close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Кривушина Диана Александровна. Спектрофотометрическое определение малонового диальдегида и пролина в некоторых плодовых растениях

код для вставки
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ
ФЕДЕРАЦРШ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ
УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ
«ОРловскШ/і ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УРШВЕРСИТЕТ
имени И.С. ТУРГЕНЕВА»
ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА
по направлению подготовки 04.04.01 Химия
направленность (профиль) Аналитическая химия
Студента Кривушиной Дианы Александровны
шифр 151582
ФЗКУЛЬТСТ естественных наук
Тема выпускной квалификационной работы
Спектрофотометрическое определение малонового Диальдегида и пролина в
некоторых ПЛОДОВЫХ растениях
‘,
Студент
Руководитель
Зав. кафедрой химии
/
‹Ыщым
!
‚`
%
7“
%%
Ё/(подпись)
Орел 2017
Кривушина Д. А.
,
Грибанов Е.Н.
Оскотская Э. Р.
Оглавление:
ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 4
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ........................................................................................... 6
Глава 1. Обзор литературы ............................................................................................. 6
1.1 Общая характеристика пролина .......................................................................... 6
1.2 Синтез пролина в растительных клетках ............................................................ 9
1.3 Сигнальные и гормональные посредники, участвующие в индукции синтеза
пролина ................................................................................................................. 11
1.4 Функции пролина в стрессовых условиях ........................................................ 15
1.5 Общая характеристика малонового диальдегида ............................................ 19
1.6 Синтез малонового диальдегида в растительных клетках.............................. 20
1.7 Метод определения пролина .............................................................................. 22
1.8 Методы определения маловового диальдегида ............................................... 22
1.8.1 УФ - спектрофотометрия ............................................................................. 22
1.8.2 Высокоэффективный капиллярный электрофорез ................................. 23
Глава 2. Основные пути адаптации плодовых растений к низким температурам . 24
2.1 Действие низкой температуры на плодовые растения .................................... 24
2.2 Приспособления растений к перенесению низких температур ...................... 31
2.3 Системы регуляции у растений .......................................................................... 34
Выводы к теоретической части.................................................................................... 39
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ............................................................................. 40
Глава 3. Методика эксперимента................................................................................. 40
3.1 Используемые реактивы и растворы ................................................................ 40
3.2 Измерительная аппаратура ................................................................................. 40
3.3 Математическая обработка результатов эксперимента .................................. 41
3
3.4 Методика построения градуировочного графика для количественного
определения пролина .......................................................................................... 42
3.5 Методика определения пролина в плодовых растениях ................................. 44
3.6 Методика определения малонового диальдегида ............................................ 45
Глава 4. Результаты исследований .............................................................................. 46
4.1 Градуировочный график для количественного определения пролина .......... 46
4.2 Определение содержания пролина в некоторых плодовых растениях до
воздействия низкой температуры ...................................................................... 46
4.3 Определение содержания малонового диальдегида в некоторых плодовых
растениях до воздействия низкой температуры .............................................. 47
4.4 Определение содержания пролина в некоторых плодовых растениях после
воздействия низкой температуры ...................................................................... 48
4.5 Определение содержания малонового диальдегида в некоторых плодовых
растениях после воздействия низкой температуры ......................................... 48
Выводы к экспериментальной части ........................................................................... 50
Выводы ........................................................................................................................... 51
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................... 52
4
ВВЕДЕНИЕ
Действие биотических стрессоров вызывает снижение продуктивности и
уменьшение биоразнообразия культурных растении [1, 2]. При воздействии
разнообразных экстремальных факторов среды у растений, в первую очередь
повреждаются мембранные структуры. Это происходит из-за избыточного
образования активных форм кислорода [3]. Защиту растений от их действия
осуществляют антиоксиданты. Растения под действием стрессового фактора
активируют защитный механизм, заключающийся в синтезе разнообразных
веществ – пролина, специфических сахаров, полиаминов, беатинов, являющихся
активаторами продуцирования аминокислот, а впоследствии - белков (отвечают за
иммунные процессы). Среди аминокислот, выполняющих в растениях защитные
функции, особого внимания заслуживает пролин. Он способствует повышению
иммунитета растений в стрессовых ситуациях и накоплению азота, является
прекурсором вкуса, усиливает способность семян к прорастанию, улучшает
эффективность фотосинтеза и увеличивает содержание хлорофилла. Его действие
заключается также в улучшении генеративного развития растений и их
плодородия, он влияет на завязывание плодов, регулирует водообмен в растении.
Известно, что увеличение внутриклеточного содержания пролина у плодовых
растений происходит при действии разнообразных стрессорных факторов.
Известно, что содержание в растениях молонового диальдегида является
показателем
активности
окислительных
процессов,
обусловленных
кислородосодержащими радикалами и отражать адаптационную способность
растений. Исследования химического состава растений показывают, что уровень
накопления биологически активных веществ в растениях является интегральным
отражением действия на них экстремальных условий [4].
Исследования, касающиеся количественного определения этих двух классов
метаболитов, в плодовых растениях немногочисленны.
В связи с этим, представляет интерес совместное определение пролина и
МДА в плодовых растениях.
5
Целью работы явилось определение содержания пролина и малонового
диальдегида в зависимости от воздействия фактора низких температур.
Для достижения поставленной цели сформулированы и решены следующие
теоретические и практические задачи:
- обобщить и систематизировать литературные данные о биохимических
свойствах пролина и МДА, их свойствах, путях образования в растениях;
- провести литературный обзор имеющихся методов и методик определения
пролина и МДА в плодовых растениях, показать их достоинства и
недостатки;
- определить
содержание
пролина
и
МДА
в
плодовых
растениях,
подвергшихся воздействию температурного стресса;
- выявить
зависимость
между
содержанием
пролина
и
малонового
диальдегида в плодовых растениях, и воздействием температурного стресса.
Научная и практическая новизна.
В работе спектрофотометрически определено содержание пролина и
малонового диальдегида в однолетних побегах плодовых растений. На основе
полученных данных впервые показана корреляционная зависимость между
содержанием МДА и пролина в растениях, а также их устойчивость к низким
температурам. Полученные данные представляют практический интерес при
селекционном выведении новых сортов плодовых растений устойчивых к
воздействию стрессовых факторов.
6
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Глава 1. Обзор литературы
В данном разделе рассмотрены общие сведения о пролине и МДА, пути
образования
в
растительной
клетке.
Выполняемые
функции,
а
также
существующие методы их обнаружения.
1.1 Общая характеристика пролина
Пролин (Р) - альфа-аминокислота, одна из двадцати ДНК-кодируемых
аминокислот. Его кодоны ЦЦУ, ЦЦЦ, ЦЦА и ЦЦГ. Пролин не является
незаменимой аминокислотой, то есть может синтезироваться в организме
человека. Эта аминокислота считается уникальной среди 20 аминокислот,
формирующих белки потому, что аминный азот здесь привязан не к одной, а к
двум алкильным группам, что делает вещество вторичным амином. Более
распространенная L - форма в стереохимии обозначается как S [5].
Ричард Вильштеттер синтезировал пролин с помощью реакции натриевой
соли диэтилового эфира малоновой кислоты с 1,3-дибромпропаном. Герман
Эмиль Фишер изолировал пролин из казеина и продуктов распада γ – фталимидопропилмалонового эфира [5].
Своеобразная циклическая структура пролина в боковой цепи ограничивает
его  - задний двугранный угол примерно на 60°, что обеспечивает пролину
исключительную конформационную жесткость по сравнению с другими
аминокислотами (рис. 1.).
Рис.1. Формула аминокислоты пролина
Следовательно, пролин теряет меньше конформационной энтропии при
фолдинге (складывании), что может объяснить его широкое распространение в
белках
термофильных
организмов.
Пролин
действует
как
структурный
7
разрушитель в середине регулярных элементов вторичной структуры, таких как α
- спирали и β - листы. Пролин обычно встречается в качестве первого остатка α спирали, а также в крайних нитях β - листов. Пролин также часто встречается на
изгибах, что может объяснить такой любопытный факт, что пролин, как правило,
подвергается растворению, несмотря на наличие совершенно алифатических
боковых цепей. Когда пролин связан, как амид, пептидной связью, его азот не
взаимодействует ни с каким атомом водорода, то есть не может служить донором
в водородной связи, однако может участвовать в ней в качестве акцептора.
Различные взаимодействия боковых цепей/аминных групп позволяют пролину
образовывать бета изгибы. Несколько пролинов и/или гидроксипролинов в ряду
могут создавать полипролиновую спираль, преобладающую вторичную структуру
коллагена. Гидроксилирование пролина с помощью пролилгидроксилазы (или
других
добавок
электроноакцепторных
заместителей,
таких
как
фтор)
значительно увеличивает конформационную стабильность коллагена. Таким
образом, гидроксилирование пролина является важнейшим биохимическим
фактором для поддержания соединительной ткани высших организмов. Тяжелые
заболевания, такие как цинга, могут быть результатом дефектов данного
гидроксилирования, например, мутации фермента пролилгидроксилазы или
отсутствия необходимого кофактора аскорбиновой кислоты (витамин С).
Последовательности пролина и 2-аминоизомасляной кислоты также образуют
спиральную структуру. Пептидная связь с поступающими частями Р-тРНК-Р
образуется значительно медленнее, чем с другими т-РНК, что является общей
чертой N-алкиламиновых кислот. Образование пептидной связи между входящей
т-РНК и концом цепи пролина также происходит медленно; связь Р-Р образуется
медленнее всего [6].
Пептид
связывается
с
пролином
и
с
другими
N-замещенными
аминокислотами (такими, как саркозин), и способен заполнять как цис - , так и
транс - изомеры. Большинство пептидных связей принимают транс - изомер (в
естественных условиях обычно в 99,9% случаев), главным образом потому, что
8
амид водород (транс - изомер) имеет меньшее стерическое отталкивание с
предыдущим альфа атомом, чем со следующим альфа атомом (цис-изомер). В
противоположность этому, цис- и транс - изомеры X-P пептидной связи (где Х
представляет
собой
любую
аминокислоту)
испытывают
стерические
столкновения с соседними замещениями и энергетически почти равны. Таким
образом, доля X-P пептидных связей в цис - изомере в естественных условиях
составляет от 10 до 40%, эта доля слабо зависит от предыдущей аминокислоты с
ароматическими остатками в пользу цис - изомера. С кинетической точки зрения,
цис-транс-изомеризации пролина - очень медленный процесс, который может
препятствовать прогрессу сворачивания белка путем захвата одного или более
остатков пролина, что имеет решающее значение для складывания ненативных
изомеров, особенно когда нативный белок требует наличия цис-изомеров. Это
происходит потому, что остатки пролина синтезируются исключительно в
рибосоме, как транс - форма изомера. Все организмы имеют ферменты пролил
изомеразы, катализирующие эту изомеризацию, а некоторые бактерии имеют
специальные пролил изомеразы, связанные с рибосомой. Однако не все пролины
необходимы для фолдинга. Фолдинг (складывание) белков может протекать с
нормальной скоростью, несмотря на наличие ненативных конформеров на многих
X-P пептидных связях [7].
У многих растений она накапливается в условиях биотического и
абиотического
стрессового
воздействия.
При
этом
пролин
оказывает
стабилизирующее действие на мембраны, уменьшает осмотический стресс,
защищает белки от денатурации, участвует в передаче стрессового сигнала,
регулирует redox-потенциал клети. Есть также данные, что он участвует в
инактивации свободных радикалов, образуя с ними долгоживущие конъюгаты.
Аккумуляция пролина индуцируется в условиях стресса за счет как
увеличения синтеза, так и восстановления окисленной аминокислоты. Было
показано, что большая часть накопленного пролина в условиях стресса является
результатом увеличения его синтеза из глутамата. Есть еще другой путь синтеза –
9
из аргинина и орнитина. При стрессе часто происходит уменьшение окисления
пролина, что приводит к увеличению его уровня.
1.2 Синтез пролина в растительных клетках
Синтез пролина в клетках происходит следующим образом (рис. 2):
6
N - ацетилглутама
6
орнитин
6
5
глутамат
аргинин
6
6
1
Р5С
GSA
4
2
3
пролин
Рис. 2. Схема синтеза пролина в растительных клетках GSA –
глутаминовый γ - полуальдегид, Р5С - Δ1-пирролин-5-карбоксилат
Синтез может проходить в цитозоле, митохондриях и хлоропластах.
Существует некоторая приуроченность пути синтеза к компартменту. Так, в
цитозоле синтез большей частью происходит из глутамата. При действии Δ1пирролин-5-карбоксилатсинтетазы (P5CR, 1) Глутамат превращается в GSA. При
этом затрачивается молекула АТФ и НАДФН. P5C является таутомером GSA,
поэтому реакция протекает спонтанно в обе стороны. P5C восстанавливается до
пролина под действием Δ1-пирролин-5-карбоксилатредуктазы (2) при затрате еще
одной молекулы НАДФН.
Следует отметить, что конечное звено синтеза пролина и начальное звено
его распада имеют разные ферменты, точно так же, как и синтеза/распада
интермедиатов процесса.
Начальное звено окисления пролина катализируется ФАД-зависимой
пролиндегидрогеназой (PDG, 3). В результате реакции получается P 5C, вода и
ФАДН2. Дальнейшее
окисление
карбоксилатдегидрогеназой
(P5CDG,
восстановленный НАДФ и глутамат.
контролируется
4),
при
этом
Δ1-пирролин-5снова
образуется
10
Альтернативный
процесс
синтеза
происходит
большей
частью
в
митохондриях. Он начинается с аргинина. Его превращение в орнитин
осуществляется при участии воды аргиназой (6). Орнитин δ-амино-трансфераза
(ОАТ, 5) катализирует следующую стадию превращения – в GSA. Для этого
необходим 2-оксоглутарат. Побочным продуктом данной реакции будет являться
глутамат.
Выбор биосинтетического пути также зависит от азотного статуса растения.
Чем выше концентрация N в клетках, тем больше предпочтение будет отдаваться
синтезу через орнитин (N активирует ОАТ-генную экспрессию).
Оба фермента, PDG и P5CDG, связаны с внутренней мембраной
митохондрий со стороны матрикса. При окислении пролина они ответственны за
перенос электронов на первом участке электронтранспортной цепи (ЭТЦ).
Именно
таким
образом
может
регулироваться
соотношение
восстановленной и окисленной формы НАДФ. В хлоропластах синтез пролина
может являться конечным акцептором электронов ЭТЦ.
На первой стадии окисления пролин может реагировать не только с
атомарным кислородом, но и с 1О2. Этим объясняется его антиоксидантная
функция.
В большинстве случаев при действии на растение стрессоров, таких как Cu,
Cr, Cd, Co, Zn, Ni, Al, уровень пролина повышается. Это можно объяснить
увеличивающейся активностью ОАТ и P5CR и неизменяющейся PDG и P5CDG.
Но наблюдаются случаи, когда при воздействии неблагоприятных условий
(например, тяжелых металлов – Cd) уровень пролина уменьшается с увеличением
нагрузки. Это связывают с недостатком потенциала его синтеза.
Именно поэтому нельзя использовать уровень концентрации свободного
пролина в клетке для определения уровня загрязненности среды, в которой
произрастает растение.
11
Хотя увеличение концентрации пролина в ответ на тяжелые металлы было
описано многими авторами, накопление этой аминокислоты в условиях стресса
недостаточно хорошо объяснено.
1.3 Сигнальные и гормональные посредники, участвующие в индукции
синтеза пролина
Механизмы сигнализации, с помощью которых происходит индуцирование
синтеза пролина при действии на растения абиотических стрессоров (в первую
очередь, обезвоживания и засоления) включают в себя абсцизвую кислоту (АБК),
ионы кальция, АФК и, возможно, другие сигнальные и гормональные посредники.
Изменение кальциевого гомеостаза является одной из наиболее ранних
реакций растений на действие стрессоров различной природы. Имеется немало
сведений об активации поступления кальция в клетки растений при осмотическом
и солевом стрессах. Так, в ответ на действие на проростки арабидопсиса
маннитола, вызывающего обезвоживание клеток, концентрация цитозольного
кальция возрастала от 0,1 до 1,65 мкМ. Такой эффект нивелировался ионами
лантана, блокирующими кальциевые каналы.
Значение кальция в синтезе пролина у растений изучалось на разных
объектах. Показана способность Са2+
усиливать накопление пролина в
проростках клевера при осмотическом стрессе, в проростках арабидопсиса в
условиях натрий-хлоридного засоления. Идентичные результаты получены и при
действии соли кальция на сеянцы Casuarina equisetifolia, подвергнутые засухе.
На арабидопсисе было показано угнетение экспрессии гена At5pct, который
кодирует Δ1-пиролин-5-карбоксилатсинтетазу, при обработке растений солью
лантана или ЭГТА перед осмотическим стрессом. Это свидетельствует о роли
кальция в индуцировании синтеза пролина в ответ на обезвоживание.
Антагонисты кальция также угнетали вызываемое действием хлорида натрия
накопление пролина у галофита Nitraria tangutorum Bobr [6]. В необходимом для
синтеза пролина увеличении концентрации цитозольного Ca2+ , по-видимому,
участвует инозитолтрифосфат, освобождаемый из мембранных фосфолипидов
12
фосфолипазой С, поскольку стресс-индуцируемое накопление пролина у растений
угнеталось ингибитором фосфолипазы С U73122.
С другой стороны, на примере галофита Thellungiella halophila с
использованием ингибитора фосфолипазы С U73122 показано, что этот фермент
может выступать как в роли положительного регулятора накопления пролина при
сильном (400 мМ NaCl) стрессовом воздействии, так и в качестве отрицательного
регулятора содержания этой иминокислоты в отсутствие стрессового воздействия
или при слабом (200 мМ NaCl) солевом стрессе.
Позитивным регулятором содержания пролина в условиях жесткого
солевого или осмотического стресса у галофита Thellungiella halophila наряду с
фосфолипазой С может выступать фосфолипаза D. Накопление пролина при
сильном стрессовом воздействии (400 мM NaCl или 400 мМ манитол) угнеталось
бутанолом-1 – ингибитором зависимого от фосфолипазы D образования
фосфатидной кислоты. Как фосфолипаза С, так и фосфолипаза D, задействованы в
регуляции содержания цитозольного кальция. В свою очередь кальциевый сигнал
передается к транскриптфактору MYB2 с участием CaM4 кальмодулина, что
приводит к активации синтеза П5КС1.
Еще одним сигнальным посредником, задействованным в процессах
индуцирования синтеза пролина, может быть пероксид водорода. В клетках
каллусной культуры галофита N. tangutorum в ответ на действие NaCl
происходило повышение содержания пероксида водорода и пролина. Обработка
культуры скавенжером H2O2 диметилтиомочевиной (ДМТМ) препятствовала
накоплению пролина и повышению активности орнитин-δ-аминотрансферазы –
одного из ключевых ферментов орнитинового пути синтеза пролина [7].
Одним из основных ферментативных источников активных форм кислорода
(АФК) у растений является НАДФН-оксидаза. Показано, что индуцируемое
солевым стрессом образование АФК у растений арабидописа происходило с
участием этого фермента и подавлялось его ингибитором дифенилениодониумом.
13
Обработка
растений
ингибитором
НАДФН-оксидазы
снижала
и
их
солеустойчивость.
Предобработка проростков проса скавенжером пероксида водорода ДМТМ
или ингибитором НАДФН-оксидазы имидазолом снимала как вызываемое
солевым стрессом повышение содержания пероксида водорода в растениях проса,
так и накопление пролина в листьях [8]. В связи с этим можно полагать, что
индуцирование
накопления
зависимым
НАДФН-оксидазы
от
пролина
при
солевом
накоплением
стрессе
пероксида
опосредовано
водорода
как
сигнального посредника. Увеличение содержания пролина в растениях под
действием АФК может быть связано с их влиянием на комплекс ферментов,
задействованных в его синтезе, в частности на П5КС.
Увеличение содержания пролина в колеоптилях пшеницы индуцировалось
обработкой пероксидом водорода. Также пероксид водорода вызывал накопление
пролина в колеоптилях и корнях интактных проростков кукурузы, при этом
отмечалось повышение активности и экспрессии гена П5КС и снижение
активности ПДГ. Этими же авторами отмечено повышение под действием H2O2
активности
орнитин-δ-аминотрансферазы
и
глутаматдегидрогеназы,
также
причастных к синтезу пролина.
Накопление пролина в растениях может быть индуцировано и действием
экзогенной салициловой кислоты. Такой эффект, в частности, был получен на
проростках пшеницы. Их обработка салициловой кислотой вызывала накопление
пероксида водорода и повышение содержания пролина в листьях и корнях. При
этом на фоне солевого стресса, который сам по себе повышал содержание
пролина в тканях, отмечалось дополнительное его увеличение в вариантах с
предобработкой салициловой кислотой. Можно полагать, что эффект повышения
салициловой кислотой содержания пролина опосредован АФК, поскольку он
угнетался обработкой проростков антиоксидантом ионолом.
14
В листьях чечевицы отмечалось увеличение содержания пролина под
влиянием экзогенной салициловой кислоты. Оно может быть связано с
повышением активности П5КР и снижением активности ПДГ.
Повышение количества пролина в тканях растений происходит и при
инфицировании растений авирулентными патогенами. В этом случае накоплению
пролина предшествует увеличение содержания салициловой кислоты и АФК и
последующая активация экспрессии гена П5КС2.
Имеются сведения, что накопление пролина может быть индуцировано и
другим стрессовым фитогормоном – АБК. При этом посредником в трансдукции
сигнала, вызывающего экспрессии гена П5КС, также являются АФК.
Весьма неоднозначны сведения об участии брассиностероидов как особого
класса стрессовых фитогормонов в регуляции содержания пролина. У растений
сорго под влиянием брассиностероидов установлено повышение содержания
пролина в условиях водного стресса. На растениях огурца и проростках пшеницы
выявлено повышение содержания пролина при обработке брассиностероидами
без действия стрессоров. Однако у растений перца 24-эпибрассинолид снижал
накопление пролина в условиях засоления. Похожие результаты получены и на
низших – Spirulina platensis [9].
У арабидопсиса экзогенный брассиностероид ингибировал экспрессию гена
основного изофермента П5КС и не влиял на образование транскриптов ПДГ.
Также
24-эпибрассинолид
подавлял
активацию
экспрессии
гена
П5КС,
вызываемую светом, засолением и действием абсцизовой кислоты.
Таким образом, сведения о влиянии брассиностероидов на содержание
пролина весьма противоречивые. Не исключено, что эти эффекты во многом
зависят от видовых (генетических) особенностей растений.
В целом можно говорить об участии широкого спектра сигнальных и
гормональных посредников, задействованных в регуляции экспрессии генов,
контролирующих содержание пролина. Среди них особое значение, по-видимому,
имеют ионы кальция, АФК, абсцизовая и салициловая кислоты.
15
1.4 Функции пролина в стрессовых условиях
Помимо хорошо известной функции как инертного совместимого осмолита,
пролин при действии стрессоров выполняет целый ряд других взаимосвязанных
функций: мембранопротекторную, шаперонную, антиоксидантную, а также
принимает участие в регуляции экспрессии некоторых генов.
В последние годы происходит интенсивное накопление результатов
исследований
таких
функций
пролина.
В
связи
с
эти
представляется
целесообразным подробнее остановится на их вкладе в феноменологию стресспротекторного действия пролина [10].
В ряде исследований показано шаперонное действие пролина на некоторые
белки. Пролин обладает способностью предотвращать образование агрегатов
белковых
молекул.
дегидрогеназы
Показано,
мышечных
что
тканей
пролин
кролика
защищал
от
изозим
денатурации,
M4-лактат
вызываемой
замораживанием-оттаиванием, действием высокой температуры и химических
агентов. Авторы полагают, что в отличие от других осмолитов, пролин
стабилизирует фермент, не только усиливая гидратацию белка, но также и путем
взаимодействия с доступными гидрофобными его областями.
Также выявлено защитное влияние пролина на нитратредуктазу растений
риса,
подвергнутых
воздействию
осмотического
стресса
и
алюминия.
Установлено, что пролин in vitro восстанавливал активность РНКазы проростков
риса после денатурирующего действия арсенита на этот белок.
Как
отдельная
функция
антиоксидантные эффекты
в
настоящее
пролина. Так,
время
экзогенный
рассматриваются
пролин,
уменьшая
содержание активных форм кислорода (АФК), предотвращал программируемую
гибель мутантного
нарушенным
грибного
образованием
патогена люцерны
АФК,
устранял
Colletotrichum trifolii с
индуцируемую
экзогенным
пероксидом водорода фрагментацию ДНК и гибель опухолевых клеток человека.
Показано защитное влияние пролина на растения в условиях окислительного
стресса, вызываемого паракватом и пероксидом водорода [11]. В ряде работ
16
сообщается об уменьшении содержания продукта пероксидного окисления
липидов (ПОЛ) малонового диальдегида в растительных тканях в стрессовых
условиях под влиянием пролина. Установлено, что экзогенный пролин в
концентрации 1 мМ снимал эффект повышения содержания пероксида водорода в
корнях и побегах проростков пшеницы, вызываемый действием гипертермии, в то
же время аланин в такой же концентрации подобного эффекта не проявлял.
Однако механизмы уменьшения содержания пероксида водорода и
возможно других АФК в клетках растений под влиянием пролина объяснить
довольно сложно. Его структурные особенности дают основания рассматривать
возможность прямой инактивации радикальных форм кислорода. Так, пролин
может образовывать устойчивый радикал, поскольку содержит третичный
углеродный атом. Образование такого устойчивого радикала приводит к
«тушению» или обрыву каскада свободнорадикальных реакций, запускаемых
супероксид
-
радикалом,
пероксид-радикалом
или
гидроксил-радикалом.
Антирадикальное действие пролина проявлялось в системе in vitro при реакции со
свободным стабильным радикалом 2,2-дифенил-1- пикрилгидразила. Показано,
что при рН 7-8 свободный пролин, а также его концевые группы в составе
полипептидов, могут прямо реагировать с пероксидом водорода, гидроксильным
радикалом и синглетным кислородом с образованием стабильных свободных
радикалов – аддуктов производных пролина и гидроксипролина(рис.3)
В то же время прямая реакция между пероксидом водорода и пролином
возможна при довольно высоких концентрациях последнего, что ставит под
сомнение значение этого процесса в клетках растений.
Как
отдельная
причина
антиоксидантного
действия
пролина
рассматривается его способность связывать ионы металлов с переменной
валентностью
и
тем
самым
ограничивать
неферментативные
свободнорадикальные процессы [12].
Естественно, что in vivo антиоксидантные эффекты пролина могут
отличаться от его действия в искусственной системе. In vivo представляется
17
весьма вероятным косвенное антиоксидантное действие пролина в стрессовых
условиях, связанное с его шаперонным эффектом в отношении антиоксидантных
ферментов.
Рис. 3. Взаимодействие пролина и АФК.
Как указывалось, выше, экзогенный пролин в относительно низкой
концентрации (1мМ) снимал эффект увеличения содержания пероксида водорода
в корнях проростков пшеницы, вызываемый кратковременным закаливающим
прогревом. На этой же модели показано, что обработка проростков 1 мМ
пролином нивелировала и вызываемое закаливанием повышение активности
антиоксидантных ферментов – СОД, аскорбатпероксидазы и гваяколпероксидазы.
В то же время при обработке проростков 1 мМ аланином подобных эффектов не
наблюдалось.
В контексте упомянутых феноменов следует отметить сравнительные
исследования
функционирования
ферментативной
и
неферментативной
(включающей пролин) антиоксидантных систем растений. Проводившиеся
исследования показали, что в основе высокой солеустойчивости галофита
Thellungiella salsuginea лежит его способность к стресс-зависимому накоплению
пролина. В то же время у растений Plantago major, характеризующихся более
низкой
устойчивостью
к
засолению,
не
обнаруживалось
высокого
18
конститутивного и стресс-индуцированного уровня пролина, но они отличались
высокой конститутивной активностью СОД. Иными словами, между содержанием
пролина и активностью СОД проявлялись реципрокные отношения. Позднее
подобные взаимоотношения между содержанием пролина и активностью СОД
были показаны на ряде других дикорастущих видов растений, а также у сортов
пшеницы [13].
Наряду с возможным влиянием на экспрессию генов и активность
антиоксидантных
ферментов
пролин
может
участвовать
в
регуляции
окислительно-восстановительного баланса клеток путем изменения соотношения
НАДФН/НАДФ+. Известно, что в стрессовых условиях, например, при действии
засухи, засоления, высоких температур, происходит ограничение фиксации CO2,
вследствие чего НАДФН расходуется слабо, что увеличивает вероятность
«утечки» в фотосистеме I электрона от ферредоксина к молекулярному кислороду
в реакции Мелера: 2O2 + 2Fdred → 2O2•− + 2Fdox.
Фотосистема
II
рассматривается
в
качестве
основного
источника
синглетного кислорода. Он образуется в результате перехода хлорофилла Р680 в
триплетное состояние в реакционных центрах ФС II и/или в светособирающем
комплексе. Вероятность образования синглетного кислорода также увеличивается
при
перевосстановленности
электрон-транспортной
цепи
в
результате
поглощения света высокой интенсивности или действия других стресс- факторов.
Активация биосинтеза пролина в хлоропластах в стрессовых условиях
усиливает расход НАДФН и увеличивает количество НАДФ+, который может
быть использован в качестве акцептора электронов. Таким образом, синтез
пролина,
снижая
соотношение
НАДФН/НАДФ+,
может
способствовать
поддержанию потока электронов в электрон- транспортных цепях хлоропластов,
стабилизировать
окислительно-восстановительный
баланс
и
уменьшать
фотоингибирование и повреждения фотосинтетического аппарата. У растений
сои, трансформированных антисмысловым геном П5КР, отмечалось торможение
синтеза пролина, увеличение соотношения НАДФН/НАДФ+ и повышение
19
чувствительности фотосинтетического аппарата к засухе. Напротив, избыточная
экспрессия гена П5КР вызывала увеличение содержания НАДФ+ и повышение
устойчивости растений.
Как функцию, опосредованно связанную с защитными эффектами пролина,
можно рассматривать его окисление в митохондриях с участием ПДГ и ПКДГ. В
этом случае пролин увеличивает восстановительный потенциал митохондрий и
таким образом может способствовать энергоснабжению клеток, что особенно
важно в постстрессовый период.
С другой стороны, как уже упоминалось, катаболизм пролина в
митохондриях может вызывать усиление образования АФК. У растений
арабидопсиса
при
реакции
сверхчувствительности
на
инфицирование
авирулентными патогенами накопление пролина сопровождалось последующим
усилением экспрессии гена ПДГ, повышением активности этого фермента и, как
следствие, увеличением количества П5К. В сочетании с АФК П5К может
функционировать как триггер реакции сверхчувствительности и апоптоза [14].
В целом предполагается, что благодаря способности как связывать АФК,
так и усиливать их образование пролин может быть задействован в АФКсигналинге.
1.5 Общая характеристика малонового диальдегида
Малондиальдегид, малоновый диальдегид (MДA) — альдегид с формулой
CH2(CHO)2. Возникает при деградации полиненасыщенных жиров активными
формами кислорода, служит маркером перекисного окисления жиров (в том числе
и при действии излучения) и оксидативного стресса [15]. Вследствие дальнейших
биохимических превращений он окисляется до диоксида углерода или вступает во
взаимодействие с фосфолипидами, аминокислотами и нуклеиновыми кислотами.
Рис. 4. Формула малонового диальдегида
20
Малоновый диальдегид образует шиффовы основания с аминогруппами
белка, выступая в качестве "сшивающего" агента. В результате сшивки
образуются нерастворимые липид-белковые комплексы, называемые пигментами
изнашивания или липофусцинами.
Малоновый диальдегид в клетках плодовых деревьев – это признак
неблагоприятный, так как он свидетельствует о том, что происходит активное
перекисное
окисление
липидов.
Когда
свободные
радикалы
разрывают
полиненасыщенные жирные кислоты, процесс окисления выходит из-под
контроля
и
образующийся
альдегид
начинает
«склеивать»
белковые
аминогруппы. Подобные вредные соединения называются липофусцинами –
пигментами «старения».
1.6 Синтез малонового диальдегида в растительных клетках
Повреждения липидов АФК приводят к перекисному окислению липидов
(ПОЛ), вызывая в остатках полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) цепные
реакции
с
образованием
липидных
радикалов
L•,
пероксилов
LOO•
,
гидропероксидов LOOH и алкоксилов LO•:
LH
+НО∙
Н 2О
L•
+ О2
(а)
LOO•
+LH
L• ….
+Fe2+
LOOH
-Fe 3+
-HO.
+LH
(б)
LO• -LOH L• → ….
Первые три превращения (а) представляют собой начало и ход цепной
реакции (инициация). В ходе третьего превращения наряду с липидным
радикалом образуется гидропероксид. Последний, взаимодействуя с ионами
металлов переменной валентности, находящихся в восстановленной форме,
например с Fe2+ или Cu2+, создают разветвления цепи (б). Накапливающиеся в
результате цепной реакции гидропероксиды жирных кислот, входящих в состав
липидов, подвергаются распаду по следующей схеме:
21
------
Н Н
–CH–CH–CH=CH– → –СH–С + C–CH2–
О ᅳ ОН
О
Гидропероксид
О
Карбонильные соединения
Продукты расщепления, несущие двойную связь, под действием радикалов
подвергаются дальнейшему перекисному окислению и распаду. В результате
жирные кислоты образуют целый ряд соединений. Многие из них представляют
собой альдегиды, которые обладают высокой биологической активностью и часто
высокотоксичны. При распаде жирных кислот, сопровождающем ПОЛ, сначала
образуют диеновые коньюгаты, а затем такие метаболиты, как малоновый
диальдегид.
Продуктами ПОЛ могут быть и более простые соединения, например, такие,
как пентан и этан. ПОЛ прежде всего повреждает клеточные мембраны, что в
свою очередь приводит к нарушениям функций мембранных белков и нарушению
внутриклеточной
компартментации
веществ.
Продукты
окислительной
модификации липидов (4-гидроксиалкенали, соединения типа С5Н9–СНОН–
СН=СР–СНО и малоновый диальдегид) вызывают мутации и блокируют
клеточное деление.
Прежде
ПОЛ
считали
исключительно
спонтанным
процессом,
протекающим без участия ферментов. Затем было показано, что важную роль в
ПОЛ играют и ферментативные реакции, в частности реакции, катализируемые
липоксигеназами. В норме липоксигеназы не активны. Активация этого фермента
наблюдается при стрессах, связанных с повреждением растений, при нападении
насекомых или травоядных животных. Окисление липидов с помощью этих
ферментов приводит к образованию специфических веществ – эйкозаноидов,
выполняющих функцию сигнальных молекул при экспрессии генов. Таким
образом, в результате перекисного окисления липидов мембран возникает целый
каскад свободнорадикальных реакций с образованием разнообразных спиртов,
эфиров, альдегидов. Среди этих соединений могут быть и токсичные. Например,
22
4-гидрокси-2-ноненал, 4-гидрокси-2-гексанал, малоновый диальдегид оказывают
токсическое действие в клетках растений, модифицируя структуру белков и ДНК.
1.7 Метод определения пролина
Содержание
свободного
пролина
определяют
с
помощью
кислого
нингидринового реактива (30 мл ледяной уксусной кислоты + 20 мл 6М H3PO4 +
1,25 г нингидрина) по методу Бейтса с соавт.
Навеску свежей растительной ткани листьев (200 мг) заливают в пробирке
5-20 мл кипящей дистиллированоой воды и на 10 минут помещают в кипящую
водяную баню. В чистую пробирку приливают 1 мл ледяной уксусной кислоты и
1 мл нингидринового реактива, затем приливают 1 мл экстракта. Пробы
инкубируют в течение 1 часа в кипящей водяной бане,
после чего быстро охлаждали во льду. Интенсивность окраски определяют
спектрофотометрически при длинне волны 520 нм.
Значения содержания пролина рассчитывают с помощью калибровочной
кривой, используя для ее построения пролин фирмы «Serva». Определение
содержания пролина проводят в 2-х биологический и 2-х аналитических
повторностях.
1.8 Методы определения маловового диальдегида
Известно, что для выделения и изучения малонового диальдегида
используют
различные
методы,
основанные
на
получении
окрашенного
триметинового комплекса малонового диальдегида с тиобарбитуровой кислотой,
количество которого определяется по оптической плотности при 532 нм.
1.8.1 УФ - спектрофотометрия
Наиболее близким к заявляемому способу техническим решением является
способ
определения
малонового
диальдегида
в
растениях.
Для
этого
растительный материал гомогенизируют в 20%-ной трихлоруксусной кислоте,
центрифугируют и в супернатант добавляют 0,5%-ную тиобарбитуровую кислоту
в 20%-ной трихлоруксусной кислоте и эту смесь инкубируют 30 мин при 95°C. В
23
качестве
контроля
используют
раствор
тиобарбитуровой
кислоты
в
трихлоруксусной кислоте [16].
Недостатки способа: при взаимодействии альдегидов с нуклеофилами
образуются вещества, из которых альдегиды могут легко регенерироваться под
действием кислоты, что снижает точность их количественного определения [17].
1.8.2 Высокоэффективный капиллярный электрофорез
Задачей изобретения является определение малонового диальдегида
методом высокоэффективного капиллярного электрофореза для повышения
точности обеспечения экспрессных и достоверных количественных результатов
при минимальных затратах на пробоподготовку и выполнение анализа.
Образец листьев массой 0,1 заливают 1,5 см 96%-ного этанола и тщательно
гомогенизируют. Затем экстракцию проводят на шейкере в течение 30 минут.
Полученный экстракт центрифугируют 15 мин при 10000 g. К 0,3 см супернатанта
добавляют 1,2 см 0,5% водного раствора тиобарбитуровой кислоты в
бидистиллированной воде и полученную реакционную смесь инкубируют 30
минут при 50°C, затем охлаждают и центрифугируют 15 мин при 10000 g.
Содержание остаточной тиобарбитуровой кислоты в супернатанте определяют
методом капиллярного электрофореза. В качестве контроля использовали 1,2
см3 0,5% водного раствора тиобарбитуровой кислоты в бидистиллированной воде
в смеси с 0,3 см 96% этанола. Полученные растворы переносили для анализа в
систему капиллярного электрофореза.
Расчет содержания малонового диальдегида проводят по формуле:
=
,
где Cx - содержание малонового диальдегида, мкмоль/г сырой массы; E оптическая плотность раствора; Ve - объем экстракта, мл; Va - объем экстракта,
взятый для анализа, мл; k – коэффициент молярной экстинкции МДА=156 мМ-1 ×
см-1; mв - масса образца для экстракции, г [18].
24
Глава 2. Основные пути адаптации плодовых растений к низким
температурам
2.1 Действие низкой температуры на плодовые растения
В настоящее время считается, что основными причинами, вызывающими
гибель растений от холода, являются или непосредственное действие низких
температур на клетки, не связанное с образованием льда в тканях, или же
образование льда в тканях снаружи клеток либо внутри них. С одной стороны,
было установлено, что внутриклеточное замерзание воды всегда приводит к их
немедленно гибели, во всяком случае, в лабораторных условиях, имитирующих
природные. С другой стороны, все растения, зимующие в условиях умеренного
климата, переносят внеклеточное замерзание значительных количеств воды [19].
Мгновенное
и
необратимое
повреждение
клеток
при
образовании
внутриклеточного льда указывает на физическую природу процесса: вероятнее
всего происходит разрушение мембран клетки растущими в протоплазме
кристаллами льда. В тоже время, рассматривая причины вымерзания растений,
Г.А. Самыгин отмечает, что в природных условиях очень редко имеет место
внутриклеточное образование льда, поскольку оно возможно только при очень
быстром снижении температуры, достигающим 10–120С в час. В естественных же
условиях температура воздуха снижается со скоростью 1–20С в час или даже еще
медленнее. В этом случае происходит внеклеточное образование льда.
Повреждения при образовании льда вне клеток вызываются двумя
основными
причинами:
повреждениями
обезвоживанием
обезвоженной
протопластов
протоплазмы.
У
и
механическими
закаленных
растений
преимущественно причиной гибели являются механические повреждения, у
незакаленных – обезвоживание протоплазмы [20].
Обезвоживание
растительной
клетки
имеет ряд
опасных
для
нее
последствий, которые могут привести ее к гибели. Это, во-первых, повышение
концентрации растворенных веществ, и, прежде всего, солей; во-вторых,
изменение рН внутриклеточных растворов; в третьих, образование ковалентных
25
связей между макромолекулами; в четвертых, конформационные изменения
структуры макромолекул из-за снижения содержания стабилизирующих их
молекул воды; в-пятых, нарушение структуры мембран, и наконец, в шестых, это
повреждение структуры протоплазмы при обратном поглощении воды.
Особенно чувствительными структурами клетки, легко повреждающимися
под действием гипотермии, являются клеточные мембраны. Функциональная
устойчивость липидосодержащих протоплазматических структур, таких как
плазмалемма и мембраны хлоропластов и митохондрий, легко нарушается под
действием экстремальных температур. В частности, рядом авторов было
показано, что замораживание вызывает необратимое подавление окислительного
фосфорилирования в митохондриях. По их мнению, основной причиной
повреждения клетки морозом является нарушение структуры мембран и потеря
ими осмотических свойств. По мнению других авторов, важнейший фактор
повреждения мембран при замораживании – их обезвоживание. Удаление воды из
мембран при замораживании нарушает равновесие между системами белок –
липид и белок – вода, в результате чего возникают структурные перестройки
молекулярных слоев и изменяются свойства мембран. Обособление белков от
липидов в мембране приводит к полному ее разрушению и в дальнейшем
мембранные липиды могут стать субстратом для окисления. Наличие лишь
незначительного числа нарушений мембранной структуры вызывает утечку
протонов и разобщение окисления и фосфорилирования. Возможно повреждение
мембран и без образования льда, когда низкая температура вызывает затвердение
липидной части мембраны и нарушение ее структуры и функций [21].
Впоследствии
многочисленные
исследования
показали
сильную
зависимость состава мембран растительной клетки от температуры роста
растения. В частности, показано, что низкие температуры индуцируют в
растениях
разных
видов
накопление
фосфолипидов
и
повышение
ненасыщенности липидов. При этом были отмечены различия в содержании
фосфолипидов у высоко- и низкохолодостойких сортов растений. В частности,
26
такие различия были отмечены у высоко- и низкохолодостойких сортов люцерны,
а также различающихся по холодоустойчивости сортов озимой пшеницы, при
этом наибольшие отличия в фосфолипидном составе листьев высоко- и
низкохолодостойких сортов озимой пшеницы были отмечены после прохождения
растением процесса низкотемпературно адаптации. Наиболее важным фактором в
этом случае было возрастание доли фосфатидилхолина в составе мембран.
Сходные результаты были получены и при изучении проростков озимой
пшеницы. У проростков, выращенных при 20С, было обнаружено значительно
более высокое содержание фосфолипидов, чем у проростков, выращенных при
оптимальных температурах. У растений озимой пшеницы наблюдались также
генотипические особенности содержания фосфолипидов в узлах кущения.
Содержание как суммарных фосфолипидов, так и их отдельных фракций, таких
как фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина, было выше у морозостойкого
сорта. Аналогичные результаты были получены и при изучении липидного
состава корне озимой ржи во время роста при пониженных температурах [22].
Для того, чтобы растения выживали после действия гипотермии,
необходимо или предотвращение повреждений от действия внеклеточного или
внутриклеточного замерзания, или ликвидация таких повреждений. Это свойство
растений, определяемое как морозоустойчивость, должно включать в себя как
предотвращение воздействия повреждающих факторов, так и устойчивость к их
действию. Предотвращение воздействия повреждающих факторов возможно
следующими путями:
– предотвращение воздействия низко температуры;
– предотвращение замерзания путем высушивания;
– предотвращение замерзания нормально гидратированных клеток может
осуществляться путем накопления растворимых веществ;
– предотвращение замерзания вследствие переохлаждения обеспечивает
выживание определенных тканей у многих древесных культур;
27
–
предотвращение
образования
льда
внутри
клеток
у
растений
обеспечивается различными способами и сохраняет жизнеспособность растений
лишь в том случае, если они устойчивы к внеклеточному замерзанию;
– уменьшение количества льда при замерзании воды вне клеток идентично
предотвращению обезвоживания при замерзании.
В
большинстве
предотвращения
случаев
повреждений,
для
а
выживания
необходима
растений
еще
и
недостаточно
устойчивость
к
замораживанию некоторых тканей и, вследствие этого, их обезвоживанию.
Растение может переносить обезвоживание тканей морозом двумя путями: вопервых, путем предотвращения летального обезвоживания при замерзании
посредством действия накопленных растворимых веществ и, во-вторых,
повышением
устойчивости
обусловливающей
высокую
растений
к
обезвоживанию
морозостойкость
тех
видов,
при
у
замерзании,
которых
не
наблюдается корреляция между степенью морозоустойчивости и накоплением
растворимых соединений [22].
В отличие от древесных растений, травянистые не входят в конце лета в
состояние глубокого покоя. Их ткани, несмотря на вынужденную приостановку
роста, сохраняют способность к нему на протяжении все зимы. В то же время,
несмотря на то, что неблагоприятные температурные условия вызывают в их
клетках ряд последовательных изменений: снижение водного потенциала,
нарушение метаболизма и др. У видов, способных к закаливанию, надземные
ткани переносят температуру до -20…– 25°С после предварительного воздействия
закаливающих условий.
Закаливание озимых растений происходит в три фазы, которые связаны с
различными температурными условиями:
– первая фаза закаливания индуцируется снижением температуры до 2 –
5°С, в результате чего исходная морозостойкость повышается на 4–5°С;
– вторая фаза связана с небольшими морозами и в естественных условиях
проходит только в том случае, если температура воздуха снижается ниже 0°С;
28
– третья фаза закаливания может совпадать со второй и зависит от
продолжительных морозов, вызывающих обезвоживание клеток [23].
При изучении процессов закаливания различными исследователями было
установлено, что во время первой фазы закаливания в растениях происходят
изменения метаболических процессов, таких как гидролиз крахмала и накопление
редуцирующих сахаров и водорастворимых белков. Другими метаболическими
изменениями, которые тоже являются специфическим ответом растительных
тканей на понижение температуры среды, являются превращения липидов и
фосфолипидов. Установлено, что низкие положительные температуры повышают
ненасыщенность жирных кислот. Было также показано, что содержание
фосфолипидов в тканях растений пшеницы возрастало при низкотемпературном
закаливании [24].
Существует ряд доказательств того, что накопление в тканях растений в
результате воздействия низких положительных температур некоторых веществ
происходит не только вследствие уменьшения их утилизации в ходе ростовых
процессов
ввиду
их
приостановки,
но
и
в
результате
усиления
их
новообразования. Увеличение ненасыщенности жирных кислот фосфолипидов в
условиях пониженных температур, как было показано, тоже в значительно
степени связано с их синтезом. Все эти данные свидетельствуют о том, что на
первой фазе закаливания у травянистых растений происходит, предпочтительны
синтез некоторых метаболитов.
Что касается отрицательных температур, которые необходимы для
прохождения второй фазы закаливания, то предполагается, что их роль в процессе
закаливания не сводится только к физическому действию. По-видимому, она
также связана с некоторыми метаболическими процессами, протекающими при
этих температурах.
Поскольку прекращение роста растений является необходимым условием
прохождения
первой
фазы
закаливания,
то
метаболические
изменения,
29
происходящие в это время, могут быть вызваны изменением гормонального и
энергетического баланса.
Принимая
во
внимание
тот
факт,
что
внеклеточное
замерзание
предотвращает образование внутриклеточного льда, но вызывает при этом
обезвоживание макромолекулярных структур клетки, предполагается, что процесс
закаливания включает в себя следующие механизмы:
– усиление оттока воды из клетки через мембраны;
– защита клеточных компонентов от действия обезвоживания. Обеспечение
оттока
воды
через мембраны может обеспечиваться
путем повышения
ненасыщенности липидов. Изменения содержания фосфолипидов также влияют
на свойства мембран и повышают их проницаемость для воды, а быстрое
снижение содержания фосфолипидов при замораживании вызывает усиленный
отток
воды
в
межклетники
и
защищает
клетку
от
внутриклеточного
льдообразования [25].
При действии мороза повреждения, вызываемые обезвоживанием у
закаленных растений, могут быть предотвращены следующими путями:
– структурными и конформационными изменениями компонентов клетки,
которые они претерпевают в процессе закаливания;
– защитой компонентов клетки от обезвоживания взаимодействием с
низкомолекулярными веществами.
Хотя и установлено, что под действием гипотермии у травянистых растений
происходят изменения активности некоторых ферментов, имеется относительно
немного
экспериментальных
доказательств трансформации
белковых
макромолекул, которые бы вели к повышению их устойчивости к низко
температуре. В то же время показано большое значение происходящего во время
закаливания
растений
торможения
роста
для
использования
белков,
синтезированных в процессе закаливания, на структурную и функциональную
реорганизацию клеток [26].
30
Исследование процессов холодовой адаптации древесных растений на
молекулярном уровне ограничивается наложением на процессы развития
холодоустойчивости событий, связанных со входом растения в состояние
покоя. R.A. Salzman с соавторами, используя в качестве объекта исследования
виноград, создали систему, в которой развитие состояния покоя могло быть
индуцировано отдельно от холодовой акклиматизации. С использованием это
системы было охарактеризовано дифференциальное накопление ряда белков в
почках винограда во время реализации программы нормального входа в
состояние покоя совместно с холодовой акклиматизацией и в почках, которые
входили только в состояние покоя. Было установлено, что белок с молекулярно
массой 47 кДа накапливался в почках винограда во время входа в состояние покоя
без холодовой акклиматизации до уровня содержания белка, обнаруженного в
находящихся в состоянии покоя и закаленных почках, но не накапливался в
закаленных почках, не вошедших в состояние покоя. В то же время 27 кДа LEAподобный белок накапливался только в закаленных почках. Следовательно, 47
кДа гликопротеин является связанным с состоянием покоя, но не связанным с
развитием холодовой акклиматизации, в то время как 27 кДа LEA-подобны белок,
по-видимому, более специфичен для холодового закаливания [27].
Большое значение в регуляции холодо- и морозоустойчивости растений
играет абсцизовая кислота. Установлено, что при закаливании растений
содержание эндогенно абсцизовой кислоты значительно возрастает, в частности,
при
закаливании
способного
к
картофеля Solanum commersonii содержание
холодовой
эндогенной
адаптации
абсцизовой
вида
кислоты
возрастало в 2,5 раза. У мутанта Arabidopsis thaliana, имеющего низкий уровень
содержания эндогенно абсцизовой кислоты, по сравнению с диким типом
отсутствовала или была резко снижена способность к холодовой адаптации. В то
же время обработка этого мутанта экзогенно абсцизовой кислотой приводила к
появлению эффекта адаптации растений к холоду. При этом была показана
31
взаимосвязь между экспрессией регулируемых холодом и регулируемых
абсцизовой кислотой генов [28].
Аналогичные результаты были получены и при изучении других видов
растений. Было проведено определение морозоустойчивости побегов, корней и
тканей
эпикотиля
гороха
сорта Alaska двух
генотипов:
дефицитного
по
содержанию абсцизовой кислоты мутанта «wil» и его дикого типа при различных
типах стресса. В ходе исследований спектры белков изучались при помощи
двумерного SDS-PAGE электрофореза.
При
этом
было
установлено,
что
холодовая обработка индуцировала образование семи белков в побегах, трех – в
эпикотиле и двух – в корнях гороха. В тканях побегов пять из семи новых белков
накапливались также в ответ на обработку абсцизовой кислотой. Полипептид с
молекулярной массой 24 кДа продуцировался и в мутантных, и в «диких»
проростках и тканях эпикотиля только после холодовой обработки [29].
Таким образом, существенным этапом перехода от стрессовых
к
адаптационным реакциям является изменение экспрессии генов, выражающееся в
ингибировании активных генов, в норме контролирующих рост, развитие и
фотосинтез. При этом активируется система генов контроля за устойчивостью:
происходит синтез новых белков, специфических адаптогенов и стресспротекторов. Завершается эта перестройка структурными изменениями в
организме растения [30].
2.2 Приспособления растений к перенесению низких температур
Морозоустойчивые растения способны предотвращать или уменьшать
действие
низких
отрицательных
температур.
Такие
растения
обладают
приспособлениями, уменьшающими обезвоживание клетки.
1. Для предотвращения образования внутриклеточного льда при заморозках
первостепенное значение имеет возможность быстрого транспорта свободной
воды из клетки к местам внеклеточного образования льда, т. е. поддержание
высокой проницаемости мембран в этих условиях. Такая возможность обеспечивается особенностями липидного состава мембран устойчивых растений.
32
Общая реакция растений на низкие температуры — увеличение в составе мембран
количества ненасыщенных жирных кислот. Это обусловливает снижение температуры фазового перехода липидов из жидко-кристаллического состояния в гель до
величины, лежащей ниже точки замерзания у морозостойких растений, а у
неустойчивых растений она выше 0°С. Фазовые переходы мембран из жидкокристаллического в твердое (гель) состояние на 1/3 снижают проницаемость
липидных мембран. Поэтому понижение температуры фазового перехода липидов
у морозоустойчивых растений сохраняет высокую проницаемость мембран при
замораживании.
2. Перенесению морозов способствует также усиление процессов синтеза
веществ,защищающих ткани(криопротекторов). К ним относятся прежде всего
полимеры,
способные
связывать
значительные
количества
воды,
—
гидрофильные белки, моно-и олигосахариды. Вода, связываемая в виде гидратных
оболочек этими молекулами, не замерзает и не транспортируется, оставаясь в
клетке. Таким образом клетки защищаются от внутриклеточного льда и
чрезмерного обезвоживания. У морозо устойчивых растении при действии низких
температур усиливается гидролиз крахмала и в цитоплазме накапливаются сахара,
у большинства растений возрастает синтез водорастворимых белков. Чем выше их
содержание, тем больше способность клетки к выживанию
в
условиях
низких температур.
Другой тип полимеров-криопротекторов — молекулы геми-целлюлоз
(ксиланы, арабиноксиланы), выделяемые в клеточную стенку. Они обволакивают
кристаллы льда и тормозят их рост. В итоге образуются более мелкие кристаллы,
Меньше повреждающие клетку.
3.
У
морозоустойчивых
растений
в
период
подготовки
к
зиме
накапливаются запасные вещества, которые могут использоваться затем при
возобновлении роста. Существенна также устойчивость их к болезням, опасность
возникновения которых возрастает при повреждении тканей морозом.
33
Холодоустойчивость растений можно повысить с помощью закалки.
Закаливание подготавливает весь комплекс защитных средств растения, о
котором говорилось выше. Закалка ускоряется при остановке ростовых процессов
у растения и осуществляется при постепенном снижении температуры, а для ряда
объектов — и при укороченном фотопериоде [31].
В нашей стране теория закаливания к низким температурам разработана И.
И. Тумановым. Согласно этой теории растения для приобретения свойства
морозостойкости должны пройти три этапа подготовки: переход в состояние
покоя, затем первую и вторую фазы закаливания. Вступление в состояние покоя
без последующих этапов лишь немного повышает морозоустойчивость. Переход в
состояние покоя сопровождается смещением баланса фитогормонов в сторону
уменьшения содержания ауксина и гиббереллинов и увеличения абсцизовой
кислоты.
Обработка
растений
в
этот
период
ингибиторами
роста
(хлорхолинхлоридом или трийодбензойной кислотой) повышает устойчивость
растений к низким температурам, а обработка ИУК или ГА — понижает ее. У
древесных растений покой наступает в начале осени и в первую фазу закаливания
лишь углубляется; у травянистых — переход в состояние покоя сопровождает
первую фазу закаливания [32].
В течение первой фазы закаливания (озимые злаки проходят первую фазу на
свету при 0,5 - 2°С за 6 - 9 дней; древесные - за 30 дней) при пониженных
положительных температурах (до 0 °С) останавливается рост (если растения не
находятся
в
состоянии
покоя),
в
клетках
накапливаются
соединения,
выполняющие защитную функцию (сахара, растворимые белки и др.), в
мембранах возрастает содержание ненасыщенных жирных кислот, снижается
точка
замерзания
цитоплазмы,
отмечается
некоторое
уменьшение
внутриклеточной воды, что тормозит образование внутриклеточного льда.
В период прохождения второй фазы закаливания (постепенное понижение
температуры до -10, -20 °С и ниже со скоростью 2 - 3°С в сутки) в межклетниках
34
образуется лед и начинают функционировать механизмы защиты от обезвоживания, подготовленные в течение первой фазы.
На морозоустойчивость, как и на холодостойкость растений, положительное
влияние оказывают микроэлементы. Так, цинк повышает содержание связанной
воды и усиливает накопление Сахаров, а молибден способствует увеличению
содержания общего и белкового азота. Сходный эффект оказывают кобальт, медь,
ванадий и др [33].
2.3 Системы регуляции у растений
Подавляющая часть клеточных механизмов устойчивости сформировалась
на ранних этапах эволюции, поэтому защитные системы у высших растений и
более примитивных организмов имеют общую основу. Изменения в метаболизме,
физиологических функциях и ростовых процессах при стрессах, прежде всего,
связаны с изменениями в экспрессии генов. Ответ на действие стрессора
происходит,
если
растение
распознает
стрессор
на
клеточном
уровне.
Распознавание стрессора, т.е. рецепция сигнала, приводит к активации пути
передачи сигнала. Последний поступает в геном, индуцируя или подавляя синтез
тех или иных белков. Связанные с экспрессией генов ответные реакции клеток на
действие стрессора интегрируются в ответцелого растения, который выражается,
например, в ингибировании роста и развития растения и одновременно в
повышении его устойчивости к действию стрессора [34].
Во время переключения обмена веществ на новый режим при стрессовых
воздействиях резервные возможности организма объединяются благодаря
системам регуляции (рис. 5).
35
Рис. 5. Системы регуляции у растений
Для координации функциональной активности клетки в нормальных и
неблагоприятных условиях среды необходим аппарат регуляции, включающий
тесно связанные между собой генетическую, метаболическую (ферментную) и
мембранную системы. Эти системы тесно связаны между собой. Например,
свойства мембран зависят от генной активности, а дифференциальная активность
самих генов находится под контролем мембран [35].
Внутриклеточные системы передачи сигнала
В клетке растения есть несколько систем передачи информации. В
настоящее время они активно исследуются. Общая картина передачи информации
внутри клетки от внеклеточного сигнала к эффектору пока изучена не до конца. В
основе всех форм внутриклеточной регуляции лежит единый принцип – белковая
молекула-рецептор «узнает» специфический для нее фактор, и, взаимодействуя с
ним, изменяет свою конфигурацию.
Существует 3 основных типа рецепторов, интегрированных во внешнюю
клеточную мембрану:
1. рецепторы, сопряженные с G-белками;
2. рецепторы, ассоциированные с ферментами;
36
3. рецепторы – ионные каналы.
Рецепторы, сопряженные с G-белками (GPCR-G-protein coupled receptor),
передают сигнал к внутренним мишеням с помощью каскада: Рецептор (GPCR-Gprotein coupled receptor) – G-белок – эффекторный белок (рис. 6).
Рис. 6. Рецепторы, сопряженные с G-белками
Эти
ГТФ-связывающие
белки
изменяют
свою
конформацию
при
связывании с ГТФ или ГДФ. Они изучены в основном на животных. Они
представляют собой гетеротримерные белки и состоят в основном из 3-х
субъединиц: Gα, Gβ, Gγ.
Тримеры могут взаимодействовать с рецептором. Субъединица Gα имеет
связывающие центры и с ГТФ и с ГДФ. Связывание с ГТФ ведет к изменению
конформации этой субъединицы и отделению ее от тримера. Связанная с ГТФ
субъединица Gα функционирует как активатор энзимов, играющих роль
посредников в передаче сигналов [36].
Так, в животных клетках, связанная с ГТФ субъединица стимулирует
аденилатциклазу, катализирующую синтез цАМФ из АТФ. Однако у растений
участие цАМФ в сигнальной трансдукции точно не установлено. Может
произойти активирование ГТФ-зависимой Gα фосфолипазы С. С активированием
37
фосфолипазы С связано освобождение кальция как посредника сигнальной
трансдукции. Связь субъединицы Gα с ГТФ уже через несколько минут
гидролизируется ГТФазой до ГДФ, в результате меняется конформационное
состояние белка и его активаторная функция теряется.
Однако Gα может снова войти в состав тримера, и цикл будет повторен.
Рецепторы, сопряженные с G-белками, представляют собой мономерные
интегральные белки, полипептидная цепь которых несколько раз пересекает
клеточную мембрану. Во всех случаях участок рецептора, ответственный за
взаимодействие с первичным сигналом, локализован на внешней стороне
мембраны, а участок, контактирующий с G-белком, на ее цитоплазматической
стороне [37].
У рецепторов, ассоциированных с ферментом, участок для связывания
первичного сигнала локализован на той стороне, которая обращена во
внеклеточное
пространство.
По
механизму
взаимодействия
с
цитоплазматическими мишенями эти рецепторы разделяются на 2 группы
(рис.7):
1. Рецепторы, у которых каталитический участок, активируемый при
действии внешнего сигнала, находится на цитоплазматической стороне, рис. 7а.
Рецепторы данного типа участвуют в регуляции водно-солевого обмена.
2. Рецепторы второй группы собственной ферментативной активностью не
обладают, рис. 7б.
Рис. 7. Рецепторы, ассоциированные с ферментами
38
Однако под действием внешнего сигнала они приобретают способность
связывать цитоплазматические (нерецепторные) протеинтирозинкиназы, которые
в свободном состоянии неактивны, но в комплексе с рецептором активируются и
фосфорилируют его. Включение фосфатных остатков в такой рецептор-«якорь»
создает условия для связывания с ним других белков- мишеней, которые также
фосфорилируются и тем самым передают сигнал дальше [38].
Рецепторы – ионные каналы. Это интегральные мембранные белки,
состоящие из нескольких субъединиц, полипептидная цепь которых несколько раз
пересекает мембрану. Они действуют одновременно как ионные каналы и как
рецепторы, которые способны специфически связывать с внешней стороны
первичные сигналы, изменяющие их ионную проводимость (рис. 8).
Рис. 8. Рецепторы – ионные каналы
В отсутствие сигнала канал закрыт, он открывается при связывании с
рецептором. Таким образом, вещества, инициирующие трансмембранную
передачу сигналов, активируют рецепторы, после чего активированный рецептор
передает сигнал к внутриклеточным мишеням. Если мишень или эффекторный
белок представлен ферментом, то сигнал увеличивает или уменьшает его
каталитическую активность. Если эффекторным белком служит ионный канал, то
увеличивается или уменьшается проводимость этого канала.
Во всех случаях результатом будет изменение активности какой-то
метаболической стадии либо концентрации в цитоплазме того или иного иона, и,
как следствие, возникновение клеточного ответа [39].
39
Выводы к теоретической части
Обобщены и систематизированы литературные данные о свойствах и путях
образования в клетках плодовых растений пролина и МДА, а также оказываемое
ими воздействие в целом на растение. Рассмотрены инструментальные методы
определения
данных
веществ (спектрофотометрия,
капиллярный
электрофорез).
Показана
высокоэффективный
необходимость
количественного
определения пролина и МДА в клетках растений. Рассмотрено влияние
температурного стресса на плодовые растения.
40
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Методика эксперимента
Экспериментальная
часть
работы
заключалась
в
исследовании
корреляционной зависимости между содержанием МДА и пролина в растениях, а
также их влияние на устойчивости к низким температурам плодовых растений.
3.1 Используемые реактивы и растворы
Все использованные в работе реактивы относятся к подгруппе чистоты 2
(х.ч.) или 3 (ч.д.а.) по ГОСТ 13867 [32].
ледяная уксусная кислота
фосфорная кислота 6М
нингидрин
трихлоруксусной кислоте 20%-ной
тиобарбитуровая кислоту 0,5% в 20% трихлоруксусной кислоте
раствор гидроксиметиламинометана с соляной кислоты (Трис рН 7,7)
хлорид натрия 0,35 М
Для получения основного раствора пролина массовой концентрацией 100
мг/дм3. Навеску пролина массой 25 мг количественно переносили в мерную колбу
вместимостью 250 см3. В колбу вносили небольшое количество воды.
Содержимое колбы перемешивали до полного растворения кристаллов пролина,
после чего объем в колбе доводили водой до метки, содержимое колбы тщательно
перемешивали. Рабочие растворы пролина готовили разведением основного
раствора. Для этого в мерные колбы вместимостью 100 см3 вносили 5, 10, 25, 40 и
50 см3 основного раствора и доводят объемы в колбах водой до метки.
Содержимое колб тщательно перемешивали. Срок годности основного и рабочих
растворов — 20 суток при хранении в холодильнике.
3.2 Измерительная аппаратура
Вся аппаратура, примененная для опытов, прошла метрологическую
аттестацию в соответствии с требованиями государственных стандартов.
Измерение массы проводилось на весах Ohaus Navigator STX222.
41
Для измерения спектральной оптической плотности (десятичный логарифм
спектрального коэффициента пропускания) жидких образцов в диапазоне длин
волн 520… 535 нм использовали сканирующий настольный спектрофотометр
SmartSpec Plus (Bio-Rad)
Центрифуга Jouan MR 1812
Баня лабораторная ПЭ-4312
Климатическая камера «Espec» PSL-2KPH.
Одноканальные дозаторы с наконечниками Thermo scientific (ЛЕНПИПЕТ)
на 1см3, 10 см3
В работе использовали посуду лабораторную: колбы мерные на 100 см 3, 250
см3. пробирки лабораторные, цилиндрические пробирки с крышкой на 10 см3
3.3 Математическая обработка результатов эксперимента
Величины оптимальных данных оценивали с помощью методов
математической
статистики.
Использовалась
компьютерная
обработка
результатов с помощью программы Microsoft Excel из пакета программ Microsoft
Office
2003.
При
статистической
обработке
градуировочных
графиков
рассчитывали параметры уравнения y = ax + b методом линейной регрессии [40].
Дисперсию, то есть меру разброса результатов измерения относительно
среднего значения, вычисляли по уравнению:
i n
i n
s   ( x1  x)
2
2
, где
i 1
x
x
i 1
1
n
Среднеквадратичное отклонение вычисляли по уравнению:
in
s
(x
1
i 1
 x) 2
n 1
Относительное стандартное отклонение вычисляли по уравнению:
sr =
s
x
Коэффициенты корреляции r рассчитывали по уравнению:
42
r
 ( x  x)( y  y)
 ( x  x) ( y  y )
1
1
2
1
2
1
3.4 Методика построения градуировочного графика для
количественного определения пролина
Готовят пять исследуемых растворов и пять растворов сравнения. В
пробирки для приготовления исследуемых растворов вносят по 1 см3 каждого
рабочего раствора пролина, 1 см3 раствора уксусной кислоты и 2 см3 раствора
нингидрина. В пробирки для приготовления растворов сравнения вносят по 1 см 3
каждого рабочего раствора пролина, 1 см3 раствора уксусной кислоты и 2 см3
монометилового эфира этиленгликоля. Массовая концентрация пролина в
полученных рабочих растворах составляет соответственно 5, 10, 25, 40 и 50
мг/дм3.
Содержимое всех пробирок тщательно перемешивают после добавления
каждого реактива. Пробирки помещают на кипящую водяную баню, при этом
уровень воды в бане должен быть выше уровня жидкости в пробирках.
Необходимо следить за тем, чтобы вода в бане постоянно кипела. Пробирки с
исследуемыми жидкостями выдерживают на водяной бане в течение 15 мин,
после чего охлаждают в воде температурой около 20 ° С от 5 до 10 мин. В
пробирки вносят по 10 см3 бутилацетата, закрывают пробками и интенсивно
встряхивают [41].
После разделения слоев из каждой пробирки отбирают пипеткой верхний
слой и фильтруют его через воронку с ватным тампоном, нанесенным на него
слоем сульфата натрия толщиной от 1 до 2 см.
По истечении 15 мин после окончания фильтрации измеряют оптическую
плотность фильтрата исследуемого раствора относительно соответствующего
раствора сравнения в кюветах рабочей длиной 1 см на спектрофотометре при
длине волны 520 нм.
По полученным значениям оптической плотности строят градуировочный
график, откладывая по оси абсцисс массовую концентрацию пролина в рабочем
43
растворе, мг/дм3, по оси ординат — соответствующее значение оптической
плотности. При правильном выполнении всех предшествующих операций
градуировочный график представляет собой прямую линию, проходящую через
начало координат. Градуировочный коэффициент рассчитывают следующим
образом. В трех различных точках градуировочного графика (например, при
массовых
концентрациях
пролина
10,
25
и
40
мг/дм3)
определяют
соответствующие значения оптической плотности. Для этих точек рассчитывают
градуировочные коэффициенты Кi,
мг
по формуле:
еоп
K=
,
где Сi — массовая концентрация пролина в рабочем растворе,мг/дм3; Di —
оптическая плотность, ед. оптической плотности. Из полученных значений
рассчитывают
окончательный
среднеарифметическое
результат
значение,
определения
которое
принимают
градуировочного
за
коэффициента.
Градуировочный коэффициент следует определять при испытании каждой серии
образцов.
Градуировочную характеристику считают линейной, если для каждого
градуировочного раствора выполняется условие
0,05где
,
— среднеарифметическое значение градуировочных коэффициентов,
вычисленных при построении градуировочной характеристики; За окончательное
значение градуировочного коэффициента принимают среднеарифметическое
значение Кi.
Значение оптической плотности для раствора с массовой концентрацией
пролина 50 мг/дм3 не должно превышать 1,5 е. о. п.
Градуировочная характеристика считается приемлемой, если вычисленное
программным
обеспечением
градуировочной характеристики
значение
коэффициента
корреляции
для
0,99. При невыполнении указанных
условий градуировку устанавливают заново [42].
44
3.5 Методика определения пролина в плодовых растениях
Для количественного определения пролина использовали
спектрофотометрический метод.
Содержание свободного пролина определяли в коре однолетних побегов
плодовых растений с помощью кислого нингидринового реактива по методу
Бейтса с соавт [43].
Навеску свежей растительной ткани коры (200 мг) заливали в пробирки 10
мл кипящей дистиллированоой воды и на 10 минут помещали в кипящую
водяную баню. В чистую пробирку приливали 1 мл ледяной уксусной кислоты и 1
мл нингидринового реактива, затем приливали 1 мл экстракта. Пробы
инкубировали в течение 1 часа в кипящей водяной бане, после чего быстро
охлаждали во льду. Интенсивность окраски определяли на спектрофотометре
SmartSpec Plus (Bio-Rad).
Массовую концентрацию пролина в пробе Спр, мг/дм3, вычисляли по
формуле:
Спр = D
∙
где D — оптическая плотность раствора лабораторной пробы, е. о. п.;
—
среднеарифметическое значение градуировочных коэффициентов, вычисленных
при построении градуировочной характеристики,
,V2— вместимость
мерной колбы, взятой для разбавления, см3; V1 — объем лабораторной пробы
соковой продукции, см3. Все вычисления проводят до третьего десятичного знака.
За результат измерений принимают среднеарифметическое значение
результатов двух параллельных измерений, если выполняется условие
приемлемости
где С1, С2 — результаты параллельных измерений массовой концентрации
пролина, мг/дм3; r — значение предела повторяемости % [44].
45
3.6 Методика определения малонового диальдегида
Для исследования брали 0,5 мг сырой массы и растирали в 1 мл раствора
гидроксиметиламинометана (Трис), добавляли 10 мл 0,35 М NaCl. Затем
центрифугировали при 2000 об/мин, в течение 10 минут.
После чего к 3 мл вытяжки из центрифугата добавляли 2 мл 0,5 % раствора
тиобарбитуровой кислоты в 20% растворе трихлоруксусной кислоты. Пробы
инкубировали в течение 1 часа в кипящей водяной бане, после чего быстро
охлаждали во льду. Интенсивность окраски определяли на спектрофотометре
SmartSpec Plus (Bio-Rad) при длине волны 535 нм.
Концентрацию малонового диальдегида в пробе С, мкмоль на 1 г сырой
массы, вычисляли по формуле:
где С – концентрация МДА, мкмоль; D – оптическая плотность; e –
коэффициент молярной экстинции (1,56∙ 105 см -1 ∙ М -1); t – толщина слоя
раствора в кювете (1 см) [45].
46
Глава 4. Результаты исследований
4.1 Градуировочный график для количественного определения пролина
Готовят пять исследуемых растворов и пять растворов сравнения. В
пробирки для приготовления исследуемых растворов вносят по 1 см3 каждого
рабочего раствора пролина, 1 см3 раствора уксусной кислоты и 2 см3 раствора
нингидрина. В пробирки для приготовления растворов сравнения вносят по 1 см 3
каждого рабочего раствора пролина, 1 см3 раствора уксусной кислоты и 2 см3
монометилового эфира этиленгликоля. Массовая концентрация пролина в
полученных рабочих растворах составляет соответственно 5, 10, 25, 40 и 50
мг/дм3.
A, e.o.п.
4,0
y = 0,0941x - 0,1024
R² = 0,9839
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
С, мг/мл
0,0
5
10
15
20
25
30
35
40
Рис. 9. Градуировочный график для спектрофотометрического определения
пролина
4.2 Определение содержания пролина в некоторых плодовых растениях
до воздействия низкой температуры
Пролин оказывает стабилизирующее действие на мембраны, уменьшает
осмотический стресс, защищает белки от денатурации, участвует в передаче
стрессового сигнала, регулирует redox-потенциал клети.
47
120
100
80
мг/г до стресса
60
40
20
0
Новелла
Неженка
Антоновка
Рис. 10. Содержание пролина в коре плодовых растений до воздействия
низкой температуры, мг/г
4.3 Определение содержания малонового диальдегида в некоторых плодовых
растениях до воздействия низкой температуры
Малоновый диальдегид в клетках плодовых деревьев – это признак
неблагоприятный, так как он свидетельствует о том, что происходит активное
перекисное окисление липидов.
14
12
10
8
мкмоль/г до стресса
6
4
2
0
Новелла
Неженка
Антоновка
Рис. 11. Содержание малонового диальдегида в коре плодовых растений до
воздействия низкой температуры
48
4.4 Определение содержания пролина в некоторых плодовых растениях
после воздействия низкой температуры
Для того, что бы в растении произошло количественное изменение
содержания пролина, образцы помещали на 72 часа при температуре - 5 ºС в
климатической камере «Espec» PSL-2KPH.
140
120
100
80
мг/г после
60
40
20
0
Новелла
Неженка
Антоновка
Рис. 12. Содержание пролина в коре плодовых растений после воздействия
низкой температуры, мг/г
Аккумуляция пролина индуцируется в условиях стресса за счет как
увеличения синтеза, так и восстановления окисленной аминокислоты. Было
показано, что большая часть накопленного пролина в условиях стресса является
результатом увеличения его синтеза из глутамата. Есть еще другой путь синтеза –
из аргинина и орнитина. При стрессе часто происходит уменьшение окисления
пролина, что приводит к увеличению его уровня. Что отражено на рисунке 12
4.5 Определение содержания малонового диальдегида в некоторых плодовых
растениях после воздействия низкой температуры
Для того, что бы в растении произошло количественное изменение
содержания малонового диальдегида, а именно произошло разрушение клеточных
49
мембран за счет АФК, образцы помещали на 72 часа при температуре - 5 ºС в
климатической камере «Espec» PSL-2KPH.
25
20
15
ммоль/г
10
5
0
Новелла
Неженка
Антоновка
Рис. 13. Содержание малонового диальдегида в коре плодовых растений после
воздействия низкой температуры
В результате опыта было замечено увеличение содержания малонового
диальдегида, что свидетельствует о перенесенном растением температурном
стрессе.
50
Выводы к экспериментальной части
В работе получены экспериментальные данные по количественному
изменению содержания пролина и малонового диальдегида в некоторых
плодовых растениях до и после действия низкой температуры. Выявлено
значительное увеличение пролина у яблони (Антоновка) на 40 % относительно
контроля, у вишни (Новелла) 81,5 %, а у сливы (Неженка) 9% в сравнении с
контрольным вариантом. Наряду с этим возрастало и содержание МДА – маркера
развития окислительного стресса. Чем выше было внутриклеточное содержание
пролина, тем больше было МДА. На 23,4% повысилось содержание в образце
яблони (Антоновка), 77% вишни (Новелла) и 8,3 % в образце сливы (Неженка)
чем в контрольном образце.
51
Выводы
1. Обобщены и систематизированы литературные данные о биохимических
свойствах пролина и МДА, схемах синтеза в растениях и физиологических
свойствах.
2. Проведен литературный обзор имеющихся методов и методик определения
пролина и МДА в плодовых растениях, показаны их достоинства и
недостатки.
3. Получены экспериментальные данные по динамики изменения содержания
пролина и малонового диальдегида в некоторых плодовых растениях до и
после действия низкой температуры. Выявлено значительное увеличение
пролина у яблони (Антоновка) на 40 % относительно контрольного опыта, у
вишни (Новелла) 81,5 %, а у сливы (Неженка) 9% в сравнении с
контрольным вариантом. Наряду с этим возрастало и содержание МДА –
маркера развития окислительного стресса. Установлено, что чем выше
внутриклеточное содержание пролина, тем больше было МДА. На 23,4%
повысилось содержание в образце яблони (Антоновка), 77% вишни
(Новелла) и 8,3 % в образце сливы (Неженка) чем в контрольном образце.
4. Выявлена прямая зависимость между содержанием пролина и малонового
диальдегида в плодовых растениях, и воздействием температурного стресса.
52
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Бухерей, A., Азиз, A., Лархер, Ф., Мартин-Танги, Ж. Экологические
проблемы полиаминов и недавнее развитие // Журнал наука растений. –
1999. – Т. 140. – № 2. – С. 103-125.
2. Кузнецов, Вл.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль,
метаболизм, регуляция // Физиология растений. – 1999. – Т. 46. – С. 321-336.
3. Цандекова, О. Л. Роль перекисного окисления липидов в процессах
адаптации сосны обыкновенной в условиях природного // Научные
достижения биологии, химии, физики: сб. ст. по матер. IV междунар. науч.практ. конф. – Новосибирск: СибАК, – 2012.
4. Егоров, Д.А. Витамин С и каротин в растительности Якутии. 1954.  М.:
Изд-во АН СССР.  С. 248.
5. Денисова, М.Н. Черкасова, О.Г. Харитонов, Ю.Я. - Фармация,- 2006, Т. 45,
№ 3. - С. 22-28.
6. Гармаш, А.В. Современные методы аналитической химии. - М.: Бином
2003. С. 412.
7. Беликов, В.Г., Сами, А.А., Соловей, Н.В. Фармация.1995. Т. 44. № 4.
8. Кузнецова,
Вл.В.,
Кузнецова,
В.В.,
Романова,
Г.А.
Молекулярно-
генетические и биохимические методы в современной биологии растений //
Лаборатория знаний - М.: Бином  2012. С  487.
9. Реутов, О.А. Органическая химия. - Т. 3. - М.: Бином. Лаборатория знаний,
2004. - С. 10-134
10. Кишкун, А.А. Руководство по лабораторным методам диагностики. Учебнопрактическое издание. ГЭОТАР-Медиа, 2009 - 800 с.
11. Лифшиц, В.М., Сидельникова В.И. Медицинские лабораторные анализы.
Справочник, М.: Триада-Х, 2011
12. Данилова, Л.А. Анализы крови и мочи, СПб:Салит-Медкнига, 2010
13. Вайнер, А.А., Колупаев Ю.Е., Обозный А.И. Влияние экзогенного пролина
на содержание пероксида водорода в проростках пшеницы и формирование
53
индуцированной теплоустойчивости // Физиология растений и генетика. –
2014а. – Т. 46, № 3. – С. 252-258.
14. Герасимова, С.В., Кочетов А.В., Ибрагимова С.С., Шумный В.К. Функции
дельта-орнитинаминотрансферазы у растений // Успехи соврем. биологии. –
2011. – Т. 131, № 6. – С. 531-542.
15. Джавадиан, Н., Каримзаде Г., Мафузи С., Ганати Ф. Вызванные холодом
изменения активности ферментов и содержания пролина, углеводов и
хлорофиллов у пшеницы // Физиология растений. – 2010. – Т. 57, № 4. – С.
580-588.
16. Карташов, А.В., Радюкина Н.Л., Иванов Ю.В., Пашковский П.П., Шевякова
Н.И., Кузнецов Вл.В. Роль антиоксидантных систем при адаптации
дикорастущих видов растений к солевому стрессу // Физиология растений. –
2008. – Т. 55. – С. 516-522.
17. Колодяжная, Я.С., Куцоконь Н.К., Левенко Б.А. Cю-тикова О.С., Рахметов
Д.Б., Кочетов А.В. Трансгенные растения, толерантные к абиотиче-ским
стрессам // Цитология и генетика. – 2009. – Т. 43, № 2. – С. 72-93.
18. Креславский, В.Д., Лось Д.А., Аллахвердиев С.И., Кузнецов Вл.В.
Сигнальная роль активных форм кислорода при стрессе у растений //
Физиология растений. – 2012. – Т. 59, № 2. – С. 163-178.
19. Кузнецов, Вл.В., Шевякова Н.И. Пролин при стрессе: биологическая роль,
метаболизм, регуляция // Физиология растений. – 1999. – Т. 46, № 2. – С.
321-336.
20. Обозный, А.И.,
Колупаев
Ю.Е.,
Ястреб
Т.О.
Активность
супероксиддисмутазы и содержание низкомолекулярных протекторных
соединений при формировании перекрестной устойчивости проростков
пшеницы к тепловому и осмотическому стрессам // Агрохимия. – 2013. – №
8. – С. 59-67.
21. Поморцев,
А.В.
Физиологические
и
биохимические
процессы,
определяющие зимостойкость озимых зерновых культур в условиях
54
Восточной Сибири: Автореферат дисс. … канд. биол. наук. – Иркутск, 2013.
– 22 с.
22. Пустовойтова,
Т.Н.,
Жданова
Н.Е.,
Жолкевич
В.Н.
Повышение
засухоустойчивости растений под воздействием эпибрассинолида // Докл.
АН [Россия]. – 2001. – Т. 376, № 5. – С. 697-700.
23. Радюкина, Н.Л., Карташов А.В., Иванов Ю.В., Шевякова Н.И., Кузнецов
Вл.В. Сравнительный анализ функционирования защитных систем у
представителей
галофитной
и
гликофитной
флоры
в
условиях
прогрессирующего засоления // Физиология растений. – 2007. – Т. 54, № 6. –
С. 902-912.
24. Радюкина, Н.Л., Шашукова А.В., Макарова С.С., Кузнецов Вл.В.
Экзогенный пролин модифицирует дифференциальную экспрессию генов
супероксиддисмутазы в растениях шалфея при UV-B облучении //
Физиология растений. – 2011. – Т. 58, № 1. – С. 49-57.
25. Радюкина, Н.Л., Шашукова А.В., Шевякова Н.И., Кузнецов Вл.В. Участие
пролина в системе анти-оксидантной защиты у шалфея при действии NaCl и
параквата // Физиология растений. – 2008. – Т. 55, № 5. – С. 721-730.
26. Сошинкова, Т.Н., Радюкина Н.Л., Королькова Д.В., Носов А.В. Пролин и
функционирование антиок-сидантной системы растений и культивируемых
клеток Thellungiella salsuginea при окислительном стрессе // Физиология
растений. – 2013. – Т. 60, № 1. – С. 47-60.
27. Стеценко, Л.А., Шевякова Н.И., Ракитин В.Ю., Кузнецов Вл.В. Пролин
защищает растения Atropa belladonna от токсического действия солей
никеля // Физиология растений. – 2011. – Т. 58, № 2. – С. 275-282.
28. Сун, С.К., Леи Е.Б., Тян К.Р. Метаболизм пролина и перекрестная
устойчивость к засолению и тепло-вому стрессу у прорастающих семян
пшеницы // Физиология растений. – 2005. – Т. 52, № 6. – С. 897-904.
55
29. Титов, С.Е., Кочетов А.В., Коваль В.С., Шумный В.К. Трансгенез как
способ повышения устойчивости растений к абиотическим стрессам //
Успехи соврем. биологии. – 2003. – Т. 123, № 5. – С. 487-494.
30. Тищенко,
Е.Н.
Генетическая
инженерия
с
использованием
генов
метаболизма L-пролина для повышения осмотолерантности растений //
Физиология растений и генетика. – 2013. – Т. 45, № 6. – С. 488-500.
31. Юлдашев, Р.А. Регуляция 24-эпибрассинолидом метаболизма цитокининов
в растениях пшеницы: Автореферат дисс. … канд. биол. наук. – Уфа, 2009. –
23 с.
32. Abraham, E., Rigo G., Szekely G., Nagy Re., Koncz C., Szabados L. Lightdependent induction of proline biosynthesis by abscisic acid and salt stress is
inhib-ited by brassinosteroid in Arabidopsis // Plant Mol. Biol. – 2003. – V. 51. –
P. 363-372.
33. Carvalho, K., Campos M.K., Domingues D.S., Perei-ra L.F., Vieira L.G. The
accumulation of endoge-nous proline induces changes in gene expression of
several antioxidant enzymes in leaves of transgenic Swingle citrumelo // Mol.
Biol. Rep. – 2013. – V. 40. – P. 3269-3279.
34. Funck, D., Winter G., Baumgarten L., Forlani G. Re-quirement of proline
synthesis during Arabidopsis reproductive development // BMC Plant Biology. –
2012. – V. 12. – doi:10.1186/1471-2229-12-191
35. Анисимова, Н.А. Идентификация органических соединений: учебное
пособие (для студентов, обучающихся по специальности «химия»). - ГорноАлтайск: РИО ГАГУ, 2009. 95с.
36.Лидин, Р. А. Неорганическая химия в реакциях: справочник / Р. А. Лидин,
В. А. Молочко, Л. Л. Андреева; под ред. Р. А. Лидина. – М: Дрофа, 2007 –
637с.
37. Анисимова, Н. А. Идентификация органических соединений: учебное
пособие / Н. А. Анисимова. - Горно-Алтайск. РИО ГАГУ, 2009. – 95 с.
56
38. Луценко, Н.Г. Начала биохимии: Курс лекций/ РХТУ им. Д.И.Менделеева.М.: МАИК «Наука/Интерпереодика», 2012- 125 с.
39.Полевой В.В. Внутриклеточные и межклеточные системы регуляции у
растений // Соросов. образов. журн. – 1997. – № 9. – С. 6-11.
40.Регуляция адаптивных реакций растений / Под ред. В.Е. Петрова. –
Казань: Изд-во Казан. ун-та, 1990. – 126 с.
41.Тарчевский И.А. Катаболизм и стресс у растений: 52-е Тимирязевское
чтение. – М.: Наука, 1993. – 80 с.
42.Тарчевский И.А. Сигнальные системы клеток растений. – М.: Наука,
2002. –294 с.
43.Устойчивость растений и ее регуляция / Морд. гос. ун-т. – Саранск,
1990. – 112 с.
44.Физиология растений / Н.Д. Алехина, Ю.М. Балнокин, В.Ф. Гавриленко
и др.; Под ред. И.П. Ермакова. – М.: Издат. центр «Академия», 2005. – 635 с.
45.Чиркова Т.В. Физиологические основы устойчивости растений. – СПб.:
Изд-во СпбУ, 2002. – 244 с.
%? . ПЛАГИАТ
Орловский ГУ
ТВОРИТЕ СОБСТВЕННЫМ умом
СПРАВКА
О РЕЗУЛЬТЗТЗХ проверки ТЕКСТОВОГО документа
на наличие ЗЗИМСТВОВЗНИЙ
Проверка выполнена в системе
Антиплагиат.ВУЗ
Автор работы
КриёушйііаддД ? ’
Факультет, кафедра,
номер группы
кафедра химии '
Тип работы
Магистерская диссертация :
Название работы
Кривушина ' : у у '
Название файла
_Кривушина.с!осх
Процент заимствования
14,33%
Процент цитирования
0,00%
Процент оригинальности
85,67%
Дата проверки
22:34:54 ‚ 25 июня 2017;
Модули поиска
›Міодуль поиска ЭВС".'Би'бЛИоРжсинаЁ';ЦитИро'вание; МОДУЛЬ поиска ЭБС .
"Универсшетсн'аябиблиотека онлайн"-; ’Коллекция диссерта ций РГБ; Коллекция
іеЦВКАЁЖКЦ: Модуль поиска ЭБС “АйбуКС"; і‘хдодулвпоиска` ИнТерНет; Модуль поиска
ЭВС "Лань“; Модуль поиска -"ФГБОУ БСЭ:;ОГУ им.-ИдсдТургенева“; Кольцо вузов, ‚
Работу проверил
‚Симакова Ольга Евгеньевнг
ФИО проверяющего
Дата подписи
им;/%
.
@?
Подпись проверяющего
Чтобы убедиться
в подлинности справки,
используйте ОК-код, который
содержит ссылку на отчет.
Ответ на ВОПРОС, ЯВЛЯЕТСЯ ЛИ обнаруженное ЗЭИМСТВОВЭНИЕ
корректным, СИСТЕМЕ ОСТЗВЛЯЕТ на усмотрение проверяющего.
Предоставленная информация не ПОДЛЕЖИТ ИСПОЛЬЗОВЗНИЮ
В коммерческих целях.
`
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа