close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Панферова Елена Викторовна. Цветометрическое и тест-определение антибиотиков тетрациклинового ряда в молоке и молочных продуктах

код для вставки
2
ОГЛАВЛЕНИЕ:
Введение………………………………………………………………………........
5
I. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ……………………………………………….........
8
Глава 1. Общая характеристика тетрациклина и способов его
определения..........................................................................................
1.1
1.2
1.3
8
Общие сведения о тетрациклине, применение, воздействие на
организм человека…………………………………………………....
8
Контроль содержания антибиотиков в продуктах питания……..
10
Методы определения остаточных количеств тетрациклина в
продуктах питания……………………………………………….......
13
1.3.1 Определение методом ВЭЖХ……………………………………..... 14
1.3.2 Люминесцентные методы………………………………………........ 15
1.3.3 Электрохимические методы……………………………………….... 18
1.3.4 Иммунологические и микробиологические методы……………..... 18
1.3.5 Тест-методы.......................................................................................... 19
Глава 2.
Тест-системы: общая характеристика.......………………………..... 21
2.1
Характеристика тест-систем и требования к ним…………............. 21
2.2
Системы регистрации визуального сигнала……………………...... 23
2.2.1 Индикаторные порошки…………………………………………...... 24
2.2.2 Индикаторные трубки……………………………………….............. 25
2.3
Способы использования реагентов………………………………..... 26
2.4
Способы физической и химической иммобилизации реагентов..... 27
Глава 3.
Сорбенты на основе цеолита……………………………………....... 32
3.1
Общая характеристика цеолитов………………………………........ 32
3.2
Особенности строения и свойства цеолита Хотынецкого
месторождения…………………………………………………...…..
3.3
Общая характеристика синтетических цеолитов, их
преимущества и недостатки.......………………………………....….
3.4
34
35
Способы варьирования свойств цеолитов……………………...….. 37
Выводы к теоретической части……………………………………………........... 43
3
II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ……………………………………….......
Глава 4.
44
Методика проведения эксперимента…………………………........ 44
4.1
Используемые оборудование и реактивы……………………..….. 44
4.2
Условия выполнения анализа...........................................................
45
4.3
Методика получения синтетического цеолита типа NaX..............
45
4.4
Методика определения химико-аналитических свойств
природного и синтетического цеолитов по отношению к
железу(III)..........................…..….......................................................
46
4.4.1 Построение градуировочного графика............................................. 46
4.4.2 Определение оптимальных условий сорбции ………....................
47
4.4.3 Определение сорбционной емкости сорбента и построение
изотерм сорбции……………………………………......................... 48
4.5
Методика модифицирования природного и синтетического
цеолитов железом(III)........................................................................
49
4.6
Методика получения ИК-спектров................................................... 50
4.7
Методика тест-определения тетрациклина в водных растворах
на основе цветометрического метода............................................... 50
Глава 5.
Результаты исследования и их обсуждение……………...……….. 53
5.1
Получение синтетического цеолита типа NaX................................ 53
5.2
Сорбция железа(III) природным и синтетическим цеолитами...... 53
5.2.1 Градуировочный график для спектрофотометрического
определения железа(III) в водных растворах…………………......
53
5.2.2 Определение оптимальных условий сорбции железа(III)……......
54
5.2.3 Изотермы сорбции и сорбционная емкость…………………...….. 57
5.3
Модифицирование синтетического и природного цеолитов
железом(III).......................................................................................
5.4
ИК-спектроскопия поверхности иммобилизованных
материалов..........................................................................................
5.5
58
59
Количественная цветометрия для определения тетрациклина в
водных растворах...............................................................................
61
4
Глава 6.
6.1
Апробация методики на реальных объектах...................................
Методика определения тетрациклина в молоке и молочных
продуктах............................................................................................
6.2
68
68
Количественная цветометрия для определения тетрациклина в
молоке и молочных продуктах.......................................................... 68
Выводы к экспериментальной части……………………….......………………...
70
ВЫВОДЫ………………………………………………….......…………………...
71
Список используемой литературы……………………….......…………………... 72
5
ВВЕДЕНИЕ
Антибиотики различных групп и происхождения широко применяются в
медицине
для
предотвращения
и
лечения
воспалительных
процессов,
в
животноводстве и пищевой промышленности для улучшения потребительских
свойств
продуктов
питания
и
снижения
их
себестоимости.
Это
создает
необходимость в оценке качества и безопасности товаров потребления (по
статистике антибиотики обнаруживают в 15-20% всей продукции животного
происхождения [1]). Как правило, антибиотики умышленно применяются для
выращивания скота и продуктов растительного происхождения. На данный момент
существуют жесткие ограничения содержания в продуктах питания для следующих
групп
антибиотиков:
левомицетин,
тетрациклиновая
группа,
стрептомицин,
пенициллин, гризин, бацитрацин. Они являются потенциально опасными. При
регулярном поступлении в организм человека с пищевыми продуктами, они
оказывают токсическое и канцерогенное действие (возникновение аллергических
реакций, дисбактериозов, подавление активности некоторых ферментов, изменение
микрофлоры кишечника, ухудшение работы почек и др.). Кроме того, наличие
антибиотиков может затруднять микробиологические исследования качества
продуктов животного происхождения.
Существуют
различные
методы
качественного
и
количественного
определения антибиотиков: вольтамперометрический, ВЭЖХ, иммуноферментный,
люминисцентные и т.д. Однако, лабораториям для практической работы требуются
легко
доступные
удовлетворительными
экспресс-методы
с
метрологическими
высокой
чувствительностью
характеристиками.
и
Такими
характеристиками обладают тест-методы. Существующие в настоящее время тесты
обладают большинством необходимых характеристик, однако стоит отметить их
недостатки: высокая себестоимость и специфика хранения, из-за присутствия в них
ферментов. Перспективным при разработке тест-систем является применение
алюмосиликатов, как дешевых и доступных средств для анализа жидких сред,
обладающих хорошими аналитическими характеристиками и высокой сорбционной
способностью.
6
Таким образом актуальным представляется получение и изучение свойств
сорбционных материалов на основе алюмосиликатов для тест-определения
тетрациклина.
Целью работы является систематическое изучение свойств функциональных
материалов
на
основе
природного
и
синтетического
алюмосиликата
для
цветометрического тест-определения тетрациклина в реальных объектах.
Задачи исследования:
-
провести
литературный
обзор
применения
и
путей
поступления
антибиотиков и в частности тетрациклина в организм человека, методах и
методиках контроля его содержания;
- обобщить и систематизировать литературные данные о тест-методах
определения антибиотиков, их достоинствах и недостатках;
-
определить
оптимальные
условия
синтеза
новых
функциональных
материалов на основе природного и синтетического алюмосиликатов, показать их
перспективность при создании тест-систем для определения тетрациклина;
- экспериментально изучить возможность применения параметров цветности
цифрового изображения, как количественного аналитического сигнала для
разработки цветометрических методик определения тетрациклина в реальных
объектах.
Предмет исследований: физико-химические и аналитические свойства
модифицированных природного цеолита Хотынецкого месторождения Орловской
области и синтетического цеолита типа NaX в отношении к тетрациклину.
Объект исследований: модифицированные природный цеолит Хотынецкого
месторождения Орловской области и синтетический цеолит типа NaX.
Научная новизна работы заключается в следующем:
впервые
изучены
сорбционные
свойства
природного
(Хотынецкого
месторождения) и синтетического цеолитов по отношению к железу(III)
из
модельных водных растворов. Установлены цветометрические характеристики тестсистемы
(на
основе
химически
модефицированных
определения тетрациклина в реальных объектах.
алюмосиликатов)
для
7
Полученные данные могут быть использованы при разработке тест-системы
для определения тетрациклина в реальных объектах при анализе «на месте».
Работа
способствует
развитию
природных ресурсов Орловской области.
высокотехнологического
использования
8
I. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Глава 1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ТЕТРАЦЕКЛИНЕ И СПОСОБАХ ЕГО
ОПРЕДЕЛЕНИЯ
1.1 Общие сведения о тетрациклине, применение, воздействие на организм
человека
Тетрациклины (ТЦ) –
группа антибиотиков, относящихся к классу
поликетидов, близких по химическому строению и биологическим свойствам
(рисунок 1).
Они выделяется из плесеней рода Actinomyces
бактериостатическим
эффектом,
в
структуре
которых
обладающих
имеется
четыре
конденсированных шестичленных карбоцикла [2].
Рис. 1. Общая формула тетрациклинов
Представители данного семейства характеризуются общим действием и
механизмом
антимикробного
действия,
близкими
фармакологическими
характеристиками. Различия касаются некоторых физико-химических свойств,
степени антибактериального эффекта, особенностей всасывания, распределения,
метаболизма в организме и переносимости.
Наиболее широко в сельском хозяйстве и пищевой промышленности
применяются следующие антибиотики тетрациклиновой группы (рис. 2).
Хлортетрациклин (ауреомицин, биомицин), открытый в 1945 г. – первый
представитель данной группы антибиотиков, на данный момент применяемый
только в ветеринарной практике.
Окситетрациклин (террамицин) в 1949 г. выделен из культуральной жидкости
актиномицета Streptomyces rimosus.
9
а)
б)
в)
г)
Рис. 2. Основные представители тетрациклинов:
а) – хлортетрациклин, б) – окситетрациклин, в) – тетрациклин,
г) – доксициклин
Тетрациклин, полусинтетический антибиотик, получен в 1952 г. химическим
путѐм, посредством восстановительного дегалоидирования хлортетрациклина.
Доксициклин, полусинтетическое производное окситетрациклина.
Все тетрациклины принято разделять на природные и полусинтетические. К
первым относятся тетрациклин и окситетрациклин. В число полусинтетических
препаратов входят доксициклин, демеклоциклин, метациклин и миноциклин [3].
В настоящее время значение тетрациклинов сохраняется в лечении особо
опасных инфекционных заболеваний, как: чума, холера, туляремии, бруцеллеза и
д.р. Классический препарат тетрациклинового ряда тетрациклин практически не
используется, в основном как БАД1 для профилактики заболеваний и нарастания
мышечной массы у животных и растений.
Не смотря на достаточно большое количество плюсов тетрациклина: высокая
биодоступность, всасывается 75–77%, широкий спектр действий,
1
БАД- биологически активная добавка.
относительно
10
высокая выводимость из организма, устойчив по отношению к жидкостям
организма (плазма, моча, желчь), активен к большому числу бактерий - тетрациклин
обладает рядом минусов. Из распространенных побочных эффектах употребления
или повышения концентрации ТЦ являются:
 аллергические реакции;
 нарушения функций желудочно-кишечного тракта (диспепсии, поносы,
тошнота, рвота, дисбактериоз);
 головокружение;
 повышение внутричерепного давления;
 тромбоцитопения;
 фотосенсибилизация (при приеме демеклоциклина, встречается редко).
Доказано, что тетрациклины обладают тератогенностью. Кроме этого,
представители данного класса антибиотиков достоверно тормозят процессы
остеогенеза и метаболизма костной ткани. Тетрациклин избирательно накапливается
в костях, печени, селезенке, опухолях, зубах. Проходит через плаценту и проникает
в грудное молоко. У детей до 8 лет тетрациклин может вызывать долговременное
изменение цвета зубов, гипоплазию эмали, замедление продольного роста костей
скелета [3, 4].
По этим причинам тетрациклины абсолютно противопоказаны во время
беременности, а также детям до 8 лет включительно. Другие противопоказания:
повышенная чувствительность к тетрациклинам, несахарный диабет, нарушения
функций печени и почек [3].
1.2 Контроль содержания антибиотиков в продуктах питания
Для увеличения производительности и снижение стоимости продукции
используют антибиотики и стимуляторов роста (в животноводстве и птицеводстве),
гербицидов, инсектицидов, фунгицидов (в растениеводстве) [5]. К сожалению, все
выше перечисленное не всегда используется рационально. Остаточное колличество
этих потенциально опасных химических соединений в готовой продукции должно
быть ниже предельно допустимых значений, определенных законодательством.
11
Ответственные
производители
сельскохозяйственной
продукции,
пользующиеся в соответствии со своим технологическим регламентом антибиотики,
пестициды и стимуляторы роста, несут ответственность за безопасность своей
продукции для здоровья человека.
Снижение риска загрязнения сырья потенциально опасными химическими
соединениями может быть достигнут только при тщательной системе контроля на
всех стадиях производства – от закупки сырья до реализации. Вследствие этого к
методам контроля вредных соединений в сырье и продуктах животного
происхождения должны предъявляться весьма жесткие требования – методы
должны быть надежны, просты, оперативны, они должны обеспечивать высокую
чувствительность и селективность определения [6].
Проблема является предметом обсуждения как в национальных, так и в
международных масштабах. В РФ действуют санитарно-эпидемиологические
правила и нормативы «Гигиенические требования безопасности и пищевой
ценности пищевых продуктов» (СанПиН 2.3.2.1078-01), где четко регламентируется
содержание ряда антибиотиков в сырье и продуктах животного происхождения [7,
8].
Установлено
что,
ПДК
остаточного
содержания
антибиотиков
тетрациклиновой группы в мясных, молочных и других пищевых продуктах,
составляет 0,01 ед/г (у высокочистого тетрациклина 1 ед. соответствует 1 мкг) [10].
В действующих на территории Российской Федерации требованиях к
безопасности
мясных
продуктов
остаточное
содержание
антибиотиков
не
допускается и нормируется на уровне долей единицы антибиотической активности
(мкг) в одном грамме образца (таблица 1) [10].
Постоянное поступление антибиотиков в организм человека с продуктами
питания крайне вредно, так как они могут оказать нежелательный эффекты, чаще
всего в виде возникновения аллергических реакций, дисбактериоза, изменять
микрофлору кишечника, способствовать распространению устойчивых форм
микроорганизмов и т.д.
12
Таблица 1. Допустимые уровни содержания антибиотиков в продуктах питания,
Низин
Пенициллин
Стрептомицин
Бацитрацин
Гризин
Группа продуктов
Тетрациклиновая группа
ед./г, не более
Мясо и птица свежие и
охлажденные
0,01
0,05
0,02
-
-
-
Яйца и яйцепродукты
0,01
-
-
0,5
-
-
Молоко и кисломолочные
изделия, в том числе
сухие и творожные
изделия; казеин
0,01
-
-
0,5
0,01
-
Молоко сгущенное
0,01
-
-
0,5
0,01
25
Следует учитывать возможность неблагоприятного влияния антибиотиков в
сырье для пищевой промышленности на ряд необходимых стадий технологических
процессов в переработке мяса, рыбы, молока (в частности, при получении
кисломолочных продуктов) и других продуктов. Кроме того, наличие антибиотиков
может затруднять микробиологические исследования качества продуктов животного
происхождения [9]. Стоит отметить, что постоянное потребление продуктов
содержащих тетрациклин повышает вероятность привыкание организма к данной
группе антибиотиков и в момент приема его с целью лечения не даст
положительных результатов.
В настоящее время для качественного и количественного определения
остатков
жидкостная
антибиотических
хроматография
препаратов
(ВЭЖХ);
используются;
жидкостная
высокоэффективная
хроматография
с
масс-
13
спектрометрическим детектированием (ЖХМС); тонкослойная хроматография
(ТСХ); флуоресцентный анализ. Метод газовой хроматографии не используют из-за
сложности перевода антибиотиков в летучее состояние. Следует отметить, что
применение хроматографических и спектральных методов для анализа остаточных
количеств препаратов позволяет решать задачу аналитического контроля качества,
однако имеется ряд проблем. Во-первых, хроматографическая идентификация
предусматривает анализ содержания конкретного вещества по времени удержания
хроматографического пика.
Во-вторых, хотя методы является достаточно надежными, они требует
дорогостоящего сопровождающего оборудования и не может быть рекомендован
для серийного анализа.
Если учесть требования, предъявляемые к экспресс-методам анализа
продовольствия (селективность, скорость обработки данных и детектирования
аналитического
сигнала,
чувствительность),
предпочтительным
является
иммуноферментный анализ. Однако, стоит отметить высокую стоимость проведения
химического анализа данным методом.
1.3 Методы определения остаточных количеств тетрациклина в продуктах
питания
Наличие в ароматических и частично-восстановленных ароматических
шестичленных кольцах гидроксильных, карбонильных и диметиламиногрупп делает
тетрациклины лигандами при их комплексообразовании с ионами Al3+, Be2+, Zr4+,
Mg2+, Ca2+, Ga3+, и при этом образуются интенсивно флуоресцирующие хелаты. При
взаимодействии ионов Fe2+, Fe3+, Co2+, Ni2+, Mn2+, Cu2+ с тетрациклинами возникают
окрашенные в водных и водноорганических средах координационные соединения с
высокими величинами молярных коэффициентов поглощения. Вместе с тем, при
фотометрическом определении содержания тетрациклинов в различных объектах
используется только реакция с железом(III). Тетрациклины сорбируются на
активных углях, катионитах, оксиде алюминия и алюмосиликатах различного
происхождения.
14
1.3.1 Определение методом ВЭЖХ
Метод
определения
тетрациклинов
обеспечивает
хроматографическое
разделение данных антибиотиков и их эпиформ. Сущность метода заключается в
проведении предварительной стадии твердофазной экстракции в обращено-фазном
варианте и последующем разделении и определении индивидуальных компонентов
методом ВЭЖХ с масс-спектрометрическим детектированием [11]. Расчеты
содержания в пробе антибиотика тетрациклиновой группы выполняют с помощью
градуировочной характеристики путем вычисления отношения площади пика
фрагментного иона к площади внутреннего стандарта и последующего соотношения
с градуировочной кривой [12]. Наиболее эффективным при этом является метод
ВЭЖХ с флуоресцентным или УФ-детектированием.
Данный
метод
обеспечивает
выполнение
измерений
содержания
тетрациклинов с аналитических измерений при коэффициенте охвата k=2, указанной
в таблице 2.
Таблица 2. Значения относительной расширенной неопределенности измерений Vn
(%) в диапазонах измерений содержаний антибиотиков тетрациклиновой группы,
(мкг/кг)
Антибиотик
тетрациклиновой
группы
Относительная расширенная неопределенность
измерений Vn (%) при Р=0,95 и диапазоне измерений
содержаний тетрациклинов (мкг/кг)
от 1 до 10
свыше 10 до 100
свыше 100 до 1000
Тетрациклин
69
27
12
Окситетрациклин
67
28
20
Доксициклин
80
25
12
Хлортетрациклин
114
23
18
Определение
окситетрациклина
в
рыбном
филе
методом
ВЭЖХ
с
флуоресцентным детектированием при 335 нм, с пределом обнаружения 20 нг/г
предложено в [13]. При определении окситетрациклина в тканях свиней [14] после
ВЭЖХ отделения также используют флуориметрическое детектирование (λ возб = 380
15
нм, λизлуч = 520 нм), предел обнаружения – 0.04 мкг/г. Чувствительные методики
определения тетрациклинов (окситетрациклина, тетрациклина и хлортетрациклина)
в
продуктах
животного
происхождения
предусматривают
измерение
постколоночной молекулярной люминесценции антибиотиков, усиленной при
комплексообразовании с катионами циркония(IV) [15] или алюминия(III) [16].
Пределы обнаружения составляют 1 – 4 нг/мл.
Сочетание
иммуноаффинной
хроматографии
и
сенсибилизированной
люминесценции европия(III) в комплексе с тетрациклином и N, N – бис (2 –
гидроксиэтил) глицином использовано для определения тетрациклина в молоке с
пределом обнаружения 19 нг/мл [17]. Методика является дорогостоящей, т.к.
требует наличия моноклональных антител к тетрациклину.
Методика
[18]
определения
тетрациклина,
окситетрациклина,
хлортетрациклина и демеклоциклина в яйцах, мышечной ткани и печени цыпленка,
мышечной
ткани оленины, лосося
и форели, основанная на экстракции
антибиотиков, упаривании экстракта досуха, растворении остатка в метаноле,
очистке методом аффинной хроматографии с хелатами металлов, элюировании и
разделении с последующим УФ – детектированием при 350 нм. Предел
обнаружения для описанных антибиотиков – 5; 3; 6 и 5 мкг/кг соответственно.
Определение антибиотиков тетрациклинового ряда в пищевых продуктах
методом ВЭЖХ описано также в работах [19-21].
1.3.2 Люминесцентные методы
Определение антибиотиков тетрациклинового ряда в пищевых продуктах
посвящено
большое
сенсибилизированной
число
исследований,
люминесценции
ионов
основанных
Ln(III).
на
использовании
Некоторые
из
этих
исследований проведены в таблице 3.
Обладая высокими значениями молярных коэффициентов поглощения,
органические лиганды в том числе и антибиотики, эффективно поглощают энергию
возбуждения. Если при этом энергия триплетного состояния лиганда больше
энергии резонансного уровня иона лантанида, то она может передаваться ему. Ион
16
переходит в возбужденное состояние, а затем высвечивает, выделяя кванты света
[35].
Таблица 3. Определение антибиотиков по сенсибилизированной люминесценции
ионов лантанидов(III)
Антибиотик
Ион
Ln(III)
Условия
эксперимента
Предел
обнаруже
ния
Обьект
анализа
Литератур
ный
источник
Ципрофлоксацин
Энрофлоксацин
Tb
ДДС,рН 7,4
3.5 мкг/кг
Мясо
циплят
22
0.18
нг/мл
Молоко
23
5.0 нг/мл
6.7·10-9
моль/л
Молоко
24, 25
3.0 нг/г
Корм для
животны
х
26
2.3 ·10-9
моль/л
Молоко
27
Куриное
мясо
Мясо
птицы,
куриная
паечень
Флумеквин
Окситетрациклин
Tb
Eu
ВЭЖХ,постколо
.
Детектир.,рН6,7
рН7,4, цитратион, -циклодекстрин
Окситетрациклин
Eu
ЭДТА, рН 9,0
Тетрациклин
Окситетрациклин
Хлортетрациклин
Доксициклин
Eu
Метанол, рН 9,0,
Amderlite XAD-4
Флумеквин
Tb
Фен, ДДС, рН
7,0
1.3·10-9
г/мл
Лазалоцид
Tb
рН 6,5, Тритон
Ч-100, ТОФО
2 нг/г
Хлортетрациклин
Eu
Хлортетрациклин
Eu
Норфлоксацин
Tb
Мицеллярные
среды, ТОФО,
рН 6,7
ТФ люм.ЭДТА,
цитрат, ЦТА,
сорбенткартридж для
ВЭЖХ
28
29
2.0 ·10-9
моль/л
Грудное
молоко
30
19.0 нг/г
Куриное
мясо
31
Мясо,
рыба
32
ТСХ,ТДС,рН 7,1 0.001 мкг
17
Ципрфлоксацин
Ампициллин
Тетрациклин
Tb
ТСХ,
ТДС,ТОФО
0.005 мкг
Молоко
33
Eu
Кинетич. Метод,
рН 7,4, ТТА,
Тритон Х-100
0.01
нг/мл
0.04
нг/мл
Молоко
34
Антибиотики тетрациклинового ряда образуют с ионами лантанидов
комплексные соединения, в которых ионы Eu(III) и Tb(III) обнаруживают
интенсивную люминесценцию при λ=615 нм (переход 5D0 →7F2) и при λ=545 нм
(переход 5D4 →7F5) соответственно [36].
Для снижения предела обнаружения при люминесцентном определении
антибиотиков в качестве аналитических форм часто используют разнолигандные
комплексы, в которых в качестве второго лиганда вводятся органические основания
или
донорно-активные
вещества,
такие
как
1,10-фенантролин
(Фен),
триоктилфосфиноксид (ТОФО), β-дикетоны, этилендиаминтетраацетат (ЭДТА), βциклодекстрин, оксикарбоновые кислоты и другие лиганды [24-26].
В ряде исследований для снижения пределов обнаружения, повышения
селективности, либо уменьшения времени проведения анализа применяется
твердофазная спектрофлуориметрия [31-33].
Методика [31] предусматривает определение тетрациклина в курином мясе
непосредственно в фазе сорбента по люминесценции его комплекса с ионом Eu (III),
в присутствии цитрат–ионов и катионного ПАВ – цетилтриметиламмоний хлорида
(ЦТА).
Хемилюминесцентное определение тетрациклина в меде основано на
сенсибилизированной люминесценции ионов европия(III) в системе тетрациклин –
H2O2 – Fe(II)/ Fe(III). Предел обнаружения – 5.0 · 10–8 моль/л [37]. В некоторых
исследованиях в качестве аналитического сигнала используют собственную
молекулярную люминесценцию антибиотиков.
Для быстрого флуориметрического определения тетрациклина в мышечной
ткани и почках свиней антибиотики предварительно экстрагируют этилацетатом.
Методом твердофазной экстракции на катионообменной колонке проводят
18
концентрирование и очищение экстракта, после чего регистрируют собственную
люминесценцию аналита. Чувствительность метода составляет 0.1, 0.05, 0.2 мг/кг
соответственно [38].
1.3.3 Электрохимические методы
Разработаны
методики
электрохимического
определения
антибиотиков
тетрациклинового ряда (окситетрациклина, метациклина и тетрациклина) в молоке с
использованием амперометрического титрования и ионометрии [39–41]. При этом в
качестве электродноактивного вещества мембран ионселективных электродов
использованы
ионные
ассоциаты
антибиотиков
тетрациклинового
ряда
с
гетерополианионами структуры Кеггина. В случае амперометрического определения
в качестве титранта применяют 12-молибдофосфорную кислоту. Методики
отличаются высокой чувствительностью, простотой и селективностью. Пределы
обнаружения составляют 7·10–6 – 1·10–5 моль/л.
Метод дифференциальной импульсной вольтамперометрии использован для
одновременного определения окситетрациклина, тетрациклина и хлортетрациклина.
В качестве стационарного применяется ртутный электрод (висящая ртутная капля).
Методика позволяет определять содержание перечисленных антибиотиков в кормах
для животных, мышечной ткани рыб в интервале концентраций 0.02–0.18 мг/мл [42].
1.3.4 Иммунологические и микробиологические методы
Учитывая требования, предъявляемые к экспресс-методам мониторинга сырья,
полуфабриката и готового продукта (чувствительность, время для получения
результатов, селективность, стоимость выполнения анализов), более применяемым
является метод иммуноферментного анализа. Самым популярным является одна его
разновидность - метод ELISA, удовлетворяющий всем требованиям, предъявляемым
к методам рутинного контроля [10].
Принцип метода основан на конкуренции свободного антибиотика из
измеряемой пробы и антибиотика, предварительно иммобилизованного на твердой
фазе в составе белкового конъюгата, за центры связывания специфичных к
19
конкретному
антибактериальному
несвязавшихся
реагентов
препарату
количество
антител.
антител,
После
отделения
прореагировавших
с
иммобилизованным антигеном, определяют с помощью антивидовых антител,
меченых пероксидазой хрена. Количество связавшегося с антителами конъюгата
вторичных антител выявляют с помощью субстрат-хромогенной смеси.
Количество определяемого антибиотика, содержащегося в исследуемом
образце, обратно пропорционально регистрируемой оптической плотности продукта
ферментативной реакции. Пределы обнаружения метода составляют 1,510-3-1,510-1
мг/кг для антибиотиков тетрациклиновой группы [43].
1.3.5 Тест-методы
Экспресс–тесты удобны и просты в применении, не требуют дополнительного
оборудования или считывающего устройства, позволяют проводить анализ в
полевых условиях. Тестовые полоски с результатами анализа долго сохраняются и
могут быть использованы для сравнительной оценки определений достаточно
длительный срок.
Известны следующие тесты определения антибиотиков тетрациклинового
ряда:
«Tetrastar» – экспресс–тест, основанный на анализе специфического
рецептора
тетрациклиновой
группы,
имеет
высокую
чувствительность
к
антибиотикам группы тетрациклина. Чувствительность составляет 60-80 мкг/кг [44].
«Betastar Combo» – экспресс–тест, обладающий чувствительностью к
антибиотикам двух групп: бета–лактамов и тетрациклинов. Чувствительность теста
– от 2 до 50 мкг/кг [45].
Широкое применение в производстве нашли также микробиологические
методы, основанные на непосредственном биологическом действии антибиотиков
на чувствительные штаммы микроорганизмов. Содержание антибиотиков выявляют
при их диффузии в агар по величине торможения роста различных тест–культур,
внесенных в питательные среды.
20
Микробиологический
stearothermophilus
тест «Copan Test»
calidolactis,
с
высокой
–
включает споры
чувствительностью
Bacillus
определяет
антибиотики группы бета–лактамов, тетрациклинов, аминогликозидов, макролидов
и других антибиотиков. Возможность определения полного спектра антибиотиков в
молоке, большой срок хранения и простота в использовании обеспечили тесту
широкое применение на предприятиях молочной промышленности, а также в
ветеринарных лабораториях, выдающих ветсвидетельства и осуществляющих
государственный контроль заготавливаемого молока [39].
Набор Ridascreen Tetracyclin представляет собой тест-систему для иммуноферментного анализа в комплекте с необходимыми реагентами, предназначен для
обнаружения сверхмалых остаточных концентраций тетрациклинов в мясе, меде и
молоке [46].
Тест «Снап Тетрациклин» так же является имунно-ферментным методом
определения остаточного тетрациклина, хлортетрациклина и окситетрациклина в
сыром цельном коровьем молоке на уровне, не превышающем допустимые
стандарты [47].
Все перечисленные тест-системы обладают рядом преимуществ:
 высокая чувствительность;
 экспрессность;
 простота применения;
 устойчивость результата анализа во времени.
Однако они имеют и недостатки:
 специфические условия хранения;
 дороговизна.
21
Глава 2. ТЕСТ-МЕТОД
2.1 Характеристика тест-систем и требования к ним
Тестирование (тест) (в химическом анализе) – это быстрый и однозначный
отклик (оценка) на присутствие и/или содержания определяемого химического
компонента в образце.
Тест-системы – простые в эксплуатации, портативные, легкие и дешевые
аналитические
средства
и
соответствующие
экспрессные
методики,
для
обнаружения и определения веществ без существенной пробоподготовки (иногда
без
отбора
проб),
без
использования
сложных
стационарных
приборов,
лабораторного оборудования, без самой лаборатории, без сложной обработки
результатов, а также подготовленного персонала; в большинстве случаев применяют
автономные средства однократного использования [48].
Общий принцип работы химических тест-методов – это выявление визуально
наблюдаемого или легко измеряемого аналитического сигнала (изменение окраски,
появление полосы и т.д) при использовании различного рода химических реакций и
реагентов в определенных условиях и формах (бумага, твердый носитель).
Одной из основных тенденций развития тестовых методов это возможность
анализа анализированного объекта «на месте». Он имеет большое количество
положительных характеристик:

экономия средств и времени на доставку проб в лабораторию;

отсутствие необходимости в пробоотборе и пробоподготовке;

быстрота анализа;

возможность самоконтроля (отсутствие необходимости в присутствии
квалифицированного персонала);

высокий предел обнаружения и т.д.
Прогрессивными в данной области является использоание химических
сенсоров. Под химическими сенсорами обычно понимают датчик, помещенный в
анализируемую среду, который непрерывно и обратимо регистрирует содержание
какого либо одного компонента [48].
22
Для анализа на месте наиболее популярными, а так же дешевыми являются
тест-системы. Как было сказано выше, они включают методику, и устройство
улавливания аналитического сигнала - бумажные полоски, порошки, таблетки,
ампулы, капельницы и т.п. Иногда используется портативный прибор.
Тест-системы нашли широкое применение в анализе воздуха рабочей зоны,
обнаружение и количественное определение содержания наркотических веществ и
алкоголя, клинические исследования (определение сахара в крови).
Классификация тест-систем приведена в схеме 1.
Схема 1.Классификация тест-систем
Требования к тест-системам:
23
1. применение тестов для предварительной оценки обязывает на ошибочный
положительный результат, для предотвращения нежелательных последствий и
возможности для более точного дальнейшего анализа.
2. независимо от формы применяемой тест-системы химическая реакция должна
проходить относительно быстро.
3. операции использования тест-системы должны быть минимальны.
4. при
визуальной
контрастными
(в
неоднозначного
оценки
случае
результаты
цвета),
определения
т.е
анализа
сводить
результата.
должны
к
быть
четкими,
минимуму
возможность
Воспроизводимость
визуальных
изменений приблизительно характеризуется погрешностью в 10-15% [40].
5. правильность тест-методов обычно проверяют сравниванием результатов
проведенного анализа с инструментальными методами.
6. устойчивость реагентов при хранении в той форме, в какой они используются в
тест методах.
7. устойчивость аналитического сигнала во времени.
2.2 Системы регистрации визуального сигнала
Из пункта 2.1 видно, что общими требованиями к системам регистрации в
тест-системах является: простота, быстрота, малые размеры и вес установки или
тест-средства, автономность (независимый источник энергоснабжения). Что
касается визуального обнаружения и определения, то к перечисленным требованиям
можно дополнить устойчивость цвета, четкость тона, интенсивность окраски или
длина окрашенной зоны
По распространенности визуальные методы в тест-методах являются наиболее
используемыми: они самые дешевые и простые. Распространенным способом
является
оценка
изменений
окраски
при
взаимодействии
тест-средства
с
анализируемым объектом. Пример - это определение величины рН индикаторными
бумажными полосками, появление окрашивания в трубке при обнаружении паров
алкоголя в выдыхаемом воздухе водителей автомобилей [48].
24
Из этих примеров видно, что визуальные методы используют как для
обнаружения веществ, так и для полуколичественного, а иногда и количественного
определения. Точность визуальных методов чаще всего не очень высока. Случается
что ответ качественных испытаний лежит на границе между положительным и
отрицательным результатами.
Воспроизводимость не редко не превышает 10%,
однако это не уменьшает значения визуальных методов.
В настоящее время создано много аналитических приборов карманного типа с
автономным электропитанием, простых в использовании [49]. Однако, не редко для
визуальной регистрации аналитического сигнала используют такие тест-средства
как: бумажные индикаторные полоски, индикаторные трубки, таблетки и
простейшие устройства для титрования.
2.2.1 Индикаторные порошки
Индикаторными порошками называют либо смеси необходимых реагентов для
определения веществ, либо сыпучие материалы на которых иммобилизованы
реагенты. В первом варианте аналитический сигнал определяют по интенсивности
окраски жидкости после внесения индикаторного порошка и его растворения в
анализируемом растворе [50]. Во втором случае индикаторный порошок вносят в
пробу, перемешивают и определяют концентрацию по интенсивности окраски
порошка (рисунок 3).
Рис.3. Прибор для тест-определения с использованием индикаторных порошков: 1колориметрическая трубка;2-анализируемый раствор; 3-индикаторный порошок
25
Использование синтетически полученных материалов
позволяет сочетать
сорбционное концентрирование определяемого компонента из разбавленных
растворов с его визуальным определением на поверхности индикаторного порошка
Установлено,
[48].
что
с
увеличением
удельной
площади
поверхности
заполненные
носителем
чувствительность определения возрастает.
2.2.2 Индикаторные трубки
Представляют
собой
тонкие
трубки
иммобилизированным на нем реагентом. Через заполненную трубку пропускают
определенный объем анализируемой жидкости. Данную операцию проводят 3
способами (рисунк 4):
а)
б)
в)
Рис.4. Качественное определение анализируемого вещества с использованием
индикаторной трубки с пропусканием при помощи шприца (а), за счет
гидростатического давления (б) и за счет капиллярных сил (в):1-анализируемая
жидкость;2- индикаторная трубка; 3- окрашенная зона носителя

с помощью шприца;

за счет гидростатического давления;

за счет капиллярных сил.
26
В результате химической реакции между закрепленным реагенте и
анализированным
веществом
образуется
окрашенное
соединение.
Длина
окрашенной зоны зависит от концентрации аналита.
Перспективным материалом как для индикаторных порошков, трубок и
таблеток являются как природные так и искусственно синтезированные цеолиты.
2.3 Способы использования реагентов
Существуют три основных пути применения аналитических реагентов в тестсистемах:
1) использование в виде заранее приготовленных и фасованных растворов;
2) использование в форме заранее взвешенных и упакованных доз в виде
порошков, шариков, таблеток и т.п.
3) иммобилизованные на твердую матрицу (носитель);
Готовые растворы. Используют обычно водные растворы; изготовители тестсредств помещают их в ампулы, капельницы, закрытые пробирки.
 Реагенты в таких растворах должны быть устойчивыми в течение
длительного времени.
 Концентрация
реагентов
соответствует
ожидаемой
концентрации
определяемого компонента.
Иногда растворы содержат не только сам реагент, но также другие
необходимые вещества.
Так же к готовым растворам относят реагенты-добавки: восстановители или
окислители, буферы, маскирующие агенты, смачивающие соединения, закрепители
и др.
Реагенты на твердой матрице это тест-средства, приготовленные на твердом
носителе - на бумаге, ткани, на синтетических органических полимерах, силикагеле
и др. Природа носителя, способ его приготовления и способ иммобилизации
реагентов на нем имеют весьма существенное значение. Реагент иммобилизуют
адсорбцией, испарением растворителя после импрегнирования раствором реагента в
этом растворителе, другими физическими методами или химической ковалентной
27
иммобилизацией. Относительно слабая фиксация «физически» закрепленного
реагента способствует частичному смыванию его при контакте с раствором,
является основным недостатком таких тест-систем. Увеличения прочности
связывания реагента с носителем добиваются образованием химических связей
между ним (химическая иммобилизация). Однако «физическое» закрепление, как
правило, намного проще, поэтому оно весьма широко распространено [49].
2.4 Способы физической и химической иммобилизации реагентов
Термином «иммобилизация» обозначают процесс фиксации соединений на
поверхности носителя или процесс переноса вещества из гомогенной подвижной
фазы на поверхность твердой фазы-носителя и его закрепление за счет
специфических взаимодействий. Носители (подложки, матрицы) различаются по
химической природе (металлы, оксиды, сильносшитые органические полимеры), по
морфологии
(пористые,
планарные,
высокодисперсные),
по
структуре
(кристаллические, аморфные) и так далее. Благодаря наличию структурных
функциональных групп на поверхности носителя, происходит его химическое
связывание с прививаемым веществом (модификатором) [51].
Иммобилизированные тест-средства классифицируют по трем основным
признакам:
 по способу иммобилизации (физическая за счет физической сорбции;
химическая - за счет ковалентной прививки модификатора);
 по типу модификатора (органический и неорганический);
 по типу носителя (смолы, пенополиуретаны, силикагели, мембраны) [52].
Все методы физической иммобилизации разделяют на три группы [50]:
1. адсорбция на поверхности нерастворимого носителя (в том случае, когда
удерживающая поверхность или часть поверхности носителя «омывается» внешней
средой (жидкой или газообразной);
2. включение в массу носителя (включение в двухфазную реакционную среду, где
препарат может находиться только в одной из фаз);
28
3. иммобилизация в полимерных пленках (мембранах) (вещество и небольшая часть
внешней среды помещены в замкнутый объем, отделенный от остальной среды
избирательно проницаемой мембраной, размер пор, в которой таковы, что субстраты
и продукты через них проникают, а иммобилизованный препарат удерживается
внутри замкнутого объема).
Слабое закрепление адсорбционно иммобилизованных гидрофильных реагентов
на поверхности носителя, приводимое к частичному смыванию их при контакте с
раствором, является основным недостатком такого физического способа фиксации.
Способы физической иммобилизации реагентов:
1. Иммобилизация на поверхности носителя.
При иммобилизации на носителе препарат может быть зафиксирован
различными силами:
– не ковалентной природы (ионные, гидрофобные, водородные и др.);
– комплексообразующие;
– химически удерживающая матрица должна иметь особые группировки, способные
реагировать с компонентами препарата (этот случай можно рассматривать как
хемосорбцию); либо для ковалентного связывания препарата с носителем
необходим специальный сшивающий агент.
К достоинствам адсорбционной иммобилизации относятся исключительная
простота методов ее проведения. По существу, иммобилизация происходит при
контакте водного водного раствора препарата с адсорбентом.
Способы иммобилизации на поверхности носителя делятся на статические, с
перемешиванием и путем нанесения на колонке (рисунок 5).
Статический способ наиболее прост. Он заключается в том, что носитель
(адсорбент)
вносят
в
раствор
и
смесь
оставляют
на
некоторое
время.
Иммобилизация достигается за счет осаждения частичек вещества из раствона и
последующей их адсорбции на частицах носителя. Недостатком способа является
необходимость длительного контакта адсорбента с раствором [52].
29
Рис.5. Способы иммобилизации на поверхности носителя:
а- статические, б- с перемешиванием, в- путем нанесения на колонке
(1-суспензия; 2- носитель; 3- колонка; 4- насос)
Способ с перемешиванием обеспечивает более быстрое завершение процесса
адсорбции и более равномерное заполнение носителя.
Способ нанесения в колонке заключается в прокачивании раствора с
необходимым веществом через колонку, заполненную носителем.
Иногда для проведения адсорбционной иммобилизации применяют метод
электроосаждения (электроадсорбция) (рисунок 6).
В этом случае в раствор погружают два электрода, на поверхность одного из
которых помещают слой носителя. При пропускании электрического тока молекулы
необходимого вещества, благодаря имеющимся на поверхности заряженным
группам, начинают перемещаться в растворе в направлении электрода с носителем и
осаждаются на его поверхности.
30
Рис.6. Иммобилизация методом электроосождения
2. Иммобилизация в массе носителя.
Сила, которая позволяет удерживать вещество в объеме носителя, может
осуществляться как обездвиживание за счет физических факторов (просто массой
носителя, т. е. механически), так и фиксация с образованием ковалентных связей
между компонентами препарата и веществом матрицы (препарат «вшивается» в
носитель) (рисунок 7).
Рис.7. Иммобилизация в массе носителя
(1-носитель; 2-препарат; 3- внешняя среда)
В данном варианте иммобилизации достигается более высокая концентрация
иммобилизованного вещества в носителе, что позволяет повысить продуктивность
31
процесса в целом. Стоит так же
отметить важное преимущество этого вида
иммобилизации по сравнению с иммобилизацией на носителе заключающееся в
хороших эксплутационных свойствах получаемых систем, в том числе и защищены
от многих неблагоприятных факторов окружающей среды.
3. Иммобилизация в полимерных пленках (мембранах).
Существующие вариации этого метода различаются лишь способами
получения избирательно проницаемой мембраны и ее природой. Важным фактором
является толщина мембраны – с ее уменьшением происходит повышение
проявляемой
иммобилизованным
веществом
активности,
что
определяется
возможностью увеличения диффузии субстрата к сенсеру [52].
Плоские мембраны – легко пропускают молекулы субстрата, но представляют
собой непреодолимый барьер для крупных молекул (рисунок 8. а).
Пористые волокна – аналогично случаю плоских мембранных носителей,
только здесь используются мембранные полые волокна. Фактически эти волокна
представляют собой длинные тонкие трубки, стенки которых выполнены из
полимерной мембраны (рисунок 8. б).
а
б
Рис.8. Иммобилизация в полимерных пленках : а - с использованием плоских
мембран, б - с использованием пористого волокна
По сравнению с плоскими мембранами в отношение занимаемого веществом
объема к общему объему системы, у пористого волокна – выше. В связи с этим
мембраны из пористого волокна обладают большей продуктивностью, что
объясняет их более широкое использование.
32
Глава 3. СОРБЕНТЫ НА ОСНОВЕ ЦЕОЛИТА
3.1 Общая характеристика цеолитов
Цеолит - алюмосиликаты с каркасной кристаллической структурой (рисунок
9), в которой имеются полости, характеризующиеся значительной подвижностью,
что обеспечивает возможность ионного обмена [53].
Рис.9. Каркасная кристаллическая структура алюмосиликата.
В центре расположен атом металла
Структурная формула цеолита: Мm/n [(AlO2)x (SiO2)y]∙zH2O x+y – сумма
тетраэдров в элементарной ячейке, m – число катионов М, n-валентность катиона
[54].
Кристаллы цеолитов пронизаны системой каналов или полостей, обладают
хорошо развитой внутренней поверхностью. Такое строение позволяет цеолитам
избирательно сорбировать молекулы.
Другое название цеолита – молекулярные сита – это пористые неорганические
твердые тела, состоящие из множества пористых кубических цеолитных кристаллов
микронных размеров. Цеолитные кристаллы являются действующим началом
молекулярных сит [55].
Широкое использование молекулярных сит обусловлено их необычными
свойствами:
 способностью сорбировать и десорбировать различные вещества в
газообразном состоянии, в том числе и водяной пор;
 способностью легко обменивать катион цеолитов на любой другой
положительный ион;
33
 способностью образования внутренней поверхности большой величины, за
счет сети полостей и узких диффузионных путей (пор). Внутренняя поверхность
цеолитов составляет от 10 000 до 100 000 значений величины внешней поверхности.
Эти свойства цеолитов используют в процессах сушки и селекционного
разделения.
Наиболее распространенные типы синтетических цеолитов - это типы А, Х и
Y (Таблица 4).
Таблица 4. Основные виды цеолитов
Тип
А
Размер пор и название
Формула
Алюмосиликат натрия с диаметром пор
4 A (т.е. 4 нм или 4*10-8 см ), называется
4А (NaA). Замещение катионов Na на
Са приводит к увеличению диаметра
отверстий до 5 A; этот цеолит
называется 5А (СаА). Аналогично,
цеолитам с входным отверстием 3 A,
цеолит 3А (КА) получают замещением
натрия калием. Диаметр входного окна
0,3-0,5 нм.
Данная кристаллическая структура
построена с получением более широких
входных отверстий. Она соответствует
Х
(фожазит) молекулярным ситам 13Х (NaX).
Диаметр входного окна 0,8-0,9 нм.
Y
Na12[Al12Si22O48]∙ 27 H2O
Nan[AlnSi106O384]∙ 260 H2O
(87 > n > 83)
Имеет
ту
же
кристаллическую (Nan[AlnSi192-nO384]∙ 260 H2O
структуру, что и тип Х, но иной
(75 > n > 56)
химический состав.
Молекулярные
сита
относительно
стабильны
как
химически,
так и
термически. При восстановлении активности молекулярные сита подвергают
воздействию температур порядка до 700°С. Однако для десорбции достаточно
температуры 200-300°С. Структура сит не подвергается разрушению
при
погружение в воду, так же наблюдается устойчивая стабильность в разбавленных
щелочных
растворах.
Сильные,
не
разбавленные
кислоты
разрушают
34
кристаллический каркас. В некоторых солевых растворах происходит обмен
катионами между своим катионом и катионом цеолита [53].
Ионообменная емкость цеолитов — один из основных параметров,
характеризующих их сорбционные и технологические свойства. Максимальной
сорбционной способности цеолита соответствует полное замещение одного иона
другим во всех кристаллических позициях.
3.2 Особенности строения и свойства Хотынецкого цеолита
Месторождения цеолитов неоднородны по минералогическому и химическому
составу, в результате получается различный эффект при их применении.
Использование этого природного минерала в России, обладающей крупнейшими
запасами, является незначительным, что говорит о нетрадиционностью и высокой
наукоемкостью освоения этого полезного ископаемого. Содержание аморфного
кремнезема в Орловских цеолитах в соответствии с ГОСТ 8269-97 составляет
30,69%, при среднем показателе 6,16-12% [56]. В состав Орловских цеолитов входит
также до 40% клиноптилолита.
Усредненный элементный и химический состав цеолита Хотынецкого
месторождения приведен в таблице 5 [57].
Таблица 5. Усредненный элементный состав цеолита (n=5)
Элемент
Атомный
процент, %
Средний
атомный
процент, %
Mg
Al
0,53 - 0,63
2,88 – 3,56
0,58
3,28
Соединение
средний
весовой
процент, %
1,34
9,20
Si
21,73 – 28,26
23,99
81,07
SiO2
K
0,51 – 0,80
0,64
1,77
K2O
Ca
0,46 – 0,68
0,55
1,84
CaO
Ti
0,10 – 0,15
0,13
0,48
TiO2
Fe
0,79 – 1,25
1,05
3,91
Fe2O3
Cu
O
0,31 – 0,38
64,88 – 72,2
0,34
69,78
1,51
CuO
Формула
MgO
Al2O3
35
*n – количество изученных образцов
3.3 Общая характеристика синтетических цеолитов, их преимущества и
недостатки
Синтетические цеолиты без связующих компонентов по физическим свойствам
близки к природным цеолитам, но значительно превосходят их по ряду показателей
таких как: механическая прочность, увеличенная доля полезного объема адсорбента,
улучшенные кинетические показатели. Скорость транспорта молекул значительно
увеличивает
наличие
активной
поверхности
вторичных
пор
адсорбата
к
микропорам. Цеолиты без связующего материала преимущественно применяются в
первую очередь при осушке жидкостей [58].
Они обладают рядом преимуществ перед аналогами:

высокая мезопористость облегчает транспортировку газа по всему объему
гранулы, что повышают емкостные характеристики материала;

увеличенный межрегенерационный пробег, который возможно получить в
цеолитах NaX и NaA вследствие одностадийной кристаллизации, в процессе
которой происходит построение упорядоченного цеолитного каркаса;

более селективная работа адсорбента, достигаемая при новом способе
проведения стадии ионного обмена цеолита NaA для получения цеолитов КА и СаА
максимальной чистоты, что способствует в очистке газа от воды и специфических
примесей.
1. Преимущество цеолита NaХ. Он обладает достаточно широким входным окном,
что способствует адсорбции большое количество компонентов сложных смесей:
органические сернистые и азотистые и кислородные соединения (меркаптаны,
тиофен, фуран, хинолин, пиридин, диоксан и др.), все типы углеводородов,
пентаборан
и
декаборан,
галогензамещенные
углеводороды
(хлороформ,
четыреххлористый углеводород, фреоны).
2. Цеолит KА применяется для осушки нестойких веществ, склонных к реакциям
полимеризации, так как при обычной температуре в значительных количествах
поглощает только воду.
36
3. Цеолит NaA приимущественно используется для адсорбции промышленных
газов, критический размер молекул которых не превышает 0,4 нм. К ним относят:
углерода, пропилен, аммиак, сероводород, сероуглерод, диоксид изшие диеновые и
ацетиленовые углеводороды, этан, этилен, органические соединения с одной
метильной группой, а также метан, неон, аргон, криптон, ксенон, кислород, азот,
оксид углерода. Пропан и органические соединения с числом атомов углерода в
молекуле более 3 не адсорбируются цеолитом NaA. Более 3 молекул адсорбируется
при осушке и очистке.
Последняя группа веществ в значительных количествах поглощается только
при низких температурах.
4. К преимуществу цеолита СаА относят возможность адсорбировать углеводороды
и спирты только нормального строения (независимо от длины цепи). Это позволяет
использовать его в процессах разделения многокомпонентных органических
веществ на молекулярно-ситовой основе. Кроме того, цеолитом СаА поглощаются
метил- и этилмеркаптаны, органические соединения с числом атомов углерода в
молекуле, равным двум, (этиловый спирт, этиламин, диборан др.). Цеолит СаА так
же отличается повышенной стойкостью к слабокислым средам и, поэтому его
используют в процессах сероочистки и декарбонизации газов.
5. Цеолит СаХ при полном замещении катиона натрия на кальций, в отличие от
цеолита NаХ, не адсорбирует ароматические углеводороды или их производные с
разветвленными радикалами. Применение цеолитов СаХ и NаХ основано на
избирательности процессов адсорбции, а не на молекулярно-ситовых свойствах.
Преимущества синтетического цеолита типа NaX
Цеолит NaХ представляет собой плотную мелкозернистый порошок белого
или светло-серого цвета. Он
имеет достаточно широкое входное окно и
адсорбирует подавляющее большинство компонентов сложных смесей: пентаборан
и декаборан, все типы углеводородов, азотистые и кислородные соединения (вода,
аммиак, меркаптаны, тиофен, фуран, хинолин, пиридин, диоксан и др.),
органические
сернистые,
галогензамещенные
четыреххлористый углеводород, фреоны).
углеводороды
(хлороформ,
37
Важная особенность цеолита типа NaX - это температурная устойчивость.
Так же не маловажной особенностью цеолиты NaX является получение
одностадийной кристаллизацией, в процессе которой происходит построение
упорядоченного цеолитного каркаса и повышение прочностных характеристик
материала, что позволяет увеличивать межрегенерационный пробег и легко
варьировать его физическими и химическими свойствами [59].
3.4 Способы варьирования свойств цеолитов
Состав алюмокислородного каркаса цеолитов одного и того же структурного
типа в значительной степени определяет их свойства. Каркас состоит из различного
процентного содержания тех или иных соединений (таблица 6).
Таблица 6. Химический состав каркаса алюмосиликатов
SiO
69,0-74,0 %
CaO
1,7-3,3 %
TiO
0,08-0,16 %
MgO
0,4-1,7 %
Al2O3
11,4-14,0 %
K2O
4,0-5,5 %
Fe2O3
0,60-1,8 %
Na2O
0,4-0,9 %
MnO
0,02-0,05
H2O
до 10 %
Во многих случаях отношение Si/Al в однотипных кристаллах синтетических
цеолитов может изменяться в сравнительно широких пределах. Типичными
примерами такого рода являются синтетические фожазиты (цеолиты X и Y),
синтетические калиевые шабазиты (цеолиты G), синтетические анальцимы.
Путем изменения состава исходных алюмосиликатных смесей и силикатных и
алюминатных
растворов
может
происходить
регулирование
состава
кремнеалюмокислородного каркаса цеолитов одного и того же структурного типа и
оно может осуществляться в пределах поля кристаллизации данного цеолита [60].
Большее соотношение SiO2/Al2O3 в цеолитах, делает его более устойчивым к
воздействию кислот. В таблице 7 приведена стабильность цеолитов разных типов по
отношению к кислотам [61].
38
Таблица 7. Стабильность цеолитов разных типов в кислотах
Цеолит
SiО2/Al2О3
Устойчивость к кислотам
NaA
2
Растворяется при pH<5
NaX
2,4-2,7
То же
NaY
До 3,5
Разрушается в 3н уксусной кислоте
NaY
NaЭ
NaM
4,0-5,9
6
10
Мало разрушается в 3н уксусной кислоте
То же
Не разрушается в 3н соляной кислоте.
Образование гелей получается при обработке цеолитов сильными кислотами.
Так, например, под действием соляной кислоты цеолиты натриевой формы A и X
легко разлагаются, и при этом осаждается светлый гель.
Соотношение SiO2/Al2O3 в каркасной структуре цеолитов влияет и на
абсорбционную способность цеолита типа NaX (таблицы 8 и 9) [62].
путем
изменения
состава
исходных
алюмосиликатных
смесей
или
силикаалюмогелей можно варьировать дисперсность кристаллов, это возможно
делать в ограниченных пределах [58].
Таблица 8. Свободный объем в цеолите NaX (SiO2/Al2O3 = 1,25)
Адсорбант
t,C
Vp, см3/г
Число молекул в расчете на э.я.
H2O
25
0,36
265
C2O
-78
0,33
120
Ar
-183
0,30
140
Kr
-183
0,27
116
Xe
O2
N2
n-пентан
-78
-183
-196
25
0,25
0,31
0,35
0,30
74
149
134
34
неопентан
25
0,26
29
2,2,4-триметилпентан
25
0,27
22
бензол
25
0,30
45
(C4H9)3N
25
0,29
16,4
39
Таблица 9. Свободный объем в цеолите NaX (SiO2/Al2O3 = 1,33)
Углеводород
T, K
Vp, см³/г
Число молекул в расчете на э. я.
n-пентан
298
0,311
35,8
изопентан
298
0,309
34,8
n-гексан
298
0,309
31,3
n-гептан
298
0,311
28,3
n-октан
313
0,308
24,4
изооктан
298
0,282
22,7
бензол
303
0,295
43,3
толуол
313
0,301
36,8
циклопентан
303
0,334
45,1
циклогексан
313
0,268
33,0
К получению более мелких кристаллов и к интенсификации процесса
зародышеобразования в гелях приводит повышение щелочности гелей. Однако
регулирование размеров кристаллов путем изменения щелочности гелей не всегда
применимо, поскольку вместе с изменением содержания щелочи может измениться
и сама природа кристаллизующихся фаз.
Для регулирования дисперсности кристаллов применяют метод старения
гелей, который позволяет в определенных случаях варьировать размеры кристаллов
цеолитов одного и того же структурного типа в широких пределах. Чем больше
периода старения одного и того же геля, тем меньше размер кристаллов цеолита.
Однако, метод старения гелей не позволяет получать крупные кристаллы цеолита,
так как старение всегда приводит лишь к уменьшению размеров кристаллов, как
было сказано ранее.
Необходимо иметь ввиду, что в некоторых случаях возникает задача синтеза
крупных монокристаллов цеолитов. Значительные успехи были достигнуты в
области выращивания кристаллов цеолитов типа содалита, однако выращивание
совершенных и достаточно больших монокристаллов других цеолитов все еще
остается не решенной задачей [63].
40
Варьирование адсорбционных свойств цеолитов
Подытоживая
регулирования
все
вышесказанное,
избирательной
перечислим
адсорбционной
основные
способности
способы
цеолитов можно
отнести:
1. изменение состава в процессе кристаллизации. Из одних и тех же исходных
веществ можно получить алюмосиликатные пористые кристаллы, обладающие
разными свойствами. Так, например, цеолит типа А образуется из смесей, богатых
щелочами и бедных кремнеземом, а цеолит типа Y кристаллизуется в области с
наименьшей щелочностью среды и наибольшей концентрацией кремнезема;
2. способ ионного обмена. Ионным обменом можно регулировать молекулярноситовые свойства, особенно типа А. Зная размеры адсорбируемых молекул и окон
цеолита, можно подбирать определенную катионообменную форму цеолита для
разделения любой смеси газов или растворенных газов;
Так, например, цеолит, КА, у которого размер окон равен примерно 3 Å,
адсорбирует хорошо воду, воду но не адсорбирует молекулы метанола, двуокиси
углерода, критический диаметр молекул которых больше 3 Å. Цеолит NaA у
которого рамер окон равен 4 Å, адсорбирует метанол, двуокись углерода и не
адсорбтрует молекулы пропана, гексана и другие молекулы, критический диаметр
которых выше
4 Å. На цеолите CaX, у которого размер окон равен 8 Å, молекулы
1,3,5-триэтилбензола не адсорбируются, а на цеолите NaX (размер окон 9 Å) они
хорошо адсорбируются.
Цеолиты обладают также ионоситовым действием. Так, например, натрий в
цеолите типа X нельзя обменять на катионы алкиламония в связи с большим
размером последних. Катионно-ситовые эффекты в цеолитах могут быть вызваны и
тем, что из-за слишком большого размера катион не может проникать в малые
каналы и полости в каркасе цеолита или же, обменные катионы в процессе синтеза
некоторых цеолитов локализуются в недоступных для обмена участках и поэтому не
замещаются [59].
3. введение в кристалл цеолита легко поглощаемых примесей, обычно
небольших полярных молекул. Эти модифицирующие молекулы фиксируются
41
прежде всего у входных окон, через которые должны диффундировать молекулы
адсорбата, и создают препятствия их продвижению. Так, например, предсорбция
небольших количеств паров воды на цеолите типа А резко уменьшает адсорбцию
кислорода.
Эффективные
диаметры
окон
можно
регулировать,
образуя
металлоорганические комплексы. Так, при обработке пиридином медной формы
цеолита X образуется весьма прочный комплекс пиридин катион. Адсорбция
молекул газов и паров на таком цеолите указывает на значительное уменьшение
размеров пор вследствие их блокирования металлоорганическими комплексами;
4. особое место среди катионзамещенных цеолитов занимают водородные, или
декатионированные, формы цеолитов. Замещение катионов цеолита водородом
является одним из способов модифицирования пористых кристаллов. Водородная
форма цеолитов в отличие от других форм не может быть получена простой
обработкой цеолита кислотами, т.к. последние разрушают кристаллическую
решетку, особенно низкокремнеземных цеолитов. Поэтому вначале ионы натрия
замещаются на ионы аммония, затем последний термически разлагают, при этом
выделяется
аммиак
и
образуется
протон,
который
обеспечивает
электронейтральность решетки цеолита;
5. одним из методов модифицирования цеолитов является деалюминирование.
Обработка цеолита кислотами приводит к растворению тетраэдрического алюминия
в
решетке.
В
результате
увеличивается
адсорбционная
емкость
цеолита.
Деалюминирование можно осуществлять также обработкой цеолита веществами,
образующими с ионами алюминия комплексные соединения, или обработкой слоя
цеолита парами воды при повышенных температурах [60]. Деалюминирование
позволяет в определенных пределах варьировать соотношение кремне- и
алюмокислородных тетраэдров в цеолите без изменения его кристаллической
решетки;
Избирательная адсорбция на цеолитах возможна и тогда, когда молекулы всех
компонентов смеси достаточно малы и свободно проникают в адсорбционное
пространство. При прочих равных условиях обменные катионы являются
адсорбционными центрами и определяют специфику взаимодействия при адсорбции
42
на цеолитах молекул разного строения и электронной структуры. Меняя природу и
размер обменного катиона, можно усилить или ослабить вклад специфического
взаимодействия в энергию адсорбции. Кроме взаимодействия с положительным
зарядом катионов, молекула адсорбата испытывает сильное дисперсионное
воздействие со стороны других атомов, образующих стенки каналов цеолита. Один
из важных вопросов адсорбционного взаимодействия на цеолитах - выяснение
природы активных центров [64].
43
Выводы к теоретической части
Обобщены и систематизированы литературные данные о применении
антибиотиков в том числе тетрациклинового ряда в животноводстве, пищевой
промышленности, медицины и ветеринарии. Приведены пути их поступления в
организм человека, показано негативное воздействие на него.
Проведен обзор основных методов и методик определения остаточных
количеств антибиотиков в продуктах животного происхождения. Изучены основные
аналитические характеристики методов, показаны их плюсы и минусы. Особое
внимание уделено существующим на данный момент тест – методикам определения
тетрациклина, показаны их достоинства и недостатки.
Приведена классификация видов и характеристик природных, синтетических,
модифицированных сорбционных материалов. Особое внимание уделено цеолитам
Хотынецкого месторождения Орловской области и синтетическим аналогам:
рассмотрены особенности их строения и свойства.
44
II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 4. МЕТОДКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПИРИМЕНТА
4.1 Используемые оборудование и реактивы
Реактивы: Все используемые реактивы имели квалификацию «ос.ч.», «х.ч.»,
«ч.», «ч.д.а.». Растворы приготовлены на бидистиллированной воде.
Исходный раствор Fe(III) с концентрацией 1 мг/мл готовили растворением
точной навески FeCl3·6H2O в бидистиллированной воде. Рабочие растворы с
концентрациями
50 мкг/мл готовили разбавлением исходного раствора в день
выполнения эксперимента.
В качестве фотометрического реагента для определения Fe(III) использовали
водный раствор салициловой кислоты с концентрацией 2,5 мг/мл.
Исходный раствор тетрациклина с концентрацией 2,4 мг/мл получали
растворением точной навески фармацевтического препарата в бидистиллированной
воде.
Рабочие
растворы
готовили
разбавлением
исходного
раствора
до
концентрации 100 мкг/мл.
Необходимое значение кислотности среды при изучении сорбции установили
добавлением ацетатного буферного раствора с соответствующим значением рН.
В качестве носителя для железа (III) использовались природный цеолит
Хотынецкого месторождения и синтетический цеолит типа NaX.
Приборы:
Измерение массы проводилось на аналитических весах Ohaus Explorer Pro
EP114.
Спекание веществ производилось в муфельной электропечи по ТУ 16531.408-72 с терморегулятором, обеспечивающая температуру 1100°С.
Высушивание золя производилось в сушильный шкаф с терморегулятором
обеспечивающий температуру 150°С;
Для измерения значения рН растворов применялся иономер И – 500. В
качестве электрода сравнения применялся хлорсеребряный электрод, в качестве
45
измерительного электрода – стеклянный электрод ЭСЛ–43-07. Абсолютная
погрешность измерения составляла 0,05 единиц рН.
Перемешивание
растворов
осуществляли
на
магнитных
мешалках.
Используемый фильтр «Белая лента».
ИК-спектры получают благодаря спектрофотометру ФСМ 2202.
Вся аппаратура, примененная для опытов,
прошла метрологическую
аттестацию в соответствии с требованиями государственных стандартов.
4.2 Условия выполнения анализа
Научно-исследовательская работа проведена при следующих условиях:
 Температура окружающего воздуха 20±5 °С
 Относительная влажность воздуха от 30 до 80%
 Атмосферное давление от 630 до 800 мм.рт.ст.
 Напряжение питающей сети 220±10 В.
4.3 Методика получения синтетического цеолита типа NaX
Для получения синтетического цеолита использовали золь-гель метод. Он
основан на переводе свежеосажденных соединений (обычно гидроксидов) в
коллоидное состояние. Для образования золей используют длительную пептизацию
осадков в воде, кислотах, растворах солей. Удаление воды из золей с переводом их в
гели, а затем в сыпучие порошки проводится сушкой или экстракцией воды
органическими растворителями с последующей прокалкой. Метод дает возможность
получать мелкодисперсные порошки соединений заданного состава.
Золь-гель метод - это один из перспективных методов получения особо чистых
цеолитов позволяющий синтезировать продукты, минуя стадию варки.
Методику получения синтетического цеолита типа NaX можно разделить на 2
стадии: 1- получение алюмината натрия, 2- получение синтетического цеолита типа
NaX.
Получение алюмината натрия (NaAlO2)
Получение алюмината натрия подчиняется схеме:
46
Al2O3 + 2NaOH = 2NaAlO2 + H2O
Процесс проводят при температуре 1000 °С в течении 5-7 часов.
Полученное соединение, после остывания, извлекают из тигля и измельчают.
Получение синтетического цеолита типа NaX
Готовят два раствора растворяя одинаковое количество метасиликата натрия
(Na2SiO2∙ 9Н2О) и алюмината натрия (NaAlO2) в бидистиллированной воде.
Силикатный и алюминатный растворы отдельно друг от друга смешивают с 2,5 мл
аминосодержащего соединения [61].
Алюмосиликатный гель готовят путем медленного смешивания одного
раствора с другим. Образовавшийся гель помещают в сушильный шкаф при
температуре 100 °С до образования устойчивого нерастворимого соединения. Для
установления качества получаемого материала нами через каждые 24 часа
отбирается проба синтезируемого материала и проверяется еѐ растворимость в воде.
4.4 Методика определения химико-аналитических свойств природного и
синтетического цеолитов по отношению к железу(III)
Измерение концентрации железа(III) в исследуемых объектах осуществлялось
спектрофотометрическим методом с использованием органического реагента салициловой кислотой, образующим с определяемым элементом комплекс розового
цвета. Определение проводилось с помощью КФК-2 при оптимальной длине волны
540 нм и значение рН=2,6-2,8.
4.4.1 Построение градуировочного графика
Для построения градуировочного графика готовят модельные растворы
объемом 25 мл содержанием Fe(III) 0; 25; 50; 100; 150; 200; 250; 300; 400 мкг.
Анализ образцов для градуировки проводят в порядке возрастания их концентрации,
каждый раствор фотометрируют 3 раза с целью исключения случайных результатов
и усреднения данных [65]. По полученным данным строят график в координатах:
оптическая плотность – концентрация Fe(III) в мкг/мл.
47
4.4.2 Определение оптимальных условий сорбции железа
Для описания сорбционных характеристик материала необходимо определить
его свойства в оптимальных условиях сорбции изучаемого элемента. К ним относят
pH оптимальное (pHопт.) показывающие наиболее благоприятную кислотность
среды для сорбции и время контакта сорбента с элементом при которой степень
сорбции максимальна.
Количественно процесс сорбции характеризует
Степень
извлечения
(R)
показывает,
какая
доля
степень извлечения.
абсолютного
количества
микроэлемента содержится в концентрате и часто выражается в процентах (1):
R
qk
100% (1),
qпр
где qк и qпр – абсолютные количества микроэлемента в концентрате и пробе
соответственно [66].
Соблюдение оптимальных условий сорбции позволяет значительно увеличить
степень
извлечения
элемента,
а,
следовательно,
повысить
эффективность
сорбционного материала.
Оптимальные параметры процесса извлечения железа из водных растворов
цеолитами устанавливали экспериментальным путем.
Влияние кислотности среды
Определение оптимального интервала кислотности среды при извлечении
элемента сорбентом является первым и обязательным этапом изучения сорбции.
Оптимальную
величину
рН
извлечения
элементов
определяли
экспериментально по графикам зависимости степени сорбции (R, %) от
концентрации ионов водорода в интервале рН 1,0 - 8,5.
Для этого в растворах, содержащих 300 мкг катиона металла и 0,1 г цеолита,
устанавливают различные значения pH. Смеси перемешивают на магнитных
мешалках 1,5 часа при t = 20±2ºС. Выбор оптимального времени сорбции проводили
позднее.
Далее
сорбент
отфильтровывают
через
фильтр
«белая
лента»,
устанавливают рН 2,6-2,8 и добавляют 1 мл раствора органического реагента -
48
салициловую кислоту. В растворах определяют содержание несорбированного
компонента фотометрическим методом [66].
По полученным данным строят кривую зависимости степени извлечения
элементов (R, %) от рН раствора, из которых определяют интервал значений рН с
максимальной степенью сорбции (рНопт).
Влияние времени на сорбцию железа(III)
Для изучения влияния времени на степень извлечения Fe(III) из водных
растворов устанавливают значение рНопт. Серии растворов перемешивают при
температуре 202оС, время измеряли в интервале от 1 до 90 минут. Далее сорбент
отфильтровывают через фильтр «белая лента», устанавливают значение рН = 2,6-2,8
и добавляют 1 мл раствора органического реагента - салициловую кислоту. В
растворах определяли содержание несорбированного компонента фотометрическим
методом. По полученным данным строят кривую зависимости степени сорбции (R,
%) от времени перемешивания (t, мин) и определяют оптимальное время,
необходимое для достижения максимальной сорбции элемента.
4.4.3 Определение сорбционной ѐмкости сорбента и
построение изотерм сорбции
Основные сведения о сорбционных свойствах материала и характере сорбции
на нем определяемых веществ могут быть получены из изотерм сорбции,
характеризующих зависимость сорбционных свойств (α) от концентрации (С)
сорбируемого компонента при постоянной температуре:
Изотермы
сорбции
железа(III)
изучены
в
α =f(С).
статическом
режиме
при
оптимальном значении рН. Для этого приготавливают серию растворов содержащих
от 300 до 1700 мкг металла (их объемы составляли 25 мл). Далее в растворы
добавляют ацетатную буферную смесь, устанавливая оптимальное значение рН,
вносили по 0,1 г цеолита, перемешивают на магнитных мешалках tопт., фильтруют на
бумажном фильтре «белая лента», остаточное количество компонента определяли
фотометрическим методом.
49
По полученным данным определяют равновесные концентрации ([С]) для
растворов после сорбции. Сорбцию (мг/г) оценивали через величины исходной
(Сисх), равновесной [С] концентраций железа и массы сорбента m.
A
Ссорб
m

(Cисх  [C ])  V
(2);
m
где Ссорб – количество сорбированного вещества (мг); V – объем раствора (см3); m –
масса элемента в аликвоте исходного раствора, мг.
По точке выхода кривой на плато находили массу элемента А∞, которая
является предельной по емкости для 1 г данного сорбента, то есть СЕС.
Определяли количество сорбированного элемента в каждом опыте, делая
пересчет на 1 г сорбента по формуле (3):
СЕС 
А
мг / г  (3);
М
где А – масса элемента в аликвоте исходного раствора, мг; M – масса сорбента в
эксперименте, г.
По полученным данным строят графическую зависимость в координатах:
степень извлечения - масса элемента, поглощенная 1 г сорбента.
Изотерма
сорбции
-
представленная
графически
зависимость концентрации вещества в неподвижной фазе от его концентрации в
подвижной при постоянной температуре.
4.5 Методика модифицирования природного и синтетического цеолитов
железом(III)
Для иммобилизации ионов железа (III) в массу носителей использовался
статический метод внедрения с перемешиванием. Готовят маточный раствор
содержащий 12000 мкг железа(III) и 40 мл ацетатного буфера с оптимальным
значением рН, при котором происходит максимально возможная сорбция
элемента на носитель. В получившийся раствор (общим объемом 100 мл)
вносят
1
г
установленного
цеолита
и
перемешивают
оптимального
времени.
в
течение
По
экспериментально
истечению
времени
50
отфильтровывают,
просушивают
при
температуре
20-25°С,
а
затем
прокаливают, для полного устранения жидкости.
4.6 Методика получения ИК-спектров
Сыпучие вещества предварительно прокаливались
не менее 2 часов. Для
снятия ИК-спектров исследуемого вещества использовали метод прессования
таблеток
с
KBr
[67].
Он
заключается
в
тщательном
перемешивании
тонкоизмельченной пробы (в количестве 1 мг) с порошком КВr в количестве (0,3г) с
последующим прессованием смеси в пресс-форме, в результате чего получается
прозрачная или полупрозрачная таблетка.
Обработка полученных ИК-спектров проводится с помощи программы FSpec
4.1.
При расшифровки спектров необходимо учитывать проявление в них
адсорбированной
воды
всегда
имеющейся
в
некотором
количестве
в
гигроскопичном КВr (1640 и 3450 см-1).
4.7 Методика тест-определения тетрациклина в водных растворах на основе
цветометрического метода
Изучение возможности тест определения проводили в нескольких вариантах: 1
- статическом (при перемешивании) с детектированием порошкообразного сорбента
и таблетированного - после прессования; и 2 -динамическом – при пропускании
водного раствора тц различной концентрации через колонку наполненную
модифицированным цеолитом.
Исходя из эксперимента, времени проведения методики и еѐ трудоемкости
оптимальным является динамический метод.
Для его осуществления через колонку d=0,4см заполненную 0,3 см цеолитом
пропускался раствор с тетрациклином со средней скоростью 0,00841мл/мин.
Растворы содержали 0, 10, 20, 40, 80, 200 и 400 мкг/проба тетрациклина
соответственно. После пропускания фиксируется изменение цвета верхнего слоя
цеолита
с
помощи
цифрового
фотодетектирующего
устройства
(ЦФУ)
–
51
фотоаппарата в специальной установки (рисунок 10)
которая включает в себя:
светонепроницаемую камеру (1) со встроенными источниками света в которой
размещается кюветодержатель с кюветой, содержащей анализируемый образец (2).
Перпендикулярно плоскости дна камеры устанавливается объектив цифрового
фотоаппарата (3) , сопряженный с персональным компьютером (4). Управление
цифровым фотоаппаратом и характеристиками фотосъемки осуществлялись
программными средствами.
Рис. 10. Схема экспериментальной установки:
1 – светонепроницаемая камера со встроенными источниками света (две лампы
накаливания), 2 – кювета с анализируемым раствором; 3 – устройство цифрового
детектирования (фотоаппарат); 4– персональный компьютер
Определение оптимальных параметров настроек фотоаппарата
Оптимальные
настройки
цифрового
фотодетектировающего
устройства
(фотоаппарата), при которых наблюдается максимальная чувствительность при
определении ТЦ по цветной реакции с химически модифицированным цеолитом,
определяли экспериментально. Для этого готовили серию растворов содержащих
различные количества ионов антибиотика, устанавливают оптимальное значение
кислотности среды, при которой наблюдается наиболее насыщенная визуально
наблюдаемая окраска комплекса ТЦ-Fe3+ и пропускали через колонку, наполненную
52
модифицированным цеолитом [68]. Далее колонку с анализируемым веществом
помещали в держатель и фотографировали.
Эксперимент проводили в светонепроницаемой камере, для устранения
артефактов, связанных с неоднородностью плотности светового потока. В качестве
осветительного элемента использовались: энергосберегающие лампы NCL–2U
накаливания мощностью 15W, световым потоком 800 и цветовой температурой
4200К.
В процессе эксперимента получен массив цифровых изображений,
элементами которого являются фотоснимки колонки с различным содержанием
антибиотика
в массе сорбента,
экспонирования,
величина
при различных условиях фотосъемки (время
светопропускания,
использование
различных
комбинаций осветительных приборов: лампа – вспышка, вспышка, лампа).
Анализ полученных цифровых изображений необходимо с помощью
программы Adobe Photoshop CS6. Определив интенсивность компонент цветности в
системе
RGB
,строят
концентрация металла».
зависимость
«интенсивность
компоненты
цвета
–
53
Глава 5. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
5.1 Получение синтетического цеолита типа NaX
В таблице 10 представлен ход выполнения работы.
Таблица 10. Основные технологические этапы синтеза
1
Получение алюмината натрия (NaAlO2) сплавлением оксида алюминия
(Al2O3) cо щелочью в течении 5-7 часов при температуре 1000 °С
2
 Перевод полученного алюмината натрия (NaAlO2) в раствор. С
добавлением хлорид метиламмония.
 Приготовление раствора метасиликата натрия (Na2SiO2 ∙ 9Н2О) с
хлорид метиламмония.
 Медленное сливание двух растворов при перемешивании.
 Оставление раствора не время для получения геля.
3
Сушка полученного геля в течение 7 суток при температуре порядка 90-100
°С.
Для установления качества получаемого материала нами через каждые 24 часа
отбиралась проба синтезируемого материала и проверялась еѐ растворимость в воде.
Обнаружено что уже после 5 суток сушки материал не растворялся в воде, что
говорит об окончании процесса кристаллизации цеолита.
5.2 Сорбции железа(III) природным и синтетическим цеолитами
5.2.1 Градуировочный график для спектрофотометрического определения
железа(III) в водных растворах
Для построения градуировочного графика готовили образцы для градуировки
определяемого компонента из рабочего раствора Fe(III) с содержанием метала от 0
до 400 мкг. Анализ образцов для градуировки проводили в порядке возрастания их
концентрации, каждый раствор фотометрировали 3 раза с целью исключения
случайных результатов и усреднения данных. Строили график в координатах:
оптическая плотность – концентрация Fe(III) в мкг/мл (рисунок 11).
54
А, о.е
0,30
0,25
y = 0,0005x
0,20
R2 = 0,9328
0,15
0,10
0,05
С, мкг/проба
0,00
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Рис. 11. Градуировочный график спектрофотометрического определения Fe(III) с
органическим реагентом салициловая кислота
5.2.2 Определения оптимальных условий сорбции железа(III)
Влияние кислотности среды
В результате эксперимента установили оптимальную pH сорбции Fe(III)
природным и синтетическим цеолитом рисунки 12 и 13.
R, %
100
80
60
pH
40
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
Рис. 12. Оптимальное pH сорбции железа (III) природным цеолитом
55
R, %
100
80
60
рН
40
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
Рис. 13 Оптимальное pH сорбции железа (III) синтетическим цеолитом типа
NaХ
Как видно из рисунков 11 и 12 оптимальное pH сорбции природным и
синтетическим цеолитом равно 4,5-6,5, однако, в случае синтетического цеолита
извлечение при низких значениях pH примерно в 2 раза выше чем при извлечении
природным цеолитом, рНопт находится в интервале ≈ 4,7- 5,5. При рН 6,5
наблюдается гидролиз железа(III) (pKa,r (Fe3+) = 2,2).
Влияние времени
В результате эксперимента установили оптимальное время сорбции Fe(III)
природным и синтетическим цеолитом рисунки. 14 и 15. Как видно из рисунков
степень извлечения железа(III) из водных растворов привышент 95% на первой
минуте сорбции.
Незначительное время необходимое для количественной сорбции железа,
позволяет достаточно быстро проводить очистку объектов, использовать цеолит как
природного так и синтетического происхождения не только в статическом, но и
динамическом варианте сорбции.
56
R, %
100
80
60
40
20
t, мин
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Рис. 14. Оптимальное время сорбции Fe(III) природным цеолитом
R, %
100
80
60
40
20
t, мин
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Рис. 15. Оптимальное время сорбции Fe(III) синтетическим цеолитом
57
5.2.3 Изотермы сорбции и сорбционная ѐмкость
Для характеристики сорбции Fe (III) построены изотермы сорбции в
координатах α=f(с) (где с – равновесная концентрация элемента в растворе, мкг/мл;
а – содержание иона в фазе сорбента, мг/г) (рисунки 16 и 17).
Сорбционная
емкость
цеолита
по
железу
в
оптимальных
условиях
кислотности среды составляет CEC как для природного цеолита, так и для
синтетического приблизительно равны 6,1 мг/г сорбента.
А, мг/г
4,0
3,0
2,0
1,0
С, мкг/мл
0,0
0
2
4
6
8
10
12
14
Рис. 16. Изотерма сорбции железа(III) природным цеолитом
16
58
А, мг/г
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
С, мкг/мл
0,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Рис. 17. Изотерма сорбции Fe(III) синтетическим цеолитом
5.3 Модифицирование синтетического и природного цеолитов железом(III)
В результате
проведенной иммобилизации получились два вещества
представленные на рисунках 18 и 19.
Рис. 18. Природный цеолит с
Рис. 19. Синтетический цеолит с
иммобилизованным железом
иммобилизованным железом
59
Очевидным является использование в дальнейшем анализе
синтетический
цеолит, так как он обладает преимуществом - светлым цветом. Из-за более темной
окраски
фиксация
чувствительность
цвета
природного
визуального
или
цеолита
затруднена,
цветометрического
тест
что
снижает
определения
обнаружение тетрациклина на поверхности сорбента.
5.4 ИК-спектроскопия поверхности иммобилизованных материалов
Полосы поглощения основных колебаний тетраэдров [(Al, Si)O4]-каркаса
находятся в средней области ИК-спектра. Наиболее интенсивные полосы
поглощения в области частот 950-1250 и 450-550 см-1 отнесены к колебаниям внутри
тетраэдров. Сильная полоса поглощения при 1075,
1140 см-1 соответствуют
симметричным валентным колебаниям ν(Si, Al-О). Следующая по интенсивности
полоса поглощения при 450-550 см-1 отнесена к деформационным колебаниям δ(Si,
Al-О4). Валентным колебаниям, в которых участвуют в основном алюмо- и/или
кремнекислородные тетраэдры, отвечают полосы поглощения в области 650-820 см1
.
В спектре синтетического цеолита типа NaX в области 2300 см-1 относятся к
колебаниям Al-O, что говорит о его сродстве с алюмосиликатами. Уменьшение
интенсивности полосы в области 568, 610 и 758 см-1 в спектре синтетического
цеолита говорит о преобладании кремния в структуре (рисунок 20).
60
Рис. 20 ИК-спектр поверхности синтетического (1) и природного (2) цеолитов
При иммобилизации Fe в структуру синтетического цеолита можно наблюдать
и изменения в его ИК-спектре (рисунок 21).
Рис. 21. ИК-спектр поверхности синтетического цеолита (1) и его
модифицированной аналог (2)
Смещение полосы поглощения в области 1000-1100 см-1 говорит об
изменении катиона (в частности железа(III)) в структуре синтетического каркаса.
61
5.5 Количественная цветометрия для определения тетрациклина в водных
растворах
Железо(III) в реакции с тетрациклином образует комплексное соединение
красного цвета:
Fe3+
С малыми концентрациями железа комплекс не образуется, что ограничивает
возможность качественного определения тетрациклина в объеме раствора с низкой
концентрацией аналита. Проведение реакции взаимодействия тетрациклином на
поверхности
матрицы-носителя
железа(III)
существенно
повышает
чувствительность реакции за счет эффекта концентрирования.
Изучение возможности тест определения проводили в нескольких вариантах:
1- статическом (при перемешивании) с детектированием порошкообразного
сорбента и таблетированного - после прессования; и 2-динамическом – при
пропускании водного раствора ТЦ различной концентрации через колонку,
наполненную модифицированным цеолитом. Исходя из эксперимента, времени
проведения методики и еѐ трудоемкости оптимальным является динамический
метод (рисунки 22 и 23).
62
Рис. 22. Изменение цвета тест-системы
Рис. 23. Изменение цвета тест-
в зависимости от содержания
системы в зависимости от содержания
тетрациклина в пробе при
тетрациклина в пробе при статическом
динамическом методе пропускания
методе пропускания
Для
данного
цветного
теста
на
приведены
зависимости
изменения
интегрального значения цветности IR, IG, IB от концентрации тетрациклина в
растворах, где Ii – интенсивность компонент цветности R, G, B в цветовой модели
RGB. Зависимости носят линейный характер и можно выделить диапазоны
концентрации металла в растворе, пригодные для построения градуировочных
зависимостей (рисунки 24, 25).
63
I, RGB о.е
260
220
180
140
100
60
С мкг/проба
20
0
100
200
300
400
Рис. 24. Зависимость интегрального значения цветности компоненты Ii в системе
RGB от концентрации тетрациклина в растворе при цветометрическом
детектировании с выдержкой фотоаппарата 1/10сек
I, RGB о.е
160
140
120
100
80
60
40
20
С мкг/проба
0
0
100
200
300
400
Рис. 25. Зависимость интегрального значения цветности компоненты Ii в системе
RGB от концентрации тетрациклина в растворе при цветометрическом
детектировании с выдержкой фотоаппарата 1/30сек
Выбор оптимальных условий фотосъемки объясним высоким значением ΔI,
как показателя крутизны градировочной зависимости равной разнице максимальной
64
и минимальной интенсивности зеленый компоненты цветности раствора (таблица
11).
Таблица 11. Градуировочные зависимости для I i в системе RGB от
концентрации тетрациклина.
(рН 3,12; объем раствора 10 мл, [ ТЦ]=10 – 400 мкг/проба; n=3, P=0,95;
колонка d=0.4 см; свет, чувствительность 1600, диафрагма 36)
Условия
Диапазон
определения
С, мкг/мл
0-40
выдержка 1-10
40-400
0-40
выдержка 1-30
40-400
0-40
выдержка 1-60
40-400
выдержка 1-80
0-40
ΔI**,
Градуировочное уравнение
R2 *
I R =-0,8397∙C т ц +217,79
0,87
34,94
I G =-1,3465∙C т ц +186,18
0,97
53,91
I B =-0,8187∙C т ц +73,656
0,79
30,92
I R =-0,1202∙C т ц +187,29
0,83
43,26
I G =-0,078∙C т ц +131,71
0,68
24,15
I B =0,0054∙C т ц +38,797
0,07
5,13
I R =-0,1245∙C т ц +153,47
0,94
47,95
I G =-1,2989∙C т ц +122,92
0,96
53,63
I B =-0,6223∙C т ц +32,064
0,87
24,84
I R =-0,0922∙C т ц +118,33
0,95
31,59
I G =-0,0596∙C т ц +72,655
0,59
16,00
I B =0,0127∙C т ц +6,2623
0,48
6,70
I R =-1,133∙C т ц +113,09
0,88
49,24
I G =-1,1793∙C т ц +87,003
0,97
49,73
I B =-0,2508∙C т ц +11,449
0,99
10,28
I R =-0,0796∙C т ц +75,159
0,79
25,02
I G =-0,0484∙C т ц +43,907
0,72
13,53
I B =0,0021∙C т ц +2,2774
0,13
1,06
I R =-1,0056∙C т ц +99,575
0,88
43,89
I G =-1,0413∙C т ц +74,967
0,96
43,94
I B =-0,0201∙C т ц +2,9757
0,02
0,39
о.е.
65
40-400
0-40
I R =-0,0655∙C т ц +64,575
0,73
20,83
I G =-0,0356∙C т ц +36,019
0,58
9,13
I B =0,0017∙C т ц +1,9437
0,095
0,77
I R =-0,7766∙C т ц +63,59
0,89
33,90
I G =-0,638∙C т ц +43,185
0,96
27,02
0,34
I R =-0,0303∙C т ц +35,968
0,59
0,76
I G =-0,0165∙C т ц +18,713
0,64
4,58
I B =0,0046∙C т ц +1,3561
1,48
I R =-0,6085∙C т ц +52,511
0,49
0,83
I G =-0,5107∙C т ц +34,442
0,97
21,51
I B =0,0023∙C т ц +1,318
0,88
0,10
I R =-0,0282∙C т ц +30,969
0,83
9,90
I G =-0,013∙C т ц +14,995
0,76
3,85
I B =0,0045∙C т ц +1,6016
0,40
1,46
I B =-0,011∙C т ц +1,692
выдержка 1-160
40-400
0-40
выдержка 1-200
40-400
9,37
26,80
2
*R – степень аппроксимации
**ΔI –разница между максимальным и минимальным значеничем
показателя цветности.
Как видно из таблицы 11, самой не приемлемой для груданировочной
зависимости является зависимость интенсивности компонент цветности R, G, B в
цветовой модели RGB при включенных источниках света и большой выдержкой
экспонирования 1/160 сек. и 1/200 сек. из-за высокого значения ΔI (рисунки 26 и
27).
66
I, RGB о.е
80
60
40
20
0
0
100
200
С, мкг/проба
300
400
Рис. 26. Зависимость интегрального значения цветности компоненты Ii в системе
RGB от концентрации тетрациклина в растворе при цветометрическом
детектировании с выдержкой фотоаппарата 1/160сек
Предлагаемый
экспрессный,
избирательный
комбинированный
метод
определения тетрациклина включающий в себя предварительное концентрирование
железа на носитель, позволяет выделять и определять на уровне 10 мкг
тетрациклина из сложных по составу продуктов животного и растительного
происхождения и технически-бытовых вод. Стоит отметить, что при дальнейшем
усовершенствовании метода и методики возможно создание портативной тестсистемы в виде простых в использовании тест-полос, или тест-порошков, что
позволит совершать анализ объекта далеко от лаборатории, а это представляется
достаточно привлекательным.
67
I, RGB о.е
60
40
20
0
0
100
200
С, мкг/проба
300
400
Рис. 27. Зависимость интегрального значения цветности компоненты Ii в системе
RGB от концентрации тетрациклина в растворе при цветометрическом
детектировании с выдержкой фотоаппарата 1/200сек
68
Глава 6. АПРОБАЦИЯ МЕТОДИКИ НА РЕАЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ
6.1 Методика определения тетрациклина в молоке и молочных продуктах
Первая стадия определения тетрациклина и доксициклина в молоке и
молочных продуктах включает пробоподготовку - удаление из пробы белков и
молочного жира. Для этого в 100-250 мл анализируемого продукта вносят 2-3 мл
концентрированной уксусной кислоты и термостатируют при 40-45С в течение 5-10
мин. Не рекомендуется вести процесс при температуре выше 55-60С, т.к. это может
вызвать частичную деструкцию тетрациклина. Далее пробу перемешивают и
центрифугируют 5-7 мин при 3000-5000 об/мин. Центрифугат переносят в колбу,
доводят кислотность среды до pH ~2,5 5М азотной кислотой и добавляют 25 мл
ацетатного буфера (рН=2,50).
Вторая стадия: сорбция антибиотика. Полученный центрифугат пропускают
через
сорбционный
патрон,
наполненный
синтетическим
алюмосиликатом
химически модифицированным железом(III) со скоростью ~2.0 мл/минуту.
Третья
стадия:
цветометрическое
или
тест-определение
аналитов.
Поверхность материала в сорбционном патроне анализируют сразу после
пропускания пробы:
а) визуально полуколичественно, сравнивая с заранее построенной тестшкалой;
б) цветометрически путем обработки сигнала ЦФУ.
6.2 Количественная цветометрия для определения тетрациклина в молоке и
молочных продуктах
В таблице 12 приведены результаты определения антибиотика в модельном
растворе – образце молока не содержащего аналиты.
Анализ метрологических характеристик способа определения тетрациклина и
доксициклина в молоке и молочных продуктах показывает достаточно высокую
чувствительность.
Предел
определения
тетрациклина
предлагаемой методике составляет 4 мкг/проба.
и
доксициклина
по
69
Таблица 12. Результаты определения тетрациклина и доксициклина в молоке
(Vпробы=100 мл, n=5, P=0,95)
Введено
антибиотика, мкг/мл
Результаты визуального
детектирования в пробе
(присутствие/отсутствие)
Найдено после
цветометрического
детектирования,
sr
мкг/мл
0,000
отсутствует
-
-
0,040
присутствует/отсутствует
0,055±0,013
0,19
0,080
присутствует
0,082±0,012
0,13
0,160
присутствует
0,176±0,019
0,09
0,480
присутствует
0,468±0,039
0,07
Способ отличается экспрессностью, простотой исполнения и экономичностью,
не требует применения дорогостоящего оборудования. Он может быть использован
в практике лабораторий, осуществляющих химический анализ пищевых продуктов.
70
Выводы к экспериментальной части
В работе получен синтетический цеолит типа NaX золь-гель методом и
изучены его сорбционные свойства по отношению к железу(III). Систематически
изучена сорбция железа(III). Установлено, что синтетический материал не уступает
природному материалу в сорбционных свойствах. Оптимальное время сорбции
железа составило 5 минут, рНопт находиться в интервале от 4,7 до 6,3. Определена
сорбционная емкость природного и синтетического цеолита по железу ~ CECFe
= 6,1 мг/г сорбента. На основе полученных данных разработана тест-система для
определения тетрациклина в продуктах питания животного и растительного
происхождения, основанная на образовании окрашенного комплекного соединения
между
антибиотиком
и
иммобилизованным
в
массе
сорбента,
железом.
Детектирование изменения цвета при динамическом пропускании тетрациклина
через
колонку
осуществлялось
цветометрическим
методом.
Получены
градуировочные зависимости интенсивности цвета (I) красной, зеленой и синей
компоненты от концентрации тетрациклина в водном растворе, по которым можно
определить количественное содержание тетрациклина в исследуемом объекте.
Правильность разработанной методики цветометрического или тест-определения
антибиотиков тетрациклинового ряда после предварительного сорбционного
концентрирования проверена методом «введено-найдено» на образцах молока и
молочных продуктов.
71
ВЫВОДЫ:
1. Проведен литературный обзор применения и путей поступления антибиотиков и в
частности тетрациклина в организм человека, методах и методиках контроля их
содержания.
2. Обобщены и систематизированы литературные данные о цветометрических тестметодах определения антибиотиков, их достоинствах и недостатках.
3. Определены оптимальные условия синтеза новых функциональных материалов на
основе природного и синтетического цеолита, химически модифицированного
железом(III), показана их перспективность при создании тест-систем для
определения тетрациклина.
4. Экспериментально изучены возможности использования параметров цветности
цифрового изображения, как количественного аналитического сигнала для
разработки цветометрических методик определения концентрации тетрациклина в
реальных объектах.
72
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ:
1.
Антибиотики // Центр здорового питания (официальный сайт) [Электронный
ресурс]. – 2013. – Режим доступа: http://eat-info.ru/references/pollutants/antibiotiki/. –
Дата доступа: 06.05.2013.
2. Александров, А.А. Тетрациклины: общие сведения: [Электронный ресурс]. –
1990-2011. – Режим доступа: http://humbio.ru/humbio/drugs/0001e9a7.htm. – Дата
доступа: 17.09.2010
3. Тетрациклины
//
[Электронный
Большой
ресурс].
справочник
–
здоровья
2009-2013.
–
(официальный
Режим
сайт)
доступа:
http://spravzdrav.ru/spravochnik-boleznej/pharmacology/t/tetracikliny/. – Дата доступа:
06.02.2011.
4. Тетрациклин // Здоровье info (официальный сайт) [Электронный ресурс]. – 2010.
– Режим доступа:
http://www.zdorovieinfo.ru/spravochnik-lekarstv/Tetracycline/. –
Дата доступа: 20.010.2010.
5. ГОСТ 3622-68 Молоко и молочные продукты отбор проб и подготовка их к
испытанию. Межгосударственный стандарт. Использование и издание официальное.
– М.: Стардантин-форм, 2009. – 10с.
6. Мурох, В.И. Загрязненность пищевых продуктов антибиотиками / В.И. Мурох,
В.К. Криничная; под общей ред. Д.Б. Меламед. – Мн.: БелНИИНТИ, 1991. – 40 с.
7. Брек, Д. Цеолитные молекулярные сита / Д. Брек.  Москва: Мир, 1996.  781с.
8. Цицишвили, Г.В Природные цеолиты / Т.Г.Андроникашвили, Г.Н. Киров, Л. Д.
Филиппова. – М.: Химия, 1985. – 224 с.
9.
Онищенко,
Г.Г.
Определение
остаточных
количеств
левомицетина
(хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии и иммуноферментного анализа:
[Электронный ресурс]. – http://bestpravo.ru/rossijskoje/hw-zakony/n3o.htm. – Дата
доступа: 1.05.2004.
10. Контроль за остаточным содержанием антибиотиков в продуктах питания //
БИОФАЙЛ научный информационный журнал (официальный сайт) [Электронный
73
ресурс]. – 2010. – Режим доступа: http://biofile.ru/bio/17884.html. – Дата доступа:
10.012.2012.
11. ГОСТ Р 53601-2009. Метод определения остаточного содержания антибиотиков
тетрациклиновой
группы
с
помощью
высокоэффективной
жидкостной
хроматографии с масс-спектрометрическим детектором. Национальный стандарт
Российской федерации. Издание официальное. – М.: Стардантинформ, 2010. – 15с.
12. Бельтюкова, С.В., Ливенцова, Е.О. Методы определения антибиотиков в
пищевых продуктах: обзор. / Научные труды Одесской национальной академии
пищевых технологий / С.В. Бельтюкова, Е.О. Ливенцова, – Од.: 2012. – 13с.
13.
Harikkhan, R., Moats, W.A. Identification and measure ement of beta - lactams
antibiotic residues in milk. Integration of screening kits liquid – chromatography / R.
Harikkhan, – J. AOAC.: Int. [J. Assoc. Offic. Anal. Chem.], 1995, – 986с.
14. Kawata, S. Liquid-chromatographic determination of oxytetracycline in swine tissues
/ K. Sato, Y. Nishikawa, K. Iwama. – J. AOAC Int. [J. Assoc. Offic. Anal. Chem.], 1996
– 1465с.
15. Croubels, S., Sensitive spectrofluorimetric determination of tetracycline residues in
bovine milk. / W. Baeyen, C. Van – Peteghem. – Analist, – 1994. – 119с.
16. McCracken, R.J. Simultaneous determination of oxytetracycline, tetracycline and
chlortetracycline in
animal tissues using liquid chromatography, post column
derivatization with aluminium, and fluorescence detection / W.J. Blanchflower, S.A.
Haggan D.G. Kennedy. – Analyst, – 1995, – 120с.
17. Savage, A.L.
A novel
screening method for tetracycline in milk combining
sensitized – Eu (III) fluorescence and immunoaffinity techniques / H.S. Siti, Y. A. Baird.
– Acta.: Anal.Chim., 1998 – 375 с.
18. Cooper, A.D. Improved method for the on-line chelate affinity chromatog-raphy –
high-performance liquid chromatographic determination of tetracycline antibiotics in
animal products / G.W.E. Stubbings, M. Kelly, J.A. Tarbin, W.H.H. Farrington. – J.
Chromatogr. A, 1998. – 812 с.
74
19. Wrightson,
W.R.
Analysis
of
minocycline
by
high-performance
liquid
chromatography in tissue and serum / S.R. Myers, S. J. Galandiuk. – J. Chromatogr.
B.,1998. – 706 с.
20. Moats, W.A., HPLC de-termination of tetracycline antibiotics in milk / R. HarikKhan, J. Rapid. – Agric. Food.: Chem., 1995. – 43 с.
21. Rogstad, A. Optimization of solid phase extraction of oxytetracycline from fish tissue
and its determination by HPLC / V. Hormazadal, M. Yndestad. – J. Liquid Chromatogr,
1988. – 234 с.
22. Hernandez-Arteseros, J.A. Determination of ciprofloxacin and enrofloxacin in edible
animal tissues by terbium-sensitized lumi-nescence / R. Compano, M.D. Prat. – Analyst,
1998. – 123 с.
23. Rodriguez–Diaz, C., Fernandez-Romero M., Aguilar–Caballos P., Gomez-Hens A.
Chromat o-graphic determination of flumeguine in food samplis by post Colum
derivatisation with terbium (III) / Anal.Chim. Acta. 2006. 226.
24. Витюкова, Е.О. Определение окситетрациклина в молоке с использованием
сенсибилизированной
люминесценции
ионов
Eu
(III)
/
А.В.Егорова,
С.В.Бельтюкова, Е.В. Малинка // Весник Од. ун-ту., 2004. 105 с.
25. Wang, M. Ethyl substituted fluorimetric method for the determination of trace
amounts of oxytetracycline in rine, sernm, feed of chook and milk / F.Hou, C.Jiang. – J.
Luminescence, 2005. – 113с.
26. Chena, G. Europium-sensitized luminescence determination of oxytetracycline in
catfish muscle / M.J.Schneider, A.M.Darwish, S.J.Lehotay, D.W. Freeman. –Talanta,
2004. – 257с.
27. Traviesa-Alvares, Y.V. Direct screening of tetracyclines in water and bovine milk
using room temperature phosphorescence detection / J.M.Costa-Fernandez, R. Pereiro, A.
Sanz-Medel. – Acta.: Anal. Chim., 2007. – 589с.
28. Смирнова, Т.Д. Флуори-метрическое определение флумеквина с помощью
сенсибилизированной флуоресценции тербия в организованных средах /
Штыков,
С.Н.
Н.В. Неврюева, Д.А.Жемеричкин, И.И. Паращенко.- Химико-фарм.
журнал. 2010. – 52с.
75
29. Aguilar-Caballos, M.P. Determination of lasalocid with sensitized terbium (III)
luminescence detection / A.Gomez-Hends, D. Perez-Bendito. – Talanta, 1999. –217с.
30. Feng, P. Determination of chlortetracycline in body fluids with the complex cation of
chlortetracycline-europium(III)-trioctylphosphine oxide by total
internal
reflected
fluorescence at a wate / Y.F.Li, C.Z. Huang. – Acta.: Analyt. Chi, 2001. – 95с.
31. Schneider, M.J. Time-resolved luminescence screening assay for tetracyclines in
chicken muscle / G. Chen. – Anal. Lett, 2004. – 37с.
32. Бельтюкова, С.В. Определение норфлоксацина в мясных и рыбных продуктах
методом тонкослойной хроматографии / Е.В.Малинка, В.Д. Бойченко, О.И.Теслюк,
Е.О.Ливенцова.- М.: Журн. хроматограф. Товарищества, 2005. – 19с.
33. Бельтюкова С.В. Определение ципрофлоксацина в молоке с помощью
люминесцентной спектроскопии в тонком слое / С.В. Бельтюкова, Е.В. Малинка,
Е.О. Ливенцова. – Од.: Труды Одес. политех. Универ., 2008. –30с.
34. Gala, B. A. Simultaneous determination of ampicilin and tetracycline in milk by using
a stopped-flow / B. A. Gala, D. Perez – Bendito.- Talanta: T – fonuat spectrofiuorimeter,
1997. – 44с.
35. Полуэктов,
Н.С.
Спектрофотометрические
и
люминесцентные
методы
определения лантанидов / Н.С. Полуэктов, Л.И.Кононенко, Н.П. Ефрюшина, С.В.
Бельтюкова. – Киев: Наукова Думка, 1989. – 254с.
36. Бельтюкова, С.В. Использование f-люминесценции ионов Eu (III) и Tb(III) в
анализе лекарственных препаратов / С.В.Бельтюкова, А.В.Егорова, О.И. Теслюк. –
Киев: Укр. хим. журн., 2000. – 121с.
37. Kaczmarek, M. Europi-um-sensitized chemiluminescence of system tetracycline–
H2O2–Fe(II)/(III) and its application to the determination of tetracycline. / M. Kaczmarek,
A. Idzikowska, S. Lis. – J.: Fluorescence, 2008. 18с.
38. Haagsma, N. A rapid fluorimetric screening method for chlortetracycline,
oxytetracycline and tetracycline in pig meat and kidney tissues / N. Haagsma, M.J.B.
Mengelers. – Z.: Ledensm Unters Forsch, 1989. – 189с.
76
39. Толстенко, Ю.В. Пряме потенціометричне визначення окситетрациклину
гидрохлориду в молочних продуктах // Весник. Чернивецького нац. у–ту. Серия:
Химия. Выпуск 128 . – Чернигов, 2008. – 401с.
40. Толстенко,
Ю.В.
Аналитичний
мониторинг
вмисту
окситетрациклину
гидрохлориду в продуктах електрохимичними методами / Т.М. Деркач, В.І. Ткач. –
Киев: КНУ, 2008. – 201с.
41. Толстенко, Ю.В. Визначення вмисту окситетрациклина гидрохлориду в
молочних продуктах електрохимичними методами / Ю.В. Толстенко,
Т.Д.
Смирнова, В.І. Ткач // Вопросы химии и хим. Технологии. – Киев: КНУ 2010. – 87с.
42. Kokot, S. Simultaneous voltammetric analysis of tetracycline antibiotics in foods //
Food Chemistry / Y. Ni, S. Li, S. Kokot. – Pekin: 2011.- 124с.
43. Capitan – Vallvey, R.F. Singleuse phosphorimetric sensor for the de-termination of
nalidixic acid in human urine and milk / R.F.Capitan – Vallvey, M.A.Al-Barbarawi
Osama, M.D. Fernandes-Ramos, R. Avidad, G. V. Ramirez. – Analis,. 2000. – 125с.
44. Алыков,
Н.М.
Экстракционно-флуориметрическое
определение
аминогликозидных антибиотиков / Журн. аналит. хим. Выпуск 36(7). –М.: МГУ,
1981. –1389 с.
45. Карычев, Р. Современные методики определения антибиотиков в молоке /
Р.Карычев // ООО «Хр.Хенсен» (официальный сайт) [Электронный ресурс].- 2008. –
Режим
доступа:
http://www.chr-
hansen.com/uploads/tx_tcdownloadablessecure/Testy_na_opredelenie_antibiotikov_v_mo
loke_Chr.Hansen.pdf. – Дата доступа 06.03.2009
46. Определение тетрациклина в молоке и в меде. Тест-система RIDASCREEN®
Tetracyclin // ОДО «КомПродСервис» (официальный сайт) [Электронный ресурс]. –
–
2014.
Режим
доступа:
http://www.komprod.com/ru/products/pr2/antibacterial/144/149/.
–
Дата
доступа
10.01.2015
47. Инструкция использования теста «СНАП Тетрациклин» // ООО «ЗИП-И»
(официальный
сайт)
[Электронный
ресурс].
–
2010.
–
Режим
доступа:
77
http://www.zip-i.ru/modules/spaw2/uploads/files/instr/SNAP_Tetraziklin.pdf.
–Дата
доступа: 26.06.2008
48. Золотов, Ю.А. Химические тест-методы анализа / Ю.А Золотов, В. М. Иванов,
В.Г. Амелин. – М.: Едиториал УРСС, 2002. – 302с.
49. Бишоп, Э. Индикаторы: в 2т./ Э. Бишоп. – М.: Мир, 1996. – 2т.
50. Моросанова, Е.И. Средства для внелабораторного санитарно-гигиенического,
агрохимического, технологического и экологического контроля / Е.И. Моросанова,
А.А Великородный, О.В. Мышляков // Журнал аналитической химии. –2006. – 56. –
320с.
51. Гольдт, А.Е. Химия привитых поверхностных соединений / А.Е. Гольдт, под
редакцией Г.В. Лисичкина. – М.: Физматлит, 2009. – 592с.
52. Методы физической иммобилизации : [Электронный ресурс]. – Режим доступа :
http://studopedia.org/8-40486.html. – Дата доступа: 24.01.2015
53. Ильинский, П.С.
Цеолит, химические свойства, применение, направленный
синтез / П.С. Ильинский // "KIS-PIS Group" (официальный сайт) [Электронный
ресурс]. – 2012. – Режим доступа:
http://kispis.ru/produkzia3.html. – Дата доступа
14.03.2012
54. Кусов, А.А.
Кипящие камни / А.А. Кусов // Соросовский образовательный
журнал. – 1998.- №7. – 7с.
55. Рабо, Дж. Химия цеолитов и катализ на цеолитах / Дж.Рабо. – М.: Мир, 2000. –
1т. – 502с.
56. ГОСТ 8269.0-97 Щебень и гравий из плотных горных пород и отходов
промышленного
производства
для
строительных
работ.
Методы
физико-
механических испытаний. Межгосударственный стандарт. М.: Госстрой России,
ГУП ЦПП, 1998. – 22с.
57. Грибанов, Е.Н. Элементный состав цеолита Хотынецкого месторождения по
данным энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии / Е.Н. Грибанов, под
общей редакцией Оскотской Э.Р. // «Ученые записки Орловского государственного
университета». Серия: Естественные, технические и медицинские науки, 2012. –
№6 (50). – 90с.
78
58. Брек, Д. Цеолитные молекулярные сита / Д.Брек. – М.: Мир. 1999. – 781с.
59. Кусов, А.А.
Цеолиты - кипящие камни / А.А. Кусов // Соросовский
образовательный журнал  1998.  №7.  С 70-76.
60. Цеолиты // ОАО «Газпром нефтехим Салават»
(официальный сайт)
[Электронный
Режим
ресурс].
–
2009.
–
доступа:
http://skatz.ru/uploads/static/6/zeolites.pdf. – Дата доступа: 18.02.2010.
61. Казанцева, Л.К. Способы получения цеолитов типа NaА или NaХ / К.Л.
Казанцева // Патент №2452688. Патентообладатель(и): Учреждение Российской
академии наук Институт геологии и минералогии им. В.С.Соболева Сибирского
отделения РАН. – Институт геологии и минералогии СО РАН, ИГМ СО РАН, 2012.
– 9с.
62. Виды и структура // Компания КНТ Групп (официальный сайт) [Электронный
ресурс].
–
2007.
–
Режим
доступа:
http://www.kntgroup.ru/ru/information/types_and_structure. – Дата доступа: 14.05.2007.
63. Паничев, А.М. Природные минералы и причинная медицина будущего / А.М.
Паничев, А.Н. Гульков. – Владивосток: ДВГТУ, 2001. – 210с.
64. Мирский, Я.В. Адсорбенты, их получение свойства, и применение / Я. В.
Мирский, В.В. Пирожков. – С-П.: Наука, 2001. – 26с.
65. Музгин, В.И. Аналитическая химия ванадия / В.И. Музгин, Л.Б. Хамазина, В.Л.
Золотавин, И.Я. Безруков.  М.: Наука 1991. 217 с.
66. Золотов, Ю.А. Основы аналитической химии: учебник для вузов: в 2 кн. / Ю.А
Золотов, Е.Н. Дорохова.  М.: Высшая школа, 2004. 413 с.  1 кн.  Общие
вопросы. Методы разделения.
67. Тарасевич, Б.Н. Основы ИК спектроскопии с преобразованием Фурье.
Подготовка проб в ИК спектроскопии / Б.Н.Тарасевич // Пособие к спецпрактикуму
по физико-химическим методам.  М.: МГУ,2012.  С.17-22.
68. Бабичева, О.В. Определение биологически активных веществ и контроль
качества продукции методами основанными на цифровом видеосигнале: авториф.
дис. На соискание ученой степени к.х.н.: 02.00.05 Бабичева Ольга Валентиновна. 
Воронеж, 2009.  18с.
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа