close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Бобкова Екатерина Борисовна. Особенности культивирования In Vitro отдаленных гибридов подсемейства Prunoideae

код для вставки
Министерство образования и науки РФ
Федеральное государственное бюджетное образовательное
учреждение высшего образования
«ОРЛОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
ИМЕНИ И.С. ТУРГЕНЕВА»
На правах рукописи
Бобкова Екатерина Борисовна
Доклад
По научно-квалификационной работе
ОСОБЕННОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO ОТДАЛЕННЫХ
ГИБРИДОВ ПОДСЕМЕЙСТВА Prunoideae
Направление подготовки 06.06.01Биологические науки
Направленность (профиль) Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Научный руководитель: к.с.-х. н., доцент Федотова И.Э.
Орел - 2018
2
СОДЕРЖАНИЕ
ГЛАВА 1. НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДОВ
КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ IN VITRO ..................................... 7
1.1 Обоснование применения метода клонального микроразмножения
плодовых культур in vitro ..................................................................................... 7
1.1.1 Преимущества метода ............................................................................ 7
1.1.2 Этапы клонального микроразмножения растений .............................. 8
1.2. Особенности стерилизации исходного материала растений. .................... 8
1.3 Питательные среды для клонального микроразмножения плодовых
культур ................................................................................................................... 9
1.5 Физические факторы культивирования эксплантов in vitro ..................... 10
1.6 Особенности исходного растительного материала при введении в
культуру in vitro и дальнейшем микроразмножении....................................... 11
ГЛАВА 2. УСЛОВИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ............ 12
2.1. Условия проведения исследований ............................................................ 12
2.2. Объекты исследования, исходный материал ............................................ 12
2.3. Методы исследований ................................................................................. 13
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ .. 15
3.1. Изучение стерилизующей активности ряда различных чистящих и
моющих средств на примере модельной гибридной формы ......................... 15
3.2. Изучение влияния сроков введения в культуру на состояние и развитие
эксплантов отдалѐнных триплоидных гибридов вишни в условиях in vitro 16
3.3 Изучение воздействия состава питательных сред на жизнеспособность,
степень развития и коэффициент размножения эксплантов в зависимости от
гибридной формы на этапах введения в культуру и пролиферации ............. 18
3.4 Определение возможностей улучшения качественных показателей
микрорастений отдалѐнных триплоидных гибридов вишни при подготовке к
этапу ризогенеза .................................................................................................. 20
ВЫВОДЫ ............................................................................................................... 22
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ............................................................... 23
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ: ............................................ 24
2
3
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы.
Наблюдаемые изменения климата последних десятилетий, широкое
распространение на территории России и стран ближнего зарубежья опасного
грибного заболевания косточковых – коккомикоза (возбудитель Coccomyces
hiemalis Higg.) привели к резкой потере адаптивности растений косточковых
плодовых культур, в том числе — вишни (Сerasus vulgaris Mill.). Недостаточно количество сортов, способных к вегетативному размножению, выявлено
снижение всхожести семян из-за грибной и бактериальной инфекции.
Для улучшения сортимента вишни были получены отдалѐнные гибриды
между сортами вишни обыкновенной и дальневосточными диплоидными видами: вишней курильской (C. kurilensis Sock. et Junus), вишней сахалинской
[C. sachalinensis (Fr. Schmidt) Kom. et Aliss]. Они обладают целым рядом положительных качеств: достаточно высокой устойчивостью к коккомикозу,
зимостойкостью, скороплодностью [33, 35]. Для преодоления трудностей,
возникающих при гибридизации отдалѐнных видов вишни, а также для ускорения селекционного процесса актуально в селекции вишни использовать методы клеточной и тканевой биотехнологии, среди которых особое место занимает клональное микроразмножение растений [7, 9, 10, 11, 19, 21, 24, 27, 32,
33, 37].
Этот метод имеет ряд преимуществ перед методами традиционного вегетативного размножения, однако существует ряд факторов, затрудняющих
его использование в промышленном масштабе. Один из них – недостаточность знаний о морфогенетическом потенциале каждой отдельной культуры и
способов управления им в условиях in vitro [7, 10, 11].
Несмотря на значительные результаты экспериментальных работ, посвящѐнных изучению размножения и развития вишни в микрокультуре, имеются лишь фрагментарные исследования о возможностях использования микроклонального размножения применительно к отдалѐнным триплоидным гиб3
4
ридам вишни; это и определило цель и специфику исследования данной выпускной квалификационной работы.
Цель исследований: изучение особенностей клонального микроразмножения отдалѐнных триплоидных гибридов вишни, полученных от скрещивания сортов вишни обыкновенной и диплоидных дальневосточных видов.
Задачи исследований:
-провести информационно-аналитическое исследование научных публикаций по изучаемой проблеме;
- выявить эффективность дезинфицирующего действия ряда коммерческих чистящих и моющих средств при использовании их в качестве стерилизующего агента при микроклональном размножении отдалѐнных гибридов
вишни;
- изучить влияние различных сроков введения в культуру на состояние
и развитие эксплантов отдалѐнных гибридов в условиях in vitro;
- установить характер и степень влияния органо-минерального состава
питательных сред на эффективность клонального микроразмножения отдалѐнных триплоидных гибридов вишни на этапах введения в культуру in vitro
и пролиферации в зависимости от генотипических особенностей исследуемых
форм;
- выявить характер и степень влияния содержания регуляторов роста
растений в питательных средах на жизнеспособность, степень развития и коэффициент размножения эксплантов отдалѐнных триплоидных гибридов
вишни на этапах введения в культуру in vitro и пролиферации в зависимости
от генотипических особенностей исследуемых форм;
- выявить закономерности развития отдалѐнных триплоидных гибридов
вишни на этапах введения в культуру in vitro и пролиферации в зависимости
от генотипических особенностей исследуемых форм;
- разработать рекомендации по оптимизации технологии клонального
микроразмножения отдалѐнных триплоидных гибридов в культуре in vitro.
4
5
Объекты исследования:
Объектами исследования послужили отдалѐнные гибриды, полученные
от скрещивания сортов вишни обыкновенной с диплоидными дальневосточными видами: формы 1-42, 1-43, 1-44, 1-45 (Любская х С. serrulata); формы150, 1-51, 1-52, 1-53 (Антрацитовая х С. serrulata); формы1-34, 1-35, 1-36, 1-37
(Шоколадница х C. serrulata); формы 2-02, 2-03, 2-04, 2-05 (Шоколадница х C.
kurilensis); формы ПВх1-320-1, ПВх1-320-2, ПВх1-320-3, ПВх1-320-4 (Памяти
Вавилова х C. sachalinensis), формы 9-22, 9-23, 9-24, 9-25 (С. vulgaris х C. sachalinensis).
Предмет исследования: Технология клонального микроразмножения
отдалѐнных триплоидных гибридных форм вишни с учѐтом их генотипических особенностей.
Методы исследования:
Методологическую основу исследования составили общенаучные и частнонаучные методы познания: исторический, диалектический, сравнительный, функциональный, метод классификации, анализ, синтез, индукция, дедукция, сравнение, конкретизация, аналогия, абстрагирование, а также комплексный и системный подходы.
В экспериментальных лабораторных исследованиях руководствовались
современными методическими рекомендациями по клональному микроразмножению [24, 30, 37].
Теоретическая значимость: выявлены закономерности развития отдалѐнных триплоидных гибридов вишни на этапах введения в культуру in vitro
и пролиферации в зависимости от генотипических особенностей исследуемых
форм, что вносит определѐнный вклад в биологическую науку.
Практическая значимость.
Оптимизированы технологии клонального микроразмножения отдалѐнных триплоидных гибридов в культуре in vitro. Разработаны рекомендации по
5
6
использованию оптимизированных технологий в практике биотехнологических лабораторий научных учреждений и производственных питомников.
6
7
ГЛАВА 1. НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ ПРИМЕНЕНИЯ МЕТОДОВ
КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ IN VITRO
1.1 Обоснование применения метода клонального микроразмножения плодовых культур in vitro
Выход гибридных растений, получаемых селекционным путѐм мал, и
гибриды часто бывают стерильны. Поэтому перед исследователями часто
стоит задача – размножить и сохранить полученные растения. В этом помогает метод клонального микроразмножения[1, 4, 10, 27, 35].
В данной главе проанализированы научные публикации, раскрывающие
преимущества метода клонального микроразмножения in vitro
1.1.1 Преимущества метода
В разделе представлен анализ научных публикаций, раскрывающих историю возникновения и преимущества метода клонального микроразмножения in vitro. В основе метода лежит уникальная способность растительной
клетки реализовывать присущую ей тотипотентность. Термин "клон" был
предложен в 1903 году Уэбстером (от греческого klon - черенок или побег,
пригодный для размножения растений). Клонирование подразумевает получение идентичных организмов из единичных клеток. Метод клонального микроразмножения растений позволяет решать широкий спектр задач, таких как:
возможность быстро размножать и получать достаточное количество посадочного материала новых генотипов растений, созданных селекционным путѐм; возможность получения оздоровленного посадочного материала: освобождение растений от вирусов за счет использования меристемной культуры,
а также от бактериальных, грибных болезней и вредителей; улучшение качества посадочного материала: повышение генетической однородности, безвирусные саженцы меньше поражаются грибными, бактериальными и другими
болезнями, их урожайность выше; получение в сжатые сроки достаточного
количества посадочного материала, быстрое размножение ценных клонов;
7
8
получение вегетативного потомства у трудно размножаемых форм; возможность работы в течение всего года и планирования выпуска материала к определѐнному сроку; экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала; возможность автоматизации процесса выращивания; размножение сеянцев без выхода их из ювенильной фазы; получение гибридных
сеянцев из зародышей ранних фаз развития при отдалѐнной гибридизации;
получение соматических гибридов с ценными признаками; возможность создания банков длительного хранения ценных форм растений in vitro без контакта с
внешней средой, обмена материалом в международном масштабе без риска занести карантинные объекты [3, 11].
1.1.2 Этапы клонального микроразмножения растений
Процесс микроклонального размножения растений состоит из ряда последовательных операций, каждая из которых имеет свою специфику [9,10]. В
литературе, обычно, выделяют 4 этапа [15]:

выбор исходного растения-донора, стерилизация и изолирование эксплантов,
создание оптимальных условий для их роста развития в условиях in vitro;

снятие апикального доминирования и стимуляция развития пазушных почек, микрочеренкование побегов;

укоренение полученных микропобегов и адаптация пробирочных растений к переносу в нестерильные условия;

перенос пробирочных растений в нестерильные почвенные условия, адаптация и выращивание полученных растений в закрытом грунте.
Для каждого конкретного сорта растения на каждом этапе требуется
индивидуальный подбор состава питательной среды.
1.2. Особенности стерилизации исходного материала растений.
Поверхностные покровы всех растительных органов и тканей загрязнены различного рода бактериальными, грибными и микоплазменными инфекциями. Внутренние ткани относительно стерильны. Стерилизация исходного
материала – достаточно сложная процедура. При подборе дезинфицирующего
8
9
агента необходимо выполнить две задачи: нейтрализовать патогенную микрофлору и не повредить ткани растения. Любой стерилизующий агент должен
хорошо смачивать поверхность тканей и легко смываться дистиллированной
водой, при этом не иметь способности проникать в живые клетки и ткани [28].
Для поверхностной стерилизации растительных тканей в практике микроклонального размножения используют различные химические соединения.
Их можно разделить на две основные группы: вещества, содержащие активный хлор (хлорамин, гипохлориты кальция, натрия, хлорная известь), и вещества, содержащие ртуть (двухлористая ртуть – сулема, диоцит, мертиолат) [9,
10]. Проанализированы научные публикации, раскрывающие особенности
стерилизации эксплантов [9, 10, 19, 22, 39].
1.3 Питательные среды для клонального микроразмножения плодовых культур
Питательные среды для культивирования эксплантов плодовых культур
могут быть твѐрдыми, жидкими, двухслойными: нижний слой – агаризованный, верхний – жидкий. Питательные среды содержат макро- и микроэлементы, источники углеводного питания — различные углеводы типа сахарозы,
глюкозы, фруктозы, галактозы; витамины.
Для различных видов и сортов растений необходимо подбирать оптимальное сочетание различных компонентов питательных сред в индивидуальных концентрациях.
1.4 Использование стимуляторов роста для клонального микроразмножения плодовых культур
Основной метод, использующийся при клональном микроразмножении
растений - активация развития уже существующих в растении меристем. Он
основан на снятии апикального доминирования. Этого можно достичь двумя
путями: а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro на безгормональной среде; б) добавлением в
питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих
развитие многочисленных пазушных побегов.
9
10
Второй метод - индукция возникновения адвентивных почек непосредственно тканями экспланта. Он основан на способности изолированных частей растения при благоприятных условиях питательной среды восстанавливать недостающие органы и таким образом регенерировать целые растения.
Можно добиться образования адвентивных почек почти из любых органов и
тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек
и донца луковиц, сегментов корней и зачатков соцветий). Этот процесс происходит на питательных средах, содержащих цитокинины в соотношении с
ауксинами 10:1 или 100:1. В качестве ауксина используют ИУК или НУК.
Важным элементом технологии производства безвирусного посадочного материала в культуре in vitro является применение регуляторов роста. Чаще
всего используют природные регуляторы роста – фитогормоны (метаболиты
самих растений) и их синтетические аналоги: цитокинины: природный — зеатин, синтетические - 6-бензиламинопурин (БАП), 6-фурфураминопурин (кинетин), 2-изопентениладенин (2ip); ауксины: природный ауксин - индолил-3уксусную кислоту (ИУК) и его синтетические аналоги — индолил-3масляную кислоту (ИМК), α-нафтил-уксусную кислоту (α-НУК); гиббереллины (ГК); витамины: аскорбиновую кислоту, пиридоксин HCl, никотиновую
кислоту, тиамин HCl и др. Они участвуют в регуляции процессов жизнедеятельности, в значительной мере определяя характер и темпы роста и развития
эксплантов. Литературные источники содержат множество данных о концентрациях, сочетаниях, времени введения в культуру in vitro перечисленных фитогормонов [1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,12, 13,15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,
24, 25, 26, 27, 29, 31, 32,34, 36, 37, 38,39, 40, 41, 42].
1.5 Физические факторы культивирования эксплантов in vitro
К физическим факторам выращивания относятся температура, условия
освещения, спектральный состав света влажность воздуха и др.
По поводу применяемых физических факторов культивирования эксплантов in vitro, мнения учѐных сходятся в том, что необходимо каждому ви10
11
ду с учетом его естественного ареала произрастания подбирать индивидуальные условия культивирования. [7, 20, 21, 23, 38, 40].
1.6 Особенности исходного растительного материала при введении
в культуру in vitro и дальнейшем микроразмножении
В разделе представлены сведения о генотипической реакции растений при
их культивировании in vitro. В культуре in vitro, по мнению многих исследователей, у большинства плодовых и ягодных культур на всех этапах микроразмножения ярко проявляются сортовые и видовые особенности, и коэффициент размножения в большей степени зависит от генотипа, чем от модели размножения
in vitro [7, 18, 24, 37].
Проанализированы сведения о влиянии на успех клонального микроразмножения местоположения отделяемой части на растении (экспланта), а
также возраста исходных растений (взрослые деревья, сеянцы в ювенильной
фазе) [8, 17, 25, 27], сроков изоляции эксплантов [2, 9, 17, 26, 33, 34, 37, 41,
42], ориентации эксплантов на среде. [23].
Таким образом, учѐные утверждают, что генотип растений, происхождение
экспланта, сроки изоляции, размер эксплантов, ориентация их на среде оказывают
большое влияние на успех микроразмножения и являются теми инструментами,
оптимизацией которых можно повысить эффективность всей технологии.
1.7 Особенности укоренения эксплантов
Контроль ризогенеза у размноженных in vitro побегов возможно осуществлять путѐм изменения состава питательных сред на этапе, предшествующем укоренению, способа аппликации индуктора ризогенеза и, в отдельных
случаях, изменением температурных условий культивирования. [20, 23, 33,
38]. Рассмотрены особенности влияния различных стимуляторов роста и развития растений на процесс ризогенеза [23, 31].
Каждому виду и сорту с учетом его индивидуальных особенностей необходимо подбирать индивидуальное сочетание регуляторов роста и развития
растений на различных этапах культивирования.
11
12
ГЛАВА 2. УСЛОВИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Условия проведения исследований
Исследования проходили на базе лаборатории биотехнологии Орловского государственного университета при кафедре почвоведения и прикладной биологии в 2015-2018 годах.
Работы по вычленению эксплантов проводились в стерильной операционной. Для вычленения эксплантов пользовались бинокулярными микроскопами типа МБС-9, МБС-10.
Изолированные экспланты культивировали в культуральной комнате на
стеллажах с верхнебоковым освещением. В качестве источника света использовали люминисцентные лампы типа ЛДЦ-40, ЛДЦ-80, ЛБ-40, ЛД-40. Освещѐнность составляла 3000 люкс при фотопериоде в 16 часов. Температура в
культуральной комнате находилась в пределах 21-23◦С при относительной
влажности воздуха 70-75%.
2.2. Объекты исследования, исходный материал
Объекты исследований. Объектами исследования послужили отдалѐнные гибриды, полученные от скрещивания сортов вишни обыкновенной с диплоидными дальневосточными видами: формы 1-42, 1-43, 1-44, 1-45 (Любская х
С. serrulata); формы1-50, 1-51, 1-52, 1-53 (Антрацитовая х С. serrulata); формы134, 1-35, 1-36, 1-37 (Шоколадница х C. serrulata); формы 2-02, 2-03, 2-04, 2-05
(Шоколадница х C. kurilensis); формы ПВх1-320-1, ПВх1-320-2, ПВх1-320-3,
ПВх1-320-4 (Памяти Вавилова х C. sachalinensis), формы 9-22, 9-23, 9-24, 9-25
(С. vulgaris х C. sachalinensis). Каждая группа форм в таблицах с результатами
экспериментальных исследований и по тексту работы обозначена условным
обозначением последнего номера в группе (выделена жирным шрифтом).
Исходный материал. В качестве исходных эксплантов для культивирования in vitro использовали меристематические верхушки апикальных и латеральных вегетативных почек однолетних побегов.
12
13
2.3. Методы исследований
В исследованиях руководствовались методическими рекомендациями
по микроклональному размножению: «Программа и методика селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур» (1995), «Методические рекомендации по использованию биотехнологических методов в работе с плодовыми,
ягодными и декоративными культурами» (2005) [24, 30].
Схема опытов.
Эксперимент №1: Изучение стерилизующей активности ряда чистящих
и моющих средств на примере модельной гибридной формы.
Испытывали Domestos (действующее вещество – гипохлорит натрия) 10% с
экспозицией 10 минут, Fairy 10% (действующие вещества - лауретсульфат
натрия (анионное ПАВ), оксид лаурамина (неионогенное ПАВ)) с экспозицией 10 минут, Ace-гель (действующее вещество – гипохлорит натрия) 10% с
экспозицией 10 минут, Лизоформин 3000 (действующие вещества - глутаровый альдегид, глиоксаль и хлорид дидецилдиметиламмония) в концентрациях
3%, 5% и 10% с экспозицией 5-7 минут.
Эксперимент №2: Изучение влияния сроков введения в культуру на поведение эксплантов отдалѐнных триплоидных гибридов в условиях in vitro: осенний период - октябрь, ноябрь; зимний период – февраль; весенний период - март.
Эксперимент №3: Изучение воздействия состава питательных сред на
жизнеспособность, степень развития и коэффициент размножения эксплантов
отдалѐнных гибридов вишни на этапах введения в культуру и пролиферации
Эксперимент многофакторный. Первый фактор – органо-минеральный
состав искусственных питательных сред. Культивирование эксплантов проводили на питательных средах Мурасиге и Скуга и экспериментального состава
(далее - Экспериментальная).
Испытывали эффективность использования 4-х вариантов гормонального состава в питательных средах: по 2 варианта с различной концентрацией
фитогормонов для каждой питательной среды (таблица 1):
13
14
Таблица 1 — Варианты гормонального состава питательных сред
Гормоны
БАП
ГК
ИМК
Концентрация гормонов в питательных средах, мг/л
МурасиМурасиге и
Эксперименталь- Экспериментальге и
Скуга I
ная I
ная II
Скуга II
1
2
1
2
0,5
1
0,5
0,5
0,5
0,5
1
1
Объѐм выборки: на питательной среде каждого из 4-х вариантов культивировали 3 повторности, в каждой повторности по 10 эксплантов (всего 30
эксплантов).
Сроки наблюдений. Учѐт инфицированных микрорастений проводили
через 2 недели после начала культивирования. Жизнеспособность и степень
развития эксплантов изучали через каждые 2 недели после введения в культуру in vitro: через 2, 4 и 6 недель. Коэффициент размножения после каждого
пассажа. Результаты экспериментальных исследований обрабатывали методом дисперсионного анализа [39].
Изучали следующие показатели, характеризующие рост и развитие эксплантов: степень контаминации (в процентах), динамику жизнеспособности (в
процентах), степень развития (в баллах), коэффициент размножения. Степень
развития эксплантов оценивали по 5-ти бальной шкале.
Коэффициент размножения определяли после каждого последующего
пассажа с учетом исходного количества эксплантов и эксплантов, полученных
в процессе собственно микроклонального размножения. С помощью этих
двух показателей и можно вычислить коэффициент размножения исследуемого генотипа. Формулу для нахождения можно выразить следующим образом:
K = F2/F1, где условно K – коэффициент размножения, F1 – количество
исходных микрорастений (эксплантов), F2 – количество микрорастений полученных в ходе микроразмножения.
Статистическую обработку данных проводили по Доспехову [39].
14
15
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Изучение стерилизующей активности ряда различных чистящих и моющих средств на примере модельной гибридной формы
Оценку степени контаминации эксплантов различных гибридов вишни
в процессе их культивирования проводили по истечении двух недель после их
высаживания в питательную среду. В ходе оценки учитывались также и погибшие на момент учета растительные экспланты.
При изучении степени контаминации эксплантов гибридной формы
вишни 1-61 в зависимости от стерилизующего агента (Таблица 4) нами было
установлено, что самую низкую стерилизующую активность продемонстрировал Domestos - более половины от введѐнных в культуру эксплантов поражалось инфекцией в первые недели культивирования. (67,72%). Синтетическое моющее средство Ace-гель при достаточно высоких показателях степени
контаминации (61,54%) оказывало угнетающее действие на развитие эксплантов (41.67% стерильных жизнеспособных эксплантов).
Наилучший стерилизующий эффект проявил Лизоформин 3000 в концентрациях 3% и 5% (степень контаминации – 13,33% и 0,00% соответственно). Негативных последствий влияния данного стерилизатора в таких концентрации на развитие эксплантов не было зафиксировано (степень развития эксплантов – 100% для двух вариантов). Однако дальнейшее увеличение концентрации этого вещества до 10% при неименной методике стерилизации приводит к сильному ожогу тканей и гибели эксплантов в первые недели культивирования (0,00% стерильных жизнеспособных эксплантов).
На основании проведѐнного эксперимента в дальнейших исследованиях
в качестве основного стерилизующего вещества стали применять лизоформин
5%-ный.
15
16
3.2. Изучение влияния сроков введения в культуру на состояние и
развитие эксплантов отдалѐнных триплоидных гибридов вишни в условиях in vitro
Способность растений расти и развиваться и в условиях in vitro сильно
варьирует в зависимости фенофазы, в которую было произведено изолирование эксплантов.[10, 19, 37]. Степень контаминации эксплантов изученных
гибридных форм В среднем была максимальна в осенний период (октябрь –
12,22%), с приближением зимы постепенно снижалась (ноябрь – 5,56%, февраль – 4,44%) и к началу весны стала практически незначительной (март –
1,67%).Каждаягибридная форма проявляла индивидуальные особенности. На
протяжении всего эксперимента больше других поражались инфекцией экспланты гибридной формы 1-37 (7,08%). Самые низкие показатели степени
контаминации эксплантов продемонстрировали гибридные формы 1-53 и 9-25
(5,00% для двух вариантов).
Было установлено, что количество инфицированных объектов на каждой питательной среде оказалось примерно одинаковым, следовательно, наличие инфекции практически не зависит от органоминерального состава среды выращивания.
При анализе результатов изучения жизнеспособности эксплантов установлено, что в целом самые высокие показатели жизнеспособности были зафиксированы для эксплантов, введѐнных в культуру in vitro в октябре
(97,97%), в то время как в ноябре процент гибели эксплантов превысил 30%
(66,69%).
С февраля жизнеспособность эксплантов вновь стала возрастать
(70,72% - в феврале и 74,65% - в марте). Для форм 1-53, 1-37 и 2-05 минимальные значения жизнеспособности отмечены у эксплантов, введѐнных в
культуру в феврале (32,26%, 78,81% и 60,77% соответственно).
В ходе эксперимента вне зависимости от времени начала культивирования самые высокие показатели жизнеспособности в условиях стерильной
16
17
культуры показала гибридная форма 1-37 (89,67%), самые низкие – гибрид 153 (67,73%). Установлено, что в среднем при введении эксплантов гибридных
форм вишни в культуру in vitro в октябре степень развития эксплантов составила 3,03 балла, что несколько выше, чем в ноябре – 2,48 балла. При введении эксплантов в культуру in vitro в феврале экспланты исследованных гибридных форм имели наибольшую степень развития (4,10 балла), а в марте
степень развития вновь снизилась, но не столь значительно (4,01 балла).
Хуже всех в искусственных условиях росла форма 2-05 (2,73 балла).
Развитие остальных объектов исследования было оценено в среднем в 3-4
балла на протяжении всего эксперимента. Самые высокие показатели зафиксированы у гибридной формы 9-25 (3,79 балла).
На основании анализа полученных данных выявлены оптимальные сроки введения эксплантов отдалѐнных триплоидных гибридов вишни в культуру
in vitro (таблица 2).
Таблица 2 - Оптимальные сроки введения эксплантов отдалѐнных триплоидных гибридов вишни в культуру in vitro согласно каждому из показателей
Гибридная
форма
1-45
1-53
1-37
2-05
ПВх1-320
9-25
Исследуемые показатели
Степень контамиСтепень развиЖизнеспособность
нации
тия
Февраль, Март
Октябрь
Февраль
Март
Октябрь
Март
Март
Октябрь
Март
Февраль
Март
Февраль
Март
Октябрь
Февраль
Февраль, Март
Октябрь
Март
Таким образом, учитывая отмеченные нами закономерности колебания
показателей степени контаминации, жизнеспособности и степени развития
эксплантов отдалѐнных триплоидных гибридов можно с уверенностью утверждать, что в любой из изученных периодов можно добиться значительного
выхода стерильных жизнеспособных эксплантов при условии изменения характера стерилизации и культивирования согласно особенностям каждого из
17
18
сроков. Так в октябре и ноябре следует применять более жѐсткую методику
стерилизации растительного материала для минимизации потерь, связанных с
высокими показателями степени контаминации в осенний период. В ноябре
для стимуляции процессов роста и развития эксплантов рекомендуется вводить в состав питательных сред более высокие дозы фитогормонов.
3.3 Изучение воздействия состава питательных сред на жизнеспособность, степень развития и коэффициент размножения эксплантов в
зависимости от гибридной формы на этапах введения в культуру и пролиферации
Учет степени развития эксплантов первоначально проводили на этапе
введения в культуру, а затем на этапе их пролиферации. Это дало возможность проследить влияние состава питательных сред на различные генотипы в
динамике, так как сохранялась возможность сравнения начальных результатов с более поздними.
Установлено, что жизнеспособность эксплантов исследованных форм
вишни вне зависимости от генетических особенностей гибридов и состава питательных сред в целом удовлетворительная (77,49%).
Однако на среде Экспериментальная (80,84%) экспланты приживались
несколько лучше (80,84%), чем на среде Мурасиге и Скуга (74,13%). Самый
высокий процент жизнеспособных эксплантов был отмечен на питательной
среде Экспериментальная I (82,15%). Самые низкие значения жизнеспособности в условиях эксперимента показали экспланты, культивируемые на среде
Мурасиге и Скуга I (70,92%).
В среднем значения степени развития исследованных отдалѐнных гибридов на протяжении всего времени эксперимента не превышают 4 баллов по
5-бальной шкале (3,41 балла). Различия в развитии микрорастений на среде
Мурасиге и Скуга и среде Экспериментальной в целом не столь кардинальны
(3,46 и 3,35 балла соответственно). Наибольшая степень развития эксплантов
была отмечена на среде Мурасиге и Скуга II варианта (3,70 балла).
18
19
Анализ данных о способности отдалѐнных гибридов вишни к размножению в условиях микрокультуры показал, что коэффициент размножения
эксплантов, развивавшихся на среде экспериментальная I, несколько превышает значения этого параметра для эксплантов, культивируемых на питательной среде Мурасиге и Скуга. Самую высокую степень размножения в условиях эксперимента показали экспланты, произраставшие на среде Экспериментальная II (2,83), самую низкую – на среде Мурасиге и Скуга I варианта (1,40).
Лучше всего в условиях in vitro размножалась гибридная форма 1-45 (2,82).
Самые низкие значения коэффициента размножения были отмечены для формы 2-05 (1,44).
Исходя из результатов исследований практически для каждого из изученных генотипов вишни был подобраны наиболее оптимальный и допустимый составы питательной среды для этапов введения в культуру и пролиферации (таблица 3).
Таблица 3 - Оптимальный и допустимый состав питательной среды для культивирования эксплантов отдалѐнных триплоидных гибридов вишни на этапах
введения в культуру и пролиферации
Питательная среда
Форма
Этап введения в культуру
Этап пролиферации
Оптимальная Допустимая Оптимальная Допустимая
Экспер II
Экспер I
Экспер II
Экспер I
1-45
Экспер I
МS II
Экспер II
MS II
1-53
Экспер II
MS II
MS II
Экспер II
1-37
Экспер II
2-05
Экспер I
Экспер II
ПВх1-320
Экспер I
Экспер II
9-25
Для культивирования эксплантов отдалѐнных гибридов на этапе введения в культуру хорошо зарекомендовали себя питательная среда Экспериментальная I и II.вариантов. Для стимуляции пролиферирующей активности эксплантов отдалѐнных гибридов вишни целессобразно применение питательной
среды Экспериментальная II.
19
20
а
б
Рис.1 - Экспланты гибридной формы 1-45 на этапе введения в культуру на питательных средах Мурасиге и Скуга I и Мурасиге и Скуга II (февраль)
3.4
Определение
возможностей
улучшения
качественных
показателей микрорастений отдалѐнных триплоидных гибридов вишни
при подготовке к этапу ризогенеза
Для подготовки эксплантов к корнеобразованию испытывались питательные среды Мурасиге и Скуга и Экспериментальная, содержащие в качестве регуляторов роста гибберелловую кислоту в сочетании с пониженным,
по сравнению с этапом пролиферации, количеством 6-БАП.
При оценке предварительных данных о степени увеличения линейных
размеров микрорастений в условиях этапа подготовки к ризогенезу выявлено,
что в целом высота микрорастений, произрастающих на среде Экспериментальной (23,0 мм), несколько больше, чем высота растений на среде Мурасиге
и Скуга (20,9 мм). Самое значительное увеличение длины микропобегов отмечено для растений, культивируемых на питательной среде Экспериментальная PII (23.6 мм). Значительно меньших размеров достигли микрорастения на среде Мурасиге и Скуга PI (19.5 мм).
Помимо хороших результатов по вытяжению микропобегов, у отдельных растений гибридных форм 1-53, 1-37 и 9-25 уже на данном этапе образовались корни. Данное явление наблюдалось только на питательной среде
20
21
Экспериментальная PII.
Лучше других увеличивалась в размерах на данном этапе форма 9-25
(28,7 мм). Почти не развивалась гибридная форма 2-05 (14,9 мм).
При индивидуальной оценке изменений размеров микрорастений следует указать, что для форм 1-53, 1-37 и 2-05 на этом этапе больше подошла
среда Мурасиге и Скуга PII (30.5 мм, 25,2, мм и 18,3 мм). Гибридная форма
ПВх1-320 продемонстрировала значительное увеличение длины микропобегов на питательной среде Мурасиге и Скуга PI. А гибриды 1-45 и 9-25, лучше
всего проявившие себя на предыдущем этапе, хорошо развивались на среде
Экспериментальная PII (25,3 мм и 36,2 мм соответственно)
Рис. 2 - Гибридные формы 1-53 (а) и 1-37 на питательной среде Экспериментальная PII
на этапе подготовки к ризогенезу
21
22
ВЫВОДЫ
1. Выявлены особенности развития эксплантов отдалѐнных триплоидных гибридов вишни на искусственных питательных средах: все отдалѐнные
гибридные триплоидные формы способны развиваться на искусственных питательных средах; степень их развития зависит от срока введения в культуру
in vitro, состава питательной среды и генетических особенностей гибридов.
2. Лучше других развивалась и имеет более высокий морфогенетический потенциал форма 9-25 (28,7 мм); менее других — гибридная форма 2-05
(14,9 мм).
2. Наиболее эффективным дезинфицирующим агентом для отдалѐнных
триплоидных гибридов вишни является лизоформин 5%.
3. В любой из изученных периодов культивирования можно добиться
значительного выхода стерильных жизнеспособных эксплантов при оптимальных условиях стерилизации и культивирования согласно особенностям
каждого из сроков и генотипов.
4. На этапе введения в культуру и пролиферации для образования
большого числа мериклонов целесообразно использовать экспериментальную
питательную среду с гормональным составом варианта II – 6-БАП 2 мг/л, ГК
0,5 мг/л, ИМК 1 мг/л.
5. На этапе подготовки к ризогенезу для улучшения качественных показателей эксплантов отдалѐнных триплоидных гибридов вишни целесообразно
использовать экспериментальную питательную среду с гормональным составом варианта PII – 6-БАП 0,2 мг/л, ГК 2 мг/л, ИМК 1 мг/л.
6. Оптимизирована технология микроклонального размножения для исследуемых гибридных форм вишни с учѐтом их генотипических особенностей.
22
23
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. В качестве стерилизующего агента для поверхностной дезинфекции
растительного материала отдалѐнных триплоидных гибридов вишни использовать лизоформин 5%.
2. Культивирование in vitro эксплантов отдалѐнных триплоидных гибридов вишни проводить в октябре, ноябре, феврале и марте
3. На этапе введения в культуру и пролиферации для образования
большого числа мериклонов применять экспериментальную питательную
среду с гормональным составом варианта II – 6-БАП 2 мг/л, ГК 0,5 мг/л, ИМК
1 мг/л.
4. На этапе подготовки к ризогенезу для улучшения качественных показателей эксплантов отдалѐнных триплоидных гибридов вишни применять
экспериментальную питательную среду с гормональным составом варианта
PII – 6-БАП 0,2 мг/л, ГК 2 мг/л, ИМК 1 мг/л.
5. Использовать разработанные нами оптимизированные технологии
микроклонального размножения для исследуемых гибридных форм вишни в
практике биотехнологических лабораторий научных учреждений и производственных питомников.
23
24
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:
1.
ГОСТ 54051-2010 Плодовые и ягодные культуры. Стерильные культуры и адаптированные микрорастения. Технические условия. – М.: Стандартинформ, 2011. – 11 с.
2.
Беседина, Е.Н. Стимуляторы роста нового поколения и альтернативные структурообразователи питательных сред. Эффективность адаптации
микрорастений подвоев яблони ex vitro [Электронный ресурс] / Е.Н. Беседина,
Л.Л. Бунцевич, // Плодоводство и виноградарство Юга России. – 2015. - №35. –
Режим доступа: http://journal.kubansad.ru/pdf/15/05/17.pdf
3.
Бунцевич, Л.Л. Исследование эффективности антибиотиков и стерилизаторов нового поколения для подавления бактериальной и грибной контаминации среды и эксплантов [Электронный ресурс] / Л.Л. Бунцевич, М.А. Костюк, Р.С. Захарченко, Е.Н. Палецкая // Плодоводство и виноградарство Юга
России. – 2012. - №16. – Режим доступа:http://journal.kubansad.ru
4.
Бунцевич, Л.Л. Оптимизация питательных сред при клональном
микроразмножении подвоев яблони серии СК / Л.Л. Бунцевич, А.Т. Киян, Е.Н.
Беседина, М.А. Костюк // Плодоводство и ягодоводство России. - 2013. XXXVII том. -С.46-51.
5.
Верзилин, А.В. Оздоровление и клональное микроразмножение слаборослых подвоев яблони: монография / А.В. Верзилин, В. А. Минаев, А.М. Тарасов. – Мичуринск: МГПИ, 2007. – 146 с.
6.
Выращивание растений земляники с использованием клонального
микроразмножения / С.Л. Расторгуев // Экономический аспект. Мичуринские
чтения «Развитие научного наследия И.В. Мичурина по генетике и селекции плодовых культур»: международная научно-практическая конференция, посященная
155–летию со дня рождения И.В. Мичурина, – Мичуринск, 2010 – С. 268-270.
7.
Высоцкий В. А. – Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала и селекции плодовых и ягодных
растений. Автореферат диссертации на соискание учѐной степени доктора сельскохозяйственных наук. М.: – 1998. – 44 с.
8.
Высоцкий В. А. – Биотехнологические приѐмы в современном садоводстве. // Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. работ /ГНУ ВСТИСП
Россельхозакадемии. – М., 2011. – Т. XXVI. – C.3-10.
9.
Деменко, В. И. Микроклональное размножение плодовых и ягодных
культур. //Методические рекомендации к практическим занятиям по плодоводству. – М.: МСХА, 1997. – 35 с.
24
25
10. Джигадло, Е.Н. Методические рекомендации по использованию
биотехнологических методов в работе с плодовыми, ягодными и декоративными
культурами / под ред. Е.Н. Джигадло. – Орѐл: ГНУ ВНИИСПК, 2005. – 50 с.
11. Джигадло, М. И. Использование биотехнологических и биофизических методов в селекции и сорторазведении плодовых и ягодных культур: автореф. дис. … канд. с.-х. наук: 06.01.05 / Джигадло Михаил Иосифович. – Орѐл,
2003. – 210 c.
12. Дорошенко, Н.П. Биотехнология оздоровления и сохранения донских аборигенных сортов винограда / Н.П. Дорошенко, А.С. Куприкова // Генетические ресурсы и селекционное обеспечение современного виноградарства:
материалы Международной научно-практической конференции. - Новочеркасск,
2011. – С.156-160.
13. Дорошенко, Н.П. Особенности клонального микроразмножения
сорта Крестовский. / Н.П., Дорошенко; А.С., Куприкова // Виноделие и виноградорство –2011. – № 5. – C.32-34.
14. Доспехов, Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований)/ Б.А. Доспехов – 2-е изд., перераб. и
доп. – М.: Колос, 1985. – 352 с.
15. Здруйковская – Рихтер, А.И. Культура изолированных зародышей и
некоторые другие приемы выращивания растений in vitro. / А.И. ЗдруйковскаяРихтер// Методические рекомендации. – М., 1974.
16. Испытание регуляторов роста в питомниководстве плодовых и
ягодных культур / Е.А. Чернышев, Т.В. Бурдейная, В.Г. Лахтин, А. А. Борисова
// Промышленное производство оздоровленного посадочного материала плодовых, ягодных и цветочно-декоративных культур: мат. межд. науч.-практ. конф. –
М.: ВСТИСП, 2001. – С. 142-143.
17. Калинин, Ф.Л. Технология микроклонального размножения растений /
Ф.Л. Калинин, Г.П. Кушнир, В.В. Сарнацкая // Киев: Наукова Думка, –1992. – 213с.
18. Катаева, Н.В., Александрова, И.Г., Драгавцева, Е.В. Значение гормонов в формировании витрифицированных побегов яблони при микроразмножении. //Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. – М.:
Наука, 1991. – С. 189-192.
19. Ковальчук, И. Ю. Боровикова, О. В. Клональное микроразмножение
вишни и сливы. //Ускоренное размножение посадочного материала плодовоягодных культур с использованием биотехнологических методов. – Алма-Ата,
изд. КАСХН, 1991. – С. 14-21.
25
26
20. Корнацкий, С.А. Особенности клонального микроразмножения сливы в системе производства оздоровленного посадочного материала: автореф. дис.
… канд. с.-х. наук: 06.01.07 / Корнацкий Сергей Аркадьевич. – М., 1991. – 24 с.
21. Крамаренко, Л.А., Катаева, Н.В. Клональное микроразмножение некоторых представителей косточковых плодовых. //III Всесоюзная конференция молодых учѐных по физиологии растительной клетки. – Петрозаводск, 1988. – С. 140-141.
22. Кузьмина Н. Микроклональное размножение и оздоровление растений [Электронный ресурс] / Н. Кузьмина // Биотехнология. –2010. – Режим доступа: Кухарчик, Н.В. Научные и практические основы оздоровления от вирусов
и размножения плодовых и ягодных культур in vitro: автореф. дис. … д-ра с.-х.
наук: 06.01.05 / Кухарчик Наталья Валерьевна. – Жодино, 2006. – 40 с.
23. Матушкина, О. В. Клональное микроразмножение яблони и груши в
системе производства высококачественного посадочного материала / О. В. Матушкина, И. Н. Пронина // Агро XXI. – 2009. – № 4-6. – С. 28-29.
24. Методические рекомендации по использованию биотехнологических методов в работе с плодовыми, ягодными и декоративными культурами /
Под ред. Е. Н., Джигадло. - Орел, 2005. - 50с.
25. Муратова, С.А. Особенности введения в культуру in vitro плодовых
и ягодных растений / С.А.Муратова, М.Б. Янковская, Д.Г. Шорников, Н.В. Соловых, В.М. Тюленев // Плодоводство: Научные труды, Самохваловичи, 2005. –
Т. 17, ч. – С.182-184.
26. Набиева, А.Ю. Биотехнологические приемы клонального микроразмножения перспективных сортов Syringa vulgaris L. для Западной Сибири / А.Ю.
Набиева // Вестник ИрГСХА. – Иркутск, 2011. - Вып. 44, ч. V. - С. 69-76. 82
27. Осипова, Л. В. Получение растений-регенерантов вишни в культуре
тканей. //Индукция морфогенеза и тканевая селекция плодовых и ягодных культур (Методические рекомендации). /Под ред. В. М., Тюленева– Мичуринск,
1996. – С. 24-39.
28. Острейко, С.А., Дроздовский, Э.М. О генетической и фенотипической стабильности при культуре растений in vitro. //Плодоовощное хозяйство,
1987. – № 12. – С. 30-31.(V-53)
29. Попович, Е.А., Филипеня, B.JI. Влияние экзогенного цитокинина на
жизнеспособность эксплантов голубики высокой in vitro. //Физиология растений.
– 1997. Т.44. – № 1. – С. 104-107.
30. Программа и методика селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур/ Под общей редакцией академика РАСХН Е.Н. Седова, доктора с/х
наук Т.П. Огольцовой.— Орел: ВНИИСПК, 1995 г. — 502 с.
26
27
31. Райков, И.А. Совершенствование клонального микроразмножения
межвидовых форм смородины чѐрной и малины ремонтантного типа: автореф. дис.
… канд. с.-х. наук: 06.01.05 / Райков Игорь Александрович. – Брянск, 2012 – 19 с.
32. Свитайло, A.M. Размножение in vitro сортов вишни Метеор и Норд
Стар. //Садоводство. 1989. – № 34. – С.57-58.
33. Селекция и сорторазведение плодовых культур /Ерѐмин Г. В., Исачкин
А. В., Седов Е. Н. и др., под ред. проф. Ерѐмина Г. В. — М.: Колос, 1993 – 288 с.
34. Трушечкин, В. Г., Высоцкий, В. А. – Клональное микроразмножение
плодовых и ягодных культур. // Плодоовощное хозяйство. М., 1985. - №1 – С. 43-46.
35. Федотова, И. Э. Использование некоторых видов рода Cerasus Mill.
В селекции вишни на устойчивость к коккомикозу и адаптивность к условиям
среды. //Автореферат диссертации на соискание учѐной степени кандидата сельскохозяйственных наук. – Брянск, 2000. – 22 с.
36. Федотова, И. Э., Хархардина, Е. Л. Оптимизация технологии микроклонального размножения отдалѐнных гибридов вишни. // Учѐные записки Орловского государственного университета. Научный журнал. – Орѐл, 2010. - №2 –
С. 268-273.
37. Фролова, Л. В. – Методические рекомендации по микроклональному размножению косточковых культур. Орѐл: ГОУ ВПО «ОГУ», 2009. – 46 с.
38. Шипунова, А. А., Высоцкий, В. А. – Влияние некоторых факторов
культивирования на клональное микроразмножение плодовых и ягодных растений. // Плодоводство и ягодоводство России: Сб. науч. работ. /ВСТИСП. – М.,
2002. – Т. IX. – С. 193 – 200.
39. Reed, B.M. Cold Storage of Strawberries In Vitro: A Comparison of
Three Storage Systems// Fruit Varieties Journal. 1992. V. 46 (2). P.98-102.
40. Ruzic, D. Relationship between the concentration of macroelements, their
uptake and multiplication of cherry rootstock Gisela 5 in vitro [Text]/ D. Ruzic, M. Saric ,
R. Cerovic, I. Culafic // Plant Cell Tissue Organ Cult. - 2000. Vol. 63.- P. 9–14.
41. Technical quidelinesfor the management of field and in vitro germplasm
collections. IPGRI, Italy, 2004. 105 p.
42. Wanas, W.H., Collow J.A., Lindsey A.W. Growth Limitation for the
Conservation of Pea Genotypes// Plant Tissue Culture and its Agricultural Application.
London: Butterworths, 1986. — 285 p.
27
28
28
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа