close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Макогон Дарья Александровна. Влияние физиологического состояния дрожжей Yarrowia lipolytica на способность к продуцированию лимонной кислоты и биоэмульгаторов

код для вставки
2
3
4
АННОТАЦИЯ
Выпускная квалификационная работа на тему «Влияние физиологического
состояния дрожжей Yarrowia lipolytica на способность к продуцированию
лимонной кислоты и биоэмульгаторов».
Год защиты: 2018.
Направление подготовки: 19.04.01 «Биотехнология».
Студент группы: 61БТ-м Макогон Д.А.
Руководитель: к.т.н. Винокуров А.Ю.
Ключевые
слова:
Yarrowia
lipolytica,
дрожжи,
лимонная
кислота,
биоэмульгаторы, клетки, мицелий, синтез, культуральная жидкость, ферментация.
Выпускная квалификационная работа состоит из введения, аналитического
обзора литературы, возможных механизмов повышения скорости утилизации
углеводородов и синтеза лимонной кислоты клетками Yarrowia lipolytica, раздела
объектов и методов исследования, экспериментальной части, выводов и
рекомендаций, списка использованных источников и приложений.
Общий
объем
работы
составляет
82
страницы.
Работа
содержит
32 рисунка, 4 таблицы и 2 приложения. Список использованных источников
включает 100 наименований.
Графическая часть выпускной квалификационной работы выполнена в
редакторе презентаций Power Point 2010 и включает схемы, таблицы, графики и
диаграммы, представленные на 20 листах формата А4.
Данная выпускная квалификационная работа прошла проверку в система
«Антиплагиат.ВУЗ». Справка прилагается (Приложение 1).
5
ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Тема ВКР: «Влияние физиологического состояния дрожжей Yarrowia lipolytica
на способность к продуцированию лимонной кислоты и биоэмульгаторов».
Предмет ВКР: штамм дрожжей Y. lipolytica HMM-187, дизельное топливо с
повышенным содержанием нормальных парафинов с относительно длинным
углеродным скелетом, питательные среды.
Характер ВКР: прикладная научно-исследовательская работа.
Цель ВКР: изучение физиологического состояния дрожжей Y. lipolytica,
технологии их культивирования на углеводородсодержащих средах и разработка
мер по увеличению скорости биосинтеза лимонной кислоты.
Методы
исследования:
углеводородсодержащих
культивирование
средах,
исследование
микроорганизмов
ферментационной
среды
на
и
культуральной жидкости методами оптической микроскопии, спектрофотометрии,
потенционометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Полученные результаты: физиологическое состояние дрожжей оказывает
важное влияние на их способность накапливать в ферментационной среде лимонную
кислоту. Наибольшая активность биосинтеза была обнаружена в цикле ферментации,
в котором поддерживали уровень рН на уровне 5,5 и при ограниченном поступлении
кислорода в ферментер. Кроме того мицелиальная форма дрожжей характеризуется
наибольшей способностью к выделению внеклеточных эмульгаторов.
Новизна: использование альтернативных продуцентов для биосинтеза
лимонной кислоты.
Область
применения:
промышленная
биотехнология,
производство
органических кислот, утилизация углеводородсодержащих соединений.
Возможность практической реализации: по результатам разработаны меры
применимые в крупнотоннажном производстве по повышению способности к
продуцированию лимонной кислоты.
6
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 8
ГЛАВА 1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ ........ 10
1.1 Продуценты и способы получения лимонной кислоты ...................................... 10
1.2 Физиолого-биохимическая характеристика дрожжей Y. lipolytica .................... 15
1.3 Факторы, определяющие эффективность производства лимонной кислоты
дрожжами Y. lipolytica................................................................................................... 25
1.4 Отличия строения и особенности биохимии клеток, утилизирующие
углеводороды ................................................................................................................. 29
Выводы по главе 1 .......................................................................................................... 34
ГЛАВА
2
ВОЗМОЖНЫЕ
МЕХАНИЗМЫ
ПОВЫШЕНИЯ
СКОРОСТИ
УТИЛИЗАЦИИ УГЛЕВОДОРОДОВ И СИНТЕЗА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ
КЛЕТКАМИ Y. LIPOLYTICA ....................................................................................... 35
ГЛАВА 3 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ............................................ 43
3.1 Объекты исследования ........................................................................................... 43
3.2 Методы исследования ............................................................................................. 44
3.2.1 Приготовление питательных сред для активации и накопления биомассы
дрожжей Y. lipolytica ..................................................................................................... 44
3.2.2 Посев и культивирование при поддержании и получении накопительной
культуры ......................................................................................................................... 45
3.2.3 Этапы подготовки посевного материала, проведение процесса ферментации
и анализа культуральной жидкости............................................................................. 45
3.2.4 Исследование проб ферментационной среды ................................................... 49
3.2.4.1 Определение концентрации клеток в ферментационной среде ................... 49
3.2.4.2 Определение эмульгирующей способности культуральной жидкости ....... 50
7
3.2.4.3 Определение содержания лимонной кислоты................................................ 51
3.2.4.4 Определение оптимума рН культуральной жидкости .................................. 52
ГЛАВА 4 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ АНАЛИЗ ............................... 53
4.1 Изучение особенности роста культуры дрожжей ................................................ 53
Y. lipolytica HMM-187 на питательных средах различного состава ......................... 53
4.2 Изучение диморфизма дрожжей Y. lipolytica HMM-187 ..................................... 55
4. 3 Изучение влияния рН среды на физиологическое состояние клеток дрожжей
Y. lipolytica ...................................................................................................................... 58
На рисунке 24 представлены ........................................................................................ 58
4.4 Изучение влияния рН среды и концентрации кислорода в культуральной
жидкости на биосинтез лимонной кислоты и эмульгирующую способность клеток
Y. lipolytica HMM-187 .................................................................................................... 60
4.4.1 Описание и результаты реализованных в работе циклов ферментации ........ 60
4.4.2 Особенности морфологии клеток дрожжей Y. lipolytica в трех циклах
ферментации .................................................................................................................. 62
4.4.3 Анализ влияния рН среды и концентрации кислорода на продуцирование
дрожжами Y. lipolytica HMM-187 лимонной кислоты ............................................... 63
4.5 Анализ влияния рН среды и концентрации кислорода на эмульгирующую
способность клеток Y. lipolytica HMM-187 ................................................................. 66
Выводы по главе 4 ........................................................................................................ 67
ВЫВОДЫ ....................................................................................................................... 69
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ ..................................................... 70
Приложение 1 ................................................................................................................ 81
Приложение 2 ................................................................................................................ 82
8
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время микробиологический синтез занимает одну из лидирующих
позиций
в
крупнотоннажном
производстве
химических
соединений
различной
функциональной направленности. В частности, на смену традиционным методам
экстрагирования или химического синтеза при получении лимонной кислоты, находящей
свое применения в различных отраслях промышленности и в быту, пришли технологии,
основанные на культивировании микроорганизмов-продуцентов на углеводород- и
углеводсодержащих субстратах. Широко применяемые штаммы плесневых грибов
Aspergillus niger (далее по тексту – A. niger) имеют ряд недостатков, связанных с возможной
патогенностью, технологическими сложностями при культивировании, высокими
требованиями к составу субстрата. В этом аспекте представляется актуальной работа,
посвященная поиску или изучению других продуцентов лимонной кислоты, а также
субстратов, которые могли бы быть использованы для биосинтеза. Особый интерес
вызывает возможность обоснования применения дешевых сырьевых ресурсов, например
относящихся к отходам нефтехимической или перерабатывающей промышленности.
Как показывает анализ литературных данных, в качестве альтернативы A. niger могут
рассматриваться штаммы дрожжей Yarrowia lipolytica (далее по тексту – Y. lipolytica),
ассимилирующие в качестве источников органического углерода широкий спектр
соединений (углеводороды, углеводы, спирты, глицерин, и т. д.).
В связи с изложенными положениями, целью данной работы является изучение
физиологического состояния дрожжей Y. lipolytica, параметров технологии их глубинного
культивирования
на
углеводородсодержащих
обеспечивающих
увеличение
скорости
субстратах
биосинтеза
ими
и
разработка
лимонной
мер,
кислоты
и
биоэмульгаторов.
Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:
1) аналитический обзор литературных источников, посвященных
изучению
физиологического состояния и условий промышленного культивирования дрожжей
Y. lipolytica;
9
2) изучение особенностей биохимических процессов, протекающих в клетках,
утилизирующих нерастворимый в воде углеводородный субстрат;
3) отработка методов активации и накопления биомассы для инокуляции в
ферментационную установку;
4) разработка приемов, обеспечивающих интенсификацию продуцирования
лимонной кислоты дрожжами Y. lipolytica, и проверка их эффективности в лабораторных
условиях;
5) определение влияния рН-среды и содержания кислорода в культураьной жидкости
на биосинтез лимонной кислоты.
Основными теоретическими методами исследования является анализ литературных
источников, а также моделирование процесса биосинтеза лимонной кислоты с учетом
специфики продуцента и физико-химических свойств субстрата. В работе были
использованы следующие методы экспериментального исследования: культивирование
микроорганизмов с использованием питательных сред различного состава, исследование
ферментационной среды и культуральной жидкости методами оптической микроскопии,
спектрофотометрии, потенционометрии, а также высокоэффективной жидкостной
хроматографии (далее по тексту – ВЭЖХ).
Выпускная квалификационная работа содержит введение, 4 главы, 4 таблицы,
32 рисунка, общие выводы по работе и список литературы, включающий 100 источников, из
которых 85 – иностранные.
Теоретическая значимость работы заключается в изучении физиологического
состояния дрожжей Y. lipolytica при развитии на различных питательных средах и
выявление роли таких факторов, как рН-среды и уровень кислорода на накопление
лимонной кислоты в культуральной жидкости, а также анализ особенностей развития
микроорганизмов в гетерогенных системах, содержащих водонерастворимый субстрат,
Практическая значимость состоит в отработке процесса накопления биомассы
дрожжей Y. lipolytica, способов их культивирования, приложении метода ВЭЖХ для
определения количества лимонной кислоты в культуральной жидкости.
ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ
ИСТОЧНИКОВ
1.1 Продуценты и способы получения лимонной кислоты
Лимонная кислота является уникальной в своем роде, так как широко
применяется в различных отраслях промышленности. Лимонная кислота
необходима в пищевой промышленности для производства алкогольных и
безалкогольных напитков, ее используют для осветления и улучшения вкуса, в
кондитерских изделиях, при рафинировании растительных масел и производства
сгущенного молока. Значительное увеличение потребления лимонной кислоты
стимулирует секреторные функции поджелудочной железы, способствует
выделению поджелудочного сока и повышению усвояемости пищи. Натриевые
соли
лимонной
кислоты
способны
стимулировать
пенообразование
и
поддерживать механическую устойчивость пены, поэтому лимонную кислоту
используют в кулинарии при изготовлении выпечки, как антиоксидант,
консервант, для контроля рН продукта.
При
производстве
молочных
продуктов
используется
в
качестве
эмульгатора для стабилизации, улучшает органолептические свойства продукта.
Лимонная кислота играет важную роль в процессе дубления кожи, окраске
тканей, очистке паровых котлов, изготовлении чернил, выступает в качестве
хелатирующего агента.
В фармакологии лимонная кислота используется для консервирования
крови, при изготовлении витаминных препаратов, болеутоляющих порошков и
таблеток. Как антикоагулянт, в качестве вкусового и стабилизирующего агента в
жидких суспензиях и растворах входит в состав шипучих растворимых таблеток и
маскирует горький вкус, а также применяется в качестве диетической добавки.
Также лимонную кислоту применяют в нанобиотехнологии, тканевой
инженерии. Она может быть использована в составах противоопухолевых
препаратов. Может использоваться в качестве сополимера при производстве
наноматериалов, которые, в свою очередь, используются в нанолекарствах [8].
11
Лимонная кислота является одним из главных промежуточных продуктов
метаболического цикла трикарбоновых кислот (далее по тексту – ЦТК), который
является основным путем получения энергии для аэробов. Как следствие,
лимонная кислота содержится во многих организмах в различных количествах.
Особенно ее много в незрелых фруктах и ягодах (лимонах, клюкве, яблоках,
винограде, бруснике и др.) – до 50 % и в соках – до 9 % (от общего содержания
всех органических кислот в продукте), где лимонная кислота является
естественным консервирующим агентом. Особенно много лимонной кислоты
содержится в лимонах. Поэтому долгое время лимонную кислоту получали из
сока лимона, а также из махорки. Однако на сегодняшний день основной путь
промышленного
производства
является
биосинтез
лимонной
кислоты
промышленными штаммами плесневого гриба A. niger при культивировании на
средах, содержащих сахаристые вещества (например, мелассу).
Процесс производства лимонной кислоты из плесневого гриба A. niger
включает все основные стадии биотехнологии [9]:
1) получение посевного материала;
2) подготовка сырья;
3) стерилизация;
4) ферментация;
5) отделение биомассы продуцента - мицелия;
6) выделение лимонной кислоты из культурной жидкости и получение ее в
кристаллическом виде.
В
промышленном
производстве
лимонной
кислоты
используется
поверхностные и глубинные способы культивирования.
При реализации поверхностного способа культивирования ферментация
осуществляется в закрытых помещениях в специальных камерах, которые
оснащены системой подачи стерильного воздуха, и в которых на стеллажах
расположены кюветы. Кюветы изготавливают из алюминия или нержавеющей
12
стали прямоугольной формы. Внесение питательной среды в кюветы и отбор из
них культуральной жидкости осуществляется через штуцеры на дне кювет.
Перед началом цикла ферментации камеры и кюветы тщательно промывают
и стерилизуют. После охлаждения камер в кюветы вносят питательную среду
слоем, при помощи специального распылителя в кюветы с питательной средой
вносят посевной материал – конидии гриба A. niger. В процессе ферментации
поддерживают необходимую температуру, контролируют уровень подачи
кислорода, содержание сахаров и кислот в культуральной жидкости. При
накоплении лимонной кислоты в культуральной жидкости на уровне 12-20 %
прекращают процесс ферментации. Культуральную жидкость сливают из кювет в
сборник, откуда ее подают в химический цех для выделения лимонной кислоты.
Мицелий гриба тщательно отмывают горячей водопроводной водой от
кислоты и используют в производстве кормов для животных.
Периодические способы ферментации имеют некоторые недостатки:
маленькая скорость ферментации; в конце цикла мицелий утилизируют, хотя он
еще жизнеспособен, а для получения нового мицелия требуются затраты конидий,
мелассы и времени на его рост; во всех кюветах трудно одновременно
поддерживать постоянную температуру, поэтому ферментация происходит
неравномерно.
Вместе с тем за рубежом существуют способы ферментации на твердых
средах, которые также являются поверхностными способами ферментации. В
Японии практикуют твердофазное культивирование специальных штаммов
A. niger на пшеничных отрубях. Твердофазная ферментация предусматривает
использование твердого пористого материала, пропитанного питательной средой,
как багасса, картофель, пульпа сахарной свеклы и др. в определенных
соотношениях. Загрязнение субстрата металлами является проблемой в таком
процессе, так как их труднее удалять, чем в других видах ферментации. Поэтому
проводят селекцию штаммов и используют только те, которые устойчивы к
металлам.
13
Глубинное культивирование гриба A. niger является более продуктивным,
чем поверхностный способ. При этом питательная среда заливается в хорошо
аэрируемые ферментеры с функцией автоматическим перемешиванием и
возможностью контроля подачи кислорода воздуха. Глубинная ферментация
может осуществляться разными вариантами: периодической ферментацией с
подпиткой и непрерывной.
Синтез лимонной кислоты при глубинном культивировании гриба A. niger
проводят в ферментерах и в качестве посевного материала используют уже
подросший мицелий, полученный в отдельных аппаратах.
Раствор мелассы готовят так же, как и при поверхностном культивировании,
но исходный раствор мелассы для глубинной ферментации не должен превышать
4 % сахаров.
В
процессе
культивирования
на
определенной
стадии
происходит
вспенивание среды. Для того, чтобы предотвратить этот процесс вводят
небольшими порциями олеиновую кислоту в качестве пеногасителя. По общей
концентрации сахаров и кислотности определяют конец ферментации.
После
окончания
процесса
ферментации
культуральную
жидкость
нагревают острым паром до 60-65 °С и сливают в сборник, а оттуда подают на
вакуум-фильтр для отделения и промывки биомассы мицелия. Очищенный
мицелий используется как корм для животных. Культуральную жидкость,
содержащую лимонную кислоту, вместе с промывными водами направляют в
химический цех для выделения лимонной кислоты.
Суть отъемно-долевного способа ферментации заключается в том, что в
процессе
культивирования
соответствующими
продолжают
предварительными
подливать
отъемами
мелассную
жидкости.
среду
В
с
начале,
ферментацию проводят как при периодическом способе, затем подливают
дополнительное количество среды в 3-4 приема.
14
Преимуществом непрерывной ферментации A. niger перед периодической,
является то, что A. niger проявляет большую кислотообразующую способность за
счет изменения своей морфологии.
Недостатком непрерывной ферментации в одном аппарате является проскок
неферментированного сахара и невозможность проведения без прерывания
процесса профилактической стерилизации. Более перспективным методом,
исключающим указанные недостатки, представляется схема с несколькими
последовательно соединенными аппаратами [4].
Исходя
из
выше
сказанного,
весь
производственный
процесс
культивирования гриба A. niger имеет ряд недостатков: медленный рост
продуцента, что обуславливает высокую длительность процесса накопления
биомассы; повышенная вязкость культуральной жидкости, вследствие чего
затрудняется массообмен. Последнее обусловливает высокие требования к
аэрации, приводящие к увеличению расхода энергии на перемешивание.
Использование в качестве продуцента лимонной кислоты гриба A. niger
представляется сложным, экологически небезопасным, так как в процессе
ферментации образуются жидкие стоки, содержащие органические вещества,
цианиды, минеральные кислоты, а так же твердые отходы (гипс). Кроме того,
A. niger относится к условно патогенным грибам, которые вызывают аллергию и
такое заболевание, как аспергиллез.
Перспективным является поиск других видов микроорганизмов – дрожжей,
бактерий, которые не имеют перечисленных недостатков.
В последние годы дрожжи стали рассматривать как альтернативу для
получения различных веществ, включая органические кислоты.
Наиболее
перспективными
продуцентами
лимонной
кислоты
представляются дрожжи вида Y. lipolytica. На сегодняшний день известно и
изучено большое количество штаммов Y. lipolytica – продуцентов лимонной
кислоты, развивающихся на средах, содержащих различные соединения: глюкозу,
15
н-алканы, ацетат, глицерин, этанол, жирные кислоты и другие вещества в
качестве источников углерода.
1.2 Физиолого-биохимическая характеристика дрожжей Y. lipolytica
Y.
является
lipolytica
одним
из
наиболее
широко
изученных
«нетрадиционных» дрожжей. Будучи строго аэробными микроорганизмами, они
способны продуцировать важные метаболиты, характеризуются интенсивной
секреторной активностью. Это оправдывает усилия по использованию их в
промышленности
(как
биокатализатора),
в
молекулярной
биологии
и
генетических исследованиях. Дрожжи Y. lipolytica способны производить
лимонную кислоту, используя различные источники углерода, включая углеводы,
алканы,
растительные
масла,
гидролизаты
крахмала,
этанол
и
глицерин [32, 81, 82].
Название Y. lipolytica было предложено van der Walt and von Arx, а название
«lipolytica» происходит от способности этих дрожжей гидролизовать липиды.
В природе штаммы Y. lipolytica были изолированы из молочных продуктов (сыры:
Камамбер, Рокфор, йогурты, а также из колбас). Способность этих дрожжей
деградировать белки и липиды может быть четко визуализирована путем анализа
внеклеточной липолитической и протеолитической активности. В среде, богатой
липидами, дрожжи выделяют внеклеточную липазу. Интерес ученых и
промышленных исследователей к данным дрожжам связан с ферментом липазой,
поскольку
она
может
использоваться
в
пищевой,
экологической
и
фармацевтической промышленности, в реализации мероприятий по очистке
отходов, при производстве стиральных порошков и моющих средств.
Дикие штаммы Y. lipolytica проявляют разнообразные морфологии колоний,
которые зависят от условий роста и генетического фона и могут варьироваться от
сильно закрученных и матовых до гладких и блестящих.
16
Y. lipolytica имеет шесть хромосом с высоким содержанием G+C (находится
в пределах 49,6-51,7 %); по разным данным размер генома составляет от 12,7 до
22,1 миллионов пар нуклеотидов [26].
Как облигатно-аэробные микроорганизмы, Y. lipolytica очень чувствительны
к концентрации кислорода, которая считается важным фактором для жизненного
цикла и метаболизма. Температуры, пригодные для роста, не должны превышать
32-34 °С [30]. Дрожжи Y. lipolytica не являются патогенным и рассматриваются (в
частности, Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых
продуктов и медикаментов США) как безопасные.
Дрожжи Y. lipolytica характеризуются диморфизмом, имея различные
формы клеточного роста, такие как дрожжевые клетки (рисунок 1) и мицелий
(рисунок 2). Причем в зависимости от условий среды обитания возможен переход
от одной формы к другой.
Рисунок 1 – Микрофотография культуры Y. lipolytica в форме
индивидуальных дрожжевых клеток [25]
17
Рисунок 2 – Микрофотография культуры Y. lipolytica в форме мицелия [25]
Явление диморфизма в случае ряда патогенных грибов особенно важно для
человека
и
растений,
поскольку
физиологическое
состояние
таких
микроорганизмов непосредственно связано с их вирулентностью [64, 75]. Переход
между разными формами развития – сложный процесс, который включает в себя
обширную модификацию клеточной организации в ответ на экологические
сигналы [74]. Переход дрожжей к мицелию связан с однополярным ростом,
асимметричным делением, образованием крупных полярно расположенных
вакуолей и репрессией разделения клеток после деления [37]. Истинный мицелий
Y. lipolytica состоит из гиф с перегородками шириной 3-5 мкм и длиной в
несколько миллиметров. Апикальные клетки часто превышают 100 мкм, в то
время как сегменты измерения 50-70 мкм.
Условия, которые индуцируют диморфный переход дрожжей к мицелию,
очень разнообразны. Среди них изменения температуры, рН, газового состава
атмосферы или наличие/отсутствие конкретных соединений в культуральной
среде [62, 71, 89]. В обычных средах Y. lipolytica растет в виде смеси
дрожжеподобных и коротких мицелиальных клеток. Важно отметить, что
18
условия, которые влияют на диморфизм Y. lipolytica различны в твердых и жидких
средах, и существенно зависят от особенностей используемого штамма [26].
Значение
рН
было
рассмотрено
в
качестве
важнейшего
фактора,
регулирующего диморфной переход. Образование мицелия максимально при рН
около нейтрального, и уменьшается по мере смещения в кислую область. При
рН=3 образование мицелия прекращается. Важно подчеркнуть, что начальное, а
не конечное значение рН среды является более важным для диморфизма [89].
Кроме того, было также выявлено, что временное увеличение внутриклеточного
рН предшествует морфологическому переходу Candida albicans [61, 92].
На сегодняшний день имеется небольшое количество информации о
генетической регуляции процесса диморфизма [32]. Dominguez и др. [39]
установили, что переход Y. lipolytica от отдельных клеток к мицелию и наоборот
связан с условиями окружающей среды и генетическими механизмами
регулирования. Дрожжи Y. lipolytica имеют два сигнальных механизма, которые
участвуют в регуляции указанных переходов: активируемую протеинкиназу и
циклический АМФ-зависимую протеинкиназу. Dominguez и др. [39] показали, что
N-ацетилглюкозамин или сыворотка действуют на одни и те же сигнальные
механизмы во время перехода. Pérez-Campo и Dominguez [85] показали, что
клетки растут, в первую очередь, в виде мицелия, когда в качестве источника
углерода используются N-ацетилглюкозамин или сыворотка. Развитие в виде
отдельных дрожжевых клеток происходит при культивировании на глюкозе в
качестве источника углерода. Guevara-Olvera др. [50] сообщили, что полиамины
синтезируются, как правило, мицелиальными, а не дрожжевыми клетками. При
использовании в качестве источника углерода стоков производства пальмового
масла, штамм Y. lipolytica NCIM 3589 демонстрирует переход к истинному
мицелию [79]. Zinjarde др. [99] сообщили, что формирование мицелия
наблюдается в культуре Y. lipolytica NCIM 3589, когда различные виды масел,
такие как кокосовое и пальмоядровое, содержащие лауриновую и миристиновую
кислоты, были использованы в качестве источников углерода.
19
Обратный переход к дрожжевым клеткам наблюдался при использовании в
качестве субстрата н-додекана. Кроме того, другие факторы окружающей среды,
включая рН, азотное голодание и температуру также влияют на физиологические
переходы Y. lipolytica. Ruiz-Herrera и Sentandreu [89] сообщили о влиянии
различных факторов окружающей среды (в том числе рН, источников углерода и
азота) на формирование мицелия штаммами Y. lipolytica W29 и Po1a.
Bellou др. [28] продемонстрировали, что содержание в среде растворенного
кислорода также влияет на морфологию дрожжей.
Среди гидрофильных источников органического углерода, которые могут
быть использованы для культивирования Y. lipolytica, учеными рассмотрены
сахара, глицерин, этанол и некоторые другие соединения.
Сахара, как эффективные углеродные субстраты, содержащие, прежде
всего, гексозы (например, глюкозу, фруктозу, маннозу и галактозу), а также
другие соединения (такие как лактоза), могут быть усвоены дрожжами. Flores и
др. рассмотрели метаболизм различных источников углерода и путей утилизации
энергии в нетрадиционных дрожжах [43]. Y. lipolytica отличается от S. cerevisiae и
других дрожжей и могут усваивать несколько сахаров, такие как глюкозу и
фруктозу [29]. Кроме того, Lazar и др. [69, 70] показали, что Y. lipolytica имеет
предпочтительное потребления глюкозы над фруктозой при выращивании на их
смеси. Lazar и др. [68] сообщили, что поглощение фруктозы может быть успешно
улучшено за счет гиперэкспрессии гексокиназ. В список эффективных
водорастворимых сахаров не может быть внесена сахароза, потому что в
Y. lipolytica не хватает гена, кодирующего секретируемую инвертазу (EC 3.2.1.26).
Однако использование современных инструментов генной инженерии может в
перспективе устранить данный недостаток [77].
Глицерин,
который
является
побочным
продуктом
производства
биодизельного топлива, может быть использован многими микроорганизмами в
качестве
углеродного
субстрата
для
продуцирования
функциональных
химических веществ. Естественно, чистый глицерин (с массовой долей, по
20
меньшей мере 98 %) является достаточно ценным, так как может быть
использован в качестве промышленного сырья для производства каких-либо
химических веществ. Однако, использование для различных задач (например, для
химического синтеза или в качестве добавки при кормлении крупного рогатого
скота) сырого глицерина, имеющего низкую чистоту (массовая доля в диапазоне
75-83 %) и сильно загрязненного различными примесями, такими как соли,
метанол и остатки жирных кислот, достаточно затруднительно.
Кроме того, штаммы Y. lipolytica при выращивании в условиях,
лимитирования некоторых питательных веществ, способны вырабатывать
лимонную кислоту на различных источниках углерода, включая сахара, алканы,
растительные масла, гидролизаты крахмала, этанол и сырой глицерин (основной
побочный продукт в производстве биодизеля) [35].
Следует отметить, что при выращивании на смеси глюкозы и сырого
глицерина – дикий штамм Y. lipolytica LGAM S (7) 1 использует глицерин для
производства лимонной кислоты [62]. В последнее время Workman др. [95] также
показали, что глицерин метаболизируется до утилизации глюкозы при
периодической ферментации Y. lipolytica IBT 446.
Y. lipolytica может ассимилировать этанол благодаря наличию эндогенных
функциональных генов, кодирующих алкогольдегидрогеназы (EC 1.1.1.1) и
дегидрогеназы альдегидов (EC 1.2.1.3). Barth и Gaillardin [26] показали, что
Y. lipolytica может выжить в среде с концентрацией этанола до 3 % (об/об).
Однако более высокие концентрации этанола невыгодны для роста Y. lipolytica,
потому что они будут нарушать клеточную мембрану и инактивировать
некоторые функциональные белки. Следует отметить, что эта функциональная
активность ферментов удивительно репрессирована в Y. lipolytica, когда глюкоза
используется в качестве источника углерода. Более того, Y. lipolytica может
эффективно использовать ацетат в качестве единственного источника углерода в
ферментационном процессе. Было сообщено, что при концентрации до 0,4 %
ацетат натрия хорошо переносится клетками Y. lipolytica, при содержании 0,4-
21
1,0 % снижается скорость развития, при содержании более 1,0 % – наблюдается
ингибирование роста клеток [26]. Это происходит потому, что при более высоких
концентрациях ацетата натрия может происходить увеличение рН в результате
его потребления. Высокое значение рН может останавливать рост клеток.
Гидрофобные
соединения,
такие
как
алканы,
жирные
кислоты
и
триацилглицерины, могут быть усвоены и метаболизированы Y. lipolytica, для
получения энергии и биосинтеза функциональных химических веществ.
Способность штаммов дрожжей Y. lipolytica утилизировать органические
соединения, включая алифатические и ароматические углеводороды, часто
сопровождается
образованием
биосурфактантов
(биоэмульгаторов).
В
углеводородных ферментациях масляная фаза диспергируется в виде капелек в
водной фазе, а межфазное натяжение, действующее между масляной фазой и
водной фазой, имеет тенденцию удерживать капли в сферической форме от
напряжения сдвига, которое имеет тенденцию к его деформации. Эти капли
непрерывно сливаются и распределение по размеру зависят от межфазного
натяжения, объемной доли углеводорода и интенсивности перемешивания [35].
Поэтому ассимиляция углеводородов дрожжами Y. lipolytica включает в
себя: модификацию свойств адгезии клеток для непосредственного контакта,
включая создание выступов на поверхности клетки; уменьшение толщины стенки
клетки и периплазматического пространства; мембранные инвагинации и
электронно-плотные каналы, связанные с эндоплазматическим ретикулум (далее
по тексту – ЭР) и его псевдо-солюбилизацию поверхностно-активными
соединениями [63, 52]. Есть гипотеза о том, что н-алканы, прикрепленные к
выпячиваниям или гидрофобным выростам, могут мигрировать через каналы
через плазматическую мембрану в ЭР [84].
После поглощения и переноса в клетке, н-алканы затем гидроксилируются с
помощью системы монооксидазы цитохрома Р-450, локализованной в ЭР.
Жирный спирт, образовавшийся после первой стадии, затем окисляется связанной
с мембраной оксидазой жирного спирта, что приводит к жирным альдегидам [27].
22
Окисление жирного альдегида до жирной кислоты катализируется жировой
альдегиддегидрогеназой [42]. Когда триглицериды присутствуют в среде,
Y. lipolytica может использовать его в качестве источника углерода. Для этого
липазы получают этим организмом для гидролиза триглицерида в глицерине и
жирных кислотах. Исследователи обнаружили, что дрожжи Y. lipolytica могут
продуцировать внеклеточные и клеточные липазы и выяснили, что липазы,
связанные с клетками, секретируются, когда источник липидного углерода
становится дефицитным в среде [80, 84]. С жирной кислотой, доступной на среде,
в большинстве случаев этот источник углерода диффундирует в клетку, но его
также может облегчать транспортер, подобно структурам, напоминающим
каналы, пересекающие указанную выше мембрану [65]. После внутри цитоплазмы
жирные кислоты могут взаимодействовать с жирно-кислотосвязывающими
белками [38].
Как показывают исследования [42] существуют три основные стадии путей
разложения алканов и жирных кислот в дрожжах Y. lipolytica. Первая: первичное
или монотерминальное окисление в ЭР и пероксисомах с образованием
соответствующих жирных кислот с одинаковой длиной цепи, инициированное в
ЭР цитохромом P450 катализируемое терминальное гидроксилирование. Кроме
того, может происходить дитерминальное или ω-окисление, приводящее к
дикарбоновой кислоте. Вторая: активация свободных жирных кислот с
образованием соответствующих СоА-эфиров, которые затем деградируют до
ацетил-СоА и пропионил-СоА (в случае алканов с нечетной цепью) с помощью
пероксисомального β-окисления или прямого включения жирно-ацильных
фрагментов в клеточные липиды после удлинения и десатурации цепи. В
зависимости от условий окружающей среды клетки могут накапливать свободные
жирные кислоты. Третья: синтез промежуточных продуктов цикла трикарбоновых
кислот из ацетил-СоА через цикл глиоксилата с последующим глюконеогенезом и
активацию
цикла
метилцитрата
для
утилизации алканов с нечетной цепью.
использования
пропионил-СоА
при
23
Монотерминальное или первичное окисление алканов и дитерминальное
или β-окисление жирных кислот в дрожжах включают три стадии.
Первый этап включает в себя терминальное гидроксилирование с помощью
P450-зависимой
алканмонооксигеназной
системы
или
жирной
кислоты
β-гидроксилазы, соответственно. Это приводит к получению жирного спирта из
алкана или образованию β-гидрокси-жирной кислоты из жирной кислоты. Вторая
стадия реализуется либо с помощью мембранно-связанных или растворимых
NAD+ или NADP+-зависимых жирно-спиртовых дегидрогеназ, либо с помощью
перекиси водорода, продуцируемой жирно-спиртовой оксидазой, которые
превращают концевые гидроксигруппы 1-алканолов, ω-диолов, или ω-гидроксижирных кислот в соответствующие жирные альдегиды. Третья стадия включает
окисление жирного альдегида до свободной жирной кислоты, катализируемой ЭР
или пероксисомальной NAD(P)+-зависимой жирно-альдегиддегидрогеназой. Эти
этапы окисления, наконец, приводят к получению жирной кислоты из алкана или
получению дикарбоновой кислоты из жирной кислоты [42].
Точный транспорт и механизм ассимиляции алканов, остается до сих пор
неясным. Существует две модели, которые включают в себя пассивный процесс
диффузии субстрата и активный транспорт, требующий затрат энергии. Механизм
поглощения зависит от длины скелета алканов. Различают короткие (С10 или С12)
и длинные карбоцепные алканы (C14 или C16) [94]. Как правило, алканы с более
короткой цепью (C5-C10) не могут быть использованы в качестве субстрата,
потому что они являются цитотоксическими и нарушают целостность клеточной
мембраны. Подробнейший анализ метаболизма н-алканов при развитии дрожжей
Y. lipolytica представил Fukuda [46].
Примечательно, что Y. lipolytica может усвоить в качестве углеродного
субстрата
длинноцепочечные
спирты
и
альдегиды
непосредственно
из
культуральной среды. Однако, из-за цитотоксичности, спирты и альдегиды с
более короткой цепью, такие как деканол и деканаль, не могут быть
использованы.
24
Способность Y. lipolytica развиваться на гидрофобных углеводородных
субстратах может быть одним из путей решения серьезных проблем загрязнения
почв и водных объектов нефтью, отходами с высоким содержанием липидов
(такие как жир и остатки масла).
Papanikolaou и др. [83] сообщили, что сточные воды производства
оливкового
масла,
а
также
многие
отходы
нефтеперерабатывающей
промышленности могут быть использованы в качестве источника углерода для
Y. lipolytica в производстве лимонной кислоты.
Например, в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН
СССР получен штамм Y. lipolytica HMM-187 путем обработки клеток
Candida lipolytica ИБФМ У-160 (704) нитрозометилмочевиной и последующего
отбора [1]. Молодая культура данного штамма на жидкой среде и сусло-агаре
имеет
округлые,
овальные
или
слегка
удлиненные
клетки
размером
2,0-5,0×3,0-10,0 мкм. Реже наблюдаются достаточно сильно удлиненные клетки –
2,4×11,0-16,0 мкм, и цепочки, состоящие из 3-4 клеток. При росте на сусло-агаре
на 10 сутки образуются колонии беловато-кремового цвета, имеющие гладкую
матовую поверхность, которые могут быть слегка выпуклыми, а центр колонии
немного приподнят и имеет ровные края. Кремовый цвет приобретает гигантская
колония, которая по краям имеет желтовато-зеленый цвет, плоскую, но при этом
морщинистую поверхность, центр также приподнят, края слабо лопастные.
Культура Y. lipolytica HMM-187 является строгим аэробом, у которой
отсутствует способность сбраживать сахара, но которая может ассимилировать
глюкозу, этанол, ацетат, глицерин и имеет слабый рост на галактозе. Оптимальная
температура роста 26-30 °С, максимальная – 33 °С.
Описанный штамм Y. lipolytica HMM-187 характеризуется способностью
роста на средах с н-алканами и при этом осуществлять синтез лимонной кислоты.
При этой такой продукт, как изолимонная кислота, которая обычно сопутствует
лимонной при ее биосинтезе, практически не накапливается. Так, по данным
25
авторского свидетельства, соотношение лимонной кислоты и изолимонной
кислоты находится в пределах 8:1-12:1 [1].
1.3 Факторы, определяющие эффективность производства лимонной
кислоты дрожжами Y. lipolytica
Существует большое количество патентов на получение лимонной кислоты
дрожжами Y. lipolytica с использованием различных субстратов: глицерина,
этанола, мелассы, глюкозы, сахарозы, жиров, отходов нефтеперерабатывающей
промышленности, нормальных парафинов и т.д. Многие из перечисленных
субстратов являются дорогостоящим и нецелесообразным сырьем для получения
такого дешевого продукта, как лимонная кислота. Известно, что дрожжи
Y. lipolytica способны использовать в качестве источника углерода нормальные
парафины. Себестоимость такого синтеза лимонной кислоты значительно ниже
себестоимости
процесса,
в
котором
используется
более
традиционное
углеводсодержащее сырье – меласса.
Перспективность использования штаммов микроорганизмов, способных
развиваться на нерастворимых в воде субстратах, требует выделить факторы,
которые будут определять эффективность производства лимонной кислоты. К
ним можно отнести наличие кислорода, значение pH среды, физиологическое
состояние клеток и эмульгирование нерастворимого в воде субстрата [59].
Важным параметром является количество кислорода, доступного для
данного
микроорганизма.
Во
время
непрерывного
культивирования
Y. lipolytica N 1, было установлено, что требования кислорода для роста и синтеза
лимонной кислоты, зависит от концентрации железа в среде [60]. Сообщалось об
использовании добавления перфторуглеродов (ПФУ) в культуральную среду
Y. lipolytica в качестве нового подхода повышения потребления кислорода [21].
Проницаемость для кислорода на ПФУ значительно выше, чем в воде. Кроме того
растворимость кислорода в ПФУ в 10-20 раз выше по сравнению с чистой водой.
Максимальные темпы роста Y. lipolytica были получены с увеличением
26
концентрации ПФУ и скорости перемешивания [20]. В некоторых опытах
наблюдали распределение дрожжей между водной и органической фазы ПФУ, с
неожиданным предпочтением дрожжами органического растворителя.
Эти специфические взаимодействия могут быть связаны со способностью
дрожжей Y. lipolytica к разложению гидрофобных субстратов. Потребление
кислорода осуществляется при посредничестве двух терминальных оксидаз, т.е.
цитохромоксидазы и альтернативной оксидазы [18]. Причем реализация
альтернативного пути наблюдается после достижения стационарной фазы роста.
Система
окислительного
фосфорилирования
играет
важную,
если
не
исключительную роль в клеточной энергетическом балансе дрожжей [24]. По
данным Medentsev A. G. и др. [71], альтернативная система не в состоянии
конкурировать с работой цитохромоксидазы. Альтернативная оксидаза только
передает электроны, которые излишни для цитохрома дыхательной цепи.
Данные исследователей говорят о том, что клетки дрожжей обладают
эффективными защитными механизмами от окислительного стресса, что помогает
им развиваться при повышенном давлении. Так, при 6 бар наблюдалось
увеличение скорости прироста биомасса клеток в 3-5 раз по сравнению с
процессом при нормальном давлении [31].
Имеются сведения о том, что оксигенация является одним из важнейших
параметров для контроля и регулирования развития дрожжей, поскольку
присутствие кислорода играет важное значение в управлении деятельность
внутриклеточных ферментов [16, 19, 49]. Так, например, в гипербарическом
биореакторе (при 5 атм полного давления) было изучено влияние кислорода на
протекание β-окисления в клетках Y. lipolytica. Было обнаружено, что высокие
уровни кислорода привели к возрастанию активности ферментов, участвующих в
деградации γ-декалактона, и имели существенно менее важное значение для
накопления липазы в среде [53].
При развитии на нерастворимых в воде источниках углерода дрожжи
Y. lipolytica образуют биоэмульгаторы, которые имеют высокую активность и
27
стабильность эмульгирования, повышая биодоступность субстрата, являясь при
этом безопасными даже при использовании их в пищевых целях.
Известно о том, что ряд микроорганизмов, которые способны усваивать
углеводороды,
обладают
механизмами
эмульгирования
их
в
водной
дисперсионной среде [40, 53, 57, 100]. Существует сообщения, описывающие
выделение такими микроорганизмами внеклеточных эмульгаторов [54, 66, 86, 88,
93, 96, 97, 100]. Имеются сведения о выделении внеклеточных эмульгаторов
штаммом дрожжей Y. lipolytica HMM-187, развивающихся на углеводородных
субстратах [36, 51, 55, 56, 58, 73, 76]. Известно, что дрожжи Y. lipolytica при росте
на чашках Петри с агаром, содержащих гексадекан, производят эмульгаторы,
которые снижают поверхностное натяжение в среде [76, 87]. На ранних стадиях
ферментации, снижение межфазного натяжения главным образом, связано с
выделением Y. lipolytica жирных кислот. Изменения межфазного натяжения на
последних
стадиях
ферментации
приписываются
другим
метаболитам,
продуцируемым микроорганизмом.
Выявлено, что дрожжи Y. lipolytica
выделяют два типа эмульгаторов.
Водорастворимый – Liposan, состоящий из углеводов и белков, и растворимый в
неполярных растворителях – Yansan [87]. Liposan выделяется уже на поздних
стадиях
ферментации
и
его
эффективность
в
качестве
эмульгатора
ограничивается в нейтральном диапазоне pH (максимальная активность – при pH
от 2 до 5). Способность Liposan эмульгировать углеводороды не зависит от
содержания алифатических и карбоциклических компонентов в субстрате. Однако
эффективность Liposan в качестве эмульгатора зависит от длины углеродной цепи
компонентов субстрата (таблица 1) [33, 34].
28
Таблица 1 – Эмульгирующая активность Liposan по отношению к гидрофобным
субстратам [33, 41]
Вещество
Керосин
Гексан
Гептан
Октан
Декан
Додекан
Тетрадекан
Гексадекан
Октодекан
М-ксиол
Толуол
Горячий воск
Эмульгирующая способность,
ед/мл
0,30
0,01
0,02
0,04
0,15
0,98
1,01
1,20
0,60
0,30
0,63
1,25
По данным исследователей [87, 91, 22], эмульгирующая активность Yansan
также имеет большую зависимость от строения молекул гидрофобного субстрата
и, в частности, от количества атомов углерода в цепи (рисунок 3).
Рисунок 3 – Влияние длины углеродной цепи алифатических углеводородов
на эмульгирующую активность Yansan (♦) и стабильность образующейся
эмульсии (□) [22]
29
Такой тип эмульгаторов как Yansan ассоциирован с клеточной стенкой, что
ведет
к
повышению
микроорганизмов
гидрофобности
связывать
и
клеток
поглощать
и
облегчает
водонерастворимые
способность
источники
органического углерода [91]. Выделение Yansan микроорганизмами наблюдается
в стационарной фазе роста, хотя некоторая эмульгирующая способность
обнаруживается в экспоненциальной фазе при pH 5-7 [22].
На протяжении всего цикла ферментации дрожжей Y. lipolytica изменение
эмульгирующей активности имеет скачкообразный характер. Предположительно
снижение межфазного натяжения в течение начальных стадий ферментации
связанно с высвобождением жирных кислот. После 36 ч ферментации
производство жирных кислот снижается, а межфазное натяжение продолжает
падать вследствие активного продуцирования биоэмульгаторов типа Liposan и
Yansan.
Образование эмульгаторов максимально в присутствии аммонийных
соединений, которые используются в качестве источников азота [91]. Помимо
этого выход биомульгатора зависит от многих факторов, таких как источники
углерода, наличие кислорода и значение рН среды [17, 45, 90].
Очевидно, что, определяя доступность нерастворимого в воде субстрата для
микроорганизмов, процесс эмульгирования может оказывать существенное
влияние на процесс биосинтеза лимонной кислоты.
1.4 Отличия строения и особенности биохимии клеток, утилизирующие
углеводороды
В процессе физиологической адаптации микроорганизмов к жидким
н-алканам
происходят
характерные
адаптационные
преобразования
физиологического состояния клеток и компонентов состава культуральной среды:
синтез индуцибельных ферментов, морфологические изменения, интенсивное
накопление ПАВ в культуральной среде, диспергирование и солюбилизаци
гидрофобного субстрата.
30
Жидкие н-алканы практические нерастворимы в воде, их транспорт в клетки
микроорганизмов
может
происходить
по
трем
основным
механизмам:
контактному, диффузному и опосредственному. Первый предполагает сорбцию
«капля – клетка»; второй – транспорт растворенных н-алканов в водной среде,
третий – внедрение в мицеллы, адсорбцию мицелл на клетках с последующей
диффузией субстрата в них. Наиболее вероятно, что основной поток н-алканов в
клетки происходит посредством второго и (при накоплении ПАВ) третьего
механизмов.
Физико-химические
особенности
субстрата
обуславливают
ряд
морфологических и биохимических осбенностей, которые передает схема
взаимодействия и регуляции процессов утилизации н-алканов дрожжами
Y. lipolytica, предложенная Фукуи и Танака (рисунок 4) [3].
При развитии на углеводородных субстратах в клетках Y. lipolytica
наблюдается активное формирование и функционирование специфических
органелл – пероксисом. В пероксисомах находятся ферменты, которые
учувствуют в реакциях окисления органических
веществ, при помощи
молекулярного кислорода. Основными путями разложения алканов и жирных
кислот в дрожжах, утилизирующих углеводороды, является β-окисление,
протекающее только в пероксисомах. В таких дрожжах размер и количество
пероксисом намного больше, чем в дрожжах, развивающиеся на углеводных
субстратах.
31
1 – цитохром Р-450; 2 – НАД.Н-цитохром Р-450-редуктаза; 3 –
алкогольдегидрогеназа; 4 – альдегид-дегидрогеназа; 5 – ацил-СоА-синтетаза; 6 –
каталаза; 7 – система в-окисления; 8 – изоцитратлиаза; 9 – малатсинтетаза; 10 –
НАДФ-зависимая изоцитратдегидрогеназа; 11 – малатдегидрогеназа; 12 –
цитратсинтетаза; 13 – аконитаза; 14 – НАД-зависимая изоцитратдегидрогеназа; 15
– картининацетилтрансфераза; 16 – НАД-зависимая глицерол-3фосфатдегидрогеназа; 14 –ФАД-зависимая глицерол-3-фосфатдегидрогеназа; 18 –
глицерофосфатсинтетаза.
Рисунок 4 – Предположительная схема взаимодействия и регуляции
процессов утилизации н-алканов дрожжами C. lipolytica, предложенная Фукуи и
Танака [3]
32
Деградация высвобожденных жирных кислот происходит в пероксисоме по
пути β-окисления. Деградация внутриклеточного липида может происходить наряду с
секрецией лимонной кислоты в стационарной фазе [54]. Исследования показывают,
что азот-ограничивающие условия также способствуют секреции лимонной
кислоты [85]. Фактически, синтез липидов и производство лимонной кислоты
конкурируют за предшественников ацетил-СоА.
В клетках дрожжей утилизация углеводородов осуществляется при помощи
глиоксилатного цикла и ЦТК. Учитывая новейшие исследования, у мицелиальных
дрожжей ферменты глиоксилатного цикла локализованы не только внутри
пероксисомы, но и снаружи, поэтому протекание глиоксилатного цикла включает
транспорт некоторых его промежуточных соединений через мембрану пероксисомы.
Благодаря этому такие дрожжи могут расти в среде содержащей ацетат и
использовать в качестве единственного источника углерода жирные кислоты и
углеводороды [67].
Очевидно, что при решении задачи увеличения выхода лимонной кислоты
необходимо обеспечить увеличение скорости поступления в клетку и превращения налканов.
Однако,
взаимодействия
на
и
основе
известной
регуляции
гипотетической
процессов
утилизации
биохимической
н-алканов
схемы
дрожжами
Candida lipolytica (β-окисление жирных кислот локализовано в пероксисомах)
(рисунок 4) и с учетом влияния продуктов катаболизма н-алканов на кинетику
ферментативных реакций [7, 10], на проницаемость цитоплазматиеской и
митохондриальной мембран [11, 12, 13] можно сделать следующие предположения
относительно внутриклеточных событий при избыточном метаболизме субстрата:
1. будучи гидрофобными соединениями, н-алканы обладают высоким
сорбционным сродством к внутриклеточном мембранным структурам, что может
отрицательно сказаться на метаболизме клеток. Как следствие, клетки вынуждены
«освоить»
высокопроизводительные
углеводородов;
пути
биохимического
превращения
33
2. накопление н-алканов (немодифицированных) в клетках приведет к
повышению осмотического давления. Это также обуславливает важность быстрых
превращений углеводородов;
3. накопление в клетках жирных кислот (показатель константы кислоты
примерно равен 5,6) приведет к понижению значения водородного показателя в
цитоплазме клеток и в митохондриях, что отрицательно скажется на метаболизме
клеток (ввиду зависимости активность ферментов от водородного показателя). Одним
из путей решения этой проблемы для клетки должно стать выделение наружу
метаболитов, образовавшихся сверх потребностей клеток;
4. н-алканы и продукты их катаболизма (жирные кислоты и спирты) являются
индукторами специфических ферментов. Процессы физиологической адаптации
микроорганизмов являются одной из причин задержки роста [7]. Следовательно,
происходящий в фазе G1 клеточного цикла синтез индуцибельных ферментов
приведет к задержке пролиферации клеток, следовательно, и задержке роста
популяции;
5. превышение скорости транспорта субстратов в клетке над ростовыми
потребностями могут являться причиной задержки роста популяции [7];
6. жирные кислоты обладают выраженными регуляторным действием на
внутриклеточные процессы,
в частности, воздействуют на направленность и
интенсивность гликолиза (фосфоглюкоизомераза, пируваткиназа ингибируются
жирными кислотами) [7, 10], направленность которого тесно связана с цикличностью
клеточного развития (эндогенная модель деления клеток предполагает необходимость
образования пула резервных полисахаридов [15]);
7. продукты катаболизма н-алканов – жирные кислоты и спирты, способные
повреждать биологические мембраны [11, 12, 13], что приведет к следующим
результатам:
а) при воздействии на митохондриальную мембрану – к разобщению
окислительного форфорилирования;
34
б) при воздействии на цитоплазматическую мембрану к нарушению
внутриклеточного энантиостаза (градиента ионов).
Жирные кислоты с числом атомов углерода менее 10-12 способны в
неактивированной форме (более 12 – только в форме ациклкарнитинов) посредством
диффузии проникать через митохондриальную мембрану [7], следовательно, их
транспортов в митохондрию не регулируется.
Выводы по главе 1
Лимонная кислота представляет собой крупнотоннажный продукт, поэтому
поиск новых путей ее получения представляется актуальным.
Исторически лимонную кислоту выделяли из цитрусовых и махорки или
получали химическим путем. Но эти способы сопряжены с большими затратами,
низкой технологичностью, а также образованием побочных продуктов.
В связи с развитием биотехнологии важнейшим на сегодняшний день способом
получения лимонной кислоты является биосинтез гриба A. niger. Но этот способ имеет
ряд
недостатков:
использование
дорогостоящих
субстратов,
высокая
продолжительность роста культуры, патогенность плесневых грибов и токсичность
образующихся отходов, которые способны загрязнять окружающую среду. В связи с
ухудшением с каждым годом экологической обстановке в мире представляет интерес
поиск других субстратов и продуцентов.
В качестве альтернативы для биосинтеза лимонной кислоты могут выступать
дрожжи Y. lipolytica. Этот вид дрожжей способен развиваться, и расти на
нефтепродуктах и на отходах их переработки, не является патогенным. Особенность
тих дрожжей является способность в зависимости от условий среды находится в
одной из двух состояний – в виде индивидуальных дрожжевых клеток и в виде
мицелия (диморфизм). Так как дрожжи Y. lipolytica способны перерабатывать и
утилизировать нефтепродукты – это является преимущественным в использовании их
не только для получения лимонной кислоты, но и для отчистки загрязнённых
водоемов и почв.
35
ГЛАВА 2. ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ПОВЫШЕНИЯ СКОРОСТИ
УТИЛИЗАЦИИ УГЛЕВОДОРОДОВ И СИНТЕЗА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ
КЛЕТКАМИ Y. LIPOLYTICA
2.1 Активная кислотность среды (рН) как инструмент управления
продуцированием лимонной кислоты
Исходя из литературных данных, можно выдвинуть ряд гипотез о влиянии
условий культивирования на процесс утилизации углеводородов в клетках
дрожжей Y. lipolytica. Нашей целью является максимизация продуцирования
лимонной кислоты, которая в зависимости от рН среды может существовать в
одной из четырех форм (рисунок 5).
СООН
СН2
С
ОН
рКа1=3,13
ОН
СН2
СООН
СООН
С
СН2
(Форма 2)
(Форма 1)
ОН
СН2
С
ОН
рКа2=4,77
СН2
СОО–
СОО–
С
СН2
(Форма 2)
С
СОО–
(Форма 3)
ОН
СН2
СН2
СООН
СООН
СОО–
СОО–
СООН
СООН
СООН
СН2
ОН
рКа3=6,4
СН2
СООН
(Форма 3)
СОО–
СОО–
СН2
С
СН2
СОО–
СОО–
(Форма 4)
Рисунок 5 – Четыре формы лимонной кислоты, образующиеся при
ступенчатой диссоциации карбоксильных групп
36
При низком значении рН-среды происходит подавление диссоциации всех
трех карбоксильных групп лимонной кислоты. По мере увеличения рН раствора
начинает происходить диссоциация карбоксильных групп. Сначала диссоциирует
первая карбоксильная групп, затем идет диссоциация второй группы и при более
высоких значениях рН – третьей.
Таким
образом,
по
мере
роста
рН
среды
происходит
переход
недиссоциированной лимонной кислоты к частично, а затем - полностью
диссоциированной. Важно, что недиссоцированная
лимонная кислота в
наибольшей степени способна к диффузии через клеточную мембрану. С
увеличением степени диссоциации, т. е. с переходом от формы 1 к форме 2, 3 и 4,
способность их проникать через мембрану, резко падает, потому что мембрана
малопроницаема для ионов. Возможность их прохождения через мембрану может
быть обусловлена только наличием специальных переносчиков. В своих
рассуждениях мы исходим из предположения, что в основном транспорт
лимонной кислоты через клеточную мембрану из культуральной жидкости в
клетку может осуществляться в результате диффузии.
Значение рН внутри клетки относительно постоянно и близко к рН=7.
Поэтому
лимонная
кислота
внутри
клетки
находится
полностью
диссоциированном состоянии (форма 4). А вот форма, в которой
в
лимонная
кислота находится в межклеточном пространстве, зависит от рН культуральной
жидкости.
При низком рН среды происходит подавление диссоциации
карбоксильных групп и лимонная кислота приобретает гидрофобную форму. При
активном накоплении в межклеточной жидкости лимонная кислота стремится
вернуться в клетку по градиенту концентрации. Это, вероятно, будет подавлять ее
продуцирование клеткой, а значит, этот процесс неприемлем для нас. Поэтому,
мы предполагаем, что для исключения диффузии лимонной кислоты обратно в
клетку по градиенту концентрации, надо поддерживать рН на сравнительно
высоком уровне.
37
Известны
работы,
посвященные
исследованию
активности
кислотообразования при разных значениях рН среды [23]. Лимонная кислота в
основном накапливается при рН в пределах между 2-6. Но при этом,
максимальное накопление лимонной кислоты наблюдается в пределах рН=5,0-6,0.
При более низких значениях рН происходит образование полиолов, главным
образом,
эритриола
и
маннитола.
При
рН
более
6,0
наблюдается
преимущественно синтез изолимонной кислоты, в то время как при рН=4,5
накапливается только лимонная кислота. Также, рН среды влияет на морфологию
клеток, при более высоком значении рН клетки переходят в мицелиальную
форму, при которой наблюдается сверх синтез лимонной кислоты. Следовательно,
необходимо выбрать наиболее оптимальное значение рН, при котором
накопление лимонной кислоты будет максимальным.
Мы предполагаем, что для исключения обратного движения лимонной
кислоты из культуральной жидкости в клетку достаточно обеспечить рН=5,5, при
котором происходит почти полная диссоциация двух из трех карбоксильных
групп (исходя из значения рКа).
При этих условиях лимонная кислота будет, в основном, в виде полного
двухзарядного аниона (форма 4) и не сможет проникать внутрь клетки, а
следовательно, не сможет подавлять продуцирование ЛК клетками дрожжей.
2.2 Биохимические основы сверхпродуцирования лимонной кислоты
клетками дрожжей Yarrowia lypolitica
Синтез лимонной кислоты происходит в ЦТК (рисунок 6), причем
в
результате первой его реакции взаимодействия Ацетил-СоА с оксалоацетатом.
В дальнейших реакциях цикла цитрат расходуется. Причем первой стадией
выступает изомеризация в изоцитрат. ЦТК для аэробных микроорганизмов –
основной путь получения энергии, и ряд стадий, которые следуют после цитрата,
а
именно стадии перехода цитрата в 2-оксоглутарат,
2-оксоглутарата в
сукцинил-СоА и переход малата в оксалоацетат сопровождаются образование
38
восстановленной формы НАД (НАД·Н), а стадия перехода сукцината в фумарат
сопровождается образованием восстановленной формы ФАД – ФАД·Н2.
Рисунок 6 – Цикл трикарбоновых кислот [14]
Эти восстановленные формы в митохондриях окисляются кислородом, в
результате чего выделяется энергия, необходимая для образования АТФ. Таким
образом,
нормальная
работа
ЦТК,
при
котором
скорости
процессов
восстановления и окисления коферментов (НАД+ и ФАД+) равны, не может
обеспечить продуцирование больших количеств лимонной кислоты. Из этого, мы
39
предполагаем, что регуляция подачи кислорода (либо повышение ее либо
понижение либо контроль на каком-то уровне) позволит управлять стадиями
образования восстановленных форм НАД·Н и ФАД·Н2 [27].
Как показывает анализ литературных данных, в синтезе лимонной кислоты
также важную роль играет глиоксилатный цикл, реализация которого происходит
совместно с ЦТК (рисунок 7).
Рисунок 7 – Объединенная схема ЦТК и глиоксилатного цикла
В обоих этих процессах происходит утилизация одного и того же продукта
окислительной деградации углеводородов – ацетил-СоА. Однако наблюдается
различие в пространственной локализации вхождения ацетил-СоА в указанных
циклах (рисунок 8).
40
Клетка дрожжей
Микросомы
н-алкан
Спирт
Альдегид
Липиды
Жирная кислота
Пероксисомы
Жирная кислота
н-алкан
Митохондрии
Альдегид
Спирт
Ацетил-СоА
ФАД
Н2О2
ФАД
ДОАФ
ФАД.Н2
Н2О
½ О2
ФАД.Н2
Г-3-Ф
О2
β-окисление ЖК
НАД
НАД.Н
Ацетил-СоА
Г-3-Ф
ДОАФ
Ацетил-Кар.
Ацетил-Кар.
Ацетил-СоА
Цитрат
Оксалоацетат
НАД·Н
Глиоксилат
Изоцитрат
Малат
Сукцинат
Малат
Цис-аконитат
Цикл
Кребса
Изоцитрат
НАД.Н
Фумарат
α-Кетоглуторат
ФАД.Н2
α-Кетоглутарат
Сукцинат
АД*Н
Н
Сукцинил-СоА
Рисунок 8 – Схема, отражающая утилизацию углеводородов с образованием
лимонной кислоты.
41
Как видно из рисунка 8, если в случае глиоксилатного цикла это происходит
в пероксисомах, где ацетил-СоА и синтезируется в результате β-окисления
жирных кислот, то для участия в ЦТК ацетил-СоА перемещается в митохондрии в
составе комплекса с карнитином (мембраны митохондрий непреодолимы для
свободного
ацетил-СоА).
Очевидно,
что
скорость
такого
перемещения
лимитирована содержанием в клетке переносчика – карнитина – и не может
обеспечить
быструю
утилизацию
ацетил-СоА
в
условиях
избытка
углеводородных субстратов и промежуточных продуктов их метаболизма
(спиртов, альдегидов, жирных кислот), накопление которых в клетке может
вызвать необратимые нарушения. В этой связи в условиях культивирования
Y. lipolytica
на
глиоксилатный
средах
цикл,
с
н-алканами
метаболиты
важнейшее
которого
значения
приобретает
перемещаются
между
рассматриваемыми клеточными органеллами за счет механизма антипорта: в
ответ на диффузию малата в митохондрии происходит выделение из митохондрий
промежуточных метаболитов ЦТК, в частности – лимонной и изолимонной
кислоты. Последняя, под действием изоцитратлиазы, локализованной в клетках
Y. lipolytica в пероксисомах, расщепляется с образованием сукцината и
глиоксилата. Затем глиоксилат конденсируется с молекулой ацетил-СоА с
образованием малата, поступающего в митохондрии и включающегося в ЦТК.
Таким
образом,
обеспечивается
увеличение
поступления в
митохондрии
ацетил-СоА, образующеюся при избыточной деградации углеводородов в
микросомах и пероксисомах.
Следует особенно отметить отличие дрожжей Y. lipolytica от других
организмов, реализующих глиоксилатный цикл. Если в растениях этот
биохимический
путь
полностью
реализуется
в
специальных
органеллах
глиоксисомах, то в клетках Y. lipolytica только две реакции – распада изоцитрата и
конденсации глиоксилата с ацетил-СоА – реализуется в перокисомах. Остальные
реакции протекают в митохондриях с участием тех же ферментов, что и реакции
ЦТК. Это говорит об очень тесной связи глиоксилатного цикла и ЦТК и
42
возможности их совместного регулирования за счет применения одних и тех
факторов.
Одним из важнейших факторов регуляторов скорости глиоксилатного цикла
и ЦТК является содержание в ферментационной среде растворимого кислорода.
Он выступает в качестве конечного акцептора электоронов в аэробных условиях,
окисляя образовавшиеся формы коферментов (НАД·Н и ФАД·Н2).
Образование окисленных форм НАД+ и ФАД и поддержание определенной
их концентрации в клетке – является обязательным условием функционирования
рассматриваемых
метаболических
метаболических
путей
видно,
путей.
что
Из
каждый
приведенной
такт
ЦТК
схемы
двух
требует
трех
восстановленных форм НАД+ и одной восстановленной формы ФАД, а каждый
такт глиоксилатного цикла – только одну восстановленную форму НАД+.
Таким образом, регулирование содержание кислорода в культуральной
жидкости в процессе культивирования клеток Y. lipolytica может стать
инструментом для повышения выхода лимонной кислоты.
43
ГЛАВА 3. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные исследования проводили в условиях
лаборатории
кафедры промышленной химии и биотехнологии Федерального государственного
бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Орловского
государственный университет имени И.С. Тургенева». Схема реализованных в
работе исследований приведена на рисунке 9.
3.1 Объекты исследования
В качестве объектов исследования в работе были использованы:
– штамм дрожжей Y. lipolytica HMM-187, приобретенный в Всероссийской
коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП «Государственный научноисследовательский
институт
генетики
и
селекции
промышленных
микроорганизмов»;
– дизельное топливо с повышенным содержанием нормальных парафинов с
относительно длинным углеродным скелетом (содержащим свыше 10 атомов
углерода в цепи) («летнее»);
– питательные среды: дрожжевая среда и среда Ридер с дизельным
топливом, которые использовали на стадиях поддержания, подготовки и
инокуляции культуры дрожжей в ферментер.
44
Аналитический обзор литературы и выдвижение гипотез о способах увеличения
эмульгирующей способности и способности к синтезу лимонной кислоты
клетками Y. lipolytica
Поиск оптимального рН среды для максимального выхода лимонной кислоты из
клетки в культуральную жидкость
Активация и накопление биомассы культуры дрожжей Y. lipolytica на плотных
питательных средах с различными субстратами
Осуществление биосинтеза лимонной кислоты при варьировании условий
ферментации
Культивирование
дрожжевых
клеток
Культивирование
мицелиальных
клеток
Культивирование
дрожжевых клеток
с поддержанием
рН=5,5
Культивирование
дрожжевых клеток с
поддержанием рН=5,5
без постоянно подачи
кислорода
Анализ состава и физико-химических свойств ферментационной среды
Определение
и корректировка рН
среды
Определение
содержания
клеток
Оценка
эмульгирующей
способности
Регуляция
подачи
кислорода в
ферментер
Определение
концентрации
лимонной кислоты в
культуральной
жидкости
Рисунок 9 – Схема экспериментальных исследований
3.2 Методы исследования
3.2.1 Приготовление питательных сред для активации и накопления
биомассы дрожжей Y. lipolytica
В работе использовали следующие питательные среды:
– дрожжевая среда (г/л): глюкоза – 20; пептон – 10; дрожжевой экстракт – 5.
(Для приготовления дрожжевого экстракта прессованные дрожжи разводили с
45
водой в соотношении 1:1. Смесь кипятили 1 ч и после фильтрования
стерилизовали в течение 30 минут при 115 °С);
– среда Ридер с дизельным топливом (г/л): дизельное топливо – 10;
(NH4)2SO4 – 3; MgSO4·7H2O – 0,7; NaCl – 0,5; Ca(NO3)2 – 0,4; KH2PO4 – 1; K2HPO4
– 0,1; агар-агар 25. При приготовлении 500 мл среды добавляли дрожжевой
автолизат в количестве 1 мл, а также набор микроэлементов по Буркгольдеру
следующего состава (в мг/л среды): KI – 0,1; B – 0,01; Mn2+ – 0,01; Zn2+ – 0,01;
Cu2+ – 0,01; Mo6+ – 0,01; Fe2+ – 0,05 [1]. (Для получения дрожжевого автолизата
прессованные дрожжи разводили с водой в соотношении 1:3, смесь ставили на
водяную баню при 56 °С на 24 ч, после чего стерилизовали в течение 15 мин при
0,5 атм и хранили в морозильной камере [6].
3.2.2 Посев и культивирование при поддержании и получении
накопительной культуры
Для активации и поддержания культуры дрожжей Y. lipolytica посев
производили на плотных питательных средах в чашках Петри на агаризованной
среде. На чашки Петри проводили сплошной посев с помощью шпателя
Дригальского.
Посев
осуществляли
в
стерильных
условиях,
посуду
и
оборудование для посева предварительно стерилизовали при 180 °С в течение 2 ч.
Среды для культивирования стерилизовали при 120 °С и 1 атм в течении 20 мин.
Культивирование происходило в термостате при 29 °С.
3.2.3 Этапы подготовки посевного материала, проведение процесса
ферментации и анализа культуральной жидкости
Исследование процесса биосинтеза лимонной кислоты, которая включало
отработку аспектов культивирования биомассы и исследование состава и физикохимических свойств ферментационной среды и культуральной жидкости,
проводили по схеме, приведенной на рисунке 10.
46
Получение посевного материала
культуры
Внесение инокулянта и
компонентов питательной среды
в ферментер
Ферментация
Отбор проб культуральной
жидкости
Определение
pH-среды
Определение
числа клеток
Определение
эмульгирующей
способности
Определение
содержания
лимонной
кислоты
Рисунок 10 – Порядок и содержание экспериментов по глубинному
культивированию дрожжей Y. lipolytica и исследованию состава и свойств
ферментационной среды
Получение посевного материала культуры дрожжей. Накопительную
культуру с агаризованной среды Ридер переносили в колбы с посевной средой
следующего состава (г/л): дизельное топливо – 48; (NH4)2SO4 – 3; MgSO4·7H2O –
0,7; NaCl – 0,5; Ca(NO3)2 – 0,4; KH2PO4 – 1; K2HPO4 – 0,1; дрожжевой автолизат –
47
4 мл (на 1000 мл среды); набор микроэлементов по Буркгольдеру (мг/л среды): KI
– 0,1; B – 0,01; Mn2+ – 0,01; Zn2+ – 0,01; Cu2+ – 0,01; Mo6+ – 0,01; Fe2+ – 0,05.
Инкубацию производили на качалке в течении 48 ч при температуре не
ниже 25 °С и не выше 30 °С. Полученную посевную культуру переносили в
новую колбу с посевной средой (объем инокулума – 6 % объема среды), которую
также выдерживали на качалке в течение двух суток [1].
Внесение инокулята и компонентов питательной среды в ферментер.
150 мл жидкой посевной среды переносили в ферментационную среду объемом
1 л следующего состава (г/л): дизельное топливо – 170; (NH4)2SO4 – 5,7;
MgSO4·7H2O – 0,8; NaCl – 0,43; Ca(NO3)2 – 0,46; KH2PO4 – 1,1; K2HPO4 – 0,1;
дрожжевой автолизат – 8 мл.
Ферментация. Ферментацию проводили в ферментере объемом 3,5 л при
температуре 29 °С в условиях интенсивного перемешивания при аэрации среды
воздухом. Внешний вид и принципиальная схема ферментера представлена на
рисунках 11, 12 и 13.
Рисунок 11 – Внешний вид разработанного ферментера
48
Рисунок 12 – Внешний вид разработанного ферментера
1 – делительная воронка для подачи питательной среды и инокулята; 2 –
патрубок для выпускания воздуха из ферментера; 3 – патрубок для отбора проб из
ферментера; 4 – круглодонная колба; 5 – насос для выравнивания температуры в
термостате; 6 – ферментационная среда; 7 – распылитель воздуха; 8 –
терморегулятор; 9 – термометр; 10 – бактериальный фильтр; 11 – компрессор; 12
– увлажнитель воздуха; 13 – водяной термостат
Рисунок 13 – Принципиальная схема ферментера
49
Культивирование дрожжей проводили в четырехгорлой круглодонной колбе
4 объемом 2 л. Контроль температуры в ферментационной среде осуществляли с
помощью ртутного термометра 9. Введение посевного материала и питательной
среды
проводили
через
делительную
воронку
1.
Перемешивание
ферментационной среды осуществляли воздухом, подаваемым с помощью
компрессора 11 через бактериальный фильтр 10 и промежуточную склянку 12 (в
целях увлажнения воздуха и исключения испарения воды из ферментера). Для
равномерного
распределения
распылитель 7.
Выпускание
воздуха
воздуха
из
в
объеме
ферментера
среды
использовали
осуществляли
через
патрубок 2, оснащенный двухходовым краном. При закрывании последнего за
счет избыточного давления в колбе 4 производили отбор ферментационной среды.
Для обеспечения постоянного значения температуры колбу 4 помещали в водяной
термостат
13,
оснащенный
терморегулятором
8
и
перемешивающим
устройством 5.
3.2.4 Исследование проб ферментационной среды
В целях контроля развития дрожжей периодически проводили отбор проб
объемом около 30 мл. Сразу после отбора культуральную жидкость подвергали
центрифугированию
(Центрифуга
ЦЛН-16,
частота
вращения
ротора
–
3000 об/мин, продолжительность – 10 минут) для осаждения клеток. Центрифугат
использовали для определения концентрации клеток методом оптической
микроскопии (микроскоп Биомед-6, оптическое увеличение х400), pH (pH-метрионометр «Эксперт-001» с калиброванным комбинированным электродом),
эмульгирующей способности и анализа содержания лимонной кислоты.
3.2.4.1 Определение концентрации клеток в ферментационной среде
Осадок в центрифужной пробирке суспендировали в 1 мл или 5 мл
стерильного физиологического раствора. Подсчет количества клеток дрожжей в
полученной взвеси проводили с помощью камеры Горяева-Тома (площадь
50
квадратов сетки соответствует 0,04 мм2 (большой квадрат) и 0,0025 мм2 (малый
квадрат)). Количество клеток в 1 мл исследуемой суспензии вычисляли по
формуле (1):
 =
где
×10
ℎ××
,
(1)
– число клеток в 1 мл суспензии;
 – среднее число клеток в квадрате сетки;
ℎ– глубина камеры в мм;
 – площадь квадрата сетки;
10 – коэффициент перевода мм в см;
 – степень концентрирования клеток (рассчитывали как отношение
исходного объема пробы, отобранной из ферментера, к объему физиологического
раствора, в котором осуществляли суспендирование осадка клеток дрожжей).
3.2.4.2 Определение эмульгирующей способности культуральной
жидкости
В 10 мерных градуированных пробирок объемом 10 мл помещали по 2 мл
центрифугата ферментационной среды, добавляли по 2 мл универсального
буферного раствора Бриттона-Робинсона (pH=3,0) и по 1 мл дизельного топлива.
Пробирки закрывали пробками и встряхивали в одинаковом режиме в течение
1 мин. Полученную эмульсию выдерживали 10 мин, после чего исследовали с
помощью спектрофотометра UNICO-1200 при длине волны 540 нм и толщине
поглощающего слоя 5 мм. О состоянии эмульгирующей способности судили по
оптической плотности эмульсии [33].
51
3.2.4.3 Определение содержания лимонной кислоты
Анализ
проводили
использованием
методом
прибора
обращенно-фазовой
«Милихром
ВЭЖХ
5-3»,
[5]
с
оборудованного
спектрофотометрическим детектором и колонкой КАХ-4-64-3.
В качестве элюента использовали 0,1 М фосфатный буферный раствор
(pH=2,2-2,6).
Проведение
использованием
анализа
программного
и
обработку
обеспечения
данных
Unichrom.
проводили
Для
с
построения
градуировочного графика (рисунок 14) готовили серию стандартных растворов
лимонной кислоты с концентрациями 20 г/л, 10 г/л, 5 г/л, 2,5 г/л, 1 г/л. В качестве
аналитического сигнала использовали высоты пиков (H).
При исследовании в целях удаления остатков дизельного топлива было
предложено проведение дополнительных стадий пробоподготовки, включающих
центрифугирование ферментационной среды при 11 000 об/мин в течение 15 мин
и последующее вакуумирование в течение 30 мин. Полученные растворы
использовали
для
определения
содержания
лимонной
кислоты
после
десятикратного разбавления.
3000
Высоты пиков, усл. ед.
y = 126,35x + 18,668
2500
2000
1500
1000
500
0
0
5
10
15
20
25
Концентрация ЛК, г/л
Рисунок 14 – Градуировочный график зависимости высот пиков на
хроматограммах от концентрации лимонной кислоты в стандартных растворах
52
Рисунок 15 – Пример ВЭЖХ-хроматограммы культуральной жидкости
3.2.4.4 Определение оптимума рН культуральной жидкости
В 6 конических колб со средой Ридер с дизельным топливом с разной рНсреды от 3 до 8 проводили культивирование дрожжевых клеток Y. lipolytica для
определения оптимального рН в ферментации. Культивирование проводили в
течение 7 дней. За изменением физиологии клеток дрожжей Y. lipolytica следили
при помощи оптической микроскопии (микроскоп Биомед-6, оптическое
увеличение х400).
53
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ АНАЛИЗ
4.1 Изучение особенности роста культуры дрожжей
Y. lipolytica HMM-187 на питательных средах различного состава
Одним
из
важных
этапов
при
работе
со
штаммом
дрожжей
Y. lipolytica HMM-187 является размножение и поддержание культуры на
дрожжевой питательной среде. Через 72-120 ч культивирования в условиях
термостата при 29 °С в лабораторных условиях
наблюдали сплошной рост
микроорганизмов на средах в чашках Петри (рисунок 16, 17).
Рисунок 16 – Чистая культура штамма дрожжей Y. lipolytica HMM-187 на
дрожжевой среде
54
Рисунок 17 – Чистая культура штамма дрожжей Y. lipolytica HMM-187 на
дрожжевой среде
Колонии на сусло-агаре и дрожжевой среде беловато-кремовые, гладкие,
матовые, выпуклые, центр колонии несколько приподнят, края ровные.
Для размножения штамма дрожжей Y. lipolytica HMM-187 использовали
среду Ридер с дизельным топливом (рисунок 18).
Рисунок 18 – Биомасса дрожжей штамма Y. lipolytica HMM-187 на
питательной среде Ридер с дизельным топливом
55
Колонии
дрожжей
штамма
Y.
lipolytica
HMM-187
на
углеводородсодержащей среде имеет белый цвет, края выпуклые, центр колонии
имеет гладкую и матовую поверхность.
Морфологию исследуемых микроорганизмов изучали методом оптического
микроскопирования (рисунок 19). Молодая культура на агаризованной среде
представлена
округлыми,
овальными
и
слегка
удлиненными
клетками
(2,0-5,0)×(3,0-10,0) мкм. Встречаются сильно удлиненные клетки размером
2,4×(11,0-16,0) мкм, а также цепочки из 2-3 клеток.
10 мкм
Рисунок 19 – Микрофотография клеток дрожжей штамма Y. lipolytica HMM-187
1
(х400)
0 мкм
4.2 Изучение диморфизма дрожжей Y. lipolytica HMM-187
При пересеве дрожжей Y.lipolytica HMM-187 с углеводсодержащей
питательной среды на среду с гидрофобным субстратом и их чередовании, а так
же при поддержании рН на уровне значения 6 было обнаружено образование
колоний в виде белого пушистого мицелия (рисунок 20, 21).
Результаты микроскопического исследования препаратов проб мицелия
приведены на рисунках 22 и 23.
56
Рисунок 20 – Внешний вид мицелия дрожжей Y. lipolytica HMM-187 на
дрожжевой среде
Рисунок 21 – Внешний вид мицелия дрожжей Y. lipolytica HMM-187 на
среде Ридер с дизельным топливом
57
10 мкм
Рисунок 22– Микрофотография мицелия дрожжей штамма Y. lipolytica
HMM-187 (х400)
40 мкм
Рисунок 23 – Микрофотография мицелия дрожжей штамма Y. lipolytica
HMM-187 (х100)
Исходя
из
анализа
литературных
источников,
полученные
микрофотографии индивидуальных дрожжевых клеток и мицелия культуры
58
дрожжей
Y.lipolytica
HMM-187
полностью
совпадают
с
теоретическими
сведениями.
В дальнейших опытах по биосинтезу лимонной кислоты использовали
культуру продуцента, как в виде дрожжевых клеток, так и в мицелиальной форме.
4. 3 Изучение влияния рН среды на физиологическое состояние клеток
дрожжей Y. lipolytica
На рисунке 24 представлены микрофотографии препаратов дрожжей
Y. lipolytica, культивирование которых проводили в жидкой питательной среде
Ридер с дизельным топливом при разных значениях рН среды.
Исходя из рисунка 24 можно сделать вывод о том, что оптимальные
значения рН-среды для культивирования продуцента находятся в интервале
между 5 и 6. При рН=4 начинает появляется мицелий, но в малой степени. При
рН=5 мицелий развивается наиболее активно, а при рН=6 наряду с мицелием
обнаруживаются свободные дрожжевые клетки. При рН=7 мицелий полностью
разрушается. При рН=3 и рН=8 очевидны существенные отличия физиологии
дрожжей: при высокой кислотности зафиксированы индивидуальные клетки
вытянутой формы, а при рН=8 наблюдаются беспорядочные агрегаты клеток,
образование
которых
возможно
происходит
вследствие
выхода
условий
культивирования из оптимальных границ для данной культуры.
Поскольку
мицелиальная
форма
характеризуется
наибольшим
продуцирование лимонной кислоты, и рН=5,5 обеспечивает более низкую
диффузию лимонной кислоты в клетку, следовательно можно определить
оптимум рН, равный 5,5.
59
40 мкм
40 мкм
рН=3,0
рН=4,0
40 мкм
рН=5,0
40 мкм
рН=6,0
40 мкм
40 мкм
рН=7,0
рН=8,0
Рисунок 24 – Микрофотографии физиологического состояния дрожжей
штамма Y.lipolytica HMM-187 при разных значениях рН-среды (увеличение х100)
60
4.4 Изучение влияния рН среды и концентрации кислорода в
культуральной жидкости на биосинтез лимонной кислоты и эмульгирующую
способность клеток Y. lipolytica HMM-187
4.4.1 Описание и результаты реализованных в работе циклов ферментации
Было выполнено три цикла ферментации, в которых изучали влияние
различных факторов на образование лимонной кислоты.
Первый цикл ферментации проводили на среде Ридер с дизельным
топливом, с инокуляцией культурой продуцента в виде индивидуальных
дрожжевых клеток, без постоянного корректирования уровня рН среды.
Во втором цикле ферментации использовали индивидуальные дрожжевые
клетки с поддержанием рН=5,5 при постоянной подаче кислорода в ферментер.
В третьем цикле ферментации использовали индивидуальные дрожжевые
клетки с поддержанием рН=5,5 при периодической подаче кислорода в
ферментер.
В таблице 2 приведены результаты исследования состава и физикохимических свойств ферментационной среды на первом цикле.
Таблица 2 – Результаты определения содержания клеток, лимонной кислоты, рН,
эмульгирующей
способности
ферментационной
среды
при
проведении
биосинтеза в первом цикле ферментации
Продолжительность, ч
Содержание клеток,
млн.кл/мл
рН
1
1
22,5
44,5
70
93,5
117,5
140
164,5
190,5
2
5,02
7,50
14,30
21,83
29,62
34,75
41,75
61,88
84,33
3
5,51
5,71
5,65
6,02
5,80
5,80
5,66
5,58
5,41
Оптическая
плотность
эмульсии
4
0,227
0,110
0,113
0,139
0,133
0,114
0,138
0,097
0,191
Концентрация
лимонной
кислоты, г/л
5
58,52
70,85
72,21
74,01
73,40
80,99
85,31
95,08
112,10
61
В таблице 3 приведены результаты исследования состава и физикохимических свойств ферментационной среды на третьем цикле.
Таблица 3 – Результаты определения содержания клеток, лимонной кислоты, рН,
эмульгирующей
способности
ферментационной
среды
при
проведении
биосинтеза во втором цикле
Продолжительность, ч
Содержание клеток,
млн.кл/мл
рН
1
0
22
45
70
88
166
190
237
2
0,05
0,43
0,35
0,27
0,40
0,67
0,60
0,71
3
5,5
5,5
5,5
5,5
5,5
5,5
5,5
5,5
Оптическая
плотность
эмульсии
4
0,38
0,39
0,41
0,31
0,24
0,18
0,43
0,33
Концентрация
лимонной
кислоты, г/л
5
1,91
2,08
2,01
1,91
2,23
2,40
2,43
2,66
В таблице 4 приведены результаты исследования состава и физикохимических свойств ферментационной среды на третьем цикле.
Таблица 4 – Результаты определения содержания клеток, лимонной кислоты, рН,
эмульгирующей
способности
ферментационной
среды
при
проведении
биосинтеза в третьем цикле
Продолжительность, ч
1
0
22
45
70
88
166
190
237
Содержание
клеток,
млн.кл/мл
2
0,95
0,37
0,38
0,28
0,16
0,19
0,15
0,23
рН
3
5,5
5,5
5,5
5,5
5,5
5,5
5,5
5,5
Оптическая
плотность
эмульсии
4
0,29
0,37
0,30
0,24
0,23
0,21
0,32
0,27
Концентрация
лимонной
кислоты, г/л
5
1,58
1,18
1,24
1,29
1,21
1,24
1,25
1,22
Концентрация
изолимонной
кислоты, г/л
6
0,28
0,61
0,68
0,69
0,70
0,75
0,71
0,67
62
4.4.2 Особенности морфологии клеток дрожжей Y. lipolytica в трех
циклах ферментации
Результаты микроскопического исследования состояния клеток продуцента
при биосинтезе лимонной кислоты в первом цикле приведены на рисунках 25-27.
10 мкм
Рисунок 25 – Микрофотография индивидуальных клеток дрожжей
Y. lipolytica HMM-187 в ферментационной среде (х400)
10 мкм
Рисунок 26 – Микрофотография индивидуальных клеток дрожжей
Y. lipolytica HMM-187 в ферментационной среде (х400)
63
10 мкм
Рисунок 27 – Микрофотография индивидуальных клеток дрожжей
Y. lipolytica HMM-187 в ферментационной среде (х400)
В первом цикле присутствуют крупные и мелкие клетки. Крупные имеют
округлую форму, диаметром 6-8 мкм и содержат внутри капли углеводородов.
Мелки клетки 1-2 мкм. Во втором и третьем цикле клетки более мелки и имеют
удлиненную форму размером 2-4 мкм. Некоторые из них выстраиваются
цепочкой из клеток, что означает образование небольшого мицелия.
4.4.3 Анализ влияния рН среды и концентрации кислорода на
продуцирование дрожжами Y. lipolytica HMM-187 лимонной кислоты
В
целях
проведения
объективного
сравнительного
анализа
экспериментальных данных было принято решение представить кинетику
накопления лимонной кислоты в виде графиков зависимости, на которых по оси
абсцисс откладывали продолжительность культивирования, а по оси ординат –
отношение концентрации лимонной и изолимонной кислоты к содержанию
клеток в ферментационной среде. Полученные результаты представлены на
рисунке 28.
64
14
1 цикл (ЛК)
Отношение концентрации ЛК и ИзоЛК к
содержанию клеток в 1 мл среды в 3 цикле
ферментации
рН=5,51
12
10
2 цикл (ЛК)
5,71
8
3 цикл (ЛК)
рН=5,5
6
3 цикл (ИзоЛК)
5,65
4
рН=5,5
6,02
5,8
5,8
5,66
2
5,58
рН=5,5
5,41
0
0
50
100
150
Продолжительность, ч
200
250
Рисунок 28 – График зависимости отношения концентрации лимонной и
изолимонной кислот к содержанию клеток в 1 мл среды от продолжительности
культивирования в трех циклах ферментации
На рисунке 28 видно, что поддержание рН на уровне 5,5 во втором и
третьем более эффективно, чем в первом цикле без контроля уровня рН. Также
видно, что при ограниченном поступлении кислорода в третьем цикле лимонной
кислоты накапливается больше, чем в
первом и втором цикле. При этом в
третьем цикле идет накопление изолимонной кислоты, а суммарных выход кислот
в 5 раз выше, чем в первых двух циклах. Следовательно, поддержание рН на
уровне 5,5 и ограниченная подача кислорода положительно влияет на выход
лимонной кислоты.
На
рисунках
29-30
приведены
графики
отражающие
концентрации клеток в трех реализованных циклах ферментации.
изменение
Концентрация клеток, млн/мл
65
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
50
100
150
Продолжительность, ч
200
250
Рисунок 29 – График зависимости концентрации клеток от
продолжительности культивирования в первом цикле ферментации
Концентрация клеток,
млн/мл
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
50
100
150
Продолжительность, ч
200
250
Рисунок 30 – График зависимости концентрации клеток от
продолжительности культивирования во втором цикле ферментации
Концентрация клеток,
млн/мл
66
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
50
100
150
200
Продолжительность, ч
250
Рисунок 31 – График зависимости концентрации клеток от
продолжительности культивирования в третьем цикле ферментации
В первом случае наблюдается рост биомассы клеток на протяжении всего
цикла ферментации. Во втором цикле имеются небольшие скачки в росте, но в
целом биомасса нарастает. В третьем цикле биомасса резко снижается и идет на
убыль. Это связанно с тем, что в третьем цикле ограничивали поступление
кислорода в ферментер.
4.5 Анализ влияния рН среды и концентрации кислорода на
эмульгирующую способность клеток Y. lipolytica HMM-187
Эмульгирующая способность
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
1 цикл
0,2
2 цикл
0,15
3 цикл
0,1
0,05
0
0
50
100
150
200
250
Продолжительность, ч
Рисунок 32 – График зависимости эмульгирующей способности от
продолжительности ферментации в трех циклах ферментации
67
Из графиков, представленных на рисунке 32 видно, что эмульгирующая
способность имеет скачкообразный характер во всех трех циклах ферментации.
В первой цикле эмульгирующася способность не превышает значения 0,2.
Во втором цикле эмульгирующая способность возрастает и максимальное
значение 0,47, что говорит о положительном влиянии поддержания рН на уровне
5,5 и постоянной подаче кислорода. А в третьем цикле эмульгирующая
способность меньше, чем во втором и достигает значения 0,37. Это связано с
недостаточным поступлением кислорода и уменьшение накопление биомассы
клеток, следовательно эмульгирующая способность падает.
Выводы по главе 4
Результаты экспериментов позволяют сделать заключение о том,
биосинтез лимонной кислоты дрожжами Y. lipolytica успешно реализуется при
их развитии на питательных средах, содержащих в качестве источника
углерода дизельное топливо с повышенным содержанием н-парафинов
(«летнее» топливо).
Выяснено, что диморфизм дрожжей Y. lipolytica проявляется при пересеве
с углеводсодержащих сред на среды с гидрофобными субстратами и их
чередовании, а также при поддержании рН на уровне значения 6.
Физиологическое состояние дрожжей (развитие в форме индивидуальных
дрожжевых клеток или в форме мицелия) оказывает очень важное влияние на
их способность накапливать в ферментационной среде лимонную кислоту.
Наибольшая активность биосинтеза была обнаружена в цикле ферментации, в
котором поддерживали уровень рН на уровне 5,5 и при ограниченном
поступлении кислорода в ферментер. Кроме того мицелиальная форма
дрожжей
характеризуется
и
наибольшей
способностью
к
выделению
внеклеточных эмульгаторов. Это приводит к тому, что образование лимонной
кислоты при таком подходе выше, чем использование индивидуальных
дрожжевых клеток.
68
Эмульгирующая
способность
на
протяжении
всех
трех
циклов
ферментации имела скачкообразных характер. Это говорит о том, что на
отдельных этапах развития культуры происходит выделение и накопление
нескольких типов эмульгаторов – жирных кислот, а также соединений
сложного состава, получивших в иностранной литературе названия Liposan и
Yansan. Однако в разных циклах их соотношение различно.
При первом цикле ферментации дрожжи Y. lipolytica накапливают
ассоциированные
с
мембраной
эмульгаторы,
что
подтверждается
микроскопическим исследованием клеток дрожжей.
Поддержание рН на уровне 5,5 повысило накопление лимонной кислоты
по
сравнению
корректировки
с
рН.
первым
Так
циклом
же
ферментации,
ограниченное
в
котором
поступление
не
было
кислорода в
ферментационную среду повысило выход лимонной кислоты и привело к
накоплению изолимонной кислоты. Следовательно, суммарных выход кислот в
5 раз выше, чем в 1 первом цикле. Это говорит об эффективности поддержания
рН на уровне 5,5, а так же ограниченного поступление кислорода для повышения
производства лимонной кислоты.
69
ВЫВОДЫ
В ходе проделанной работы были изучены физико-биохимические особенности
и условия культивирования штамма дрожжей Y. lipolytica HMM-187. Выявлено, что
дрожжи Y. lipolytica способны использовать в качестве субстрата дизельное топливо
для продуцирования лимонной кислоты.
Были выявлены некоторые причины перехода индивидуальных дрожжевых
клеток штамма дрожжей Y. lipolytica HMM-187 к мицелиальной форме. Это связанно с
чередованием углевод- и углеводородсодержащих сред, а также при рН=6 в
культуральной жидкости.
С учетом всех потребностей и факторов роста дрожжей Y. lipolytica как
продуцента
лимонной
кислоты
была
спроектирована,
создана
и
успешно
апробирована в лабораторных условиях ферментационная установка (ферментер) для
глубинного культивирования.
Отработаны методы активации и накопления биомассы дрожжей Y. lipolytica
для инокуляции в лабораторную установку на основе использования нескольких
питательных сред, содержащих в качестве источника углерода как углеводы, так и
углеводороды (предпочтительно – н-парафины).
Были разработаны приемы для интенсификации продуцирования лимонной
кислоты дрожжами штамма Y. lipolytica HMM-187 (а именно, поддержание рН на
уровне 5,5 и контроль подачи кислорода в ферментер) и проведена оценка их
эффективности в лабораторных условиях.
Так же определили как влияет рН-среды и содержание кислорода в
культуральной жидкости на биосинтез лимонной кислоты.
На основе метода обращено-фазовой ВЭЖХ отработан подход к определению
содержания лимонной кислоты в ферментационной среде, предполагающий
проведение
дополнительных
стадий
пробоподготовки,
обеспечивающих
максимальное удаление нерастворимых в воде углеводородов и, как следствие,
улучшающих надежность проводимых измерений.
70
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. А. с. 695230 СССР, М. Кл3 С 12D 1/04 / Лозинов А.Б., Финогенова Т.В.,
Шишканова Н.В., Илларионова В.И., Карклинь Р.Я., Пелцмане И.Ж., Раминя Л.О.,
Лука В.Т. и Кестерис Б.Я.; заявитель и патентообладатель Институт биохимии и
физиологии
микроорганизмов
АН
СССР
и
Экспериментальный
завод
биохимических препаратов АН Латвийской ССР. - №2502883/28-13; заявл.
04.07.77; опубл. 23.06.82, Бюл. №23. – 3 с.
2. Бич, Г. Биотехнология. Принципы и применение / Г. Бич; пер. с англ. под.
ред. И. Хиггинса, Д. Беста и Дж. Джонса. – М.: Мир, 1988. – 480 с.
3. Ганин, П.Г. Гипотетическая модель избыточного метаболизма дрожжей,
утилизирующих жидкие н-алканы / П.Г. Ганин, В.А. Галынкин // СПбГПУ. –
2009. – №2 (77). – С. 45-51.
4. Гореликова, Г.А. Основы современной пищевой биотехнологии: учебное
пособие / Г.А. Гореликова. – Кемерово: Изд-во Кемер. технолог. институт пищ.
пром-ти, 2004. – 100 с.
5. ГОСТ Р 54684–2011. Продукция соковая. Определение органических
кислот
методом
обращенно-фазовой
высокоэффективной
жидкостной
хроматографии. – М.: Изд-во стандартов, 2011. – 20 с.
6. Кузнецова, Е.А. Микробиология: учебно-методическое пособие /
Е.А. Кузнецова. – Орел: ОрелГТУ, 2005. – 186 с.
7. Ленинджер, А. Биохимия / А. Ленинджер. – М.: Мир, 1974. – 958 с.
8. Моргунов, И.Г. Метаболическая организация окислительных путей у
дрожжей Yarrowia lipolytica – продуцентов органических кислот: автореф. дис. на
соискание ученой степени докт. биол. наук 08.00.05 / Игорь Григорьевич
Моргунов. – Пущино: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им.
Г.С. Скрябина РАН, 2009. – 46 с.
71
9. Муратова, Е.И.
Биотехнология органических кислот и белковых
препаратов: учебное пособие / Е.И. Муратова, О.В. Зюзина, О.Б. Шуняева. –
Тамбов: Изд-во Тамб. гос. техн. ун-та, 2007. – 80 с.
10. Мусил, Я. Современная биохимия в схемах / Я. Мусил, О. Новакова,
К. Кунц. – М.: Мир, 1984. – 216 с.
11. Кларксон, Д. Транспорт ионов и структура растительной клетки / Д.
Кларксон. – М.: Мир, 1978. – 368 с.
12. Владимиров, Ю.А. Перекисное окисление липидов / Ю.А. Владимиров,
А.И. Арчаков. – М.: Наука, 1972. – 252 с.
13. Скулачев, В.П. Биоэнергетика / В. П. Скулачев. – М.: Высшая школа,
1989. – 271 с.
14. Карасевич, Ю.Н. Эксперементальная адаптация микроорганизмов / Ю.Н
Карасевич. – М.: Наука, 1975. – 178 с.
15. Иванов, В.Н. Клеточный цикл микроорганизмов и гетерогенность их
популяций / В.Н. Иванов, Г.А. Угодчиков. – Киев: Наукова Думка, 1984. – 280 с.
16. Aguedo, M. Decalactones production by Yarrowia lipolytica under increased
O2 transfer rates / М. Aguedo, N. Gomes, E. Escamilla Garcia, Y. Waché, M. Mota,
J.A. Teixeira, I. Belo // Biotechnol Lett. – 2005. – № 27(20). – P. 1617-1621.
17. Albuquerque, C.D. Optimizing the medium components in bioemulsifiers
production by Candida lipolytica with response surface method / C.D. Albuquerque,
A.M. Filetti, G.M. Campos-Takaki // Can J Microbiol. – 2006. – № 52. – P. 575-583.
18. Alonso, F.M. Improvement of lipase production at different stirring speeds
and oxygen levels / F.M. Alonso, E.L. Oliveira, G.M. Dellamora-Ortiz, F.V. PereiraMeirelles // Brazilian J Chem Eng. – 2005. – № 22. – P. 9-18.
19. Amaral, P.F. Optimization of oxygen mass transfer in a multiphase bioreactor
with perfluorodecalin as a second liquid phase / P.F Amaral, M.G. Freire, H.M. RochaLeao, I.M. Marrucho, J.P. Coutinho, A.Z. Coelho // Biotechnol Bioeng. – 2008. –
№ 99. – P. 588–598.
72
20. Amaral, P.F. Cell Surface Characterization of Yarrowia lipolytica IMUFRJ
50682
/
P.F.
Amaral,
M.
Lehocky,
M.B.
Timmons,
H.M.
Rocha-Leão,
A.Z. Coelho, J.P. Coutinho // Yeast. – 2006a. – № 23. – P. 867-877.
21. Amaral, P.F. Improving Lipase Production using a Perfluorocarbon as
Oxygen Carrier.
P.F. Amaral, H.M. Rocha-Leão, I.M. Marrucho, J.P. Coutinho,
M.Z. Coelho // Journal of Chemical Technology and Biotechnology. - 2006c. – № 81. –
P. 1368-1374.
22. Amaral, P.F. Production and characterization of a bioemulsifier from
Yarrowia lipolytica / P.F. Amaral, J.M. da Silva, M. Lehocky, M.V. Barros-Timmons,
A.Z. Coelho, I.M. Marrucho et al. // Process Biochem. – 2006. – № 41. – P. 1894-1898.
23. Anastassiadis, S. Continuous citric acid secretion by a high specific pH
dependent active transport system in yeast Candida oleophila ATCC 20177 /
S. Anastassiadis, H.J. Rehm // Biotechnology. – 2005. № 8 (2). – P. 847-850.
24. Andreishcheva, E.N. Energy metabolism of Candida (Yarrowia) lipolytica
yeast under nonstress and salinity stress conditions / E.N. Andreishcheva, I.M. Soares,
R.A. Zvyagil’Skaya // Russian Journal of
Plant Physiology. – 1997. – № 44. –
P. 568-574.
25. Anna, M. Metabolic activities of biotechnological interest in Yarrowia
lipolytica grown on glycerol in repeated batch cultures / M. Anna, F. Stylianos,
A. George // Bioresource Technology. – 2010. – № 101. – P. 2351-2358.
26. Barth, G. Yarrowia lipolytica / G. Barth, C. Gaillardin // Nonconventional
yeasts in biotechnology / Berlin Heidelberg: Springer-Verlag. – 1996. – P. 313-88.
27. Barth, G. Physiology and genetics of the dimorphic fungus Yarrowia
lipolytica / G. Barth, C. Gaillardin // FEMS Microbiology Reviews. – 1997. – № 19. –
P. 219-237.
28. Bellou, S. Morphological and metabolic shifts of Yarrowia lipolytica induced
by alteration of the dissolved oxygen concentration in the growth environment /
S. Bellou, A. Makri, I.E.
Triantaphyllidou, S. Papanikolaou, G. Aggelis //
Microbiology. – 2014. – № 160. – P. 807-817.
73
29. Belo, I. Morphological and physiological changes in Saccharomyces
cerevisiae by oxidative stress from hyperbaric air / I. Belo, R. Pinheiro, M. Mota //
J. Biotech. – 2005. – № 115(4). – P. 397-404.
30. Beopoulos, A. The hydrocarbon-degrading oleaginous yeast Yarrowia
lipolytica / T. Desfougeres, J. Sabirova, S. Zinjarde, C. Neuvéglise, J.M. Nicaud //
Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. – Berlin Heidelberg: SpringerVerlag. – 2010. – P. 2111-2121.
31. Biryukova, E.N. Tolerance of the Yeast Yarrowia lipolytica to Oxidative
Stress / E.N. Biryukova, A.G. Medentsev, A.Y. Arinbasarova, V.K. Akimenko //
Microbiology. – 2006. – № 75. – P. 243-247.
32. Casaregola, S. Genomic exploration of the hemiascomycetous yeasts /
S. Casaregola, C. Neuvéglise, A. Lépingle, E. Bon, C. Feynerol, F. Artiguenave //
Yarrowia lipolytica. – 2000. – № 487. – P. 95-100.
33. Cirigliano, M.C. Isolation of a bioemulsifier from Candida lipolytica /
M.C. Cirigliano, G.M. Carman // Appl Environ Microbiol. – 1984. – № 48. –
P. 747-750.
34. Cirigliano, M.C. Purification and characterization of liposan, a bioemulsifier
from Candida lipolytica // M.C. Cirigliano, G.M. Carman // Appl Environ Microbiol. –
1985. № 50. – P. 846-850.
35.
Coelho,
M.A.Z.
Yarrowia
lipolytica:
an
industrial
workhorse
/
M.A.Z. Coelho, P.F.F. Amaral, I. Belo // Currient Research, Technology and Education
Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology. – 2010. № 203. –
P. 930-944.
36. Cooper, D. G. Production of a biosurfactant from Torulopsis bombicola /
D. G. Cooper, D. A. Paddock // Appl. Environ. Microbiol. – 1984. – № 47. –
P. 173-176.
37. Cruz, J.M. Dimorphic behaviour of Debaryomyces hansenii grown on barley
bran acid hydrolyzates / J.M. Cruz, J.M. Domínguez, H. Domínguez, J.C. Parajo //
Biotechnol Lett. – 2000. – № 22. – P. 605-610.
74
38. Dell Angelica, E.C. Study on fatty acid binding by proteins in yeast.
Dissimilar results in Saccharomyces cerevisiae and Yarrowia lipolytica / E.C. Dell
Angelica, C.A. Stella, M.R. Ermacora, E.H. Ramos, J.A. Santome // Comp Biochem
Physiol B. – 1992. – № 102. – P. 261-265.
39. Domínguez, A. Yarrowia lipolytica: an organism amenable to genetic
manipulation as a model for analyzing dimorphism in fungi / A. Domínguez,
E. Fermiñán, C. Gaillardin // Contrib Microbiol. – 2000. – № 5. – P. 151-172.
40. Erickson, L. E. Growth in cultures with two liquid phases: hydrocarbon
uptake and transport / L. E. Erickson, T. Nakahara // Process Biochem. – 1975. – № 10.
– P. 9-13.
41. Escamilla-Garcia, E. Use of a Doehlert factorial design to investigate the
effects of pH and aeration on the accumulation of lactones by Yarrowia lipolytica //
E. Escamilla-Garcia, J.M. Belin, Y. Waché // J Appl Microbiol. – 2007. – № 103. –
P. 1508-1515.
42. Fickers, P. Hydrophobic substrate utilisation by the yeast Yarrowia lipolytica,
and its potential applications / P. Fickers, P.H. Benetti, Y. Waché, A. Marty,
S. Mauersberger, M.S. Smit, J.M. Nicaud // FEMS Yeast Research. – 2005. – № 5. –
P. 527-543.
43. Fickers, P. Carbon and nitrogen sources modulate lipase production in the
yeast Yarrowia lipolytica / P. Fickers, J.M. Nicaud, C. Gaillardin, J. Destain,
P. Thonart // Journal of Applied Microbiology. – 2004. – № 96. – P. 742-749.
44. Flores, C.L. Carbohydrate and energy-yielding metabolism in nonconventional yeasts / C.L. Flores, C. Rodríguez, T. Petit, C. Gancedo // FEMS
Microbiol Rev. – 2000. – № 24. – P. 507-529.
45. Fontes, G.C. Factorial design to optimize biosurfactant production by
Yarrowia lipolytica / G.C. Fontes, P.F. Amaral, M. Nele, M.A. Coelho // J Biomed
Biotechnol. – 2010. – № 2010. – P. 306-317.
75
46. Fukuda, R. Metabolism of hydrophobic carbon sources and regulation of it in
n-alkane-assimilating yeast Yarrowia lipolytica / Fukuda, R. // Biosci Biotechnol
Biochem. – 2013. – № 77. – P. 1149-1154.
47. Fukui, S. Metabolism of Alkanes by Yeast / S. Fukui, A. Tanaka // Advances
in Biochemical Engineering. – 2005. – № 19. – P. 217-235.
48. Gomes, N. Oxygen transfer rate in a biphasic medium: influence on the
biotransformation of methyl ricinoleate into γ-decalactone by the yeast Yarrowia
lipolytica / N. Gomes, M. Aguedo, J. Teixeira, I. Belo // Biochem Eng J. – 2007. –
№ 35. – P. 380-386.
49. Gómez-Díaz, D. Oxygen mass transfer to emulsions in a bubble column
contactor / D. Gómez-Díaz, N. Gomes, J.A. Teixeira, I. Belo // Chemical Engineering
Journal. – 2009. – №152 (2-3). – P. 354-360.
50. Guevara-Olvera, L. The role of polyamine metabolism in dimorphism of
Yarrowia lipolytica / L. Guevara-Olvera, C. Calvo-Mendez, J.J. Ruiz-Herrera // Gen
Microbiol. – 1993. – № 39. – P. 485-493.
51. Guire, P. E. The microbial degradation of oil pollutants / P. E. Guire,
J. D. Friede, R.K. Gholson // In publication LSU-SG73-01 / Centre for Wetland
Resources. – Baton: Rouge La. – 1973. – 586 p.
52. Gutierrez, J.R. Hydrocarbon Uptake in Hydrocarbon Fermentations / J.R.
Gutierrez, L.E. Erickson // Biotechnol Bioeng. – 1977. – № 19. – P. 1331-1349.
53. Gutnick, О.L. Oil tankers and pollution: a microbiological approach /
О.L. Gutnick, E. Rosenberg // Annu. Rev. Microbiol. – 1977. – № 31. – P. 379-396.
54. Hisatsuka, K. Formation of rhamnolipid by Pseudomonas aeruginosa and its
function in hydrocarbon fermentation / K. Hisatsuka // Agric. Biol. Chem. – 1971. –
№ 35. – P. 686-692.
55. Iguchi, T. Emulsifying factor of hydrocarbon produced by a hydrocarbonassimilating yeast / T. Iguchi, I. Takeda, H. Ohsawa // Agric. Biol. Chem. – 1969.
№ 33. – P. 1657-1658.
76
56. Ito, S. Sophorolipids from Torulopsis bombicola: possible relation to alkane
uptake / S. Ito, S. Inoue // Appl. Environ. Microbiol. – 1982. № 43. – P. 1278-1283.
57. Jobson, A. Microbial utilization of crude oil / A. Jobson, F.D. Cook, D.W.S.
Westlake // Appl. Microbiol. – 1972. № 23. – P. 1082-1089.
58. Jones, D.G. Novel macrocyclic glycolipids from Torulopsis gropengiesseri /
D.G. Jones // J. Chem. Soc. – 1967. – P. 479-484.
59. Kamzolova, S.V. Effects of temperature, pH and ethanol concentration on the
maximal speci¢c growth rate and biomass composition of Yarrowia lipolytica, mutant
strain N 1 / S.V. Kamzolova, T.I. Chistyakova, E.G. Dedyukhina, N.V. Shishkanova,
T.V. Finogenova // Microbiologiya (Russ.). – 1996. № 65. – P. 202-207.
60. Kamzolova, S.V.Oxygen requirements for growth and citric acid production
of Yarrowia lipolytica / S.V. Kamzolova, N.V. Shishkanova, I.G. Morgunov,
T.V. Finogenova // FEMS Yeast Research. – 2003. № 15. – P. 1-6.
61. Kaur, S. Dimorphism-associated changes in intracellular pH of Candida
albicans / S. Kaur, P. Mishra, R. Prasad // Biochim Biophys Acta. – 1988. № 972. –
P. 277-282.
62. Kawasse, F.M. Morphological Analysis of Yarrowia lipolytica under Stress
Conditions through Image Processing / F.M. Kawasse, P.F. Amaral, H.M. Rocha-Leão,
A.L. Amaral, E.C. Ferreira, A.Z. Coelho // Bioprocess and Biosystems Engineering. –
2003. № 25(6). – P. 371-375.
63. Kim, T.H. The possible involvement of the cell surface in aliphatic
hydrocarbon utilization by an oil degrading yeast Yarrowia lipolytica 180 /
T.H. Kim Oh Y-S, S.J. Kim // Microbiol Biotechnol. – 2000. № 10. – P. 333-337.
64. Klein, B.S. Dimorphism and virulence in fungi / B.S. Klein, B. Tebbets //
Curr Opin Microbiol. – 2007. № 10. – P. 314-319.
65. Kohlwein, S. Uptake of fatty acids by yeasts, Saccharomyces uvarum and
Saccharomycopsis lipolytica / S. Kohlwein, F. Paltauf // Biochim Biophys Acta. – 1984.
№ 792. – P. 310-317.
77
66. Kretschmer, A. Chemical and physical characterization of interfacial-active
lipids from Rhodococcus erythropolis grown on n-alkanes / A. Kretschmer, H. Bock,
F. Wagner // Appl. Environ. Microbiol. – 1982. № 44. – P. 864-870.
67. Kunze, M. A central role for the peroxisomal membrane in glyoxylate cycle
function / M. Kunze, I. Pracharoenwattana, S.M. Smith, A. Hartig // Biochimica et
biophysica acta. – 2006. № 12. – P. 1441-1452.
68. Lazar, Z. Hexokinase-a limiting factor in lipid production from fructose in
Yarrowia lipolytica / Z. Lazar, T. Dulermo, C. Neuvéglise, A.M. Crutz-Le Coq,
J.M. Nicaud // Metab Eng. – 2014. № 26. – P. 89-99.
69. Lazar, Z. Optimized invertase expression and secretion cassette for improving
Yarrowia lipolytica growth on sucrose for industrial applications / Z. Lazar,
T. Rossignol, A.M. VerbekeCrutz-Le Coq, J.M. Nicaud, M. Robak // Ind Microbiol
Biotechnol. – 2013. № 40. – P. 1273-1283.
70. Lazar, Z. Simultaneous production of citric acid and invertase by Yarrowia
lipolytica SUC+ transformants / Z. Lazar, E. Walczak, M. Robak // Bioresour Technol.
– 2011. № 102. – P. 6982-6989.
71. Lobão, F.A. Aluminum impairs morphogenic transition and stimulates H+
transport mediated by the plasma membrane ATPase of Yarrowia lipolytica /
F.A. Lobão, A.R. Façanha, L.A. Okorokov, K.R. Dutra, A.L. Okorokova-Façanha //
FEMS Microbiol Lett. – 2007. № 274. – P. 17-23.
72. Medentsev, A.G. Involvement of the alternative oxidase in respiration of
Yarrowia lipolytica mitochondria is controlled by the activity of the cytochrome
pathway / A.G. Medentsev, A.Y. Arinbasarova, N.P. Golovchenko, V.K. Akimenko //
FEMS Yeast Research. – 2002. № 2. – P. 519-524.
73. Mimura, A. Biochemical engineering analysis of hydrocarbon fermentation.
III. Analysis of emulsification phenomena / A. Mimura, S. Watanabe, I. J. Takeda //
Ferment. Technol. – 1971. № 49. – P. 255-271.
78
74. Morín, M. Proteomic analysis reveals metabolic changes during yeast to
hypha transition in Yarrowia lipolytica / M. Morín, L. Monteoliva, M. Insenser, C. Gil,
A. Domínguez // Mass Spectrom. – 2007. № 42(11). – P. 1453-1462.
75. Nadal, M. Dimorphism in fungal plant pathogens / M. Nadal, M.D. GarcíaPedrajas, S.E. Gold // FEMS Microbiol Lett. – 2008. № 284. – P. 127-134.
76. Nakahara, T. Characteristics of hydrocarbon uptake in cultures with two
liquid phases / T. Nakahara, L.E. Erickson, J.R. Gutierrez // Biotechnol. Bioeng. – 1977.
№ 19. – P. 9-25.
77. Nicaud, J.M. Expression of invertase activity in Yarrowia lipolytica and its
use as a selective marker / J.M. Nicaud, E. Fabre, C. Gaillardin // Curr Genet. – 1989.
№ 16. – P. 253-260.
78. Osumi, M. Surface structure of some Candida yeast cells grown on n-alkanes
/ M. Osumi, F. Fukuzumi, N. Yamada, T. Nagatani, Y. Teranishi, A. Tanaka, S. Fukui //
Ferment Technol. – 1975. № 53. – P. 244-248.
79. Oswal, N. Palm oil mill effluent treatment by a tropical marine yeast /
N. Oswal, P.M. Sarma, S.S. Zinjarde, A. Pant / Bioresour Technol. – 2002. № 85. –
P. 35-37.
80. Ota, Y. Purification and some properties of cell-bond lipase from
Saccharomycopsis lipolytica / Y. Ota, K. Gomi, S. Kato, T. Sugiura, Y. Minoda // Agr
Biol Chem. – 1982. № 46. – P. 2885-2893.
81. Papanikolaou, S. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on
industrial glycerol in a single-stage continuous culture / S. Papanikolaou, G. Aggelis //
Bioresour Technol. – 2002a. № 82. – P. 43-49.
82. Papanikolaou, S. Lipids of oleaginous yeasts. Part I: Biochemistry of single
cell oil production / S. Papanikolaou, G. Aggelis // Eur J Lipid Sci Technol. – 2011a.
№ 113. – P. 1031-1051.
83. Papanikolaou, S. Citric acid production by Yarrowia lipolytica cultivated on
olive-mill wastewater-based media / S. Papanikolaou, M. Galiotou-Panayotou, S. Fakas,
M. Komaitis, G. Aggelis // Bioresour Technol. – 2008b. № 99. – P. 2419-2428.
79
84. Pereira-Meirelles, F. V. Lipase location in Yarrowia lipolytica cells /
F.V. Pereira-Meirelles, M.H. Rocha-Leão, G. L. Sant’Anna // Biotechnol Lett. – 2000.
№ 22. – P. 71-75.
85. Pérez-Campo, F.M. Factors affecting the morphogenetic switch in Yarrowia
lipolytica / F.M. Pérez-Campo, A. Domínguez // Curr Microbiol. – 2001. № 43. –
P. 429-433.
86. Pines, O. Localization of emulsan-like polymers associated with the cell
surface of Acinetobacter calcoaceticus / O. Pines, E.A. Bayer, D.L. Gutnick // Bacteriol.
– 1983. № 154. – P. 893-905.
87. Rosenberg, E. Emulsifier of Arthrobacter RAG-1: specificity of hydrocarbon
substrate / E. Rosenberg, A. Perry, D.T. Gibson, D.L. Gutnick // Appl. Environ.
Microbiol. – 1979. № 37. – P. 409-413.
88. Rosenberg, E. Emulsifier of Arthrobacter RAG-1: isolation and emulsifying
properties / E. Rosenberg, A. Zuckerberg, C. Rubinovitz, D.L.Gutnick // Appl. Environ.
Microbiol. – 1979. № 37. – P. 402-408.
89. Ruiz-Herrera, J. Different effectors of dimorphism in Yarrowia lipolytica /
J. Ruiz-Herrera, R. Sentandreu // Arch Microbiol. – 2002. № 178. – P. 477-483.
90. Sarubbo, L.A. Bioemulsifier production in batch culture using glucose as
carbon source by Candida lipolytica / L.A. Sarubbo, M.C. Marçal, M.L. Neves,
M.P. Silva, A.L. Porto, G.M. Campos-Takaki // Appl Biochem Biotechnol. – 2001.
№ 95. – P. 59-67.
91. Smita, S. Emulsifier from a tropical marine yeast, Yarrowia lipolytica NCIM
3589 / S. Smita, P. .Zinjarde, P. Aditi // Arch Microbiol. – 2002. № 42. – P. 167-173.
92. Stewart, E. Cytoplasmic alkalinization during germ tube formation in C.
albicans / E. Stewart, N.A.R. Gow, D.V. Bowen // Gen Microbiol. – 1988. № 134. –
P. 1079-1087.
93. Suzuki, T. Trehalose lipid and a-branched ,-hydroxy fatty acid formed by
bacteria grown on n-alkanes / T. Suzuki, K. Tanaka, I. Matsubara, S. Kinoshita // Agric.
Biol. Chem. – 1969. № 33. – P. 1619-1627.
80
94. Thevenieau, F. Characterization of Yarrowia lipolytica mutants affected in
hydrophobic substrate utilization / F. Thevenieau, M.T. Le Dall, B. Nthangeni,
S. Mauersberger, R. Marchal, J.M. Nicaud // Fungal Genet Biol. – 2007. № 44. –
P. 531-542.
95. Workman, M. Comparing cellular performance of Yarrowia lipolytica during
growth on glucose and glycerol in submerged cultivations / M. Workman, P. Holt,
J. Thykaer // AMB Express – 2013. № 3. – 58 p.
96. Zajic, J.E. Emulsifying and surface active agents from Corynebacterium
hydrocarboclastus / J.E. Zajic, H. Guignard, D.F. Gerson // Biotechnol. Bioeng. – 1977.
№ 19. – P. 1285-1301.
97. Zajic, J.E. Properties and biodegradation of a bioemulsifier from
Corynebacterium hydrocarboclastus / J.E. Zajic, H. Guignard, D.F. Gerson //
Biotechnol. Bioeng. – 1977. № 19. – P. 1303-1320.
98. Zajic, J. E. Emulsification and degradation of bunker C fuel oil by
microorganisms / J. E. Zajic, B. Supplisson // Biotechnol. Bioeng. – 1972. № 14. –
P. 331-343.
99. Zinjarde, S.S. Morphogenetic behavior of tropical marine yeast Yarrowia
lipolytica in response to hydrophobic substrates / S.S. Zinjarde, B.V. Kale,
P.V. Vishwasrao, A.R. Kumar // Microbiol Biotechnol. – 2008. № 18. – P. 1522-1528.
100. Zuckerberg, A. Emulsifier of Arthrobacter RAG-1: chemical and physical
properties / A. Zuckerberg, A. Diver, Z. Peeri, D.L. Gutnick, E. Rosenberg // Appl.
Environ. Microbiol. – 1979. № 37. – P. 414-420.
81
Приложение 1
82
Приложение 2
УДК 663.1
БИОЭМУЛЬГАТОРЫ МИКРОБНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Макогон Д.А.
ФГБОУ ВО «Орловский государственный университет имени И.С.
Тургенева», Орел, Россия
Руководитель: Винокуров А.Ю., кандидат технических наук
Ключевые слова: эмульгатор, биоэмульгатор, Yarrowia lipolytica, Yansan.
Применяемые
в
различных
областях
человеческой
деятельности
поверхностно-активные вещества (ПАВ), в основном, имеют синтетическую
природу, но в последние годы значительно вырастает интерес к природным
эмульгаторам, в т. ч. Микробиологического происхождения. Такие ПАВ могут
быть двух видов: внеклеточными и внутриклеточными. Вторые являются частью
клеточной мембраны дрожжей, бактерий и грибов. Биоэмульгаторы микробного
происхождения столь же эффективны, как и синтетические ПАВ, а при решении
ряда
задач
имеют
некоторые
преимущества.
Например,
способность
к
биологическому разложению является одним из наиболее важных факторов
применения ПАВ, поскольку решает проблемы их токсичности и накопления в
естественных экосистемах [3, 6].
ПАВ
в
промышленности
характеризуются
широким
спектром
потенциального применения – от нефтедобычи до производства пищевых
продуктов и составления косметических смесей [4].
Одним из перспективных продуцентов ПАВ рассматриваются дрожжи
Yarrowia lipolytica, которые относятся к строгим аэробам и демонстрируют
разнообразную метаболическую активность. По результатам многочисленных
исследований, в т. ч. проводимых Food and Drug Administration of USA, дрожжи
Yarrowia
lipolytica
и
процессы,
связанные
классифицируются как непатогенные и безопасные [5].
с
их
использованием,
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа