close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Кабина Наталья Александровна. Состояние JAK-STAT системы при гнойно-воспалительных заболеваниях мягких тканей

код для вставки
ГОСУДAРСТВЕННОЕ ОБРAЗОВAТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНAЛЬНОГО ОБРAЗОВAНИЯ
«ОРЛОВСКИЙ ГОСУДAРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
имени И.С. ТУРГЕНЕВA»
МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ
КAФЕДРA ИММУНОЛОГИИ И СПЕЦИAЛИЗИРОВAННЫХ
КЛИНИЧЕСКИХ ДИСЦИПЛИН
Кабина Наталья Александровна
Научный доклад
Состояние JAK-STAT системы при гнойно-воспалительных
заболеваниях мягких тканей
Нaучный руководитель:
доктор медицинских нaук
Снимщикова Ирина Анатольевна
Орел – 2018
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Роль иммунологических механизмов в патогенезе гнойных ран и
раневой инфекции
1.2 Роль сигнального JAK-STAT-пути при патологических процессах.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЛАВА 3. ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ TLR2 ФАГОЦИТАМИ КРОВИ
И ОЧАГА ВОСПАЛЕНИЯ ПРИ ГНОЙНЫХ РАНАХ
ГЛАВА 4. ИЗУЧЕНИЕ СИСТЕМНОЙ И ЛОКАЛЬНОЙ ПРОДУКЦИИ
ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ
И
ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ
ЦИТОКИНОВ ПРИ ГНОЙНЫХ РАНАХ И РАНЕВОЙ И ИНФЕКЦИИ
ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ТРAНСКРИПЦИОННЫХ ФAКТОРОВ STAT1,
STAT3,
STAT6
И
НЕГАТИВНЫХ
РЕГУЛЯТОРОВ
КЛЕТОЧНОЙ
СИГНАЛИЗАЦИИ SOCS 1,3,6 У ПАЦИЕНТОВ С РАНЕВОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК
РАБОТ,
ОПУБЛИКОВАННЫХ
КВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ
ПО
ТЕМЕ
НАУЧНО-
ВВЕДЕНИЕ
AКТУAЛЬНОСТЬ ТЕМЫ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ
РАБОТЫ.
Гнойно-воспалительные заболевания мягких тканей до настоящего
времени остаются одной из актуальных проблем современной медицины, что
обусловлено их распространѐнностью, тенденцией к хроническому течению,
недостаточной эффективностью традиционных методов лечения. Изучению
роли нарушений иммунного ответа при гнойных ранах посвящены
многочисленные исследования, однако многие особенности дисрегуляции
компонентов врождѐнного и адаптивного иммунитета при раневой
инфекции остаются дискутабельными и нуждаются в уточнении. В
последние годы показано, что инфекционно-воспалительные процессы
зачастую связаны с патологией рецепторных мембранных и/или ферментных
внутриклеточных
систем
передачи
цитокин-опосредованного
сигнала.
Взаимодействие цитокинов с рецепторами на поверхности клеток приводит к
запуску сигнального JAK-STAT-пути, основными компонентами которого
являются тирозиновые янус-киназы JAK, TYK и транскрипционные факторы
STAT. При этом набор янускиназ и STAT-белков для каждого цитокина
достаточно специфичен, а супрессоры цитокинового сигнала (SOCS)
подавляют процесс его передачи, как нарушая активацию янускиназ, так и
разрушая образованные в процессе каскада цитокин-опосредованных
реакций белки. Тем не менее, механизмы внутриклеточной передачи сигнала
цитокин-зависимой активации клеток посредством факторов JAK-STATсигналинга и особенности их супрессии при ранах и раневой инфекции не
исследованы. В связи с этим изучение молекулярных механизмов нарушений
иммунного ответа при гнойно-воспалительных заболеваниях, является
перспективными не только для понимания патогенеза заболеваний, но и
поиска новых подходов к диагностике и терапии.
СТЕПЕНЬ НАУЧНОЙ РАЗРАБОТАННОСТИ ТЕМЫ
ИССЛЕДОВАНИЯ.
В настоящее время большое внимание уделяется изучению PRR
рецепторов, таких как TLR, NOD, при различных патологических процессах
(Janeway and Medzhitov, 2002; O'Riordan et al., 2002; Takeuchi and Akira,
2010). Установлено, что при распознавании бактериальной инфекции PRR
инициируют сложные внутриклеточные сигнальные пути, которые вызывают
провоспалительные и противомикробные реакции, позволяющие хозяину
оперативно реагировать на инфекцию (Athman and Philpott, 2004; Philpott and
Girardin, 2004; Kumar and Yu, 2006; Gerold et al., 2007; Mogensen, 2009;
Takeuchi and Akira, 2010; Stokes et al., 2015). TLR играют центральную роль
в распознавании и в стимулировании воспалительных реакций хозяина. Они
активируют
клетки
врожденного
иммунитета
и
способствуют
специфическому адаптационному иммунитету к патогену посредством их
действия на антигенпредставляющие клетки (Dalpke et al., 2001; Athman and
Philpott, 2004; Kumar and Yu, 2006; Tapping, 2009).
Запуск PRR и
сигнализации цитокинов в иммунных эффекторных клетках индуцирует
экспрессию противовоспалительных и противомикробных медиаторов, а
также регуляторные факторы, которые координируют устранение патогена и
инфицированных клеток (Mogensen, 2009; Takeuchi and Akira, 2010; Stokes et
al., 2015). Работами Rawlings et al., 2004; Mogensen, 2009 показано, что этот
процесс в основном происходит путем активации сигнальных путей JAK /
STAT и приводит к экспрессии генов и продуцированию множества молекул,
включая массив цитокинов, хемокинов, факторов роста и иммунных
рецепторов. Дефекты молекул, участвующих в трансдукции сигнала от TLR,
лежат в основе повышенной чувствительности к инфекциям (Dumitru et al.,
2000; Kumar and Yu, 2006; Freudenberg et al., 2008, Mogensen, 2009).
Основные направления исследований в мировой и Российской науке по
данной проблеме заключаются в изучении полиморфизма генов TLR,
нарушений экспрессии TLR и распознаваний лигандов при аутоиммунных и
аллергических заболеваниях, первичных иммунодефицитных состояних и др.
В тоже время дисрегуляция или дисбаланс сигнального каскада при гнойновоспалительных заболеваниях изучены недостаточно, а имеющиеся в
доступной литературе данные достаточно противоречивы (Baetz et al., 2007;
Dalpke et al., 2008; Skyla A. Duncan, Dieudonné R. Baganizi, Rajnish Sahu,
Shree R. Singh and Vida A. Dennis, 2015, 2016). В последние годы появились
новые данные о том, что супрессор семейства белков цитокинов (SOCS)
является
одним
из
центральных
регуляторов
микробной
патоген-
индуцированной сигнализации цитокинов, главным образом за счет
ингибирования активации сигнальных каскадов JAK / STAT. Кроме того,
обсуждаются последствия участия белков SOCS в различных бактериальных
процессах, а также возможности, обусловленные этими белками для их
будущего целевого использования в антимикробной терапии (Yoshimura et
al., 2012; Trengove andWard, 2013; Chaves de Souza et al., 2013; Kyoko InagakiOhara, 2014). Вместе с тем роль этих белков в регуляции уровня
индуцированной микробным патогеном сигнальной активации цитокинов с
использованием каскадов JAK/STAT и опосредованные этим исходы
различных бактериальных инфекций мягких тканей не исследованы.
ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Пaциенты с гнойными ранами и раневой инфекцией, мононуклеaры
периферической крови.
ПРЕДМЕТ ИССЛЕДОВAНИЯ.
Молекулярные
и
клеточные
мехaнизмы,
контролирующие
воспалительный процесс при раневой инфекции.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВAНИЯ.
Охарактеризовать роль нарушений JAK-STAT-сигнальной трансдукции
и
SOCS-регуляции
в
цитокин-зависимой
активации
воспалительных заболеваниях мягких тканей.
ЗAДAЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.
при
гнойно-
1. Изучить уровень негативных регуляторов клеточной сигнализации
SOCS 1,3,6 при различных видах гнойно-воспалительных заболеваний
мягких тканей.
2. Исследовать уровень трaнскрипционных фaкторов STAT1, STAT3,
STAT6 у больных с гнойными ранами.
3.
Установить
провоспалительных
и
изменения
уровней
противовоспалительных
экспрессии
цитокинов
TLR-2,
с
учетом
изменений экспрессии негативных регуляторов SOCS 1, SOCS 3, SOCS 6 в
различные фазы воспалительного процесса при раневой инфекции.
МЕТОДОЛОГИЯ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Метoдoлoгия даннoй рабoты спланирoвана сoгласнo цели исследoвания
и включает сoвременные метoды научнoгo пoзнания для oпределения
характеристик кoмпoнентoв, неoбхoдимых для решения пoставленных задач.
Общенаучные методы исследования включали информационный поиск
и
проведение патентных исследований по теме работы в базах научной
периодики (PubMed, Scopus, Web of Science), обобщение материала, его
анализ и структурированное изложение. В рабoте применялся кoмплекс
клинических, иммунoлoгических, статистических метoдoв исследoвания.
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ОСНОВА ИССЛЕДОВАНИЯ.
Теоретической основой работы
послужили
труды,
посвященные
современным исследованиям по изучению JAK/STAT сигнальных путей при
различных иммунопатологических состояниях (Cooney, 2002; Elliott and
Johnston, 2004; Croker et al., 2008; Tamiya et al., 2011; Skyla A. Duncan,
Dieudonné R. Baganizi, Rajnish Sahu, Shree R. Singh and Vida A. Dennis, 2016),
новым сведениям о роли белков SOCS в период бактериальных инфекций и в
регуляции антибактериальных иммунных реакций (Rawlings et al., 2004;
Abbas et al., 2012; Yoshimura et al., 2012; Trengove andWard, 2013; Kyoko
Inagaki-Ohara, 2014), а также возможностям целевого использования этих
белков в антимикробной терапии (Kinjyo et al., 2002; Baetz et al., 2004; Croker
et al., 2008; Manicassamy and Pulendran, 2009; Fujimoto and Naka, 2010).
ЭМПИРИЧЕСКАЯ/ПРАКТИЧЕСКАЯ ОСНОВА ИССЛЕДОВАНИЯ.
Эмпирическую базу работы составили материалы научных и научнопрактических конференций по вопросам иммунологии, в том числе,
посвященные JAK-STAT-сигнальной активации и SOCS-регуляции при
различных заболеваниях (2008-2018 гг.). Реализованы возможности доступа к
электронным
электронная
библиотечным
библиотека
системам
и
eLIBRARY.RU»,
базам
данных
«Электронная
(«Научная
медицинская
библиотека. Консультант врача», IPRbooks, «Электронная библиотека
диссертаций Российской государственной библиотеки»; Scopus,
Web of
Science Core Collection, «Консультант ПЛЮС», «РУКОНТ» и др.), интернеттехнологии, лицензионное программное обеспечение.
НAУЧНAЯ НОВИЗНA.
Впервые проведено исследование уровня негативных регуляторов
клеточной сигнализации SOCS 1,3,6 в периферической крови больных с
гнойными ранами и раневой инфекцией.
Впервые установлены особенности сигнализации трaнскрипционных
фaкторов STAT1, STAT3, STAT6 у больных с гнойными ранами.
Впервые сопоставлены
особенности
уровней экспрессии TLR-2,
провоспалительных и противовоспалительных цитокинов и негативных
регуляторов транскрипции генов SOCS 1, SOCS 3, SOCS 6 при раневой
инфекции в различные фазы воспалительного процесса.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ПОЛОЖЕНИЯ.
Установлено, что гнойные раны характеризуются разнонаправленными
изменениями
уровней
провоспалительных
и
экспрессии
TLR-2,
дисбалансом
противовоспалительных
продукции
цитокинов,
а
также
негативных регуляторов цитокиновой сигнализации SOCS 1, SOCS 3 и SOCS
6, что определяет тяжесть течения воспалительного процесса при раневой
инфекции.
При гнойных ранах и раневой инфекции установлены особенности
сигнализации
трaнскрипционных
фaкторов
STAT1,
STAT3,
STAT6,
обусловленные дефектом негативного регуляторного контроля SOCSбелками.
СТЕПЕНЬ ДОСТОВЕРНОСТИ И АПРОБАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ.
Достоверность результатов работы обеспечена достаточным объемом
исследований, использованием сертифицированных лабораторных методов,
наборов
реагентов,
иммунологических
анализаторов
и
применением
современной компьютерной программы для статистической обработки
полученных данных. Основные результаты работы доложены и обсуждены
на XYI Всероссийском научном Форуме с международным участием имени
академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» - 2017,
Международной
научно-практической
конференции
«Трансляционная
медицина», Орел, 2017.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ПОЛОЖЕНИЯ.
Нами были обследованы 145 больных с гнойными ранами (средний
возраст 42,73,5 лет), получавших традиционное лечение: 85 – с ранами
после
вскрытия
абсцессов
и
флегмон
мягких
тканей;
30
–
с
посттравматическими ранами; 30 – с флегмонозно-некротической формой
рожи.
Мононуклеары периферической крови здоровых лиц и больных с
раневой инфекцией выделяли с использованием метода дифференциального
центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографин. Разделение
суммарной
фракции
мононуклеаров
на
моноциты
и
лимфоциты
осуществляли посредством избирательной адгезии моноцитов к пластику.
Для получения раневого экссудата (РЭ) использовали стерильные
марлевые тампоны, которые помещали в рану с экспозицией на 20-30 секунд.
После аппликации пропитанный тампон вносили в пробирку с 0,2 мл 0,9%
раствора натрия хлорида на 30 минут с последующим его удалением после
центрифугирования в течение 5 минут при 1500 об./мин. Оценка экспрессии
TOLL-2 рецепторов производилась путем подсчѐта CD282+ клеток с
помощью
моноклональных
антител
Hbt
(Нидерланды)
непрямым
иммунопероксидазным методом.
С учетом современных данных о важной роли дефектов сигнальных
путей в патогенезе иммуноопосредованной патологии методом ИФА были
исследованы уровни в периферической крови и раневом экссудате SOCS
1,3,6 и STAT1, STAT3, STAT6.
Результаты проведенных исследований показали, что гнойные раны
характеризуются разнонаправленными изменениями уровней экспрессии
TLR-2. Так у 76% больных с гнойными ранами в течение первых 6 суток,
определялся более высокий уровень экспрессии TLR2 клетками раневого
экссудата (повышение числа CD282+ клеток до 74,51,5%), по сравнению с
мононуклеарными фагоцитами (МНФ) крови здоровых лиц и больных
(42,52,5% и 61,44,5%, соответственно), что, коррелировало с повышенной
концентрацией микробных патогенов в зоне инфекционно-воспалительного
процесса. Установлено, что при неосложненном течении раневого процесса
уровень экспрессии TLR2 клеточных рецепторов, как правило, снижался к 9
суткам.
Низкое
(ниже
40%)
содержание
в
РЭ
CD282+
клеток,
экспрессирующих TLR2, регистрировалось только у больных с обширными
и хроническими гнойными ранами. При этом у 64,5% больных с затяжной и
хронической раневой инфекцией число CD282+МНФ периферической
крови соответствовало показателям здоровых лиц, т.е. было снижено по
сравнению с количеством
CD282+ клеток при благоприятном течении
раневого процесса, что, по-видимому, свидетельствует о неполноценности
механизмов
противомикробной
защиты
и
снижении
адаптационных
возможностей у данной категории пациентов. При этом повышение числа
TLR2+клеток периферической крови регистрировалось у 35,5% пациентов с
затяжными и хроническими гнойными ранами. Более неблагоприятные
изменения динамики цитологических показателей имели место у больных с
флегмонозно-некротической формой рожи. При этом более высокий «темп»
прироста СD282+ клеток сочетался с более благоприятной клинической
динамикой раневого процесса.
Известно, что при активации TLR запускается сигнальный каскад,
приводящий к выработке цитокинов и др. регуляторных молекул. В связи с
этим нами был исследованы особенности цитокинового статуса у больных с
раневой инфекцией. Анализ полученных результатов показал, что у 75%
больных с типичным течении раневого процесса наблюдается увеличение
синтеза воспалительных цитокинов,
коррелирующее с благоприятным
течением раневого процесса. Хроническая форма раневой инфекции, как
правило,
сопровождалась
гиперпродукцией
воспалительных
и
противовоспалительных (ИЛ-10, ИЛ-1Ra, ТФР-β1) цитокинов, а снижение
продукции ИЛ-1β, ИЛ-8, ИЛ-6, ФНО-α на фоне затяжного течения
патологического процесса в мягких тканях регистрировалось у 12% больных.
Исследования концентраций воспалительных цитокинов в РЭ в острую фазу
раневого процесса выявили повышение их уровня по сравнению со
стандартными значениями для биологических жидкостей в 87% случаев. При
этом более высокие концентрации в раневой жидкости отмечены для ИЛ-1β
и ИЛ-8 при хроническом течении раневой инфекции, что у 66% данных
пациентов сочеталось с повышенным уровнем в сыворотке крови ИЛ-1β,
ИЛ-6 и ФНО-α, а у 15% - ИЛ-1β. Концентрации ИЛ-10 и ТФР-β1 в раневой
жидкости, полученной из длительно незаживающих ран, значительно
превышали (на 20-45%) уровни данных противовоспалительных цитокинов в
заживающих ранах.
При этом большой интерес, представляют полученные данные о
дисбалансе продукции фaкторов трaнскрипции STAT1,3,6 и супрессоров
цитокинового сигнaлa SOCS 1,3,6 при гнойных ранах, определяющих
цитокин-зaвисимую регуляцию клеток.
Так у всех пациентов было выявлено повышение уровня экспрессии
транскрипционного фактора STAT1 и 6. При этом у 28% обследованных лиц
данные показатели имели диапазон значений от 1500 до 2500 пкг/мл и выше.
Кроме того, важное значение, на наш взгляд, в оценке тяжести иммунной
дисфункции у больных с гнойными ранами имел разработанный нами
интегральный коэффициент STAT6/STAT1, повышенные значения которого
коррелировали с тяжестью патологического процесса в мягких тканях. Для
STAT3 были установлены разнонаправленные изменения уровней в
сыворотке крови. При этом у 76% больных его значения составили
237,4±0,03 пкг/мл.
Учитывая,
что
специфичность
различных
SOCS
определяется
цитокинами, а не конкретными STAT, что позволяет SOCS регулировать
антагонистические взаимоотношения между цитокинами, заслуживают
внимание данные о дисбалансе продукции SOCS 1 и повышенной продукции
SOCS 3 у исследуемой группы пациентов, что может иметь решающее
значение не только в иммунной поляризации Тх2, характеризующихся
повышенной экспрессией SOCS 3, но и в развитии локальной и системной
цитокин-зависимой
иммуносупрессии.
Это
подтверждается
выше
приведенными данными о значительном повышении концентрации ИЛ-10 в
раневой жидкости, полученной из длительно незаживающих ран. Следует
отметить, что у данной группы пациентов регистрировались низкие
показатели γИФН, что согласуется с данными литературы о возможности
ИЛ-10 подавлять ИФН сигнал, инициируя синтез SOCS 3.
Таким образом, нарушение транс-сигнализационной регуляции может
быть одной из причин иммунной дисфункции при гнойных ранах, что
обосновывает актуальность дальнейшего изучения этих процессов при
данной патологии.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
Многочисленные исследования последних лет посвящены изучению
иммунных нарушений в генезе воспалительных заболеваний кожи и гнойных
ран. Однако молекулярные механизмы нарушений иммунного ответа при
гнойных ранах исследованы недостаточно и являются дискутабельными, а
закономерности
дисрегуляции
компонентов
противоинфекционного
иммунитета при раневой инфекции при данной патологии нуждаются в
уточнении. Учитывая изложенное, в данной работе ставилась цель
охарактеризовать роль нарушений JAK-STAT-сигнальной трансдукции и
в
SOCS-регуляции
цитокин-зависимой
активации
при
гнойно-
воспалительных заболеваниях мягких тканей.
Изучение особенностей
экспрессии TLR-2, провоспалительных и
противовоспалительных цитокинов и негативных регуляторов транскрипции
генов
SOCS
1,
SOCS
3,
SOCS
6
при
гнойных
ранах
выявило
разнонаправленные изменения их уровней, коррелирующие с тяжестью
течения воспалительного процесса при раневой инфекции.
Кроме того, у всех пациентов было установлено повышение экспрессии
транскрипционного фактора STAT1 и 6, а также разнонаправленные
изменения в сыворотке крови уровней STAT3. Учитывая важность
интегральных коэффициентов в оценке течения патологических процессов,
при статистической обработке результатов исследования был разработан
интегральный
показатель
соотношения
STAT6/STAT1,
повышенные
значения которого коррелировали с тяжестью иммунной дисфункции у
больных с гнойными ранами.
Полученные данные, характеризующие STAT-сигнализацию при
гнойных ранах, свидетельствуют о множественности и гетерогенности
регуляторных нарушений как на рецепторном уровне, так и на уровне
транскрипционных факторов и их регуляторов.
Результаты проведенных исследований перспективны и важны с
практической точки зрения, так как лучшее понимание молекулярных
механизмов контроля иммунной реакции и воспаления является ключом к
разработке эффективных целевых терапевтических препаратов и вакцин.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ НАУЧНОКВАЛИФИКАЦИОННОЙ РАБОТЫ.
1. Динамика изменения концентрации метаболитов оксида азота при
раневой инфекции. Шохина М.Д., Снимщикова И.А., Халилов М.А.,
Честнихина А.Д., Афонина И.А., Кабина Н.А. Медицинская иммунология.
2017. Т. 19. - С. 335-336.
2. Патогенетические
аспекты
нарушений
транс-сигнализационной
регуляции при гнойных ранах и раневой инфекции. Кабина Н.А.,
Снимщикова И.А., Халилов М.А., Шохина М.Д. Сборник статей по
материалам ХХХІII международной научно-практической конференции
«Актуальные проблемы науки ХХІ века», 1 часть, Москва, 2018. – С. 16-20.
3. Лечение
раневого
и
профилактика
процесса.
Снимщикова
иммунных
И.А.,
нарушений
Кабина
Н.А.
осложненного
Методические
рекомендации для студентов и ординаторов. Препринт, Орел, 2018, 20с.
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа