close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Предметы;pdf

код для вставкиСкачать
ФГБОУ ВПО
«Кубанский государственный аграрный университет»
Кафедра биотехнологии, биохимии и биофизики
Рабочая тетрадь
по биофизике для студентов
агрономических специальностей
Студент ____________________________
Академическая группа ________________
Краснодар 2014
Рабочая тетрадь по биофизике для студентов агрономических специальностей / сост.. – Г.А. Плутахин, Н.Л. Мачнева, Л.М. Кораблева
Краснодар: Кубанский ГАУ, 2014. – 29 с.
Рабочая тетрадь по биофизике для студентов агрономических специальностей
Рецензенты:
доктор ф-м.н., профессор Н. М. Богатов
доктор м.н., профессор П. В. Нефедов
Оглавление
Некоторые опонятия ......................................................................................................... 4
Лабораторная работа № 1
Как выполнить и оформить лабораторную работу ........................................................ 5
Лабораторная работа № 2
Изучение образования мембранного потенциала на ионоселективной мембране...... 9
Лабораторная работа № 3
Получение дисперсионной кривой клубня картофеля ................................................ 13
Лабораторная работа № 4
Получение спектра поглощения спиртового экстракта хлорофилла ......................... 17
Лабораторная работа № 5
Получение калибровочной кривой для определения концентрации хлорофилла
методом измерения интенсивности его люминесценции............................................ 21
Лабораторная работа № 6
Оценка физиологического состояния растения по параметрам замедленной
флуоресценции хлорофилла........................................................................................... 25
НЕКОТОРЫЕ ПОНЯТИЯ
Мембраны, способные избирательно пропускать определенные ионы, называются ионоселективными.
2. Система двух проводников электрического тока, разделенных диэлектриком,
является конденсатором, имеющим электрическую емкость, измеряемую в
Фарадах (Ф).
3. Графики зависимости сопротивления и емкости биоткани от частоты переменного тока называются дисперсионными кривыми сопротивления и емкости.
4. Коэффициент поляризации равен отношению Кп = R4/ R6, где R4 – сопротивление ткани на частоте 104 Гц, R6 – сопротивление ткани на частоте 106 Гц.
5. Зависимость оптической плотности (или коэффициента поглощения) вещества
от длины волны падающего света называется спектром поглощения.
6. Закон поглощения света Бугера-Ламберта-Бера: I = I0 е -ααсl, где I – интенсивность света, прошедшего через окрашенное вещество, I0 – интенсивность света, падающего не окрашенное вещество, е = 2,7 – основание натурального логарифма, α – коэффициент пропорциональности, С – молярная концентрация
окрашивающего вещества, l – длина оптического пути.
7. Из двойственности природы света вытекает то, что, имея волновую природу,
он поглощается и излучается порциями – квантами.
8. Положение максимума спектральной плотности энергетической светимости
излучения определяется законом Вина и зависит от температуры тела: с повышением температуры максимум сдвигается в коротковолновую область
спектра.
9. Излучение, представляющее собой избыток над тепловым излучением тела при
данной температуре, называется люминесценцией.
10. Максимум спектра люминесценции сдвинут по отношению к максимуму спектра поглощения в сторону более длинных волн (правило Стокса).
11. Калибровочная кривая представляет собой график зависимости интенсивности люминесценции от заданной концентрации люминесцирующего в растворе
вещества.
12. Индукционной кривой замедленной флуоресценции хлорофилла называется
график зависимости интенсивности его миллисекундной люминесценции от
времени освещения биологического объекта, содержащего хлорофилл.
1.
4
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1
КАК ВЫПОЛНИТЬ И ОФОРМИТЬ ЛАБОРАТОРНУЮ РАБОТУ
ЦЕЛЬЮ лабораторного практикума является более глубокое осознание студентами биофизических явлений. Настоящее занятие ставит задачей обучить студентов правилам и технике безопасности при выполнении лабораторных работ, а
также правильной обработке полученных результатов.
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ: компьютер с набором необходимых программ.
ПОДГОТОВКА К ЛАБОРАТОРНОЙ РАБОТЕ
При подготовке к работе рекомендуется придерживаться следующего плана.
• Прочитайте название работы и выясните смысл всех непонятных слов.
• Прочитайте описание работы от начала до конца, не задерживаясь на выводе формул. Задача первого прочтения состоит в том, чтобы выяснить, какое биофизическое явление изучается в данной работе и каким методом проводится исследование.
• Прочитайте по лекциям или учебнику материал, относящийся к данной работе. Разберите вывод формул по методическому пособию. Найдите ответы на контрольные вопросы, приведенные в конце описания работы.
• Ознакомьтесь с оборудованием, используемым при выполнении работы и
правилами их безопасной эксплуатации. Разберите по методическому пособию
принцип устройства и работы приборов, которые предполагается использовать в
работе.
• Выясните, какие физические величины, с какой точностью будут непосредственно измеряться и каковы их размерности.
• Продумайте, какой окончательный результат должен быть получен в данной лабораторной работе.
ВЫПОЛНЕНИЕ РАБОТЫ
При выполнении работы вначале следует ознакомиться с приборами. Нужно
установить их соответствие описанию, выполнить рекомендованную в описании
прибора последовательность действий по его подготовке к работе, убедиться в том,
что при изменении положений органов управления возникают ожидаемые изменения параметров, определить цену деления шкалы прибора, попробовать сделать
пробный отсчет. Далее следует провести предварительный опыт с тем, чтобы пронаблюдать качественно изучаемое явление, оценить, в каких пределах находятся
измеряемые величины. После проведенной подготовки можно приступать к измерениям. Следует помнить, что всякое измерение, если только это возможно сделать,
должно выполняться больше, чем один раз.
Производимые по приборам отсчеты записываются в лабораторный протокол
сразу же после выполнения отсчета в том виде, как они считаны со шкалы прибора
Естественно, что единицы измерений и множитель шкалы должны быть записаны в
заголовке соответствующей таблицы с результатами измерений. При измерениях,
5
выполняемых при помощи осциллографа, отсчет следует делать непосредственно
по шкале осциллографа, установив предварительно подходящий размер изображения. Картинка, срисованная с экрана, может быть использована только в качестве
иллюстрации или для качественного анализа. Все записи при выполнении лабораторной работы должны вестись исключительно в лабораторном протоколе. Все исправления должны делаться так, чтобы предыдущий результат оставался читаемым.
ОФОРМЛЕНИЕ ОТЧЕТА
Проведите эксперимент, результат внесите в таблицы.
Обработайте полученные результаты: проведите необходимые вычисления и
постройте графики
ПРАВИЛА ПОСТРОЕНИЯ ГРАФИКОВ
Оформление результатов эксперимента в виде графиков является составной
частью большинства лабораторных работ по курсу биофизики. Дело в том, что графическое представление результатов любых изменений является наиболее наглядным и дает максимум информации на минимальном пространстве. Построив график, можно сразу выявить характерные особенности изучаемых зависимостей: области возрастания и убывания, максимумы и минимумы, области наибольшей скорости изменения, периодичность и др.
ВЫБОР КООРДИНАТНЫХ ОСЕЙ
Построение графика проводится в выделенном протоколе месте, на котором
нанесены координатные оси. По оси абсцисс, как правило, откладывают переменную, принятую за независимую (аргумент), а по оси ординат – функцию. Так, например, при снятии зависимости сопротивления биологической ткани от частоты
переменного тока по оси абсцисс откладывают частоту, а по оси ординат – сопротивление.
ВЫБОР ИНТЕРВАЛОВ
Интервалы изменения величин по обеим осям выбирают независимо друг от
друга так, чтобы на графике была представлена лишь экспериментально исследованная область, а сам график занимал бы все поле чертежа. При этом начало координат (точку (0,0)) не обязательно помещать на графике. Например, если в процессе
измерений сопротивление биоткани уменьшается от 450 до 800 Ом, то на графике
явно неразумно изображать область сопротивлений ниже 400 Ом и выше 800 Ом.
ВЫБОР МАСШТАБА И НАНЕСЕНИЕ ШКАЛ ПО ОСЯМ
За единицу масштаба выбирают отрезки, кратные 5, 10, 50 и т.д., позволяющие
легко отсчитывать на бумаге доли делений сетки. Расстояние между соседними делениями шкалы (единица масштаба) должно соответствовать «круглому» числу
единиц измеряемой величины (1,2,5 или те же цифры, умноженные на 106). В конце
указывается откладываемая величина и ее размерность. Множитель 106 , определяющий порядок величины, включается в единицы измерений, например: «U, мкВ»,
или “U×106, В.
6
НАНЕСЕНИЕ ТОЧЕК И ПРОВЕДЕНИЕ КРИВОЙ
ПО ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫМ ТОЧКАМ
Точки на график следует наносить точно и тщательно, обводя их кружком или
иным знаком. Если на одном графике представляют результаты двух зависимостей,
то изображают две оси ординат (с правой и с левой стороны графика, каждая со
своим масштабом), а экспериментальные точки, относящиеся к разным зависимостям, обозначают разными значками (кружками, квадратиками, и т.д.). Нельзя проводить экспериментальную кривую, соединяя нанесенные точки ломаной линией!
По нанесенным точкам проводят «наилучшую» кривую так, чтобы она прошла по
возможности ближе к экспериментальным точкам, а точки эти располагались примерно поровну по обеим сторонам линии. Кривая не должна заслонять экспериментальных точек, поскольку точки – результат опыта, а кривая – наше толкование результатов.
ПРИМЕР ПРАВИЛЬНОГО ПОСТРОЕНИЯ ГРАФИКА
Таблица 1
С, мг/л
ИЛ, ое
0,02
12
0,04
26
0,08
48
1,2
58
1,6
70
2
80
2,4
94
2,8
106
3,2
118
Удобным способом обработки
полученных результатов является
компьютерное построение графиков
и получение необходимых расчетов.
Для этого используют программы,
написанные в MICROSOFT EXCEL.
ИЛ,ое
140
120
100
80
60
40
20
0
1
2
3
4
5
С, мг/мл
Рисунок 1. Зависимость интенсивности
люминесценции хлорофилла от его концентрации
ЗАДАНИЯ ДЛЯ
САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
1. Самостоятельно заполните
табл. 2, примерно представляя, какой
был у вас рост в возрасте от рождения по сегодняшний день. По полученным результатам под руководством преподавателя с использованием компьютерной программы распечатайте график.
2. Используя результаты табл. 3, самостоятельно постройте график. Для разбивки осей определите диапазоны изменения аргумента и функции, масштаб. Подпишите оси, не забыв указать размерности величин. Дайте название графику.
Таблица 2
Мой возраст, лет
Мой рост, см
7
Рисунок 2. График зависимости моего роста от возраста
Таблица 3
Концентрация, мМ
Электропроводность, µS
2
6
8
24
28
0,02 0,06 0,08 0,24 0,28
30
35
0,3 0,35
40
0,4
50
0,5
Рисунок 3.__________________________________________________________
___________________________________________________________________
ВЫВОД:
РАБОТА ПРОВЕРЕНА______________________________(________________)
РАБОТА СДАНА___________________________________(________________)
8
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2
ИЗУЧЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ МЕМБРАННОГО ПОТЕНЦИАЛА
НА ИОНОСЕЛЕКТИВНОЙ МЕМБРАНЕ
ЦЕЛЬ РАБОТЫ: изучение пассивной диффузии ионов через полупроницаемую
мембрану и образующейся при этом трансмембранной разности электрических потенциалов; выявление зависимости разности потенциалов от соотношения концентрации ионов по разные стороны мембраны.
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ: электрод с ионоселективной мембраной,
высокоомный милливольтметр, химические стаканы емкостью 100 мл с растворами
исследуемых веществ разных концентраций.
КРАТКАЯ ТЕОРИЯ
Для поддержания жизненных процессов в клетке необходимо поступление в
нее определенных веществ и одновременное выведение из нее продуктов метаболизма. В клетку поступают вода, соли, неорганические ионы, сахара, аминокислоты
и другие низкомолекулярные соединения. Биомембраны выполняют две прямо противоположные функции: барьерную, благодаря которой клетка защищается от чужеродных веществ, и транспортную, обеспечивающую поступление в неё веществ,
необходимых для жизнедеятельности. Мембраны, способные избирательно пропускать определенные ионы, называются ионоселективными.
Разделим сосуд ионоселективной мембраной, и по обе стороны её поместим
растворы одного и того же электролита разных концентраций (рис. 1). Пусть мембрана пропускает ионы одного знака и не пропускает ионы другого знака. Причиной этому может быть сильное различие в эффективных диаметрах гидратированных ионов, вследствие чего более крупные ионы не проходят через поры мембраны.
Возможно также и электрическое отталкивание
ионов какого-либо знака заряженными концами
дипольных молекул, находящихся на поверхности
[KCl]=1Ml
[KCl]=0,1Ml
мембраны. Допустим, что в обеих половинах сосуда находятся растворы хлорида калия [C]1 и [C]2,
K+
+
причём [C]1 > [C]2 , а мембрана пропускает К+.
E= ϕ1-ϕ2
Ионы калия будут диффундировать из левой
части сосуда в правую, а ионы хлора, не прохоϕ1
ϕ2
дящие через мембрану, будут оставаться в левой
Cl+
части сосуда. Поскольку ионы калия заряжены
положительно, в правой части сосуда возникает
Ионоселективная мембрана
избыточный
положительный заряд, а жидкость в
Рисунок 1. Схема образования
левой половине сосуда, потерявшая часть ионов
мембранного потенциала
калия, зарядится отрицательно. Возникающее при
этом электрическое поле препятствует дальнейшей диффузии ионов калия, которая,
в конце концов, прекратится. Работа, которую совершают силы электрического поля для того, чтобы прекратить диффузионный поток из левой части сосуда в правую, равна работе диффузионных сил, т.е. Аэ=Ад.
-
9
Можно показать, что
RT ln
[C ]1
= zF (ϕ 1 − ϕ 2) ,
[C ]2
(1)
где R=8,314 Дж/(К•моль) — универсальная газовая постоянная, Т — абсолютная
температура, z — валентность иона, диффундирующего через мембрану,
F=9,698•104 Кл/моль — число Фарадея, [C] 1 и [C] 2 — концентрации диффундирующего иона по разные стороны мембраны, ϕ1 и ϕ2 — электрические потенциалы
по разные стороны мембраны.
Отсюда легко найти разность потенциалов ϕ1 - ϕ2, образующуюся на мембране.
Эту величину называют мембранной (трансмембранной) разностью потенциалов,
или просто мембранным потенциалом. Обозначив ϕ1-ϕ2 через Em, и перейдя от натурального логарифма к десятичному, получим
Em =
RT [C ]1
RT [C ]1
ln
lg
= 2,3
zF [C ]2
zF [C ]2
(2)
Таким образом, мембранный потенциал прямо пропорционален температуре,
обратно пропорционален валентности диффундирующего иона и зависит от логарифма концентрационного градиента ионов. Для температуры 20°С (300°К) и валентности диффундирующего иона +1 (Н+, К+) левая дробь в формуле (2), умноженная на 2,3, числено равна 0,059, поэтому
Em = 0,059 ( lg [C] 1 - lg [C] 2)
(3)
Для отрицательных одновалентных ионов (например, NO3-) знак потенциала
меняется.
Мембранную разность потенциалов можно измерить с помощью пары неполяризующихся электродов. Такая пара
Рисунок 2. Установка
электродов представляет собой сосуд,
для измерения мембранзаполненный раствором хлористого
ного потенциала.
калия, в который погружена серебряная проволока, покрытая тонким слоем
AgCl. Однако, и в этом случае имеется
электродный потенциал, на который
необходимо вводить поправку.
Удобной моделью для изучения
мембранного потенциала является
электрод с ионоселективной искусственной мембраной. Электрод имеет
пластмассовый цилиндрический корпус, нижний торец которого представляет собой полупроницаемую мембрану. Внутрь электрода заливают раствор необходимого электролита известной концентрации [C]1 (приэлектродный раствор), в который погружают контактный полуэлемент. Если такой электрод опустить в раствор того же электролита концентрации [C]2, содержащий диффундирующие через ионоселективную мембрану ионы, то
очень скоро на мембране образуется мембранный потенциал, пропорциональный
разнице концентраций электролита на противоположных сторонах мембраны. Его
10
можно измерить с помощью высокоомного милливольтметра, подключив к нему
контактный полуэлемент, находящийся в контакте с раствором [C]1 хлорсеребряный электрод, погруженный в раствор [C]2 (рис. 2).
На практике электроды с ионоселективными мембранами использую для экспресс оценки содержания в воде, растворах, экстрактах, соках овощей и фруктов
различных ионов: Hg2+, Pb2+, NO3-, NO2- и др. Потенциал на мембране равен нулю,
если мембрана не пропускает ионы, если вещество не диссоциирует (например, сахароза) и если концентрации иона по обе стороны мембраны одинаковы.
ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
1. Включите измерительный прибор в сеть.
2. В табл. 1 запишите химическую формулу использованной соли, иона, для которого мембрана является проницаемой, и величину концентрации соли внутри
электрода.
3. Опустите электрод с ионоселективной мембраной и хлорсеребряный электрод в раствор соли минимальной концентрации. Измерьте электрический потенциал на мембране с помощью высокоомного милливольтметра. Результат запишите в
табл. 1. Проделайте те же самые измерения для других растворов последовательно в
сторону увеличения концентрации [C]1.
4. Используя полученные результаты, постройте с помощью компьютера график зависимости электрического потенциала на мембране концентрации соли.
ОТЧЕТ
Измеренная разность мембранного потенциала, компьютерная распечатка экспериментального и теоретического графиков зависимости мембранного потенциала от
концентрации соли в стакане. Вывод сделайте, проанализировав распечатанные
графики.
Таблица 1
Использован раствор соли
KCl
Мембрана проницаема для иона
К+
Концентрация соли внутри электрода |C|1
0,01 М
Поправка на электродный потенциал
мВ
|C|2, М
Em, mV
ВЫВОДЫ (сделайте по результату компьютерной распечатки).
11
Постройте теоретический график зависимости Em = f ( [C] 1, [C] 2 )
для иона
при температуре
К и [C]1 =
М
Ем, мВ
0
-8
-7
-6
-5
-4
-3
-2
-1
lg [C2], M
Рисунок 3. Теоретический мембранный потенциал.
Контрольные вопросы:
1. Какая мембрана называется ионоселективной?
2. Объясните механизм образования на ионоселективной мембране мембранного потенциала.
3. При каких условиях потенциал на ионоселективной мембране равен нулю?
4. Глюкоза, сахароза, глицерин не диссоциируют на ионы в водных растворах.
Будут ли образовываться потенциалы на мембранах, селективно пропускающих эти
вещества и почему?
5. Для чего в практике используют ионоселективные электроды?
6. Как определить содержание нитратов (NO3-) в овощах и ионов тяжелых металлов (Cu2+) в бассейнах рек и лиманов?
РАБОТА ПРОВЕРЕНА__________________________________(________________)
РАБОТА СДАНА_______________________________________(________________)
12
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №3
ПОЛУЧЕНИЕ ДИСПЕРСИОННОЙ КРИВОЙ
КЛУБНЯ КАРТОФЕЛЯ
ЦЕЛЬ РАБОТЫ: изучить работу измерителя иммитанса, с его помощью построить дисперсионные кривые для нативного и промороженного в течение 30 мин.
при -20 ОС клубней картофеля.
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ: измерителя иммитанса, электроды, биологический объект – нативный и промороженный клубень картофеля.
КРАТКАЯ ТЕОРИЯ
Величина электрического сопротивления R и электрической емкости С живых
клеток и тканей меняются в зависимости от частоты тока, на которой ведется измерение.
На рис. 1 изображена эквивалентная электрическая схема биологической ткани. Биологическая ткань имеет клеточную структуру. Каждая клетка окружена липидной мембраной, которая является диэлектриком, омываемым с внутренней стороны цитоплазмой, с внешмембрана
биологическая ткань
ней — межклеточной жидкостью. И цитоплазма, и
С
межклеточная
жидкость —
См
электрод
м
Rц
электролиты, т.е. проводят
электрический ток. Два проклетка
водника
электрического
тока, разделенные диэлекRмж
триком, являются конденсатором. Если на электроды
подать напряжение, то мембрана поляризуется в рек измерителю иммитанса
зультате разделения зарядов
внутри клетки и в межклеРисунок 1. Эквивалентная электрическая схема
точной жидкости под дейстбиологической ткани
вием электрического поля.
Это эквивалентно заряду конденсаторов. См (емкость мембраны), обкладками которого является с внутренней стороны мембраны цитоплазма, с внешней — межклеточная жидкость.
Так как цитоплазма и межклеточная жидкость электропроводны, то они обладают электрическими сопротивлениями. На рисунке этими эквивалентами являются
Rц и Rмж.
При увеличении частоты тока и емкость, и сопротивление биоткани уменьшаются. Это связано с механизмом ее поляризации.
Для проведения измерений электрической емкости и сопротивления в биофизике используется измеритель иммитанса – радиоизмерительный прибор, предназначенный для определения параметров полного сопротивления или полной прово13
измеритель иммитанса
картофель
игольчатые
электроды
Рисунок 2. Схема установки для измерения сопротивления и емкости биологической ткани
димости электрической цепи: R —
сопротивления, С — емкости.
Сумма активного (R) и емкостного
(С) сопротивлений называется —
обобщающее понятие для полного
(комплексного) сопротивления —
называется импедансом (Z).
Принцип измерения основан на
анализе прохождения тестового
сигнала (обычно синусоидального)
с заданной частотой через измеряемую цепь, обладающую комплексным сопротивлением. Напряжение рабочей частоты с внутреннего генератора подается на измеряемый объект. На выделенном
участке цепи измеряется напряжение, ток и фазовый сдвиг между
ними. Измеренные величины ис-
пользуются для расчёта параметров цепей.
Графики зависимости сопротивления и емкости биоткани от частоты переменного тока называются дисперсионными кривыми.
У нативной ткани мембраны не повреждены. При повреждении мембран поляризационные эффекты уменьшаются, что приводит к уменьшению как электрической емкости, так и электрического сопротивления ткани. Поэтому для них будут
различными дисперсионные кривые.
Измерение импеданса и построение дисперсионной кривой позволяет контролировать состояние органов при трансплантации в медицине, оценивать физиологическое состояние человека и животных. В селекции растений отбирать устойчивые
к низким температурам экземпляры, так как у неустойчивых особей при низких
температурах мембраны разрушаются кристаллами льда цитоплазмы и фазовыми
переходами мембраны. Более быстрым является расчет коэффициента поляризации Кп
Кп = R4/ R6,
(1)
где R4 – сопротивление ткани на частоте 104 Гц, R6 – сопротивление ткани на частоте 106 Гц.
ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
1. Изучите используемые в работе приборы. Включите измеритель иммитанса
2. Воткните игольчатые электроды в нативный картофель.
3. Измерьте сопротивления и емкости в диапазоне частот 100 Гц – 100000 Гц
на типе биологической ткани, указанных преподавателем. Результаты запишите в
табл. 1.
4. Повторите те же измерения для промороженного картофеля.
14
5. По результатам измерений постройте графики в полулогарифмических координатах в диапазоне частот 100 Гц – 100000 Гц или используйте для этой цели
компьютер.
6. Рассчитайте значения коэффициентов поляризации по формуле (1).
Таблица 1
Зависимость сопротивления и емкости клубня картофеля
от частоты переменного тока
f, кГц
0,1
0,5
1
5
10
50
100
500
Нативный
клубень
R, Ом
1000
Промороженный клубень
C, нФ
R, Ом
C, нФ
Значение коэффициента поляризации для нативной ткани:
КпН =
Значение коэффициента поляризации для разрушенной ткани КпР =
Рисунок 3.__________________________________________________________
____________________________________________________________________
____________________________________________________________________
15
ВЫВОДЫ:
Контрольные вопросы:
1. Нарисуйте эквивалентную электрическую схему биологической ткани.
2. Почему биологические ткани обладают электрической емкостью?
3. Что такое импеданс?
4. Что такое дисперсионная кривая?
5. Чему равен коэффициент поляризации биологической ткани?
6. Что характеризует коэффициент поляризации?
РАБОТА ПРОВЕРЕНА_________________________________(________________)
РАБОТА СДАНА______________________________________(________________)
16
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №4
ПОЛУЧЕНИЕ СПЕКТРА ПОГЛОЩЕНИЯ
СПИРТОВОГО ЭКСТРАКТА ХЛОРОФИЛЛА
ЦЕЛЬ РАБОТЫ: изучить законы поглощение света и получить спектр поглощения спиртового экстракта хлорофилла, определить концентрацию в экстракте
хлорофилла и каротиноидов.
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ: спектрофотометр с принадлежностями,
ФЭК, спиртовой экстракт хлорофилла.
КРАТКАЯ ТЕОРИЯ
При прохождении света через вещество часть фотонов захватывается атомами
вещества и световой поток ослабляется. Захват фотона переводит оптические электроны атома на более высокие энергетические уровни. Чем больше атомов и молекул встретится на пути светового потока, тем больше вероятность захвата фотона и
тем большая их часть поглощается.
Направим на плоскую поверхность цилиндра с раствором окрашенного вещества параллельный пучок света интенсивностью I0 (рис. 1). На расстоянии x от поверхности выделим бесконечно тонкий слой вещества dx.
Интенсивность света dI, поглощенного этим
l
слоем, пропорциональна интенсивности падающего на него света I и количеству атомов, находящихся в слое dx,:
dI=-k I dx
(1)
I
I0
Знак минус означает, что интенсивность света в направлении оси ОХ уменьшается, k – константа пропорциональности, она характеризует
поглощение света в слое единичной толщины.
Разделим переменные в равенстве (1) и про0
X
x dx x+dx
интегрируем его от одной поверхности кюветы с
раствором до другой, т. е. левую часть от I0 до I, а
Рисунок 1. К выводу закона
правую — от 0 до l, где l — толщина кюветы:
поглощения света
I
l
(2)
dI
= − ∫ kdx
I0 I
0
∫
.
Считая показатель поглощения k не зависящим от расстояния и от интенсивности света, после интегрирования получим:
(3)
ln I – ln I0 = - kl.
Из уравнения (3) найдем значение интенсивности света, прошедшего через кювету:
I = I0 е -kl.
(4)
17
Показатель поглощения света k должен зависеть от молярной концентрации
окрашенных молекул с. Введем коэффициент пропорциональности α, тогда k=αc и
запишем уравнение (4) в виде:
I/I0 = e
-α сl
или I = I0 е
-α
α сl
.
(5)
Это закон поглощения света Бугера-Ламберта-Бера.
После логарифмирования выражения (5) и преобразования натурального логарифма в десятичный получим:
(6)
-lg(I/I0) = lg(I0/I) = ε cl.
где ε называется молярным коэффициентом гашения (экстинции) вещества
(ε =α/2,3). Его значение определяют при толщине кюветы 1 см и концентрации окрашивающего вещества в 1 М, и он зависит только от длины волны света, проходящего через кювету.
Отношение интенсивности света, прошедшего через кювету (I), к интенсивности падающего света (I0) называют коэффициентом пропускания (Т) и выражают
в процентах:
Т(%)= I/ I0
(7)
Сравнивая уравнения 6 и 7, можно записать:
(8)
lg(I0/I) = ε cl=lg(1/T)
Десятичный логарифм отношения интенсивности падающего на вещество света к интенсивности света, прошедшего через это вещество, называется оптической
плотностью вещества: D=lg(I0/I). Выразим в последнем уравнении значение концентрации вещества через оптическую плотность:
c = D /ε l или D = ε c l
D, о.е.
300
500
700
900
λ, нм
Рисунок 2. Спектр поглощения
(9)
Из уравнения (9) следует, что оптическая плотность прямо пропорциональна концентрации вещества и
толщине кюветы (длине оптического
пути).
Так как показатель поглощения зависит от длины волны проходящего
света, то от нее также зависят оптическая плотность и коэффициент пропускания. Зависимость оптической плотности вещества от длины волны называется спектром поглощения, а зависимость коэффициента пропускания —
спектром пропускания. Пример спек-
тра поглощения приведен на рис. 2.
Для измерения величин D и Т существует широкая группа приборов, называемых спектральными. Наиболее простым из них является фотоэлектроколоритметр
(ФЭК), служащий для измерений концентраций окрашенных веществ в видимой
области спектра. Спектр поглощения возможно получить только с использованием
спектрофотометра. Спектры поглощения используют для идентификации веществ,
18
так как они строго индивидуальны, а так же для измерения концентраций. В последнем случае пользуются той длиной волны, при которой оптическая плотность
максимальна.
При экстракции спиртом из листьев растений пигментов основная часть пигментов приходится на хлорофилл. Вместе с ним экстрагируется незначительное
количество каротиноидов.
ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
ЗАДАНИЕ 1
1. Включите ФЭК и спектрофотометр. Прогрейте их в течение 10 мин.
2. Откройте кюветное отделение ФЭК. По ходу луча установите белый экран
и, переключая сменные фильтры, определите цвет, соответствующий каждой длине
световой волны, пропускаемой светофильтром. Заполните таблицу 1.
ЗАДАНИЕ 2
1. Установите на компьютере программу для построения спектра поглощения
и расчета концентраций хлорофилла и каротиноидов в спиртовом экстракте.
2. В кюветное отделение спектрофотометра установите в дальнюю ячейку
кювету с растворителем, в ближнюю ― кювету с экстрактом хлорофилла. Измерьте
оптическую плотность D с шагом 20 нм для диапазона длин волн 320-720 нм. Результаты занесите в таблицу компьютерной программы.
3. Измерьте оптическую плотность при длинах волн 665, 649 и 440 нм. Используйте эти данные для расчета содержания хлорофиллов и каротиноидов в вашем экстракте
4. Распечатайте полученный спектр поглощения и вклейте в протокол.
Таблица 1
Зависимость окраски светового луча от длины волны
λ, нм
Цвет
луча
Таблица 2
Оптическая плотность экстракта хлорофилла при трех длинах волн
Длина волны, нм
D, о.е.
665
649
ОТЧЕТ
Расчет концентрации хлорофилла и каротиноидов экстракта, мг/л
Cхл . =. 6,10*D665 + 20,04*D649 =
Cкар = 4,695* D440 - 0,268 * Cхл =
19
440
Рисунок 3. __________________________________________________________
_______________________________________________________________________
ВЫВОДЫ:
Контрольные вопросы:
1. Что такое коэффициент поглощения, коэффициент экстинции, оптическая
плотность?
2. Сформулируйте закон Бугера-Ламберта-Бера.
3. Для каких целей можно использовать ФЭК?
4. Для каких целей можно использовать спектрофотометр?
5. Как выбрать оптимальный светофильтр у ФЭКа или длину волны у спектрофотометра для количественной оценки содержания красящего вещества в цветном
растворе?
6. Дайте определение спектра поглощения.
РАБОТА ПРОВЕРЕНА_________________________________(________________)
РАБОТА СДАНА______________________________________(________________)
20
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №5
ПОЛУЧЕНИЕ КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
КОНЦЕНТРАЦИИ ХЛОРОФИЛЛА МЕТОДОМ ИЗМЕРЕНИЯ
ИНТЕНСИВНОСТИ ЕГО ЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ
ЦЕЛЬ РАБОТЫ: научиться регистрировать интенсивность люминесценции
хлорофилла и построить калибровочную кривую для определения его концентрации.
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ: флуориметр, спиртовые экстракты хлорофилла известной и неизвестной концентраций.
КРАТКАЯ ТЕОРИЯ
К фотобиологическим процессам относит группу явлений, связанных с поглощением света и приводящих к разнообразным биохимическим, физиологическим и
общебиологическим процессам. К этим явлениям относится фотосинтез — единственный биологический процесс, в котором происходит увеличение свободной энергии системы, все остальные биологические процессы осуществляются за счет потенциальной энергии, накапливаемой фотосинтезирующими организмами.
Природа света. Видимый свет представляет собой
Е S*
3
электромагнитные
волны длиною от 350 до 760 нм. Свет
3
S*2
с длиной волны менее 350 нм называется ультрафиоле4
товым, более 760 нм — инфракрасным. Двойственность
S*1
6
природы света заключается в том, что, имея волновую
2 8
T
природу, он при этом поглощается и излучается порция1
5
7
ми — квантами. Поглощение света сопровождается
переходом одного из электронов в молекуле с более низS0
кого (основного) энергетического уровня (S0) на более
Рисунок 1. Схема
высокие (S*2, S*3) (рис. 1, переходы 1 и 2). Расстояние
энергетических
между уровнями по шкале энергии соответствует энерэлектронных уровгии поглощенного кванта. Атомы или молекулы, поглоней
тившие квант энергии, находятся в возбужденном состоянии. Такое состояние термодинамически неравновесно, поэтому электрон стремится вернуться на более низкий уровень. Это возможно двумя путями и сопровождается уменьшением энергии возбужденного электрона.
В первом случае электрон, тратя поглощенную энергию на излучение кванта
света, возвращается на основной уровень (переход 8, резонансная люминесценция).
Во втором случае при переходе электрона с уровня S*3 возможны безизлучательные переходы 3 и 4 на нижележащие уровни. Потерянная часть энергии при
этом трансформируется в кинетическую энергию (тепловую) возбужденной молекулы. С уровня S*2 возможно высвечивание кванта света (переход 5, люминесценция), либо переход на триплетный уровень Т, связанный с изменением спина электрона.
На триплетном уровне электрон будет находиться до того момента, пока не
произойдет в результате малого дополнительного поглощения энергии повторное
21
изменение спина. Только в этом случае становится возможным переход 7, при котором излучается квант (фосфоресценция).
Все нагретые тела в природе излучают электромагнитные волны. Положение
максимума интенсивности свечения в спектре излучения определяется законом
Вина и зависит от температуры тела: с повышением температуры максимум сдвигается в коротковолновую область спектра. Так солнце, температура поверхности
которого около 6000 0К, имеет максимум в зеленой области спектра, а лампа накаливания с температурой нити в два раза ниже излучает преимущественно желтый
свет. Такое свечение называется равновесным. Однако некоторые вещества при
комнатной температуре способны в определенных условиях излучать свечение в
области спектра, далекой от температурного максимума. Такое излучение, представляющее собой избыток над тепловым излучением тела при данной температуре,
называется люминесценцией. К люминофорам, т.е. люминесцирующим веществам,
относятся газы в разрядных трубках, пары серы, йода, ароматические соединения
(нафталин), красители, кристаллы неорганических соединений с примесями ионов
тяжелых металлов (рубин) и др. При температуре незначительно превышающей
окружающую, они способны излучать как тела, нагретые до более высокой температуры. Так, у солнца и у лампы дневного света температуры разные, но спектры
излучения одинаковые.
Если после подъема на возбужденный уровень электрон безизлучательно опустится на более низкий возбужденный уровень, а затем, излучив квант, опустится на
основной уровень, то вследствие потери части энергии длина волны люминесценции будет больше длины волны возбуждающего света. Поэтому максимум спектра
люминесценции сдвинут по отношению к максимуму спектра поглощения в сторону более длинных волн (правило Стокса).
Многие биологические молекулы, поглощая свет, люминесцируют. Среди них
хлорофилл, β-каротин и др. Возбуждение
2
3
4
может осуществляться ультрафиолетовым
либо синим светом. Люминесценция хлорофилла происходит в красной области спектра.
Наблюдать люминесценцию можно непосредственно, но для ее количественной оценки используют приборы, называемые флуориметрами. Так как интенсивность люми132,5
5
несценции пропорциональна содержанию
люминесцирующих молекул в растворе, то
флуориметр может быть использована для
измерения концентрации веществ.
Рисунок 2. Схема флуориметра.
Работа флуориметра состоит в следующем (рис. 2). Возбуждающий свет от источника 1 (синий светодиод) попадает на пробирку с раствором пигмента 2, вызывая
его флуоресценцию. Между пробиркой и фотодиодом 4 расположен светофильтр 3,
прозрачный для света люминесценции и непрозрачный для возбуждающего света.
В результате в фотодиоде возникает фототок, пропорциональный интенсивности
22
люминесценции. Измерительный прибор 5, шкала которого прокалибрована в относительных единицах, преобразует сигнал фотоэлемента в числовую величину.
Линейная часть зависимости интенсивности люминесценции от концентрации
люминесцирующего вещества будет только в определенном диапазоне от нуля до
некоторой величины. При низких концентрациях свет люминесценции свободно
выходит за пределы раствора, не поглощаясь им. При увеличении концентрации
часть света люминесценции поглощается самим раствором, и зависимость приобретает нелинейный характер. Поэтому для точного определения концентрации строят
калибровочную кривую, по которой затем можно определять концентрацию.
ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
1. Включите флуориметр.
2. В кюветное отделение поместите пробирку с водой. Закрыв крышку кюветного отделения, установите «нулевое» показание прибора нажатием на соответствующую кнопку.
3. Замените пробирку с водой на экстракты известных концентраций. Проведите измерения интенсивности флуоресценции пигмента и запишите в таблицу полученные значения.
4. Поместите в прибор раствор с самым высоким уровнем люминесценции.
Определите визуально цвет возбуждающего света и люминесценции.
5. Постройте график зависимости интенсивности люминесценции от концентрации использованного экстракта (калибровочную кривую).
6. Используя калибровочную кривую, определите неизвестную концентрацию
экстракта.
Таблица 1
Интенсивность люминесценции спиртового экстракта хлорофилла
Концентрация,
Интенсивность
люм., отн. ед.
Определение неизвестной концентрации экстракта.
Интенсивность люминесценции ______________ отн. ед.
Концентрация________________________
Цвет возбуждающего света ________________, цвет люминесценции_____________
23
Рисунок 3 _________________________________________________________
___________________________________________________________________
___________________________________________________________________
ВЫВОДЫ
Контрольные вопросы:
1. Сформулируйте закон Вина
2. В чем заключается двойственность природы света?
3. Что такое люминесценция?
4. Что такое возбужденное состояние молекулы или атома?
5. По схеме, приведенной на рис. 1, объясните, почему выполняется правило
Стокса.
6. Чем вы объясните то, что люминесценция хлорофилла возбуждается синим
светом, а цвет люминесценции красный?
РАБОТА ПРОВЕРЕНА_________________________________(________________)
РАБОТА СДАНА______________________________________(________________)
24
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №6
ОЦЕНКА ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ РАСТЕНИЯ ПО
ПАРАМЕТРАМ ЗАМЕДЛЕННОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ХЛОРОФИЛЛА
ЦЕЛЬ РАБОТЫ: методом регистрации параметров замедленной флуоресценции (ЗФ) растений, произрастающих в разных условиях, оценить их физиологическое состояние.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ: флуориметр Фотон-10 для регистрации флуоресценции, листья растений, устройство для получения круглых высечек из них, компьютер
КРАТКАЯ ТЕОРИЯ
К первичным реакциям фотосинтеза относятся поглощение кванта света молекулами антенного хлорофилла и переход их в возбужденное состояние, миграция
(перенос) энергии к реакционному центру, движение электронов от пигмента P680
реакционного центра фотосистемы 2 (ФС2) к акцептору электронов Q и последующее их движение по электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) через фотосистему 1 (ФС1)
к НАДФ. Возмещение ушедшего электрона Р680 происходит путем окисления Z
молекулы воды.
В результате движения электрона по электронно-транспортной цепи образуются высокоэнергетические молекулы АТФ и НАДФ.Н, которые используются в темновой (ферментативной) фазе фотосинтеза для синтеза углеводов из СО2.
Фотосинтетический реакционный
центр
ФС2 представляет собой комS*с
БФ
плекс
белковых
молекул, которые удерS*к
живаются в определенном положении
Q
молекулами хлорофилла, Основной из
ЗФ
них является молекула хлорофилла
ЭТЦ
0
P680, способная получать энергию от
S
молекул антенного хлорофилла. Квант
Р680
света, поглощенный молекулой антенH2O
Z
ного хлорофилла, переводит эту молекулу в возбужденное состояние. АктивРис. 1. Процессы движения элекный
возбужденный электрон восстанавтронов и генерации ЗФ в ЭТЦ.
ливает молекулу Q – первичный акцептор электронов фотосистемы 2 (рис. 1).
В результате Р680 приобретает положительный заряд, а Q – отрицательный,
т.е. энергия возбуждения Р680 была использована на первичное разделение электрических зарядов в реакционном центре и создание потенциала со знаком «+» со
стороны Р680.
Этот процесс можно описать так:
Z-P680-Q
Z-P680*-Q
Z-P680+-Q,*
где P680 - означает возбужденное состояние молекулы Р680.
25
Следующим этапом является перенос электрона от первичного донора электронов Z на Р680. При этом молекула Z приобретает положительный заряд, а Р680
становится нейтральным:
Z-P680+-QZ+-P680-QЗатем молекула Z+ получает электрон от воды и нейтрализует свой
положительный заряд:
е- + Z+-P680 QZ-P68O-Q-
а молекула Q отдает электрон в ЭТЦ, и реакционный центр приходит в исходное
состояние:
Z-P680-Q- - еZ-P68O-Q
Однако часть электронов, попавших в электронно-транспортную цепь, возвращается на первичный акцептор Q, заряжая его отрицательно. В этом случае может
происходить обратная реакция рекомбинации зарядов с образованием возбужденного состояния Р680:
Z-P680+QZ-Р680*-Q
Энергия возбуждения может мигрировать на молекулы антенного хлорофилла
и затем испускаться в виде кванта света. Поскольку физически (по спектру излучения) это свечение не отличается от обычной (быстрой) флуоресценции, то его называют ещё и замедленной флуоресценцией.
Регистрацию флуоресценции хлорофилла в растениях и водорослях осуществляют специальными флуориметрами (рис. 2).
Принцип их работы следующий
(рис.2). В кювету из черного тефлона помещают испытываемый образец – высечки
1
листьев, мох, суспензию микроводорослей
(4). В темноте вспышкам мощных синих
2
3
светодиодов миллисекундной длительности (3) освещают образец. В это время фо4
тоэлектронный умножитель (1) (ФЭУ)
электрически заперт. В темновой промежуРисунок 2. Схема флуориметра.
ток ФЭУ отпирается и свет флуоресценции
(2) через красный светофильтр поступает
на фотокатод ФЭУ. Электрический сигнал
I зф
Fm
обрабатывается компьютером и на монитоFvar
ре
изображается индукционная кривая
F0
флуоресценции.
Форма индукционной кривой сложная. В начальный момент, когда темновые
Время
реакции фотосинтеза и ЭТЦ не адаптированы к световым условиям, прямой поток
Рисунок 3. Индукционная криэлектронов невелик, вероятность движения
вая замедленной флуоресценэлектронов в обратном направлении высоции хлорофилла
ка, свечение резко увеличивается, достигая
значения F0 (рис.3). Затем за несколько секунд уровень возрастает до максимального значения Fm. После этого прямой фотосинтетический поток электронов усиливается, а обратный уменьшается вследствие «настройки» темновых реакций фотосин26
теза (ферментативные реакции фиксация СО2) и уровень послесвечения падает до
стационарного значения. Разность (Fm - F0) называют индукцией послесвечения, а
величину (Fm - F0)/ Fm - относительной индукцией послесвечения.
Относительная индукция определяется физиологическим состоянием растения.
Кроме того, форма индукционной кривой дает дополнительную информацию об
этом. Время выхода индукционной кривой на стационарный уровень и величина
стационарного уровня свидетельствуют об интенсивности протекания темновых
реакций, с помощью которых синтезируется глюкоза. Чем меньше это время и чем
ниже уровень – тем эффективнее протекают темновые ферментативные реакции.
Одновременно с падением послесвечения нарастают скорости выделения О2 и
скорости фиксации СО2, поэтому послесвечение может быть косвенным параметром, характеризующим активность фотосинтетических процессов, обеспечивающих
фиксацию СО2 после включения света.
Если при освещении листа светом низкой интенсивности замедленная флуоресценция ЗФн имеет значение близкое к значению, полученному при освещении
светом высокой интенсивности ЗФв, то фотосинтез идет малоактивно. Для характеристики интенсивности фотосинтеза используют отношение В/Н = ЗФв/ ЗФн. Чем
больше оно, тем более продуктивен фотосинтез.
Флуориметр Фотон-10 позволяет оценивать следующие параметры. Фо – интенсивность быстрой флуоресценции, которая пропорциональна содержанию хлорофилла в листьях. Фм – значение максимальной замедленной флуоресценции. Фпер – это
относительная индукция послесвечения, которая возрастает при более благоприятных
условиях произрастания растений. ЗФв и ЗФн – флуоресценция при освещении листьев
насыщающим светом и светом, в десять раз более слабом, и последний параметр В/Н –
это их отношение, которое обсуждалось выше.
Второй режим работы флуориметра – это регистрация индукционной кривой
замедленной флуоресценции листьев с расчетом тех же параметров.
ЗАДАНИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
1. Включите флуориметр и подсоединенный к нему компьютер. Выберите режим измерения параметров ЗФ.
2. Первая кювета флуориметра должна быть пустой. В остальные кюветы поместите высечки из листьев растений. Листья возьмите от разных растений и растущих в разных условиях – например, на хорошо освещенном месте и в тени. Кнопкой ПУСК интерфейса программы включите измерения.
3. По окончании измерений запишите полученные значения в таблицу !
4. Выберите режим записи индукционной кривой. Кнопкой ПУСК запустите
программу.
5. Полученный массив значений используйте для построения индукционной
кривой ЗФ в программе Exel. Распечатав ее, вклейте в тетрадь.
6. По индукционной кривой определите F0, Fm, Fvar, Fst. Внесите значения в
таблицу 2. Сравните результаты.
7. Сделайте выводы по полученным результатам.
27
Таблица 1
Параметры ЗФ листьев
Параметр
1
2
Фо
Фм
Фпер
ЗФв
ЗФн
В/Н
Таблица 2
Параметры индукционной кривой ЗФ листьев
Параметр
1
2
F0
Fm
Fvar
Fst
Первый лист: F0 =
Fm =
Fvar = (Fm - F0)/ Fm =
Второй лист: F0 =
Fm =
Fvar = (Fm - F0)/ Fm =
ВЫВОДЫ
Контрольные вопросы:
1. Каков механизм возникновения замедленной флуоресценции?
2. Чем замедленная флуоресценция отличается от обычной (быстрой)?
3. Что такое индукционная кривая?
4. Как можно зарегистрировать послесвечение?
5. Что такое F0 и Fm?
6. Что такое (Fm - F0)/ Fm?
РАБОТА ПРОВЕРЕНА_________________________________(________________)
РАБОТА СДАНА______________________________________(________________)
28
БИОФИЗИКА
Рабочая тетрадь по биофизике для студентов агрономических
специальностей
Составители:
Плутахин Геннадий Андреевич
Мачнева Надежда Леонидовна
Кораблева Людмила Михайловна
Подписано в печать ____________. Усл. печ. л. 1,8.
Тираж ___. Заказ № ___
Типография ФГБОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет»
350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13
29
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа