close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Методические указания к выполнению дипломного проекта;doc

код для вставкиСкачать
Проточная цитофлуориметрия в мониторинге
ВИЧ и СПИД
Пичугина Л.В.
к.м.н., ЗАО «БиоХимМак Диагностика»
CD4+ и ВИЧ
•
1981 г – впервые описано снижение
количества Т-хелперов (CD4+) у ВИЧинфицированных
Newman JT, Nicodemus DS, Ordonez GA, Stone MJ. Lymphocyte
phenotyping by fluorescence microscopy and flow cytometry:
Results in homosexual men and heterosexual controls. AIDS Res
983;1:127–134.
•
1995г - появление коммерчески доступных,
одобренных FDA, тестов на вирусную нагрузку
Вирусная нагрузка + абсолютное количество CD4+клеток
золотой стандарт мониторинга ВИЧ-инфицированных
Стратегия действия ВИЧ
•
Для инфицирования ВИЧ необходимо наличие молекулы
CD4, экпрессирующейся Т-хелперами и
антигенпрезентирующими клетками
CD4 – корецепторная структура Т-клеточного рецептора.
Представлена на T-хелперах и участвует в распознавании антигена
при антиген-специфическом иммунном ответе.
Цитотоксический Т-лф
CD3+CD8+
Гемопоэз
Т-хелпер
CD3+CD4+
Антигенпредставляющие
Клетки
Макрофаги/моноциты,
дендритные клетки
В-клетка
CD19+
NK (естественные
киллеры)
CD3-CD56+CD16+
Сеть цитокинов
Стратегия действия ВИЧ
Выключение субкласса Т-хелперов вызывает нарушение
баланса продукции цитокинов и клеточных взаимодействий,
что приводит к развитию функциональной недостаточности
цитотоксических CD8+ клеток, В и NK клеток, нарушению
гемопоэза.
Цитотоксический Т-лф
CD3+CD8+
Гемопоэз
Т-хелпер
CD3+CD4+
Антигенпредставляющие
Клетки
Макрофаги/моноциты,
дендритные клетки
В-клетка
CD19+
NK (естественные
киллеры)
CD3-CD56+CD16+
CD4 на клетках
CD4 присутствует на других клетках
• Моноциты
• Макрофаги
• Дендритные клетки
Репликация вируса в дендритной клетке в 30 раз
выше, чем в Т-хелпере
Поражение антигенпредставляющего звена иммунной
системы снижает противоинфекционную защиту в
первую очередь от внутриклеточных патогенов
(M.tuberculosis)
Основные оцениваемые
параметры состояния иммунной
системы
1) Абсолютное и относительное количество основных субпопуляций лимфоцитов
Т-хелперы, Т-цитотоксические, В-клетки, NK.
2) Относительное количество активированных лимфоцитов
2) Функциональное состояние гранулоцитов и моноцитов –
фагоцитарная и бактерицидная активности
3) Функциональное состояние лимфоцитов – продукция цитокинов
под действием специфических и поликлональных стимуляторов
Проточная цитометрия
Проточная цитофлуориметрия позволяет различать клетки сходные по морфологическим
признакам по наличию белков-маркеров (фенотип)
Clusters of Differentiation – CD – кластеры дифференцировки (>350 молекул)
CD45
CD45
CD4
CD3
CD45
CD8
CD45
CD45
CD45
CD45
CD19
CD19
CD45
CD3
CD3
CD4+ Т-лимфоцит
(T-хелпер)
CD45
CD45
CD45
CD3
CD19
CD19
В-лимфоцит
CD8+ цитотоксический
Т-лимфоцит
Детекция по окраске специфическими антителами, конъюгированными с флуоресцентными
красителями.
Современные проточные цитофлуориметры позволяют определять 10 и более видов белков на
одной клетке одновременно.
Активационные маркеры
•
Нарушение клеточных взаимодействий + высокая вирусная нагрузка
вызывает активацию иммунной системы. Избыточная активация
приводит к стимуляции репликации вируса и инфицированию новых
клеток.
Активацию можно оценить по наличию специальных маркеров
•
HLA-DR – молекула гистосовместимости II класса, в норме на Тклетках практически не экспрессируется
•
CD38 – в норме экспрессируется на клетках костного мозга, тимоцитах,
NK-клетках.
На Т-клетках (CD4+ и CD8+) HLA-DR и CD38 появляются только при
активации
Активационные маркеры
CD38 – ценный прогностический маркер
У пациентов с низким уровнем
CD8+CD38+HLA-DR+ необходимость
назначения антиретровирусной терапии
возникает позже (Cossarizza A. et al., (2012) T Cell activation
but Not Polyfunctionality after Primary HIV Infection Predicts Control of Viral
Load and Length of the Time without Therapy. PLoS ONE 7(12): e50728)
Высокий уровень CD8+CD38+ сопряжен с
высокой вирусной нагрузкой и
прогрессивным уменьшением количества
CD4+ клеток
Повышение уровня CD8+CD38+ неблагоприятный прогноз
Прямое влияние ВИЧ на
фагоцитоз
gp120
gp120
Оценка фагоцитоза.
Принцип метода.
Поглощение
E.Coli FITC
Окислительный взрыв
DHR123
E.coli
FagoFlow & IngoFlow
Оценка фагоцитоза методом проточной
цитометрии
(кат.№ ED7042)
(кат.№ ED7040)
Продукция
Cytomics FC500
1 или 2 лазера
7 параметров на 1 клетку
Navios
2 или 3 лазера
От 8 до 12 параметров на 1 клетку
Автоматический загрузчик проб на 32 пробирки
Автоматические приложения для подсчета CD4+ клеток и других субпопуляций
Сканер штрих-кода индивидуальной пробирки
Высокая производительность
Интуитивно-понятное программное обеспечение
Продукция
Pima Analyser
Портативный цитометр для подсчета клеток
с фенотипом CD3+CD4+ в периферической
крови
•Анализ 20 минут
•Отсутствие пробоподготовки
•Не требует инсталляции инженером и промывок
•Не контактирует с инфицированным материалом
(реакция в картридже)
•Мобильный – 2,5 кг
•Работает от аккумуляторов или сети
•Не требует высокой квалификации персонала
Картридж Pima CD4
Крышка
Основание
Штрих-код
Крышка
канала
Капилляр
Трубка
Оболочк
а
Коллектор образца
Идентификато
р образца
Образцы:
Венозная кровь (ЭДТА)
Капиллярная кровь
Реагент сухой
Моноклональные антитела:
CD3 – PE-Cy5
CD4 – PE
Соль ЭДТА
Результат
Pima Analyser
Удачное решение для мобильных лабораторий и лабораторий с
потоком 10-12 пациентов в день
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа