close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

(2,6-дигалогенбензил)пиримидин-4(3Н)

код для вставкиСкачать
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Волгоградский государственный технический университет»
На правах рукописи
Бабушкин Александр Сергеевич
2-(Алкилсульфанил)-6-(2,6-дигалогенбензил)пиримидин-4(3Н)-оны: синтез и
исследование физико-химических свойств и энантиоселективности
противовирусного действия
02.00.03 - Органическая химия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Волгоград – 2014
Работа
выполнена
на
кафедре
«Органическая
химия»
Волгоградского
государственного технического университета.
Научный руководитель
доктор химических наук, доцент
Навроцкий Максим Борисович.
Научный консультант
академик РАН, доктор химических наук
Новаков Иван Александрович.
Официальные оппоненты:
Злотин Сергей Григорьевич,
доктор химических наук, профессор,
Институт органической химии им. Н.Д. Зелинского
РАН, заместитель директора;
Озеров Александр Александрович,
доктор химических наук, профессор,
Волгоградский
государственный
университет,
кафедра
медицинский
фармацевтической
и
токсикологической химии, заведующий кафедрой.
Ведущая организация:
ФГАОУ
ВПО
"Северо-Кавказский
федеральный
университет", г. Ставрополь
Защита
состоится
«23»
декабря
2014
г.
в
12-00
часов
на
заседании
диссертационного совета Д 212.028.01, созданного на базе Волгоградского
государственного технического университета по адресу: 400005, Волгоград,
проспект Ленина, 28, ауд. 209.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Волгоградского
государственного технического университета и на сайте www.vstu.ru по ссылке
http://vstu.ru/nauka/dissertatsionnye-sovety/zaschita/babushkin-aleksandrsergeevich.html
Автореферат разослан «23» октября 2014 года.
Учёный секретарь
диссертационного совета,
кандидат химических наук, доцент
Дрябина Светлана Сергеевна
2
ВВЕДЕНИЕ1
Актуальность
содержащие
темы.
различные
Производные
6-бензилпиримидин-4(3Н)-она,
гетерофункциональные
группы
в
положении
2
пиримидинового гетероцикла, были впервые получены и охарактеризованы Marino
Artico и соавторами, как анти-ВИЧ-1 агенты в 1993 году. Начиная с этого момента
был выполнен целый ряд химических модификаций отдельных представителей
этого класса соединений, направленных на оптимизацию их структуры, повышение
противовирусной активности и безопасности. В результате было показано, что
наиболее высокий уровень противовирусной активности соответствует веществам,
содержащим 2,6-дигалогенбензильный радикал в положении 6 пиримидинового
гетероцикла,
являющихся
формальными
производными
2-тиотимина
и
изоцитозина. Первоначально считалось, что наибольшей активностью обладают
2,6-дифтор-замещенные производные. В 2004 году на примере производных 2{[(метилсульфанил)метил]сульфанил}пиримидин-4(3Н)-она
было
впервые
показано, что несимметричное замещение ароматического ядра и переход к 2-фтор6-хлор-замещенным
аналогичная
производным
закономерность
является
предпочтительным.
подтвердилась
в
случае
Позднее,
функциональных
производных 2-тиоурацила, несущих фрагмент ацетофенона или ацетанилида при
атоме серы, а также - для производных 2-(диметиламино)пиримидин-4(3Н)-она.
Несмотря на это, открытым остался вопрос о противовирусных свойствах
производных 6-(2-фтор-6-хлорбензил)-2-тиоурацила, содержащих гомоалкильный
фрагмент при атоме серы. Основываясь на установленной ранее высокой
противовирусной
активности
конформационно
ограниченных
хиральных
производных 6-бензилпиримидин-4(3Н)-она, содержащих две метильные группы в
-положении бензильного радикала и положении С5 пиримидинового гетероцикла,
виделось оправданным исследование соответствующих соединений, содержащих
2-фтор-6-хлорбензильный
фрагмент.
В
свете
изложенного
выше,
была
сформулирована цель и задачи настоящей работы.
Автор выражает глубокую признательность директору ЦКП «ФХМИ», д.х.н., профессору Орлинсону Б.С.
и доценту кафедры «Органическая химия», к.х.н. Брунилиной Л.Л. за участие в обсуждении результатов
работы.
1
3
Цель: разработка эффективных путей синтеза новых производных 2(алкилсульфанил)-6-(2,6-дигалогенбензил)пиримидин-4(3Н)-она, исследование их
физико-химических свойств и энантиоселективности биологического действия.
Задачи:
1.
Разработка
структур
новых
функциональных
производных
2-
(алкилсульфанил)-6-(2-фтор-6-хлорбензил)пиримидин-4(3Н)-она, как вероятных
ингибиторов репликации ВИЧ-1 ненуклеозидной природы.
2.
Синтез и исследование физико-химических свойств целевых соединений и
ключевых интермедиатов их получения.
3.
Сравнительная оценка противовирусной активности и цитотоксичности
полученных соединений с использованием инфицированных диким штаммом и
клинически
релевантными
мутантными
штаммами
ВИЧ-1
и
квази-
инфицированных колоний клеток лимфоидной ткани.
4.
Изучение молекулярного механизма действия полученных соединений на
основе энзимологических исследований с использованием рекомбинантного
гетеродимера ревертазы дикого штамма ВИЧ-1 и её изоформ.
5.
Разработка методов разделения веществ-лидеров на отдельные энантиомеры
и сравнительная оценка их биологической активности.
6.
Установление взаимосвязей химической структуры и биологической активности
полученных
веществ.
Рационализация
установленных
закономерностей
через
построение модели взаимодействия веществ лидеров с биологической мишенью.
Научная новизна работы. Впервые с использованием спектроскопии
кругового дихроизма и эффекта Коттона выполнено отнесение стереоконфигурации
хирального
бензильного
атома
углерода
в
индивидуальных
энантиомерах
производных 2-(алкилсульфанил)-6-[1-(2-фтор-6-хлорфенил)алкил]пиримидин-4(3Н)она, и показано, что повышению уровня анти-ВИЧ-1 активности соответствует Rконфигурация этого центра, в то время как S-изомеры - менее активны.
Впервые с использованием сопоставления результатов молекулярного
докинга и констант ингибирования рекомбинантной ревертазы ВИЧ, выполнено
отнесение конфигурации хиральных центров в алкилсульфанильных группах
новых
производных
2-(алкилсульфанил)-6-(2-фтор-6-хлорбензил)пиримидин-
4
4(3Н)-она. Установлена связь угла вращения плоскости поляризации в этих
веществах с абсолютной конфигурацией стереогенных центров в этих соединениях.
С использованием реакций региоселективного -С-алкилирования 2-(2,6дигалогенфенил)уксусных кислот в присутствии системы диизопропиламид лития 1,3-диметил-1,3-пропиленмочевина, с высоким выходом получены исходные
вещества для синтеза новых производных 2-(алкилсульфанил)-6-(2-фтор-6хлорбензил)пиримидин-4(3Н)-она - 2-(2,6-дигалогенфенил)алкановые кислоты.
На основании реакции ацилирования монокалиевых солей алкилмалоновых
кислот
2-(2,6-дигалогенфенил)алкановыми
кислотами
в
присутствии
модифицированной системы Ратке (хлорид магния - N,N-диизопропил-N-этиламин)
и N,N-карбонилдиимидазола, в качестве конденсирующего агента, с высоким
выходом
и
чистотой
получены
ключевые
интермедиаты
синтеза
новых
производных 2-(алкилсульфанил)-6-(2-фтор-6-хлорбензил)пиримидин-4(3Н)-она этиловые эфиры 4-(2,6-дигалогенфенил)-3-оксобутановых кислот.
С помощью методов молекулярного моделирования установлена взаимосвязь
стереоконфигурации хирального центра алифатического радикала при атоме серы в
полученных производных 2-(алкилсульфанил)-6-(2-фтор-6-хлорбензил)пиримидин4(3Н)-она с способностью к связыванию с аллостерическим участком ревертазы ВИЧ1, объяснены пути взаимодействия полученных соединений с этой биомишенью.
Практическая значимость работы. Разработаны эффективные способы
получения новых функциональных производных 2-(алкилсульфанил)-6-(2-фтор-6хлорбензил)пиримидин-4(3Н)-она, обладающих противовирусными свойствами, на
основе 2-(2-фтор-6-хлорфенил)уксусной кислоты.
С использованием нормальнофазовой хиральной препаративной хроматографии
разработан метод разделения рацемических смесей новых производных 2-(алкилсульфанил)6-(2-фтор-6-хлорбензил)пиримидин-4(3Н)-она.
Получены
стереоизомеры
наиболее
активных синтезированных соединений и установлена взаимосвязь стереоконфигурации
хиральных центров их молекул с уровнем противовирусной активности. Установлено, что
правовращающие энантиомеры являются более активными противовирусными агентами,
чем их левовращающие оптические антиподы.
5
Впервые получены вещества, превосходящие по уровню анти-ВИЧ-1
активности (дикий штамм ВИЧ-1 NL4-3) невирапин в 4000, а ифавиренц - более
чем в 200 раз, при значительно более низком уровне цитотоксичности.
Показано, что 2-(изопропилсульфанил)- и 2-(циклопентилсульфанил)-5метил-6-[1-(2-фтор-6-хлорфенил)этил]пиримидин-4(3Н)-оны
могут
рассматриваться как прототипы для получения новых производных этого ряда,
имеющих реальную перспективу применения в составе комбинированной
высокоэффективной противовирусной терапии.
Личный вклад автора. Соискателем проведено выполнение химических
экспериментов
в
части
получения,
анализа
и
подтверждения
чистоты
синтезированных соединений, в том числе, получено 46 соединений, не описанных
ранее, обобщение и анализ литературных данных по проблеме диссертационного
исследования, диссертация и автореферат написаны самостоятельно.
Апробация
работы.
Результаты
работы
докладывались
на
Междисциплинарном симпозиуме по медицинской, органической и биологической
химии – 2014. МедОргБиоХим–2014 (пос. Новый Свет (Крым), 2014 г.), Уральском
научном форуме "Современные проблемы органической химии" (Екатеринбург,
2014 г.), а также ежегодных научных сессиях ВолгГТУ.
Публикации. По содержанию диссертации опубликовано 2 статьи в
изданиях, включенных в перечень ВАК РФ, и 2 тезиса научных докладов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы,
посвященного взаимосвязи химической структуры и свойств биологически активных
производных 6-бензилпиримидин-4(3Н)-она, обсуждения результатов, экспериментальной
части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 145 страницах машинописного
текста и содержит 12 таблиц, 7 рисунков, 182 литературные ссылки.
Настоящая работа выполнена при поддержке гранта Президента РФ для
молодых ученых - докторов наук МД-1658.2014.3 и Минобразования России в рамках
базовой части государственного задания (проект №2896), в целях реализации
программы стратегического развития ФГБОУ ВПО ВолгГТУ на 2012-2014 годы.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Производные бензилпиримидин-4(3Н)-она: химическая
структура, синтез и биологические свойства.
6
Проанализированы литературные данные по взаимосвязи химической структуры и
свойств биологически активных функциональных производных 6-бензилпиримидин-4(3Н)-она.
Глава 2. Результаты и их обсуждение
2.1.
Получение полупродуктов синтеза и целевых производных 2-
(алкилсульфанил)-6-[1-(2,6-дигалогенфенил)алкил]пиримидин-4(3Н)-она
Целевые производные 2-(алкилсульфанил)-6-(2-фтор-6-хлорбензил)пиримидин4(3Н)-она (7-12) были синтезированы наряду с производными 2-(алкилсульфанил)-6-(2,6дифторбензил)пиримидин-4(3Н)-она
(13-15),
исходя
из
соответствующих
2-(2,6-
дигалогенфенил)уксусных кислот (1,2). Все полученные производные 2-(алкилсульфанил)6-(2-фтор-6-хлорбензил)пиримидин-4(3Н)-она были получены впервые, в то время как
некоторые
из
стандартов
сравнения
-
производных
2-(алкилсульфанил)-6-(2,6-
дифторбензил)пиримидин-4(3Н)-она были описаны в литературе ранее.
Синтез данных веществ осуществляется через следующие стадии: 1) -Салкилировании исходных 2-(2,6-дигалогенфенил)уксусных кислот (1,2) йодистым
метилом или этилом, с использованием лития диизопропиламида в качестве основания
(схема 1); 2) применении полученных 2-(2,6-дигалогенфенил)алкановых кислот (3-6,
выход - 65-80%) для ацилирования калия 3-оксо-3-этоксипропаноата, с использованием
модифицированной системы Ратке (хлорид магния - N,N-диизопропил-N-этиламин) и
N,N'-карбонилдиимидазола в качестве конденсирующего агента, с образованием
соответствующих 3-оксоэфиров (17, выход - 65-78%) (схема 2); 3) циклоконденсации
полученных 3-оксоэфиров с тиомочевиной в основной среде и получении производных
2-тиоурацила (18, выход - 49-69%) (схема 3); 4) S-алкилировании производных 2тиоурацила
галогеналканами
в
присутствии
безводного
калия
карбоната
с
образованием целевых веществ (7-15, выход - 65-89%) (схема 4).
Схема 1
1,2
3-6
где:
R1 = Cl (1, 3, 4), F (2, 5, 6); R2 = CH3 (3, 5), C2H5 (4, 6). DMPU - 1,3-диметилгексагидропиримидин-2-он.
Характерной
особенностью
дигалогенфенил)алкановых
кислот
метода
является
7
получения
использование
в
(2,6качестве
сорастворителя
и
комплексообразующего
гидропиримидин-2-она,
который
позволяет
агента
1,3-диметилгекса-
обеспечить
повышение
региоселективности процесса и выхода искомых продуктов моноалкилирования за
счет повышения растворимости промежуточного соединения - реактива Иванова, а
также эффекта специфической сольватации переходного комплекса.
Выделение
проводилось
с
целевых
веществ
использованием
(3-6,
соединение
кислотно-щелочной
4
является
экстракции,
новым)
а
их
дополнительная очистка - методом колоночной хроматографии. Аналитические
образцы твердых продуктов были получены путем кристаллизации из пентана (до
постоянной температуры плавления).
Схема 2
1-6
17a-i
где:
R1 = Cl (1, 3, 4, 17a-f), F (2, 5, 6, 17g, 17h, 17i); R2 = H (1, 2, 17a, 17b), CH3 (3, 5, 17c, 17d,
17e, 17g, 17h), C2H5 (4, 6, 17f, 17i); R3 = H (17a, 17c), CH3 (17b, 17d, 17f, 17g, 17i), C2H5 (17e, 17h).
Технические продукты, полученные после простой экстрактивной обработки
реакционной массы, имели достаточную для последующих превращений степень
чистоты. Дополнительная очистка полученных соединений (3-оксоэфиры 17a-i, из
которых 17e и 17f - новые) выполнялась методом колоночной хроматографии (в
случае твердых продуктов - с дополнительной кристаллизацией из гексана).
Следует отметить, что этот модифицированный способ синтеза 3оксоэфиров имеет ряд важных особенностей. С одной стороны, он реализуется по
"бесхлорному" варианту, позволяя миновать стадию образования хлорангидрида
кислоты. Ацилирующий агент - 1-ацил-1Н-имидазол получается in situ из исходной
кислоты и N,N'-карбонилдиимидазола, причем единственным газообразным
побочным продуктом является углекислый газ. Также, немаловажно отметить, что
этот метод синтеза исключает применение пожароопасных металлических
оснований, таких как реактивы Гриньяра или гидриды щелочных металлов.
8
Применение же N,N-диизопропил-N-этиламина в сочетании с хлоридом магния,
позволяет повысить выход целевых веществ на 10-15%, по сравнению с
использованием классической системы Ратке, содержащей триэтиламин.
Схема 3
17a-i
18a-i
где:
R1 = Cl (17a-f, 18a-f ), F (17g, 17h, 17i, 18g, 18h, 18i); R2 = H (17a, 17b, 18a, 18b), CH3 (17c,
17d, 17e, 17g, 17h, 18c, 18d, 18e, 18g, 18h), C2H5 (17f, 17i, 18f, 18i); R3 = H (17a, 17c, 18a, 18c), CH3
(17b, 17d, 17f, 17g, 17i, 18b, 18d, 18f, 18g, 18i), C2H5 (17e, 17h, 18e, 18h).
Выделение и очистка целевых веществ (2-тиоурацилы 18a-i, из которых 18c-f и
18h - новые) были выполнены путем осаждения уксусной кислотой из воднощелочного раствора. Для получения аналитических образцов вещества дополнительно
очищались перекристаллизацией из полярных органических растворителей.
Следует отметить, что для некоторых 3-оксоэфиров протекание этой реакции
было осложнено экранированием кето-группы алифатическими радикалами. В этой
связи, продукты синтеза первоначально выделялись в виде масла, а процедура их
очистки
дополнялась
колоночной
хроматографией
с
гравитационным
элюированием в градиенте этилацетата в петролейном эфире (40-70оС).
Реакция
S-алкилирования
полученных
производных
2-тиоксо-2,3-
дигидропиримидин-4(1Н)-она разнообразными йодистыми алкилами легла в
основу получения целевых структур, представляющих практический интерес с
точки зрения противовирусной активности и изучения энантиоселективности
действия. Эта реакция проводится с использованием карбоната калия в качестве
основания, в среде безводного ДМФА, в соответствии со следующим уравнением:
9
Схема 4
18a-i
7-15a-e
где:
R1 = Cl (7-12a-e, 18a-f), F (13-15a-e, 18g, 18h, 18i); R2 = H (7-8a-e, 18a, 18b), CH3 (9-11a-e,
13-14a-e, 18c, 18d, 18e, 18g, 18h), C2H5 (12a-e, 15a-e, 18f, 18i); R3 = H (7a-e, 9a-e, 18a, 18c), CH3 (8ae, 10a-e, 12a-e, 13a-e, 15a-e, 18b, 18d, 18f, 18g, 18i), C2H5 (11a-e, 14a-e, 18e, 18h); Alk = i-C3H7 (7a12a), n-C3H7 (7b-12b), s-C4H9 (7c-12c), n-C4H9 (7d-12d), c-C5H9 (7e-12e).
Полученные соединения (7-15a-e, из которых 7-12a-e, 13b, 14a-e, 15b, 15d всего 38 - не описаны ранее в литературе) были выделены путем экстрактивной
обработки реакционной массы, с последующей хроматографической очисткой и
перекристаллизацией из углеводородных растворителей или ацетонитрила.
Химическая структура и чистота полученных веществ определялись с
использованием
комплекса
методов:
тонкослойной
хроматографии,
Н-ЯМР-
1
спектроскопии, масс-спектрометрии и элементного анализа. Содержание основного
вещества было установлено на основании данных ВЭЖХ с УФ-детектором (=260 нм).
Было установлено, что при регистрации масс-спектров в режиме ионизации
электроспреем (МС-ЭСИ) для всех полученных веществ характерным является ион
М+1. При анализе спектров
1
Н-ЯМР отмечен ряд характеристических групп
сигналов, которые условно можно разделить на сигналы атомов водорода
бензильного положения, заместителя при С5 пиримидинового гетероцикла, группы
N3H, алифатического радикала при экзоциклическом атоме серы, заместителя при
бензильном углероде и атомов водорода ароматического ядра.
Основным признаком, позволяющим различить между собой производные,
содержащие 2-фтор-6-хлорфенил и 2,6-дифторфенил, является различие характера и
взаимного расположения атомов водорода в ароматическом ядре. В области 6.806.90 м.д. в структуре производных 6-(2-фтор-6-хлорбензил)пиримидин-4(3Н)-она
характерным триплетом проявляется сигнал атома водорода положения 4
ароматического ядра, в то время как атомы водорода в положения 3 и 5 дают
10
мультиплетный сигнал в области 7.10-7.30 м.д. В 2,6-дифтор-замещенных
соединениях наблюдается обратный порядок взаимного расположения этих
сигналов, а именно: в области 6.80-6.90 м.д. в форме мультиплета регистрируются
сигналы атомов водорода при С3 и С5 бензольного ядра, а сигнал атома водорода при
С4 ароматического ядра также дает мультиплетный сигнал в области 7.10-7.30 м.д.
Мультиплетность сигналов в этих соединениях в значительной степени объясняется
их расщеплением на ядрах атома (или атомов) фтора, а взаимное расположение существенным различием констант Гаммета для атомов фтора и хлора.
2.2.
Разделение
энантиомеров
некоторых
производных
2-
(алкилсульфанил)-6-[1-(2-фтор-6-хлорфенил)этил]пиримидин-4(3Н)-она
и
отнесение стереоконфигурации при бензильном атоме углерода2
С целью изучения взаимосвязи между конфигурацией стереогенных центров,
оптической и биологической активностью, для некоторых из наиболее активных
производных
2-(алкилсульфанил)-6-(2-фтор-6-хлорбензил)пиримидин-4(3Н)-она,
выявленных в ходе биологических исследований (см. разделы 2.3. и 2.4.), а именно
-
2-(втор-бутилсульфанил)-6-[1-(2-фтор-6-хлорфенил)этил]пиримидин-4(3Н)-она
(9c), 2-(изопропилсульфанил)-5-метил-6-[1-(2-фтор-6-хлорфенил)этил]пиримидин4(3Н)-она
(10а)
и
2-(втор-бутилсульфанил)-5-метил-6-[1-(2-фтор-6-
хлорфенил)этил]пиримидин-4(3Н)-она (10c) (схема 5), было выполнено разделение
последних на отдельные оптические изомеры:
Схема 5
где:
R1 = H; R2 = CH3 (9с) (2 хиральных центра). R1 = CH3; R2 = H (10a) (1 хиральный центр). R1
= CH3; R2 = CH3 (10c) (2 хиральных центра)
Автор выражает глубокую признательность Cirilli R. (Istituto Superiore di Sanità, Dipartimento del Farmaco)
за проведение исследований с помощью хиральной ВЭЖХ.
2
11
Для
этого
была
использована
полупрепаративная
нормальнофазовая
жидкостная хроматография на хиральной фазе Chiralpak IA с использованием
двухканального КД/УФ-детектора. Характерный вид хроматограммы приведен ниже:
Рисунок 1 - Хроматограмма, показывающая разделение ±2-(втор-бутилсульфанил)-6-[1-(2-фтор-6хлорфенил)этил]пиримидин-4(3Н)-она (9с) с одновременным УФ- (черная кривая) и КД-детектированием
(оранжевая кривая). (Ниже приведены кривые контроля чистоты при полупрепаративном разделении, где
"ее" - степень энантиомерного обогащения, а "de" - степень диастереомерного обогащения.)
Ввиду того, что спектры кругового дихроизма структурно родственных
соединений зависят, в большей степени, от конфигурации хирального бензильного
атома углерода, было выполнено сравнение КД-спектров отдельных энантиомеров
12
полученных веществ и соединений сравнения - (S,R)- и (R,R)-диастереомеров 2(втор-бутилсульфанил)-6-[1-(2,6-дихлорфенил)пропил]-5-метилпиримидин-4(3Н)она. На основе сопоставления спектров кругового дихроизма отдельных
энантиомеров разделяемых соединений со спектром кругового дихроизма вещества
сравнения, руководствуясь эффектом Коттона, был сделан вывод о конфигурации
бензильного атома углерода. Соответствующие кривые приведены ниже:
Рисунок 2 - Сопоставление спектров кругового дихроизма отдельных энантиомеров
изученных веществ 9c, 10a, 10c и двух диастереомеров 2-(втор-бутилсульфанил)-6-[1-(2,6дихлорфенил)пропил]-5-метилпиримидин-4(3Н)-она (в этаноле), в координатах эллиптичность
(градусы по оси ординат) и длина волны (нм, по оси абсцисс).
Таким образом, было показано, в частности, что правовращающей форме
соответствует
2-(изопропилсульфанил)-5-метил-6-[(1R)-1-(2-фтор-6-
13
хлорфенил)этил]пиримидин-4(3Н)-он,
а
левовращающей
-
S-изомер
этого
соединения. Аналогичным образом выполнены отнесения для веществ 10a, 10c.
2.3. Биологические исследования рацемических форм полученных
производных 2-(алкилсульфанил)-6-(2,6-дигалогенбензил)пиримидин-4(3Н)-она
с использованием инфицированных и квази-инфицированных колоний клеток3
Исследования противовирусной активности и цитотоксичности полученных
соединений
были
выполнены
с
использованием
колоний
клеток
МТ-4,
жизнеспособность которых оценивалась с использованием МТТ-метода. Для
каждого из веществ были определены значения ЭК50 - 50%-ной эффективной
концентрации (приводящей к подавлению цитопатических эффектов ВИЧ-1 в
культуре клеток на 50%), ЦК50 - 50%-ной цитотоксической концентрации
(приводящей к гибели 50% клеток в контрольной группе) и их соотношение
(ЦК50/ЭК50), характеризующее индекс селективности (ИС) вещества. Данные этих
исследований по веществам-лидерам в сравнении со стандартами - невирапином
(Вирамун) и ифавиренцом (Стокрин) приведены в таблице 1.
Таблица 1 - Противовирусная активность веществ-лидеров в отношении дикого штамма ВИЧ-1
10a, 10b, 10e
Вещество
Alk
Невирапин
ЭК50, пмоль
Ифавиренц
ЦК50, пмоль
Индекс
селективности
10a
i-C3H7
40
>15*106
>375000
10b
n-C3H7
50
>15*105
>30000
10e
c-C5H9
30
>15*106
>500000
Невирапин
120000
>7*106
>62
Ифавиренц
7000
>3*106
>429
Автор выражает глубокую признательность Este J. A. (IrsiCaixa, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol,
Universitat Autònoma de Barcelona) за проведение биологических исследований.
3
14
Из
данных
таблицы
видно,
что
полученные
соединения-лидеры
с
существенным отрывом опережают два ненуклеозидных ингибитора ВИЧ-1,
широко применяемых в России.
Аналогичные исследования были проведены также для панели клинически
значимых мутантных штаммов ВИЧ-1. В данном случае, однако, наиболее
перспективными оказались и некоторые другие, из числа полученных веществ.
Соответствующие данные приведены в таблице 2.
Таблица 2 - Противовирусная активность веществ-лидеров в отношении клинически
значимых мутантных штаммов ВИЧ-1
Вещество R1
R2
ЭК50, нмоль
Alk
K103N
Y181C
Y188L
10e
Cl
H
c-C5H9
93
230
2900
15a
F
CH3
i-C3H7
530
750
270
15c
F
CH3
s-C4H9
200
300
900
Невирапин
5600
>7000
>7000
Ифавиренц
340
13
1970
В данном случае, с уверенностью можно сказать, что полученные
соединения составляют серьезную конкуренцию невирапину, как потенциальные
импорт-замещающие средства. В то же время, по совокупности данных, их нельзя
назвать безоговорочными лидерами по сравнению с ифавиренцом, который также
весьма активно подавляет репликацию рассмотренных мутантных штаммов ВИЧ-1.
Таким образом, можно заключить, что несимметричное замещение бензольного
ядра в указанных производных обеспечивает соединениям уверенный рост
противовирусного действия в отношении дикого штамма ВИЧ-1, в то время как для
15
достижения широкого спектра действия вещества этого может оказаться
недостаточно.
Энзимологические
2.4.
производных
исследования
рацемических
форм
новых
2-(алкилсульфанил)-6-(2,6-дигалогенбензил)пиримидин-4(3Н)-
она4
Ввиду того, что обратная транскриптаза ВИЧ-1 рассматривается как одна из
основных биологических мишеней полученных веществ в жизненном цикле ВИЧ1, полученные соединения были изучены, как ингибиторы обратной траснкриптазы
дикого штамма ВИЧ-1 и клинически значимых изоформ этого фермента.
Эффективность веществ характеризуется величиной ИК50 - концентрацией
вещества, приводящей к 50%-ному подавлению активности ревертазы ВИЧ-1.
Полученные данные для веществ-лидеров и стандартов приведены в таблице 3.
Таблица 3 - Ингибирующая активность веществ-лидеров в отношении обратной
транскриптазы дикого штамма ВИЧ-1 и её клинически значимых изоформ
Вещество R1
R2
ИК50, мкмоль
Alk
wt
K103N
Y181I
L100I
10c
Cl
CH3
s-C4H9
3*10-4
1.75
35.0
75*10-3
13e
F
CH3
c-C5H9
5*10-3
3*10-2
0.9
0.3
15c
F
C2H5
s-C4H9
6*10-3
0.14
4.0
48*10-3
Невирапин
0.4
7.0
35.0
9.0
Ифавиренц
3*10-2
3.0
0.08
-
Таким образом, можно сделать вывод о том, что наиболее активные из
полученных веществ не уступают невирапину, однако несколько проигрывают
ифавиренцу в отношении изоформы фермента Y181I. Кроме этого, отчетливо
видно, что способность блокировать активность ревертазы у полученных веществ
заметно ниже, чем собственно противовирусная активность. Нет также и сильной
корреляции между этими двумя параметрами. Это приводит к заключению о том,
что полученные соединения оказывают влияние на целый набор биологических
Автор выражает глубокую признательность начальнику исследовательского отдела Instituto di Genetica
Molecolare IGM-CNR G. Maga за проведение энзимологических исследований.
4
16
мишеней в жизненном цикле вируса, то есть представляют собой multi-target антиВИЧ-1 агенты.
2.5. Биологические (in vitro) и докинговые (in silico) исследования
энантиоселективности
действия
некоторых
новых
производных
2-
(алкилсульфанил)-6-[1-(2-фтор-6-хлорфенил)этил]пиримидин-4(3Н)-она5
Вещества 9c, 10a, 10c, выделенные методом полупрепаративной ВЭЖХ,
были исследованы на предмет энантиоселективности действия с использованием
инфицированных и квази-инфицированных колоний клеток МТ-4, а также рекомбинантной ревертазы дикого штамма ВИЧ-1 и её клинически значимых
изоформ. Данные исследований на колониях клеток суммированы в таблице 4.
Таблица 4 - Противовирусная и цитотоксическая активность соединений 9c, 10a, 10c в
отношении дикого и клинически значимых мутантных штаммов ВИЧ-1
Вещество
ЭК50, мкмоль
ЦК50
ИС (wt)
NL4-3 wt
K103N
Y181C
Y188L
9c (рацемат)
4*10-3
1.3
2.3
19.2
>73
>18250
(R,S)-(+)-9c'
11*10-3
1.22
1.24
7.4
>39
>3545
(S,S)-(+)-9c"
0.144
7.64
>73.3
>73.3
>73
>507
(R,R)-(-)-9c"
3*10-4
0.2
0.58
0.86
>31
>103333
(S,R)-(-)-9c'
47*10-3
5.56
13.2
51.6
>52
>1106
10a (рацемат)
1*10-4
0.22
0.99
6.3
>73
>730000
-5
(R)-(-)-10a
3*10
0.01
0.15
0.35
>23.5
>783333
(S)-(+)-10a
0.22
>36.9
>36.9
>36.9
>36.9
>168.7
10c (рацемат)
9*10-4
0.06
0.41
2.1
>70.4
>78222
(R,R)-(-)-10c'
6*10-5
15*10-3
87*10-3
0.39
>70.4
>1733333
-4
(S,R)-(-)-10c"
14*10
0.15
0.89
3.3
>70.4
>50285
(S,S)-(+)-10c"
3.66
3.66
>47
>47
>47
>12.8
(R,S)-(+)-10c'
43.9
>70
64
>70
>70.4
>1.6
Невирапин
0.12
5.6
>7
>7
>7
>62
Ифавиренц
7*10-3
0.34
13*10-3
1.97
>3
>429
Автор выражает глубокую признательность Prof. R. Ragno (Rome Center for Molecular Design, Dipartimento
di Chimica e Tecnologie del Farmaco, Università degli Studi di Roma “La Sapienza”) за проведение докинговых
исследований и Este J. A. (IrsiCaixa, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol, Universitat Autònoma de
Barcelona) за проведение биологических исследований.
5
17
Из
приведенной
таблицы
отчетливо
заметна
выраженная
связь
противовирусной активности с конфигурацией бензильного атома углерода.
Меньшее влияние оказывает конфигурация стереогенного центра втор-бутильного
радикала при атоме серы6.
При изучении способности тех же веществ ингибировать активность
обратной транскриптазы дикого штамма ВИЧ-1 и её клинически значимых
изоформ, были получены результаты, суммированные в таблице 5.
Таблица 5 - Ингибирующая активность соединений 9c, 10a, 10c в отношении обратной
транскриптазы дикого штамма ВИЧ-1 и её клинически значимых изоформ
Вещество
ИК50
wt
K103N
Y181I
L100I
9c (рацемат)
13*10-3
10.2
>20
0.13
(R,S)-(+)-9c'
27*10-3
6.16
>20
0.65
(S,S)-(+)-9c"
0.55
>20
>20
2.22
(R,R)-(-)-9c"
38*10-4
1.61
14.11
69*10-3
(S,R)-(-)-9c'
41*10-3
14.8
>20
0.15
10a (рацемат)
15*10-3
3.20
>40
0.50
(R)-(-)-10a
9*10-3
0.61
21.19
0.18
(S)-(+)-10a
3.35
>40
>40
1.49
10c (рацемат)
11*10-3
12.43
>40
0.38
(R,R)-(-)-10c'
1*10-3
0.1
3.55
41*10-3
(S,R)-(-)-10c"
14*10-3
0.97
>40
0.52
(S,S)-(+)-10c"
4.66
>40
>40
0.91
(R,S)-(+)-10c'
5.92
>40
>40
0.60
Невирапин
0.4
7.0
35.0
9.0
Ифавиренц
0.03
3.0
0.08
-
Представленные
в
таблице
результаты,
демонстрируют
энантиоселективность действия полученных веществ в их способности связываться
Конфигурации стереогенных центров, выделенные подчеркиванием, были определены на основе данных
исследований по молекулярному моделированию, которые приведены ниже.
6
18
с аллостерическим участком обратной транскриптазы. В данном случае, важный
вклад дает как конфигурация бензильного атома углерода, так и стереогенного
центра заместителя при атоме серы. Кроме этого, сопоставление этих результатов с
соответствующими данными по прямой противовирусной активности, еще больше
указывают на то, что для этих соединений существуют и другие, не менее
значимые биологические мишени ВИЧ-1.
В
таблице
6
представлены
данные
о
соотношениях
десятичных
антилогарифмов величин ИК50, полученные путем расчета и на основе
эксперимента.
Расчет,
направленный
на
построение
модели
комплекса
биологической мишени - обратной транскриптазы ВИЧ-1 с ингибитором, был
выполнен с использованием протокола COMBINEr, при помощи программного
пакета Vina Autodock.
Таблица 6 - Соотношение антилогарифмов расчетных и экспериментальных значений
ингибирующих концентраций соединений 9c, 10a, 10c в отношении обратной транскриптазы
дикого штамма ВИЧ-1 и её клинически значимых изоформ
Вещество
wt
K103N
Y181I
L100I
эксп.
выч.
эксп.
выч.
эксп.
выч.
эксп.
выч.
(R,S)-(+)-9c'
6.262
9.035
4.699
4.531
4.699
5.847
5.654
4.822
(S,S)-(+)-9c"
7.570
9.029
5.211
4.69
4.699
6.004
6.188
5.138
(R,R)-(-)-9c"
8.425
9.277
5.792
5.362
4.850
5.793
7.163
6.932
(S,R)-(-)-9c'
7.392
9.029
4.83
4.69
4.699
6.596
6.829
7.134
(R,R)-(-)-10c'
9.000
9.299
6.996
7.182
5.450
5.358
7.387
8.514
(S,R)-(-)-10c"
7.854
9.323
6.012
6.001
4.398
5.665
6.281
6.840
(S,S)-(+)-10c"
5.331
5.623
4.398
6.000
4.398
5.355
6.040
5.137
(R,S)-(+)-10c'
5.228
5.204
4.398
5.457
4.398
5.570
6.225
5.357
Данные, приведенные в таблице говорят о хорошей сходимости значений
антилогарифмов ингибирующих концентраций, определенных экспериментально и
установленных с использованием компьютерного моделирования. Иными словами,
эти значения являются мерой констант связывания или констант устойчивости
комплекса фермента с ингибитором. Хорошая сходимость теоретических и
19
экспериментальных значений, в свою очередь, свидетельствует об адекватности
примененной модели, что позволило использовать структуру рассчитанных
комплексов для отнесения абсолютной конфигурации стереогенного центра в
структуре заместителя при атоме серы. На рисунке 4 представлено графическое
соотношение
между
расчетными
и
экспериментальными
значениями
антилогарифмов ингибирующих концентраций.
Рисунок 3 - Графическое отображение соотношений антилогарифмов расчетных (по оси
ординат) и экспериментальных (по оси абсцисс) значений ингибирующих концентраций
диастереомеров веществ 9c, 10c.
Структуры комплексов аллостерического участка связывания с двумя
оптическими
изомерами
2-(втор-бутилсульфанил)-5-метил-6-[1-(2-фтор-6-
хлорфенил)этил]пиримидин-4(3Н)-она,
различающимися
стереоконфигурацией
хирального центра в структуре заместителя при атоме серы приведены на рисунке
4. Для сравнения представлена также структура комплекса ненуклеозидного
ингибитора обратной транскриптазы ВИЧ-1 - делавирдина с аллостерическим
участком связывания (экспериментальные данные).
20
(R,R)-(-)-10c'
(S,R)-(-)-10c'
Делавирдин
(оранжевый)
(голубой)
(пурпурный)
Рисунок 4 - Сравнение моделей связывания стереоизомеров (R,R)-10c' (оранжевый) и (S,R)10c" (голубой) с аллостерическим участком связывания (серый) ревертазы дикого штамма ВИЧ-1
(слева). Комплекс молекулы делавирдина (пурпурный) с аллостерическим участком связывания
(серый) ревертазы дикого штамма ВИЧ-1 (справа).
Для молекулярного моделирования была использована экспериментальная
структура
комплекса
аллостерического
участка
связывания
обратной
транскриптазы дикого штамма ВИЧ-1, представленная в Protein Data Bank под
кодом 1KLM. Из этого комплекса была удалена молекула делавирдина, а взамен
нее вписана молекула одного из исследуемых веществ, с предварительной
оптимизацией геометрии последней. После этого, было выполнено докинговое
исследование, которое было направлено на оптимизацию геометрии комплекса, с
минимизацией его свободной энергии. В результате, было установлено, что изомер
(R,R)-(-)-10c'
обладает
гораздо
большим
сродством
к
аллостерическому
связыванию фермента, чем изомер (S,R)-(-)-10c'. В эксперименте это выражается
21
снижением ингибирующей концентрации в 14 раз. На рисунке 4 хорошо заметна
различная ориентация втор-бутильной группы при атоме серы, связанная с
абсолютной конфигурацией атома С2 в структуре этого радикала. В свою очередь,
такое репозиционирование втор-бутила отвечает за увеличение ингибирующей
активности вещества.
Глава 3. Экспериментальная часть
Содержит подробное описание методов синтеза полупродуктов и целевых
соединений, выделения индивидуальных энантиомеров некоторых из них, а также информацию о биологических исследованиях полученных веществ.
Выводы
1.
Разработан
и
синтезирован
ряд
функциональных
(алкилсульфанил)-6-(2,6-дигалогенбензил)пиримидин-4(3Н)-она.
производных
На
2-
примере
оптических изомеров некоторых из этих веществ выполнено отнесение абсолютной
конфигурации стереогенных центров их молекул и показана её взаимосвязь с углом
вращения плоскости поляризации и биологическими свойствами соответствующих
энантиомеров.
2.
Предложен
эффективный
и
простой
метод региоселективного
-C-
моноалкилирования 2-(2,6-дигалогенфенил)уксусных кислот с использованием
системы лития диизопропиламид - 1,3-диметилгексагидропиримидин-2-он.
3.
Усовершенствован способ синтеза этиловых эфиров 4-(2,6-дигалогенфенил)-
3-оксобутановых кислот, с использованием моноацилирования монокалиевых
солей
этиловых
эфиров
2-алкилмалоновых
кислот
свободными
2-(2,6-
дигалогенфенил)уксусными кислотами, в присутствии модифицированной системы
Ратке (безводный хлорид магния - N,N-диизопропил-N-этиламин) и N,N'карбонилдиимидазола, в качестве конденсирующего агента, позволивший в мягких
условиях с хорошим выходом получать целевые 3-оксоэфиры.
4.
Предложен
метод
установления
абсолютной
конфигурации
асимметрического атома углерода -замещенного 2-фтор-6-хлорбензильного
радикала
в
новых
производных
2-(алкилсульфанил)-6-(2,6-
дигалогенбензил)пиримидин-4(3Н)-она, путем соотнесения спектров кругового
дихроизма полученных соединений со стандартным веществом, выполнено
22
отнесение,
и
установлено,
что
максимум
противовирусного
действия
ассоциируется с R-конфигурацией этого хирального центра.
5.
С использованием программного пакета Autodock Vina и протокола
COMBINEr,
установлена
алифатического
заместителя
абсолютная
при
атоме
стереоконфигурация
серы
и
её
влияние
хирального
на
способ
взаимодействия вещества с биологической мишенью. Показан высокий уровень
сходимости расчетных и экспериментальных данных о способности вещества к
ингибированию обратной транскриптазы ВИЧ-1.
6.
На основании данных энзимологических исследований установлено, что
основной биологической мишенью действия этих веществ является обратная
транскриптаза ВИЧ-1. Модель взаимодействия этих веществ с субстратом
реконструирована с использованием подходов молекулярного докинга.
7.
Впервые получены вещества, превосходящие по уровню анти-ВИЧ-1
активности невирапин в несколько тысяч, а ифавиренц - в несколько сот раз, при
условии
сопоставимой
соединения
могут
или
более
рассматриваться
низкой
как
цитотоксичности.
прототипы
при
Полученные
создании
новых
высокоэффективных противоретровирусных агентов.
Основные публикации по теме диссертации
Публикации в журналах, включенных в перечень ВАК
1.
Convenient Synthesis of Building-Blocks for Pyridine / Piperidine-Decorated
Crown Ethers (Усовершенствованный синтез билдинг-блоков для получения краунэфиров с пиридиновыми или пиперидиновыми фрагментами) / Навроцкий М.Б.,
Горбунов Е.Б., Бабушкин А.С., Ручко Е.А., Русинов Г.Л., Чарушин В.Н., Новаков
И.А. // Макрогетероциклы = Macroheterocycles. - 2014. - Т. 7, № 1. - C. 18-22.
2.
Exploring the Role of 2-Chloro-6-fluoro Substitution in 2-Alkylthio-6-benzyl-5-
alkylpyrimidin-4(3H)-ones: Effects in HIV-1-Infected Cells and in HIV-1 Reverse
Transcriptase Enzymes / D. Rotili, D. Tarantino, M.B. Nawrozkij, A.S. Babushkin, G.
Botta, B. Marrocco, R. Cirilli, S. Menta, R. Badia, E. Crespan, F. Ballante, R. Ragno,
J.A. Esté, G. Maga, A. Mai // Journal of Medicinal Chemistry. - 2014. - Vol. 57, No. 12. P. 5212-5225.
23
Тезисы докладов
3.
Синтез
и
сравнительная
оценка
противовирусной
активности
конформационно ограниченных карбоаналогов умифеновира / Новаков И.А.,
Каменева
И.Ю.,
Захарова
Е.К.,
Бабушкин
А.С.,
Навроцкий
М.Б.
//
Междисциплинарный симпозиум по медицинской, органической и биологической
химии – 2014. МедОргБиоХим–2014 (МОБИ-Хим2014), пос. Новый Свет (Крым),
25-28 мая 2014 г. : сб. тез. / МГУ им. М.В. Ломоносова, Химический факультет [и
др.]. - [М.], 2014. - C. 104-105.
4.
Синтез, цитотоксическая и противовирусная активность новых производных
6-[1-(2,6-дифторфенил)циклопропил]-2-тиотимина / Balzarini J., Бабушкин А.С.,
Ручко Е.А., Захарова Е.К., Новаков И.А., Навроцкий М.Б. // Уральский научный
форум "Современные проблемы органической химии" : сб. тез. (в рамках XVII
молодёжной школы-конференции по органической химии, Екатеринбург, 8-12
июня 2014 г.) / Уральский федеральный ун-т [и др.]. - Екатеринбург, 2014. - C. 45.
Подписано в печать 2014 г. Заказ № . Тираж 100 экз. Печ. л. 1,0
Формат 60 х 84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная.
Типография ИУНЛ
Волгоградского государственного технического университета.
400005, г. Волгоград, просп. им. В.И.Ленина, 28, корп. №7
24
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа