализацией и
восстановлением окисленных форм йода (Бок Р., 1984). Количественное
определение селена так же требует перевода всех соединений селена в одну
форму, чаще всего – в гидридную («мокрое» озоление), однако ряд
исследователей отмечают неустойчивость гидридных форм селена (Ермаков
В.В., 2001)
По мнению некоторых авторов при термической обработке биологических
субстратов теряется 20 – 60 % йода (Покровский А.А., 1981), при «мокром»
окислении ошибочное возмещение достигает 750%. (Vanhoe H, 1993 )
Использование таких современных методов как атомно-абсорбционный
анализ (ААА) с пламенной или электротермической атомизацией элементов,
масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой (МС-ИСП) и атомноэмиссионная спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой (АЭС-ИСП)
так же требует достижения постоянной массы образцов перед применением
метода. Чаще всего применяется подсушивание биологических объектов до
постоянной массы при 85оС ( Alvarez M, 1990 ) или 100оС (Andrasi E., 2007) в
течение суток или озоление при 500 оС (Пашкова В.Г., 2010). Возможные
потери йода при озолении были указаны выше.
Количественный рентгеновский микроанализ (РМА) относится к наиболее
точным современным методам микроанализа, и, в отличие от химических и
физических методов позволяет определять концентрацию микроэлементов
без разрушения тканей, однако пробоподготовка заключается в удалении или
иммобилизации воды, так как определение квантов характеристического
рентгеновского излучения проводится в глубоком вакууме (Goldstein J.,
2003).
Аналогичный
недеструктивный
метод
ренгенфлюоресцентного
анализа, не требующий обезвоживания объектов, к сожалению, обладает на
185
порядок
меньшей
чувствительностью
(определение микроэлементного
состава проводится в низком вакууме).
Широко
применяется
химическое
обезвоживание
(пропускание
фиксированных тканей через несколько смен этилового или метилового
спирта или ацетона), сушка в критической точке (для двуокиси углерода –
304К), замораживание образцов, лиофильная сушка (сублимация льда из
клеток и тканей в вакууме).
Перечисленные
виды
пробоподготовки
дискутабельны:
химическое
обезвоживание образца приводит к потерям йода в связи с его способностью
растворяться в органических растворителях, в том числе, в спиртах и
альдегидах
(Rognoni
J.,1974).Замораживание
образца
(обычно
при
температуре жидкого азота) приводит к повреждением его структуры
кристаллами льда. При лиофильной сушке проводится замещение воды
проникающими
криопротектантами,
такими
как
глицерин
или
диметилсульфоксил, которые остаются в тканях после сушки и могут
повлиять на точность измерений. (Гоулдстейн Дж.,1984).
В
лаборатории
электронной
микроскопии
Южно–Уральского
государственного университета (зав. – профессор Михайлов Г.Г.) был
разработан
новый
способ
пробоподготовки
биосубстратов
для
рентгенспектрального анализа (Басалаева Н. с соавт.,2009).
В основу изобретения была положена техническая задача – уменьшить
потери йода в образцах при их предварительной подготовке к исследованию.
Фиксацию образца осуществляли замораживанием при температуре – 18–
20ºС. Образцы толщиной 1–2 мм весом до 20 мг подсушивали при
температуре 100ºС в течение 45 мин. Затем образец помещали в камеру
напылителя, в которой создавался вакуум. При 3 Pa на поверхность образца
ионным напылением наносили платину толщиной слоя до 1 микрона. Таким
186
образом, пробоподготовка объектов состояла из комбинации вакуумной и
термальной сушки.
Предложенная пробоподготовка исключала как разрушение исследуемой
ткани, сопутствующее «сухому» и «мокрому» озолению, так и возможные
потери йода, характерные для замораживания образцов и контакта их с
агрессивными растворами.
Дальнейшие исследования на базе центра «Нанотехнологии» Южно–
Уральского государственного университета (зав. – докт. хим. наук Авдин
В.В.) подтвердили оптимальность вышеописанной пробоподготовки. Более
того, было выявлено, что увеличение времени термального подсушивания (с
45 до 90 минут) приводит к потере йода биологическими субстратами.
Разработанная пробоподготовка биологических образцов была оформлена
в виде патента на метод исследования «Метод определения содержания йода
в биосубстратах организмов», RU Patent 2366952 (Басалаева Н.Л.,с соавт.,
2009).
Право
патентообладания
было
передано
Южно-Уральскому
государственному университету.
Определение содержания йода и селена в эндокринных органах крыс с
помощью количественного рентгенспектрального микроанализа
Рентгенспектральный метод анализа для исследования органов крыс
применялся
редко.
Robinson
WL,
Davis
D.
(1969)
использовали
рентгенспектральный (энергодисперсионный) анализ для исследования
распределения йода в фолликулах крыс. Однако, как указывалось в обзоре
литературы, энергодисперсионный анализ на порядок менее чувствителен,
чем волновой дисперсионный, и, следовательно, не мог применяться к
исследованию содержания йода в эктратиреоидных органах.
Так как данные литературы по изучаемому вопросу были незначительны,
то нами были определены нормативы содержания йода и селена в
эндокринных органах крыс с помощью PMA (ВДС – метод точек).
187
Результаты исследований в основном соответствовали литературным
источникам: максимальный уровень йода был определен в йод-позитивных
точках щитовидной железы. Тот факт, что йод распределялся в структурах
щитовидной железы
неравномерно
–
так же соответствовал ранее
полученным данным (Robinson WL, Davis D., 1969).
Было установлено, что в большинстве эндокринных органов крыс
(исключая щитовидную железу и семенники) уровень йода в йод позитивных точках одинаков и может быть определен как «базисный
уровень». Интересным явилось достоверное превышение «базисного уровня»
йода в ЙПТ семенников.
Использование метода точек позволило определить не только уровень йода
в йод-позитивных точках эндокринных органов крыс, но и установить, что
йод в экстратиреоидных органах распределяется неравномерно, как и в
щитовидной железе. Во всех экстратиреоидных эндокринных органах были
выявлены точки, в которых йод не определялся (возможно, содержание йода
в этих структурах находилось за пределами обнаружения спектрометра). Эти
структуры были определены как йод-негативные точки. Процент йодпозитивных точек (от числа всех определений йода в образце) варьировал от
100% в щитовидной железе до 37% в поджелудочной железе. Структуры
мозга (гипофиз и гипоталамус) содержали примерно 60% ЙПТ, яичник и
семенник – около 40 50%.
По литературным данным (Bates J., 2000) содержания селена в тканях у
крыс следующее: в гипофизе – 1,7мкг/г сухой ткани; в семенниках – 1,3; в
яичниках и щитовидной железе – 0,8; в мозге и матке – 0,5. Некоторые
авторы не находили различий в содержании селена в гипофизе и щитовидной
железе (Chanoine J, 1993; Thorlacius-Ussing O, 1988).
По результатам проведенного нами исследования уровень селена в селенпозитивных
точках
был
одинаков
во
всех
эндокринных
органах.
Варьировал процент селен-позитивных точек: от 80% в поджелудочной
188
железе и семенниках до 50% в яичниках. Приблизительно 60% селенпозитивных точек содержалось в щитовидной железе и структурах мозга гипоталамусе и гипофизе.
Таким образом, при исследовании содержания йода в различных
эндокринных органах методом PMA (анализ точек) было выявлено, что в
зависимости от вида органа изменялся как уровень йода в йод-позитивных
точках, так и процент йод-позитивных точек. Уровень йода в ЙПТ
большинства экстратиреоидных эндокринных органов был охарактеризован
как «базисный уровень».
При аналогичном исследовании селена было установлено, что в различных
органах изменялся только процент селен-позитивных точек. Интересно, что в
органах с минимальным процентом йод-позитивных точек наблюдался
максимальный процент селен-позитивных точек (testis, pancreas).
Количественный рентгенспектральный микроанализ содержания йода в
щитовидных железах, гипофизах и яичниках женщин и самок - крыс
Большинство
экспериментальных
исследований,
посвященных
тиреоидной и репродуктивной системам было выполнено с использованием
крыс (Pedraza P, 2006).
Когда результаты исследования на животных экстраполируются на
человека, важно учитывать, что сроки периодов жизнедеятельности (включая
внутриутробный)
среди
млекопитающих
представляет
существенные
различия, даже если наблюдается одинаковая последовательность этапов
развития (Fisher, D.1988, Holt, A.,1981, Morreale de Escobar G. 1983).
Например, у человека и грызунов рост мозга происходит после рождения, но
крысы и мыши рождаются с менее развитой тиреоидной системой, чем люди.
По мнению J. Legrand (1984), "новорожденную крысу можно сравнить с
человеческим плодом во втором триместре беременности, а новорожденного
человеческого ребенка – с 6 – 10 дневной крысой".
189
Возможно, что различия в этапности развития органов и систем
отражаются и на состоянии взрослых млекопитающих и людей, что
затрудняет экстраполяцию научных данных – так, демонстрация эффекта
Вольфа-Чайкова (неорганический йод в плазме крови, в дозировке, 5 –
кратно превышающей уровень общего йода в щитовидной железе крысы,
временно ингибирует транспорт йодида и образование йодтирозинов в
щитовидной железе ) у человека остается предположительной (Wolff J.,1969).
В последние годы вновь начал дискутироваться вопрос о возможности
экстраполирования на человека данных, полученных при исследованиях на
крысах – выраженность некоторых эффектов у человека и крыс не были
адекватны. Например, реакция на биологически обоснованные дозы
перхлората у людей и крыс была различной. ( Fisher J. 2012).
В нашем исследовании использование РМА позволило определить, что у
женщин позднего репродуктивного возраста уровень йода в йод-позитивных
точках щитовидной железы и яичников в 2 раза превышает соответственный
показатель полугодовалых самок – крыс (причем как по йод – позитивным
точкам, так и по общему числу определений). В гипофизе у женщин уровень
йода в ЙПТ по общему числу точек превышал показатели самок – крыс в 4
раза, по уровню йода в ЙПТ – в 3 раза.
Таким образом, по результатам проведенного исследования выявлено:
- видовая пропорция содержания йода 2:1 у женщин и самок – крыс
характерна не только для щитовидной железы, но и для экстратиреоидных
органов (гипофиз, яичники)
- содержание йода в гипофизах у самок – крыс и женщин видозависимо и
различается 4 – х кратно, в щитовидных железах и яичниках –2-х кратно. Так
же было установлено, что содержание йода в гипофизе в зависимости от вида
находится в различных соотношениях с щитовидной железой и яичниками.
Сравнение уровня йода по всем точкам в оси щитовидная железа – гипофиз –
190
яичники составило у самок – крыс 11,9:1:1,2; у женщин – 6,3:1:0,6.
Соотношение уровня йода в йод – позитивных точках аналогично составило
у самок – крыс 7,7:1:1,4, у женщин – 5,1:1:0,9.
Интересно, что доза йодида калия, рекомендуемая ВОЗ для блокады
щитовидной железы при угрозе радиоактивного заражения – 130 мг (160
мкг/100г при среднем весе человека 80 кг), так же превышает дозу йодида
калия, вызывающую эффект Вольфа-Чайкова у крыс (в 6 раз).
Возможно,
воздействию
при
исследованиях
йода
на
в
тиреоидную
эндокринологии,
и
посвященных
репродуктивную
системы,
экстраполяцию «крыса – человек» предпочтительно проводить с учетом
соотношения йода в исследуемых органах.
Физиологические механизмы влияния йод-индуцированной блокады
щитовидной
железы
на
гипофизарно-тиреоидную
и
гипофзарно-
гонадную системы самок-крыс
Основное применение йодида калия в настоящее время — это защита
щитовидной железы от радиоактивного йода, попадающего в окружающую
среду при авариях на ядерных реакторах. Поскольку поглощение йода
щитовидной железой обратно пропорционально уровню йодида в сыворотке,
йодид в дозе 30—100 мг/сут позволяет значительно снизить поступление
радиоактивного йода в щитовидную железу.
После Чернобыльской катастрофы в 1986 г. примерно 10 млн детей и
взрослых в Польше получали йодид, чтобы защитить щитовидную железу от
радиоактивного йода, содержавшегося в воздухе и молочных продуктах,
полученных от коров, которые ели загрязненную траву (Naumann J, Wolff J,
1993). По мнению экспертов, это помогло снизить заболеваемость раком
щитовидной железы, заметно выросшую среди детей, проживавших в
окрестностях Чернобыля.
191
Общеизвестно, что конечные эффекты влияния йода на щитовидную
железу характеризуются парадоксальной зависимостью от его дозы. Ее
механизм действия все еще остается неопределенным (Duntas LH. 2008).
При недостаточном поступлении йода в организм наблюдается развитие
гипотиреоидного зоба, при поступлении адекватных доз сохраняется
эутиреоидное
состояние,
при
избыточном
поступлении
проявляется
антитиреоидное действие (секреция гормонов угнетается). Однако в
последнем случае уже в течение пятидесяти лет нет полной ясности –
повышенные дозы йодидов могут индуцировать и гипертиреоз (Braverman
LE, 1991). По мнению исследователей, гипо- или гипертиреоидная реакция
на
повышенные
дозы
йодидов
обусловлена
исходным
состоянием
щитовидной железы (при скрытом аутоиммунном тиреоидите возникает
гипертиреоз).
Дозы йода, вызывающие фармакологический отклик щитовидной железы,
выходящий за пределы компенсации, обычно превышают 1-6 мг в сутки у
человека (при расчете на 80 кг веса человека в среднем дозы бы составили
1,25 мкг и 7,25 мкг/100г.в.ж. при исследовании в эксперименте). Начиная с
этих доз йод оказывает многостороннее действие на синтетические функции
и морфологию щитовидной железы.
Йодид в высоких концентрациях влияет практически на все этапы
метаболизма йода в щитовидной железе (Roti E.,Vagenakis G., 2000). Йодид
подавляет синтез йодтирозинов и йодтиронинов (феномен Вольфа—
Чайкова). Механизмы, лежащие в основе феномена Вольфа—Чайкова, до
конца не известны. Эффект длится около 2 - 5 суток (по мнению различных
авторов), после чего исчезает (феномен ребаунд-эффекта).
Было предложено множество версий ребаунд-эффекта.
На сегодняшний
день наиболее вероятным считается, что основную роль играет снижение
активности натрий – йодного симпортера, возможно, за счет подавления
котранспорта Na+-I~. (Marcou К. et al., 2001). Предполагается, что этот
192
эффект обусловлен снижением экспрессии гена, кодирующего переносчик
Na+-I~ (Eng et al., 1999). Вполне вероятно, что важную роль играют
образующиеся в тироцитах йодорганические соединения (Pisarev М., Gartner
R.. 2000).
Как уже говорилось в главе 3., аналогом для нашего исследования
послужили эксперименты Wolff J, Chaikoff IL, (1948) . Авторы определили,
что органический экстратиреоидальный йод снижается при дозе йодида
калия, приблизительно в 5 раз превышающей количество йода в щитовидной
железе крыс (25 мкг/100 г в.ж.).
Аналогично
приведенной
схеме,
доза
йода,
соответствующая
определенному нами «базисному уровню» йода в йод – позитивных точках
большинства эндокринных органов крыс была определена как - 0,6 мкг/100 г
в.ж..
Для экспериментального исследования нами были выбраны следующие
дозы йодида калия:
- 1 мкг KI/100г в.ж. (как соответствующая «базисному уровню» йода в йодпозитивных точках большинства экстратиреоидных эндокринных органов
крыс). Как указывалось выше, эта доза и являлась дозировкой, с которой
начинал проявляться фармакологический эффект йодидов.
- 4 мкг KI/100 г в.ж. (доза примерно в 5 раз превышающая «базисный
уровень», приблизительно соответствующая уровню йода в щитовидной
железе крысы)
- 8 мкг KI/100 г в.ж. (доза, в 2 раза превышающая уровень йода в щитовидной
железе крысы, аналогичная уровню йода в щитовидной железе человека)
- 25 мкг KI/100 г в.ж. (доза, в 5 раз превышающая уровень йода в
щитовидной железе) – дозировка, при которой проявляется феномен Вольфа
– Чайкова) (Basalaeva N.L., 2011,1)
193
Физиологические механизмы влияния йодида калия на гипофизарно–
тиреоидную и гипофизарно–гонадную системы самок – крыс при
однократном введении в дозировке 4 мкг /100 г массы животного
Подавляющее влияние йодида калия на уровень ТТГ было описано
многократно (Turakulov I.K., 1978). По результатам проведенного нами
исследования так же было выявлено, что у крыс однократное применение
йодида калия в дозировке 4 мкг /100 г в.ж. провоцировало краткосрочную
(до 120 часов) легкую гиперфункцию гипофизарно – тиреоидной системы
(снижение ТТГ, рост оТ3); причем реакция гипофиза на нагрузку йодом
более длительная (до 120 часов после введения препарата), чем у
щитовидной железы (до 48 часов после применения йодида калия). Следует
отметить,
что
результаты
термометрии
подтвердили
исследование
гормонального статуса – изменений ректальной температуры после
воздействия 4 мкг/100г йодида калия зарегистрировано не было.
Интересным явилось выявленное нами подавляющее влияние калия
йодида в дозировке 4 мкг /100 г в.ж на репродуктивную систему крыс,
которое было так же краткосрочно и не превышало длительность одного
эстрального
цикла.
Было
отмечено,
что
уровень
гипофизарных
гонадотропинов восстанавливался быстрее, чем концентрация гормонов,
продуцируемых яичниками.
Общепризнано, что гипотиреоз связан с нарушениями менструального
цикла (ановуляцией) (Poppe K., 2007). Однако результаты исследования
влияния антитиреоидных препаратов на репродуктивную функцию были
разноречивы – имелись данные как о наличии негативного воздействия
(Hapon MB. 2003), так и о безопасности антитиреоидной терапии (ArmadaDias L. 2001, Hapon MB. 2010). По нашим данным, даже однократное
применение йодида калия в малой фармацевтической дозе оказывало
влияние на репродуктивную сферу. Однако
это
воздействие было
краткосрочным.
194
Исследование выраженности каспазозависимого апоптоза в щитовидных
железах, гипофизах и яичниках крыс при воздействии йодида калия в
дозировке 4 мкг/100г.в.ж. так же показало неожиданные результаты.
Несмотря на то, что в литературе имеются данные о влиянии йодидов на
активность апоптоза в различных тканях, некоторые детали о механизме
этого эффекта еще до конца не изучены .
По мнению одних авторов (Boechat LHB et al., 2002) йодиды влияют как на
митохондриальный,
так
и
на
каспазозависимый
пути
апоптоза
(
исследовались щитовидные железы мышей (Fas-L и Bcl-w) после введения 20
мкг йодида калия на одно животное в течение 4 дней на фоне
индуцированного метимазолом тиреоидита). Другие авторы (Shrivastava А. et
al.,
2006)
предполагают,
что
молекулярный
йод
влияет
лишь
на
молекулярный путь апоптоза. Однако последние исследования проводились
на культуре рака молочной железы.
Результаты
нашего
эксперимента
показали,
что
ответ
гипофиза,
щитовидной железы и яичников на однократное применение относительно
низкой дозы неорганического йода являлся не только каспазо-зависимым, но
и органоспецифичным.
Йодид калия достоверно индуцировал рост экспрессии эффекторной
каспазы 3 в клетках гипофизов и яичников у животных через 48 и 120 часов
после однократного введения йодида калия и инициаторной каспазы 8 – в
яичниках крыс через 120 часов. В щитовидной железе при воздействии
вышеназванной дозы йодида было выявлено снижение активности процессов
апоптоза к 5 – м суткам после введения йодида калия. Следует также
отметить что в яичниках, в отличие от гипофиза, активизировался и
митохондриальный путь апоптоза.
Сравнивая данные разных источников, можно было предположить, что
реакция отдельных органов на йодиды может быть также дозозависима.
Например, Bоechat LHB et al.(2002) наблюдали активацию апоптоза в
195
щитовидной железе при использовании дозы неорганического йода в 100 раз
превышающую дозировку нашего эксперимента.
Вполне вероятным было предположить, что каспазный путь апоптоза
превалирует в нормальных тканях, так как Shrivastava А. et al. (2006) доказал
митохондриальный путь для малигнизированных тканей молочной железы.
Возможно, что характеристики процессов апоптоза зависели и от
химической природы йода, поскольку митохондриальный путь апоптоза
преимущественно наблюдался после молекулярного йода, в то время как
неорганический
йодид
приводил
к
комбинации
каспазного
и
митохондриального путей. Liu C. at al. (2010) исследовали эффект
молекулярного йода на апоптоз на трех различных подтипах клеток рака
щитовидной железы и отметили, что апоптоз, индуцированный йодом, был
митохондриально-опосредован.
Результаты исследования каспазозависимого апоптоза в тканях самок –
крыс после йодида калия в дозировке 4 мкг/100 г были опубликованы в 2010
году.
В
последние
годы
появились
исследования
(Silva
J., 2013)
подтверждающие влияние дисфункции щитовидной железы на выраженность
апоптоза в желтом теле яичников самок-крыс в эксперименте. По данным
авторов, гипотиреоз снижал, а гипертиреоз – повышал активность апоптоза в
клетках
желтых
тел
яичников
(использовался
метод
TUNEL,
характеризующий выраженность фрагментации ДНК, без характеристики
пути активации апоптоза).
Физиологические механизмы влияния йодида калия на гипофизарно–
тиреоидную и гипофизарно–гонадную системы самок – крыс при
однократном введении в различных дозировках
В 1968 году была описана особенность однократного применения
антитиреоидных препаратов (Langer P.) – выраженность и длительность
196
реакции щитовидной железы не зависели от дозы и химической природы
препарата.
По результатам проведенного нами исследования функциональной
активности гипоталамо-гипофизарной и гипоталамо-гонадной систем можно
было предположить, что для воздействия йода в малых фармацевтических
дозах данная особенность (реакция на введение йодида, не зависящая от
дозы) была характерна только для уровня гипофизарных гормонов в крови.
При эксперименте с различными дозами йодида калия изменения
функциональной активности щитовидной железы были расценены как
гипофизарный гипотиреоз (уровень ТТГ снизился начиная с дозы 1 мкг/100г
и не менялся в зависимости от дозы йодида калия). Вариабельность
тиреоидных гормонов отличалась разнообразием – уровень
оТ3
не
изменился даже при 25 мкг/100г, а уровень сТ4 , наоборот, уменьшился
начиная с дозировки 1 мкг/100г и достоверно на менялся при нарастании
дозы в 8 раз, продолжив снижение только при 25 мкг/100г.
При первом этапе эксперимента (исследование воздействия 4 мкгKI/100г)
реакция щитовидной железы была расценена как гипертиреоз (снижению
ТТГ соответствовало повышение оТ3 и снижение сТ4).
Таким образом, однозначно по результатам двух этапов экспериментов
(при 4 мкг/100г и при различных дозах йодида калия) на нагрузку йодом
реагировал только уровень тиреоторпного гормона, который снижался при
всех дозировках.
Динамика
физикальных
параметров
(ректальная
термометрия)
соответствовала изменениям гормонального статуса : через 48 часов после
введения йодида калия не было зарегистрировано изменений ректальной
температуры ( в том числе и после дозы 25 мкг/100 г).
197
Похожая ситуация (однозначно на нагрузку йодом реагировали
гипофизарные гонадотропины и дифференцировано – периферические
гормоны) наблюдалась и при исследовании гормонов гипофизарно-гонадной
системы – реакция гипофизарных гонадотропинов и эстрадиола началась с
дозы 1 мкг/100 г, приближаясь к показателям персистирующего эструса, и не
зависела от нарастания дозы йодида калия. Прогестерон же достоверно
снизился при дозах 4 и 8 мкг/100г и не отреагировал на дозы 1 и 25 мкг/100
г. Эстрадиол не изменялся при всех дозах йодида калия.
Таким образом, по результатам двух этапов проведенного исследования
можно было предположить, что на введение различных дозировок йодида
калия отвечали снижением функции гормоны гипофиза – ТТГ, ФСГ и ЛГ,
причем реакция их не зависела от дозы KI.
Изменения
гормонов
периферических
эндокринных
органов
(щитовидной железы и яичников) были более сложные – одни гормоны не
реагировали на введение йодида (оТ3), другие – снижались при всех дозах
йодида калия и глубина их снижения не зависела от дозы (эстрадиол), у
третьих – наблюдалось «плато» снижения уровня при нарастании дозы (сТ4 и
прогестерон), однако при дозе 25мкг/100 г вышеназванные гормоны вели
себя различно – сТ4
продолжил снижение, прогестерон – поднялся к
показателям контрольной группы.
Исследование экспрессии гипофизарных гормонов в тканях гипофиза
после воздействия йодида калия в различных дозировках дало новые
интересные данные.
Особое внимание обращал на себя тот факт, что
экспрессия гипофизарных гормонов в гипофизе начинала реагировать при
дозах йодида калия, превышавших «базисный уровень йода». При 1 мкг/100г
KI изменения уровня гипофизарных гормонов в крови не сопровождались
изменением экспрессии гормонов в гипофизе. На повышение дозы йодида
калия экспрессии ТТГ и гипофизарных гонадотропинов реагировали
дозозависимо: при 4 мкг/100г – изменились синхронно экспрессии всех
198
гипофизарных гормонов; при 8 мкг/100 – только экспрессия ТТГ, при 25
мкг/100 г – экспрессия ТТГ и ФСГ.
Таким
исследования
образом,
было
при
анализе
определено,
результатов
что
проведенного
функциональная
нами
активность
экстратиреоидных органов (гипофиза и яичников), как и функциональная
активность щитовидной железы, изменялись при малых фармакологических
дозах йодида калия. Выраженность этих изменений была дозозависима
внутри изучаемого диапазона доз: минимальное влияние (без изменения
экспрессии гипофизарных гормонов в гипофизе) наблюдалось при 1
мкгKI/100г; выраженное влияние (с изменением экспрессии гипофизарных
гормонов в тканях гипофизов) на гипофизарно-гонадную систему оказывала
доза 4 мкг/100г, на гипофизарно-тиреоидную – 8 и 25 мкг/100г.
Новые нюансы воздействия йодидов на щитовидную железу, гипофиз и
яичники позволило осветить сочетанное исследование содержания йода в
органах
с
помощью
РМА
и
иммуногистохимическом
определении
экспрессии НИС.
Широко известен следующий факт – накопление йода в щитовидной
железе
происходит
при
малых
фармакологических
дозах
йодидов,
подавление накопления – большими фармакологическими дозами. В нашем
эксперименте накопление йода щитовидной железой происходило только
при дозе йодида калия, не превышающей «базисный уровень» (1 мкг/100г), в
соответствии с литературными данными (Escobar G.,1968). Подавление
аккумуляции йода щитовидной железой наблюдалось при превышении
вышеназванной концентрации йодида.
Следует отметить, что накопление йода щитовидной железой после 1
мкгKI/100г не сопровождалось изменениями экспрессии НИС в щитовидной
железе и гипофизе. При этой дозировке не снижалась экспрессия ТТГ и не
повышалась экспрессия ФСГ и ЛГ в гипофизе. Йодид калия в дозе 1 мкг/100
199
г в.ж. не вызывал аккумуляцию йода в ЙПТ гипофиза. Все эти изменения
наблюдались в разной степени выраженности при воздействии доз йодида
калия, превышающих «базисный уровень».
Таким
образом,
ориентация
доз
йодида
на
внутриорганную
концентрацию йода, возможно, позволила бы обосновать и уточнить понятия
«малых» и «больших» фармакологических доз.
Четкой классификации
«больших» и «малых» доз йодидов нет до сих пор. Диапазон «малых» доз
иодидов простирается до 225 мкг/100г (Marković L.,2010). Следует отметить,
что дозы, при которых в нашем эксперименте подавлялась аккумуляция йода
в щитовидных железах, традиционно относились к «малым дозам» йодидов
(Duntas LH., 2008). Однако при нашем исследовании было определено, что в
диапазоне 1 - 25 мкг/100 г наблюдались принципиальные различия в реакции
гипофизарно - тиреоидной системы:
- при дозе йодида калия, соответствующей «базисному уровню», йод
накапливался только в щитовидной железе.
- при диапазоне 5 – 10 кратно превышающем «базисный уровень»
наблюдалось накопление йода в ЙПТ гипофиза и снижение аккумуляции
йода щитовидной железой. Таким образом, этот диапазон «малых
фармакологических доз» йодида калия обладал свойствами «больших
фармакологических доз». Следует отметить, что дозировка йодида калия 4 –
8 мкг /100 г в несколько раз ниже дозировки калия йодида, общепринятой
для блокады щитовидной железы при угрозе радиоактивного заражения.
- при дальнейшем нарастании дозировки йодида калия в гипофизе не
было выявлено аккумуляции йода, в щитовидной железе йод снижался.
Таким образом, эффект подавления аккумуляции йодидов щитовидной
железой наблюдался при дозах, традиционно относимых к «малым».
200
Следует также отметить, что доза 4 мкг/100г, с которой начиналось
подавление накопления йода в щитовидной железе,
была выбрана как
аналогичная 5 – кратному превышению «базисного уровня», то есть 5 –
кратно превышающая уровень йода в ЙПТ гипофиза и соответствующая
уровню йода в щитовидной железе.
Следовательно, можно было
предположить, что реакция гипофиза и щитовидной железы начиналась при
достижении определенной пропорции между уровнем неорганического йода
в крови и уровнем йода в ЙПТ гипофиза и щитовидной железы.
Дополнительным обоснованием предложенной дифференцировки доз
может служить тот факт, что экспрессии гипофизарных гормонов
реагировали на дозы йодида калия, превышающие 1 мкг/100г.
Изменения экспрессии НИС в щитовидной железе и гипофизе при
воздействии различных доз иодида калия так были дозозависимы.
Интересно, что накопление йода щитовидной железой при 1 мкг/100г не
сопровождалось изменением экспрессии тиреоидного НИС. Этот показатель
изменился (снизился) при увеличении дозы йодида калия свыше «базисного
уровня», когда щитовидная железа йод не накапливала.
В отличие от
щитовидной железы, аккумуляция йода в ЙПТ гипофиза при 4 и 8 мкг KI/100
г сопровождалась ростом экспрессии НИС в гипофизе.
Так же заслуживал самого пристального внимания тот факт, что
увеличение экспрессии НИС в гипофизах самок - крыс после введения
неорганического йодида начиналось с дозы 4 мкг/100г, в то время как в
щитовидной
железе
–
с
8
мкг/100г. Следовательно,
можно
было
предположить, что гипофиз оказался более чувствительным к воздействию
йодида калия, чем щитовидная железа.
Следует подчеркнуть, что реакция гипофиза на йодид калия отличалась
от реакции другого экстратиреоидного органа - яичника.
Исходя из того факта, что в контрольной группе крыс уровень
экспрессии НИС в яичниках в 2 раза превышал показатель в гипофизах, хотя
201
ЙПТ яичников содержали равное с гипофизами количество йода, мы
ожидали боле активную реакцию яичников на введение йода.
Однако в яичниках
рост экспрессии НИС отмечался только при 8
мкг/100г, без достоверного роста уровня йода в ЙПТ яичников.
Было так же выявлено, что яичники обладают как общими с гипофизом
особенностями реакции на йодную нагрузку, так и индивидуальными.
Экспрессия НИС у яичников, как и у гипофизов, не реагировала на дозу
йодида, соответствующую их собственному внутриорганному содержанию
йода (1 мкг/ 100 г в.ж.). При превышении этого порога (4 мкг/100г)
повышалась экспрессия НИС в гипофизе, в яичнике показатель не отличался
от контрольного. Синхронный рост экспрессии НИС у яичников и гипофизов
наблюдались при дозах 8 мкг100 г в.ж.. Но при 25 мкг/100г в.ж. экспрессия
НИС в яичнике не отличалась от контрольных показателей, в гипофизе была увеличена.
Следует отметить, что если росту экспрессии НИС в гипофизе
соответствовал рост уровня йода в ЙПТ гипофиза, то в яичниках такой
взаимосвязи выявлено не было – достоверный рост экспрессии НИС в
яичниках не сопровождался увеличением уровня йода в ЙПТ яичника.
В связи с вышеизложенным можно было заключить, что изменения
гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадной систем при воздействии
йодида калия в дозировках 1 – 25 мкг KI/100 г не только дозозависимы, но и
и органоспецифичны. Причем реакция экстратиреоидных органов (гипофиза
и яичника) различна по активности.
Дальнейшие исследования показали, что изменения в вышеназванных
системах при воздействии йодида калия связаны с каспазозависимым
апоптозом.
По
данным
литературы,
большие
дозы
йодидов
индуцируют
каспазонезависимый апоптоз в щитовидной железе (Vitale M, 2000).
202
По данным нашего исследования было подтверждено влияние йодидов на
каспазозависимый апоптоз в щитовидной железе. Однако было уточнено, что
в щитовидной железе активация апоптоза дозозависима и проявляется, когда
концентрация вводимого йодида начинает превышать уровень йода в ЙПТ
щитовидной железы (8 мкг/100г) и происходит на фоне снижения уровня
йода в щитовидной железе. При дальнейшем нарастании дозы йодида
достоверной активации каспазозависимого апоптоза в щитовидной железе
выявлено не было.
Исследование каспазозависимого апоптоза в гипофизе
выявило, что
экспрессия каспаз в тканях гипофиза изменяется активнее, чем в тканях
щитовидной железы и наблюдается при нарастании уровня йода в ЙПТ
гипофиза. Рост экспрессии каспаз в гипофизе был выявлен уже при
воздействии 1 мкг/100 г KI и увеличивался при 4 мкг/100г. Максимальный
рост экспрессии обеих каспаз в гипофизе наблюдался при 8 мкг KI/100г. При
дальнейшем нарастании дозы йодида калия активность апоптоза в тканях
гипофиза была менее выраженной, чем при 8 мкг/100г.
При сравнении динамики экспрессии ТТГ , каспаз и уровня йода в ЙПТ в
гипофизах исследуемых животных можно было утверждать, что экспрессия
ТТГ в гипофизе снижалась сочетано с ростом экспрессии гипофизарных
каспаз и повышением уровня йода в ЙПТ гипофиза. Этот эффект так же был
дозозависим и наблюдался в диапазоне 4 - 8 мкг/100г. При 25 мкг/100г такой
взаимосвязи уже не наблюдалось: несмотря на выросший уровень экспрессии
НИС в гипофизе и щитовидной железе, йод в ЙПТ гипофиза и щитовидной
железы не накапливался, а выраженность экспрессии каспаз в органах не
достигала уровня показателей при 8 мкг/100г.
В яичнике этот эффект не был обнаружен. Увеличение экспрессии
яичникового НИС было синхронным с ростом экспрессии каспаз при только
при 8 мкг/100г. Однако эти изменения не сопровождались ростом уровня
йода в ЙПТ яичников и изменением экспрессии ФСГ и ЛГ в гипофизе.
203
Экспрессия гипофизарных гонадотропинов синхронно изменялась при 4
мкг/100г, без реакции экспрессии НИС и каспаз.
Многочисленные исследования посвящены изучению процессов апоптоза
в гипофизе, но основною целью этих исследований было выявление
факторов, влияющих на аденому гипофиза ( Nakabayashi H,2001). Было
установлено, что многие химические агенты и физические факторы могут
служить триггерами апоптоза: неорганические вещества - кадмий (Poliandri
A, 2003); органические соединения - глютамат ( C. Caruso, 2004),
анакардиновая кислота
(Sukumari-Ramesh S,2011), куркумин ( Christian
Schaaf,2010) ; гормоны – половые стероиды (Zaldivar V, 2011; Jaita G, 2011),
медикаментозные аналоги гормонов -дексамеиазон (L. A. Nolan, 2002; 2004) ,
бромкриптин ( Drewett N, 1993 ), соматостатин ( Cerman J., 2003) . Было
уделено внимание факторам, влияющим на апоптоз в тканях аденомы, но не
воздействующим на нормальную ткань гипофиза - ингибиторам протеасом (
R Yu, 2002). Было выявлено, что полипептиды гипофиза воздействуют на
апоптоз в экстратиреоидных тканях ( Seaborn T,2011)
Таким
образом,
апоптические
процессы
в
гипофизе
активно
рассматривались с позиции патологии, а не физиологии.
Понимание деталей процессов регуляции каспаз тесно связано с
возможностью рационально манипулировать апоптозом с целью получения
терапевтических выгод.
В последнее время роль йодида в экстратиреоидных тканях неоднократно
и широко обсуждалась (Cann S. A., et al.. .1999; Cann S. A., et al. 2006 года).
Йодид не может органифицироваться в экстратиреоидных тканях, однако
есть некоторые исключения из этого правила. Так, выраженный рост
экспрессии NIS был найден в слюнных железах, околоушных железах,
подчелюстных железах, гипофизе, поджелудочной железе, семенниках,
молочной железе, слизистой оболочке желудка, предстательной железе,
яичниках, надпочечниках, сердце, тимусе и легких (Spitzweg E.T. et al.,1998).
204
Предположительно, органифицированный йод в экстратиреоидных тканях
может выполнять множество функций, таких как антимикробная защита
поверхности ткани, например, слизистой желудочно-кишечного тракта,
роговицы или кожи (Majerus P., Courtois P.,1992): обеспечение йодом
новорожденных (в молочной железе) (Rillema J., Rowady D.,1997) и
репродуктивная функция (в матке, яйцеводах) (Brown-Grant K, Rogers
A.,.1972).
Кроме того, формирование определенных йодопротеинов (например
iйодолактонов, йодоальдегидов) (Dugrillon A, 1996) как в щитовидной
железе, так и в экстратиреоидных тканях может дать антипролиферативный
и антиоксидантный эффект, влияя на целостность клеток, их пролиферацию
и онкогенез (Eskin BA, 1970; Kato N, et al., 1994).
Результаты нашего исследования дали возможность предположить, что
функция экстратиреоидного йода может быть расширена в связи с его
возможным влиянием на каспазозависимый апоптоз.
Было установлено, что в гипофизе экспрессия каспаз увеличивалась в
прямой зависимости от нарастания интраорганного йода. При 4 мкгKI/100г
начиналось нарастание йода в ЙПТ гипофиза и синхронный рост экспрессии
гипофизарных каспаз;
максимум йода в ЙПТ совпадал с максимумом
экспрессии обеих каспаз в гипофизе при 8 мкг/100г. Причем этот процесс
был связан со снижением функциональной активности гипофиза (снижение
экспрессии ТТГ и рост экспрессии ФСГ и ЛГ).
Следует
отметить,
что
процесс
накопления
экстратиреоидного
(гипофизарного) йода зависел от его внутритканевой концентрации –
накопление начиналось и заканчивалось при определенном соотношении
уровня неорганического йодида в крови и внутритканевого йода.
Вероятно, результаты этого исследования смогут помочь в объяснении
феномена, описанного P. Langer ( Langer P, 1968) - при однократном
применения антитиреоидных препаратов выраженность и длительность
205
возникающего гипотиреоза не зависели
от дозы и химической природы
препарата. Возможно, в нарушении функции
гипофизарно – тиреоидной
системы играет роль снижение или повышение уровня йода в крови
вследствие диеты или применения препаратов, влияющих на щитовидную
железу. Чувствительность гипофиза к колебаниям йода в крови и
обуславливает однотипную реакцию гипофизарно–тиреоидной системы на
различные препараты в различных дозировках. Вероятно, главную роль
играет не доза и химическая природа препарата, а уровень йода в крови, к
изменению которого приводит применение препарата.
Можно было предположить, что и процесс органификации йода в
щитовидной железе вторичен, и находится под влиянием команд гипофиза,
функциональная активность которого первична (начинает проявляться на
меньших дозах йодида калия) и через каспазный механизм напрямую зависит
от соотношения уровня йода в крови и внутриорганного йода.
Однако эта зависимость наблюдалась только при «физиологических»
концентрациях вводимых доз йодида калия. При дозе 25 мкг/100г (доза
эффекта Вольфа-Чайкова) показатели уровня йода в ЙПТ гипофиза не
отличались
от
контрольных
показателей,
а
уровень
экспрессии
гипофизарных каспаз были на уровне 1 и 4 мкг KI/100г. Таким образом,
блокада щитовидной железы при эффекте Вольфа-Чайкова, возможно,
происходит без регулирующего участия гипофиза. Вероятно, что гипофиз
реагировал на йодид только в диапазоне от 1 до 10 мкг/100г.
Одновременное изменение уровня йода в ЙПТ гипофиза и снижение
процента ЙПТ в гипофизе предположительно явилось компенсационным
механизмом для поддержания постоянного количества йода в гипофизе, в
отличие от щитовидной железы, количество йода в которой может
увеличиться.
206
Таким образом, по нашим наблюдениям, появилась возможность
предполагать, что возможно прямое влияние йода на функциональную
активность гипофиза, опосредованное через йод-позитивные точки гипофиза
путем каспазозависимого апоптоза. Синхронное и однонаправленное
изменение активности каспаз и экспрессии NIS позволяли предложить
определенную роль йода в регуляции апоптоза у упомянутых выше
эндокринных органов. Однако необходимы были дальнейшие исследования
для выяснения этих еще недостаточно выясненных функций.
Критическая доза йодида калия при
определена как 8 мкг/100г:
воздействии на гипофиз
была
при этой дозировке уровень йода в ЙПТ
гипофиза повышался в 3 раза, а уровень экспрессии каспаз – в 10 раз по
сравнению с контрольными показателями. Именно эта дозировка была
выбрана
для
исследования
влияния
йод-индуцированной
блокады
щитовидной железы на гипофизарно–тиреоидную и гипофизарно–гонадную
системы самок – крыс
Физиологические механизмы дозозависимости интегративной реакции
щитовидной железы, гипофиза и яичников с учетом динамики йода в йодпозитивных точках, выявленные в нашей работе, представлены в виде
нижеприведенной схемы (рисунок 43).
Рисунок 43. Физиологические механизмы дозозависимости интегративной
реакции щитовидной железы, гипофиза и яичников с учетом динамики йода в
йод-позитивных точках
207
Щитовидная
железа
Гипофиз
Яичники
1 мкг KI/100г в.ж
ТТГ
.
Т4
I
↓
↑
ЛГ
↓
Каспаза 3
↑
↑
4 мкг KI/100г в.ж
ТТГ,
Т4
ЛГ,эк.ЛГ
эк.ТТГ ↓
↓
ФСГ,
↑
эк.ФСГ
↑
НИС
Каспаза 3
↑
↑
Прогестер
он ↓
8 мкг KI/100г в.ж
Каспаза 3
НИС
Т4
I
I
↑
↑
↓
↓
↑
Эк.ЛГ
ТТГ,
↑
эк.ТТГ
НИС
Каспаза 3
↑
↑
Прогестер
он ↓
Каспаза 8
↑
↓
НИС
↑
25 мкг KI/100г в.ж
НИС
Т4
I
↑
↓
↓
ТТГ,
эк.ТТГ
↓
ЛГ
↑
Эк.ФСГ
↑
НИС
Каспаза 3
↑
↑
Каспаза 8
↑
208
Физиологические механизмы влияния йод-индуцированной блокады
щитовидной железы на гипофизарно–тиреоидную и гипофизарно–
гонадную системы самок – крыс
При первых двух этапах эксперимента с помощью количественного
рентгеноспектрального микроанализа было установлено, что гипофиз самок
– крыс накапливает йод через 48 часов после однократного воздействия
йодида калия в дозировках, соответственных диапазону содержания йода в
гипофизе ( «базальный уровень») и щитовидной железы крыс.
Накопление йода в гипофизе начиналось, когда доза KI соответствовала
уровню йода в йод – позитивных точках гипофиза, и достигало максимума
при дозе, соответствующей уровню йода в щитовидной железе (разница
между приведенными показателями у крыс была определена как 8 кратная).
При дальнейшем повышении дозы KI внутриорганный йод в гипофизе не
увеличивался и не отличался от контрольных показателей.
Так же было определено, что йодид калия в дозах, соответствующих
диапазону уровня йода от гипофиза до щитовидной железы, стимулирует
процессы каспазозависимого апоптоза в клетках гипофиза и яичников.
Причем в гипофизе и яичниках показатели активности апоптоза находятся в
прямой зависимости от уровня йода, а в щитовидной железе – в обратной..
Однако исследование гормонального статуса гипофизарно – тиреоидной
системы
при описанных выше экспериментах выявило, что реакция
щитовидной железы и гипофиза через 48 часов после однократного введения
KI – однотипна (гипофизарный гипотиреоз) как при дозах, соответствующих
диапазону содержания йода «базисный уровень – щитовидная железа», так и
в дозах, превышающих этот диапазон. Эта реакция гипофизарно –
тиреоидной системы несколько не совпадала по временному интервалу
развития гипотиреоза с описанным Р.Langer ( 1968) ребаунд – эффектом при
воздействии антитиреоидных препаратов (через 20 часов после введения
препарата развивался гипотиреоз, сменяющийся затем гипертиреозом в
209
течение 100 – 140 часов; длительность гипотиреоза и гипертиреоза при
ребаунд – эффекте не зависела от дозировки, длительности введения и
химической структуры препарата). В проведенных нами экспериментах был
уточнен характер гипотиреоза при воздействии йода калия – гипотиреоз был
гипофизарным, но он наблюдался и через 48 часов после введения препарата.
Закономерно встал вопрос уточнения взаимодействия гипофиза и
щитовидной железы при полном моделировании ребаунд – эффекта с
помощью калия йодида.
При йод-индуцированной блокаде после воздействии калия йодида в
дозировке 8 мкг/100 гр веса животного в течение 5 дней наблюдалось
снижение ТТГ, длившееся в течение недели. Длительность реакции
гипофизарно – тиреоидной системы соответствовала литературным данным:
еще в 1966 году был описан ребаунд – эффект при введении йодида калия
(кратковременный гипотиреоз, сменяющийся гипертиреозом, длящимся в
течение недели) (Hall R., 1966)
Изменения уровня ТТГ течение первых трех суток блокады щитовидной
железы не сопровождались какими- либо изменениями тиреоидных гормонов
(оТ3 и сТ4 в этот период не отличались от контрольных показателей) и,
следовательно снижение уровня ТТГ вряд ли могло быть вторичным.
Реакция
щитовидной
железы
(гипертиреоз)
присоединилась
к
гипофункции гипофиза только после четырехкратного введения йодида.
Сочетанная реакция гипофиза и щитовидной железы предшествовала
нормализации уровня ТТГ и тиреоидных гормонов при пятикратном
введении KI.
Исходя из динамики изменения гормонов
гипофизарно –тиреоидной
оси, можно было предположить, что первично на введение йодида калия
отреагировал гипофиз. Реакция щитовидной железы наступила лишь на 4 – е
сутки после начала введения препарата. Вероятно, присоединение реакции
210
щитовидной железы
к реакции гипофиза на продолжающееся введение
йодида и явилось триггером для
нормализации функции гипофизарно –
тиреоидной системы.
Многие ранние исследования предполагали, что йодиды влияют на
синтез ТТГ или его освобождения из гипофиза (DelConte E. 1955, McClendon
J., 1948). При исследовании уровня ТТГ в сыворотке крови и тканях
гипофиза тиреоидэктомированных крыс, получавших йодистый калий, было
выявлено, что йодид приводит к снижению концентрации ТТГ (Abbassi
V.,1967).
Существовали
и
другие
мнения,
основанные
на
исследовании
непосредственного введения йодида в гипофиз, не оказавшего влияние на
освобождение щитовидной железы от 131I в течение суток (Greer M., 1960).
По
данным
проведенного
нами
исследования
можно
было
предположить, что йодид калия влияет на уровень ТТГ, в соответствии с
данными E. DelConte ( 1955), J. McClendon (1948) и др. Но справедливо и
утверждение M. Greer (1960) о том, что введение KI не влияет на функцию
щитовидной железы в течение суток. По нашим данным, реакция
щитовидной железы отсутствовала в течение 3 –х суток от начала
инстилляций йодида калия.
Таким образом, результаты изучения взаимодействия гипофиза и
щитовидной железы при йод-индуцированной блокаде щитовидной железы
на гормональном уровне были неоднозначны и требовали дальнейших
исследований.
При первых двух этапах эксперимента было установлено, что йодид калия
при однократном применении вызывал краткосрочный, длительностью не
более одного эстрального цикла, персистирующий эструс у эутиреоидных
самок–крыс.
211
Йод-индуцированная БЩЖ так же сопровождалась персистирующим
эструсом: со второго дня БЩЖ в 3 раза снижался уровень прогестерона, с
третьего дня БЩЖ отмечался рост ФСГ и ЛГ, с четвертого дня в 3 раза
возрастал эстрадиол. После 3–х кратного введения йодида калия наблюдался
эффект «ускользания» гипофизарно– гонадной системы – на 5 день БЩЖ
уровень ЛГ снизился, а прогестерона – поднялся до контрольных
показателей. Однако последующее введение йодида вновь спровоцировало
подъем ЛГ и снижение прогестерона. ФСГ и эстрадиол оставались
монотонно высокими в течение 3–7 и 4–7 дней блокады соответственно.
При ребаунд–эффекте (7 день БЩЖ), в отличие от гипофизарно–
тиреоидной системы, полноценной скачкообразной нормализации йод –
индуцированного персистирующего эструса не наблюдалось: определялась
нормализация только одного гормона – снизился уровень ЛГ.
Возможно, нормализация эстрального цикла после БЩЖ требовала
более длительного временного периода, чем восстановление функции
тиреоидной системы.
Изменения
физиологических
параметров
–
региональной
компьютерной точечной термометрии подтвердили отсутствие реакции
гормонов щитовидной железы на БЩЖ после 8 мкгKI/100г.
Было отмечено возрастание влагалищной температуры на 2 и 3 дни
БЩЖ (на 1 и 1,5 оС). Но вышеназванный показатель, не достигнув уровня
контрольной группы (рост на 3оС на 5 и 6 дни наблюдений (проэструс и
эструс)) - снизился. На 5 и 6 дни наблюдений мезор температур групп
контроля и БЩЖ достигал 2 и 3 оС соответственно. Аналогично изменялась и
температура ушей.
Изменения вагинальной температуры при БЩЖ скорее могли быть
связаны с развитием у экспериментальных животных персистирующего
212
эструса ( на 2 день БЩЖ снизился прогестерон, на 3 день- поднялись ФСГ и
ЛГ)..
Таким образом, физиологические изменения у самок – крыс с йодиндуцированной
БЩЖ
при
дозе
соответствовали
результатам
йодида
калия
исследования
8
мкг/100г
гормонального
в.ж.
профиля
гопофизарно- тиреоидной и гипофизарно- гонадной систем.
Данные
исследований
репродуктивную
функцию
влияния
до
антитиреоидных
настоящего
времени
препаратов
на
противоречивы.
Возможно, ПЭ характерен именно для йод–индуцированной БЩЖ, так как
по
мнению
некоторых
исследователей
антитиреоидная
терапия
пропилтиоурацилом (ПТУ) не оказывала влияния на уровень гипофизарных
гонадотропинов, пролактина и яичниковых гормонов у крыс, изменяя лишь
выраженность физиологических колебаний гормонов в некоторых фазах
эстрального цикла (Hapon M.,2010).
Другие исследователи не находили изменений гормонов репродуктивной
сферы у крыс ни при воздействии антитиреоидных препаратов (ПТУ), ни при
введении L-тироксина (Armada-Dias L., 2001). Однако имеются данные и о
том, что ПТУ провоцировал у крыс нерегулярный эстральный цикл и
спонтанную псевдобеременность (Hapon M., 2003).
Возможно, столь различные результаты исследований обусловлены
отсутствием унифицированного подхода к оценке выраженности гипо– или
гиперфункции щитовидной железы. При нашем исследовании БЩЖ была
доказана непосредственным определением интратиреоидального йода, в то
время как изменения тиреоидных гормонов были незначительны и
кратковременны.
Таким образом, при исследовании гормонального статуса было
выявлено, что на блокаду щитовидной железа при дозировке йодида калия 8
мкг/100 г реагировала как гипофизарно-тиреоидная, так и гипофизарно213
гонадная системы. Реакция этих систем на йод-индуцированную БЩЖ имела
некоторые различия:
- изменения уровня гормонов гипофизарно–тиреоидной системы
начались с гипофизарного уровня (снижение ТТГ наблюдалось на второй
день
БЩЖ,
щитовидной
после
железы
однократного
введения
(кратковременный
ЙК),
реакция
однодневный
гормонов
гипертиреоз)
присоединилась к гипофункции гипофиза только после четырехкратного
введения йодида и нивелировалась при ребаунд–эффекте.
- изменения гормонов гипофизарно–гонадной системы, в отличие от
гипофизарно–тиреоидной, начались со снижения уровня прогестерона на 2
день БЩЖ (после однократного введения ЙК), гормоны гипофиза снизились
только на 3 день блокады, эстрадиол повысился на четвертый. Исходя из
изложенных данных, можно было бы предположить, что изменения ФСГ и
ЛГ при БЩЖ вторичны, однако единственным гормоном гипофизарно–
гонадной
системы,
нормализующимся
при
ребаунд–эффекте,
был
лютеинизирующий гормон.
Закономерно встал вопрос о точке приложения воздействия йодида калия
на репродуктивную систему – гипофиз или яичники?
При проведении первых двух этапов эксперимента в яичниках
исследовалась экспрессия НИС (как маркера присутствия йода в органах) и
экспрессия каспаз. Было выявлено, что однократное введение йодида калия
оказывает влияние на вышеназванные показатели. Соответственный подход
был
применен
для
яичников
и
при
исследовании
влияния
йод-
индуцированной БЩЖ.
По результатам проведенных исследований было выявлено, что
экспрессия НИС в яичниках достоверно однократно поднималась на 3 день
БЩЖ. Экспрессия каспазы 3 была достоверно выше контрольных
показателей почти на всем протяжении БЩЖ, поднимаясь со второго дня;
214
однако на третий день БЩЖ наблюдалось кратковременное снижение до
норматива.
При сопоставлении полученных данных с результатами исследований
гормонального статуса, было определено, что на второй день БЩЖ
одновременно с ростом экспрессии каспазы 3 в яичнике снижался
прогестерон в крови. На третий и шестой день блокады одновременно
повышалась экспрессия НИС в яичнике и ФСГ и ЛГ в крови.
Однако полной идентичности вариабельности экспрессии каспазы 3 и
прогестерона не было выявлено – каспаза 3 однократно снижалась до уровня
контрольных показателей
на 3 день БЩЖ, а прогестерон однократно
повышался до норматива на 5 день БЩЖ.
Вариабельность экспрессии НИС в яичнике так же имела ряд отличий от
характера изменений гипофизарных гонадотропинов: экспрессия НИС
снижалась на 4 и 5 дни БЩЖ, а ЛГ уменьшился однократно на 5 день БЩЖ,
одновременно с однократным ростом прогестерона.
При сопоставлении изменений экспрессии НИС и каспазы 3 в гипофизе,
щитовидной железе и яичниках при БЩЖ можно суммировать, что при
начальных периодах развития БЩЖ динамика изменений экспрессии НИС в
яичнике была идентична с щитовидной железой (уровень НИС в
щитовидной железе так же увеличивался только на 3 день БЩЖ), а
вариабельность экспрессии каспазы 3 – с гипофизом (в гипофизе так же
наблюдался скачкообразный рост экспрессии каспазы 3 на 2 день БЩЖ).
Но при последующих периодах БЩЖ такой идентичности не
наблюдалось – в гипофизе экспрессия каспазы 3 снижалась однократно на 4
день БЩЖ, а в яичнике – на 3 день. Экспрессия НИС в щитовидной железе
снижалась на 5 день блокады и опускалась ниже нормального уровня на 6
день блокады, нормализуясь на 7 день при ребаунд–эффекте. В яичнике
215
экспрессия НИС понижалась до норматива на 4 и 5 дни БЩЖ, вырастала на
6 день и снижалась ниже норматива на 7 день блокады.
Таким образом, первичная реакция яичника на БЩЖ, вероятно,
присутствовала – в виде активации местного апоптоза. Этот эффект имел как
общие с щитовидной железой и гипофизом, так и индивидуальные
особенности: в яичниках на начальных этапах развития БЩЖ активация
апоптоза не была синхронна с изменениями маркера содержания йода в
тканях – рост экспрессии каспазы 3 (2 день БЩЖ) предшествовал росту
экспрессии НИС (3 день БЩЖ). В гипофизе и щитовидной железе активация
апоптоза была синхронизирована с ростом НИС, но в гипофизе этот эффект
наблюдался на 2 день БЩЖ, а в щитовидной железе – на третий.
Вариабельность вышеназванных показателей в яичниках на протяжении
БЩЖ так же отличалась индивидуальностью. Основной индивидуальной
особенностью реакции яичников на БЩЖ явилась длительная активация
апоптоза,
не
прекратившаяся
при
ребаунд–эффекте
при
снижении
экспрессии НИС. В гипофизе и щитовидной железе при ребаунд –эффекте
экспрессия НИС и каспазы 3 нормализовались.
Блокада щитовидной железы как мера профилактики радиоактивного
поражения при угрозе ядерного заражения активно исследуется, однако
вопрос, заданный исследователями много лет назад -“что является фактором,
инициирующим рост ТТГ при ребаунд-эффекте?» (what is the factor initiating
the presumably increased TSH release by rebound - effect?” , остается
актуальным ( Langer P, 1968).
Eng R. (1999) выдвинул гипотезу о том, что при блокаде щитовидной
железы интратиреоидальный йод снижается до критического уровня. Однако
эта гипотеза основывалась на исследовании изменений НИС при блокаде
щитовидной железы и не давала ответ – что такое " критический уровень
снижения интратиреоидального йода"?
216
На основании полученных нами данных, можно предположить, что "
критический уровень снижения интратиреоидального йода " - это «базисный
уровень»
йода,
определенный
в
ЙПТ
большинства
эндокринных
экстратиреоидных органов. Эта гипотеза подтверждается тем фактом, что
рост экспрессии ТТГ в гипофизе перед ребаунд эффектом был синхронен
со снижением
уровня йода в ЙПТ щитовидной железы до «базисного
уровня». При настоящем исследовании не было выявлено более низкого
снижения уровня йода в ЙПТ щитовидной железы.
В последнее время появились работы, ставящие под сомнение ведущую
роль НИС в развитии блокады щитовидной железы. Так, Leoni S, (2011)
установил, что снижение накопления йода щитовидной железой начинается
намного раньше, чем снижение mRNK НИС. Наши данные согласуются с
данными Leoni S. – снижения йода в щитовидной железе начинается на 3 дня
ранее снижения
экспрессии НИС в щитовидной железе. Более того,
снижение интратиреоидного йода происходит на фоне роста тиреоидной
экспрессии НИС.
По нашим данным, снижение йода в щитовидной железе было синхронно
со снижением экспрессии тиреотропного гормона в гипофизе. Этот факт
привлекает внимание к функции гипофиза в развитии йод – индуцированной
блокады щитовидной железы.
Как уже указывалось, многие ранние исследователи считали, что йодиды
влияют на синтез и высвобождение ТТГ (DelConte E. (1955), McClendon J.
(1948)). При исследовании уровня ТТГ в крови и тканях гипофиза у
тироидэктомированных крыс было выявлено, что йодиды вызывают
снижение экспрессии ТТГ (Abbassi V., McKenzie J., 1967)). Однако были и
другие мнения – так, прямое введение йодидов в гипофиз не оказывало
влияния на поглощение йода щитовидной железой в течение 24 часов (Greer,
M., 1960).
217
Наши результаты подтвердили данные обеих групп исследователей: йодид
калия при блокаде щитовидной железы влияет на
уровень ТТГ уже на
второй день блокады, но реакция щитовидной железы наступает не через 24
часа, а на четвертый день блокады (достоверное снижение уровня йода в
щитовидной железе происходит с четвертого по шестой дни блокады).
При нашем исследовании гормонов гипофизарно – тиреоидной системы в
крови было установлено, что уровень ТТГ в крови снижается со 2 по 6 дни
блокады щитовидной железы (« плато»), затем на 7 день скачкообразно
вырастает до контрольных показателей. Достоверный рост уровней гормонов
щитовидной железы наблюдался только на 6 день блокады, перед ребаунд
эффектом. Надо отметить, что по результатам исследования гормонального
статуса факт блокады щитовидной железы было трудно определить –
наблюдался
лишь
кратковременный
гипофизарный
Исследование содержания йода в щитовидной железе
гипертиреоз.
с помощью PMA
позволило выявить, что эти изменения гормонального статуса произошли на
фоне снижения йода в щитовидной железе.
Оптимизация пробоподготовки образцов для EPMA позволила провести
это
исследование
и,
возможно,
избежать
ошибок
в
определении
микроэлементов, описанных в ранее опубликованных работах (Rognoni J.B.,
Simon C., 1974).
Исследование содержания йода и селена в щитовидной железе и гипофизе
при йод – индуцированной блокаде щитовидной железы с помощью PMA
помогло выявить новые аспекты как развития процесса блокады, так и
ребаунд эффекта.
По
данным
PMA,
подавление
функции
гипофиза
при
йод
–
индуцированной блокаде щитовидной железы было синхронно с ростом
уровня йода в йод позитивных точках гипофиза. И эти изменения
подтверждаются ростом экспрессии НИС в гипофизе. Рост уровня йода в йод
218
позитивных точках гипофиза был синхронен с ростом экспрессии каспазы 3 в
гипофизе и снижением гипофизарного селена - совокупность этих изменений
явилась началом блокады щитовидной железы.
PMA дал возможность определить, что при блокаде щитовидной железы
существуют периоды «плато» равных уровней йода в йод – позитивных
точках гипофиза и щитовидной железы.
С помощью PMA удалось выяснить и некоторые аспекты ребаунд эффекта:
удалось определить "критический уровень снижения интратиреоидного
йода", соответствующий базисному уровню йода в йод – позитивных точках
большинства эндокринных органов. Результаты исследования экспрессии
ТТГ в гипофизе показали, что рост экспрессии ТТГ наблюдался именно при
" критическом уровне интратиреоидного йода " и предшествовал ребаунд
эффекту.
Интересны данные по гипофизарному селену: было определено, что он
скачкообразно
исчезает
в
моменты
дестабилизации
сначала
физиологического, а затем и адаптационного процессов.
Таким образом, определение йода и селена в щитовидной железе и
гипофизе с помощью PMA помогли выявить новые аспекты в исследовании
йод-индуцированной блокады щитовидной железы.
H. Burgi (1974) исследовал в эксперименте на крысах интратиреоидное
содержание йода и уровень ТТГ при йод-индуцированной блокаде
щитовидной железы при введении 3 мг йодида калия каждые 12 часов в
течение недели. У одной из групп животных выработка ТТГ была
заблокирована
тироксином.
По
результатам,
полученным
автором,
изначально высокая концентрация интратиреоидального йодида быстро
уменьшалась в течение первых 4 дней избытка йода, независимо от того, был
ли подавлен уровень ТТГ тироксином или нет. Автором был сделан вывод о
219
том, что ТТГ играла лишь незначительную роль в адаптации активного
транспортного механизма йодида.
Образование органического йода при суточной дозе 6 мг йодида калия
было заблокировано в течение первых 4 дней. При снижении уровня
интратиреоидального йода ниже 0,1 мкг/мг ткани, органическое йодирование
было возобновлено вместе с ростом ТТГ. У животных с низким ТТГ ребаундэффект наблюдался на 1 день позже, когда интратиреоидальный йодид упал
ниже 0,05 мкг/мг. На основании этого этапа исследований тем же автором
был сделан вывод о том, что уровень ТТГ оказывает влияние на
выраженность ребаунд-эффекта.
По
результатам
проведенного
нами
исследования
очевидно,
что
компенсаторная система щитовидной железы позволяет поддерживать почти
нормальный уровень тиреоидных гормонов даже при «критическом уровне
йода» в щитовидной железе. Таким образом, реакция ТТГ на влияние
тироксина (органического йода) в сочетании с влиянием острой нагрузки
неорганическим йодом, описанное в эксперименте H. Burgi (1974), требует
более глубокого исследования, чем просто определение уровня ТТГ крови.
Однако мы более интенсивно, чем H. Burgi, исследовали роль гипофиза в
развитии блокады щитовидной железы и считаем, что гипофиз играет
активную роль не только при ребаунд-эффекте. Тот факт, что изменения
экспрессии НИС в гипофизе в наблюдались уже в период «старта БЩЖ» (на
2 день БЩЖ), а в щитовидной железе – только на 3 день БЩЖ, говорит о
том, что реакция гипофиза опережает реакцию щитовидной железы на
йодную нагрузку.
Так же выяснилось, что по уровню гормонов гипофизарно-тиреоидной
системы в крови затруднительно судить о выраженности БЩЖ. Уровень ТТГ
в крови не изменялся в зависимости от выраженности БЩЖ – он был
одинаково низок во все дни БЩЖ, исключая день ребаунд-эффекта; уровню
220
интратиреоидального йода больше соответствовала экспрессия ТТГ в
гипофизе. Изменения эксперессии тиреоидной НИС так же давали мало
информации о
глубине снижения интратиреоидного
йода,
так
как
уменьшение уровня тиреоидного йода в определенные периоды БЩЖ
сопровождалось ростом экспрессии НИС.
Данные РМА по изменениям уровня йода в щитовидной железе при йодиндуцированной блокаде щитовидной железы, подтверждают результаты H.
Burgi (1974) по динамике интратиреоидного йода при БЩЖ. Следует
отметить,
что
применение
РМА
позволило
уменьшить
количество
экспериментальных животных - H. Burgi для набора количества материала,
необходимого для определения йода традиционными аналитическими
методами, использовал более 200 крыс.
Таким образом, проведенное исследование позволило выявить, что в
эксперименте уже на дозе 8 мкгKI/100 г наблюдается блокада щитовидной
железы. Точные данные по наличию блокады могло предоставить только
исследование интратиреоидного йода. Исследование гормонов крови и
экспрессии тиреотропного гормона не отражало в полном объеме изменений
уровня йода в ЙПТ щитовидной железы.
Возможно, полученные данные дадут возможность оптимизировать дозы
йодида калия, применяемые в настоящее время при угрозе радиационного
поражения. Вполне вероятно, что анализ результатов, полученных при
сравнении уровней йода в щитовидных железах и экстратиреоидных органах
у женщин и самок-крыс, помогут в экстраполяции экспериментальных
данных на человека.
Выявленное нами влияние йодида калия на гипофизарно-гонадную
систему вероятно, должно повысить настороженность по поводу возможных
осложнений репродуктивной функции при применении йодида калия.
221
Физиологические
механизмы
динамического
изменения
звеньев
интегративной реакции щитовидной железы, гипофиза и яичников с учетом
динамики йода и селена в-позитивных точках, выявленные в нашей работе,
представлены в виде нижеприведенной схемы (рисунок 44 и 45).
222
Щитовидная
железа
Яичники
Гипофиз
Период 1 Старт блокады щитовидной железы ( 2 день БЩЖ)
Se
I
I
НИС
ТТГ
ФСГ
ЛГ
Se
Каспаза3
N
↓
↑
↑
↓
↑
↑
↓
↑
Прогестер
он ↓
Каспаза 3
↑
Период 2. Период плато одинаковых уровней йод а в йодпозитивных точках щитовидной железы и гипофиза (3 –
4 дни БЩЖ)
НИС
↑
Каспаза3
↑
Se
N
I
I
↓=
↑=
НИС
↑
ТТГ
ФСГ
ЛГ
↓
↑
↑
Se
↑→N
Каспаза 3
↓
НИС
↓↑→N
Каспаза 3
↓
Рисунок 44. Физиологические механизмы йод - индуцированной блокады щитовидной железы с учетом динамики
тиреоидного и гипофизарного йода в периоды старта и плато равных уровней йода в йод- позитивных точках
щитовидной железы и гипофиза
223
Щитовидная
железа
Гипофиз
Яичники
Период 3. Начало дестабилизации плато (5 день БЩЖ)
НИС
Каспаза3
↑
↓-N
Se
N
I
I
↓=
↑=
НИС
↓→N
ТТГ
ФСГ
ЛГ
↓
↑
↓
Se ↓
Каспаза 3
↑
Прогестер
он ↑
Каспаза3
↑
Период 4 Дестабилизация плато ( 6 день БЩЖ)
НИС
Т3 ↑
Каспаза 3
↑
↓↓
Se
I ↓↓
I ↑
ТТГ
↑→N
N
ФСГ
↑
ЛГ
↑
Se
↑→N
Каспаза 3
↓→N
Прогесте
рон ↓
НИС
↑
Каспаза3
↑
Период 5 Ребаунд-эффект (7 день БЩЖ)
НИС
↑→N
Т3
↓→N
Каспаза3
Se
I
↓→N
N
↑↑
I
↓→N
ЛГ
↓→N
Se
N
Прогесте
рон ↓
НИС
↓→N
Каспаза3
↑
Рисунок 45. Физиологические механизмы йод - индуцированной блокады щитовидной железы с учетом динамики
тиреоидного и гипофизарного йода в периоды дестабилизации плато равных уровней йода в йод- позитивных точках
щитовидной железы и гипофиза и период ребаунд-эффекта
224
Таким образом, по результатам нашего исследования физиологических
механизмов йод – индуцированной блокады щитовидной железы было
выявлено
что воздействие
йода оказывало
влияние не
только
на
гипофизарно–тиреоидную, но и на гипофизарно-гонадную системы у самок –
крыс, то есть являлось интегративным: йодид калия как при однократном
применении, так и при йод-индуцированной блокаде (многократном
введении KI) вызывал персистирующий эструс у эутиреоидных самок–крыс
Определение с помощью РМА уровня йода и селена в щитовидной
железе и большинстве эндокринных органов крыс позволило ввести понятие
«базисного
уровня»
йода
–
уровня
йода
в
ЙПТ
большинства
экстратиреоидных эндокринных органов крыс (исключая семенники).
Понятие
«базисного
дифференциацию
уровня»
внутри
йода
«малых
дало
доз»
возможность
йодидов
в
провести
зависимости
от
направленности их воздействия на функцию щитовидной железы, а так же
выраженности и дифференцированности воздействия на функциональную
активность гипофизарно- тиреоидной и гипофизарно- гонадной систем.
На основании результатов исследования был сделан вывод о том, что
выраженность и характер изменений в щитовидной железе, гипофизе и
яичниках зависели не только от определенной пропорции между уровнем
неорганического йода в крови и уровнем йода в щитовидной железе, но и от
определенной пропорции между уровнем неорганического йода в крови и
«базальным» уровнем йода.
Было
установлено,
фармацевтических
дозах
что
воздействие
было
связано
йодида
с
калия
в
малых
органоспецифической
и
дозозависимой активацией каспазозависимого апоптоза в щитовидных
железах, гипофизе и яичниках, причем наиболее выражен этот эффект был в
гипофизе.
225
В теоретическом аспекте нами была подтверждена гипотеза о том, что при
блокаде щитовидной железы интратиреоидальный йод снижается до
критического уровня. Было установлено, что «критический уровень
интратиреоидального йода» - это «базисный уровень» йода: скачкообразный
рост экспрессии ТТГ в гипофизе перед ребаунд-эффектом был синхронен со
снижением уровня йода в йод-позитивных точках щитовидной железы до
«базисного уровня».
Были выявлены изменения содержания селена в гипофизе при йодиндуцированной блокаде щитовидной железы: было установлено, что
снижению уровня селена в селен-позитивных точках гипофиза за пределы
чувствительности РМА соответствуют максимальные подъемы экспрессии
гипофизарных каспаз.
Было установлено, что видовая пропорция содержания йода 2:1 у женщин
и самок – крыс характерна не только для щитовидной железы, но и для
экстратиреоидных органов (гипофиз, яичники). Так же было выявлено, что
видозависимо и соотношение уровней йода в вышеназванных органах.
Предложенная
нами
оптимизация
пробоподготовки
биологических
субстратов для РМА (комбинация вакуумной и термальной сушки) позволила
минимизировать потерю микроэлементов в исследуемых тканях при
пробоподготовке.
В практическом аспекте полученные знания по патогенетическим
механизмам
йод-индуцированной
блокады
щитовидной
железы
обосновывают новые возможности для оптимизации доз йодида калия,
применяемых при угрозе радиационного заражения и оценки возможных
осложнений
со
вышеназванных
биосубстратов
стороны
мер
для
репродуктивной
профилактики.
РМА
дает
системы
Оптимизация
новые
при
проведении
пробоподготовки
возможности
исследования
226
микроэлементов с минимальными потерями в процессе аналитических
процедур.
ВЫВОДЫ
1. Йод – индуцированная блокада щитовидной железы оказывает влияние не
только на гипофизарно – тиреоидную, но и на гипофизарно - гонадную
системы у самок – крыс.
2. Йодид калия как при однократном применении, так и при йодиндуцированной
блокаде
(многократном
введении
KI)
вызывет
персистирующий эструс у эутиреоидных самок–крыс
- при однократном применении длительность персистирующего эструса не
превышает один эстральный цикл
-
при
многократном
введении
при
ребаунд-эффекте
полноценной
нормализации персистирующего эструса не наблюдается
3.Определение с помощью РМА уровня йода в щитовидной железе и
большинстве
«базисного
эндокринных
уровня»
йода
органов
–
крыс
уровня
позволяет
йода
в
ввести
ЙПТ
понятие
большинства
экстратиреоидных эндокринных органов крыс (исключая семенники).
4. Выраженность и характер изменений в щитовидной железе, гипофизе и
яичниках при воздействии йодида калия зависит не только от определенной
пропорции между уровнем неорганического йода в крови и уровнем йода в
щитовидной железе (феномен Вольфа – Чайкова), но и от определенной
пропорции между дозой йодида калия и «базальным уровнем» йода.
Понятие
«базисного
уровня»
йода
дает
возможность
провести
дифференциацию внутри «малых доз» йодидов в зависимости от:
-
направленности их воздействия на функцию щитовидной железы: при
227
дозах йодида калия, не превышающих «базисный уровень» щитовидная
железа накапливает йод, при превышении этого показателя – теряет.
- выраженности воздействия на функциональную активность гипофизарнотиреоидной и гипофизарно- гонадной систем: при дозах йодида калия, не
превышающих «базисный уровень», реагируют гормоны крови, при
превышении – экспрессия гипофизарных гормонов в гипофизе и экспрессия
НИС щитовидной железы, гипофизов и яичников
-
дифференцированности воздействия на функциональную активность
гипофизарно- тиреоидной и гипофизарно- гонадной систем: при дозировках
йодида калия не превышающих уровень йода в ЙПТ щитовидной железы (4
мкг/100г),
активнее
реагируют
гипофизарные
гонадотропины,
при
превышении указанного уровня – показатели гипофизарно-тиреоидной
системы
5. Изменения гипофизарно- тиреоидной и гипофизарно-гонадной систем при
воздействии
йодида
калия
в
малых
фармацевтических
дозах
органоспецифичны, причем реакция экстратиреоидных органов (гипофиза и
яичников) различна по активности. Гипофиз более чувствителен к
воздействию йодида калия, чем щитовидная железа и яичники, так как
увеличение экспрессии НИС в гипофизе началось с дозы 4 мкгKI/100г, а в
щитовидной железе и яичниках – с 8 мкг/100г. При 25 мкгKI/100г экспрессия
НИС в яичниках не реагирует.
6. Воздействие йодида калия в малых фармацевтических дозах связано с
органоспецифической активацией каспазозависимого апоптоза.
- в щитовидной железе активация каспазозависимого апоптоза сочетается со
снижением интратиреоидального йода
- в гипофизе рост активности каспаз происходит на фоне увеличения уровня
йода в ЙПТ (выявлена прямая зависимость между этими показателями) и
228
снижения
экспрессии
тиреотропного
гормона
(выявлена
обратная
зависимость между этими показателями)
-
в яичниках вышеописанная зависимость четко не просматривается;
выявлена активация местного апоптоза при БЩЖ
7. При йод-индуцированной блокаде щитовидной железы при использовании
дозы 8 мкгKI/100г первично на введение йодида калия реагирует гипофиз:
уровень тиреотропного гормона в крови и его экспрессия в гипофизе
снижаются после первого введения йодида калия; изменения гормонов
щитовидной железы проявиляются только после четырехкратного введения
йодида.
8. Присоединение реакции гормонов щитовидной железы к реакции гипофиза
на продолжающееся введение йодида, возможно, является триггером для
нормализации
сочетанная
функции
реакция
гипофизарно–тиреоидной
гормонов
гипофиза
и
системы,
щитовидной
так
как
железы
предшествовала ребаунд-эффекту
9. Нами подтверждена гипотеза о том, что при блокаде щитовидной железы
интратиреоидальный йод снижается до критического уровня. Установлено,
что " критический уровень интратиреоидального йода " - это «базисный
уровень» йода: скачкообразный рост экспрессии ТТГ в гипофизе перед
ребаунд-эффектом синхронен со снижением уровня йода в йод-позитивных
точках щитовидной железы до «базисного уровня». При настоящем
исследовании не выявлено более низкого снижения уровня йода в йодпозитивных щитовидной железы.
10. Выявлены изменения содержания селена в гипофизе при йодиндуцированной блокаде щитовидной железы: установлено, что при
максимальных подъемах экспрессии каспаз (на второй и пятый дни блокады
щитовидной железы) уровень селена в селен-позитивных точках гипофиза
снижается за пределы чувствительности РМА.
229
11. Установлено, что содержание йода у женщин и самок – крыс
видозависимо
и
органозависимо.
Соотношение
2:1
соотвтественно
характерно не только для щитовидной железы, но и для экстратиреоидных
эндокринных органов (гипофиз, яичники). Уровень йода в йодпозитивных
точках в гипофизах у женщин 4 – х кратно превышает соответственный
показатель у самок - крыс.
12.
Предложенная нами оптимизация пробоподготовки биологических
субстратов для РМА (комбинация вакуумной и термальной сушки) позволила
минимизировать потерю микроэлементов в исследуемых тканях при
пробоподготовке.
Практическое использование полученных результатов
1. . Полученные данные могут быть использованы для оптимизации доз
йодида калия, применяемых для профилактики поражения щитовидной
железы при угрозе радиоактивного заражения.
2. Полученные данные могут быть использованы для профилактики
нарушений репродуктивной системы у женщин при применении йодида
калия в качестве профилактики поражения щитовидной железы при угрозе
радиоактивного заражения.
3. Метод пробоподготовки биосубстратов для РМА (комбинация
вакуумной (3 Pa ) и термальной сушки ( 45 минут при 100оС) рекомендуется
к применению в рентенспектральном микроанализе.
4. Полученные данные могут быть использованы при написании
монографий, справочников по вопросам физиологических механизмов
влияния йодида калия.
230
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Айламазян Э.К. Гинекология от пубертата до менопаузы: Практ.
Руководство для врачей /Под ред.акад. РАМН, проф.Э.К. Айламазяна.М.:МЕДпресс-информ, 2006.- 2–е изд., доп.-496с.
2.
Алешин Б.В. Влияние половых гормонов на состояние щитовидной
железы и обмен тиреоидных гормонов./ Алешин Б.В., Цариковская Н.Г.
//
Успехи современной биологии.- 1965.- Т.59(2).-С.280-300.
3.
Анисимов, В.Н. Световой режим, мелатонин и риск развития рака /В.Н
Анисимов, И.А Виноградова //Вопросы онкологии. –2006. – Т. 52. – № 5. – С.
491 – 498.
4.
Алипов В.И. Лечебный эффект тиреоидина у эутиреоидных женщин с
ановуляторным бесплодием./ Алипов В.И., Бескровный С.В., Носова Л.Г..
Потин В.В.,Ткаченко Н.Н.//Акуш. и гин.-1988.-№11.-С.53-55.
5.
Бабичев
взаимодействия
В.Н.
Современные
представления
гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной
гипофизарно-гонадной систем
о
и
механизме
гипоталамо-
в организме./ Бабичев В.Н., Самсонова
В.М.//Успехи современной биологии.-1983.-Т.2(2).- С.281-292.
6.
Басалаева, Н.Л. Метод определения содержания йода в биосубстратах
организмов/ Басалаева Н.Л., Михайлова Э.Н.. Казачков Е.Л, Сычугов
Г.В.//RU Patent 2366952, 2009
7.
Бок Р. Методы разложения в аналитической химии/ Бок Р. - М.: Химия,
1984. - 170 с.
8.
Брауде, И.Л. Неоперативная гинекология/ Брауде И.Л., Малиновский
М.С., Серебров А.И. – М.: Медгиз, 1957. – С. 431 – 435.
9.
Ван – дер – Верден Б.Л. Математическая статистика / Б.Л. Ван – дер –
Верден: пер. с нем. – М., 1960.- 434 с.
10. Герасимов
Г.А.
О
рекомендациях
Всемирной
организации
здравоохранения по йодной профилактике после ядерных катостроф./
Герасимов Г.А.//Клиническая Тиреоидология.-2003.-. Т. 1. - №4.-С. 32-37.
231
11. Дедов И.И Диагностика, лечение и профилактика ятрогенных
йодиндуцированных
заболеваний
щитовидной
железы/
Дедов
И.И.,
Мельниченко Г.А.. Свириденко Ю.Н., Платонова Н.М., и др. // Вестн. Росс.
АМН.- 2006.- №2.-С. 15 – 22.
12. Гланц С. Медико – биологическая статистика: пер.с.англ./ С.Гланц.-М.,
1999.- 459 с.
13. Георгиевский В.И., Минеральное питание животных./ Георгиевский
В.И., Анненков Б.Н., Самохин В.Т.. - М.:Колос.- 1979.-471 с.
14. Гоулдстейн Дж. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский
микроанализ: в 2 –х книгах. Книга 1. Пер. с англ./. Гоулдстейн Дж.. Ньюбери
Д.. Эчлин П . и др -М.:Мир,1984.-303с.
15. Дерябина Е.Г. Распространенность и структура тиреопатий после
естественной и хирургической менопаузы у женщин 45–55 лет в регионе с
легким дефицитом йода./ Дерябина Е.Г., Башмакова Н.В. // Уральский
медицинский журнал. — 2008. — № 12. — С. 24-27.
16. Ермаков В.В. Материалы о распределении селена в органах и тканях
человека/ Ермаков В.В //Бюлл. эксперим. биол. и мед.- 1965.-Т. 59,- № 3 .С. 283-284.
17. Ермаков В.В. Особенности количественного определения селена в
биоматериалах./ Ермаков В.В., Тютиков С.Ф., Хушвахтова С.Д.. Данилова
В.Н., Боев В.А. и др.// Вестник Тюменского государственного университета.2010.- № 3.- С. 208-215.
18. Зайчик В.Е. Потери химических элементов при сухом озолении
образцов
биологических
материалов./Зайчик
В.Е.//
Микроэлементы
в
медицине.-2004.-Т.5 (3).-С.17-22.
19. Кабак Я.М. Практикум по эндокринологии. Основные методики
экспериментально-эндокринологических исследований./ Кабак Я.М. -М., Изд.
МГУ, - 1968.- 153с.
232
20. Капланский С.Я. Минеральный обмен. /Капланский С.Я..- М.-Л., 1938.-311c.
21. Козлов,
В.Н.
терморегуляции
в
Хронобиологические
экспериментальной
методы
исследования
патофизиологии
/В.Н.
Козлов//Современные проблемы ветеринарной медицины и животноводства:
Сб. науч. тр. – Уфа, 2005. - С. 95-100.
22. Козлов, В.Н. Интегральная оценка и коррекция тиреоидзависимых
морфофункциональных нарушений у животных: автореф. дисс … .д-ра биол.
наук/ В.Н. Козлов – М., 2008. –38 стр.
23. Козуб
Н.И.
Избранные
вопросы
практической
эндоскопии
в
гинекологии.- Харьков, 2002.- 213 стр.
24.
Короткевич, Т.В. Влияние бактериального липополисахарида на
температуру тела и содержание холестерина липопротеинов крови у крыс в
условиях экспериментального гипо- и гипертиреоза / Т.В. Короткевич, В.А.
Касап, Т.Ф. Андрушевич//Механизмы функционирования висцеральных
систем: тез. докл. V Всерос. конф. с междунар. участием, Санкт-Петербург,
16–19 окт. 2007 г. – СПб, 2007. – С. 158–159.
25. Мерков А.М. Санитарная статистика: пособие для врачей/ А.М.
Мерков, Л.Е. Поляков.-Л.,1974.-384 с.
26. Меркулов Г.А. Курс паталогоанатомической техники/ Г.А. Меркулов. Л., -1961.- 340 с.
27. Нигматулина Е.Н. Главные минералогические типы почечных камней./
Нигматулина Е.Н., Сокол Э.В., Максимова Н.В., Чиглинцев А.Ю. и др.//
Химия в интересах устойчивого развития.- 2004.- №12.- С. 67-81.
28. Пашкова Г.В. Ренгенфлюоресцентный анализ молока и основанных на
нем продуктов./ Пашкова Г.В.// Аналитика и контроль.- 2010.-Т.14.-№ 1.-С.414.
29. Пирс Э. Гистохимия теоретическая и прикладная / Э. Пирс.- М., 1962.962 с.
233
30. Покровский А.А. Справочник диетолога /Покровский А.А., Конь И.Я..
Ширина Л.И., Под редакцией Покровского А.А. – М.: Медгиз, 1981.- С. 96-98.
31. Пономарева, Л.Ф. Суточные ритмы терморегуляции как объективный
критерий достоверной модели экспериментального гипотиреоза / Л.Ф.
Пономарева, Р.С. Кузбеков, В.Н. Козлов // Перспективы развития пищевой
промышленности России: Мат. науч.-практ. конф. – Оренбург, 2005.- С. 407410.
32. Саркисов Д.С. Микроскопическая техника./Д.С. Саркисов, Ю.Л.Перов.М..- 1996.- 544 с.
33. Северина, Т.Г. Влияние острой иммерсионной гипотермии на
температуру тела и активность лизосомных ферментов печени устойчивых и
неустойчивых к холоду крыс / Т.Г. Северина, А.И. Кубарко // Мед. журн. –
2009. – Т. 28, № 2. – С. 112–115.
34. Септлиев Д.
Статистические методы
в научных
медицинских
исследованиях/ Д. Септлиев: пер.с.болг.- М., 1968. – 419с.
35. Теппермен Дж. Физиология обмена веществ и эндокринной системы./
Теппермен Дж., Теппермен Х.-М.:Мир, 1989.- 637 с.
36. Шилин Д.Е. Морфофункциональное состояние щитовидной железы у
детей в условиях йодного дефицита и малых доз радиационного загрязнения.
/Шилин Д.Е.,Касаткина Э.П., Соколовская В.Н., Матковская А.Н. и др. //В сб.:
Медицинские аспекты влияния малых доз радиации на организм детей,
подростков и беременных. - Под. ред. Е.М. Парш-кова, Ю.А. Князева, В.В.
Шахтарина. Обнинск; М„ 1994. - Вып. 2. - С. 192-200.
37. Шилин Д.Е. Первое десятилетие после аварии на ЧАЭС: рак
щитовидной железы у населения Российского Чернобыля, подвергшегося
воздействию радиационного фактора в детском и подростковом возрасте./
Шилин Д.Е.// В сб.: Актуальные вопросы клинической железнодорожной
234
медицины (том №5 научных трудов сотрудников ЦКБ МПС РФ). М., 2000,- С.
392-402.
38. Шевченко И.Т. Элементы вариационной статистики для медиков / И.Т.
Шевченко, О.П. Богатов, Ф.П. Хрипта. – Киев, 1970.-105 с.
39. Урбах В.Ю. Статистический анализ в биологических и медицинских
исследованиях / В.Ю. Урбах. - М., 1975.- 295 с.
40. Abbassi V., Lack of iodide effect on serum and pituitary thyrotropin in
vivo./ Abbassi V., McKenzie J.//Endocrinol.-1967.-V.81.-P.871-876.
41.
Abraham P. A systematic review of drug therapy for Graves’
hyperthyroidism./ Abraham P., Avenell A., Park C., Watsonand W. , Bevan J. //
Eur J Endocrinol .- 2005.-V.153.-P.489-498.
42. Adalja AA. Use of potassium iodide (KI) in a nuclear emergency./ Adalja
AA. //Biosecur Bioterror. 2011.-V.9.-P.405-407.
43. Alvarez M. Determination of potassium and calcium in milk powder by
EDXRF spectrometry / Alvarez M, Mazo-Gray V. // X-Ray Spectrom. -1990.- V.
19.- P. 285-287.
44. Andersson MCaspase and Proteasome Activity during StaurosporinInduced Apoptosis in Lens Epithelial Cells./ Andersson M, Sjöstrand J., Petersen
A., Honarvar A.K.S., Karlsson J.// Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.- 2000.-V. 41(9).P. 2623-2632
45. Andrasi E. Determination of iodine in human brain by epithermal and
radiochemical neutron activation analysis./ Andrasi E., Kučera J., Belavari Cs.,
Mizera J.// Microchemical Journal.- 2007.- V.85.- P. 157–163.
46. Arthur J. Hepatic iodothyronine 5_-deiodinase. The role of selenium./
Arthur JR, Nicol F, Beckett G.J. // Biochem J .-1990.-V.272.-P.537–540.
47. Arthur J.R. Neometabolic roles for selenium./ Arthur JR, Beckett GJ. //
Proceedings of the Nutrition Society.- 1994.-V. 53.-P.615–624.
48. Ashkenazi A.. Death receptors: signaling and modulation./ Ashkenazi A.,
Dixit V.M. // Science.- 1998.-V.281.-P.-1305–1308.
235
49. Aubert B. Thyroid Iodine Content Measuredby X-Ray Fluorescence in
Amiodarone Induced Thyrotoxicosis: Concise Communication. / Aubert B., Fragu,
Di Paola M., et al.//Eur J Nucl Med.-1983.-V. 24(7).-P.582-585.
50. Bacher K. Thyroid uptake and radiation dose after (131) I-lipiodol
treatment: is thyroid blocking by potassium iodide necessary?/ Bacher K, Brans B,
Monsieurs M, De Winter F, et all. // Eur J Nucl Med Mol Imaging.-2002.V.29(10).-P.:1311-1316.
51. Bates J. Effects of Selenium Deficiency on Tissue Selenium Content,
Deiodinase Activity, and Thyroid Hormone Economy in the Rat during
Development./ Bates J., Spate V.L., Morris J., German S.D.L. ST., et all.//
Endocrinology .- 2000.- V. 141(7).-P. 2490-2501.
52. Behne D. Identification of type I iodothyronine 5_-deiodinase as a
selenoenzyme./ Behne D, Kyriakopoulos A, Meinhold H, Ko.hrle J.//Biochem
Biophys Res Commun.- 1990.-V. 173.-P.1143–1149.
53. Berry M.J. Type I iodothyronine deiodinase is a selenocysteine-containing
enzyme./ Berry MJ, Banu L, Larsen PR. // Nature .-1991.-V. 349.-P.438–440.
54. Birringer M. Trends in selenium biochemistry. / Birringer M, Pilawa S,
Flohe L. //Nat Prod Rep.- 2002.-V. 19.-P.693–718.
55. Boechat, L .Effect of iodide on Fas, Fas-ligand and Bcl-w mRNA expression
in thyroid of NOD mice pretreated with methimazole./Boechat L., Vilella C,
Zolliner R.// Brazil J Medic Biol Res.-2002.-V. 35.-P. 289–295.
56. Boland A. Adenovirusmediated transfer of the thyroid sodium/iodide
symporter gene into tumors for a targeted radiotherapy./ Boland A, Ricard M,
Opolon P. // Cancer Res.- 2000.- V.60.-P. 3484-3492.
57. Bongers-Schokking J. Influence of timing and dose of thyroid hormone
replacement on development in infants with congenital hypothyroidism./ BongersSchokking JJ, Koot HM, Wiersma D, Verkerk PH, de Muinck Keizer-Schrama
SMPF // J Pediatrics.- 2000.-V. 136(3).-P. 292-297.
236
58. Bosl M. R. Early embryonic lethality caused by targeted disruption of the
mouse selenocysteine tRNA gene (Trsp)./ Bosl M. R., Takaku K., Oshima M.,
Nishimura S., Taketo M. M. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.-1997.-V.94.-P.5531–
5534.
59. Börjessonand J.
Medical applications of X-Ray fluorescence for trace
element reseach. / Börjessonand J., Mattsson S.//JCPDS-International Centre for
Diffraction .- 2007.-P.1097-2002.
60. Braverman L.E. Evaluation of a simplified technique for the specific
measurement of serum thyroxine concentration./ Braverman LE, Vagenakis AG,
Foster AE, Ingbar SH. // J Clin Endocrinol Metab.-1971.-V. 32(4).-P.497–502.
61. Braverman L.E. Iodine and the thyroid: 33 years of study./Braverman L.E.//
Thyroid. -1994.- V. 4.-P.351-356.
62. Braverman L.E. The Thyroid–A clinical and fundamental text, ed 8./
Braverman LE, Utiger RD (eds) et all. // Philadelphia: Lippincott-Raven.- 2000.pp.295-315.
63. Brown-Grant K. The sites of iodide concentration in the oviduct and the
uterus of the rat./ Brown-Grant K, Rogers AW // J Endocrinol .-1972.-V.53.-P.355–
362.
64. Buglova E. et al. Thyroid cancer in Belarus after the Chernobyl accident:
incidence, prognosis of progress, risk assessment./ Buglova E. et al. // In: Low
doses of ionizing radiation: biological effects and regulatory control. International
conference. Seville, Spain, 17–21 November 1997. Austria, International Atomic
Energy Agency, 1997 (document IAEA-TECDOC-976).
65. Burikhanov R. Excess iodine induces apoptosis in the thyroid of goitrogenpretreated rats in vivo./ Burikhanov RB, Matsuzaki S.//Thyroid.-2000.-V. 10(2).P.123-129.
66. Calacura F. et al. Childhood IQ measurements in infants with transient
congenital hypothyroidism. Clinical endocrinology, 43:473–477 (1995).
237
67. Cann S. A. Iodide Accumulation in Extrathyroidal Tissues. / Cann S. A.,
van Netten J. P. and Glover D.W.//The Journal of Clinical Endocrinology &
Metabolism. -1999.-Vol. 84(2).-P.821-829.
68. Cann S.A. Hypothesis: Dietary Iodine Intake in the Etiology of
Cardiovascular Disease./ Cann SA// J Amer Coll Nutrition.-2006.-V.-25.-P.1-11.
69. Calaciura F. Measurements in Infants With Transient Congenital
Hypothyroidism./ Calaciura F, Mendoria G, Distefano M, Castorina S, et all.// Clin
Endocrinol.- 1995.-V.43.-P.473-477.
70. Castillo V. A. Changes in thyroid function in puppies fed a high iodine
commercial diet./ Castillo V A, Lalia JC, Junco M, et al: // Vet J .-2001.-V.161.-P.
80–84.
71. Carrasco N. Iodide transport in the thyroid gland./ Carrasco N.// Biochem
Biophys Acta.- 1993.-V.1154.-P. 65-82.
72. Carrión Murillo M. Determination of selenium and iodine in human
thyroids./ Carrión Murillo M, Quintana M, Sanabria G, Ríos M, // J Trace Elem
Med Biol.- 2005.-V.19(1).-P.23-27.
73. Caruso C: Glutamate Induces Apoptosis in Anterior Pituitary Cells through
Group II Metabotropic Glutamate Receptor Activation./ Caruso C, Bottino M,
Pampillo M, Pisera D, Jaita G, Duvilanski B, Seilicovich A, Lasaga M:
//
Endocrinology .-2004.-V.145.-P.4677-4684.
74. Cerman J. The Role of Apoptosis in Pituitary Adenomas in the Field of
Conventionally Used Therapeutic Approaches./ Cerman J, Cap J, Marecova M,
Nemecek S, Marek J, Rudolf E, Cervinka M // Ann N Y Acad Sci.-2003.-V. 1010.P. 520– 524.
75. Chang B. D. Molecular determinants of terminal growth arrest induced in
tumor cells by a chemotherapeutic agent./ Chang B. D., Swift M. E., Shen M., Fang
J., Broude E. V., and Roninson I. B. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2002.-V. 99.-P.
389–394.
238
76. Chanoine J. The Thyroid Gland Is a Major Source of Circulating T3 in the
Rat./ Chanoine J, Braverman L, Farwell A, Safran M, Alex S, Dubord S, Leonard J.
// Clin Invest.- 1993.-V. 91.-P.2709-2713.
77. Chunying C. Tissue contents and intracellular distribution of selenium and
iodine in human tissues studied by neutron activation analysis./ Chunying C.; Zhao
J.; Gao Y.; Chai Z.// Chemia analitycz.- 2005.-V.50(1).-P.169-178.
78. Christianson
D.
The
sex-related
difference
in
serum thyrotropin
concentration is androgen media Christianson D., Roti E., Vagenakis A.G.,
Braverman L.E. The sex-related difference in serum thyrotropin concentration is
androgen mediated. Endocrinology.- 1981.- V.108(2).- P.529-535.
79. H. Selenium repletion and glutathione peroxidase differential effects on
plasma and red blood cell enzyme activity./Cohen H., Chovaniec M.E., Mistretta
D., and Baker S.S.//The American Journal of Clinical Nutrition.- 1985.-V.41.-P.
735-747.
80. Corvilain B. The H2O2-generating system modulates protein iodination and
the activity of the pentose phosphate pathway in dog thyroid./ Corvilain B, Van
Sande J, Laurent E, Dumont JE.//Endocrinology.- 1991.-V.128.-P.779–785.
81. Corvilain B. Role of the cyclic adenosine 3,5-monophosphate and the
phosphatidylinositol-Ca2 cascades in mediating the effects of thyrotropin and
iodide on hormone synthesis and secretion in human thyroid slices./ Corvilain B,
Laurent E, Lecomte M, Vansande J, Dumont JE.// J Clin Endocrinol Metab.- 1994.V.79.-P.152–159.
82. Costa A. Iodine content of human tissues after administration of iodine
containing drugs or contrast media./Costa A, Testori OB, Cenderelli C, Giribone G,
Migliardi M. //J Endocrinol Invest.- 1978.-V.1(3).-P.221-225.
83. Cryns V. Proteases to die for. / Cryns V, Yuan J.// Genes Dev. -1998.-V.12.P.1551–1570.
84. Dai G. Cloning and characterization of the thyroid iodide transporter./ Dai
G, Levy O, Carrasco N.// Nature.- 1996.-V. 379.-P. 458-460.
239
85. Dayem M. From the molecular characterization of iodide transporters to the
prevention of radioactive iodide exposure./ Dayem M, Navarro V, Marsault R,
Darcourt J, Lindenthal S, Pourcher T. // Biochimie.- 2006.-V.88(11).-P.1793-806.
86. Dickson R.C. Selenium in blood and human tissues./ Dickson RC,
Tomlinson RH. // Clinica Chimica Acta.-1967.-V.16.-P.311–321.
87. DelConte E. Effect of thyroidectomy, thiourea and iodine on the circulating
thyrotrophin and pituitary thyrotroph cells in rats./ DelConte E., Stux M. // Actn
endocrinol.-1955.-V.20.-P. 246-256.
88. Dohan O. Predominant intracellular overexpression of the Na+/I- symporter
(NIS) in a large sampling of thyroid cancer cases./ Dohan O, Baloch Z, Banrevi Z,
Livolsi V, Carrasco N. // J Clin Endocrinol Metab.- 2001.-V. 86.-P. 2697-2700.
89. Downer J. V. Effect of Dietary on Tissue Iodine Content in the Bovine./
Downer J. V., Hemken R. W., Fox J. D. and Bull L. S. // J Anim SCI.- 1981.- V.
52.- P.413-417.
90. Dreher I. Expression of selenoproteins in various rat and human tissues and
cell lines./ Dreher I, Schmutzler C, Jakob F, Köhrle J. // J Trace Elem Med Biol.1997.-V.11(2).-P.83-91.
91. Drewett N. Apoptosis in the anterior pituitary gland of the rat: studies with
estrogen and bromocriptine. / Drewett N, Jacobi JM, Willgoss DA, Lloyd HM:
//Neuroendocrinology .-1993.-V.57.-P. 89-95.
92. Dugrillon A. Iodolactones and iodoaldehydes—mediators of iodine in
thyroid autoregulation. / Dugrillon A.//Exp Clin Endocrinol Diabetes.-1996.-V.104
.-P. - 41–45.
93. Duntas LH. Environmental factors and autoimmune thyroiditis./ Duntas LH.
// Nat Clin Pract Endocrinol Metab.-2008.-V. 4(8).-P.454- 460.
94. Echlin P. Freeze-fracture SEM of Lemna minor L (Duckweed)./ Echlin P.,
Pawley J., Hayes T. //Scanning Electron Microscopy.- 1979.- SEM Inc, AMF
O'Hare.-V.111.-P. 339–350.
240
95. Ejima A. Determination of selenium in the human brain by graphite furnace
atomic absorption spectrometry./ Ejima A. , Chiho W., Hiroshi K., Kyoko M. et
all.// Biol Trace Elem Res .-1996.-V.54(1).-P. 9-21.
96. Ekincia N. The analysis of leiomyoma ta uteri and uterus using energydispersive X-ray fluorescence spectrometry./ Ekincia N., İngeçb M.// Applied
Radiation and Isotopes.- 2008.-V. 66(8).- P. 1117-1122.
97. el-Deiry W.S. WAF1, a potential mediator of p53 tumor suppression./ elDeiry W.S., Tokino T., Velculescu V.E., Levy D.B., et all. // Cell.- 1993.-V.75.-P.
817–825.
98.
Emerson C.H.Serum thyroxine and triiodothyronine concentrations during
iodide treatment of hyperthyroidism./ Emerson CH, Anderson AJ, Howard WJ, et
al. // J Clin Endocrinol Metab.-1975.-V.40.-P.33-36.
99. Emonet N. Thiols and selenium: protective effect on human skin fibroblasts
exposed to UVA radiation. / Emonet N., Leccia M.T., Favier A., Beani J.C., et all.
//J Photochem. Photobiol. B Biol. -1997.-V. 40.-P.84–90.
100. Eskin BA. Iodine metabolism and breast cancer./ Eskin BA. // Trans N Y
Acad Sci. -1970.-V.32.-P. 911–947.
101. Eng PHK. Escape from the acute Wolff-Chaikoff effect is associated with a
decrease in thyroid sodium/iodide symporter messenger ribonucleic acid and
protein./ Eng PHK, Cardona GR, Fang S-L. // Endocrinol.-1999.-V. 140.-P. 34043410.
102. Fisher DA. The importance of early management in optimizing IQ in infants
with congenital hypothyroidism./ Fisher DA. // J Pediatrics.- 2000.- V.136(3).-P.
273-274.
103. Fisher
J.
Extrapolation
of
Hypothalamic-Pituitary-Thyroid
Axis
Perturbations and Associated Toxicity in Rodents to Humans: Case Study with
Perchlorate. Reviews./ Fisher J., Lumen A., Latendresse J., Mattie D.// J
Environmental Science Health, Part C: Environmental Carcinogenesis and
Ecotoxicology.-2012. V. 30(1).-P. 81-105.
241
104. Flohe. L. Glutathione peroxidase: aselenoenzyme./ Flohe. L, Gunzler W,
Schock HH. // FEBS Letters.- 1973.-V. 32.-P.132–134.
105. Flohe. L. Role of selenium in the enzymatic reduction of hydroperoxides./
Flohe. L, Aumann K-D, Steinert P. // Phosphorous Sulfur Silicon.- 1998.-P. 136–
138, P.25–42.
106. Fisher, D. Maturation of thyroid hormone actions/ Delange F, Fisher D,
Glinoer D, Polk D// Research in congenital hypothyroidism, Edition New York:
Plenum Press. – 1988. P. 61–77.
107. Fortier C. Functional interrelationships between the adenohypophysis,
thyroid, adrenal cortex and gonads./ Fortier C, Delgado A, Ducommun P,
Ducommun S, et all.// Can Med Assoc J.- 1970.-V.103(8).-P.864-874.
108. Fragu P. Changes in iodine mapping in rat thyroid during the course of
iodine deficiency: imaging and relative quantitation by analytical ion microscope./
Fragu P., Brian C., Halpern S., Larras-Regard E. // Biol Cell.-1988.-V. 62.-P. 145155.
109. Frisch R E. Carcass components at first estrus of rats on high-fat and low-fat
diets: Body water; protein, and fat./ Frisch R E, Hegsted D M, Yoshinaga K.// Proc.
Natl. Acad. Sci. USA .-1977.-V.74.-P.379-383.
110. Fumarola A. Medical treatment of hyperthyroidism: state of the art./
Fumarola A, Di Fiore A, Dainelli M, Grani G, Calvanese A.
// Exp Clin
Endocrinol Diabetes.- 2010.-V.118 (10).-P.678-84.
111. Ge K. The epidemiology of selenium deficiency in the etiologicalstudy of
endemic diseases in China. / Ge K, Yang G. //Americ J Clin Nutr.-1993.-V. 57.P.259–263.
112. Gladyshev
V.N.
Selenocysteine-containing
proteinsin
mammals./
Gladyshev VN, Hatfield DL. // J Biomed Sci.- 1999.-V. 6.-P.151–160.
113. Goldstein J., Newbury D., Joy D., Echlin C.I.P., Lifshin E., Sawyer L.
Scanning Electron Microscol and X-Ray Microanalysis. 2003. third edition. Kluwer
Academic/Plenum Publishers, New York
242
114. Gopalakrishna R. Selenocompounds induce a redox modulation of protein
kinase C in the cell, compartmentally independent from cytosolic glutathione: its
role in inhibition of tumor promotion. /Gopalakrishna R., Chen Z. H., Gundimeda
U.//Arch. Biochem. Biophys..- 1997.-V.-348.-P.37–48.
115. Greer, M. Yamada T, Iino S. The participation of the nervous system in the
control of thyroid function./ Greer, M. Yamada T, Iino S. // Ann. New York Acad.
SC.-1960.-V. 86.-P. 667-675.
116. Grieken R. Energy-dispersive X-ray spectrometry: present state and trends./
Grieken R. Van, Markowicz A., Török Sz.// Journal of Analytical Chemistry.1986.-V.324(8).-P. 825-831.
117. Guidance Potassium Iodide as a Thyroid Blocking Agent in Radiation
Emergencies U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug
Administration Center for Drug Evaluation and Research (CDER) November
2001Procedural
118. Hall, R. Autoantibodies in iodide goitre and asthma/Hall R, Turner Warwick M, Doniach D.//CZin. Q Exper. Immunol.- 1966.- V.1.- P. 205-211.
119. Halmi N.S. Effect of thiocyanate, stable iodide and perchlorate on the
kinetics of radioiodide transport between thyroid gland and blood of rats./ Halmi
NS, Granner DK, Müller G, Peters BH, Smith BD // Endocrinology/-1960.-V. 67.P.332–336.
120. Hakem R. Differential requirement for caspase 9 in apoptotic pathways in
vivo./ Hakem R, Hakem A, Duncan GS.// Cell.- 1998.-V.94.-P.339–352.
121. Handel M. L. Inhibition of AP-1 binding and transcription by gold and
selenium involving conserved cysteine residues in Jun and Fos ./ Handel M. L.,
Watts C. K., DeFazio A., Day R. O., Sutherland R. L. //Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.
A.- 1995.-V.92.-P.4497–4501.
122. Hansson M. A Monte Carlo (MC) based individual calibration method for in
vivo x-ray fluorescence analysis (XRF). / Hansson M., Isaksson M. //Phys. Med.
Biol. -2007.-V.52.-P. 2009-2019.
243
123. Hansson M. Sample Preparation for in vitro Analysis of Iodine in Thyroid
Tissue using X-ray Fluorescence./ Hansson M., Isaksson M., Gertrud B.// Cancer
Informatics .- 2008.-V.6.-P. 51-57.
124. Hansson M. Iodine content and distribution in extratumoral and tumor
thyroid tissue analyzed with X-ray fluorescence and time-of-flight secondary ion
mass spectrometry./ M. Hansson, T. Grunditz, M. Isaksson et al.//Thyroid.- 2008.V.18(11).-P.1215–1220
125. Hansson M. Iodine Content and Distribution in Thyroid Specimens from
Two Patients with Graves' Disease Pretreated with Either Propylthiouracil or Stable
Iodine: Analysis Using X-Ray Fluorescence and Time-of-Flight Secondary Ion
Mass Spectrometry/ Hansson M., Nyström H., Jansson S., Lausmaa J. //Case
Reports in Endocrinology.- 2012.-V.2012.-P.1 – 5.
126. Harris C.A. Evaluation of potassium iodide (KI) and ammonium perchlorate
(NH4ClO4) to ameliorate 131I- exposure in the rat./ Harris CA, Fisher JW, Rollor
EA 3rd, Ferguson DC, Blount BC// J Toxicol Environ Health .- 2009.-V.72(14).P.909-1014.
127. Hänscheid
H.
Facing
the
nuclear
threat:
thyroid
blocking
revisited./Hänscheid H, Reiners C, Goulko G, Luster M, Schneider-Ludorff M,
Buck AK, Lassmann M.// J Clin Endocrinol Metab. -2011.- V.96(11).-P.35113516.
128. Heninger R. Iodine-containing compounds of extra-thyroidal tissues./
Heninger R., Larson F., Albright E.// J clin invest.- 1963.-V.42.-P. 1761-1768.
129. Holt A. Comparative aspects of brain growth: a critical evaluation of
mammalian species used in brain growth research with emphasis on the Tammar
wallaby/ Holt A, Renfree M, Chek D, Hetzel B, Smith R// Fetal brain disorders.
Recent approaches to the problem of mental deficiency., Edition Amsterdam:
Elsevier/North Holland. 1981.–P.17– 43.
130. Holt D. Amiodarone pharmacokinetics. / Holt D.W., Tucker G.T., Jackson
P.R., Storey G.C. //Am Heart J.- 1983.-V.106.-P. 843-847
244
131. Honma K. Potassium iodide inhibits neutrophil chemotaxis./ Honma K, Saga
K, Onodera H, Takahashi M. // Acta DermVenereol. -1990.-V.70.-P.247-249.
132. Ierbasi G. Acute effects of amiodarone administration on thyroid function in
patients with cardiac arrhythmia./ Ierbasi G, Clerco A, Bonini R, Manferedi C, et
all..//J Clin Endocrinol Metab.- 1997.-V. 82.-P. 275-280.
133. Jacob P. et al. Thyroid cancer risk to children calculated./ Jacob P. et al. //
Nature.-1998.-V. 392.-P. 31–32.
134. Jaita G. Gonadal steroids modulate Fas-induced apoptosis of lactotropes and
somatotropes. / Jaita G, Zarate S, Ferrari L, Radl D, Ferraris J, Eijo G, Zaldivar V,
Pisera D,Seilicovich A. //Endocrine.-2011.-V. 39.-P. 21-27.
135. Jhiang SM. An immunohistochemical study of Na+/I- symporter in human
thyroid tissues and salivary gland tissues. / Jhiang SM, Cho J-Y, Ryu K-Y.
//Endocrinology.- 1998.-V.139(10).-P.4416-4419.
136. Joba W, Spitzweg C, Schriever K, Heufelder AE. Analysis of human
sodium/iodide symporter, thyroid transcription factor-1, and paired-box-protein-8
gene expression in benign thyroid diseases. Thyroid 1999,9: 455-466
137. Kanno J. Tumor-promoting effects of both iodine deficiency and iodine
excess in the rat thyroid./ Kanno J, Onodera H, Furuta K. // Toxicol. Pathol.- 1992.V.20.-P.226-235.
138. Kato N. Suppressive effect of iodine preparations on proliferation of
DMBA-induced breast cancer in rat./ Kato N, Funahashi H, Ando K, Takagi H. // J
Jpn Soc Cancer Ther.-1994.-V. 29.-P. 582–588.
139. Kazakov, V.S. et al. Thyroid cancer after Chernobyl./ Kazakov, V.S. et al
//Nature.-1992.-V.359.-P.:21–22.
140. Kerr J. Apoptosis a basic biological phenomenon with wide ranging
implications in tissue kinetics./ Kerr JFK, Wylhe AH, Curne AR // Br J Cancer.1972.-V.2.-P. 239-257.
141. Khan A.H. The status of trace and minor elements in some Bangladeshi
foodstuffs./ Khan A.H, Tarafdar S.A, Ali M., Biswas S.K., et all. // J. Radional.
Nucl. Chem. -1989.- V. 134(2).- P. 367-381.
245
142. Kilbane M. Tissue iodine content and serum-mediated 125I uptake-blocking
activity in breast cancer./ Kilbane M, Ajjan R, Weetman A // J Clin Endocrinol
Metab.- 2000.-V.85.-P. 1245-1250.
143. Kim I. Y., Stadtman T. C. Inhibition of NF-kappaB DNA binding and nitric
oxide induction in human T cells and lung adenocarcinoma cells by selenite
treatment./Kim I.Y., Stadtman T.C.// Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. -1997.-V.94.P.12904–12907.
144. Ko.hrle J. Selenium in biology: facts and medical perspectives./ Ko.hrle J,
Brigelius-Flohe R, Bo.ck A, Gartner R, et all.// Biol Chem.- 2000.-V.381.-P.849–
864.
145. Köhrle J. Selenium, the Thyroid, and the Endocrine System./ Köhrle J. , F.
Jakob, B. Contempré and J. E. Dumont. // Endocrine Reviews.- 2005.-V. 26(7).-P.
944-984.
146. Ko.hrle J. Selenium and thyroid./ Ko.hrle J., Ga.rtner R.// Best Practice
Research Clinical Endocrinology Metabolism.- 2009.-V.23.-P. 815–827.
147. Kryukov G.V. Characterization of mammalian selenoproteomes./ Kryukov
GV, Castellano S, Novoselov SV, Lobanov AV, et all. // Science.- 2003.-V.300.P.1439–1443.
148. Kogai T. Regulation of thyroid-stimulating hormone of sodium/iodide
symporter gene expression and protein levels in FRTL-5 cells./ Kogai T, Endo T,
Saito T, Miyazaki A, Kawaguchi A, Onaya T. // Endocrinology.- 1997.-V.138.P.2227-2232.
149. Kogai T. Retinoic acid induces sodium/iodide symporter gene expression
and radioiodide uptake in the MCF-7 breast cancer cell line./ Kogai T, Schultz J,
Johnson L, Huang M, Brent G. // Proc Natl Acad Sci, USA.- 2000.-V. 97.-P. 85198524.
150. Kogai T. Enhancement of sodium/iodide symporter expression in thyroid
and breast cancer./ Kogai T, Taki K, Brent GA. // Endocr Relat Cancer.- 2006.V.3.-P.797-826.
246
151. Ko.hrle J. Selenium, the Thyroid, and the Endocrine System./ Ko.hrle J.,
Jakob F., Contempre B., Dumont J. E.//Endocr. Rev.-2005.-V.26(7).-P.944–984.
152. Langer P. Fluctuation of Thyroid Function Following a Single and Repeated
Administration of Antithyroid Drugs./ Langer P.// Endocrinol.-1968.-V.83(6).P.1268-1272.
153. Langer R. Influence of iodide and iodolactones on thyroid apoptosis:
Evidence that apoptosis induced by iodide is mediated by lodolactones in intact
porcine thyroid follicles./ Langer R., Burzler C, Bechtner G, Gartner R. // Exper
Clin Endocrinol Diab.- 2003.-V.111.-P. 325-329.
154. Lehmann P. Dose-Related Influence of Sodium Selenite on Apoptosis in
Human Thyroid Follicles In Vitro Induced by Iodine, EGF, TGF, and H2O2./
Lehmann P., Rank P., Hallfeldt K. L. J., Krebs B., Gartner R. // Biological Trace
Element Research.- 2006.-V. 112.-P. 119 – 130.
155. Legrand J. Effects of thyroid hormones on Central Nervous System/
Legrand J, Yanai J // Neurobehavioral Teratology, Edition Amsterdam: Elsevier
Science Publishers. 1984.– 331 – 363.
156. Leoni SG. Regulation of thyroid oxidative state by thioredoxin reductase has
a crucial role in thyroid responses to iodide excess./ Leoni SG, Kimura ET,
Santisteban P, De la Vieja A// Mol. Endocrinol.-2011.-V.25(11).-P.1924-1935.
157. Leung A. Role of iodine in thyroid physiology. Review./ Leung A., Pearce
E.N., Braverman L.E.// Expert Review of Endocrinology & Metabolism.- 2010.-V.
5 (4).-P. 593-602.
158. Levander OA. Selenium. In: Mertz W, ed. Trace elements in human and
animalnutrition. 5th ed. Orlando, FL, Academic Press.- 1986.-pp.209–279.
159. Li Jin-ru. Histological Study on TSH Cells of Postnatal Rats with Iodine
Excess/ Jin-ru Li, Zheng Li-na, Liu Hao, Liu Jin-bao//Chin J Comparat Medic.2007.-V.7.-P.390 -392.
160. Li G.Y. Oxidative-induced apoptosis to an immortalized ganglion cell line is
caspase independent but involves the activation of poly(ADP-ribose)polymerase
247
and apoptosis-inducing factor./ Li GY, Osborne NN // Brain Res.-2008.-V. 188.-P.
35–43.
161. .Li Q. Effect of iodine source and dose on growth and iodine content in
tissue and plasma thyroid hormones in fattening pigs./ Li Q, Mair C, Schedle K,
Hammerl S, Schodl K, Windisch W.// Eur. J. Nutr.-2012.-V. 51(6).-P.685-691.
162. Liu C. Antisense oligonucleotide targeting Livin induces apoptosis of
human bladder cancer cell via a mechanism involving caspase 3./ Liu C, Wu X,
Luo C, et al // J Exp Clin Cancer Res.- 2010.-V. 29.-P. 63-71.
163. Liu Z., Xing M. Induction of sodium/iodide symporter (NIS) expression and
radioiodine uptake in non-thyroid cancer cells./ Liu Z, Xing M //. 2012;7(2).-P.317329.
164. Lopez P.L. In vitro uptake of selenium-75 by red blood cells from the
immature ovine during varying selenium intakes./ Lopez PL, Preston RL, Pfander
WH. // J Nutr. -1968.-V.94 (2).-P.219-226.
165. Majerus PM. Susceptibility of Candida albicans to peroxidase-catalyzed
oxidation products of thiocyanate, iodide and bromide./ Majerus PM, Courtois PA
// J Biol Buccale .-1992.-V.20.-P. 241–245.
166. Mandell R.B. Radioisotope concentrator gene therapy using the
sodium/iodide symporter gene./ Mandell RB, Mandell LZ, Link CJ. // Cancer Res.1999.-V. 59.-P.661-668.
167. Marcou K. Iodin-induced hypothyroidism. /Marcou K., Georgopoulos N.,
Kyriaazopoulou V., Vagenakis A.G.//Thyroid.-2001. -V. 11(5). - P. 501 - 510.
168. Marković L Hormones of Thyroid Gland in Sera of Rats Treated with
Different Dose of Concentrated Potassium Iodine Solutions /Marković L., Vučinić
V., Aritonović J.//Spr.Arh.Celok.Lek.-2010.-V.138(5-6).-P.323-327.
169. Martin S.Protease activation during apoptosis: death by a thousand cuts?/
Martin SJ, Green DR. // Cell.-1995.-V.82.-P.349–352.
170. Matsumura H. Inhibition of sleep in rats by inorganic selenium compounds,
inhibitors of prostaglandin D synthase. / Matsumura H., Takahata R., Hayaishi O.
//Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.-1991.-V.88.-P.9046–9050.
248
171. Matsuzaki S. Anti-goitrous effect of lecithin-bound iodine in propilthiouracil
treated rats./ Matsuzaki S., Hong - Tao MA, Burikhanov R.B.// Endocrine
Regulation.- 2000.-V. 34.-P. 57-63.
172. McClendon J. An attempt to explain the anomalous action of Lugol’s
solution in exophthalmic goiter./ McClendon J., Foster W., Cavett J.//
Endocrinology .-1948.-V. 42.-P. 168-173.
173. McKeehan W. Selenium is an essential trace nutrient for growth of WI-38
diploid human fibroblasts ./ McKeehan W. L.,Hamilton W. G.,Ham R. G.//Proc.
Natl. Acad. Sci. U. S. A.-1976.-V.73.-P.2023–2027.
174. McConnel K. Distribution of selenium in serum proteins and blood cells
after subcutaneous injection of sodium selenate containing
radioselenium. /
McConnel K.P.L., Cooper B.J.//Biol. Chem.-1950.-P.459-466.
175. McConnel K. Selenium Levels in Human Blood and Tissues in Health and
in Disease./ McConnel K.P.L., Broghamer W.L., JR., Blotsky A.J., Hurtaj O.J.
//Nutr.-1975-P.1026-1031.
176. Meck R.A. Criteria for the administration of KI for thyroid blocking of
radioiodine. /Meck RA, Chen MS, Kenny PJ.//Health Phys.-1985.-V.48(2).-P.141157.
177. Mitsuma T. Organ distribution of iodide transporter ( symporter) in the rat.
Immunohistochemical study. / Mitsuma T., Rhue N., Hirooka Y., Kayama M.,
Yokoi Y., Mory Y., Ping J., Adachi K., Wago T., Ohtake M., Takagi J., Nogimari
T., Sakai J.//Endocrine Regulations.- 1997.-V.31.-P. 15-18.
178. Miyachi Y. Effects of potassium iodide, colchicine and dapsone on the
generation of polymorphonuclear leukocyte-derived oxygen intermediates./
Miyachi Y, Niwa Y.// Br J Dermatol.-1982.-V.107.-P.209-214.
179. Monney L. Defects in the ubiquitin pathway induce caspase-independent
apoptosis blocked by Bcl-2./ Monney L, Oter R, Olivier HL, //J Biol Chem.-1998.V.273.-P.-6121–6131.
180. Morreale de Escobar G. Thyroid hormone and the developing brain/
Morreale de Escobar G, Escobar del Rey F, Ruiz–Marcos A, Dussault J, Walker P
249
// Congenital Hypothyroidism, Edition New York: Marcel Decker, Inc. 1983. – 85
– 126
181. Morreale de Escobar G. Thyroid physiology in utero and neonatally
(review)./ Morreale de Escobar G., Escobar Del Rey F. // In: Rubery, E.D. ,Smales,
E., ed. Iodine prophylaxis following nuclear accidents.Proceedings of a joint
WHO/CEC Workshop, July 1988. Oxford,Pergamon Press, 1990, pp. 3–32.
182. Mutaku J. Cell necrosis and apoptosis are differentially regulated during
goiter development and iodine-induced involution./ Mutaku J F, Poma1 J-F, Many
M-C, Denef J-F , van den Hove M-F.// Journal of Endocrinology .-2002.-V.172.-P.
375–386.
183. Nakabayashi H. Immunohistochemical Analyses of Cell Cycle-related
Proteins, Apoptosis, and Proliferation in Pituitary Adenomas./ Nakabayashi H,
Sunada I, Hara M.// J Histochem Cytochem.-2001.-V.49.-P. 1193-1194.
184. Nagataki S. Iodine: Metabolism and Pharmacology. Pharmacotherapeutics
of the Thyroid Gland./ Nagataki S., Yokoyama N.// Handbook of Experimental
Pharmacology.-1997.-V.128.-Р.171-188.
185. Namba H. Evidence of thyroid volume increase in normal subjects receiving
excess iodide./ Namba H, Yamashita S, Kimura H, et al: // J Clin Endocriol Metab.1993.-V.76.-P.605–608.
186. Nauman J. Iodine prophylaxis in Poland after the Chernobyl reactor
accident: benefits and risk. /Nauman J., Wolff J. // American journal of medicine.1993.-V. 94.-P. 524–532.
187. Nolan
L.
Adrenalectomized
Temporally
Rat
Sensitive
Anterior
Trophic
Pituitary
to
Responsiveness
Dexamethasone
of
the
Challenge:
Relationship between Mitotic Activity and Apoptotic Sensitivity. / Nolan L, Levy
A//Endocrinology.-2002.-V.144.-P. 212–219.
188. Nolan L. Pituitary mitosis and apoptotic
responsiveness following
adrenalectomy are independent of hypothalamic paraventricular nucleus CRH
input./ Nolan L, Thomas C, Levy A.// J Endocrinol.-2004.-V. 181.-P.521–529.
250
189. Nollet L. Handbook of dairy food analysis / Ed. by L.Nollet, F. Toldra. CRC
Press, 2009. 918 р
190. Oravec S. Disorders of thyroid function and fertility disorders ./ Oravec S.
Hlavascka S. //Ceska Gynecol.-2000.- V.65(1).-P.53-57.
191. Park H.
Selenite Negatively Regulates Caspase-3 through a Redox
Mechanism. / Park H. , Huh S., Kim Y., Shim J., et all. // J Biol Chem.- 2000.-V.
275.-P. 8487-8491.
192. Pavel J. Determination of iodine in biological materials and in some
standard reference materials by X-ray fluorescence spectrometry ./ Pavel J., Fille
M., Frey U. //Anal Chem .-1988.-V. 331.-P.51 -54.
193. Pearce EN. Hyperthyroidism: advantages and disadvantages of medical
therapy ./ Pearce E.N., Braderman L.E.// Surg Clin North Am.- 2004.-V.84.-P. 833
– 847.
194. Pedraza, P, Mechanisms of Adaptation to Iodine Deficiency in Rats:Thyroid
Status Is Tissue Specific. Its Relevance for Man/ Pedraza P, Obregon M, EscobarMorreale H, del Rey F, de Escobar G// Endocrinol. – 2006. – V.147(5). – P.2098 –
2108.
195. Penel C. Thyroid autoregulation: impact on thyroid structure and function in
rats./ Penel C, Rognoni JB, Bastiani P // Am J Physiol .-1987.-V.253.-P.165–172.
196. Poliandri A. Cadmium induces apoptosis in anterior pituitary cells that can
be reversed by treatment with antioxidants./ Poliandri A, Cabilla J, Velardez M,
Bodo C, Duvilanski B. // Toxicol Appl Pharmacol.-2003.-V.190.-P. 17-24.
197. Preedy V, Burrow G, Watson R editors, Comprehensive Handbook of
Iodine. 1 ed. Academic Press, Incorporated.- 2009.- pp.1334.
198. Rafferty T. S. Differential expression of selenoproteins by human skin cells
and protection by selenium from UVB-radiation-induced cell death. / Rafferty T. S,
McKenzie R. C., Hunter J. A., Howie A. F.et all.//Biochem J. -1998.-V. 332.P.231–236.
199. Rao R.H. Iodine kinetic studies during amiodarone treatment./ Rao RH,
McReady VR, Spathis GS. // J Clin Endocrinol Metab.- 1986.-V. 62.-P. 563-567.
251
200. Redmond G.P. Thyroid dysfunction and womens reproductive health./
Redmond G.P. // Thyroid.- 2004.-V.5.-P.5-15.
201. Recommendation of the German Commission on Radiological Protection
(Use of Iodine Tablets for Thyroid Blocking in the Event of a Nuclear Accident).
Adopted at the 247th session of the German Commission on Radiological
Protection,24/25, February, 2011
202. Riedel C. Post-transcriptional regulation of the sodium/iodide symporter
(NIS) by thyrotropin./ Riedel C., Levy O., Carrasco N. // J Biol Chem.- 2001.-V.
276.-P. 21458-21463.
203. Robinson WL. Determination of iodine concentration and distribution in rat
thyroid follicles by electron- probe microanalysis./ Robinson WL, Davis D.//J Cell
Biol.-1969.-V.- 43.-P.-: 115 – 122 .
204. Rognoni J.B. Critical analysis of the glutaraldehyde fixation of the thyroid
gland : a double labeling experiment./ Rognoni J.B., Simon C. // J Microsc.-1974.V. 21.-P.119-128. .
205. Rose NR. Iodine: an environmental trigger of thyroiditis./ Rose NR, Bonita
R, Burek CL.// Autoimmun Rev.- 2002.- V.1(12).-P.97-110.
206. Ron E. Thyroid cancer after exposure to external radiation: a pooled analysis
of seven studies./ Ron E. et al.//Radiation research.-1995.-V. 141.-P. 259–277.
207. Roti E. Iodine-induced hypothyroidism in euthyroid subjects with a previous
episode of subacute thyroiditis./ Roti E, Minelli R, Gardini E, Bianconi L,
Braverman LE.// J Clin Endocrinol Metab.-1990.- V.70(6).-P.1581–1585.
208. Roti E. Effects of excess iodine: clinical aspects./ Roti E., Vagenakis A.G.
In: Braverman L.E., Utiger R.D., editors. Werner's and Ingbar's// The Thyroid.
Philadelphia: Lippinpott-Raven.- 2000.- P.316-329.
209. Rotruck J.Selenium: biochemical role as a component ofglutathione
peroxidase./ Rotruck JT, Pope AL, Ganther HE, Swanson AB, et all.// Science.1973.-V. 179.-P.588–590.
252
210. Roy G. Thyroid hormone synthesis and anti-thyroid drugs: A bioinorganic
chemistry approach / Roy G., Mugesh G.//J. Chem. Sci..-2006.-V.118( 6).-Р. 619–
625.
211. Rubery ED. Practical Aspects of Prophylactic Stable Iodine Usage. / Rubery
E, Smales E.// Iodine Prophylaxis Following Nuclear Accidents: Proceedings of a
Joint WHO/CEC Workshop. Oxford, Pergamon Press.-1990.-P. 141-150.
212. Rillema JA. Characteristics of the prolactin stimulation of iodide uptake into
mouse mammary gland explants./ Rillema JA, Rowady DL // Proc Soc Exp Biol
Med .-1997.-V.215.-P. 366–399.
213. Saaranen M., Selenium in reproductive organs, seminal fluid and serum of
men and bulls./ Saaranen M., Suistomaa U., Kantola M., Remes E. et all. // Hum.
Reprod.-1986.-V.1(2).-P.61-64.
214. Saito T, Endo T, Kawaguchi A, et al, Increased expression of the Na+/Isymporter in cultured human thyroid cells exposed to thyrotropin and in Graves'
thyroid tissue./ Saito T, Endo T, Kawaguchi A, et al.// J Clin Endocrinol Metab.1997.-V. 82.-P. 3331-3336.
215. Safran M., Fang S., Bamaini G/, Pinchera A. Effects of amiodarone and
desethylamiodarone on pituitary deiodinase activity and thyrotropin secretion in the
rat. / Safran M., Fang S., Bamaini G/, Pinchera A. //Am J Med Sci.-1986.-V. 29.-P.
136-141.
216. Sanmarti A., Permanver-Miralda G., Castallanos J.M. et all. Chronic
administration of amiodarone and thyroid function: a follow-up study. / Sanmarti
A., Permanver-Miralda G., Castallanos J.M. et all.//Am Heart J.- 1984.-V. 108.-P.
1262- 1268.
217. Seaborn T. Protective Effects of Pituitary Adenylate Cyclase-Activating
Polypeptide (PACAP) Against Apoptosis./ Seaborn T, Masmoudi-Kouli O,
Fournier A, Vaudry H, Vaudry D. // Curr Pharm Des.- 2011.-V. 17(3).-P.204-14..
218. Schaaf C. Curcumin Inhibits the Growth, Induces Apoptosis and Modulates
the Function of Pituitary Folliculostellate Cells./ Schaaf C, Shan B, Onofri C, Stalla
253
G, Arzt E, Schilling T, Perone M, Renner U. // Neuroendocrinology.-2010.-V. 91.P. 200-210.
219. Schmutzler C. Selenoproteins of the thyroid gland: expression, localization
and possible function of glutathione peroxidase 3./ Schmutzler C, Mentrup B,
Schomburg L et al.// Biological Chemistry .-2007.-V.388(10).-P. 1053–1059.
220. Schomburg L. On the importance of selenium and iodine metabolism for
thyroid hormone biosynthesis and human health. / Schomburg L., Ko.hrle J.
//Molecular Nutrition & Food Research.- 2008.-V. 52(11).-P. 1235–1246.
221. Shennan DB Selenium (selenate) transport by human placental brush border
membrane vesicles./ Shennan DB//Br J Nutr.-1988.-V.59(1).-P.13-19.
222. Shrivastava, A. Molecular iodine induces caspase-independent apoptosis in
human
breast
carcinoma
cells
involvingthe
mitochondria-mediated
pathway/Shrivastava A, Tiwari M, Sinha A, Kumar A, et all.//J Biol Chem .-2006.V.281.-P., 19762–19771.
223. Silva J. Effects of Hypo- and Hyperthyroidism on Proliferation,
Angiogenesis, Apoptosis and Expression of COX-2 in the Corpus Luteum of
Female Rats. /Silva J, Ocarino N, Vieira A, Nascimento E, Serakides R. // Reprod
Domest Anim.-2013 .-V.48(4).-P.691-698.
224. Slominski A., Expression of Hypothalamic–Pituitary–Thyroid Axis Related
Genes in the Human Skin /Slominski A, Wortsman J., Kohn L, Ain K.,
Venkataraman G., et all. //Journal of Investigative Dermatology.-2002.-V.119.P.1449–1455.
225. Smanik P.A. Cloning of the human sodium iodide symporter./ Smanik PA,
Liu Q, Furminger TL, et al.// Biochem Biophys Res Commun .-1996.-V.226.-P.
339-345.
226. Smerdely P. Evidence that inhibitory effects of iodide on thyroid cell
proliferation are due to arrest of the cell cycle at G0G1 and G2M phases./ Smerdely
P, Pitsiavas V, Boyages S. // Endocrinology.-1993.-V. 133.-P.2881–2888.
254
227. Smirnova I. O. Luteinization of follicle cysts in rat ovaries as an effect of
potassium iodine administration./ Smirnova I. O. //Byulleten' Éksperimental'noi
Biologii i Meditsiny.- 1964.-V.57(5).-P. 615-619.
228. Spallek L. Adverse effects of iodine thyroid blocking. A systematic review/
Spallek L. ,L. Krille,C. Reiners,R. Schneider,S. Yamashita and H. Zeeb//Radiat
Prot Dosimetry. – 2012 . –V.150(3). – P.267-277.
229. Spitzweg C. Analysis of human sodium iodide symporter gene expression in
extrathyroidal tissues and cloning of its complementary deoxyribonucleic acids
from salivary gland, mammary gland, and gastric mucosa./ Spitzweg C, Joba W,
Eisenmenger W, Heufelder AE, // J Clin Endocrinol Metab.- 1998.-V.83.-P. 17461751.
230. Spitzweg C. Expression of the sodium iodide symporter in human kidney./
Spitzweg C, Dutton CM, Castro MR, et al, // Kidney Int.- 2001.-V. 59.-P.10131023.
231. Spitzweg C. Sodium Iodide Symporter (NIS) and Thyroid./ Spitzweg
Christine, Morris John C.// Hormones.- 2002.-V.1(1).-P.22-34.
232. Stevens C.D. The Distribution of Radioactive Iodine in Rats With and
Without Walker Tumor 256 After Injection of Radioactive Sodium Iodide./ Stevens
C.D., Stewart P.H., Quinlin P.M., et al.//. Cancer Res.- 1949.-V.9.-P.488-497.
233. Strum JM. Site of iodination in rat mamary gland./ Strum JM. // Anat Rec.1978.-V.192.-P.235–244.
234. Strum J M. Resting human female breast tissue produces iodinated proteins./
Strum JM, Phelps PC, McAtee MM.//J Ultrastruc Res.- 1983.-V.84.-P.130–139.
235. Sukumari-Ramesh S. Anacardic acid induces caspase-independent apoptosis
and radiosensitizes pituitary adenoma cells./ Sukumari-Ramesh S, Singh N, Jensen
MA, Dhandapani KM, Vender JR. // J Neurosurg .- 2011.-V. 114(6).-P.1681-1690.
236. Tagliati F. Magmas, a gene newly identified as overexpressed in human and
mouse ACTH-secreting pituitary adenomas, protects pituitary cells from apoptotic
stimuli./ Tagliati F, Gentilin E, Buratto M, Mole D, degli Uberti EC, Zatelli MC. //
Endocrinology .-2010.-V.151.-P. 4635-4642.
255
237. Tadros T.G. The iodine concentration in benign and malignant thyroid
nodules measured by X-ray fluorescence. / Tadros TG, Maisey MN, Ng Tang Fui
SC, Turner PC. //Br J Radiol.- 1981.-V.54(643).-P.626-629.
238. Taurog A. Thyroid peroxidase-catalyzed iodination of thyroglobulin;
inhibition by excess iodide./ Taurog A. //Arch Biochem Biophys.- 1970.-V.
139(1).-P.212-20.
239. Tazebay UH. The mammary gland iodide transporter is expressed during
lactation and in breast cancer./ Tazebay UH, Wapnir IL, Levy O, et al.// Nat Med.2000.-V.6.-P. 871-878.
240. Teng XC. A study on the mechanism of iodineinduced thyroid epithelial cell
injury in the induction of autoimmune thyroiditis. /Teng XC, Man N, Shan ZY, Fan
CL, Wang H, Guo R, et al.// Zhonghua Nei Ke Za Zhi.-2008.-V. 47(3).-P.19-36.
241. Thorlacius-Ussing O. Selenium in the anterior pituitary of the rat after a
single injection of 75Se sodium selenite./ Thorlacius-Ussing O, Jensen F.// Biol
Trace Elem Res.-1988.-V. 15.-P. 277-287.
242. Tochner ZA, Glatstein E, "Chapter 216: Radiation Bioterrorism," in
Harrison's Principles of Internal Medicine, 17th Edition, Fauci AS, Longo DL,
Kasper DL, Braunwald E, Jameson JL, Loscalzo J, Hauser SL, eds., pp. 1358-1364,
McGraw Hill, 2008.
243. Turakulov I.K. Effect of potassium iodide and perchlorate on the process of
thyroid hormone secretion / Turakulov I.K., Salakhova N.S., Tashkhodzhaeva
T.P., Mirmakhmudova S.I., Mullagalieva N.M. //Biull Eksp Biol Med..-1978.V.86(12).-P.653-655.
244. Torres-Mendonza BM. Effect of potassium iodide on the immune response
in the sporotrichosis./ Torres-Mendonza BM, Vásquez-Valls E, GonzálezMendonza A. // Rev Iberoam Micol.-1997.-V.14.-P.98-100.
245. Thornberry N.A. Caspases. Enemies within./ Thornberry NA, Lazebnik Y //
Science..- 1998.-V.281.-P.1241–1404.
256
246. Thorlacius-Ussing O. Selenium in the anterior pituitary of the rat after a
single injection of 75Se sodium selenite./ Thorlacius-Ussing O, Jensen FT. // Biol
Trace Elem Res.-1988.-V.15.-P.277-287.
247. Thorlacius-Ussing O. The concentration of twelve elements in the anterior
pituitary from human subjects and rats as measured by particle induced X-ray
emission (PIXE) ./ Thorlacius-Ussing O., Gregersen M. , Hertel N. // Biol Trace
Elem Res..-1988.- V.- 16(3).-P. 189-202.
248. Trotter W. The relative toxicity of antithyroid drugs. / Trotter W.R. //J New
Drugs.-1962.-V.2.-P.333–343.
249. Turakulov I.K. Effect of potassium iodide and perchlorate on the process of
thyroid hormone secretion /Turakulov I.K., Salakhova N.S.,Tashkhodzhaeva
T.P.,Mirmakhmudova S.I.,Mullagalieva N.M. //Biull Eksp Biol Med..-1978.V.86(12).-P.653-655.
250. Uson S. Validation of ED-XRF as a reliable method for determining the
mineral composition of skim milk powders. / Uson S., Immoos C., Jimenez-Flores
R. // J. Dairy. Sci. Suppl.- 2006.- V. 89(1).- P. 177–178.
251. Valenta L.J. Acute effects of iodine on the stimulated rat thyroid./ Valenta
LJ, Florsheim WC, Sharma BS. // Endocrinology. -1982.-V. 111(5).-P.1721-1727.
252. Vanbeeren H., Bakker O., Wiersinga W. Desethylamiodarone is a
competitive inhibitor of the binding of thyroid hormone to the thyroid hormone
alpha-1 receptor protein. Mol Cell Endocrinol 1995; 112: 15-19.
253. Van Rees G.P. Influence of Thyroidectomy with and without Thyroxine
Treatment on Thyrotrophin Secretion in Gonadectomized Rats with Anterior
Hypothalamic Lesions / Van Rees G.P., Moll J.//Neuroendocrinology.- 1968.-V.3.P.115–126.
254. Vanhoe H. Effect of solvent type on the determination of total iodine in milk
powder and human serum by inductively coupled plasma mass spectrometry./
Vanhoe H, Van Allemeersch F, Versieck J, Dams R.// Analyst.-1993.-V.118(8).P.1015-1019.
257
255. Vitale M. Iodide Excess Induces Apoptosis in Thyroid Cells through a p53Independent Mechanism Involving Oxidative Stress./ Vitale M., Matola T. Di.,
D’Ascoli F., Salzano S. et all.// Endocrinology.-2000.- V. 141(2).-P.598-605.
256. Verger P. Iodine kinetics and effectiveness of stable iodine prophylaxis after
intake of radioactive iodine: a review./Verger P.// Thyroid. – 2001.- V.11(4).P.353-360.
257. Versieck J. Vitamin and mineral requirements in human nutrition. Trace
elements in human plasma or serum./ Versieck J, Cornelis R. // Boca Raton, FL,
CRC Press, -1989.-pp.124.
258. Wilson R.The effect of pre-operative potassium iodide therapy on antibody
production./ Wilson R, McKillop JH, Thomson JA.// Acta Endocrinol (Copenh).1990.-V.123(5).-P.531-534.
259. Waterhouse N.J. Calpain activation is upstream of caspases in radiationinduced apoptosis./ Waterhouse NJ, Finucane DM, Green DR, et al.//Cell Death
Differ.-1998.-V5.-P.1051–1061.
260. Wilson R, McKillop JH, Thomson JA. The effect of pre-operative potassium
iodide therapy on antibody production./ Wilson R, McKillop JH, Thomson JA. //
Acta Endocrinol (Copenh).-1990.-V.123(5).-P.531-534.
261. Wynford-Thomas D. Goitrogen-induced thyroid growth in the rat: A
quantitative morphometric study./ Wynford-Thomas D, Stringer BM, Williams
ED.// J Endocrinol .-1982.-V.94.-P.131–140.
262. Wollman S.H. Histologic changes in tissue components of the hyperplastic
thyroid gland during its involution in the rat./ Wollman SH, Herverg JD, Tachiwaki
D. Am J Anat.- 1990.-V.198.-P.35–44.
263. Wolff J. Perchlorate and the Thyroid Gland./ Wolff J.// Pharmacological
Reviews .- 1998.-V. 50(1).-P.89-106.
264. Wolff J. Plasma inorganic iodide as a homeostatic regulator of thyroid
function./ Wolff J, Chaikoff I.// J Biol Chem.-1948.-V. 174.-P. 555-564.
265. Wolff J. Iodide Goiter and the Pharmacologic Effects of Excess
Iodide/Wolff J // Americ J Medic. 1969. – V.47. – P.101–124.
258
266. Wolffram S. In Vivo Intestinal Absorption of Selenate and Selenite by
Rats1. / Wolffram S, Ardaserand F., Scharrer E.. //Nutr.-1985.-V.9.-P.454-462.
267. Yen S.S. Neuroendocrinology of reproduction. Reproductive endocrinology.
Philadelfia:WB Saunders.-1999.-pp.857.
268. Yu R. Proteasome inhibitors induce apoptosis in growth hormone- and
prolactin-secreting rat pituitary tumor cells. / Yu R, Ren S-G, Melmed S. //J
Endocrinol.-2002.-V. 174.-P. 379–386.
269. Zaichick V. Determination of the natural level of human intra-thyroid iodine
by instrumental neutron activation analysis ./Ye. Zaichick V., Ya. Choporov
Yu.//Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry.- 1996.-V.- 207(1).-P. 153161.
270. Zaldivar V. Estradiol increases the expression of TNF-α and TNF receptor 1
in lactotropes. / Zaldivar V, Magri ML, Zarate S, Jaita G, Eijo G, Radl D, Ferraris
J, Pisera D, Seilicovich A: //Neuroendocrinology.-2011.-V. 93.-P. 106-113.
271. Zhang L. S. Nonradioactive Iodide Effectively Induces Apoptosis in
Genetically Modified Lung Cancer Cells./ Zhang. L, Sharma S., Zhu Li X., Kogai
T., et all.//Cancer Reserch.-2003.-V.63.-P. 5065–5072.
259
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа