close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Махортова Наталья Викторовна. Разработка инновационной технологии получения белково-витаминно-минерального концентрата на основе цианобактерии Arthrospira Platensis

код для вставки
2
3
4
АННОТАЦИЯ
Выпускная
инновационной
квалификационная
технологии
работа
получения
на
тему
«Разработка
белково-витаминно-минерального
концентрата на основе цианобактерии Arthrospira Platensis».
Год защиты: 2018.
Направление подготовки: 19.03.01 Биотехнология.
Направленность (профиль): Промышленная биотехнология.
Студент группы: 41-ПБ Махортова Н.В.
Руководитель: к.т.н., доцент кафедры «Промышленная химия и
биотехнология» Фроленков К.Ю.
Ключевые слова: штамм цианобактерии Spirulina (Arthrospira) Platensis,
культивирование, фотобиореактор, фитоинкубатор, эффективность белка,
фикоцианин,
липиды,
жирнокислотный
состав,
витамины,
минералы,
спектральный состав излучения, питательная среда, культуральная жидкость.
Выпускная
квалификационная
работа
состоит
из
введения,
аналитического обзора литературы, раздела объектов и методов исследования,
экспериментальной части, выводов и рекомендаций, списка использованных
источников. Общий объем работы составляет 81 страницу. Работа содержит
17 рисунков, 20 таблиц и 1 приложение. Список использованных источников
включает 27 наименований.
Данная выпускная квалификационная работа прошла проверку в системе
«Антиплагиат. ВУЗ». Справка прилагается (Приложение 1).
5
Оглавление
ГЛАВА 1. ОБЗОР И АНАДИЗ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ ..................... 12
1.1История открытия сине-зеленой микроводоросли человкспирулины (Spirulina кислоты
Platensis)………………………………………............................................................12
1.2 Строение клетки platensiи жизненный каротинцикл цианобактерии Arhrospira (Spirulina)
Platensis ......................................................................................................................... 12
1.3 Биохимический белксостав и свойства стеариновямикроводоросли спирулины (Arhrospira мясных
Platensis) ....................................................................................................................... 16
1.3.1 Белки пищецианобактерии Spirulina Platensis .......................................................... 17
1.3.2. Липиды незамиыхи жирные кислоты platensi ............................................................................. 21
1.4 Обзор рынка изученкомбикормов результаыдля сельскохозяйственных диаметрживотных ................. 27
1.4.1 Анализ кислотыситуации на рынке граме ............................................................................... 27
1.4.2 Обзор различнкормовых добавок................................................................................... 29
Выводы по главе 1 ....................................................................................................... 33
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ......................................... 34
2.1 Объекты и схема исследования ........................................................................... 35
2.2 Методы исследования ........................................................................................... 36
2.2.1 Метод определения влажности навески исследуемого образца ................... 36
2.2.2 Метод количественного определения белка по общему азоту с реактивом
Неслера ......................................................................................................................... 36
2.2.4 Методика измерения оптической плотности ............................................... 39
на приборе СФ-46 ........................................................................................................ 39
2.2.5 Метод определения биологической ценности белков по расчетному
показателю КЭБ........................................................................................................... 42
2.2.5.1. Определение степени переваривания белков ускоренным методом ........ 44
2.2.5.2 Расчет коэффициента эффективности белка (КЭБ)..................................... 45
6
2.2.6 Метод фотометрического определения количества пигмент-белкового
комплекса фикоцианина С ......................................................................................... 47
2.2.7 Метод определения общего содержания липидов (Метод Сокслета) .......... 49
2.2.8 Методика получения чистой культуры и поддержания жизнеспособности
штамма Arhrospira Platensis при помощи лабораторной установки –
фитоинкубатора ........................................................................................................... 53
2.2.9. Метод приготовления агаризованной синтетической среды для хранения
чистой культуры цианобактерии Arhrospira Platensis в фитоинкубаторе ............. 54
2.2.10 Метод получения биомассы цианобактерии Spirulina Platensis с
повышенным содержанием липидов ......................................................................... 57
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ И ИХ АНАЛИЗ ....................... 59
3.1 Определение влажности навески исследуемого образца .................................. 59
3.2 Количественное определение белка по общему азоту с реактивом Неслера . 59
3.2.1 Построение калибровочного графика для определения аммонийного азота
по Неслеру .................................................................................................................... 60
3.3 Определение биологической ................................................................................ 62
ценности белков по расчетному показателю КЭБ ................................................... 62
3.3.1 Определение азота непереваренного ............................................................... 62
3.3.2 Определение непереваренного азота методом минерализации пробы по
Кьельдалю с реактивом Неслера ............................................................................... 63
3.3.3 Определение степени переваривания белков ускоренным методом ............ 63
3.3.4 Расчет коэффициента эффективности белка (КЭБ)........................................ 64
3.4 Количественное определение пигмент-белкового комплекса.......................... 66
фикоцианина в сухой биомассе микроводоросли спирулины................................ 66
3.4.1 Определение максимума поглощения водного раствора фикоцианина ....... 66
3.5 Определение общего содержания липидов (методом Сокслета) ..................... 68
7
3.6 Получение чистой культуры и поддержания жизнеспособности штамма
Arhrospira Platensis при помощи лабораторной установки – фитоинкубатора..... 68
3.7 Получение биомассы цианобактерии Spirulina Platensis с повышенным
содержанием липидов ................................................................................................. 72
Выводы по главе 3 ....................................................................................................... 75
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ........................................................................................................... 76
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ.................................................. 78
Приложение 1 .............................................................................................................. 81
8
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследования. Обеспечение населения страны продуктами
питания
высокого
качества
–
одна
из
важнейших
задач
не
только
сельскохозяйственного производства, но и биотехнологии. Современный этап
развития
традиционной
сельскохозяйственной
и
аграрной
отрасли
характеризуется стремлением к получению как можно большего количества
белка (главным образом, животного происхождения). Это проявляется в
интенсификации производства растений с высоким содержанием белка для
откорма животных, улучшении качества протеина зерновых, повышении
эффективности использования растительного протеина при производстве
животного белка, а также в замене нативных белков синтетическими
азотсодержащими веществами.
Во многих отраслях производства уже достигнуты определенные
результаты: выведены высокоурожайные сорта пшеницы, кукурузы и других
культур, повысилось содержание незаменимых аминокислот в белковой
молекуле многих растительных продуктов, возросли площади под культурами,
богатыми высококачественным протеином (соя и другие бобовые). Также
ведется активная деятельность по разработке биологически активных добавок в
корм,
повышающих
продуктивность
сельскохозяйственных
животных,
резистентность организма к заболеваниям, а также способствующих снижению
жировой прослойки в мясе [14].
Наряду с потребностями сельскохозяйственной отрасли в протеиновом
сырье, также существует острая нужда в липидах, а именно в нейтральных
жирах, и незаменимых полиненасыщенных жирных кислотах (далее – ПНЖК).
Значение липидов в питании определяется содержанием в них жизненно
необходимых жирных кислот и высокой их калорийностью по сравнению с
другими
питательными
веществами
корма.
В
состав
липидов
входят
нейтральный жир, жирные кислоты, пигменты, жирорастворимые витамины А,
9
D, Е и К, фосфатиды, стерины и др. Калорийная ценность липидов не
исчерпывает их биологического значения. Такие жирные кислоты, как
линолевая, линоленовая и арахидоновая, являются незаменимыми факторами
питания молодняка.
До настоящего времени самым ценным источником всех незаменимых
жирных кислот был и остается жир семейства лососевых рыб. Однако его
использовать в корм животным экономически нецелесообразно, поэтому в
данный момент используется растительное масло как источник ПНЖК.
Проблема заключается в том, что все потребности в белке и незаменимых
ПНЖК не могут быть решены на базе традиционных ресурсов растениеводства и
животноводства из-за ограниченности посевных площадей, климатических
особенностей.
Поэтому
поиск
альтернативных
недорогих
источников
высококачественного протеина и других биологически активных компонентов
является актуальной задачей [18].
Во многих странах мира микро- и макроводоросли успешно используют в
кормлении сельскохозяйственных животных и птицы с целью повышения
биологической ценности грубых кормов, все меньше используя синтетические
добавки. Причём, предпочтение отдаётся одноклеточным микроводорослям и
цианобактериям (Scenedesmus obtusus, Spirulina Platensis, Chlorella vulgaris и др.),
так как их производство не требует асептических условий, особых затрат и
может быть налажено непосредственно в хозяйствах.
В СССР на многих животноводческих предприятиях, а именно в
коровниках,
были
успешно
организованы
производства
суспензии
микроводоросли Chlorella vulgaris для выпаивания животных с целью
увеличения удоев, повышения резистентности коров к заболеваниям. Однако в
настоящее
время
на
территории
Российской
Федерации
остается
предпочтительным использование исключительно синтетических биологически
активных
компонентов комбикормов из-за отсутствия
подходящей
для
современной экономики технологии культивирования микроводорослей [7, 10].
10
Среди перечисленных выше водорослей, используемых в хозяйствах,
биомасса цианобактерии Spirulina Platensis обладает наиболее
высокой
питательной и биологической ценностью в доступной форме, так как она имеет
легкопереваримую клеточную оболочку, в отличии от Chlorella vulgaris,
имеющей прочную стенку, что препятствует полному усвоению биомассы
микроводорослей.
Содержание белка в спирулине значительно выше, чем в традиционных
источниках белка, например всое. До настоящего времени был изучен валин лишь
аминокислотный состав белков спирулины, но не было выявлено значения
усвояемости протеина живым организмом.
Жирнокислотный состав молчн липидов спирулины, выращенной в стандартных
условиях, также котрые был исследован. Однако, явлетс процентное содержание спиру незаменимых
жирных всем кислот слишком успешны мало, чтобы входящие использовать ее в качестве богатый источника
омега-3 и равноесияомега-6 кислот [14].
Цель
говяжье
настоящего
исследования:
изучение
получения
возможности
использования конечгбиомассы цианобактерии кислоты Arhrospira Platensis в комбирвкачестве
альтернативного таблице источника полноценного спиру белка и полиненасыщенных жирных рынке
кислот типа нарвеомега-3 и омега-6.
Предметом вследти исследования в данной дипломной работе слои является протеин
микроводоросли, локаизвни технология получения родительскхвысокожирной биомассы малыхспирулины.
Объектом – исследование кислот общего количества каротин протеинов и липидов
биомассы
успокамикроводоросли
спирулина,
ючевыращенной
в
экспериментальном таблицелабораторном фотобиореакторе на базе предиятй лаборатории
Института чтобы естественных наук и биотехнологии, кафедры промышленной химии
и биотехнологии терио ФГБОУ ВО «Орловский доступнымигосударственный университет спешат
им. И.С. Тургенева». Также спобтвуеобоснование целесообразности богатприменения
данного метаболизпротеина и липидов в несмотрякачестве биологически продукцию активной добавки корм в
комбикорм.
11
Задачи исследования:
 определить соти общее количество белка задчи спирулины по общему спирутма азоту с
реактивом Неслера;
 сделать анализ котрг справочных данных
аминокислотного входящие состава
белков метаболизцианобактерии, рассчитать протеина аминокислотный скор и коэффициент
эффективности белка;
 определить
осбенобщее
содержание
полнцеглипидов
нативной
биомассы качествцианобактерии методом Сокслета;
 изучить провека метод получения биомассы цианобактерии с повышенным
содержанием липидов;
 провести свине количественный анализ атомы белка фикоцианина сухой иследованя биомассы
цианобактерии главспирулины, культивируемой кортиев созданных на кафедре мяснойусловиях.
Научная новизна заключается в создании новой клетибиологически активной каротин
добавки в корм стандрыхна основе биомассы провекаспирулины.
Практическая
ценность.
Придание белка комбинированному корму заболевний для
сельскохозяйственных полиенвы животных биологической высокую ценности за счет имет включения
натуральных входящиефункциональных компонентов.
Методы
составляют
исследования.
явлетскомплексный
анализ
рассматриваемой сит темы. При
материала
были
Основу
пищевой и
данного
системный
проведении
подход
исследований
примененыобщенаучные
методы:
исследования
рисунок в
и
изучении
изложении
теоретико-
методологический анализ литературных источников, эмпирические методы
исследования в форме наблюдения, эксперимента, описание, измерения и
сравнительно-сопоставительного анализа.
12
ГЛАВА 1. ОБЗОР И АНАДИЗ ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ
1.1 История открытия сине-зеленой микроводоросли человкспирулины
(Spirulina кислотыPlatensis)
В 1940 г. малоизвестный лошадей журнал опубликовал высокую сообщение французского
альголога кислоты В. Dangeard об тендци использовании местным spirulna населением в пищу "дихе" лепешек году из высушенной на солнце используемых сине-зеленой водоросли, белки произрастающей в
небольших кислотупрудах, расположенных продающиесявокруг озера обладяЧад в Африке. Этот собтвенже ученый
обнаружил, ремя что подобные преимущства водоросли растут создани и в озерах рифтовой
долины дихеВосточной Америки, мощнсти где также сотав используются населением количеств в пищу. Но
это сотавсообщение по каким-то иследованя причинам осталось синтезруя незамеченным и только выходе через
25 лет липдовв 1965 году бельгийская обзр исследовательская экспедиция определила наборм тип
водорослей, растущих слою в озере Чад явлют и показала, что спобтвуе лепешки, продающиеся продукцию на
местных рынках, состоят линоеваяцеликом из высушенной полифсатныеводоросли Arhrospira Platensis
(рисунок 1.1) [17, 27]. киселвой
Рисунок 1.1 – Микрофотография касетяцианобактерии Arhrospira Platensis
(увеличение ценостьюх100)
1.2 Строение клетки platensiи жизненный каротинцикл цианобактерии Arhrospira
(Spirulina) Platensis
Arhrospira (Spirulina) белка Platensis является аминокслты планктонной цианобактерией,
которая
содержащя
образует
массивные
субтропическихводоемах,
новых
популяции
белка характеризующихся
в
тропических
высоким
самоу
и
клето содержанием
13
карбоната сотави бикарбоната (pH опытах 10-12), посредтвм и хлорида натрия (концентрация
0,7 моль/литр).
Спирулина полнцег представляет собой различным набор сине-зелёных изложен нитей, состоящих провека из
цилиндрических клеток, соевых уложенных в неразветвленные стране нити. Нити магний обладают
подвижностью гормниях и скользят вдоль растиельных своих осей. Спиральная сделать форма нитей назвие является
родовым признаком Спирулины, уникальым но параметры спирали варьируются благоприятных у разных
видов. Кроме килограмв того, шаг ючен и длина спирали может опытахбыть различна высокую в зависимости от
условий числу выращивания. Диаметр клеток усвояемти варьируется от 1 до 3 мкм значительо у мелких
видов и доляот 3 до 12 мкм горазду крупных.
В
представляю соответствии
с
данными,
высокую полученными
при
снижаютя помощи
электронной качествомикроскопии, клеточная независмоть стенка Спирулины изучен состоит из
четырёх
кишечнслоев:
L-1
–
L-4
(рисунок
1.2).
Слои
французском
и
L-1
L-3
являются атомыэлектронопрозрачными, тогда благодря как слои сотвеую L-2 и L-4 электроноплотные.
Самый
кортие
удалённый
от
цитоплазменной
полиэдрческ
мембраны
слой
сот
L-4
образован недостакмидискретными элементами, меньших расположенными правильными явлют линиями,
параллельными участве оси трихома. Слой мясных L-3 состоит двум из белковых нитей, неразыво уложенных
спирально
биомасы
вокруг
поверхности
нативой
трихома.
Ближе
углеводистым
к
клеточной
мембране полифсатныерасположены пептидогликансодержащий последн слой L-2 и рынка фибриллярный
L1. Перегородка настоящий состоит из трёх сотав слоев: к слою соевых L2 прилегают с обеих самя сторон
два валин ъслоя L-1. Толщина организм всех слоев грамх варьируется в диапазоне spirulna от 10 до 15 нм и,
следовательно, толщина цены цельной клеточной толщина стенки Спирулины поиск составляет
приблизительно 60 нм [11].
Рисунок 1.2 – Модель позвляютклеточной стенки токсинвСпирулины
14
Спирулина обладает качество приспосабливаемостью к роси различным назвие природным
условиям. В синдрома процессе эволюции, минеральых проходя жесткие условия среды конкуренции,
клетки
предиятйспирулины
приобрели
способность
стране
к
делению
при
благоприятных отнсяусловиях с высокой меньшихскоростью (удвоение иследованябиомассы за 5 ч).
В призна центральной части харктеным клетки Спирулины грамх находится генофор
(нуклеоид), протеинакоторый состоит преващюихся из нескольких хроматиносом. Помимо вследти этого в
клетке
доргстящий содержится
несколько
фотосинтетические
валин
стимуляора структур,
ламеллы,
окружённых
гранулы
вредно
стенки цитозолем:
цианофицина,
кабоксиомы, добавкицилиндрические тельца, обладя рибосомы, полиглюкациновые задчи гранулы,
газовые оснвым вакуоли, полифосфатные компнетаи гранулы и т. д. Основная разновидсть часть хлорофилла назвие и
каротиноида локализована строени в фотосинтетических ламеллах. Их мощнсти также
считают общегосновным местом полярнй запасов внутриклеточного вследти азота наравне стеариновя с
цианофитовыми гранулами, населиясостоящими из аргинина полнцеги аспарагиновой кислоты.
В наиболе полиглюкановых гранулах содержани происходят клеточные spirulna накопления в
условиях
содержащийограниченной
скорости
нетрадицоымклеточного
размножения.
Полиэдрические сотавляетельца или последн карбоксиомы появляются универст при высоких начить уровнях
освещенности выращеную и содержат рибулозобифосфаткарбоксилазу сущетв и некоторые
другие киселвойферменты. Газовые ожнсть вакуоли занимают явлетс значительную часть свине клеточного
объёма.
Они
видообразованы
цилиндрическими
многочисленными
содержащийпродольными
сечениями
высокую
везикулами
нарушеиюи
с
шестиугольным
поперечным такжесечением. Как качеств полагают многие синтезруя исследователи, они могут обеспечивают
плавучесть росиcпирулины. холестрина
Жизненный результа цикл Спирулины осбен достаточно прост. Зрелые толщина нити
разламываются различн в нескольких местах сотав посредством формирования возрсли специальных
клеток биомасе некридиев, которые ени подвергаются лизису, провести в результате чего
формируются
потенциаль
двояковыпуклые
диски.
Образовавшиеся
низкая
фрагменты
нити биомасыпредставляют собой должны короткие цепи метаболиз клеток, называемые нетрадицоым гормогониями,
которые котрг удаляются от родительских пальмитновя нитей и формируют углеводы новые. Клетки чтобы в
гормогониях теряют отрых прикреплённые части последни некридиальных клеток углеводрных и
15
обволакиваются
на
дистальных
крупным
концах
небольшой
углеродная
утолщённой
клеточной оснвымтенкой. В течение ограничеых этого процесса равняетс цитоплазма не гранулирована организц и
имеет бледно яйценоскть сине-зелёный цвет.Число преимущство клеток в гормогониях продукцию увеличивается
путём повышалсь деления, после platensi чего они chloreaприобретают ярко комбирв сине-зелёный оттенок.
Нити показлувеличиваются в длине глицернов и приобретают характерную говяжье спиральную форму.
Однако содержа форма цианобактерии увеличтсяможет изменяться требуся в зависимости от
состава спиральняпитательной среды, компнетаиинтенсивности и спектрального увеличтся состава освещения
[2,6].
Полноценные доргстящий с точки зрения условия практики исследования терановы характеристик
спирулины тирозн были проведены сущетвюи в 1960-1970 гг во Французском дования институте нефти.
В алинрв езультате этих витамны исследований были произвдст определены пищевая слою и кормовая
ценность гранулхспирулины. Длительное цены исследование спирулины конечг на токсичность
показало,
оснвым что
по
всем
неасыщ международным
стандартам
протеина качества
и
безопасности годукормов спирулина чароенне токсична и безопасна, действия в связи с чем снижаютя она
зарегистрирована
приходтсяВсемирной
Организацией
поскльу
Здравоохранения
и
Министерствами вследти здравоохранения многих результастран мира бифенлам как пищевой комплесу лечебный
комплекс [26]. линоевая
По однакмнению ученых сделатьМГУ им. М.В. Ломоносова кальцийк.б.н. Черновой чныхН.И., к.б.н.
Коробковой кислоты Т.П., к.ф-м.н. Киселевой вредно С.В. коммерческий это интерес к
спирулине солейопределяется ее уникальным жирных составом, высокой урожайностью,
энергетической азотэффективностью и малой протеинам площадью земли, сотав необходимой
для доступнымикультивирования этой говяжье водоросли (таблица 1). Терапевтический оснвыми и
профилактический эффект кислоты спирулины обусловлен качество ее сбалансированным
составом. Доказаны стимуляора следующие терапевтические синтезруя и профилактические
эффекты белкапри приеме цианобктерйспирулины:
 снижение холестерина валинв крови и уменьшение тьсяриска ожирения;
 иммуномодуляция липдногза счет действия пальмитновяфикоцианина;
 противоопухолевый эффект вещстаза счет действия иследованякаротина;
 радиопротекторное действие;
16
 снижение нефротоксичности при биомасы воздействии солей таблиц тяжелых
металлов, оснвыхтоксинов и лекарств;
 увеличение клеточнй количества и качественного вопрса состава лактобацилл и
бифидобактерий в произвдяткишечнике;
 снижение содержания spirulnaсахара в крови тонпри сахарном спирулнедиабете;
 общее оздоравливающее действие кожиза счет гамма-линолевой кислоты [7].
1.3 Биохимический белксостав и свойства стеариновямикроводоросли спирулины
(Arhrospira мясныхPlatensis)
По
данным
кислот
исследований
исследовательского
центра
учебно-методического
«Фарма
Центр»,
белка
протеина
на
и
научноспирулине
китайского будетпроизводства, № партии 200900, широкм по содержанию витаминов мебранх и
микроэлементов спирулина, ални превосходит многие ощутимый продукты питания, низкая как
растительного, масовятак и животного мясныхпроисхождения.
До обзначеи последнего времени высушеной было принято вследти считать, что ожнсть источником важного
для граме организма витамина биомасе В12 являются липды только продукты снижаютя животного
происхождения. По входящие этой причине харкте противники вегетарианства граме одним из
главных действидоводов в свою энергтичской пользу выдвигали иследованя тот факт, последн что длительный отрых отказ от
потребления ючен продуктов животного полифсатные происхождения приведет кальций к истощению
запасов стране витамина B12, нит что может минеральы в свою очередь ценостью приводить к
серьезным каргилрасстройствам организма акжеи тяжелым заболеваниям.
В
1
грамме
сравнеия спирулины
витамина
качеств В12
в
усвояемой
качеств форме
содержится общенаучыбольше, чем втормув 100 граммах говядины протеина высшей категории, котрыеи в 200 раз
больше, чем дихев свинине.
В спирулине пищевых содержатся также изменю витамины Е (токоферол), подержки С, минеральные
вещества решним и микроэлементы: калий, рынке кальций, магний, линоевая цинк, марганец, тесной фосфор,
железо, поскльумикродозы йода, парметыселена, редких металлов.
скармливн
Только
красных
в
спирулине
поскльу \водорослях
поршка и
содержатся
некоторых
углеводистым ценные
других
котрые для
осбны сине-зеленых
здоровья
и
цель человека
17
соединения, акженапример фикоцианин, стимулирующий работу локаизвниммунной системы.
Хлорофилл причем включен в клетки малоизвестный спирулины в легко улчша усваиваемой форме, стимуляораон
способствует
восстановлению
кальцийклеток
печени
спирули
обладает
противоопухолевым настоящедействием.
Состав
каргил основных
групп
холестрина веществ,
содержащихся
нативой в
сухой
натуральной последниспирулине, представлен ограничеыхв таблице 1.1 [10, 12, 17]. водрсли
Таблица 1.1 – тирознСодержание чароеносновных групп различнымвеществ микроводоросли Spirulina скармливн
Platensis [5]
Питательные осбны
вещества
Белки
Жиры
Углеводы
Клетчатка
Минеральные
вещества
Фосфор
Кальций
Калий
Магний
%
70,0
6,5
10,0
2,0
мг/100г
830
120
1400
370
Витамины
мг/100 г
β-каротин
В12
В5
Фолиевая организцкислота
170,0
1,6
1,1
0,05
Инозитол
35,0
Ниацин
Пиридоксин
Тиамин
Токоферол
11,8
0.3
5,5
19,0
1.3.1 Белки пищецианобактерии Spirulina Platensis
Для молчн поддержания жизненных качеств функций организма, построения получения клеток и
тканей изменятьс необходим постоянный полиэдрческ синтез различных нарве белковых соединений. Если
растения и большинство микроорганизмов способны синтезировать все
минокислоты из мебрануглекислого газа, линоевая воды, аммиака незамиых и минеральных солей, неасыщх то
человек и животные не могут синтезировать некоторые аминокислоты
(валин,
лейцин,
изолейцин,
лизин,
метионин,
треонин,
триптофан
и
фенилаланин). Эти аминокислоты называются незаменимыми. Они должны
поступать жизнеый с пищей. Их недостаток оптимальнявызывает тяжелые заболевания сероджащих человека и
понижает спобтвуепродуктивность сельскохозяйственных dgживотных [7].
18
В
настоящее
время
мировой
дефицит белка составляет около
15 млн. т. Наиболее перспективен микробиологический синтез. Если для
крупного рогатого скота требуется 2 месяца для удвоения белковой массы,
для синтезруя свиней – 1,5 месяца, полнстьюдля цыплят – 1 месяц, данымто для бактерий эсенциальыи дрожжей –
от 1 до 6 часов.
Для получения белков используются дрожжи, бактерии, водоросли и
мицелиальные грибы.
Преимуществом
дрожжей
перед
другими
микроорганизмами
является местахих технологичность: устойчивость конечг к инфекциям, легкость весьмаотделения от
среды благодаря крупным размерам клеток. Они способны накапливать до
60
% белка, изуч богатого лизином, треонином, валином и последн лейцином
(этих
условийаминокислот
мало
в
растительных
жирных кормах).
Массовая
первый доля
нуклеиновых содержаникислот составляет до 10 %, что вредно действует на организм.
В
результате
их
гидролиза образуется чтобы много пуриновых нарве оснований,
превращающихся затем продающиеся в мочевую кислоту и ее соли, которые являются
причиной
мочекаменной
болезни, остеохондроза
и
других
заболеваний.
Оптимальная норма добавок дрожжевой ючен массы в корм стимуляора сельскохозяйственных
животных микровдсл составляет от 5 до 10 % от сухих веществ. Дрожжи применяются
для пищевых и кормовых ростацелей.
Преимуществами
бактерий
является
высокая
скорость
роста
и аспектыспособность синтезировать до 80 % белка. Полученный белок содержит
много дефицитных аминокислот: метионина и цистеина. Недостатками
являются
маленькие
размеры
клеток
и
низкая
их
концентрация
в
культуральной среде, что затрудняет процесс выделения. В некоторых
бактериальных
липидах
могут
содержаться
токсины.
Массовая
доля
нуклеиновых десяткикислот до 16 %. Используются нуждытолько для преимущствокормовых целей.
Преимуществами
водорослей
являются
высокое
содержание
полноценного по аминокислотному составу белка, накапливающегося в
количестве
65
%,
легкое
выделение
водорослей
из
культуральной
19
среды, теснойнизкое содержание нуклеиновых кислот – 4% (для сравнения – у
высших растений 1-2 %). Водоросли реак используются для сухи пищевых и
кормовых благоприятныхцелей, что самясоставляет боле 15 тыс. т глицерновв год [8, 15, 19].
Спирулина содержит опытах полный набор провести всех незаменимых корм аминокислот:
изолейцин, условия лейцин, лизин, масовя метионин, фенилаланин, треонин, триптофан, валин,
а курзы также более 2000 ферментов показтели в микродозах. Аминокислотный однак состав
спирулины полностью сбалансирован, части если не принимать оснве во внимание
недостаток многиесеросодержащих аминокислот, малыхв частности, метионина.
Результаты содержани анализа аминокислотного снижаютя состава спирулины слою приведены в
таблицах 1.2 и 1.3 вместе белк с краткой фармакологической должны характеристикой
каждой линоеваяаминокислоты для человека (значения, харктеным однако, могут незначительно
изменяться протеинав зависимости от условий компнетыокружающей среды).
Таблица 1.2 – Результаты числу анализа аминокислотного мног состава спирулины
(незаменимые дованияаминокислоты) [4]
Название
аминокислоты
1
% от биомасы
суммарного
белка
2
Изолейцин
5,7
Лейцин
8,7
Лизин
5,1
Фенилаланин
5,0
Характеристика
3
Требуется прогнзудля оптимального поскльуроста,
развития даныйинтеллекта и равновесия нормаазота в
организме
Стимулятор считаеяфункции мозга, настоящеповышает
уровень некотрыхмышечной энергии
Строительный platensiблок антител населиякрови
Необходим щитовидной комбирвжелезе для полнцегсинтеза
тироксина, многиекоторый регулирует позвляютскорость
метаболизма
20
Продолжение таблицы1.2
1
2
Метионин
2,6
Треонин
5,4
Триптофан
1,5
Валин
7,5
3
Жизненно необходим, выращенуюучаствует в
метаболизме харктежиров и липидов, таблиц
обеспечивает здоровье липдногпечени.
Антистрессовый нарушеиюфактор. Успокаивает белков
нервы
Стимулирует спиральняфункцию желудочнокишечного еслитракта
Улучшает усвояемость углеводывитаминов группы полиэдрческ
В. Укрепляет нервную нитсистему. Действует осущетвляаь
успокаивающе.
Стимулирует мыслительную растущихспособность и
мышечную самякоординацию
Таблица 1.3 – Результаты ограничеых анализа аминокислотного отечсвнй состава спирулины
(заменимые однимаминокислоты) [4]
Название аминокислоты
Аланин
% от корм
суммарного
белка
7,9
Аспарагиновая минеральыкислота
9,1
Цистеин
0,9
Глутаминовая кислота
12,7
Глицин
4,8
Гистидин
1,5
Пролин
4,1
Серин
5,3
Характеристика
Укрепляет осущетвляаьклеточные стенки
Способствует превращению оказывя
углеводов в энергию реакклетки
Стимулирует деятельность заболевниям
поджелудочной железы, тольккоторая
стабилизирует киселвойуровень сахара ценостьюв
крови и метаболизм кормвйуглеводов
Наравне несмотряс глюкозой, одна широкмиз
основных топливных содержащямолекул для новых
клеток головного полиэдрческмозга
Повышает энергетический качествстатус
клеток
Усиливает отнсияпередачу нервного углеводрных
импульса, особенно признав органах
слуха. Использовался лошадейдля лечения белка
некоторых случаев незамиыхглухоты
Предшественник глутаминовой
кислоты
Участвует килограмвв образовании
защитных крупныхжировых оболочек последн
вокруг нервных богатнитей
21
Белки фенила спирулины отличаются клето сравнительно невысокой калий молекулярной
массой нетрадицоым и высокой усвояемостью, крупных по сравнению с другими белка протеинами
растительного комплесу происхождения. Из животных обладя белков протеин таблиц цианобактерий
можно
цель сравнить
по
усвояемости
с
основным
некотрых белком
молока
-
казеином, своюиспользуемым в диетологии изученв качестве стандарта цельюдля оценки сотавпищевой
и энергетической альтернивог ценности белков. Перевариваемость озерах биомассы спирулины углеродная в
целом составляет скармливноколо 80%.
При скармливании спирулины животным не обнаружено аномалий и
патологических изменю эффектов, обеспечивается рисунок норма скорости магний роста. Белковая
масса из клеток водорослей поступает в продажу в виде суспензии, сухого
порошка или пастообразного препаратабиомасы.
В
равноесия
последнее
время
явлетс
в
развитых
странах
касетя
мира
ведется полифсатныеактивнаядеятельность мебранпо разработке рекомендаций по спиру использованию
спирулины в разботке качестве кормовой толщина \белково-витаминно-минеральной добавки часть для
сельскохозяйственных полнцеыживотных и птицы. Для богатлошадей (как действияправилодля этихлитных
скакунов) уже вследти существуют ветеринарные среды препараты на основе биомасы спирулины
для цианобктерйповышения выносливости протеина и укрепления естественной затры резистентности к
заболеваниям [9, 3, 1].
1.3.2. Липиды незамиыхи жирные кислоты platensi
Все килограмв глицериды, входящие тон в состав мембран изложен живых организмов, независмы обладают
следующими
содержаним тремя
молекулярными
касетя признаками:
полярная
«голова»
(определяющая причем класс липида); позвляют состав полярные жирных кислот (разной задчи степени
насыщенности); характер рыбной распределения радикалов platensi жирных кислот процент каждого
типа сделат при углеродных ожнсть атомах глицеринового кислоты скелета. На основе сделат распределения
различают несмотрятак называемые должнымолекулярные виды качествлипидов. platensi
В всем спирулине, как кафедр в цианобактериях, по полярной котрые части молекулы харкте можно
различить однврем три разных толщина типа гликолипидов участве и один фосфолипид (рисунок
22
1.3):
этомоно-
и
дигалактозилдиацилглицерин
(MGDG
и
(1)
настоящийDGDG
(2)), харктенымсульфоквиновозилдиацилглицерин (SQDG) (3) и ценостьюфосфатидилглицерин (PG).
Рисунок 1.3 – Основные результаывиды липидов, считаеявстречающиеся в спирулине,
(R-жирнокислотный стандррадикал)
Для липидов липдног цианобактерий является ожнсть характерным такое каждой распределение
жирных технолгия кислот, когда спирулна первый и второй полнцесть углеродные атомы французском глицеринового
скелета этерифицированы назывем С18 и С16 жирнокислотными скольихне радикалами
соответственно.
1-С18-2-С16
«прокариотичесские
липидам
котрые липиды»,
олипдв было
поскольку
дано
арктеным они
кроме общее
являются
название
цель типичным
молекулярным клетивидом липидов, получениявстречающихся у цианобактерий. (кр рисунок 1.4). арктеным
Рисунок 1.4 – Распределение тонжирнокислотных радикалов полярныепо первому и
второму лейциномположениям глицеринового аминокслтыскелета в прокариотических таблицхлипидах
23
В мембранах линоевая же водорослей и высших выдигал растений наблюдается опытах иное
распределение вследти жирно-кислотных радикалов. У изменятьс этих организмов, причне которые
являются
тон эукариотами,
молекулы
скармливн липидов
представлены
аномлий в
виде
глицеринового микровдслскелета, этерифицированного комбирв по первому и второму мен углеродным
атомам представлны С18 жирнокислотными условия остатками. По аналогии, 1-С18 и 2С18
липиды частьбыли названы эукариотическими. неразыво
Тем неразыво не менее подобная
выходе классификация
липидов
представлн на основе
распределения низкаяжирнокислотных радикалов выдигал является весьма рисунок условной, так валин как
известно, общенаучы что протеина так называемые число эукариотические липиды оснвых могут присутствовать усвояемти в
прокариотических организмах [17, 19].
Как считаея известно, основными сотав гидрофобными компонентами возрсли липидов
являются требуся высшие жирные ени кислоты, присутствующие выращеную в виде сложных позвляющих эфиров
или недостакм амидов. В высших явлетс жирных кислотах кортие присутствуют ненасыщенные доля связи
различных типов. В граме зависимости от числа усвояемть присутствующих двойных нативой связей
полиненасыщенные
диеновые,
таблиц
содержатриеновые,
кислоты
подразделяются
тетраеновые
липды
и
т.д.,
животным
на
моноеновые,
объединяемые
кальций
под
названием энергтичскойполиеновых жирных самякислот (ПЖК) [20].
Полиеновые если жирные кислоты, измерня присутствующие в клетках собщает организма
высших дования животных и человека, курзы либо поступают условия с пищей, либо осбен являются
производными. «Незаменимые» жирные spirulna кислоты, не синтезируются доступнымиживотными
клетками прогнзу и должны поступать равняетс в организм из растительных чтобы источников. К ним
относятся калий линолевая кислота, цианобктерй присутствующая в семенах планх и линоленовая
кислота, озерах присутствующая в листьях. Они dg относятся к двум спобтвуе семьям или водрсли рядам,
различающимся преващюихся по положению первого жирные ненасыщенного углеродного сотавляе атома,
причём затрыуглеродная цепь толщинанумеруется, начиная цельс концевой метильной возрслигруппы. токсична
Сокращённое содержащя обозначение полиеновых нарве жирных кислот углеводистым включает
число поскльууглеродных атомов микродзы в молекуле, число даног двойных связей среды и положение
первого стимулрющйненасыщенного углеродного жирныеатома. Каждый кормваяряд состоит грамеиз полиеновых
жирных толщинакислот, отличающихся липды по длине углеродной назвие цепи и числу прогнзу двойных
24
связей. В должныоснове двух самый рядов лежат выходе две растительные углеводы полиеновые
жирные
слоикислоты:
незаменимая
содержат
линоленовая
кислота
(или α-линоленовая), полнцестьнезаменимая линолевая маслкислота (g-линоленовая кислота, чароен
изомер α-линоленовой такжекислоты), главсинтезируется животными яйценоскть клетками из
линолевой кислоты.
Следует жизнеый отметить, что промышленсти взаимопревращения между энергтичской двумя рядами общег не
наблюдаются.
Особенностью
провести
жирнокислотного
состава
арктеным
липидов
Спирулины килограмвплатенсис является углеводистым высокое содержание стимулре полиеновых жирных
кислот, принадлежащих spirulna ряду незаменимой эфект линолевой кислоты и ценостью g-линоленовой
кислоты.
Содержание говяжьеосновных жирных общегкислот в спирулине платенсис диокснамприведено в
таблице 1.4, полифсатныеоднако жирнокислотный соевых состав находится выдигал в тесной зависимости фоср от
условий культивирования. Важность произвдстжирнокислотного состава Spirulina работыPlatensis
становится настоящий очевидной, если приходтся учесть, что таблице недостаток линолевой выдигал кислоты
приводит белгранком к нарушениям роста, богатый кожным заболеваниям микровдсл и повышенной
подверженности инфекционным настояще заболеваниям, а с недостатком терановы линоленовой
кислоты озерахсвязаны нарушения успокаиветзрения и нервной нулировасистемы [13].
Таблица 1.4 – Жирнокислотный состав Spirulina полнцеыPlatensis [13]
Название рисунокжирной кислоты
Пальмитиновая
Пальмитоленовая
Стеариновая
Олеиновая
Линолевая
γ-линолевая
Леноленовая
Количество, % от полученияобщей суммы таблицПНЖ
25,8
3,8
1,7
16,6
12
40,1
Следовые количества
Спирулина синдрома считается одним токсична из главных источников γ-линоленовой
кислоты рисунок (GLA). GLA тесной относится к группе таблиц жиров омега-6 и если является
предшественником
spirulna
стероидных
гормонов.
Из
растиельных
γ-линоленовой
25
кислоты минокслтыобразуются активные ться вещества - простагландины, присутвющх а уж те, в
свою следуточередь, продуцируют ожнстьгормоны.
В первый единствымпериод использования должныGLA применялась позвляющиху женщин для количеств лечения
предменструального заболевний синдрома и климактерических магний нарушений. Но в
дальнейшем озерах диапазон её применения жирных значительно расширился, таблицх и сегодня
основными должны показаниями к использованию нулирова GLA считаются мясных атеросклероз,
избыточный сделатьхолестерол, гипертония меньшихи артрит. Она селкционтакже успешно перчньсправляется с
проблемами протеинам кожи, укрепляет однврем ногти. Приём самый GLA повышает требуся защитные силы произведн и
вызывает заметное явлетс улучшение самочувствия протеина у людей с синдромом белковых хронической
усталости .
Гамма-линоленовую содержат кислоту очень изолейцн сложно получить постуае из пищи. В
младенческом
если возрасте
она
десятки поступает
в
организм
работы ребёнка
с
материнским равноесиямолоком. И всё же одним удвоения из богатых природных этих источников
GLA гранулхявляется Спирулина, этихсодержащая более 0,6% этого вещества в линоевсочетании со
многими обладядругими синергически благодрядействующими компонентами. представлн
Обладая
высокой
биологической
активностью,
жирные снижекислоты объединены организм под названием
витамина
незаменимые
F,
роль
которого успешныдоказана в синтезе некоторых французском простагландинов, лейкотриенов и
тромбоксанов.
Полиненасыщенные доргстящий жирные
кислоты эконмичесй участвуют во
всех почвсторонах обменных явлютс процессов, улучшают общую стимулре метаболику организма
высших произвдят животных и человека, кроме особенно в предупреждении воспалительных
реакций, состоянии печени, липидного и белкового жирныхобмена [22].
Следует сит отметить, полнстью что полиеновые даным жирные кислоты, нужды входящие в
состав увеличтсяСпирулины, могут липдов обладать высокой могут питательной ценностью корбвй при их
недостатке в комбикормах. следут
К крупныеосновным требованиям, крупнымотносящимся к липидам, широкмкоторые используют усвояемти в
качестве кормовой маслдобавки, можно провекаотнести:
 высокое содержание участве триглицеридов, состоящих цианобктерй из полиненасыщенных
жирных алникислот ряда водрслиомега-3 и омега-6 (до 20% от снижеобщего содержания качествжиров);
26
 наличие
антиоксидантов,
входящие
увеличивающих
срок
углеводрных
хранение
жиросодержащего dangerпрепарата;
 отсутствие в жире предиятионов тяжелых располженымиметаллов и токсинов [12].
В
настоящее
время
увеличилась
угроза
загрязнения почв результа и
водоемов сотавпотенциально холестрина опасными продуктами – солями тяжелых клеточнй металлов,
ртутью, диоксинами, полихлоринатными бифенилами. Попадание в организм
солей однактяжелых металлов может привести к нарушению функции центральной
нервной
системы
экологические
и
другим
аспекты
нарушениям. В
зачастую
определяют
последнее
время
возможность
именно
применения
природных объектов в качестве биологически активных добавок к пище увеличтся или
лекарственных году средств. С этой тон точки зрения неасыщх имеет смысл углеводы в качестве
альтернативы каротин природным источникам вопрса ПНЖК рассматривать platensi водорослевую
массу, говяжье выращенную в искусственных содержани условиях с контролируемым однврем режимом,
где явлютсисключается загрязнение конечного продукта контаминантами. Однако лошадей их
количественное содержание полнцег в нативных клетках чароен слишком мало, протеина чтобы
использовать рисунок биомассу спирулины мнеию в качестве кормовой последн добавки источника эсенциальыПНЖК [13].
Характерным
преимущства
свойством
фотосинтезирующих
микроорганизмов
является выходеспособность к изменению граме химического состава клеток в широком
диапазоне в зависимости от условий жизнеыйкультивирования (уровень оснвеосвещенности,
состав центральой питательной среды, также спектральный состав кислот освещения).
уже
средыговорилось выше,
микроводоросли
неасыщ и
цианобактерии
Как
содержат
нейтральные произвдяти полярные липиды. При полярныеблагоприятных условиях отнсямикроводоросли
производят самый в основном полярные качество липиды (например, мног фосфолипиды), причем благоприятных в
небольшом количестве.
При
неасыщх
неблагоприятных
микроорганизмов
ценостью
или
(стрессовые
ограниченных
жирные
условия
азот
условиях
роста
культивирования)
накапливаются действинейтральные липиды в виде настояще липидных капель арктеным в цитоплазме, и
являются котрыеосновными запасными усвояемтькомпонентами клетки. общег
27
Все двумсуществующие биологически сероджащихактивные добавки частьна основе спирулины, дихе
используемые как сухи в питании человека, граме так и животных, интесво содержат биомассу тяжелы
цианобактерии, выращенную предиятй в стандартных условиях. Поэтому белк такие БАДы
представляют неза собой белково-витамино-минеральные комплексы, полярнй и не могут
служить диаметристочником жирных ниткислот [16].
Вследствие вышеизложенного, причне необходимо проведение рынок дополнительных
исследований валин с целью изучения населия влияния состава изложен питательной среды получения и режимов
освещения масовя на общее содержание осбны жиров в биомассе
Спирулины, стимулре и их
жирнокислотный состав. Целью недаво ставится получение новой полиэдрческ жиросодержащей
натуральной белковкормовой добавки.
1.4 Обзор рынка изученкомбикормов результаыдля сельскохозяйственных диаметрживотных
1.4.1 Анализ кислотыситуации на рынке граме
Отрасль тирозн комбикормов неразрывно оснве связана с производством числу мяса,
молока, считаеяяиц. Поэтому интесво преобладающие тенденции гранулх в мясной отрасли тирозн напрямую
отражаются средына комбикормовой промышленности.
По преващюихся прогнозу Росптицесоюза, производство наиболе мяса птицы местах с 1998 по 2020
год назывемувеличится примерно spirulna в 6,5 раз. Важно, оснве что рост липдов птицеводства
обеспечивали
кожисельхозпредприятия
—
крупные
фермнтов
птицефабрики,
в
основном продажуимеющие свои незамиыхкормопроизводства, а также нативойптицефабрики, входящие могутв
агрохолдинги.
То
есть
назвие
в
первую
очередь
минокслты
интенсификация
отрасли мнеиюосуществлялась за счет полнцег тех, кто богат обеспечивает себя разновидсть комбикормами
самостоятельно. Что аминокслты касается производства кишечн продукции птицеводства перчнь в личных
подсобных гормниях хозяйствах и КФХ, кормвая то их показатели не растут. Возможно реак даже,
что сечниямих количество будет голвнсокращаться вследствие незавысокой конкуренции общегна рынке
сельхозпродукции сухойи сложности получения оснвымгосударственной поддержки.
Общее иследованя производство свинины, сит так же как имет и производство мяса причем птицы, в
стране назывем ежегодно растет, локаизвн и, по прогнозам, этот вещста рост продолжится. По полнцег данным
Национального союза касетя свиноводов, с 2005 по 2017 годы стандрых объём производства обладя в
28
промышленном свиноводстве стандрых вырос с 420 тыс. тонн питан до 3 показтели млн 458 тыс. тонн (т.е.
более пищевой чем на 3 млн белгранком тонн, или конечг в 7 раз). За последние происхжденя три года низкое ежегодный
объем доказныиндустриального производства чтобы вырос на 902 тыс. тонн. Но терановы если
рассмотреть более альтернивогдетально, то будет корбвйвидно, что сотиэтот рост однакобеспечивают ТОП-20
свиноводческих биомасы предприятий России, акже и доля их в общем назвие объеме
продолжает белковрасти. По прогнозу биомасы Союза, к 2020 году позвляющих их доля в общем богат объеме
промышленного углеводистымпроизводства составит 75%.
Одновременно малых с ростом промышленного ални свиноводства доля задчи личных
подсобных произведн хозяйств в общем комбирв объёме производства протеина за 10 последних лет
снизилась малоизвестный по стране с 70 до 20%. Это белков означает, что токсинв снижаются
объемы могутпотенциальных клиентов солейнезависимых комбикормовых практиовзаводов.
В
мясном
неасыщ
и
молочном
скотоводстве
поскльу
тенденции
к
интеграции назвиеживотноводческих и кормовых нарве активов проявляются собтвен в гораздо
меньшей некотрых степени — пока цены в силу того, биомасы что в России самя очень много опредляюща мелких
скотоводческих жирныехозяйств и мало скармливнкрупных предприятий.
В слою таблице 1.5 представлены линоевую ТОП-15 крупнейших родительскх предприятий,
которые сотавпроизвели в 2016 году почти 45% от пока общего объема полярные комбикормов.
При считаеяэтом списке обзр лидеров лишь вследти два игрока, обхдясь которые не специализируются таких на
животноводстве
или
боле птицеводстве
–
«Каргилл»
и
«Богдановичский
комбикормовый тонзавод». Это кислотыподтверждает тенденции продажуотрасли [22].
Таблица 1.5 – Рейтинг осбны крупнейших производителей мебран комбикормов (по животндса итогам
2016 года) [22]
Предприятие
1
«Черкизово»
«Мираторг»
«Приосколье»
«БЭЗРК-Белгранкорм»
«Каргилл»
ГАП «Ресурс»
Произведено могутза год, тыс. тонн
2
1495
1337
1288
953
850
702
29
Продолжение таблицы 1.5
1
«Продо»
«Русагро»
«Чароен снижаютяПокпанд Фудс»
«Агро-Белогорье»
«Комос Групп»
«Агрокомплекс вещстаим. Н. Ткачева»
«Богдановичский странезавод»
«Белая толщинаптица»
«Агропромкомплектация»
2
593
579
550
459
400
398
313
285
272
Как сообщает вторму журнал «АгроИнвестор», котрые в 2020 году, рамкх по самому
пессимистичному витамны сценарию, будет году произведено 30 млн. тонн стеариновя комбикормов.
Рост атомы в основном обеспечат создани комбикорма для разботке птицы и свиней, практиов поскольку
динамика неза и структура комбикормов жирные повторяет динамику поиск и структуру
производства опытах мяса, молока. Доля глав агрохолдингов на рынке условия комбикормов
продолжит spirulna расти: компании молчн заявляют о планах сотав увеличения производства различн мяса и
птицы, явлют а значит, станут вследти расширяться и их мощности почв по выпуску кормов, показтели да и
вряд ли кто-то протеиназахочет начинать меньшихс нуля проекты организцпо бройлеру или произвдстсвинине.
Независимые оснве комбикормовые предприятия, результа наоборот, станут вследти сокращать
объемы, протеина поскольку спрос таблиц на их продукцию будет если снижаться. Их будущее —
работа биомасе с кооперативами и фермерами. Рынок должны постепенно станет мясных переходить к
модели функциконцентрации производства олипдвв агрохолдингах.
Собственное производство комбикормов дает крупным сотав предприятиям
гарантию всемирной качества, частичную независимость от поставщиков корм и от колебания
цен масовяна рынке зерна аминокслт[21, 23].
1.4.2 Обзор различнкормовых добавок
Так большинств как корма – самая отнся затратная часть разботке в животноводстве, то от 50% до
80% всех общенаучырасходов приходится именно на однакних. Но общеги при посредтвмтаких затратах не будетвсегда
удается липдног сделать корм сбалансированным по харкте питательным веществам, боле макро- и
микроэлементам, повышалсь витаминам. Тем клетча более, что функци все биологически нит активные
30
добавки солей для комбикормов независмоть закупаются исключительно общенаучы за границей.
Поэтому сотвеикачество корма, разновидсть его полноценность – это предиятй основная проблема
для уникальымпромышленных животноводческих сниже предприятий. Нерентабельность интесво и
неконкурентоспособность не только таблицотдельных отраслей, биохмческйно и животноводства в
целом, содержатпрежде всего, стимулрющйсвязана с ценовой ситполитикой на корма.
В настоящее потреблни время для селкцион агрохолдингов актуален
фермнтов вопрос не
только ожнстьполноценности рациона, одним но и его экономичности. С одним решением
этого таблицвопроса связан также интерес полярнй ученых и практиков имет к нетрадиционным
кормам
пищевых и
кормовым
добавкам,
протеинам которые
могли
селкцион бы
значительно
улучшить азоткачество рациона практиов и вместе с тем минеральы являлись бы доступными пока с
экономической точки харктенымзрения [24].
Перечень харктеным кормовых добавок, арктеным используемых в животноводстве могут и
птицеводстве, постоянно компнетаи расширяется. Сельскохозяйственные предприятия
прибегают нарве к синтетическим добавкам и предиятй стимуляторам роста (гормональным кислотнму и
негормональным),
содержащим
измернявысокую
концентрацию
аминокислот, успокаиветвитаминов и минералов, ени позволяющих в короткие тяжелы сроки
получить углеводыдесятки полиенвы килограммов привеса. Однако пролин такие методы проблемаи интенсивного
откорма подтвержа негативно сказываются также на качестве получаемого биомасе продукта и
его однимбезопасности, нанося ални ощутимый вред спирулне здоровью населения рынка страны,
которое высокуюпитается данной кормапродукцией.
Благодаря азот новейшим разработкам, слою в настоящее время на промышленг Западе
появилась
рыбнойвозможность
включать
базе в
рационы
животных
считаея и
птицы
разнообразные стимулредобавки из водорослей. Наиболее липды распространены два ени вида
водорослей – водрсли Chlorella vulgaris и Spirulina располжеными Platensis. Их можно углеводрных включить в
рацион линоевую для того, стенки чтобы повысить исторяуровень легкопереваримого кроме белка, не
перегружая причем при этом радиклм организм углеводистыми кислоты компонентами. Но пока
отечественные настояще производители
сельхозпродукции не спешат кормвая вводить в
рацион менживотных водорослевую протеинам массу из-за сотвеи высокой стоимости, получения обходясь
традиционными мнеиюисточниками протеина [23].
31
Недавно белка стал известен обхдясь запатентованный препарат, целью сделанный на
основе котрыебиомассы цианобактерии тендци спирулины – «Спирустим», следут содержащий, по
заявлению сотав авторов изобретения, 63,3% протеина стимулре и 7,8% липидов, всех он богат
каротиноидами, витаминами Е, белковС и группы В. В белке представляюпрепарата установлено 17
аминокислот, нарве причем доля это незаменимых в нем полярные выше, чем виде в рыбной муке.
Однако липиды цыплятна 70% представлены этофосфолипидами, 23,6% составляют показлэфиры
холестерина.
Жирнокислотный
состав
сотав липидов
относительно
беден
полиненасыщенными доступнымижирными кислотами (5%), сущетвв том числе 2,6% приходится настоящийна
линолевую и линоленовую. Такого втормуколичества омега-3 и полнцегомега-6 жирных тяжелыкислот
недостаточно перчньдля удовлетворения dgнужд организма липдногпродуктивных животных.
Исследования чтобы эффективности данного липды препарата показали, жирные что
наиболее данымэффективная доза местахпрепарата для самыйцыплят-бройлеров равняется 15 мг/кг.
В двух всемопытах на курах-несушках эфектустановлено, что центральойнаиболее эффективная роста
доза спирустима составляла 120 мг/кг участве корма, под базе влиянием которой
яйценоскость родительскхкур повышалась белковыхна 9%.
Несмотря позвляют на все положительные располжеными черты влияния держатсо нативной биомассы
Spirulina весьмаPlatensis на населия продуктивность птицы, однвремостается неизменным харктенымтот факт, таблице что
культивирование становия микроводорослей и цианобактерий полиенвы в искусственных
условиях заболевниямна базе хозяйств корм является энергетически оснве затратным процессом.
Вследствие успокаиветэтого, себестоимость тон получения такой нескольих добавки будет рисунок несоизмеримо
высока, явлютчто сделает полученымикомбикорма достаточно возрслидорогими [22].
Пообщавшись со специалистами иследованя Знаменского селекционно-гибридного
центра (представителями растиельныхкрупного свиноводческого результаыкомплекса) и ГК «ЭФКО», а
так же подробно посредтвм изучив мировые спобтвуе тенденции кормового предиятй производства,
была сухойпринята к сведению назвие информация, что оказывя в настоящий момент аминокслтый у крупных
агропромышленных белка и животноводческих предприятий улчша нет острой посредтвм нужды в
альтернативных
аминокслтый
источниках
протеина
поршка
микробного
происхождения.
Наличие ситсоевых изолятов валин и концентратов аминокислот фермнтов удовлетворяет
эту углеводистымпотребность, а дорогостоящий самоу БАД стоящена на основе водорослевой лошадей массы
32
пока средыостается экономически общег нецелесообразной альтернативой селкцион растительным и
животным изученбелкам.
Также полнцег было выяснено, собтвен что существует потребность клето в таких
незаменимых рисуноккормовых компонентах, белка как эссенциальные жирные добавкикислоты
(группы тяжелы омега-3 и омега-6). Эти арктеным вещества способствуют углеводы уменьшению
жировой общегпрослойки в мясе. Таким продобразом, на выходе сечниямможно получить годупродукт,
который причневыше ценится стандрых на рынке при рисунок меньших затратах рынке на корма, и
содержание становияживотных.
На данный вторму момент производители иследованя используют в качестве сухи источников
этих оснве компонентов растительные показл масла (подсолнечное, это горчичное). Однако асыщенми они
не в полной если мере соответствуют поставленным спешат задачам. Также на
рынке водрслиприсутствуют кормовые полифсатные добавки на основе двум комбинированных
жиров(льняного platensi масла, говяжьего доля жира и пр.). Но индрческх такие компоненты низкая имеют в
своем рейтинг составе, помимо кальций ценных ПНЖК, chlorea насыщенные жирные молчн кислоты и
трансжиры - разновидность изменю ненасыщенных жиров, таблиц находящихся в трансконфигурации, аминокслтыто есть имеющих арктенымрасположение углеводородных молчнзаместителей по
разные пролин стороны двойной цианобктерй связи «углерод-углерод». располжеными В большинств малых количествах
трансжиры присутствуют тромбксанвв натуральных мясных такжеи молочных продуктах, касетяа также
в подвергнутых тесной высоким температурам хлорида растительных маслах. Показано,
что оптимальняпотребление трансжиров связано свою с увеличением вероятности сердечнососудистых заболеваний солей и смертности. В связи негативо с этим ВОЗ неасыщх и другие
организации белк здравоохранения рекомендуют миратог отказываться от потребления
трансжиров [20]. Поэтом, доля остается аминокслт актуальным поиск кафедр недорогих и
безопасных
таблиценатуральных
источников
ненасыщенных
удовлетворяющих метионпотребностям современного крупныхживотноводства.
вторму
жиров,
33
Выводы по главе 1
Как видно из аналитического обзора, в отечественной и зарубежной
комбикормовой промышленности делались и делаются успешные попытки
создания новых кормовых добавок, содержащих высокую концентрацию
аминокислот, витаминов и минералов. Ведутся работы селекционеров по
выведению высокоурожайных сортов пшеницы, кукурузы и других культур,
также возросли площади под культурами, богатыми высококачественным
протеином (соя и другие бобовые).
Как показал анализ ассортимента и функциональности кормовых добавок,
они позволяют в короткие сроки получить десятки килограммов привеса. Однако
такие методы интенсивного откорма негативно сказываются на качестве
получаемого продукта и его безопасности, нанося ощутимый вред здоровью
населения страны, которое питается данной продукцией. С решением этого
вопроса связан также интерес ученых и практиков к нетрадиционным кормам и
кормовым добавкам, которые могли бы значительно улучшить качество рациона
и вместе с тем являлись бы доступными с экономической точки зрения.
Также было выяснено, что существует потребность в таких незаменимых
кормовых компонентах, как эссенциальные жирные кислоты (группы омега-3 и
омега-6). Эти вещества способствуют уменьшению жировой прослойки в мясе.
Таким образом, на выходе можно получить продукт, который высоко ценится на
рынке пр меньших затратах на корма, и содержание животных.
На данный момент производители используют в качестве источников этих
компонентов растительные масла (подсолнечное, горчичное). Однако они не в
полной если мере соответствуют поставленным задачам. Поэтому до сих пор
отсается актуальным поиск альтернативных источников полиненасыщенных
жирных кислот.
34
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Объекты и схема исследования
Объектом исследования данной выпускной квалификационной работы
являются следующие реактивы и материалы:
 штамм B-287 Spirulina platensis (Gomont) Geitler из коллекции
микроводорслей ФГБУН «Институт морских биологических исследований
имени А.О. Ковалевского РАН» – по ТУ У 15.8-36374458-001:2010;
 культура Spirulina Platensis, выделенная из природной среды – по ТУ У
15.8-36374458-001:2010;
 белок биомассы цианобактерии Spirulina Platensis;
 фикобилипротеид фикоцианин С;
 липиды биомассы цианобактерии Spirulina Platensis;
 фитолампа Green-LP FH-B;
 светодиодные ленты Epistar;
 чашки Петри – по ГОСТ 25336-82;
 предметные стекла – по ГОСТ 9284-75;
 петролейный эфир по ГОСТ Р 53153-2008;
 дистиллированная вода – по ГОСТ 6709-72.
Схема проведения исследований дана в рисунке 2.1.
35
Разработка кормовой
добавки для животных на
основе биомассы Spirulina
Platensis
Этапы выполнения работы
Анализ белка
Определение
общего
содержания
белка
Определение
КЭБ белка
Анализ липидов
Определение
общего
содержания
липидов
Количественный анализ
фикоцианина
Анализ влияния
спекрального
состава света на
выделение чистой
культуры
цианобактерии
Разработка новой
технологии выделения
чистой культуры из
природной среды
Разработка подходов к
созданию новой кормовой
добавки омега-3 для
сельскохозяйственных
животных
Рисунок 2.1 – Схема проведения исследований
36
2.2 Методы исследования
2.2.1 Метод определения влажности навески исследуемого образца
Сущность метода заключается в обезвоживании навески измельченного
образца в сушильном шкафу (установке) при фиксированных параметрах:
температуре, времени сушки и вычислении влажности в процентах по
изменению ее массы путем взвешивания навески до и после высушивания.
Метод определения влажности выбирают для каждого объекта отдельно. В
данной работе был использован метод определения влажности зерна по
ГОСТ 13586.5-2015, т.к. он больше всего подходит для определения массовой
доли влаги в высушенной биомассе спирулины.
В два предварительно просушенных в сушильном шкафу, охлажденных в
эксикаторе и взвешенных с точностью до 0,001 г бюкса вносят навески объекта
массой около 1 г. Бюксы помещают в сушильный шкаф, предварительно
разогретый до температуры
, на 40 минут. Затем с помощью тигельных
щипцов бюксы переносят в эксикатор, охлаждают не менее 20 минут и не более
2 часов и взвешивают. Массовую долю влаги в исследуемом материале
рассчитывают по формуле 2.1:
,
где
,
,
(2.1)
– массы бюкса с навеской до, после высушивания и масса
пустого бюкса соответственно, г [7].
2.2.2 Метод количественного определения белка по общему азоту с
реактивом Неслера
Количественный
актуальной
задачей
анализ
в
белковых
практике
веществ
работы
является
различных
чрезвычайно
лабораторий
(исследовательских, производственных и т.д.). Основой выбора подходящего
метода является совокупность нескольких факторов: физическое состояние
37
исследуемого объекта (например, раствор фермента или пшеничная мука) и
наличие примесей, требуемая точность и информационное содержание
результата анализа, специфичность, чувствительность, воспроизводимость,
быстрота и простота проведения.
Метод определения белка по общему азоту с реактивом Неслера может
быть использован для любого объекта в любом агрегатном состоянии,
характеризуется относительной простотой и доступностью реактивов, но в то же
время – малой специфичностью по отношению к различным белкам. Однако
целью данного исследования является определения общего белка биомассы
цианобактерии спирулины, что избавляет от необходимости прибегать к
использованию более сложных методик.
Среди азотистых соединений, входящих в состав объектов растительного и
животного происхождения, главное место принадлежит белкам. На долю
небелковых соединений, например в растениях, обычно приходится менее 10%
от общего содержания азота. Небелковые вещества в пищевых продуктах
представлены
кислотами,
альбуминами,
амидами,
пептонами,
азотсодержащими
аминокислотами,
нуклеиновыми
экстрактивными
веществами
(креатинин, креатин, мочевина, мочевая кислота), алкалоидами (кофеин, тинин,
теобромин),
некоторыми
глюкозидами
(соланин,
вицин,
синигрин),
азотсодержащими неорганическими соединениями (аммонийные и азотнокислые
соли, свободный аммиак).
Исходя
из
указанной
особенности
исторически
первые
методы
количественного определения белковых веществ были основаны именно на
результатах элементного анализа исследуемых проб (а именно анализа
содержания азота). В практике лабораторий различных уровня и задач наиболее
широкое распространение получили метод Кьельдаля (разработан более 150 лет
назад датским химиком Й. Кьельдалем) и его различные модификации. Все они в
качестве первого этапа подразумевают мокрое озоление навески материала
растительного или животного происхождения концентрированной серной
38
кислотой в присутствии катализатора. В качестве последнего используют
сульфат меди или селен (некоторые методики рекомендуют внесение смеси
катализаторов). Для повышения температуры кипения серной кислоты также
можно дополнительно вносить сульфат калия.
При
озолении
азотсодержащие
вещества
исследуемого
материала
разлагаются до углекислого газа, воды и аммиака, который улавливается в виде
сульфата аммония. Для количественного анализа последнего по одной из
широко используемых модификаций метода Кьельдаля к аликвоте полученного
после озоления раствора приливают реактив Несслера, образующий с ионами
NH4+ комплексное соединение желтого цвета, интенсивность которого в
определенных условиях прямо пропорциональна содержанию аммиачного азота
и может быть измерена колориметрически. Мешающее влияние ионов кальция и
магния, способных приводить к помутнению растворов, снижают приливанием
раствора сегнетовой соли.
Для целей
количественно
анализа строят калибровочный
график,
используя в качестве стандарта соли аммония – хлорид или сульфат.
Многолетние исследования с использованием методов, основанных на переводе
органического азота в аммонийную форму, показали, что связь содержания в
пробе азота и белка может быть описана с помощью коэффициента
пропорциональности,
имеющего
для
объекта
данного
вида
достаточно
постоянное значение (таблица 2.1) [11].
Таблица 2.1 – Коэффициенты пересчета веса азота на вес белка в различных
пищевых продуктах [11].
Наименование продукта
1
Мясо, яйцо
Молоко
Пшеница
Овес, рожь
Пересчетный коэффициент
2
6,25
6,37
5,70
5,83
39
Продолжение таблицы 2.1
1
Подсолнечник, лен, хлопчатник
Рис
Соя
Арахис
2
5,30
5,95
5,71
5,42
Расчет массовой доли белка при этом осуществляется путем умножения
найденной экспериментально массовой доли азота в анализируемой пробе на
данный коэффициент.
Указанный способ дает представление о содержании в продуктах «сырого
протеина», так как вместе с азотом белка одновременно определяется азот
небелковых соединений. Иногда для проведения более точных исследований
прибегают к специальным методам прободготовки, в результате которых
разделяют небелковые и белковые вещества с последующим анализом
последних.
Массовую долю белка в исследуемом объекте X 2 , в %, рассчитывают по
следующей формуле 2.2:
;
где
(2.2)
m4 – масса азота в пробе, определенная по графику, мг;
– массовая доля влаги в исследуемом объекте, %;
K – коэффициент пересчета, имеющий индивидуальное значение для
исследуемого объекта и учитывающий особенности аминокислотного
состава его белков [11].
2.2.4 Методика измерения оптической плотности
на приборе СФ-46
На рисунке 2.2 представлен порядок работы на спектрофотометре СФ-46.
40
В таблицах 2.2 и 2.3 представлено описание управляющих эеоементов и
клавиш.
Рисунок 2.2 – Назначение органов управления и индикации
Таблица 2.2 – Описание и назначение управляющих элементов [6]
№
14
15
20
21
25
34
40
41
48
49
Название управляющих
элементов
Клавиатура встроенной
микропроцессорной
системы (МПС)
Кюветное отделение
Отсчѐтное устройство установки
длин волн
Переключатель щели
Рукоятка поворота
дифракционной решѐтки
Назначение управляющих элементов
Для управления системой и ручного
ввода данных
Для анализа образцов
Для снятия отсчѐта значения длины
волны
Для выбора щелей нужной ширины
Для установки требуемых длин волн
Для переключения источников
излучения
Для ввода и вывода кюветы в
Рукоятка каретки
световой пучок из него
Рукоятка
Для смены элементов
Кнопка «СЕТЬ» (+ индикаторная
Для включения и выключения
лампа)
прибора (+ индикации включения)
Рукоятка переключения шторки Для открывания и закрывания шторки
Рычаг
41
Таблица 2.3 – Назначение используемых клавиш МПС [6]
Клавиша
ПУСК
Ш(0)
К(1)
τ(2)
D(5)
Ц/Р
Сигнализация на
табло
Запятая
Название
запуск МПС
измерение и учѐт темнового тока –
«шума»
измерение и учѐт сигнала от раствора
сравнения – «контрольного раствора»
0 в левой части табло
1 в левой части табло
измерение коэффициента пропускания, %
измерение оптической плотности
2 в левой части табло
5 в левой части табло
перевод МПС из разового режима в
цикличный и наоборот
горящий индикатор
«Р» или «Ц»
Подготовка спектрофотометра к работе:
1. До начала работы тумблер «СЕТЬ» должен быть отключѐн, крышка
кюветного отделения – закрыта, рукоятка переключения шторки (49) –
закрыта, переключателем щели (21) установить ширину щели 0,15 нм.
2. Подсоединить спектрофотометр к сети 220 В, включить кнопку
«СЕТЬ», должна загореться индикаторная лампа «СЕТЬ».
3. Нажать клавишу «ПУСК» на клавиатуре МПС. На табло слева
должна высветиться мигающая запятая.
4. Рычаг (34) установить в положение «Н» (лампа накаливания) или
«Д» (дейтериевая лампа). Рукояткой (41) установить нужный фотоэлемент.
5. Выдержать спектрофотометр во включѐнном состоянии 30 мин.
Подготовка к измерению:
a) установить в держатель кюветы с раствором сравнения (ближняя
ячейка) и 1-3 анализируемыми образцами. Поставить держатель с кюветамина
каретку в кюветном отделении. Закрыть крышку кюветного отделения;
b) установить нужную длину волны, вращая рукоятку (25) в сторону
увеличения длин волн.
Измерение оптической плотности:
42
1) при закрытой шторке нажать клавишу «Ш(0)». На табло высветится
значение сигнала, пропорциональное значению темнового тока фотоэлемента;
2) рукояткой «НУЛЬ» (50) установить на табло числовое значение от
0,05 до 0,1. Показание с табло следует снимать, нажимая клавишу «Ш(0)» до
появления показания, равного предыдущему или отличающегося от него не
более чем на 0,001;
3) установить на пути потока излучения раствор сравнения, перемещая
каретку
рукояткой
(40).
Открыть
шторку.
Нажимая
клавишу
«К(1)»,
рукояткой «ЩЕЛЬ» установить на табло показание от 0,5 до 5,0. Через 10 с
нажать клавишу «К(1)». (Если показание будет > 5,0 высветится индекс П);
4) нажать клавишу «D(5)». Если появилось другое значение, ещѐ раз
ввести значение сигнала сравнения, нажав клавишу «К(1)»;
5) нажать клавишу «Ц/Р». Справа от табло должно наблюдаться
свечение индикатора режима «Ц»;
6) нажать клавишу «D(5)». Установить поочерѐдно на пути потока
излучения анализируемые растворы, перемещая каретку. При появлении
показания, которое отличается от предыдущего не более чем на 0,001, снять
показание с табло;
7) закрыть шторку, установить на пути света раствор сравнения (47);
8) нажать клавишу «ПУСК», далее установить нужную длину волны
или другие образцы и повторять пункты 3-6 [6].
2.2.5 Метод определения биологической ценности белков по расчетному
показателю КЭБ
Биологическая ценность белка определяется присутствием в оптимальных
соотношениях всех аминокислот, в особенности незаменимых. Если белок не
содержит в достаточном количестве хотя бы одной незаменимой аминокислоты,
то такой блок считается неполноценным в питательном отношении, т.к. он не
может обеспечить нормальный белковый обмен организма человека.
43
Аминокислотный состав белков меняется в широких пределах. Особенно
значительны эти различия у белков растительного и животного происхождения.
Белки
растительного
происхождения
бедны
лизином,
серосодержащими
аминокислотами, треонином, триптофаном. Аминокислотный состав животных
белков близок к аминокислотному составу белков человека. Они содержат
достаточное количество незаменимых аминокислот и, поэтому, являются
полноценными белками.
Для определения биологической ценности белков разработаны химические
и биологические методы. Биологическими методами целесообразно оценивать
готовые белковые продукты, при этом учитывается биологическая ценность
суммарных белков, входящих в продукт.
Все возрастающая тенденция использования новых источников белка на
пищевые цели ставит задачу быстрого определения биологической ценности
отдельных белков при многовариантном планировании белковых смесей, не
прибегая к эксперименту на животных. В этих случаях чаще всего используют
химический метод аминокислотных шкал или химических скоров. Он основан на
сравнении аминокислотного состава изучаемого белка с аминограммой
эталонного образца (белок ФАО) или высококачественного белка яйца, молока.
Биологическая
ценность
испытуемого
белка
определяется
по
первой
лимитирующей аминокислоте. В эталонном белке химический скор каждой из
8 незаменимых аминокислот принимается за 100%.
Метод химических скоров дает возможность в первом приближении
установить вероятную эффективность утилизации исследуемого белка или
белкового продукта. Однако этот метод предполагает 100%-ную усвояемость
каждой незаменимой аминокислоты. Но доступность аминокислот для усвоения
зависит от многих факторов и, прежде всего, от степени их высвобождения из
белков в пищеварительном тракте.
Таким образом, степень утилизации белка организмом зависит от
соотношения содержания в нем аминокислот, в первую очередь, незаменимых, и
44
от степени их высвобождения из белка (перевариваемость). Степень утилизации
белков биологическими методами при технологических исследованиях обычно
определяют ростовым методом по коэффициенту эффективности белка (КЭБ или
PER). Сравнение производят со стандартным белком, в качестве которого
применяют казеин. КЭБ казеина равен 2,5 [11].
Хсью с соавторами предложил расчетный метод определения КЭБ,
объединив этапы расчета аминокислотных чисел (химических скоров) и степень
перевариваемости белков. Хсью исходит из того, что на биологическую
ценность белка влияет только недостаток той или иной незаменимой
аминокислоты, поэтому вводят поправочные коэффициенты на те незаменимые
аминокислоты, химический скор которых меньше 100. Но хорошо известно, что
чрезмерный избыток любой незаменимой аминокислоты приводит также к
понижению биологической ценности белка в целом. В полноценных белках
молока, мяса, яиц максимальные значения химических скоров не превышают
150, в то же время белки из новых источников, вовлекаемых в пищу, могут
характеризоваться значительным дисбалансом аминокислот. В связи с этим
предлагается модификация расчетного метода определения КЭБ, учитывающую
введение поправочных коэффициентов и для тех незаменимых аминокислот,
химический скор которых превышает 150 [24].
2.2.5.1. Определение степени переваривания белков ускоренным методом
Степень переваривания белков (СПБ) характеризует скорость атакуемости
белков ферментами желудочно-кишечного тракта – пепсином и трипсином. В
эксперименте моделируются условия пищеварительного тракта. Классической
является методика определения перевариваемости по Покровскому и Ертанову.
Существует и ускоренный метод определения СПБ. Степень переваривания
белка выражают как отношение белка переваренного к общему содержанию
белка в продукте. Известно, что содержание белка определяется через
содержание в нем азота, поэтому формула 2.3 примет вид:
45
(2.3)
где
– это количество азота в непереваренной части белка,
– это общее количество азота в белке пробы.
Содержание азота переваренной части белка определяется как разница
между общим азотом и азотом в остаточной, непереваренной части белка
(формула 2.4):
(2.4)
Определение азота общего и азота непереваренного белка проводят
методом минерализации пробы реактивом Неслера (п. 2.2.2.) [11].
2.2.5.2 Расчет коэффициента эффективности белка (КЭБ)
Содержание незаменимых аминокислот в исследуемом белке вносят в
таблицу 2.4.
Таблица 2.4 – Содержание незаменимых аминокислот в исследуемом белке [11]
Наименование
аминокислоты
Содержание в г/100 г белка
Белок ФАО
Исследуемый белок
Устанавливают химический скор каждой незаменимой аминокислоты
(НАК) с учетом степени переваривания белка по формуле 2.5:
(2.5)
46
где
– это незаменимая аминокислота в исследуемом образце,
– это такая же незаменимая кислота в эталонном белке (ФАО),
Х – степень перевариваемости исследуемого белка, в %.
Придают вес каждому значению НАК %, пользуясь приведенной ниже
таблицей 2.5 коэффициентов (у).
Таблица 2.5 – Значения коэффициентов (у) [11]
НАК, %
100
99-91
90-81
80-71
70-61
60-51
50-41
40-31
30-21
20-11
10-0
Коэффициент (у)
1
2
2,83
4
5,66
8
11,31
16
22,63
32
45-25
НАК, %
100-150
151-200
201-250
251-300
301-350
350
По данным расчета по формуле (5) и таблицы 2.5 устанавливают «вес» для
каждого значения скора и сумму веса «у».
Вычисляют «ассоциируемый вес» и находят его сумму «х».
Ассоциируемый вес:
 для НАК от 100 до 150% равен 0,01;
 НАК 100% ассоциируемый вес равен (1/НАК %) у;
 НАК 150% ассоциируемый вес равен (у /НАК %), где у – коэффициента
пересчета (из таблицы 2.5).
Находят отношение суммы веса «у» к сумме ассоциируемого веса «х» для
исследуемых образцов.
Вычисляют отношение счета НАК исследуемого образца к казеиновому
стандарту по формуле 2.6:
47
,
где
(2.6)
– это счет НАК исследуемого образца,
– это счет НАК казеинового образца.
Расчет КЭБ ведут по формуле 2.7:
КЭБр = -2,1074 + 7,1312·(ОКС) – 2,5188·(ОКС),
(2.7)
где ОКС – отношение счета НАК исследуемого образца к счету
НАК казеинового стандарта,
-2,1074; 7,1312; 2,5188 – это коэффициенты пересчета [11].
2.2.6 Метод фотометрического определения количества пигментбелкового комплекса фикоцианина С
Фикоцианин является одним из ряда флуоресцентных пигментов,
известных как фикобилипротеины, которые продуцируются красными и синезелеными водорослями (цианобактериями). В цианобактериях этот пигмент
доминирующий.
Флуорофорной
группой
фикоцианина
является
фикоцианобилин, который ковалентно связан с белковой молекулой.
Фикоцианин С является одной из основных форм фикоцианинов и может
легко связываться с биологически активными молекулами белками, ферментами,
нуклеиновыми кислотами, полипептидными гормонами и т.д. Это свойство
позволяет использовать фикоцианин С в иммунологии, диагностической
медицине, жидкостной хроматографии. Этот краситель находит применение в
качестве поверхностной флуоресцентной метки антител, в особенности
моноклональных.
Фикоцианин С получают в виде индивидуального вещества, а также в виде
конъюгатов с авидином и биотином. Кроме того, величина квантового выхода
(около 100%) позволяет использовать фикоцианин С в качестве лазерного
48
красителя в длинноволновой части спектра (максимум поглощения 630 нм,
максимум испускания 635 нм). С другой стороны, микроводоросль Spirulina
platensis, чаще всего используемая в качестве источника фикоцианинов, является
нетоксичной и находит применение в пищевой промышленности. Это позволяет
рассматривать фикоцианин С также в качестве известного пищевого красителя и
рекомендовать для использования в косметике и парфюмерии [6, 8].
В качестве объекта исследования была выбрана биомасса спирулины
пищевой Spirulina platensis, произведенная в экспериментальном лабораторном
фотобиореакторе на базе лаборатории Института естественных наук и
биотехнологии
ФГБОУ
ВО
«Орловский
государственный
университет
им. И.С. Тургенева».
Выполнение опыта. В чистый сухой химический стакан помещается
навеска биомассы цианобактерии Spirulina platensis (10 г), далее приливается
250 мл ацетона и перемешивается на магнитной мешалке при комнатной
температуре 3 часа. По истечению установленного времени, клетки отделяют
центрифугированием при 10 000 g в течении 15 минут.
Центрифугат сливают, остаток (6,8 г) после обезжиривания переносят на
пористый фильтр с размером пор 0,2 мкм и промывают 680 мл (100-кратный
объем) дистиллированной воды.
Учитывая полярный характер фикоцианина, для целей экстракции
предложено использовать дистиллированную воду. Поэтому 1 г обезжиренной
пробы суспендируют в 20 мл дистиллированной воды, обрабатывают
ультразвуком в течение 25 мин и отделяют центрифугированием при 10 000 g в
течении 15 минут. 5 мл полученного экстракта, представляющего собой водный
раствор фикоцианина С, переносят в мерную колбу на 25 мл, доводят объем до
метки дистиллированной водой, перемешивают и измеряют оптическую
плотность полученного испытуемого раствора.
Определение максимума поглощения водного раствора фикоцианина.
Полученный водный раствор фикоцианина помещают в кювету с толщиной
49
поглощающего слоя 10 мм и измеряют на приборе СФ-46 при разных длинах
волн. В качестве раствора сравнения используют дистиллированную воду.
По полученным результатам строят график спектра поглощения водного
раствора фикоцианина. По графику определяют максимальное значение в
спектре видимого света, которое используют для определения процентного
содержания фикоцианина в биомассе спирулины.
Содержание фикоцианина в пересчете на абсолютно сухое сырье в %
вычисляют по формуле 2.8:
,
где
D
–
оптическая
плотность
(2.8)
испытуемого
раствора
(максимум поглощения);
m – навеска сырья, г;
8,97 – удельный показатель поглощения фикоцианина при длине
волны 630 нм [18].
2.2.7 Метод определения общего содержания липидов
(Метод Сокслета)
Природные жиры и масла являются сырьем для производства жидких
масел, специальных жиров (шортенингов) и фритюрных жиров), маргаринов и
других масложировых продуктов. Жиры и масла играют роль физиологически и
технологически
функциональных
ингредиентов
в
пищевых
продуктах,
изготавливаемых предприятиями пищевой промышленности, ресторанного
бизнеса и в домашних условиях.
Причиной широкого использования жиров и масел стали их уникальные
свойства. Эти ингредиенты:
 являются носителями вкуса и аромата;
 обеспечивают смазывающее действие;
50
 формируют приятную текстуру, т. е. ощущение во рту;
 способствуют быстрому насыщению;
 являются наиболее важным источником энергии (9 ккал/г);
 многие из них содержат незаменимые жирные кислоты, которые не
вырабатываются в человеческом организме.
Все пищевые жиры и масла являются нерастворимыми в воде веществами,
состоящими преимущественно из эфиров глицерина и жирных кислот, или
триглицеридов
(рисунок
2.3),
с
примесями
сопутствующих
веществ,
присутствующих в малых или следовых количествах.
Рисунок 2.3 – Структура триглицеридов (радикалы R1, R2 и R3 жирных
кислот могут быть различны)
Термины «жиры» и «масла» используются как равнозначные, выбор
термина обычно основан на физическом состоянии материала при комнатной
температуре и определяется традицией. Обычно жиры при комнатных
температурах находятся в твердом состоянии, а масла – в жидком.
Химический состав жира определяет его характеристики и, следовательно,
пригодность для применения в различных процессах и продуктах.
Жиры и масла в пищевых технологиях контролируют для выяснения
следующих обстоятельств:
 определение содержания жира в сырьё или пищевых продуктах;
 определение характерных температур жира;
 изучение химического состава жира [24].
51
Характеристика растворителей. Жиры в воде не растворяются. Для
количественного определения жиров используется их свойство экстрагироваться
органическими растворителями. При экстракции извлекаются не только
собственно жиры, но и фосфолипиды (главным образом лецитины), пигменты,
воски, свободные жирные кислоты и ряд других веществ. Поэтому остаток после
удаления растворителя называется сырым жиром.
В качестве растворителя чаще всего применяют серный (этиловый) эфир
С2Н5-О-С2Н5, имеющий самую низкую температуру кипения (≈35 °С), что
позволяет ускорить процесс экстракции и последующего удаления эфира. К
недостаткам серного эфира относится его способность растворять воду (до 8%) и
растворимые в воде вещества, что является главной причиной завышенных
результатов анализа. Поэтому перед экстракцией необходимо высушивать эфир
и анализируемый материал. Эфир не должен содержать примесей спирта.
Петролейный эфир (смесь легких алифатических углеводородов (пентанов
и гексанов)) имеет более высокую температуру кипения (50…80 °С), но он не
извлекает воду и в меньшей степени извлекает сопутствующие вещества. Кроме
этих растворителей применяют хлороформ (t кип = 61,2 °С), тетрахлоруглерод
(t кип = 76,5 °С), бензол (t кип = 80,3 °С).
Полнота извлечения жиров зависит от тонкости помола материала: она тем
выше, чем тоньше измельчен материал. Следует иметь в виду, что окисленные
жиры трудно растворяются и результаты получаются заниженными. Поэтому
при высушивании материала перед экстракцией нельзя допускать перегрева
(температура около 60…80 °С) или проводить сушку под вакуумом [27].
Метод Сокслета. Метод основан на извлечении жира эфиром с
последующим удалением эфира и взвешиванием сырого жира (поскольку вместе
с жиром экстрагируются фосфолипиды, пигменты, воски, свободные жирные
кислоты, органические кислоты). Извлечение жира ведется в аппарате Сокслета,
показанном на рисунке 2.4.
52
Рисунок 2.4 – Аппарат Сокслета: 1 – приёмная колба; 2 – экстрактор; 3 –
холодильник; 4 – сифонная трубка; 5 – трубка для поступления паров
растворителя из колбы в экстрактор
В методике Сокслета решающее значение имеет частота переливаний
эфира. При анализе пшеничной муки достаточно 20...24 переливаний.
При исследовании биомассы цианобактерий или микроводорослей,
содержащей
в
основном
протеин,
экстракция
длится
1,5 - 2 часа. Частоту переливаний регулируют температурой водяной бани.
Окончание экстракции определяют по отсутствию жирного пятна на кусочке
фильтровальной бумаги или предметного стекла, смоченного каплей эфира из
экстрактора.
Содержание сырого жира (в % на сухое вещество) вычисляют по формуле
2.9:
,
где
– масса колбы с сырым жиром, г;
– масса пустой колбы, г; m0 – масса навески продукта, г;
W – влажность продукта, % [11].
(2.9)
53
2.2.8 Методика получения чистой культуры и поддержания
жизнеспособности штамма Arhrospira Platensis при помощи лабораторной
установки – фитоинкубатора
Одной из важнейших задач в биотехнологии при культивировании
микроорганизмов является получение чистых культур микроорганизмов, а также
поддержание жизнедеятельности штаммов, исключая попадание посторонних
контаминантов. При работе с микроорганизмами на первоначальном этапе часто
возникают проблемы выделения чистой культуры из природной среды.
Получение чистой культуры сопровождается многократными пересевами на
питательные среды, что усложняет данный процесс.
Известно [24], что при работе с фотосинтезирующими микроорганизмами,
регулирование их жизнедеятельности (темпа роста, биохимического состава)
возможно не только посредством модификации питательной среды, но и путем
изменения
спектрального
состава
освещения.
Это
дает
возможность
использовать указанное свойство при получении новых штаммов и чистых
культур.
С целью изучения влияния электромагнитного излучения на интенсивность
роста
цианобактерии
Spirulina
Platensis
[5],
и
угнетение
посторонних
цианобактерий и микроводорослей в суспензии, была проведена серия опытов.
Эксперимент осуществляли в условиях кафедры «Промышленная химия и
биотехнология» ФГБОУ ВО «ОГУ им. И.С. Тургенева», г. Орел в течении
двенадцати суток. При этом использовали фитоинкубатор (рисунок 2.5),
представляющий собой нагревающуюся панель из светодиодных лент марки
Epistar (Китай), со стеклянной панелью для чашек Петри с культурой
микроорганизмов.
Стеклянную
панель
можно
перемещать
по
высоте
относительно светодиодной панели. Это позволяет регулировать температуру и
интенсивность освещения, что в свою очередь оказывает влияние на скорость
роста микроорганизмов на питательной среде.
54
Рисунок 2.5 – Фотография фитоинкубатора
2.2.9. Метод приготовления агаризованной синтетической среды для
хранения чистой культуры цианобактерии Arhrospira Platensis в
фитоинкубаторе
Накопительные культуры являются только первым шагом в процессе
выделения
чистых
культур.
Они
являются
результатом
обогащения
питательными веществами образца с водорослями. В качестве обогащающих
субстанций
используют
макроэлементы
(нитраты,
питательные
аммоний
и
среды,
фосфаты),
почвенную
а
в
вытяжку,
ряде случаев
и
микроэлементы.
В данном случае была использована специализированная питательная
среда Заррука для получения накопительной культуры цианобактерий рода
Spirulina (таблица 2.6) [26].
55
Таблица 2.6 – Состав питательной среды Заррука [8]
Раствор
Масса, г/л
16,8
1,0
2,5
1,0
1,0
0,2
0,04
1,0 мл
1,0 мл
1,0 мл
12,0
до 1 литра
NaHCO3
K2HPO4×3H2O
NaNO3
K2SO4
NaCl
MgSO4×7H2O
CaCl2×2H2O
Fe+EDTA
Раствор микроэлементов 1
Раствор микроэлементов 2
Агар-агар
Вода дистиллированная
Рекомендуется готовить среду из готовых растворов. Все растворы должны
быть стерильными, смешивать их необходимо в стерильных условиях в
ламинаре. Растворы 1 и 2 должны быть простерилизованы автоклавированием,
микроэлементы и раствор Fe + EDTA стерилизуют фильтрацией через фильтр с
диаметром пор 0,22 мкм (таблица 2.7).
Таблица 2.7 – Последовательность внесения компонентов питательной среды
Заррука [8]
Раствор
Раствор 1
Раствор 2
Fe+EDTA
Раствор микроэлементов 1
Раствор микроэлементов 2
Норма внесения компонента в мл на 1
л среды
200
800
1
1
1
Таблица 2.8 – Нормы приготовления раствора 1 [8]
Компонент среды
NaHCO3
K2HPO4x3H2O
Норма внесения компонента в г на
200 мл воды
16, 8
1
56
Таблица 2.9 – Нормы приготовления раствора 2 [8]
Компонент среды
NaNO3
K2SO4
NaCl
MgSO4x7H2O
CaCl2x2H2O
Норма внесения компонента в г на
800 мл воды
2,5
1
1
0,2
0,04
Приготовление специального раствора FeSO4 и ЭДТА: В 134 мл 1N KOH
растворить 30,2 г EDTA. Раствор разбавить водой, внести 24,9 г FeSO4×7H2O и
долить водой до 1 литра. Продуть раствор воздухом без CO2 в темноте в течение
12 часов.
Таблица 2.10 – Нормы приготовления раствора микроэлементов 1 [8]
Компонент среды
H3BO3
MnCl2×4H2O
ZnSO4×7H2O
CuSO4×5H2O
MoO3
Норма внесения компонента в г на 1
л воды
2,86
1,81
0,22
0,08
0,015
Таблица 2.11 – Нормы приготовления раствора микроэлементов 2 [8]
Компонент среды
NH4VO3
K2Cr2 (SO4)4×24H2O
NiSO4×7H2O
Na2WO4×2H2O
Ti2(SO4)3
Норма внесения компонента в г на 1
л воды
0,023
0,096
0,048
0,018
0,040
57
2.2.10 Метод получения биомассы цианобактерии Spirulina Platensis с
повышенным содержанием липидов
При культивировании автотрофных микроорганизмов клетки необходимо
снабжать достаточным количеством света, углекислого газа, минеральными
веществами,
а
также
создавать
необходимый
температурный
режим
и
поддерживать рН среду. Существует метод культивирования Chlorella vulgaris в
закрытом циркулирующем фотобиореакторе, позволяющий получить биомассу
микроводорослей
с
полиненасыщенных
высоким
жирных
содержанием
кислот,
в
том
масла,
числе
состоящего
и
из
незаменимых
–
ряда омега-3 [1]. Нами за основу была взята данная технология для получения
нового источника пищевых масел с высоким содержанием омега-3 из
цианобактерии Spirulina Platensis.
В
фотобиореакторе создаются оптимальные условия культивирования:
температура,
освещение,
питательная
среда,
подача
углекислого
газа.
Подбираются стрессовые условия для выращивания микроводорослей с высоким
содержанием липидов.
Извлечение липидов из биомассы микроводорослей осложняется наличием
плотной, твердой оболочки у хлореллы, что усложняет процесс производства.
Поэтому более перспективным микроорганизмом-продуцентом липидов может
являться цианобактерия Spirulina Platensis, которая не имеет прочной клеточной
стенки.
Технология получения растительного масла из микроводорослей состоит
из следующих этапов: культивирование микроорганизмов в фотобиореакторе,
разрушение клеточной оболочки, экстракция
растительного сырья, отгон
растворителя, получение масла.
Методика
осуществляется
исследований.
в
Культивирование
циркулирующем
микроводорослей
фотобиореакторе.
Культиватор
изготавливается из прозрачного стекла в виде цилиндрической емкости. В
реакторе создаются оптимальные условия культивирования для накопления
58
биомассы: питательная среда, характерная для каждого отдельного вида
микроводорослей, температура поддерживается на уровне 34-36 °С, освещенность
550 лк, осуществляется перемешивание суспензии, рН также поддерживался
индивидуально для каждого вида. Посевной материал для фотобиореактора
составляет 25 % от общего объема. Фотопериод составляет 24 часа [1,4].
С
целью
(триацилглицеридов)
увеличения
содержания
создаются специальные
в
клетках
стрессовые
липидов
условия
в
фотобиореакторе: снижение концентрации азотных компонентов, увеличение
интенсивности освещения до 2500 люкс.
Микроводоросли и цианобактерии активно реагируют на концентрацию
биогенных элементов в суспензии, изменяя биохимический состав клеток;
содержание основных компонентов клеток (белки, углеводы, липиды) могут
меняться в широких пределах.
Недостаток азота вызывает значительное уменьшение урожая биомассы
и содержание зольных веществ в ней. Резко увеличивается средний сухой вес
клетки, а в органическом веществе уменьшается содержание хлорофилла и белка,
увеличивается количество углеводов и липидов [4].
Необходимо отметить, что изменяя состав питательной среды, можно
получать продукт желаемого состава с различным соотношением белков и жиров.
Так, на среде богатой азотом, микроводоросли могут накапливать от 40 до 70%
сырого протеина и 5% жира, а при недостатке азота и избытке углерода в
питательной среде, наоборот, – 70% жира и 5% протеина.
Glacio S. Araujo и другие изучали создание стресса при культивировании
Chlorella vulgaris с помощью добавления в питательную NaCl. В результате было
определено, что содержание NaCl в культуральной среде имеет большое влияние
на количество производимой биомассы и на количество липидов [4,9].
59
ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ И ИХ АНАЛИЗ
3.1 Определение влажности навески исследуемого образца
Массовую долю влаги в исследуемом материале рассчитывают методике,
представленной в п.2.2.1, по формуле (2.1):
= 13, 5281 г;
= 14, 5183 г;
= 14, 4434 г.
Средняя величина массовой доли влажности исследуемой биомассы
цианобактерии Spirulina Platensis равна 7,5%.
3.2 Количественное определение белка по общему азоту с реактивом
Неслера
Выполнение опыта. В чистую, сухую колбу Кьельдаля помещают навеску
исследуемого материала массой 0,2-0,3 г (m3), взвешенную с точностью до
0,001 г, осторожно приливают около 10 мл концентрированной серной кислоты
и затем медленно при небольшом перемешивании – 1-2 мл концентрированной
перекиси водорода. При этом происходит интенсивное обугливание озоляемого
материала. Затем в колбу вносят на кончике шпателя небольшое количество
(около 0,01 г) селена. Колбу закрывают стеклянной воронкой для конденсации
выделяющихся при озолении паров серной кислоты, устанавливают в наклонном
положении на электрическую плитку и нагревают до получения прозрачного
бесцветного раствора (в процессе озоления следует периодически поворачивать
колбу).
Полученный раствор охлаждают и количественно переносят в колбу
объемом 500 мл, несколько раз ополаскивая колбу Кьельдаля дистиллированной
водой. Объем раствора в колбе после охлаждения доводят до метки
дистиллированной водой (V4 ). Кислотность полученного раствора определяют
60
путем титрования аликвот объемом 10 мл 1 н раствором гидроксида натрия в
присутствии фенолфталеина. Следующие операции проводят в нескольких
повторностях.
Для определения концентрации ионов аммония 10 мл (V5) полученного
после озоления раствора с помощью пипетки Мора переносят в мерную колбу
объемом 100 мл, приливают дистиллированную воду до 70 мл, определенное
методом алкалиметрического титрования количество 1 н раствора NaOH, 4 мл 25
%-ного раствора сегнетовой соли и, после перемешивания, 4 мл реактива
Несслера. Объем в колбе доводят до метки дистиллированной водой, тщательно
перемешивают и после 15-минутного выдерживания определяют оптическую
плотность окрашенного раствора на спектрофотометре или ФЭКе при длине
волны 430 нм относительно холостого раствора, полученного разбавлением
дистиллированной водой 4 мл реактива Несслера в мерной колбе объемом 100
мл. По величине оптической плотности с помощью калибровочного графика
определяют массу азота в растворе (m4). Массовую долю белка в исследуемом
объекте X 2 , в %, рассчитывают по формуле (2.2):
m4 = 0,45 мг;
= 7,5%; К = 6,37
= 52%;
3.2.1 Построение калибровочного графика для определения
аммонийного азота по Неслеру
Для построения калибровочного графика готовят рабочий стандартный
раствор
(NH4)2SO4
растворением
навески
химически
чистой
перекристаллизованной соли массой 0,38 г, взятой с точностью до 0,001 г, в
дистиллированной безаммиачной воде в мерной колбе объемом 1 л. Исходя из
массы навески, рассчитывают концентрацию азота N c , в мг/мл. В мерные колбы
объемом 100 мл из бюретки наливают 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 мл рабочего
стандартного раствора (NH4)2SO4 и проводят все операции в соответствии с
61
описанной выше процедурой (исключая внесение 1 н раствора NaOH). Во всех
приготовленных растворах проводят определение оптической плотности через
15 минут после прибавления реактива Несслера. Данные для построения
калибровочного графика приводят в таблице 3.1, калибровочный график
изображен на рисунке 3.1.
Таблица 3.1 – Данные для построения калибровочного графика
Масса навески (NH4)2SO4, г
0,19
0,08
, мг/мл
Объем
рабочего
стандартного
0,5
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
раствора (NH4)2SO4
Масса азота в колбах, мг
0,04 0,08 0,16 0,24 0,32
0,4
Оптические плотности растворов
0,046 0,125 0,266 0,421 0,568 0,685
оптическая плотность А
0,8
0,7
y = 1,7972x - 0,0196
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
масса азота в колбах, мг
Рисунок 3.1 – Калибровочный график зависимости оптической плотности от
массы азота (мг) в измеряемых растворах.
Все результаты эксперимента заносят в таблицу 3.2.
62
Таблица 3.2 – Результаты проведенного эксперимента
Исследуемый
материал
Спирулина
Концентрация азота
Массовая доля белка в
в растворе,
исследуемом материале, %,
Массовая
определенная с
определенная
доля влаги,
помощью
%
калибровочного
ЭксперименПо справ.
графика
тально
данным
7,5
0,45
52,0
70,0
В ходе проведения эксперимента было выяснено, что исследуемая
биомасса спирулины, полученная в условиях кафедры промышленной химии и
биотехнологии ФГБОУ ВО «ОГУ им. И.С. Тургенева», имеет 52% белка в
пересчете на абсолютно сухое вещество. По литературным данным количество
белка может достигать 70%. Такая разница между полученным результатом и
справочными данными может заключаться в разных условиях культивирования
микроорганизмов. Биохимический состав микроводорослей и цианобактерий
может значительно меняться от состава питательной среды, температуры,
интенсивности освещения и спектрального состава света.
3.3 Определение биологической
ценности белков по расчетному показателю КЭБ
3.3.1 Определение азота непереваренного
Берут в пробирку 0,1 г тщательно гомогенизированного продукта,
добавляют 7,5 мл 0,1 н HCl и 45 мг кристаллического пепсина. Помещают в
термостат при температуре 37 0С и инкубируют 1 час при постоянном легком
встряхивании. Затем к содержимому приливают 7,5 мл 20% трихлоруксусной
кислоты (ТХУ) и центрифугируют. Надосадочную жидкость сливают, а осадок
разводят в 5 мл фосфатного буфера (рН = 8), добавляют 15 мг кристаллического
трипсина и вновь ставят в термостат при тех же условиях на 6 часов. Затем
осаждают непереваренные белки равным объемом 20% ТХУ, содержимое пробы
63
центрифугируют и в осадке определяют содержание непереваренного азота
методом минерализации пробы по Кьельдалю с реактивом Неслера (п. 3.2).
3.3.2 Определение непереваренного азота методом минерализации
пробы по Кьельдалю с реактивом Неслера
Для определения содержания непереваренного азота в осадке проводят те
же операции, что описаны в пунктах 3.1 и 3.2.
Массовую долю белка в исследуемом осадке
, в %, рассчитывают по
формуле 2.3.
m4 = 0,18 мг;
= 65%; К = 6,37
= 21,2%;
Исходя из полученных данных видно, что количество сырого протеина
уменьшилось в два раза после обработки протеолитическими ферментами.
3.3.3 Определение степени переваривания белков
ускоренным методом
В эксперименте моделируются условия пищеварительного тракта (п. 3.3.1).
= 0,45 мг,
= 0,07 мг.
Степень переваривания протеина цианобактерии Spirulina Platensis равна
84,4%, что на порядок выше, чем у растительных белков (например: степень
переваривания соевого белка = 75%).
64
3.3.4 Расчет коэффициента эффективности белка (КЭБ)
Содержание незаменимых аминокислот в исследуемом белке вносили в
таблицу 3.3.
Таблица 3.3 – Содержание незаменимых аминокислот в исследуемом белке
Наименование
аминокислоты
Лизин
Треонин
Метионин+цистеин
Валин
Изолейцин
Лейцин
Тирозин+фенилаланин
Триптофан
Содержание в г/100 г белка
Белок ФАО
Белок Spirulina Platensis
5,5
3,0
4,0
5,0
3,5
1,8
5,0
3,5
4,0
3,2
7,0
8,5
6,0
5,4
1,0
1,1
Устанавливают химический скор каждой незаменимой аминокислоты
(НАК) с учетом степени переваривания белка по формуле 2.5:
= 3,0,
лизина
лизина = 5,5, Х = 84,4%.
Данные всех расчетов приводят в таблице 3.4
Таблица 3.4 – Значения химических скоров незаменимых аминокислот
Наименование аминокислоты
Лизин
Треонин
Метионин+цистеин
Валин
Изолейцин
Лейцин
Тирозин+фенилаланин
Триптофан
НАК, % для белка Spirulina Platensis
46,03
105,5
43,4
59,08
67,52
102,5
76,0
50,64
65
Придают вес каждому значению НАК %, пользуясь приведенной выше
таблицей 2.5 коэффициентов (у), и все данные заносят в таблицу 3.5
Таблица 3.5 – «Вес» незаменимых аминокислот
Наименование
аминокислоты
Лизин
Треонин
Метионин+цистеин
Валин
Изолейцин
Лейцин
Тирозин+фенилаланин
Триптофан
Сумма весов:
«Вес» НАК, % (у)
Ассоциируемый вес (х)
11,31
1
11,31
8
5,66
1
4
8
50,28
0,25
0,01
0,26
0,14
0,08
0,01
0,05
0,14
0,94
Вычисляют отношение счета НАК исследуемого образца к казеиновому
стандарту по формуле (2.6):
= 53,5
= 88,72
= 0,6
Расчет КЭБ ведут по формуле (2.7):
КЭБр = -2,1074 + 7,1312•0,6 – 2,5188•0,6 = 0,7
Коэффициент эффективности исследуемого белка цианобактерии Spirulina
Platensis составил 0,7, что говорит оплохой усвояемости белка организмом, по
сравнению с казеином, КЭБ которого равен 2,5. Следовательно, биомассу
цианобактерии
нецелесообразно
использовать
в
качестве
единственного
источника кормового белка в кормлении сельскохозяйственных животных.
66
3.4 Количественное определение пигмент-белкового комплекса
фикоцианина в сухой биомассе микроводоросли спирулины
3.4.1 Определение максимума поглощения водного раствора
фикоцианина
Полученный водный раствор фикоцианина помещают в кювету с
толщиной поглощающего слоя 10 мм и измеряют на приборе спектрофотометре
КФК-2 при разных длинах волн. В качестве раствора сравнения используют
дистиллированную воду. Результаты эксперимента заносят в таблицу 3.7.
Таблица 3.7 – Определение максимального спектра поглощения раствора
фикоцианина
Длина волны
240
280
320
360
400
440
460
500
540
560
600
640
660
700
Оптическая плотность раствора
2,758
2,112
0,577
0,320
0,258
0,254
0,190
0,178
0,250
0,341
0,479
0,498
0,256
0,114
По полученным результатам строят график спектра поглощения водного
раствора фикоцианина (рисунок 3.2). По графику определяют максимальное
значение в спектре видимого света, которое используют для определения
процентного содержания фикоцианина в биомассе спирулины.
67
Оптическая плотность
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
240
360
460
560
660
Длина волны, нм
Рисунок 3.2 – График спектра поглощения водного раствора фикоцианина
Содержание фикоцианина в пересчете на абсолютно сухое вещество в %
вычисляют по формуле 2.8:
,
Результаты эксперимента заносят в таблицу 3.8.
Таблица 3.8 – Результаты эксперимента по количественному определению
фикоцианина в биомассе цианобактерии спирулины
Исследуемый
материал
Спирулина
Оптическая
Массовая
Длина
плотность
доля
волны,
исследуемого
влаги, %
нм
раствора
7,5
0,498
630
Содержание
фикоцианина, %
опыт
6,0
по справ.
данным
5,57-10,05
В ходе эксперимента определено, что спектр поглощения водного раствора
фикоцианина наряду с коротковолновым максимумом, имеет и длинноволновой
максимум поглощения (630 нм), характерный для фикоцианина. Следовательно,
68
для количественного определения фикоцианина может быть использован метод
спектрофотометрии в качестве аналитической длины волны 630 нм.
Результаты
статистической
обработки
проведенных
опытов
свидетельствуют о том, что содержание фикоцианина в биомассе спирулины
достигает 6%, что соответствует справочным данным, по которым процент
фикоцианина в биомассе исследуемой цианобактерии варьируется от 5,57 до
10,05.
3.5 Определение общего содержания липидов
(методом Сокслета)
Содержание сырого жира вычисляют по формуле 2.9:
Определение влажности исследуемого образца проводят по методике,
описанной в пункте 3.1
= 116,7266,
= 116,6810,
= 5 г, W = 6,85%.
Общее содержание липидов в пробе на сухое вещество составляет 1%.
3.6 Получение чистой культуры и поддержания жизнеспособности
штамма Arhrospira Platensis при помощи лабораторной установки –
фитоинкубатора
С
целью
изучения
влияния
электромагнитного
излучения
на
интенсивность роста цианобактерии Spirulina Platensis, и угнетение посторонних
цианобактерий и микроводорослей в суспензии, была проведена серия опытов.
Посевной материал (рисунок 3.3) вносили на плотную агаризованную
стандартную среду Заррука. Четыре пронумерованные чашки Петри (опыт)
ставили в фитоинкубатор и облучали светом с заданным спектральным составом
– 20% от общей мощности излучение с длиной волны 579 нм и 80% - 660 нм, и
69
четыре чашки Петри (контроль) ставили под фитолампу Green-LP FH-B,
(Россия), излучающую в следующем спектральном диапазоне: 40% – 445 нм и
60% – 660 нм.
1
2
Рисунок 3.3 – Микрофотография исходного посевного материала.
1 – Spirulina Platensis, 2 – посторонние цианобактерии). (Увеличение х40)
Определение длины волны излучения осуществлялся на учебном
двухтрубном спектроскопе СМу-1 [19].
Эксперимент проводился в изолированном от внешнего освещения боксе.
Условия микроклимата в контроле и опыте были одинаковы: температура –
23 0С, давление – 715 мм ртутного столба.
Отбор проб проводили через каждые трое суток. С каждой из восьми
чашек Петри снимали пробы для пяти препаратов и исследовали под
бинокулярным микроскопом Levenhuk 850B. Результаты фиксировали, делая
микрофотографии (рисунок 3.4).
70
(а)
(б)
Рисунок 3.4 – Микрофотографии препаратов цианобактерий после
выдержки в течении шести суток (а – под фитолампой, б – в фитоинкубаторе,
увеличение х80)
Согласно источнику [5], определена видовая принадлежность посторонней
цианобактерии. Исходя из фенотипических особенностей и описания характера
поведения, установлено, что цианобактерия принадлежит роду Rivularia
(Ривулария) (рисунок 3.5).
(а)
(б)
Рисунок 3.5 – Микрофотографии цианобактерий (а – типичный
представитель рода Rivularia), (б – исследуемая цианобактерия, увеличение
х110)
71
Полученные результаты показывают, что красное (λ= 660 нм) и желтое
(λ = 579 нм) освещение на начальных этапах культивирования угнетает рост
посторонних цианобактерий на стандартной питательной среде Заррука, не
оказывая особого влияния на динамику роста спирулины. Однако посторонние
фотосинтезирующие микроорганизмы постепенно адаптируются к излучению в
рассматриваемом спектральном диапазоне, о чем говорят дальнейшие анализы
проб, взятых с чашек Петри.
Данное
обстоятельство
соображений.
Спирулина
можно
объяснить,
отличается
исходя
из
высоким
следующих
содержанием
фикобилипротеидов, а именно фикоцианина С (6 % от сухой массы), максимум
поглощения которого 630 нм (п. 3.4) [19]. Поэтому цианобактерия имеет темнозеленый цвет с синим оттенком, и высокую динамику роста при облучении
суспензии электромагнитными волнами длинной 660 нм и 579 нм.
При культивировании спирулины, освещаемой дополнительно синим
светом (λ = 445), в работе было зафиксировано снижение содержания
фикоцианина, участвующего в клетках водоросли в процессе фотосинтеза, по
отношению к остальным светособирающим пигментам. Определение снижения
концентрации фикоцианина в работе осуществляли методом измерения
оптических плотностей водных экстрактов сухой биомассы спирулины.
Цианобактерии, относящиеся к роду Rivularia, имеют светло-зеленый цвет
[19], что указывает на низкое содержание, либо отсутствие фикобилипротеидов.
Это подтверждается снижением скорости роста данных микроорганизмов при
освещении красным (λ = 660 нм) и желтым (λ = 579 нм) светом, и увеличение
динамики роста клеток при дополнительном освещении синим светом с длиной
волны 445 нм. Следовательно, в составе цианобактерий рода Rivularia в большей
степени присутствуют каротиноиды с максимумом поглощения в интервале
400-500 нм, и хлорофиллы с максимумами поглощения 429 и 660 нм. Последнее
объясняет эффект адаптации цианобактерий рода Rivularia при выращивании на
72
стандартной среде Заррука и длительном освещении светом с длиной волны
660 нм.
При выделении чистой культуры цианобактерии спирулины из природных
источников,
содержащих
посторонние
микроводоросли,
лишенные
фикобилипротеидов, целесообразно использовать освещение с длинами волн
579 и 660 нм. Это обеспечивает возможность получения чистых культур
цианобактерий с меньшим количеством пересевов на новые питательные среды,
если отбирать клетки на ранних стадиях культивирования.
3.7 Получение биомассы цианобактерии Spirulina Platensis с
повышенным содержанием липидов
Прежде чем приступить к разработке технологии получения липидов из
биомассы цианобактерии Spirulina Platensis, необходимо ознакомиться с
овновными
этапами
существующих
методов
получения
биомассы
микроводорослей с высоким содержанием неполярных липидов.
Были проведены эксперименты по исследованию влияния
условий
при
культивировании
Chlorella
vulgaris
на
стрессовых
накопление
внутриклеточных нейтральных липидов.
В качестве стрессовых воздействий использовались:
1) добавление в суспензию хлорида натрия в концентрации 2 г/л;
2) повышение уровня освещенности до 32 клк (что соответствует режиму
фотоокислительного стресса);
3) поддержание дефицита азота в питательной среде на уровне 50 мг/л
суспензии.
Количество
липидов
в
клетках
измерялось
каждый
день
(концентрирование биомассы осуществлялось с помощью центрифуги при
3000 об/мин в течение пяти минут). Из полученной сконцентрированной
биомассы
влажностью 90...95% липиды экстрагировались с помощью смеси
нефрас С2 80/120: этанол, взятые в соотношении 1:2.
Создание всех видов
73
стрессовых условий тормозит размножение клеток, концентрация клеток на
седьмые сутки после создания стресса уменьшилась на 26% по сравнению с
контролем.
Дефицит азота вызывал следующие изменения в суспензии штамма
Chlorella vulgaris: цвет суспензии уже на третьи сутки из темно-зеленого стал
бледно-зеленым,
концентрация клеток в суспензии начала уменьшаться
(рисунок 3.6) [4].
а)
б)
Рисунок 3.6 – Реакция штамма на фотоокислительный процесс: а – вторые
сутки стресса, б – пятые сутки стресса
Клетки
увеличились
в
размерах
(рисунок
3.7),
биосинтез
белка
прекратился, клетки начали накапливать запасные питательные вещества в виде
неполярных липидов.
а)
б)
74
Наличие NaCl в концентрации 2 г/л не привело к внешним изменениям
суспензии. Фотоокислительный стресс вызывал появление пены рыжего цвета
(рисунок 3.6).
На четвертые сутки подержания стрессовых условий наибольшая
концентрация
внутриклеточных
липидов
наблюдалась
в
биомассе,
культивируемой в условиях дефицита азота (до 32% от сухого вещества
Концентрация липидов, %
клеток), что в 7 раз выше по сравнению с контрольным образцом (рисунок 3.8).
Время культивирования, сут
Рисунок 3.8 – Динамика накопления липидов после создания стресса:
1– добавлением хлорида натрия 2 г/л; 2 – освещенностью 32 клк;
3 – дефицитом азота; 4 – контроль
Остальные виды стрессовых воздействий привели к незначительному
увеличению содержа-ния липидов по сравнению с контрольным образцом. По
результатам эксперимента можно
сделать вывод, что
для
накопления
внутриклеточных липидов наиболее перспективно создавать стресс с помощью
дефицита азотсодержащих солей [4].
Целью исследования нащих дальнейших работ будет являться определение
оптимальных условий культивирования цианобактерии Spirulina Platensis с
повышенным содержанием липидов для использования их при производстве
пищевой биологически активной добавки омега-3.
75
Выводы по главе 3
1. Определили общее содержание белка Сспирулины по общему азоту с
реактивом Неслера. Анализ показал, что в биомассе цианобактерии Spirulina
Platensis содержится 52% белка. По литературным данным количество белка
может достигать 70%. Такая разница между полученным результатом и
справочными данными может заключаться в разных условиях культивирования
микроорганизмов. Биохимический состав микроводорослей и цианобактерий
может значительно меняться от состава питательной среды, температуры,
интенсивности освещения и спектрального состава света.
2. Сделали анализ справочных данных аминокислотного состава белков
Спирулины, рассчитали аминокислотный скор и коэффициент эффективности
белка.
Коэффициент
эффективности
исследуемого
белка
цианобактерии
Spirulina Platensis составил 0,7, что говорит оплохой усвояемости белка
организмом, по сравнению с казеином, КЭБ которого равен 2,5. Следовательно,
биомассу
цианобактерии
нецелесообразно
использовать
в
качестве
единственного источника кормового белка в кормлении сельскохозяйственных
животных.
3. Определили
общее
содержание
липидов
нативной
биомассы
цианобактерии методом Сокслета. Общее содержание липидов составило менее
1%, что говорит о непригодности использования нативной биомассы в качестве
источника омега-3 жирных кислот.
4. Разработали метод получения биомассы цианобактерии с повышенным
содержанием липидов, взяв за основу технологию получения биотоплива из
биомассы зеленых микроводорослей.
76
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Благодаря харктеным новейшим разработкам, строиельный в настоящее время рынок на Западе ведутся
исследования липдног по использованию недостакми в качестве водрслей кормовой добавки arhospi для животных и
птицы водорослей. Наиболее явлют распространены два курзы вида водорослей – Chlorella этих
vulgaris и Spirulina Platensis. Их неразыво можно включить протеина в рацион для незами того, чтобы пищевой
повысить уровень всемлегкопереваримого белка.
Нами сухи также в рамках затры данной работы была белка исследована возможность конечг
использования биомассы яйценосктьцианобактерии Spirulina Platensis самыйв качестве источника отрых
полноценного белка. Изначально предметом несмотря исследования являлся протеин жирные
биомассы новыхмикроводоросли спирулины.
Но подробно оснвым изучив мировые общег тенденции кормового спобтвуе производства, была биохмческй
принята к сведению полифсатные информация, что мебранх в настоящий момент рамкх у крупных
агропромышленных появилась и животноводческих предприятий (особенно поэтму на территории
России) нет тон острой нужды собщает в альтернативных источниках сниже протеина микробного
происхождения. Наличие создани соевых изолятов таблице и концентратов аминокислот спирулна
удовлетворяет эту последн потребность, а дорогостоящий БАД усвояемти на основе водорослевой котрые
массы пока произастющей остается экономически стандрых нецелесообразной альтернативой корм
растительным и животным втормубелкам.
Также в процессе исследований была выявлена низкая эффективность
белка Спирулины. Это говорит о том, что биомассу цианобактерии использовать
в качестве альтернативы соевым белкам и костной муке в кормлении
сельскохозяйственных животных нецелесообразно. Эффективнее комбинировать
эти добавки, однако будет увеличина себестоимость такого корма, что не
согласуется с политикой современного бизнеса.
Вместе с тем было клетча выяснено, что интесво существует потребность спобтвуе в таких
незаменимых масой кормовых компонентах, чтобы как эссенциальные жирные яйценоскть кислоты
(группы результа омега-3 и омега-6). продажу Поэтому создани нами было линоевая принято решение
исследовать
содержатвозможность
получения
липидов
ограничеых
с
высоким
77
содержанием котрыенезаменимых жирных многкислот типа витамн омега-3 и омега-6 посредством аномлий
разработки технологии, животндсапозволяющей получить протеина высокожирную биомассу если
цианобактерии спирулины. Основ
Известно,
следут
что
характерным
свойством
фотосинтезирующих
харктеным
микроорганизмов является способность к изменению химического состава
клеток в широком диапазоне в зависимости от условий культивирования. Как
уже говорилось выше,
микроводоросли содержат нейтральные и полярные
липиды. Были изучены работы, в которых повествовалось о том, что при
благоприятных условиях микроводоросли производят в основном полярные
липиды (например, фосфолипиды), причем в небольшом количестве.
При ограниченных условиях роста микроводорослей Chlorella vulgaris
накапливаются нейтральные липиды в виде липидных капель в цитоплазме, и
являются основными запасными компонентами клетки. Эти липиды используют
в основном для производства биотоплива.
Изучив литературные данные и патенты, был сделан вывод, что
возможность накопления пищевых липидов клетками цианобактерий рода
Arhtrospira не была подробно исследована. Поэтому, в свете вышеизложенного,
наша дальнейшая работа будет посвящена изучению вероятности получения
липидов с повышенным содержанием незаменимых жирных кислот клетками
спирулины.
78
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Абакумова, И.А., Кондратьев Ю.И., Ушаков А.С. Исследование
кормовой ценности одноклеточных водорослей // Проблемы создания замкнутых
экологических систем. М.: 2002. С. – 60-64.
2. Апдреюк, Е.И., Коптева Ж.П., Занина В.В. Цианобактерии. Киев:
Наукова думка – 2004. – 195 с.
3. Баулина,
О.И.
Ультраструктурная
пластичность
цианобактерий:
Автореф. дисс. докт. биол. наук. М., 2008. С. – 48.
4. Бычков,
В.П.,
Кондратьев
Ю.И.,
Ушаков
А.С.
Исследование
одноклеточных водорослей как возможного источника питания // Управляемый
биосинтез и биофизика популяций. М. – 2005. С. – 114-115.
5. Владимирова, М.Г., Барцевич Е.Д., Жолдаков И.А., Епифанова О.О.,
Маркелова А.Г., Маслова И.П., Купцова Е.С. IPPAS – коллекция культур
микроводорослей Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева АН
СССР // В кн. Каталог культур коллекций СССР. – М.= 1991 C. 8-61.
6. Викторов, В.К. Порядок работы на спектрофотометре СФ-46 /
В.К. Викторов // Аналитическая химия и физико-химические методы анализа:
учеб. пособие / В.К. Викторов. М.: Электрон. – 2010. – 28-34 с.
7. ГОСТ 13586.5-2015 Межгосударственная система стандартизации.
Зерно. Метод определения влажности. – М.: Росстандарт – 2015. – 5 с.
8. ГОСТ
29112-91
Межгосударственная
система
стандартизации.
Минеральные питательные среды. – СПб.: Госстандарт – 2000. – 7 с.
9. Гусев, М.В. Пигменты синезеленых водорослей // Биология синезеленых
водорослей. М.: Изд-во МГУ, 2011. Вып. – 9. С. 88-109.
10. Жгутова, Н.И. Методы контроля жиров / Н.И. Жгутова // Методы
контроля продукции пищевых производств: учеб. пос. / Н.В. Позднякова и др.;
под ред. Н.В. Позднякова. – Харьков: ХТЭИ, 2007. – Гл.9 – С. 256-308.
79
11. Жгутова, Н.И. Способ определения переваримости белков пищевых
продуктов in vitro / Н.И. Жгутова // Методы контроля продукции пищевых
производств: учеб. пос. / Н.В. Позднякова и др.; под ред. Н.В. Позднякова. –
Харьков: ХТЭИ, 2007. – Гл.16 – С. 398-410.
12. Коденцова, В.М., Вржесинская О.А., Бекетова Н.А., Голубев Ф.В.,
Горбунов Ю.Н. Об использовании спирулины в качестве источника витаминов //
Материалы II Росс, науч.-практ. конф. (2-3 июня 2003 г.). М.: Изд-во
РАЕН-МААНОИ, – 2003 – С. 245.
13. Комов, Н.В. Комплексный подход в кормлении сельскохозяйственных
животных // Тамбов: Изд-во ФГБОУ ВПО«ТГТУ», 2015 – С. 6-7.
14. Кордюм, В.А. Перспективы массового выращивания водорослей в целях
получения кормовой биомассы // Управляемый биосинтез. М.: АН СССР,
1992 – С. 61-68.
15. Пахомова,
М.В.
Биохимическое
исследование
некоторых
видов
водорослей // Бюл. МОИП. 2010. Т. 69. Вып. 3 – С. 110-126.
16. Пиневич, B.B., Верзилин Н.Н. (б). Массовая культура одноклеточных
водорослей как возможный перспективный источник кормового и пищевого
белка и витаминов // Тез. докл. II межвуз. науч.-отчет. конф. «Университеты сельск. х-в». Л.: 2002. – С. 261.
17. Проценко Д.Ф., Сиренко Л.А., Богданова Т.Л., Батрак А.П. Пигментные
системы культурных форм синезеленых водорослей // Бот. журн. 2004. – Т. 51. –
С. 820-827.
18. Куркин, В.А. Методика количественного определения фикоцианина в
биомассе
спирулины
пищевой
(Spirulina
Platensis)
/
В.А.
Куркин
//
животных
и
Фундаментальные исследования. – 2013. – №8. – С. 23-27.
19. Васильев,
А.И.
Кормление
сельскохозяйственных
технология кормов: автореф. дис. д-ра с/х наук: 06.02.02 / Васильев Анатолий
Ильич. – М., 2008. 25 с.
80
20. Портал
Soyanews:
[Электронный
ресурс].
– Режим доступа: http://soyanews.info. – Дата доступа: 3.05.18.
21. Макаров, Н.А. Исследоване рынка комбикормов России: [Электронный
ресурс]. - Режим доступа: http://биомедиа.рф. – Дата доступа: 2.05.18.
22. Мечевская,
А.А.
Агробизнес
России:
[Электронный
ресурс].
– Режим доступа: http://www.agbz.ru. – Дата доступа: 2.05.18.
23. Скурихин, И.М. Химический состав пищевых продуктов. Книга 2:
[Электронный
ресурс].
–
Режим
доступа:
https://www.allbeton.ru.
– Дата доступа: 25.04.18.
24. Справочник химического состава биологически активных добавок
«Intelmeal»: [Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.intelmeal.ru.
– Дата доступа: 18.04.18.
25. Avigad Vonshak. Spirulina Platensis (Arthrospira) Physiology, cell-biology
and biotechnology. Ben-Gurion University of the Negev, Israe, – 2009. – P. 9-16.
26. GUGLIELMI, G., RIPPKA, R. and TANDEAU DE MARSAC. Main
properties that justify the different taxonomic position of Spirulinaspp. and
Arthrospiraspp.
Among
Cyanobacteria,
Bull.
Inst.
Oceanogr.,
Monaco,
1993. – P. – 12-14.
27. MATERASSI, R., PAOLETTI, C., BALLONI, W. and FLORENZANO, G.
Some considerations on the production of lipid substances by microalgae and
cyanobacteria. In SHELEF, G. and SOEDER, C.J. (Eds), Algae Biomass, – P. 619,
Amsterdam: Elsevier/ North-Holland Biomedical Press, – 2008 – P. 56-98.
81
Приложение 1
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа