close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Паненкова Анна Сергеевна. Особенности получения целлюлолитических ферментов из бактерий Bacillus acidocaldarius

код для вставки
MVTHVTCTEPCTBOOEPA3OBAHT4'p,rHAyKr4pOCCrfrrCKOrzOEAEPAI{'4VL
@EAEPAJIbHOE
f OC yAAP CTBEHHOE ETOAXETHOE OBPA3OBATETbHOE
yqPEXAEHI4E B bI CruEf O OEPAOBAHI4TT
( o p Jr oB cKvrn f o c y AAp c TB E HHbr rz yHr4B E p C zTE T
r4MeHr4
B
bllly C KHAfl
I4.C.
TyP|EHEBA)
KB AJII,IO
I,IKAUI4OHHAf
PAE
OTA
roHanpaBJreHr4ronoAforoBrcu 19.04.01 EzorexHoJrorr,rtr
(utufu p,
HarrpaBneHHocrb
(npoQznr)
npazr
eH
HanpazJxeH
H
oc
Q aM.un
ue node
o
moarcu)
mu (nporfiunn))
llauesxosofi AHHrr CepreesHH
(
VIrucrwtyt
a
llpoNlbrrunennaq 6uorexHoJrofr,r.s
(uawre uoeauue
CryAenra
H
un, wttn,
o
m
u e c
Ixv0p
r65298
me o)
EcrecreeHHFrx Havx u 6r4orexHororr4r4
(u
auu
e n o a an
ue
Q arcy,t ame
ma (uuc
mu my m a)
)
Teua BbrnycKHofi reanzQnKarlr4oHHofi pa6orrr:
<
Oc o6 eH Ho
crl4 lonyqeHl4t Ilennrcnorr4rnqecxux
B
S
epueHToB uz 6 arcrepuit
acillus acidocaldarius>>
Cry4eHr
/flaHenrona A.C.l
@r40)
Hayvnufi
pyKoBoAr{renr BKP
/Lllaqnoea II.B.l
HopuoxoHrponb
/lllasnona JLB.I
3an. xa$eApofi
/PlO
Open 2018
4
АННОТАЦИЯ
Выпускная квалификационная работа на тему «Особенности получения
целлюлолитических ферментов из бактерий Bacillus acidocaldarius».
Год защиты: 2018.
Направление подготовки: 19.04.01 «Биотехнология».
Студент группы: 61БТ-м Паненкова А.С.
Руководитель: к.т.н. Шаяпова Л.В.
Ключевые слова: биотехнология, целлюлоза, ферменты, целлюлазы,
микроорганизмы, бактерии, Bacillus, термофилы, культивирование, технология.
Данная выпускная квалификационная работа прошла проверку в системе
«Антиплагиат.ВУЗ». Справка прилагается в приложении 1.
Пояснительная записка выпускной квалификационной работы состоит из
введения, аналитического обзора литературы, раздела объектов и методов
исследования, экспериментальной части, выводов, списка использованных
источников и приложений.
Общий
объем
работы
составляет
94
страницы.
Работа
содержит
19 рисунков, 10 таблиц. Список использованных источников включает
86 наименований, в том числе 36 иностранных.
Графическая часть выпускной квалификационной работы выполнена в
редакторе презентаций Power Point 2013 и включает схемы, таблицы, графики и
диаграммы, представленные на 10 листах формата А4.
5
ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Выпускная квалификационная работа на тему «Особенности получения
целлюлолитических ферментов из бактерий Bacillus acidocaldarius».
Предмет ВКР: ферменты целлюлолитического действия, полученные из
бактерий Bacillus acidocaldarius штамма B-5250.
Характер ВКР: прикладная научно-исследовательская работа.
Целью настоящей работы являлось получение конкурентоспособных
целлюлолитических ферментов микробного происхождения из бактерий штамма
Bacillus acidocaldarius B-5250 и изучение их особенностей.
Методы исследования: в работе были использованы общепринятые и
специальные физико-химические, микробиологические, структурно-механические
методы исследования свойств исследуемых бактерий и выделяемых ферментов.
Полученные результаты: расширены сведения о морфологических и
культуральных
характеристиках
Bacillus
acidocaldarius
штамма
B-5250,
подобраны состав питательной среды для поверхностного и глубинного
культивирования продуцента, а также рациональные режимы биосинтеза
целлюлолитических ферментов из изучаемой культуры, предложен способ
получения целлюлаз.
Практическая
значимость
работы:
в
результате
изучения
свойств
исследуемого штамма бактерий разработана и экспериментально обоснована
технология получения ферментов целлюлолитического действия.
Рекомендации по применению: препарат
можно
рекомендовать
для
использования в пищевой промышленности (для улучшения переваривания
клетчатки, осветления соков и нектаров), в текстильной промышленности (для
предания мягкости хлопчатобумажным тканям), в сельском хозяйстве (для
повышения питательной ценности кормов) и др.
6
ПЕРЕЧЕНЬ ПРИНЯТЫХ В ТЕКСТЕ ВКР
СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ
A.
– Aspergillus;
Bac. acid.
– Bacillus acidocaldarius;
Bac. sub.
– Bacillus subtilis;
Cl.
– Clostridium;
Cl. sp.
– Clostridium sporogenes;
E. coli
– Escherichia coli;
Na-КМЦ
– натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы;
Sac. cerevisiae – Saccharomyces cerevisiae;
Т.
– Trichoderma;
ВКПМ
– Всероссийская коллекция промышленных
микроорганизмов;
ГК
– глубинное культивирование;
МПА
– мясо-пептонный агар;
МПБ
– мясо-пептонный бульон;
НАД
– никотинамидадениндинуклеотид;
НАДH2
– восстановленная форма НАД;
ПАВ
– поверхностно-активные вещества;
ПК
– поверхностное культивирование.
7
СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ .................................................................................................................... 10
ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ......................................... 13
1.1 Химическая структура целлюлозы ........................................................................ 13
1.2 Ферментативный гидролиз целлюлозы ................................................................ 14
1.3 Целлюлазы термофильного происхождения ........................................................ 16
1.4 Биотехнологическое применение целлюлолитических ферментов ................... 22
1.4.1 Использование целлюлаз в пивоварении и виноделии .................................... 22
1.4.2 Целлюлазы в кормопроизводстве ....................................................................... 23
1.4.3 Использование целлюлаз в целлюлозно-бумажной промышленности .......... 23
1.4.4 Целлюлазы в пищевой биотехнологии .............................................................. 25
1.4.5 Целлюлазы в текстильной промышленности .................................................... 26
1.4.6 Целлюлазы при производстве детергентов ....................................................... 27
1.4.7 Целлюлазы в проризводстве биоэтанола ........................................................... 27
Выводы по главе 1 ......................................................................................................... 29
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ .......................................... 31
2.1 Организация проведения эксперимента ............................................................... 31
2.2 Объекты исследований ........................................................................................... 31
2.3 Методы исследований ............................................................................................ 33
2.3.1 Подготовка лабораторной посуды...................................................................... 33
2.3.2 Оживление чистой культуры Bacillus acidocaldarius ....................................... 33
2.3.3 Получение чистой культуры Bacillus subtilis .................................................... 35
2.3.4 Приготовление питательных сред для выращивания штамма ........................ 35
2.3.5 Посев бактериальной культуры на питательные среды ................................... 37
8
2.3.6 Подбор пеногасителя ........................................................................................... 37
2.3.7 Микроскопирование препарата. Окраска по методу Грама ............................ 39
2.3.8 Определение влияния начальной кислотности среды на рост выделенных
бактерий ......................................................................................................................... 41
2.3.9 Определение количества клеток ......................................................................... 42
2.3.10 Выявление кислотоустойчивости у бактерий ................................................. 44
2.3.11 Получение биомассы клеток культуры ............................................................ 45
2.3.12 Разрушение клеточной стенки бактерий ......................................................... 45
2.3.13 Определение общего азота с реактивом Несслера ......................................... 46
2.3.14 Вискозиметрический метод определения целлюлолитической активности 47
2.3.15 Антроновый метод определения активности целлюлаз ................................. 48
2.3.16 Концентрирование ферментов Bacillus acidocaldarius .................................. 50
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ АНАЛИЗ .............................. 51
3.1 Культивирование бактерий .................................................................................... 51
3.1.1 Оживление чистой культуры Bacillus acidocaldarius ....................................... 52
3.1.2 Получение чистой культуры Bacillus subtilis .................................................... 55
3.2 Изучение культуральных характеристик исследуемых культур ....................... 57
3.2.1 Изучение влияния начальной кислотности среды на рост бактерий .............. 58
3.2.2 Определение количества клеток высевом на плотную питательную среду
(чашечный метод Коха) ................................................................................................ 58
3.2.3 Выявление кислотоустойчивости бактерий ...................................................... 60
3.2.4 Характеристика исходного штамма и штамма-сравнения............................... 61
3.3 Получение ферментов целлюлолитического действия при поверхностном
способе культивирования бактерий Bacillus acidocaldarius B-5250 ........................ 62
3.3.1 Подбор среды для культивирования .................................................................. 62
9
3.3.2 Получение биомассы клеток и разрушение их клеточной стенки .................. 63
3.4 Получение ферментов целлюлолитического действия при глубинном способе
культивирования бактерий Bacillus acidocaldarius B-5250 ....................................... 65
3.4.1 Подбор питательных сред ................................................................................... 65
3.4.2 Микроскопирование препаратов при глубинном культивировании Bacillus
acidocaldarius ................................................................................................................. 66
3.5 Определение концентрации общего азота в культуральных жидкостях .......... 70
3.6 Определение целлюлолитической активности .................................................... 74
3.6.1 Вискозиметрический метод ................................................................................ 74
3.6.2 Антроновый метод ............................................................................................... 75
3.7 Изучение влияние температуры и pH на активность целлюлолитических
ферментов....................................................................................................................... 77
3.8 Разработка условий осаждения комплекса целлюлолитических ферментов из
бактерий Bacillus acidocaldarius .................................................................................. 79
3.9 Отделение препарата целлюлаз от культуральной жидкости ............................ 81
ВЫВОДЫ ....................................................................................................................... 83
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ.................................................... 85
Приложение 1 ................................................................................................................ 93
Приложение 2 ................................................................................................................ 94
10
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность
исследований.
Растительная
биомасса
является
единственным устойчивым источником органического топлива, химических
веществ и материалов. Сложная структура клеточной стенки растений состоит из
лигноцеллюлозного материала, в основном состоящего из целлюлозных волокон,
строго связанных с гемицеллюлозой и лигнином, что затрудняет их гидролиз и
состав которых существенно отличается в зависимости от конкретного
источника [30].
Целлюлозные материалы особенно привлекательны из-за их относительно
низкой стоимости и широкого распространения. Разложение целлюлозы играет не
только ключевую роль в углеродном цикле природы, но и имеет большой
потенциал для ряда процессов, в первую очередь для получения биотоплива и
химического синтеза [41, 72].
Основное технологическое препятствие более широкого использования
этого важного ресурса является отсутствие технологий с низким уровнем затрат
на
переработку
преодоления
целлюлозной
этого
биомассы.
препятствия
Перспективная
включает
в
себя
стратегия
для
производство
целлюлолитических ферментов, гидролиз целлюлозы и ферментацию сахаров в
результате двухстадийного процесса с помощью целлюлолитических ферментов.
Следует помнить, что полное разложение целлюлозы включает комплексное
взаимодействие между различными целлюлолитическими ферментами. Учеными
было признано, что три типа ферментов, включая эндоглюканазы (EC 3.2.1.4),
экзоглюканазы (EC 3.2.1.91) и β-глюкозидазы (EC 3.2.1.21) действуют совместно
для превращения целлюлозы в β-глюкозу [55].
Согласно исследованию аналитиков компании AB Vista, мировой рынок
целлюлолитических ферментов в денежном выражении оценивается величиной
около 550 млн долларов США. Этот рынок имеет тенденцию к быстрому росту.
Так, по некоторым оценкам, в последние 15 лет он рос в среднем на 13 % в год.
Согласно прогнозам, в ближайшие 10 лет рост будет продолжаться. Основными
11
потребителями ферментов являются страны Западной Европы, Юго-Восточной
Азии и Северной Америки; доля России на этом рынке пока чрезвычайно мала.
Одной из ключевых проблем отрасли в России является очень высокая
импортозависимость: по данным экспертов, доля зарубежной продукции на
российском рынке приближается к 80 %. Эта проблема – общая для рынков
большинства биологически активных веществ: начавшееся в 1970-е годы развитие
советской
биотехнологической
промышленности
было
прервано
в
годы
рыночных реформ. Определенные надежды связываются с государственной
программой «Био-2020», предусматривающей, в частности, строительство заводов
по производству ферментов [35].
Степень научной разработанности темы и круг научных источников.
Разработке технологии получения целлюлолитических ферментов посвящены
труды многих ученых. Большой вклад сделан в решение этой проблемы
Р.В. Фениксовой, В.И. Билай, Л.Г. Логиновой, Л.С. Лосяковой, А.Г. Лобанком,
К.А. Калуняицем и многими другими исследователями [36, 65].
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось
получение конкурентоспособных целлюлолитических ферментов микробного
происхождения из бактерий штамма Bacillus acidocaldarius B-5250 и изучение их
особенностей.
В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:
1) обоснование подбора наиболее перспективного и конкурентоспособного
штамма микроорганизмов для выделения ферментов целлюлолитического
действия;
2) оживление и получение чистой культуры микроорганизмов;
3) изучение культуральных и морфологических особенностей бактерий;
4) выбор оптимального способа культивирования и состава питательных
сред;
5) определение целлюлолитической активности ферментов и изучение их
особенностей;
6) получение ферментов целлюлолитического действия и рекомендации по
12
их применению.
Научная новизна работы. Расширены сведения о морфологических и
культуральных
характеристиках
Bacillus
acidocaldarius
штамма
B-5250.
Подобраны состав питательной среды для поверхностного и глубинного
культивирования продуцента, а также рациональные режимы биосинтеза
целлюлолитических ферментов из изучаемой культуры. Предложен способ
получения целлюлаз.
Практическая значимость работы. В результате изучения свойств
исследуемого штамма бактерий разработана и экспериментально обоснована
технология получения ферментов целлюлолитического действия.
Апробация работы. Основные положения представлены на следующих
конференциях: всероссийской научной конференции с международным участием
«Биотехнология и биомедицинская инженерия» (Курск, 2016); международной
научно-технической интернет-конференции «Фундаментальные и прикладные
аспекты создания биосферосовместимых систем» (Орел, 2016); всероссийской
научно-практической конференции студентов и молодых ученых «Горизонты
биотехнологии» (Орел, 2018); международной научно-практической конференции
«Трансляционная медицина» (Орел, 2017).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.
13
ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Химическая структура целлюлозы
Французский
химик
Ансельм
Пайен
впервые
использовал
термин
«целлюлоза» для этого растительного компонента, который является наиболее
распространенным органическим соединением на Земле [77].
Целлюлоза представляет собой линейный полимер, состоящий из β-Dглюкозных звеньев, связанных 1,4-бета-связями со степенью полимеризации в
диапазоне от 2000 до 25000 [83].
Цепочки
целлюлозы
межмолекулярные
нерастворимые
образуют
водородные
кристаллические
многочисленные
связи,
которые
микрофибриллы.
внутри-
формируют
Природные
и
жесткие,
соединения
целлюлозы являются структурно неоднородными и имеют как аморфные, так и
высоко упорядоченные кристаллические области. Степень кристалличности
зависит от источника целлюлозы, а также кристаллические участки являются
более устойчивыми к ферментативному гидролизу.
Целлюлоза представляет собой нерастворимый кристаллический субстрат,
без вкуса и запаха, гидрофильный, нерастворим в воде и в большинстве
органических
растворители.
Данный
полисахарид
является
структурным
компонентом клеточной стенки растений и составляет почти 33 % от общей
биомассы. Он также синтезируется в других живых системах, таких как бактерии
и водоросли [67, 68].
В растениях целлюлоза связана с другими полимерами, в первую очередь, с
гемицеллюлозой,
лигнином,
пектином
и
другими
веществами,
которые
составляют лигноцеллюлозную биомассу.
Характерной особенностью структуры полимеров целлюлозы является
наличие различного типа связей между макромолекулами. В частности, между
гидроксильными группами макромолекул целлюлозы действуют сравнительно
прочные межмолекулярные водородные связи. Чем больше таких связей между
макромолекулами целлюлозы или ее эфиров, тем больше энергия взаимодействия
14
между ними и тем труднее происходит растворение. Поэтому более или менее
полное разрушение водородных связей между макромолекулами или их
агрегатами является одним из основных методов повышения растворимости
данного
полимера [67, 68].
Длина цепи целлюлозы, выраженная как степень полимеризации по
отношению
к
количеству
мономеров,
изменяется
в
зависимости
от
происхождения и обработки сырья. В случае древесной массы, значение, как
правило, 300 и 1700; хлопок и другие растительные волокна имеют значение в
800-10000 диапазоне; бактериальная целлюлоза имеет аналогичное значение [9].
В зависимости от количества водородных связей между молекулами
целлюлозы, структурная модель целлюлозы в растительной клетке может быть
представлена в аморфном и кристаллическом виде.
1.2 Ферментативный гидролиз целлюлозы
Целлюлазы относятся к классу ферментов, способных катализировать
гидролиз целлюлозы. Их получают, главным образом, из грибов, бактерий, а
также других живых организмов, таких как растения и животные. Такие
ферменты могут быть получены в процессе роста микроорганизмов на
целлюлозных субстратах [57].
Существует
множество
видов
целлюлолитических
ферментов,
различающиеся по структуре и механизму действия. Целлюлолитический
комплекс включает в себя следующие ферменты: эндоглюканазы (КФ 3.2.1.4),
экзоглюканазы (EC 3.2.1.74), целлобиогидролазы (EC 3.2.1.91) и β-глюкозидазы
(EC 3.2.1.21) [29, 75]. Ферментативный гидролиз представлен на рисунке 1.
Эндоглюканазы
(КФ
3.2.1.4)
способны
гидролизовать
внутренние
гликозидные связи в растворимых и аморфных областях целлюлозы, а также
создавать новые концы путем разрезания целлюлозы на длинные нити. Эта
действие приводит к быстрому уменьшению длины полимера и в постепенном
увеличении концентрации сахаров.
15
Рисунок 1 – Ферментативный гидролиз целлюлозы
Экзоглюканазы
(EC
3.2.1.74)
гидролизуют
целлюлозную
цепь
и
олигосахариды удалением последовательных единиц β-глюкозы.
Целлобиогидролазы (EC 3.2.1.91) гидролизуют целлюлозные цепи путем
поступательного удаления двух единиц целлобиозы. Это действие приводит к
быстрому высвобождению редуцирующих сахаров.
β-глюкозидазы
(ЕС
3.2.1.21)
преобразуют
полученные
продукты
олигосахаридов до глюкозы [53].
Вышеописанные компоненты целлюлолитического комплекса действуют
последовательно в синергической системе, чтобы облегчить распад целлюлозы и
последующее биологическое превращение в β-глюкозу [53].
16
1.3 Целлюлазы термофильного происхождения
Термофилы представляют собой уникальную группу микроорганизмов,
растущих при температурах, которые могут превышать 100 °С. В основном,
термофильные микроорганизмы растут при температурах от 65 до 85 °C, а
гипертермофилы растут при температурах выше 85 °C.
Гипертермофилы представлены в основном археями, хотя некоторые
бактерии тоже способны выдерживать температуру около 100 °C [38].
Необычайно жароустойчивые гипертермофилы Methanopyrus kandleri были
обнаружены на глубине 2000 м, при температуре 84-110 °С [Takai и др., 2008].
Термофильным и гипертермофильным микроорганизмам уделяется особое
внимание как перспективным продуцентам термостойких целлюлолитических
ферментов. Такие целлюлазы обладают особыми свойствами, что делает данные
биокатализаторами интересными кандидатами для промышленного применения.
Запуск биотехнологических процессов при повышенных температурах
имеет много преимуществ. Высокая температура оказывает существенное
влияние на растворимость субстратов (особенно, если субстрат обладает высокой
степенью вязкости или это полимер) и по скорости реакции. Кроме того,
проблемы микробного заражения можно избежать, когда реакцию проводят при
повышенной температуре [67].
Деградация лигноцеллюлозных субстратов среди термофилов происходит в
основном за счет видов эубактерий, например, Rhodothermus marinus, Thermotoga
sр., Caldibacillus cellulovorans, Bacillus acidocaldarius [76], в то время как
подобными свойствами обладают лишь несколько представителей архей
(Pyrococcus sр. и Sulfolobus sр.) (таблица 1). Некоторые термофильные грибы
также способны продуцировать целлюлазы (таблица 2).
Среди
термофильных
микроорганизмов,
продуцирующих
целлюлазу,
наиболее распространены аэробы. Acidothermus cellulolyticus, изолированный от
кислотных проб воды и грязи, выделенный в Национальном парке Йеллоустоун в
США, производит, по меньшей мере три термостабильной эндоглюканазы [79].
17
Аэробная термофильная бактерия Rhodothermus marinus, изолированная от
подводного горячего источника в Исландии [Альфредссон и др., 1988], производит
один высокодисперсный термостабильный фермент целлюлазы (Cel12A), который
сохраняет 50 % активности через 3,5 ч при 100 °С [54].
Таблица
1
–
Некоторые
термофильные
бактерии
и
археи,
способные
продуцировать целлюлазы [65]
Микроорганизм
1
Acidothermus cellulolyticus
Alicyclobacillus acidocaldarius
Anaerocellum thermophilum
Aquifex aeolicus
Caldibacillus cellulovorans
Caldicellulosiruptor
saccharolyticus
Clostridium stercorarium
Clostridium thermocellum
Dictyoglomus thermophilus
Dictyoglomus turgidus
Pyrococcus abyssi
Pyrococcus furiosus
Pyrococcus horikoshii
Pyrodictium abyssi
Rhodothermus marinus
спирохеты thermophila
Sulfolobus solfataricus
Thermoanaerobacter cellulolyticus
Thermobifida fusca
Thermococcus kodakaraensis
Thermotoga taritima
Thermotoga neapolitana
Thermotoga petrophila
Thermotoga thermarum
Термофильный
нитчатые
2
+
+
+
+
Температурный
оптимум роста
(° С)
3
55
60
75
85-95
68
4
аэробный
аэробный
анаэробный
аэробный
аэробный
-
70
анаэробный
+
+
+
+
+
-
65
60
73
72
96
98
98
98
65
70
85
75
50-55
85
80
80
80
77
анаэробный
анаэробный
анаэробный
анаэробный
анаэробный
анаэробный
анаэробный
анаэробный
аэробный
анаэробный
аэробный
анаэробный
аэробный
анаэробный
анаэробный
анаэробный
анаэробный
анаэробный
Грамреакция
бактерии
Thermobifida
Тип
питания
fusca
(ранее
Thermomonospora fusca) являются одними из наиболее хорошо изученных
18
аэробных продуцентов термофильной целлюлазы. Это актиномицеты секретируют
три эндоглюканазы Cel9B, Cel6A, Cel5A (ранее названный Е1, Е2, и Е5), две
экзоглюканазы Cel6B и Cel48A (ранее E3 и E6), а также эндо / экзоглюканазу
Cel9A (ранее E4), которые были детально охарактеризованы [47, 66, 82]. Ученый
O. Andre с коллегами углубили исследование с целью понять, каталитический
механизм целлюлазы Cel6A по расчетно-экспериментальному исследованию [66].
Кроме того, кристаллическая структура этого фермента, в комплексе с субстратом
и ингибитором была полностью определена [47].
Таблица 2 – Некоторые термофильные грибы, продуцирующие целлюлазы [65]
Микроорганизм
Chaetomium thermophilum
Humicola grisea var. thermoidea
Humicola insolens
Melanocarpus albomyces
Scytalidium thermophilum
Sporotrichum thermophilum
Talaromyces emersonii
Thermoascus aurantiacus
Thermomyces
lanuginosus
(Humicola lanuginosa)
Род
Alicyclobacillus
был
Температурный
оптимум роста
(° С)
45-55
45
40-50
45-55
40
45-50
40-45
45-50
Тип питания
аэробный
аэробный
аэробный
аэробный
аэробный
аэробный
аэробный
аэробный
45-50
впервые
установлен
аэробный
Н.Ф.
Высотским
и
соавторами [85], и характеризуется наличием алициклических жирных кислот в
качестве основных компонентов мембранных липидов. Все виды Alicyclobacillus
обладают высокой термо- и ацидоустойчивостью (оптимальные условия роста при
45-60 °С и рН 2,0-5,0) и могут быть хорошими источниками кислых глюканаз.
Как известно, Alicyclobacillus acidocaldarius производит четыре целлюлазы:
CelA, CelB, CelG и CelA4. Все они обладают высокой активностью при кислом
значении рН и при температурах в интервале 65-80 °С [1, 50, 74]. CelA
синтезируется при температуре и рН оптимуме 70 °С и 5,5, соответственно. CelB
19
синтезируется при оптимуме pH 4,0 и температуре 80 °С [78]. Фермент
чрезвычайно стабилен при кислом рН и температурах до 80 °C.
Другой
вид
целлюлаз,
выделенный
из
бактерий
Alicyclobacillus
acidocaldarius был выделен при выращивании микроорганизмов в жидкой среде с
добавлением Na-КМЦ в качестве источника углерода [86]. Фермент был
гликозилированным (поэтому назван CelG) с молекулярной массой 56,2 кДа.
Данный вид целлюлаз активен в широком диапазоне рН (3,0-7,0), с оптимальной
активностью при рН 4,0. Температурный интервал также довольно широкий, в
пределах от 40 до 80 °С с оптимальной температурой при 65 °С.
Термостабильность оценивали при 65 и 75 °С, и CelG сохранил 100 % своей
активности через 2 часа при 65 °С и через 1 час при 75 °С. Этот фермент был
более термостабильным, чем CelA, у которого резко снижается активность после
1 часа при 60 °C и после начинается период инактивации в последующие 30
минут при 75 °C [75, 78].
В 2010 году ученый Бай и соавторы идентифицировали целлюлазы CelA4,
полученные из бактерий Alicyclobacillus acidocaldarius, которые секретируются
белком молекулярной массой 48 кДа. Они был выделены, очищены и
охарактеризованы [79]. Фермент был более ацидоустойчив среди всех целлюлаз,
полученных из Alicyclobacillus acidocaldarius, с оптимальным значением рН 2,6.
Кроме того, он был стабилен в кислотных условиях, сохраняя более 80 %
активности в диапазоне рН 1,8-6,6 после инкубации в течение 1 часа при 37 °С.
Оптимальная температура составляла 65 °С, но общая активность была потеряна
после инкубации при этой температуре в течение 1 часа. Высокая активность при
низком рН значении делает CelA4 хорошим кандидатом в качестве коммерческих
продуцентов целлюлаз [78].
Бактерии
Aquifex
aeolicus
являются
гипертермофильными
микроорганизмами. Изначально они были выделены на Липарских островах на
севере
Сицилии
вблизи
подводных
вулканических
жерл.
Эти
бактерии
представляют собой самую глубокую ветвь в бактериальной филогении,
температура их роста может достигать 95 °C [59, 62, 81]. В настоящее время был
20
получен один термостабильный фермент целлюлолитического действия [78].
Оптимальное значение рН и температуры при биосинтезе данных целлюлаз были
7,0 и 80 °С, соответственно. При интервале температуры 90-100 °С активность
целлюлаз снизилось на 50 % после выдерживания в течение 3 часов.
Три гена (sso1354, sso1949 и sso2534), кодирующие три эндоглюканазы,
принадлежащих к семейству GH 12, были аннотированы в полностью
виртуализированы в геноме гипертермофильного и ацидофильного архей
Sulfolobus solfataricus штамма Р2 [56]. Этот микроорганизм первоначально был
выделен в сольфатарной области в районе Неаполя (Италия). Данный
микроорганизм растет при температурах в интервале от 80 до 87 °С и при очень
низких значениях рН (2,0-4,0) [63]. Ген sso2534 был идентифицирован в археях
Sulfolobus solfataricus штамма МТ4, а его продукт (CelS) показал 100 %
идентичность аминокислотной последовательности с CelB, выделенной из
штамма S. solfataricus P2 [45]. Фермент CelS (38,4 кДа) был идентифицирован как
внеклеточный. Он активен при рН 5,8, но никаких других признаков оптимальных
условий установлено не было. В 2005 году Хуанг и др. клонировали ген sso1949 из
E. coli [78].
Clostridium thermocellum являются термофильными, строго анаэробными
бактериями, и в 1983 году был обнаружен целлюлолитический комплекс, который
могут продуцировать
данные бактерии [73]. С. thermocellum производит ряд
целлюлаз как свободных, так и связанных в целлюлолитический комплекс [56, 86].
В 2002 году Тосио Курокава с соавторами [83] идентифицировали
дополнительные эндоглюканазы (CelT). Фермент показал оптимальный рН и
температуру при 7,0 и 70 °С, соответственно, однако данных о термо- и
pH-стабильности не сообщалось. Иммунологический анализ показал, что CelT
являются каталитическим компонентом целлюлолитического комплекса штамма
С. thermocellum F1. Для того, чтобы определить преобладающие каталитические
компоненты целлюлолитического комплекса, микроорганизмов C. thermocellum,
ферменты были очищены, а компоненты были разделены и идентифицированы с
помощью масс-спектрометрии [74, 79]. Анализ показал, что десять из
21
компонентов были уже известны, а три гена были неизвестны. Эти гены были
названы в соответствии с их последовательностями celR, xghA и xynD. В
соответствии
с
предполагаемой
функцией
их
каталитических
модулей,
соответствующие продукты генов были названы Cel9R, Xgh73A и Xyn10D, с
каталитическими модулями GHF9 (эндоглюканазы), GHF74 (ксилоглюканазы) и
GHF10 (эндоксиланазы), соответственно [51, 63].
Микроорганизмы, обладающие высокой целлюлолитической активностью,
встречаются среди анаэробных (гипер) термофилов, например, Thermotoga [64],
Caldicellulosiruptor [84], и Pyrococcus [68]. Несколько гипертермофильных и
термостабильных
целлюлаз
были
выделены
и
охарактеризованы
из
гипертермофильных анаэробных бактерий Thermotoga sp. Две термостабильные
эндоглюканазы (CelA и CelB) были выделены их экстремофильных бактерий
Thermotoga neapolitana [57].
Эндоглюканазы
Pyrococcus
horikoshii
являются
термостабильными,
поскольку остаточная активность составила 80 % через 3 часа при 97 °С [52].
Особенности термофильности и термостабильности открывают возможность
использования
в
промышленном
гидролизе
целлюлозы
при
высоких
температурах, в частности, в биополировке хлопчатобумажных изделий.
Например, процесс расшлихтовки, то есть этап удаления крахмала из ткани,
проводят при температуре 70 °С или выше. При введении гипертермофильных
целлюлаз
появится
возможность
сочетать
процессы
расшлихтовки
и
биополировки одновременно [61].
Существует
целлюлозных
огромный
материалов
потенциал
с
для
производства
использованием
глюкозы
из
гипертермофильных
целлюлолитических ферментов Pyrococcus sр. Полученные данные показали, что
целлюлолитический комплекс ферментов способны к полному превращению
фосфорной кислоты в глюкозу при очень высокой температуре [86].
Целлюлолитические и термофильные анаэробные бактерии, тесно связаны
(99 % идентичность) с бактериями Moorella thermoacetica (ранее Clostridium
22
thermoaceticum),
были
выделены
из
почвы
[56].
Микроорганизм
был
идентифицирован как штамм Moorella thermoacetica F2.
1.4 Биотехнологическое применение целлюлолитических ферментов
Целлюлолитические ферменты очень специфичны, их действие проявляется
лишь в деполимеризации молекул целлюлозы, обычно они действуют в виде
комплекса, который в целом доводит гидролиз целлюлозы до глюкозы.
Использование их очень перспективно в гидролизной промышленности – это
получение глюкозы из целлюлозы [33, 48, 80].
1.4.1 Использование целлюлаз в пивоварении и виноделии
Ферментные комплексы, содержащие целлюлазы, гемицеллюлазы и
пектиназы, могут гидролизовать клеточную стенку растения и, следовательно,
могут быть использованы в пивоварении и виноделии для улучшения качества
готовой продукции и во избежании использования химических веществ [7, 8].
Ферментные
препараты
используют
в
пивоваренной
и
спиртовой
промышленности, чтобы уменьшить вязкость бражки и повысить общую
эффективность процесса [4, 23, 24]. На самом деле, целлюлазы и гемицеллюлазы
обеспечивают превращение биомассы лигноцеллюлозы в сбраживаемые сахара с
последующим увеличением выхода спирта. При этом наблюдается улучшение
качества продукции, и, в то же время, сокращение общих затрат на производство.
Производство вина является биотехнологическим процессом, в котором
дрожжевые клетки и ферменты необходимы для обеспечения высокого качества
продукта [33, 48].
Использование целлюлаз, гемицеллюлаз и пектиназ при виноделии,
позволяет достичь превосходного извлечения цвета, что особенно важно при
производстве красного вина. Кроме этого, целлюлазы способствуют улучшению
процессов осветления, фильтрации, и общего качества и стабильности вина [24].
23
1.4.2 Целлюлазы в кормопроизводстве
Несмотря на то, что целлюлоза является основным ресурсом пищи для
многих видов животных, большинство всеядных и травоядных не способны сами
синтезировать целлюлазы. Напротив, жвачные животные живут в симбиозе с
микроорганизмами (бактерии и простейшие, живущие в желудочно-кишечном
тракте и способных расщеплять целлюлозу в анаэробных условиях) [48].
Низкая усвояемость кормов растительного происхождения делает их менее
пригодными в кормопроизводстве ввиду ограничения потребления животным
доступной энергии.
Поскольку
растительные
полисахариды
разлагаются
относительно
медленно и неполно, чем другие компоненты кормов, требуется эффективная
система
по
проведению
ферментативного
гидролиза
для
улучшения
использования низкокачественных кормов с высоким содержанием грубых
волокон [7, 8, 33].
На данный момент актуальными являются исследования, направленные на
разработку кормов для животных из различных видов агропромышленного сырья
для минимизации затрат.
В настоящее время для этой цели используются грибы, в том числе
некоторые виды рода Pleurotus, способные к разложению растительных остатков
[31]. Грибы рода Pleurotus могут расщеплять различные лигноцеллюлозные
остатки, такие как свекловичный жом и рисовая солома, что повышает
питательную ценность и усвояемость этого сырья благодаря внеклеточным
ферментам целлюлолитического и гемицеллюлолитического происхождения.
Добавление в рацион животных пищеварительных ферментов, способных
расщеплять лигноцеллюлолитическое сырье широко распространены в последнее
время [54].
1.4.3 Использование целлюлаз в целлюлозно-бумажной промышленности
1. Биомеханическая варка целлюлозы. Варка целлюлозы – это механический
процесс, который является электрическим и энергоемким, в ходе которого
24
снижается прочность бумаги. В ходе данного процесса идет превращение бумаги
в волокнистую структуру.
Биомеханическая варка целлюлозы – это ферментативная обрабортка
лигноцеллюлозных материалов до механической стадии варки целлюлозы.
Данный процесс был оценен рядом исследователей [35, 56]. Было установлено,
что при биомеханической варке целлюлозы наблюдается, по меньшей мере, 30 %
экономии в потреблении электроэнергии, а также значительное улучшение
прочностных свойств бумаги.
Препарат целлюлаз, продируемый грибом Chrysosporium lucknowense,
используется в целлюлозно-бумажной промышленности и представляет собой
альтернативу
грибным
целлюлазам
из
грибов
Aspergillus
sp.
и
T. reesei для производства в промышленных масштабах [23].
2. Биомодификация волокон. В последние годы популярность набирает
процесс
биомодификации
волокон,
являющийся
экологически
чистым,
требующий минимальных затрат энергии, а также препятствующий повреждению
волокон бумаги по сравнению с традиционным способом переработки [58]. В
последние годы были проведены исследования, направленные на анализ
изменений, происходящих с волокнами при получении готовой продукции. В
ходе этого были получены волокна более высокого качества, с хорошими
волоконно-оптическими связями, а именно лучшего в готовом продукте. Для
лучшего сцепления между волокнами, а также снижения издержек на
производство
был
использован
ферментный
комплекс,
содержащий
целлюлолитические и гемицелолюлолитические ферменты, действующие на
внешние и внутренние слои целлюлозных волокон [70].
3. Удаление чернил с перерабатываемой бумаги. В последнее время
большое внимание уделяется окружающей среде. Повторное использование
бумаги очень выгодно: снижает затраты на производство, а также снижает
загрязнение окружающей среды. Таким образом, циркуляцию макулатуры
следует рассматривать как неотъемлемую часть в защите лесов и экономики.
25
Традиционная
технология
удаления
чернил характеризуется
низкой
эффективностью лазерной печати, а также при этом используется щелочь.
Принцип ферментативного удаления основан на ослаблении связей между
тонером и волокнами с последующим его выделением из волокон [2, 3, 5].
Ферментативное
облагораживание
макулатуры
позволяет
избежать
использования щелочи, а также с использованием ферментов при кислом рН
можно предотвратить пожелтение, изменить распределение размера частиц
чернил, улучшить прочность волокна целлюлозы, повысить яркость, чистоту и
степень помола, тем самым уменьшить загрязнение окружающей среды.
До 2000-х годов использование ферментов для удаления чернил с
макулатуры проводилось лишь в лабораториях. Однако впоследствии, смесь
целлюлазы, липазы, амилазы стали использовать и в промышленных масштабах.
Для этого были использованы целлюлазы различных микроорганизмов: A. niger,
Т. reesei, Humicola insolens, Myceliophtora fergusii, Chrysosporium lucknowense,
Fusarium sp. [2, 3, 5].
1.4.4 Целлюлазы в пищевой биотехнологии
1. Фруктовые и овощные соки. Потребление фруктовых и овощных соков в
последнее время возрастает во многих странах. Соки потребляются широким
кругом людей, поэтому необходимо чтобы они были доступными, а также
оказывали положительное влияние на здоровье [22]. Например, апельсиновый сок
богат витамином С, фолиевой кислотой, калием. [5]. Ферменты могут играть
ключевую роль в улучшении текучести, цвета и срока хранения сока [14, 33].
Ферментный комплекс, используемый при производстве сока содержит
протеазы, амилазы, пектиназы, целлюлазы, гемицеллюлазы, выделенные из
микроорганизмов
(в
частности,
Aspergllus
niger
и
Trichoderma
sp.),
и
способствуют наибольшему выделению сока из плодов и ягод.
2. Оливковое масло. Производство оливкового масла включает в себя:
дробление и измельчение оливок в каменной или молотковой мельнице,
26
получение
оливковой
пасты
прессованием
и
высокоскоростное
центрифугирование для восстановления масла.
Для того, чтобы получить продукт высокого качества, очень важно
использовать свежесобранные, чистые и не полностью зрелые плоды, а также
проводить прессование в холодных условиях. Тем не менее, высокое количество
масла может быть получено также с полностью созревших плодов, обработанных
при условиях выше комнатной температуры, но это приводит к снижению
качества. При этом масло будет иметь высокую кислотность, прогорклость и
плохой запах [5, 32].
В течение последних десятилетий, ферментные препараты используются
при обработке фруктов и овощей, чтобы улучшить урожайность и качество
продукции. В 90-х гг. XX века систематическое исследование показало, что для
эффектиивной экстракции оливкового масла одного фермента недостаточно. Для
этого был найден ферментный комплекс, состоящий из пектиназ, целлюлаз и
гемицеллюлаз. [5, 22].
1.4.5 Целлюлазы в текстильной промышленности
Джинсы, изготовленные из джинсовой ткани, являются одним из самых
популярных товаров в мире одежды. В конце 1970-х – начале 1980-х гг. были
разработаны способы получения выцветших джинсов с помощью промывания
одежды с пемзой, которые частично удаляли краситель индиго, раскрывающий
белые внутренние части нити, что приводило к изношенному внешнему виду.
Этот процесс был назван «каменная стирка». Использование 1-2 кг камней на кг
джинсов в течение 1 ч отвечало требованиям рынка, но вызвало ряд проблем, в
том числе быстрое изнашивание стиральных машин и опасные условия труда [60].
В качестве альтернативы каменной стирки, на сегодняшний день хлопковые
ткани обрабатывают ферментами, после чего краска легко удаляется путем
механического истирания при стирке [22]. Замещение пемзы ферментативной
обработкой включает в себя много преимуществ: уменьшение энергопотребления,
большую
производительность,
минимальное
время
обработки,
менее
27
интенсивные условия труда. Кроме того, можно работать в более безопасной
среде, процесс может быть механизирован управлением, с использованием
компьютера, дозирующими устройствами жидкого препарат целлюлаз [69].
1.4.6 Целлюлазы при производстве детергентов
Применение ферментов при производстве моющих средств весьма
перспективно. Ферменты являются биологическими катализаторами, которые в
минимальном количестве могут заменить огромное количество химических
средств.
В частности, при производстве моющих средств целлюлазы используются
для удаления микрофибрилл с поверхности тканей, повышая яркость цвета и
мягкость. Благодаря этому, после многочисленных стирок одежда не станет
тусклой [5, 53].
1.4.7 Целлюлазы в проризводстве биоэтанола
В последнее время наблюдается истощение мировых запасов ископаемого
топлива и глобальное изменение погоды, вызванное увеличением выбросов
углекислого газа. Ввиду этого возникает необходимость производства биоэтанола
из возобновляемых ресурсов в качестве альтернативного вида энергии [51, 64].
Этанол, также называемый зерновой спиртом, является прозрачной
бесцветной жидкостью, биоразлагаем, а также обладает низкой токсичностью.
Биоэтанол является альтернативным видом топлива, используемым в качестве
замены
бензина
возобновляемых
и
производится
ресурсов,
такие
с
как
использованием
биомасса
биологических
лигноцеллюлозных
материалы [70].
Преимуществом биоэтанола по сравнению с ископаемым топливом является
то, что биоэтанол снижает выбросы парниковых газов, которые в основном
производятся дорожно-транспортной системой.
Еще
одна
полезность
биоэтанола
представлена
возможностью
дополнительного уменьшения количество оксида углерода, вырабатываемого от
28
двигателей
старого
типа,
тем
самым
улучшая
качество
воздуха
без
дополнительных затрат. Более того, очень важным критерием применения
биотоплива является легкость, с которой оно может быть интегрировано в
существующую дорожно-транспортную систему. Биотопливо смешивается с
обычным топливом в количестве до 5 % без необходимости модификации
двигателя.
Кроме
того,
в
качестве
источника
получения
биоэтанола
можно
использовать биомассу из различных видов материалов, характеризующиеся
низкой
стоимостью:
дерево,
твердые
бытовые
отходы,
макулатура,
сельскохозяйственные и промышленные отходы [5].
Лигноцеллюлозная биомасса относится к биомассе растений, которая
состоит из целлюлозы, гемицеллюлозы и лигнина. Цепи целлюлозы и
гемицеллюлозы встроены в матрицу лигнина, что препятствует их эффективному
разложению.
Целлюлоза и гемицеллюлоза могут быть гидролизованы ферментами или
химическими методами в моносахара, которые впоследствии могут быть
превращены в биоэтанол.
В целом, производство биоэтанола из биомассы лигноцеллюлозы состоит из
трех важных этапов [69, 70]:
1)
предварительная
обработка,
которая
позволяет
провести
делигнификацию биомассы, выпустив целлюлозу и гемицеллюлозу из комплекса
с лигнином, делая более доступным эти полисахариды для воздействия
ферментов. Тем самым ферментативный гидролиз протекает более эффективно
[Мосьер и др., 2005; Альвира и др 2010].
2) осахаривание: превращение полисахаридов в ферментируемый сахар.
Ферментативная деградация биомасса требует действие нескольких ферментов,
действующих совместно, таких как эндоглюканазы, бета-глюкозидазы, ксиланазы
и другие;
3) ферментация: с помощью дрожжей или других соответствующих
микроорганизмов для получения этанола из смеси моносахаридов.
29
Выводы по главе 1
Целлюлолитические ферменты (целлюлазы) катализируют гидролиз 1,4-βD-глюкозидных связей в целлюлозе. Они играют существенную роль в природе
путем
рециркуляции
этого
полисахарида,
который
является
основным
компонентом клеточной стенки растений. Для полной деградации целлюлозы в
растворимые сахара, а именно целлобиозы и глюкозы, которые затем усваиваются
клеткой, требуется взаимодействие целлюлаз с другими гидролитическими
ферментами [23, 30].
В биотехнологии у целлюлолитических ферментов есть огромный
потенциал для непрерывного проведения фундаментальных и прикладных
исследований. Такие биокатализаторы выделяют из грибов и бактерий. В
настоящее время целлюлазы нашли применение во многих областях, такие как
пивоварение, виноделие, кормопроизводсво, производство детергентов, пищевой,
текстильной и целлюлозно-бумажной промышленности [5].
Кроме того, растет интерес в применении целлюлаз при конверсии
лигноцеллюлозного
сырья.
Ферментативное
превращение
целлюлозы
перспективно не только с точки зрения создания самостоятельных малоотходных
технологий, но и с позиции снижения экологической опасности различных
производств целлюлозно-бумажной промышленности и других производств,
перерабатывающих растительное сырье и образующих большое количество
отходов. Ежегодное производство древесины для изготовления бумаги постоянно
возрастает, создавая тем самым мощное давление на окружающую природную
среду.
Таким ᴏбразом, невостребованные сырьевые ресурсы для ферментативного
получения углеводов из целлюлозы огромны и постоянно возобновляются. На
самом деле, биоконверсия биомассы имеет значительные преимущества по
сравнению с другими стратегиями производства альтернативных источников
энергии, поскольку лигноцеллюлоза является наиболее распространенным и
возобновляемым
биоматериалом
на
нашей
планете.
Биоконверсия
30
лигноцеллюлозы
инициируются
главным
образом
микроорганизмами,
способными разлагать лигноцеллюлозные материалы.
Тем
не
менее,
гетерогенный
характер
лигноцеллюлозных
отходов
представляет собой препятствие для эффективного процесса осахаривания и
методов предварительной обработки, необходимой для того, чтобы сделать
полисахарид более доступным к действию ферментов.
Однако часто требуется осуществить несколько предварительных обработок
лизноцеллюлозного субтрата, которые могут вредно сказываться на обычных
биокатализаторах. При
этом термостойкие ферменты
могут предложить
потенциальное решение данной проблемы. Повышенная стабильность таких
ферментов к высокой температуре и экстремальных рабочих параметрах
позволяет повысить производительность гидролиза и гибкость процесса, что
ведет к повышению общей экономичности процесса [82].
Поэтому на основании сведений, полученных при изучении и анализе
литературных источников по выбранной проблеме в данной работе, выбор был
остановлен на перспективном, с точки зрения общей характеристики, но на
сегодняшний день недостаточно изученном продуценте целлюлолитических
ферментов – штамме бактерий Bacillus acidocaldarius B-5250 [49]. Согласно
паспорту (Приложение 2), данный штамм отличается высокими показателями
скорости
роста,
ферментативной
интенсивностью
активностью,
а
накопления
также
биомассы
популяционной
и
высокой
устойчивостью,
обусловливающей его технологичность. Ацидо- и термотолерантность штамма
обеспечивает также его конкурентоспособность и высокую активность в процессе
культивирования. В настоящее время данный вид бактерий используется только
при повышении усвояемости кормов в сельском хозяйстве. На основании
комплекса исследований планируется предложить технологические решения,
направленные на получении целлюлолитических ферментов с целью дальнейшего
их применения в производственных технологиях.
31
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1 Организация проведения эксперимента
Работа проводилась на кафедре «Промышленная химия и биотехнология»
Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения
высшего образования «Орловского государственного университета имени
И.С. Тургенева» в соответствии с поставленными целями и задачами.
Первый
этап
работы
был
посвящен
теоретическому
обоснованию
актуальности исследований. С этой целью проводился сбор информации,
патентный поиск и анализ литературы по теме. Второй этап был посвящен
практической подготовке и проведению исследования. Схема исследования
представлена на рисунке 2.
2.2 Объекты исследований
В качестве объектов исследования в работе выступали:
− чистая
культура
Bacillus
acidocaldarius
B-5250,
полученная
из
ВКПМ, г. Москва [11], выделенная из прелой соломы, согласно паспорту штамма
(Приложение 2);
− чистая культура Bacillus subtilis, выделенная в лабораторных условиях из
прелого сена травы;
− сено по ГОСТ Р 55452-2013;
Сырье, используемое для приготовления питательных сред, соответствовало
требованиям нормативно-технической документации:
− агар микробиологический по ГОСТ 17206-96;
− пептон сухой ферментативный по ГОСТ 13805-76;
− соль поваренная пищевая по ГОСТ Р 51574-2000;
− дрожжи хлебопекарные прессованные по ГОСТ Р 54731-2011;
− натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы по ГОСТ 5.588-70;
− хлопковая вата по ГОСТ 5556-81;
− агар питательный по ТУ 9385-12-16542938-04;
32
− вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.
Рисунок 2 – Схема проведения исследования
33
2.3 Методы исследований
2.3.1 Подготовка лабораторной посуды
Для проведения исследования необходим этап подготовки лабораторной
посуды
перед
использованием,
а
именно
− стерилизация.
Стерилизация
проводилась сухим паром при температуре 180 ºC в течение 90 минут в
стерилизаторе.
Пробирки, колбы закрывают ватными или ватно-марлевыми пробками.
А
также поверх пробок каждый сосуд (кроме пробирок) закрывают бумажными
колпачками.
Стерилизацию чашек Петри проводят также в сушильном шкафу по
несколько штук при соответствующей температуре, предварительно обернув в
бумагу. Таким же образом стерилизуются пастеровские пипетки, только
дополнительно в каждую пипетку вставляют кусочек ваты.
Чтобы простерилизовать ватные или марлевые тампоны помещают в
сушильный шкаф или автоклав по отдельности или несколько штук, также
заворачивая в бумагу (при необходимости в несколько слоев бумаги).
Стерилизуют при температуре 121 ºC в автоклаве в течение 30 минут.
Стерильная
посуда
хранится
в
ящиках
с
крышками
или
закрывающихся шкафах. Согласно ГОСТ ИСО 7218-2011 срок хранения
стерильной посуды не более 30 суток [19].
2.3.2 Оживление чистой культуры Bacillus acidocaldarius
Оживление чистой культуры Bac. acid. было проведено по методике,
которая прилагалась к культуре. Для активации культуры бактерий Bacillus
acidocaldarius ампулу с высушенным штаммом вскрывают стерильно: верхний
конец ампулы нагревают в пламени горелки, затем кусочком стерильной ваты,
смоченным в стерильной воде, осторожно прикасаются к оттянутому концу
ампулы
так, чтобы получилось трещина, легким ударом пинцета (или
скальпеля) удаляют конец ампулы и стерильно вливают в нее пастеровской
34
пипеткой 0,2 мл дистиллированной воды или физиологического раствора с
концентрацией NaCl 0,9 %. Ампулу закрывают стерильным ватным тампоном и
оставляют для растворения материала и набухания высушенных клеток на 30
минут [10].
После полного растворения содержимого ампулы материал переносят
пастеровской пипеткой в чашки Петри с L-средой следующего состава (г/л):
дрожжевой экстракт – 5,0, пептон – 15,0, NaCl – 5,0, агар – 15,0, вода
дистиллированная – 1,0 л.
Далее распределяют жидкость шпателем Дригальского. Перед забором
клеток
микроорганизмов
бактериологическую
петлю
(иглу)
необходимо
простерилизовать, накаливая проволоку в пламени горелки докрасна, также
обжигают часть держателя.
Колонии бактерий извлечь стерильной петлей и перенести в заранее
подготовленную чашку Петри. При этом проволоку держат над горелкой почти
вертикально, с целью равномерного прокаливания. Следует помнить, что
наивысшая температура развивается в верхней и периферической частях
пламени [32].
Закончив стерилизацию бактериальной петли, ее охлаждают, прикасаясь к
внутренней поверхности сосуда или к предметному стеклу, чтобы не повредить
клетки микроорганизмов и только после этого бактериологическую петлю можно
вводить в сосуд с микроорганизмами, чтобы захватить какое-то количество
микробной массы [12].
Чашки Петри обматывают скотчем, переворачивают вверх дном и
помещают в термостат с оптимальными условиями. В соответствии с паспортом,
для
бактерий
Bacillus
acidocaldarius
B-5250
оптимальная
температура
выращивания – 35 °С. Через 24 часа образовавшиеся колонии пересевают на
свежую среду, чтобы убедиться в чистоте культуры.
микробы
обладают
несколько
пониженной
В первых пересевах
жизнеспособностью.
восстановления полной жизнеспособности требуется 2-3 пассажа [10].
Для
35
2.3.3 Получение чистой культуры Bacillus subtilis
Для получения накопительной культуры аэробных спорообразующих
бактерий необходимо поместить 1 г сена [20], взвешенных на технических весах,
в колбу и добавить 15-20 мл водопроводной воды, нагретой до 40-50 °С. Сено
настаивать в течении 30 мин. За это время из него экстрагируются вещества,
являющиеся питательным материалом для бактерий. Через 30 минут настой
профильтровать и разлить в 2 пробирки, закрыть их ватными пробками и прогреть
на кипящей водяной бане 40 мин. Вегетативные клетки и споры большинства
микроорганизмов за это время погибнут. Лишь термоустойчивые споры Bac. sub.
останутся жизнеспособными. По окончании нагревания пробирки поместить в
термостат при 30 °С.
Через 48 ч рассмотреть пробирки с накопительными культурами и отобрать
те, в которых на поверхности сенного настоя образовалась тонкая пленка.
Провести микроскопическое исследование полученных накопительных культур в
препаратах «раздавленная капля» и выбрать пробирки, в которых преобладают
мелкие одиночные палочки, образующие споры. Отобранные колонии отсеять в
пробирки со скошенным МПА. Засеянные пробирки поместить в термостат на
30°С.
Проверить чистоту выделенных культур визуально, микрокопированием
(приготовить фиксированные окрашенные препараты) и рассевом на чашки с
МПА. Предварительно проверить на чистоту культуры и отсеять в пробирки со
скошенным МПА. Для рассева расплавить МПА в колбе и залить в чашки Петри.
Для посева использовать одну петлю суспензии бактерий, приготовленной в
стерильной водопроводной воде. Рассев произвести шпателем [25, 40].
2.3.4 Приготовление питательных сред для выращивания штамма
Следующий этап – приготовление и стерилизация питательных сред.
L-среда (таблица 3) была выбрана в соответствии с инструкцией к штамму,
полученному из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов.
Данная питательная среда была использована для активации штамма. Посев
36
микроорганизма осуществлялся поверхностным методом c помощью шпателя
Дригальского [11, 21, 40].
Таблица 3 – Состав питательной среды для восстановления культуры
L-среда
Дрожжевой экстракт, мл
Пептон, г
Натрий хлористый, г
Агар ,бактериологический, г
Вода дистиллированная, мл
5,0
15,0
5,0
15,0
1000,0
Приготовление дрожжевого экстракта: свежие хлебопекарные дрожжи
(прессованные) в количестве 1 кг суспензируют в 1 л дистиллированной воды,
стерилизуют текучим паром (100 °С) в течение 30 мин., затем отстаивают в
холодильнике (+4 °С) в течение 5-6 суток. Надосадочную жидкость декантируют
(осторожно сливают), разливают в колбы и снова стерилизуют при 100 °С в
течение 30 мин [17, 32]. Последующее хранение дрожжевого экстракта
рекомендуют в холодильнике [34].
Таблица 4 – Состав питательных сред для культивирования бактерий при
поверхностном культивировании
Состав питательной среды
Na-КМЦ, г
Хлопковая вата, г
Пептон, г
Натрий хлористый, г
Агар ,бактериологический, г
Вода дистиллированная, мл
Среда №1
5,0
‒
Среда №2
‒
5,0
15,0
5,0
15,0
1000,0
В качестве субстратов для синтеза целлюлолитических ферментов были
использованы – натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы и хлопковая вата.
Хлопковую вату предварительно переводили в гидроцеллюлозу путем обработки
10н HCl в течение 1 суток при комнатной температуре и тщательного отмывания
до нейтрального pH промывных вод [15, 16, 42].
37
Стерилизацию питательных сред (таблица 4, 5) проводили с помощью
автоклава при температуре 127 °С в течение 30 минут. Немного охладив
питательную среду, проводился розлив в чашки Петри в стерильных условиях в
ламинар-боксе [24].
Таблица 5 – Состав питательных сред для культивирования бактерий при
глубинном культивировании
Состав питательной среды
Na-КМЦ, г
Хлопковая вата, г
Натрия цитрат, г
Аммония гидрофосфат, г
Калия дигидрофосфат,г
Глюкоза,г
MgSO4 х 7H2O
Вода дистиллированная, мл
Среда №1
5,0
‒
Среда №2
‒
5,0
1,29
4,75
9,6
1,3
0,18
1000,0
2.3.5 Посев бактериальной культуры на питательные среды
Выращивании бактерий поверхностным способом проводился в чашках
Петри в термостате в течение 3-х суток при 35 °С [11, 49].
Для выращивания бактерии Bacillus acidocaldarius B-5250 глубинным
методом культивирования в жидкой среде на кафедре «Промышленная химия и
биотехнология» Орловскогогосударственного
университета
имени
И.С. Тургенева был сооружен биореактор, предусматривающий аэрацию жидкой
питательной среды, поддержание необходимой температуры, возможность
стерильного отбора проб [28]. Биореактор представлен на рисунке 3.
Культивирование длилось 3 суток при температуре 35 °С при постоянной
аэрации питательной
среды. Каждые сутки проводился отбор
проб
для
дальнейших анализов [18].
2.3.6 Подбор пеногасителя
Глубинное культивирование бацилл сопровождалось пенообразованием,
которое могло помешать проведению опытов. В связи с этим производился
38
подбор наиболее подходящих пеногасителей, которые смогли бы гасить пену без
вреда для бактерий. Антивспениватели (пеногасители) представляют собой такие
вещества, которые используются в целях предотвращения или снижения
образования пены.
Принцип действия пеногасителей заключается в образовании на границе
раздела жидкой и газовой фазы нерастворимой в жидкости непроницаемой
плёнки и таким образом повышает поверхностное натяжение и предотвращает
образование пены [28, 49].
Рисунок 3 – Биореактор для культивирования микроорганизмов
В качестве пеногасителей применяют природные эфиры и масла,
органические кислоты, кремнийорганические соединения, силиконовые масла,
спирты, эфиры, неорганические вещества.
В производстве сахара и спиртов для пищевых целей используют
подсолнечное, оливковое, касторовое масла, в производстве дрожжей – масло
39
вазелиновое, при проведении ферментации – свиной жир. Кроме того, в пищевой
и фармацевтической промышленности широко применяются искусственно
синтезируемые эфиры – этилацетат, винилацетат, а также кремнийорганические
соединения. Пеногашение при обработке сточных вод, растворов моющих
средств, буровых растворов осуществляют с помощью спиртов, стеариновой
кислоты,
фосфорорганических
соединений
(например,
трибутилфосфата),
извести, а также отходов промышленности.
Анализируя литературные источники, в данной работе были использованы
такие пеногасители, как глицерин и касторовое масло. Глицерин абсолютно
безвреден, потому как в клетках многих микроорганизмов имеется липаза,
которая катализирует расщепление жиров на глицерин и жирные кислоты. Таким
образом, глицерин выступает
дополнительным
источником
углерода
в
питательной среде.
Касторовое масло также является одним из наилучших натуральных
пеногасителей, которое используют в пищевой промышленности и во многих
других производствах.
Еще одним неоспоримым достоинством касторового масла и глицерина
является доступность и дешевизна [18, 25].
2.3.7 Микроскопирование препарата. Окраска по методу Грама
Микроскопирование
препарата
проводилось
каждые
24
часа
культивирования бактерии в течение 3 суток. Для приготовления жидкого
препарата, на чистое предметное стекло наносили петлей каплю продукта и
распределяли на площади 1-2 см2.
Приготовленные микропрепараты высушивали при комнатной температуре
на воздухе (МУК 4.2.1778-03) и проводили окрашивание по методу Грама.
Сущность
метода
состоит
в
том,
что
у
грамположительных
микроорганизмов на поверхности цитоплазмы клетки находится комплекс,
состоящий из рибонуклеата магния, отсутствующего у грамотрицательных
бактерий
и
белка.
После
окрашивания
по
Граму
на
поверхности
40
грамположительных клеток образуется прочный комплекс из белка, рибонуклеата
магния, генцианвиолета и йода, не разрушающийся при обработке спиртом.
Поэтому этот вид бактерий остается окрашенным в сине-фиолетовый цвет. А
грамотрицательные бактерии не обладают способностью удерживать краску и при
проведении смыва спиртом обесцвечиваются. Поэтому, чтобы выявить такие
бактерии их препарат докрашивают фуксином. В конечном результате
грамотрицательные бактерии приобретают красный цвет [12].
План дифференцированного окрашивания по Граму:
− мазок фиксируют на воздухе или проведением препарата пару раз над
пламенем горелки, затем помещают кусочек бумажного фильтра (1,5х1,5 см) и на
него
наносят
карболовый
раствор
генцианового
кристаллический фиолетовый до полного смачивания.
фиолетового
или
Бумагу не снимают
1-2 мин;
− убирают бумажный фильтр, сливают краситель, на препарат капают
раствор Люголя, не промывая препарат водой, выжидают 1-2 мин до почернения
мазка;
− раствор Люголя сливают, смывают краску окрашенного мазка 96 %
этиловым спиртом до обесцвечивания, помещая препарат 2-3 раза в стакан со
спиртом (примерно на 30 секунд) или же капают 2-4 капли спирта на мазок
на 30-45 с;
− мазок как можно быстрее промывают водой;
– препарат окрашивают фуксином Пфейффера (водным раствором фуксина)
в течение 1-2 мин;
− сливают краситель, промывают водой препарат, проводят высушивание
фильтровальной бумагой, прикасаясь к окрашенному препарату;
− исследуют под микроскопом с иммерсионной системой.
Грамотрицательные
бактерии
окрашиваются
грамположительные – в фиолетовый цвет [12].
в
синий,
а
41
2.3.8 Определение влияния начальной кислотности среды на рост
выделенных бактерий
Расплавить мясо-пептонный агар в 2 пробирках, приготовить скошенный
агар и пересеять на него чистую культуру споровых бактерий. Чтобы изучить
влияние
начальной
кислотности
среды
на
рост
выделенных
бактерий,
приготовить среды с различными значениями pH: 4,0; 6,0 и 8,0.
Приготовить 600 мл среды, состоящей из равных объемов сусла и мясопептонного бульона, разлить ее в 2 колбы по 300 мл. В одну колбу добавить 0,9 %
KH2PO4 (среда №1), в другую – 2,4 % Na2HPO4·12H2O или 1,2 % Na2HPO4·2H2O
(среда №2). Для получений сред с различными значениями pH объединить среды
№1 и №2 в соотношениях, указанных в таблице 6.
Значения
pH
приготовленных
сред
проверить
по
универсальному
индикатору. Каждую из полученных сред разлить по 20 мл в 3 колбы. Колбы во
всех
вариантах
опыта
одинаковые.
Среды
простерилизовать
при
0,5 атм. 20 минут. Колбы с 5 %-ными растворами NaOH и HCl закрыть ватными
пробирками со вставленными в них пипетками и простерилизовать при 1 атм.
Таблица 6 – Соотношение сред №1 и №2 (в мл) и значение pH
Среда
4,0
119
1
№1
№2
Провести
посев
выделенных
Значение pH
6,0
48
72
культур
уколом
8,0
6
114
в
центр
пробирок
бактериальной иглой с мясо-пептонной желатиной. Пробирки оставить при
комнатной температуре. Снова проверить кислотность сред по универсальному
индикатору и в случае отклонения довели pH с помощью стерильных 5 %-ных
растворов NaOH и HCl до необходимых значений. Посев провести суспензией
клеток выделенных культур в стерильной водопроводной воде. Количество
посевного материала одинаково во всех вариантах опыта (2-3 капли). Засеянные
колбы поместить в термостат на 30 °С на 48 ч [25, 39].
42
2.3.9 Определение количества клеток
Определение
количества
клеток
проводить
высевом
на
плотные
питательные среды (чашечным методом Коха). Сущность его заключается в
высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на
плотную среду в чашки Петри и подсчете выросших после инкубации колоний.
Принято считать, что каждая колония – потомство одной клетки [19, 35].
Численность популяции микроорганизмов обычно достаточно велика,
поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд
последовательных разведений. Разведения готовят в 0,9 %-ном растворе NaCl,
используя постоянный коэффициент разведения равный 10. В ходе опыта
целесообразно использовать один и тот же коэффициент разведения, так как это
уменьшает вероятность ошибки.
Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разлить по
9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии стерильной
пипеткой перенести в пробирку с 9 мл стерильной воды – это 1-е разведение, 10-1.
Полученное разведение тщательно перемешать новой стерильной пипеткой,
вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную взвесь. Эту процедуру
выполнить 3-5 раз, затем этой же пипеткой отобрать 1 мл полученной суспензии и
перенести во 2-ю пробирку, тем самым получив 2-е разведение, 10-2.
Таким же образом готовить и последующие разведения (рисунок 4).
Степень
разведения
зависит
от
плотности
исследуемой
популяции
микроорганизмов; она тем больше, чем больше плотность популяции. Для
приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую
пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного
результата.
Высевать
суспензию можно
поверхностным или
глубинным
способом. Перед посевом поверхностным способом разлить расплавленную
агаризованную питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15-20 мл в
каждую. Чашки оставить на горизонтальной поверхности, − пока среда не
застынет [17, 18, 34]
43
После того, как среда готова, на ее поверхность стерильной пипеткой
нанести точно измеренный объем 0,1 мл соответствующего разведения и
распределить его стерильным стеклянным шпателем по поверхности среды.
Высевы на плотную среду произвести из трех последних разведений. Причем из
каждого следует осуществлять по 2-4 параллельных высева. Посевы можно делать
одной пипеткой, но при этом начинать необходимо с большего разведения. Для
каждого разведения рекомендуется использовать новый стерильный шпатель.
После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз. Колонии
бактерий подсчитывают через 2-е суток инкубации в термостате.
Рисунок 4 – Схема приготовления разведений и рассева суспензии
микроорганизмов шпателем
44
Подсчет проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства чернилами или
карандашом по стеклу отмечают просчитанную колонию точкой на наружной
стороне дна чашки. При большом количестве колоний дно чашки Петри
разделяют на секторы, подсчитывают число колоний в каждом секторе и
суммируют полученные результаты.
Лучшим разведением следует считать то, при высеве из которого на
агаровой пластинке в чашке Петри вырастает от 30-50 до 100-150 колоний. Если
число выросших колоний оказалось меньше 10, то эти результаты для расчета
количества клеток в исходном материале не используются.
Результаты параллельных высевов из одного и того же разведения
необходимо суммировать и определить среднее число колоний, выросших при
высеве из данного разведения на одной чашке. Количество клеток в 1 мл
исследуемого субстрата вычисляют по формуле 1 [17, 18]:
(1)
где
М – количество клеток в 1 мл;
а – среднее число колоний при высеве данного разведения;
10 – коэффициент разведения;
n – порядковый номер разведения, из которого сделан высев;
V – объем суспензии, взятый для посева, мл.
2.3.10 Выявление кислотоустойчивости у бактерий
Кислотоустойчивость – свойство, характерное для микобактерий, нокардий
и некоторых актиномицетов. Оно связано с особенностями химического состава
клеточных стенок, главным образом, с наличием в них сложных липидов и
миколовых кислот. Это свойство заключается в сохранении окраски клетками
этих бактерий при обработке их кислотой. Наибольшее распространение получил
способ выявления кислотоустойчивости по Цилю-Нильсену.
45
На фиксированный в пламене спиртовки мазок, приготовленный обычным
способом, поместить полоску фильтровальной бумаги, обильно смочить бумагу
карболовым фуксином Циля и нагреть препарат над пламенем 5 минут. Не
допускать высыхания препарата, при необходимости в него добавить 1-2 капли
воды. Не доводить также краситель до кипения. Как только появятся пары,
препарат отвести в сторону.
По окончании окрашивания и охлаждения препарата бумагу удалить, а
мазок промыть слабой струей водопроводной воды до исчезновения краски в
стоке. Затем препарат промокнуть фильтровальной бумагой и погрузить на 3-5
секунд в 5 %-й раствор серной кислоты. Снова промыть водой, промокнуть
бумагой и окрасить в течение 3-5 минут метиленовым синим Леффлера. Препарат
тщательно промыть водой, высушить и исследовать с иммерсионной системой.
Кислотоустойчивые
бактерии
окрашиваются
в
красный
цвет,
а
некислотоустойчивые – в синий [25].
2.3.11 Получение биомассы клеток культуры
Соблюдая правила асептики, в чашку Петри с культурой вносят 1-2 мл
физиологического раствора с концентрацией хлорида натрия 0,9 %.
Чашку Петри закрывают и, слегка взбалтывая, получают смыв культуры.
Полученную суспензию необходимо проинкубировать 20-40 минут в термостате
при оптимальной температуре, чтобы клетки хорошо разошлись. Полученный
смыв можно использовать для многих бактериологических процедур [12, 13, 46].
2.3.12 Разрушение клеточной стенки бактерий
Густую суспензию клеток (клетки составляют около 30 % объема
суспензии) в физическом растворе, содержащем хлорид натрия с концентрацией
0,9 %, помещают в колбу и замораживают в виде тонкого слоя. Затем суспензию
размораживают, погружая колбу в теплую воду. Далее процедуру повторяют 6
раз. Неразрушившиеся клетки удаляют центрифугированием в течение 5 минут
при 5000 об/мин. Если осадка много, его вновь суспендируют в указанном выше
46
физическом
растворе
и
повторяют
цикл
замораживания-оттаивания
с
последующим разведением. [6, 13].
2.3.13 Определение общего азота с реактивом Несслера
Принцип метода основан на свойстве реактива Несслера давать цветную
реакцию
с
ионами
азотсодержащих
аммония
(NH4)+,
органических
образующимися
веществ.
Реактивы:
после
озоления
серная
кислота
концентрированная, водорода перекись (ГОСТ 10929-76), реактив Несслера,
раствор аммония серно-кислого, содержащий 0,05 мг/мл азота.
Приготовление стандартного раствора серно-кислого аммония (0,1 мг/мл
азота). Берут точную навеску сульфат аммония – 0,2357 г и растворяют в мерной
колбе (МУК 4.2.2316-08 Методы контроля бактериологических питательных сред
500 мл) в дистиллированной воде, доводя объем раствора до метки. Стандартный
раствор хранят в течение 1 года при температуре 4-8 °С в колбе с притертой
пробкой. Перед определением стандартный раствор разводят водой в 2 раза.
Построение
калибровочной
кривой.
В
пробирки
вносят по
0,1-0,2-0,3-0,4-0,5 мл раствора аммония сернокислого. Объем каждой пробы
доводят водой до 9,5 мл, перемешивают, затем прибавляют по 0,5 мл реактива
Несслера.
Пробы
вновь
фотоэлектроколориметре
перемешивают,
(МУК
а
затем
4.2.2316-08
колориметрируют
Методы
на
контроля
бактериологических питательных) в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Раствором
сравнения служит контрольная проба, содержащая 0,5 мл реактива Несслера в
9,5 мл воды. По показаниям прибора строят кривую зависимости оптической
плотности от концентрации азота. Калибровочный график воспроизводят при
каждом определении.
Озоление проводилось таким образом: берут 5 мл анализируемой жидкости,
приливают 5 мл концентрированной H2SO4 и 5 мл перекиси. Затем кипятят на
плитке до обесцвечивания раствора. Озолят переносят в мерную колбу на 100 мл
и доводят до метки дистилированной водой [16].
47
На колориметрирование отбирают по 0,5 мл раствора озолята, добавляют
9 мл дистиллированной воды, перемешивают, а затем по 0,5 мл реактива
Несслера. Пробы перемешивают и колориметрируют на фотоэлектроколориметре
(МУК 4.2.2316-08 Методы контроля бактериологических питательных сред) в
кюветах с толщиной слоя 10 мм при длине волны λ=400 нм. Раствором сравнения
служит раствор, приготовленный аналогично образцу [26].
2.3.14 Вискозиметрический метод определения целлюлолитической
активности
Целлюлолитическая активность фермента определяется по его способности
снижать вязкость раствора натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы. Анализ
проводят с использованием вискозиметра Оствальда при температуре 28 °С.
Метод основан на регистрации скорости уменьшения вязкости 0,3 %-ного
раствора Na-КМЦ после действия целлюлозы. Для приготовления субстрата
используют Na-КМЦ со степенью замещения 65,3 и степенью полимеризации 347.
За единицу ферментативной активности принимают такое количество фермента,
которое приводит в принятых условиях опыта к увеличению величины, обратной
относительной вязкости и равной 1 мин-1. Величина, обратная относительной
вязкости, вычисляется по формуле 2 [37, 39]:
(2)
где
tв, − продолжительность истечения воды, с;
tс − продолжительность истечения реакционной смеси, с.
Скорость возрастания этой величины является линейной функцией
концентрации фермента.
48
Целлюлолитическая активность фермента рассчитывают по увеличению
величины, которая является обратной по отношению к относительной вязкости
1/η реакционной смеси, по формуле 3.
Исследование проводят следующим образом. Вискозиметр Оствальда
помещают в водяную баню с температурой 28 °С. Перед определением
активности
фермента
устанавливают
длительность
истечения
6
мл
дистиллированной воды. Затем в вискозиметр вносят 5 мл 0,3 %-ного раствора
Na-КМЦ в ацетатном буфере, перемешивают продуванием и добавляют 1 мл
испытуемого ферментного раствора, включая сразу же секундомер [27].
(3)
где
ЦАк – целлюлолитическая активность фермента, ед/г;
b – величина, обратная относительной вязкости (1/η);
1000 – пересчет миллиграммов в граммы;
а – количество ферментного препарата в реакционной смеси, мг;
t – длительность действия фермента на субстрат, мин.
Реакционную смесь перемешивают продуванием и через 2 мин с момента
включения секундомера измеряют продолжительность ее истечения. Опыт
повторяют, добиваясь сходимых данных [24, 33, 37-39].
2.3.15 Антроновый метод определения активности целлюлаз
Метод основан на определении скорости ферментативной реакции по
количеству образовавшихся спирторастворимых углеводов, содержание которых
находят, используя колориметрический способ с применением антронового
реактива.
49
Данный метод позволяет определить целлюлолитическую активность
фермента в культурах плесневых грибов, культуральных жидкостях и очищенных
ферментных препаратах [27, 33].
Для анализа на технических весах берут навеску 1,0 г ферментного
препарата (или 100 мл исследуемой смеси), растирают в ступке и переносят в
колбу на 100 мл, добавляют дистиллированную воду до метки, перемешивают и
выдерживают 1 час при комнатной температуре, периодически перемешивая
раствор. Затем его фильтруют и используют фильтрат для анализов.
Количество
спирторастворимых
углеводов
рассчитывают
по
формуле 4:
(4)
где
С – содержание спирторастворимых углеводов мг/100 мл;
15,62 и 26,03 – постоянные коэффициенты, полученные экспериментально;
D1 – оптическая плотность, полученная при длине волны 597 нм;
D2 – оптическая плотность, полученная при длине волны 440 нм;
n – коэффициент разведения.
Для
проведения
ферментативной
реакции
в
пробирку
помещают
0,5 г субстрата, приливают 10 мл раствора ферментного препарата и 5 мл
ацетатного буферного раствора. Реакционную смесь перемешивают круговыми
вращениями и инкубируют 1 ч в термостате при 50 °С. Аналогично готовят
контрольную пробу, использую предварительно инактивированный раствор
ферментного препарата, который получают путем выдерживания его в кипящей
водяной бане в течение 10 мин. Далее в две мерные колбы на 50 мл вносят по 2 мл
реакционной смеси опытной и контрольной проб, доливают до метки
ректификованным спиртом и перемешивают.
Целлюлолитическую
активность
рассчитывают
спирторастворимых углеводов, исходя из формулы 5:
по
количеству
50
(5)
где
ЦАк – целлюлолитическая активность, ед./г;
0,885,
0,0348,
–
постоянные
коэффициенты,
полученные
экспериментальным путем;
С – количество спирторастворимых углеводов, мг/100 мл;
а
–
количество
ферментного
препарата
или
исследуемой
суспензии, взятого для анализа, мг;
1000 – перевод действия фермента на 1 г.
После 5-минутного выдерживания при комнатной температуре растворы
фильтруют и в фильтре определяют содержание спирторастворимых углеводов.
Для этого в термоустойчивые пробирки с притертыми пробками вливают по
5 мл антронового реактива и осторожно по стенке приливают в одну из пробирок
2,5 мл полученного фильтрата гидролизата, а в другую – 2,5 мл полученного
фильтрата контрольного раствора.
При этом нельзя допускать смешивания обеих жидкостей. Нужно, чтобы
образовалось два слоя. Содержимое пробирок энергично встряхивают в течение
10 с и помещают в бурно кипящую водяную баню на 6 мин. затем пробирки
вынимают, содержимое охлаждают и полученные окрашенные растворы
колориметрируют в кювете с шириной грани 5 мм при двух светофильтрах с
длинами волн 597 и 440 нм [24, 26, 27].
2.3.16 Концентрирование ферментов Bacillus acidocaldarius
Для осаждения целлюлаз из исследуемой смеси необходимо добавить три
объема этилового спирта на объем культуральной жидкости. При этом исходный
рН среды должен составлять 7,6-7,8, при 20 °С. Осадок отделяют через 20-30
минут после добавления осадителя. Отделяют осадок центрифугированием при
3000-4000 об/мин в течение 10-15 мин. [43, 44, 45].
51
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ АНАЛИЗ
Согласно поставленной цели и выделенным задачам, исследования,
описанные в данной главе, как уже отмечалось ранее, посвящены достаточно
актуальной
на
сегодняшний
день
проблеме:
получению
очищенных
конкурентоспособных ферментов целлюлолитического действия с целью их
дальнейшего использования в промышленных масштабах.
Выбранная тема актуальна еще и с позиции того, что согласно политики
здорового питания Правительства РФ основным направлением в пищевой
промышленности является расширение продуктов для здорового питания. В этой
группе высокий процент составляют изделия из зерновых культур, которые
содержат
большое
количество
труднорастворимых
некрахмальных
полисахаридов. Поэтому выделенный и очищенный фермент будет рекомендован
для решения проблемы биомодификации и повышения усвоения данных
компонентов.
На первом этапе в решении поставленных задач планировалось стадия
культивирования микроорганизмов.
3.1 Культивирование бактерий
Главным объектом исследования в работе выступала чистая культура
бактерий Bacillus acidocaldarius штамма B-5250 (г. Москва, ВКПМ), способная
продуцировать целлюлолитические ферменты.
Однако, при проведении любого эксперимента требуется образец сравнения
и поскольку из-за сложностей, связанных с получением грибных продуцентов
целлюлаз, исходя из возможностей лаборатории, нами была выбрана и выделена
культура бактерий из того же рода.
Выбор был остановлен на культуре Bacillus subtilis, т.к. данный вид
бактерий рода Bacillus широко распространен в природе, доступен и не имеет
ограничений при работе с ним.
52
3.1.1 Оживление чистой культуры Bacillus acidocaldarius
Изучаемые в работе бактерии Bac. acid. были лиофильно высушены.
Культуру хранили при температуре 4-5 °С в запаянной с двух сторон пробирке.
Для дальнейшего их использование, согласно паспорту (Приложение 2),
требовалось осуществить оживление культуры по методу, изложенному в п 2.3.2.
Оживление бактерий Bacillus acidocaldarius проводили в чашках Петри в
термостате, содержащих по 50 см3 питательной среды (L-среды), приготовление
которой осуществляли следующим образом. В начале требовалось приготовление
одного из компонентов питательной среды, − дрожжевого экстракта. Для этого
100
г
прессованных
хлебопекарных
дрожжей
смешивали
со
100
мл
дистиллированной воды и выдерживали на водяной бане с обратным
холодильником в течение 60 минут. После этого, смесь охлаждали и
центрифугировали в течение 5 минут при 3000 об/мин. Затем на технических
весах отобрали следующие навески: 15 г агара, 15 г пептона, 5 г хлорида натрия, 5
г дрожжевого экстракта и размешивали в 1 л дистиллированной воды. Данную
смесь кипятили до полного расплавления агара, фильтровали через ватномарлевый фильтр, разливали в предварительно стерильные конические колбы на
250 см3 и стерилизовали автоклавированием в течение 30 минут при 1 атм.
Полученную среду охлаждали до 30 °С и помещали в стерильные чашки Петри.
После застывания среды произвели посев прокаленной бактериологической
петлей. Оживление культуры осуществляли в течение 48 ч в условиях термостата
ТС-1/80 СПУ при температуре 35 °С. Через 2-е суток наблюдался наибольший
пик роста культуры, представленный на рисунке 4.
Следующим этапом было получение изолированных колоний бактерий. Для
этого прокаленной петлей брали материал из биомассы бактерий, переносили его
в пробирку со стерильной водопроводной водой и тщательно перемешивали. Из
полученной суспензии провели рассев петлей на поверхности МПА в чашке
Петри, которые затем поместили на 48 ч в термостат ТС-1/80 СПУ при
температуре 30 °С.
53
Рисунок 4 – Оживление Bacillus acidocaldarius на L-среде
Рисунок 5 – Изолированные колонии Bacillus acidocaldarius
На рисунке 5 представлены полученные изолированные колонии бактерий.
На основании данного рисунка были изучены культуральные особенности
Bac. acid. B-5250: форма колоний округлая, размер колоний, в среднем, достигает
5 мм, поверхность морщинистая, профиль плоский; колонии матовые, бесцветные
с ровными краями, структура однородная с мягкой консистенцией.
54
Дальнейший этап заключался в изучении морфологии клеток культуры с
помощью микроскопирования. Бактерии Bac. acid. были окрашены по Граму и
детально изучены под микроскопом при увеличении х1000 (рисунок 6). Для
большей визуализации бактериальных клеток была использована система,
состоящая из микроскопа Микромед МС-2-ZOOM при увеличении х100 и
цифровой камеры «TOUPCAM UCMOS051000KPA» (рисунок 7).
Рисунок 6 – Чистая культура Bacillus acidocaldarius
при увеличении х1000
Из рисунков 6 и 7 видно, что бактерии являются грамположительными, т.к.
окрасились под действием красителя фуксина в фиолетово-пурпурный цвет;
имеют форму палочек к закругленными концами, располагаются одиночно,
парами и короткими цепочками. Поперечный размер вегетативных клеток
достигает 0,7-0,9 мкм, длина 3,0-4,0 мкм. Данная характеристика полностью
подходит под описание исследуемого штамма, следовательно, оживление чистой
культуры было проведено успешно.
55
Рисунок 7 – Фотография чистой культуры
Bacillus acidocaldarius B-5250, полученная при помощи
микроскопа Микромед МС-2-ZOOM при увеличении х100
и цифровой камеры «TOUPCAM UCMOS051000KPA»
3.1.2 Получение чистой культуры Bacillus subtilis
Получение чистой культуры было проведено в три этапа, согласно
методике, изложенной в п. 2.3.3. Первый этап заключался в получении
накопительной культуры Bacillus subtilis (рисунок 8).
О получении накопительной культуры свидетельствует ряд факторов,
которые можно выявить визуально: помутнение среды, выделение газа,
поверхностная
пленка.
Исходя
из
этого,
мы
убедились
в
получении
накопительной культуры в пробирке № 1. Данная пробирка была отобрана для
дальнейших исследований.
56
Рисунок 8 – Накопительная культура Bacillus subtilis
Дальнейший
этап
заключался
в
микроскопическом
исследовании
полученных накопительных культур в препаратах «раздавленная капля»
(рисунок 9) и изучении морфологических признаков культуры.
Рисунок 9 – Накопительная культура Bacillus subtilis
при увеличении х1000
57
Полученная в ходе пересева чистая культура Bac. sub. изображена на рисунке
10. Как видно из рисунка, клетки имеют форму палочек с закругленными
концами, располагаются одиночно, парами и короткими цепочками, что
свидетельствует о чистоте выделенной культуры. Данные микроорганизмы также
являются грамположительными, т.к. клетки бактерий окрасились под действием
красителя (фуксина), приобретя фиолетово-пурпурный цвет.
Рисунок 10 – Чистая культура Bacillus subtilis
при увеличении x1000
Все это свидетельствует о том, что была получена чистая культура Bac. sub.,
которая может быть использована для дальнейших исследований.
3.2 Изучение культуральных характеристик исследуемых культур
В
ходе
работы
были
изучены
следующие
культуральные
и
морфологические особенности бактерий: влияние начальной кислотности среды
на рост бактерий, подсчет количества клеток в 1 мл суспензии, способность к
кислотоустойчивости.
58
3.2.1 Изучение влияния начальной кислотности среды на рост бактерий
Существенное значение для роста микроорганизмов имеет оптимальная
величина pН среды. С этой целью было проведено исследование культур по
способности роста при pH 4,0; 6,0; 8,0.
Визуально было выявлено, что при различных значениях pH у бактерий
Bacillus subtilis наблюдается определенная интенсивность роста: при pH=4 роста
не наблюдалось, при pH=6 отмечался средний рост и при pH=8 максимальный
рост. Следовательно, можно сделать вывод о том, что данный вид бактерий
хорошо растет в нейтральных и щелочных средах. Что касается штамма бактерий
Bacillus acidocaldarius В-5250, то у них наблюдается одинаково интенсивный рост
в пределах всего изучаемого интервала, что говорит о высокой устойчивости
бактерий данного штамма к кислотным и щелочным средам.
Проведенные исследования позволяют сделать вывод о том, что для
проведения дальнейших исследований целесообразно поддерживать значение pH
в питательной среде, равное 6,0-6,5, поскольку это будет способствовать
наибольшему росту микроорганизмов и, как следствие, максимилизации процесса
биосинтеза фермента.
3.2.2 Определение количества клеток высевом на плотную питательную
среду (чашечный метод Коха)
Для
эффективного
количественного
подсчета
бактерий
в
работе
использован чашечный метод Коха, который позволяет с высокой точностью
определить количественное значение группы микроорганизмов.
Согласно методике, изложенной в п. 2.3.9, был произведен высев по
0,1 мл суспензии бактерий с учетом десятикратных разведений на плотные среды
в чашки Петри. После инкубации в течение 3-х суток в термостате было
подсчитано число колоний. Было определено, что при степени разведении
исходной суспензии в 10-6 количество колоний составляло 62 шт. (рисунок 11).
59
Следовательно, исходя из формулы (1), количество клеток в 1 мл
исследуемой суспензии бактерий:
Рисунок 11 – Подсчет клеток бактерий Bacillus acidocaldarius методом Коха
(при разведении 10-6)
Аналогично
вышеописанной
методике
подсчета
клеток
бактерий
Bac. acid. данное исследование также было произведено и с клетками
Bac. sub. Количество клеток в 1 мл суспензии бактерий составило:
Полученные данные свидетельствуют о том, что количество клеток из
чистой культуры Bac. acid. превосходит число клеток Bac. sub. почти в 9 раз.
Исходя из этого, находит свое подтверждением возможность применения в
60
необходимом количестве исследуемого в работе штамма Bac. acid. B-5250 в
промышленных масштабах.
3.2.3 Выявление кислотоустойчивости бактерий
Окраску бактерий для выявления кислотоустойчивости проводили по
методу Циль-Нельсона, изложенной в п. 2.3.10. Как видно из рисунка 12,
бактерии Bacillus acidocaldarius окрасились в розовый цвет, что говорит о
кислотоустойчивости данного штамма. Данный факт говорит о наличии в их
клетках липидов, воска и оксикислот.
Рисунок 12 – Выявление кислотоустойчивости у бактерий
Bacillus acidocaldarius при увеличении х1000
Аналогично, данное исследование было проведено и с культурой бактерий
Bac. sub. Опыт показал, что бактерии данного вида некислотоустойчивые, т.к.
клетки окрасились в синий цвет.
Следовательно, можно сделать вывод, что предлагаемый штамм бактерий
Bac.
acid.
B-5250
благодаря
своей
выраженной
резистентности
к
5-10 % серной или соляной кислотам, щелочам и спирту, в отличие от
выделенных бактерий Bac. sub., может быть рекомендован к применению при
61
биосинтезе ферментов, т.к. одна из стадий при их производстве, осаждение,
подразумевают воздействие кислот, щелочей, спирта.
3.2.4 Характеристика исходного штамма и штамма-сравнения
В соответствии с выше представленными данными, описывающими
морфологические
сравнительная
и
культуральные
характеристика
признаки,
исходного
была
штамма
составлена
бактерий
общая
(Bacillus
acidocaldarius B-5250), используемого в работе непосредственно и штамма,
используемого в качестве образца сравнения (Bacillus subtilis).
Анализ данных показал, что используемые в работе бактерии имеют
сходные
фенотипы
при
росте
на
питательных
средах,
являются
грамположительными, спорообразующими палочками с закругленными концами,
располагающимися одиночно, парами и короткими цепочками. Сравнительная
характеристика представлена в таблице 7.
Таблица 7 – Сравнительная характеристика исследуемых бактерий
Признаки
Морфология клеток
Исследуемые культуры
Bacillus acidocaldarius
Bacillus subtilis
Грампположительные
Грампположительные
аэробные спорообразующие аэробные спорообразующие
палочки
со
средним палочки
со
средним
размером 3,5х0,85 мкм; размером
1,9х0,5
мкм;
распологаются
одиночно, распологаются
одиночно,
парами
и
короткими парами
и
короткими
цепочками
цепочками
Опт. температура роста, °C
Количество клеток в 1 мл
Влияние pH среды на
интенсивность роста
микроорганизмов
Кислотоустойчивость
4,0
6,0
8,0
35-37
6,2·108
++
+++
+++
4,0
6,0
8,0
28-30
0,9·108
−
++
+++
Примечание:
«−» − роста не наблюдается; «+» − незначительный рост;
«++» − средний рост; «+++» − интенсивный рост
Кислотоустойчив
Не кислотоустойчив
62
Исходя из полученных данных о культурах бактерий, представленных в
таблице
7,
необходимо
отметить,
что
предлагаемый
нами
штамм
Bac. acid. B-5250 превосходит штамм-сравнения по концентрации клеток в
1 мл почти в 9 раз, способен расти при начальной кислотности pH среды, равной
4,0. Также данный штамм является ацидоустойчивым при воздействии кислот,
щелочей и спирта, способен расти в высокотемпературных условиях, вплоть до
45 °С при оптимуме 35-37 °С.
Таким образом, вышеописанные в главе 3 исследования были направлены
на исследования морфологических и культуральных особенностей изучаемых
бактерий, способных продуцировать ферменты целлюлолитического действия.
Каждый микроорганизм в процессе своей жизнедеятельности способен
синтезировать
ряд
ферментов
разной
направленности.
Следующий
этап
заключался в подборе питательных сред и получении (выделении) целлюлаз. Для
получения
эндо-
и
экзоферментов
целлюлолитического
действия
культивирование проводилось как поверхностным, так и глубинным способами
соответственно.
3.3 Получение ферментов целлюлолитического действия при поверхностном
способе культивирования бактерий Bacillus acidocaldarius B-5250
3.3.1 Подбор среды для культивирования
При поверхностном культивировании
использовали
видоизмененную
L-среду,
Bacillus acidocaldarius B-5250
содержащую
в
составе,
взамен
дрожжевому экстракту, натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы (среда №1) и
хлопковую вату (среда №2) в качестве источника углерода.
В связи с этим, питательная среда №1 имела следующий состав (г/л): NaКМЦ – 5,0, пептон −15,0, NaCl – 5,0, агар – 15,0, вода дистиллированная – 1,0 л.
Среда №2 имела следующий состав: хлопковая вата – 5,0, пептон −15,0,
NaCl – 5,0, агар – 15,0, вода дистиллированная – 1,0 л.
63
Среды стерилизовали в течение 30 минут при 1 атм., охлаждали до 30 °C и
засевали бактериями.
Рост культуры на данной питательной среде изображен на рисунке 11.
Рисунок 11 – Рост Bacillus acidocaldarius на средах, содержащих
Na-КМЦ (а) и хлопковую вату (б) в качестве источника углерода
Анализируя рисунки 2 и 11, важно отметить то, что при культивировании
бактерий на L-среде наблюдалось значительное накопление биомассы.
Напротив, в средах, содержащей Na-КМЦ и хлопковую вату в качестве
источников углерода можно заметить, что накопление биомассы происходило не
так активно. Это можно объяснить тем, что во втором случае активность бактерий
расходовалась, в основном, не на накопление биомассы, а на биосинтез целлюлаз.
3.3.2 Получение биомассы клеток и разрушение их клеточной стенки
Для получения целлюлаз было необходимо приготовить бактериальную
суспензию. Бактериальную суспензию или биомассу клеток получали способом
смыва культуры с поверхности плотной агаризованной среды.
Комплекс ферментов в среде малоактивен, поэтому для его обогащения
проводили экстракцию ферментов из поверхностной культуры водой с
64
последующим разрушением клеточной стенки сушкой и дальнейшим осаждением
ферментов из экстракта органическими растворителями.
В соответствии с требованиями методики исследования (п. 2.3.11), была
получена биомасса клеток культур Bacillus acidocaldarius (рисунок 12).
Рисунок 12 – Отделение биомассы клеток культур бактерий
Bacillus acidocaldarius B-5250 с агаризованной питательной среды
Для выделения ферментов, находящихся внутри клеток продуцента,
вводится стадия разрушения клеточных оболочек (дезинтеграция биомассы). Для
этого применяются механические, химические или комбинированные методы:
ультразвук,
измельчение,
использование
растворителей,
попеременное
детергентов,
замораживание-оттаивание,
антибиотиков,
ферментов,
ионогенных ПАВ.
В данной работе самым оптимальным способом разрушения клеточной
стенки
явился
метод
повторного
замораживания-оттаивания
биомассы,
описанный в п. 2.3.12 (рисунок 13).
В ходе 6-ти кратного попеременного замораживания и оттаивания
образующиеся кристаллы льда разрушили оболочки клеток и целлюлолитические
ферменты, находившиеся внутри клеток, высвободились наружу.
65
Данная суспензия была использована далее в работе для определения в ней
целлюлолитической активности ферментов.
Рисунок 13 – Разрушение клеточной стенки бактерий
Bacillus acidocaldarius B-5250 для извлечения ферментов из клетки:
а – замороженные клетки; б – размороженные клетки
3.4 Получение ферментов целлюлолитического действия при глубинном
способе культивирования бактерий Bacillus acidocaldarius B-5250
3.4.1 Подбор питательных сред
Глубинное культивирование проводили в биореакторе (рисунок 14) на
жидких питательных средах. Из литературных источников было выделено две
питательные среды. Их состав был видоизменен в соответствии с поставленными
задачами.
Для биосинтеза целлюлаз были использованы два субстрата – натриевая
соль карбоксиметилцеллюлозы (среда №1) и хлопковая вата (среда №2).
Культивирование в биореакторе длилось 72 часа при температуре 35 °C в
условиях постоянной аэрации среды с поддержанием постоянного значения
66
pH=6,0-6,5.
Каждые
24
часа
проводился
отбор
проб
для
дальнейших
исследований.
Рисунок 14 – Глубинное культивирование Bacillus acidocaldarius
3.4.2 Микроскопирование препаратов при глубинном культивировании
Bacillus acidocaldarius
Известно, что при соблюдении условий культивирования микроорганизмы
способны к быстрому росту. Рост микроорганизмов измеряется увеличением
популяции, увеличением числа клеток или увеличением общей массы.
Рост бактерий характеризуется четырьмя фазами: фазой замедленного
роста, фазой интенсивного роста, стационарной фазой и фазой отмирания.
Количество клеток, длина каждой фазы, скорость роста или гибели, общее
количество времени жизни клеток), варьируются в зависимости от организма или
даже от разных условий культивирования для одного и того же организма.
67
Фаза замедленного роста. Эта фаза является периодом адаптации, когда
бактерии приспосабливаются к новым условиям. Длина этой фазы может
значительно варьироваться в зависимости от того, насколько отличаются условия
от условий, из которых поступают бактерии, а также состояния самих
бактериальных клеток. Активно растущие клетки, переносимые из одного типа
сред в один и тот же тип среды с одинаковыми условиями окружающей среды,
будут иметь самый короткий период адаптации. Поврежденные клетки будут
иметь длительный период адаптации, так как они должны восстановить свою
активность, прежде чем приступить к делению клеток.
Обычно клетки в период замедленного роста синтезируют РНК, ферменты и
основные метаболиты, которые могут отсутствовать в их новой среде (например,
факторы роста или макромолекулы), а также корректировать изменения
окружающей среды, такие как изменения температуры, рН или доступности
кислорода.
Они
также
могут
провести
любой
необходимый
«ремонт»
поврежденных клеток.
Экспоненциальная фаза или фаза ускоренного роста. Когда клетки
накапливают все, что им нужно для роста, они переходят в стадию деления.
Экспоненциальная или логарифмическая фаза роста характеризуется удвоением
популяции. Условия, оптимальные для клеток, приведут к очень быстрому росту
(будет наблюдаться крутой уклон на кривые роста). Клетки в экспоненциальной
фазе роста являются самыми здоровыми и наиболее однородными, что объясняет,
почему в большинстве экспериментов используются клетки из этой фазы.
Стационарная фаза. В определенный момент бактериальная популяция
переходит в стационарную фазу. На этом этапе количество новых клеток
соответствует числу отмирающих клеток. Таким образом рост полностью
прекращается, что приводит к сглаживанию роста на кривой роста.
Фаза отмираниия. На последней фазе кривой роста, фазе спада или
отмирания, число жизнеспособных клеток уменьшается. Клетки теряют свою
жизнеспособность. Считается, что условия культивирования ухудшились до такой
68
степени, что клетки подвергаются непоправимому ущербу, так как клетки,
собранные с этой фазы, не могут показать рост при переносе на свежую среду.
В процессе культивирования каждые 24 часа проводился отбор проб
культуральной
жидкости.
По
истечению
первых
24-х
часов
при
микроскопировании пробы со среды №1 наблюдалось наличие палочек с
закругленными концами. Расположены они были одиночно, попарно и короткими
цепочками. Культура находилась в логарифмической фазе роста. На среде №2
наблюдался аналогичный рост бактерий (рисунок 15).
Через 48 ч после культивирования при микроскопировании наблюдалось
значительное увеличение биомассы клеток. На среде №1 и среде №2 наблюдалась
схожая морфология и количество клеток (рисунок 16).
Рисунок 15 – Бактерии Bac. acid. штамма B-5250
при увеличении х1000 через 24 часа после культивирования
на среде №1 (а) и среде №2 (б)
После
72
ч
после
культивирования
также
было
проведено
микроскопирование. На рисунке 17 видно, что клетки становятся совершенно
разными, так как они пытаются адаптироваться к новым условиям, связанными,
69
главным образом, с нехваткой питательных веществ. Новые синтезированные
клетки
имеют
меньший
размер,
при
этом
бациллы
становятся
почти
сферическими по форме. Их плазматическая мембрана становится менее жидкой
и проницаемой, с более гидрофобными молекулами на поверхности, которые
способствуют адгезии и агрегации клеток.
Рисунок 16 – Бактерии Bac. acid. штамма B-5250
при увеличении х1000 через 48 часов после культивирования
на среде №1 (а) и среде №2 (б)
Рисунок 17 – Бактерии Bac. acid. штамма B-5250
при увеличении х1000 через 72 часов после культивирования
на среде №1 (а) и среде №2 (б)
70
Исходя из вышеописанного, клетки находятся в стационарной фазе роста.
Во время стационарной фазы клетки склонны к образованию вторичных
метаболитов, в частности, ферментов. Клетки, которые способны создавать
споры, активируют необходимые гены на этом этапе, чтобы инициировать
процесс спорообразования.
Таким образом, было установлено, что активное деление клеток культуры
происходило через 72 часа после начала культивирования как на среде №1, так и
на среде №2. Данная стадия роста бактерий является стационарной. По
литературным данным, именно во время стационарной фазы активизируется
процесс биосинтеза вторичных метаболитов, в частности, ферментов. Исходя из
этого, отбор культуральной жидкости для определения целлюлолитической
активности и выделения целлюлаз необходимо проводить после 72 ч.
Анализируя вышесказанное, при глубинном культивировании бактерий
Bac. acid. штамма B-5250 отбор проб для определения целлюлолитической
активности можно рекомендовать проводить после 72 ч культивирования
используя питательные среды №1 и №2.
3.5 Определение концентрации общего азота в культуральных жидкостях
При глубинном культивировании Bacillis acidocaldarius штамма B-5250
проводился отбор проб, направленный на определение концентрации общего
азота с помощью реактива Несслера.
Предварительно был построен градуировочный график с использованием
стандартного раствора глюкозы (рисунок 18).
Путем получения растворов глюкозы различных концентраций и измерения
полученных разведений на ФЭКе при длине волны λ=490 нм. Данные для
построения калибровочной кривой представлены в таблице 8.
Таблица 8 – Данные для построения калибровочного графика
m (N), мкг
А стандарт. р-ра
10
0,078
20
0,178
30
0,290
40
0,378
50
0,478
71
Далее был проведен анализ двух культуральных жидкостей через 24 ч, 48 ч
и 72 ч после посева бактерий. Экспериментально полученные данные
представлены в таблице 9.
Рисунок 18 – График зависимости оптической плотности
от содержания азота в стандартном растворе глюкозы
Таблица 9 – Экспериментальные данные оптической плотности культуральных
жидкостей
Объект
исследования
Среда №1
Среда №2
контроль
0,056
0,038
Оптическая плотность, А
24 ч
48 ч
0,167
0,345
0,095
0,216
72 ч
0,895
0,645
Содержание азота в исследуемых жидкостях рассчитывается по формуле 5:
(6)
где
х – содержание азота в культуральной жидкости, мкг;
y – оптическая плотность культуральной жидкости.
72
Содержание азота в исследуемых растворах через 24 часа:
Содержание азота в исследуемых растворах через 48 часов:
Содержание азота в исследуемых растворах через 72 часа:
73
Концентрация азота (СN, мг/мл) рассчитывается по формуле 4:
(7)
где
m(N) – масса азота, рассчитанная по графику, мкг;
V1 – общий объем озолята, мл;
V2 – объем озолята, взятый для окрашивания, мл;
1000 – коэффициент пересчета;
V3 – объем культуральной жидксти, мл.
Концентрация азота в исследуемых растворах через 24 часа:
Концентрация азота в исследуемых растворах через 48 часов:
Концентрация азота в исследуемых растворах через 72 часа:
74
Таким образом, была рассчитана концентрация азота в культуральных
жидкостях. Данные представлены в таблице 10.
Таблица 10 – Концентрация общего азота в культуральных жидкостях
Объект
исследования
Среда №1
Среда №2
Исходя
культуральных
Концентрация общего азота, мг/мл
48 ч
1,568
1,024
24 ч
0,861
0,515
из полученных
жидкостях
данных
при
о
концентрации
культивировании
72 ч
3,884
2,821
общего
Bacillus
азота
в
acidocaldarius
штамма B-5250, можно сделать вывод, что в пробе культуральной жидкости с
питательной среды №1 концентрация общего азота приблизительно в 1,5 раза
больше, чем со среды №2. Также, после 72 ч культивирования наблюдается
интенсивный
рост
в
содержании
общего
азота.
Ввиду
этого,
можно
предположить, что после 72 ч культура бактерий приступила к активному синтезу
ферментов.
3.6 Определение целлюлолитической активности
Для характеристики действия эндо- и экзоферментов целлюлолитического
комплекса предлагается ряд методов определения их активности, отличающихся
друг
от
друга,
в
основном,
условиями
проведения
ферментативной
реакции [20, 29, 33]. Эти методы основаны на разных принципах и
предусматривают применение разных субстратов.
В данной работе были использованы два универсальных метода:
вискозиметрический метод и антроновый метод.
3.6.1 Вискозиметрический метод
Для анализа была взята суспензия бактерий с разрушенной клеточной
стенкой, содержащая ферменты целлюлолитического действия. В результате
замеров получено, что активность комплекса ферментов Bacillus acidocaldarius
75
штамма B-5250 на среде №1 в пересчете на Na-КМЦ составила 20,5 ед/г, а
ферментов культуральной жидкости составила 75,3 ед/г. Также была измерена
целлюлолитическая активность ферментов на средах №№2 в перечете на
хлопковую вату – 15,2 ед/г и 63,4 ед/г соответственно (рисунок 19).
Рисунок 19 – Сравнительный анализ целлюлазной активности при ПК и ГК
бактерий Bacillus acidocaldariu с использованием вискозиметрического метода
3.6.2 Антроновый метод
Для анализа была взята суспензия клеток бактерий, содержащая ферменты
целлюлолитической активности, в количестве 100 мл и субстрат – хлопковое
волокно в количестве 0,5 г. Также была взята культуральная жидкость бактерий в
таком же количестве 100 мл и субстрат – хлопковое волокно в количестве 0,5 г.
В результате замеров было получено, что активность целлюлаз в
бактериальной культуре Bacillus acidocaldarius B-5250 в пересчете на хлопковое
76
волокно составила 23,3 ед/г и 19,3 ед/г в средах №1 и №2 соответственно. А
целлюлолитическая активность ферментов в культуральной жидкости на средах
№1 и №2 – 70,1 ед/г и 63,3 ед/г соответственно (рисунок 20).
Рисунок 20 – Сравнительный анализ целлюлазной активности ферментов при ПК
и ГК бактерий Bacillus acidocaldariu с использованием антронового метода
На основании двух методов определения целлюлолитической активности,
коррелирующих между собой, можно сделать вывод, что предлагаемый штамм
бактерий Bac. acid. штамма B-5250 перспективен в получении ферментов
целлюлолитического действия. Важно отметить, что активность ферментов
целлюлолитического действия культуральной жидкости превосходит активность
ферментов биомассы клеток при ПК почти в 4 раза. Ввиду этого целесообразнее
использовать
глубинный
биосинтеза целлюлаз.
способ
культивирования
данных
бактерий
для
77
3.7 Изучение влияние температуры и pH на активность целлюлолитических
ферментов
Биосинтез целлюлаз бактерий, исходя из литературных источников,
наиболее интенсивно протекает в интервале pH 6,0-8,0. Однако у ряда
исследователей встречаются значения pH 4,5-6,5. Значение pH зависит от
субстрата, а также условий культивирования микроорганизмов. Известны также
целлюлазы с оптимумом pH 7,0-9,0.
В данной работе было изучено влияние величины pH на активность
целлюлаз бактерий Bac. acid. штамма B-5250. Для этого были взяты пробы
культуральной
жидкости
бактерий,
обладающие
целлюлолитической
активностью. Результаты представлены на диаграмме (рисунок 21).
Рисунок 21 – Зависимость целлюлолитической активности
бактерий Bacillus acidocaldarius от pH реакционной среды
Известно, что у всех видов микроорганизмов, в частности, способных
разрушать целлюлозосодержащие субстраты, существует свой температурный
оптимум, ниже или выше которого активность ферментов снижается. По
78
литературным источникам, оптимум действия целлюлаз бактерий находится в
пределах
30-60
˚С.
Однако
встречаются
экстремальные
термофилы
с
температурой 90 ˚С. Исследуемый в данной работе штамм бактерий Bacillus
acidocaldarius
способен
синтезировать
ферменты
при
30-60
˚С.
Этот
температурный интервал и был использован в качестве контрольного при
исследовании термостабильности целлюлаз данного штамма.
В
имеющихся
литературных
данных
показано,
что
внеклеточные
гидролитические ферменты бактерий обладают высокой темостабильностью.
Исходя из этого, целлюлолтические ферменты, предположительно, являются
термостабильными. Для определения термостабильности бактерий Bacillus
acidocaldarius было проведено исследование, заключающееся в прогревании
культуральной
жидкости
бактерий,
обладающей
целлюлолитической
активностью, на водяной бане при постоянном контроле температуры. В
отобранных пробах при помощи антронового метода была снова измерена
целлюлолитическая
активность.
Величина целлюлолитической
активности,
полученная при температуре 35 °С была принята за 100 %. Полученные данные
представлены на диаграмме (рисунок 22).
Из рисунка 22 видно, что после прогревания культуральной жидкости в
течение часа при температуре 80 °С происходила частичная инактивация
ферментов (до 50 % от активности). Однако нельзя не отметить, что даже при
достижении 100 ˚С целлюлолитическая активность сохранялась до 10-14 %.
Подводя итог вышесказанному, необходимо отметить, что целлюлазы
бактерий Bacillus acidocaldarius являются термостабильными. Это объясняется
особенностями строения и подвижности белковой молекулы.
Термо- и pH-устойчивые целлюлазы являются очень перспективными
ферментами, поскольку при их использовании сокращается время гидролиза
целлюлозных субстратов, а также снижается риск инфицирования посторонней
микрофлорой. Такие свойства целлюлаз исследуемых бактерий делает их
перспективными для применения в различных отраслях промышленности.
79
Рисунок 22 – Термостабильность целлюлазного комплекса
бактерий Bacillus acidocaldarius (при pH-оптимуме 6,0)
3.8 Разработка условий осаждения комплекса целлюлолитических
ферментов из бактерий Bacillus acidocaldarius
Учитывая
дальнейшую
сферу
применения
ферментного
комплекса
целлюлаз в промышленности, где требуются очищенные ферменты, было
проведен первый этап очистки, заключавшийся в концентрировании ферментного
комплекса.
Известно, что для получения препаратов как внеклеточнных, так и
внутриклеточных целлюлаз после предварительного извлечения фермента из
клетки широко используют осаждение органическими растворителями –
ацетоном, этанолом, изопропанолом до выпадения осадка и последующего его
отделения. Применение растворителей объясняется тем, что они легко удаляются
из препаратов в процессе сушки, имеют сравнительно низкую цену, легко
регенерируются. Исходя из этого, в качестве осадителя был использован
этиловый спирт соотношении 3:1.
80
Важными факторами при спиртовом осаждении являются pH, температура и
продолжительность контакта ферментов с растворителем. Увеличение или
уменьшение
кислотности
среды
ведет
к
снижению
активности
фермента [32]. Поэтому для разработки рационального режима спиртового
осаждения ранее были проведены исследования по влиянию pH в смеси и объема
этилового спирта на полноту осаждения ферментов в исследуемой бактериальной
суспензии.
Была изучена зависимость целлюлолитической активности от pH смеси при
осаждении тремя объемами охлажденного этанола. Повторно была измерена
активность целлюлаз при помощи антронового метода (рисунок 23). Данные
опыта показывают, что даже при незначительном концентрировании фермента его
активность увеличивается почти в 2 раза. Т.е. можно сказать о том, что
предлагаемый способ эффективен.
Рисунок 23 – Влияние концентрирования ферментов на величину активности
81
На основании проведенных исследований в качестве общего вывода можно
сказать, что бактерии рода Bacillus являются перспективными продуцентами
ферментов целлюлолитической направленности действия.
3.9 Отделение препарата целлюлаз от культуральной жидкости
Целью
настоящей
работы
являлось
получение
целлюлолитических
ферментов из бактерий Bacillus acidocaldarius штамма B-5250. Одной из
поставленных задач в данной работе являлось выделение ферментов из
культуральной жидкости.
Ввиду того, что целлюлазы относятся к гидролитическим ферментам, они
являются
водорастворимыми.
В
соответствии
с
этим,
было
проведено
центрифугирование культуральной жидкости с целью отделения супернатанта.
Далее супернатант высушивали с помощью ротационного испарителя в течение
часа при температуре 20 ºС.
Общая схема получение ферментного порошка представлена на схеме
(рисунок 24).
Рисунок 19 – Схема выделение целлюлаз из культуральной жидкости
82
Таким образом, используя технологическую схему, был получен препарат
целлюлаз в виде порошка. Данный ферментный комплекс может быть
использован в пищевой промышленности (размягчение сырья для виноделия,
осветление соков, получение красителей и др.), в текстильной промышленности
(придание мягкости хлопчатобумажным тканям), в сельском хозяйстве (для
повышения усвояемости кормов), производстве детергентов, а также при
производстве биотоплива.
83
ВЫВОДЫ
На основании всего комплекса проведенных исследований можно сделать
следующие выводы:
1.
Детальный анализ литературных источников обосновал выбор
микроорганизмов в качестве перспективных источников получения ферментов,
так как они содержат целый спектр ферментов. Основными продуцентами
ферментов до последнего времени были грибы. Однако сейчас все более широкое
применение находят ферменты, синтезируемые некоторыми бактериями, что
обосновало выбор в работе на бактерии Bacillus acidocaldarius штамма B-5250.
2.
Было
осуществлено
оживление
чистой
культуры
Bacillus
acidocaldarius, а также получена чистая культура штамма-сравнения Bacillus
subtilis.
3.
рода
Изучение морфологических особенностей показало, что бактерии
Bacillus
являются грамположительными, имеют форму палочек к
закругленными концами, располагаются одиночно, парами и
короткими
цепочками. Поперечный размер вегетативных клеток достигает 0,7-0,9 мкм и
длину 3,0-4,0 мкм для Bac. acid. штамма B-5250 и 0,4-0,6 мкм и длину 1,7-1,9 мкм
для Bac. sub.
Выявлено, что при различных значениях pH у бактерий Bacillus subtilis
наблюдается определенная интенсивность роста: при pH=4 роста не наблюдалось,
при pH=6 отмечался средний рост и при pH=8 максимальный рост. Что касается
бактерий Bacillus acidocaldarius штамма В-5250, то у них наблюдался
интенсивный рост в пределах всего изучаемого интервала рН 4,0-8,0, что
свидетельствует о лабильности бактерий данного штамма к значениям pH среды.
Количество клеток из чистой культуры Bac. acid. превосходит число клеток
Bac. sub. почти в 9 раз.
4.
Установлено, что культуральные жидкости содержат азотсодержащие
компоненты,
обладающие
целлюлазной
активностью.
Измерение
целлюлолитической активности было проведено вискозиметрическим методом и с
84
помощью антронового метода. Установлено, что бактерии Bac. acid. штамма
В-5250 способны синтезировать ферменты целюлолитического действия.
Установлено, что при глубинном культивировании целлюлолитическая
активность значительно выше, по сравнению с культивированием бактерий
поверхностным методом. В связи с этим, считаем целесообразным проводить
глубинное культивирование бактерий с целью максимизации процесса биосинтеза
целлюлаз.
5.
Было установлено, что выделенные целлюлолитические ферменты
характеризуются
высокой
pH-
и
термостабильностью.
Это
объясняется
особенностями строения и подвижности белковой молекулы. Такие ферменты
являются
перспективными
для
дальнейшего
применения
в
различных
технологиях.
6.
Используя разработанную схему, получили ферментный препарат в
виде порошка. Препарат можно рекомендовать для использования в пищевой
промышленности (для улучшения переваривания клетчатки, осветления соков и
нектаров),
в
текстильной
промышленности
(для
предания
мягкости
хлопчатобумажным тканям), в сельском хозяйстве (для повышения питательной
ценности кормов) и др.
85
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1.
Bacillus
Авдеева, Л.В. Биосинтез целлюлаз пробиотическими штаммами
при
subtilis
совместном
выращивании
/
Л.В.
Авдеева,
А.И. Осадчая, М.А. Хархота // Микробиология и биотехнология. – 2010. – №4. –
80-89 с.
2.
Алимова,
рода Trichoderma
Ф.К.
Промышленное
применение
грибов
/ Ф.К. Алимова. – Казань: Казанский государственный
университет им. В.И. Ульянова-Ленина, 2006. – 209 с.
3.
Безбородов, А.М. Биохимические основы микробиологического
синтеза / А.М. Безбородов. – М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. –
304 с.
4.
Биологический
энциклопедический
словарь
/
гл.
ред.
М.С. Гиляров; редкол.: А. А. Баев, Г. Г. Винберг, Г. А. Заварзин [и др.]. – 2-е изд.,
исправл. – М.: Сов. Энциклопедия, 1986. – 864 с.
5.
Беккер, М.Е. Введение в биотехнологию / М.Е. Беккер. – Рига:
Пищевая промышленность, 1978. – 231 с.
6.
Березов, Т.Т. Биологическая химия: учебник / Т.Т. Березов,
Б.Ф. Коровкин. – 3-е изд., перераб. и доп. – М.: Медицина, 1998. – 704 с.
7.
Варбанец, Л.Д. Использование методов химической модификации для
стабилизации грибных гликозидаз / Л.Д. Варбанец, Н.В. Борзова. – Киев:
Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного, 2010. — 439 с.
8.
Варфоломеев,
С.Д.
Биотехнология
/
С.Д.
Варфоломеев,
С.В. Калюжный. – М.: Высшая школа, 1990. – 296 с.
9.
Виестур, У.Э.
Биотехнология: биологические
агенты, технология,
аппаратура / У.Э. Виестур, И.А. Шмите, А.В. Жилевич. – Рига: Зинатне, 1987. –
263 с.
10.
Воробьев, А.В. Микробиология: учебник / А.В. Воробьев, А.С. Быков,
Е.П. Пашков, А.М. Рыбакова. – 2-е изд., перераб. и доп. – М.: Медицина, 2003. –
336 с.
86
11.
Всероссийская
коллекция
промышленных
микроорганизмов
[Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://www.genetika.ru/vkpm/. – Дата
обращения: 01.02.2018.
12.
Выделение и идентификация бактерий: методические рекомендации
для студентов биологического факультета специализации «Микробиология и
вирусология»
/
Сост.
О.И.
Винникова,
А.М.
Самойлов,
Ю.В. Попова. – Х.: ХНУ имени В. Н. Каразина, 2011. – 60 с.
13.
Герхардт, Ф Методы общей бактериологии: пер. с англ. / Ф. Герхардт
[и др.]. – М.: Мир, 1983. – 536 с.
14.
Гореликова, Г.А. Основы современной пищевой биотехнологии:
учебное пособие / Г.А. Гореликова. – Кемерово: Кеиеровский технолог. ис-т пищ.
пром., 2004. – 100 с.
15.
ГОСТ
5556-81
Вата
медицинская
гигроскопическая.
Общие
технические условия. – М.: ИПК Издательство стандартов, 1991, 16 с.
16.
ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. – М.: Стандартинформ, 2007,
17.
ГОСТ Р 54731-2011 Дрожжи хлебопекарные прессованные. – М.:
11 с.
Стандартинформ, 2013, 16 с.
18.
ГОСТ 26670-91 Методы культивирования микроорганизмов. – М.:
Стандартинформ, 2008, 8 с.
19.
ГОСТ ИСО 7218-2011 Общие требования и рекомендации по
микробиологическим исследованиям. М.: Стандартинформ, 2015, 17 с.
20.
ГОСТ Р 55452-2013 Сено и сенаж. - М.: Стандартинформ, 2014, 12 с.
21.
ГОСТ 29112-91 Среды питательные. Общие технические условия. –
М.: ИПК Издательство стандартов, 2001, 20 с.
22.
Грачева,
И.М.
Технология
микробных
белковых
препаратов,
аминокислот и жиров: учебник для вузов по спец. «Технология микробиол. пр-в» /
И.М. Грачева, Н.Н. Гаврилова, Л.А. Иванова. – М.: Пищевая промышленность,
1980. – 448 с.
87
23.
Грачева, И.М. Технология ферментных препаратов / И.М. Грачева,
А.Ю. Кривова. – 3-е изд. – М.: Элевар, 2000 г. – 512 с.
24.
Данилова, Т.Е. Методические указания к выполнению лабораторного
практикума по дисциплине «Общая биотехнология» для студентов специальности
240901: часть 1 / Т.Е. Данилова, Н.М. Тарнуева. – Улан-Удэ: Издательство
ВСГТУ, 2006. – 58 с.
25.
Данилова, Т.Е. Методические указания к выполнению лабораторного
практикума по дисциплине «Общая биотехнология» для студентов специальности
240901: часть 2 / Т.Е. Данилова, Н.М. Тарнуева. – Улан-Удэ: Издательство
ВСГТУ, 2006. – 37 с.
26.
Егоров,
Н.С.
Руководство
к
практическим
занятиям
по
микробиологии / М.Н. Пименова, Н.Н. Гречушкина, А.И. Нетрусов и др.; ред.
Н.С. Егоров. – М.: Изд-во Московского университета, 1995. − 224 с.
27.
Зубов, Д.В. Оперативный метод определения активности целлюлаз /
Д.В. Зубов, А.В. Сергеева, А.А. Толченов // Программные системы: теория и
приложения: тр. межд. конф. Т.2. – Переславль-Залесский: Изд-во «Университет
города Переславля», 2009. – С. 207-216.
28.
Иванова, Е.Ю. Микробиология: учебно-методическое пособие /
Е.Ю. Иванова. – Воронеж: Изд-во ВГУ, 2004. – 23 с.
29.
Квеситадзе,
Г.И.
Введение
в
биотехнологию:
монография / Г.И. Квеситадзе, А.М. Безбородов. – РАН, Институт биохимии им.
А.Н. Баха. – М.: Наука, 2002. – 284 с.
30.
Клесов, А.А., Ферментативный гидролиз целлюлозы / А.А. Клесов,
М.Л. Рабинович // Биологическая химия. Итоги науки и техники. – Москва, 1982.
– Т. 8, № 11. – С. 1490-1496.
31.
заведений
Котова, И.Б. Общая микробиология: учебник для студ. высш. учеб.
/ И.Б.
Котова,
А.И.
Нетрусов.
–
М.:
Издательский
центр
«Академия», 2007. – 288 с.
32.
Кузнецова, Е.А. Микробиология: учебное пособие для вузов /
Е.А. Кузнецова. – Орел: ОрелГТУ, 2009. – 185 с.
88
33.
Мальцева, Т.В. β-фруктозидаза дрожжей Kluyveromyces marxianus
Y-303: препаративное получение, свойства, применение в биотехнологии [Текст]:
дис. канд. биол. наук. Воронеж. гос. технолог. академия, Воронеж, 2003. – 20 с.
34.
МУК 4.2.1884-04. Санитарно-микробиологический и санитарно-
паразитологический анализ воды поверхностных водных объектов. – М., 2004, –
41 с.
35.
Обзор рынка биотехнологий в России и оценка перспектив его
развития [Электронный ресурс] М.: Frost & Sullivan, 2014. – 70 с. Режим доступа:
http://biotech2030.ru/obzor-rynka-biotehnologij-v-rossii-i-otsenka-perspek-tiv-egorazvitiya/. – Дата обращения 01.02.1018.
36.
Осадчая, А.И. Скрининг штаммов бактерий с высокой целлюлазной
активностью / А.И. Осадчая, Л.А. Сафронова, Л.В. Авдеева, В.М. Иляш //
Миробиологический журнал. – 2009. – 71, №5. – С. 41-46.
37.
Полыгалина, Г.В. Определение активности ферментов / Г.В.
Полыгалина,
В.С.
Чередниченко,
Л.В.
Римарева.
–
М:
ДеЛи
принт,
2003. – 375 с.
38.
Промышленная микробиология / А. М. Безбородов, И.Н. Блохина [и
др.]; ред. Н.С. Егоров. – 3-е издание. – М.: «Высшая школа», 1989. – 687 с.
39.
Рухлядева, А.П. Методы определения активности гидролитических
ферментов / А.П. Рухлядева, Г.В. Полыгалина. – М.: Легкая и пищевая
промышленность, 1981. – 288 с.
40.
Санданова, И. Б. Влияние факторов окружающей среды на
ферментативную
активность
микроорганизмов-деструкторов
растительного
опада/ И. Б. Санданова, Л. Б. Буянтуева // Вестник Бурятского гос. ун-та.
Биология, география. − 2008. – С. 77-80.
41.
Синицын, А.П. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов /
А.П. Синицын, А.В. Гусаков, В.М. Черноглазов. – М.: МГУ, 1995. – 224 c.
42.
Слюсаренко, Т.П. Лабораторный практикум по микробиологии
пищевых
производств: учебное пособие для студентов технологических
89
специальностей втузов / Т. П. Слюсаренко – 3-е издание, переработанное и
дополненное. – Москва: Легкая и пищевая промышленность, 1984. – 206 с.
43.
Способ получения пектолитических ферментных препаратов из
растворов: пат. 535345 СССР: МПК C 12 D 13/10/ Величко Б.А., Калунянц К.А.,
Ашомко
Э.Г.;
заявитель
и
патентообладатель
Всесоюзный
научно-
исследовательский биотехнический институт. - № 2158115; заявл. 18.07.1975;
опубл. 15.11.1976, Бюл. № 42. – 2 с.
44.
Способ получения пектолитических ферментных препаратов из
растворов: пат. 1221240 СССР: МПК C 12 N 9/42, C 12 N 15/00. / Илялетдинов
А.Н., Саубенова М.Г., Харитонова Т.А.; заявитель и патентообладатель Институт
микробиологии и вирусологии АН КАЗССР. - № 3561131; заявл. 03.03.1983;
опубл. 30.03.1986, Бюл. № 12. – 3 с.
45.
Способ
выделения
ферментов
из
жидких
растворов:
пат. 516740 СССР: МПК C 12 D 13/10. / Величко Б.А., Станкевич П.А., Калунянц
К.А., Кузнецова Т.П.; заявитель и патентообладатель Всесоюзный научноисследовательский институт биосинтеза белковых веществ, организация ПЯГ –
4740. – № 1889378/13; заявл. 02.03.1973; опубл. 05.06.1976, Бюл. № 21. – 3 с.
46.
Способ
получения
целлюлазы:
пат.
368303
СССР:
МПК С 12 D 13/10 / Фениксова Р.В., Тиунова Н.А., Родионова И.А., Кудряшова
Т.И., Сидорова И.И., Мартинович Л.И.; заявитель и патентообладатель Институт
биохимии
имени
А.Н.
Баха.
–
№
1221240;
заявл.
09.12.1970,
опубл. 26.01.1973, Бюл. № 9. – 4 с.
47.
Уонг,
Д.,
Ферментация и технология
англ./ Д. Уонг, Ч. Кооней,
А.
Демаин.
ферментов:
– М.:
перевод
с
Легкая и пищевая
промышленность, 1983. – 187 с.
48.
Ферменты в медицине, пищевой
промышленности и сельском
хозяйстве / М.Ф. Гулый [и др.]. – Киев: Наукова думка, 1968. – 252 с.
49.
Штамм
бактерий
Bacillus
acidocaldarius,
используемый
для
силосования соломы: пат. 1799395 СССР: МПК С 12 N 9/42, A 23 K 3/00 /
Саубенова М.Г., Пузыревская О.М., Галимбаева Р.Ш., Балагутина М.Р.,
90
Илялетдинов А.Н.; заявитель и патентообладатель Институт микробиологии и
вирусологии АН КАЗССР. - № 1221240; заявл. 10.09.1990, опубл. 28.02.1993, Бюл.
№ 8. – 10 с.
50.
Ферменты микроорганизмов / ред. А.А. Имшенецкий. – М.: Наука,
1973. – 314 с.
51.
Agrawal, C.M. Introduction to Biomaterials: Basic Theory with
Engineering Applications / C.M. Agrawal, J.L. Ong, M.R. Appleford, G. Mani. –
Cambridge University Press, 2014. – 422 p.
52.
Bahadur, B. Plant Biology and Biotechnology: Volume I: Plant Diversity,
Organization,
Function
and
Improvement
/
B.
Bahadur,
M.V.
Rajam,
L. Sahijram, K.V. Krishnamurthy [eds.]. – Springer, 2015. – 831 p.
53.
Bahadur, B. Plant Biology and Biotechnology: Volume II: Plant Diversity,
Organization, Function and Improvement / B. Bahadur, M.V. Rajam, L. Sahijram,
K.V. Krishnamurthy [eds.]. – Springer, 2015. – 780 p.
54.
Black, J.G., Microbiology: Principles and Explorations / J.G. Black,
L. Black – 8-th edition. – Wiley, 2012. – 975 p.
55.
Brown, J. Principles of Microbial Diversity / J. Brown. – ASM Press,
2014. – 390 p.
56.
Chandrawati, J.S. Textbook of Biotechnology / J.S. Chandrawati. –
APH Publishing, Jan 1, 2008. – 300 p.
57.
Clark, D.P. Biotechnology: Academic Cell Update / D.P. Clark,
N.J. Pazdernik. – Elsevier, 2012. – 750 p.
58.
Cohen, G.N. Microbial Biochemistry / G.N. Cohen. – 3-rd ed. – Springer,
2014. – 618 p.
59.
Colwell, R.R. Current Methods for Classification and Identification of
Microorganisms / R.R. Colwell, R. Grigorova [eds.]. – Academic Press, 1987. – 518 p.
60.
Fiechter, A. History of Modern Biotechnology: T. 1 / A. Fiechter. –
I. - Springer, 2000. – 234 p.
61.
Fiechter, A. History of Modern Biotechnology: T. 2 / A. Fiechter. –
1-st ed. – Springer, 2000. – 176 p.
91
62.
Glazer, A.N. Microbial Biotechnology: Fundamentals of Applied
Microbiology / A.N. Glazer, H. Nikaido. – Cambridge University Press, 2007. – 577 p.
63.
Grace, E.S. Biotechnology Unzipped: Promises and Realities
/
E.S. Grace. – Joseph Henry Press, 2006. – 241 p.
64.
Gupta, V.K. Biotechnology of bioactive compounds: sources and
applications / V.K. Gupta, M.G. Tuohy, A. O’Donovan, M. Lohani [eds.]. – Wiley,
2015. – 745 p.
65.
Haider, S.I. Biotechnology: A Comprehensive Training Guide for the
Biotechnology Industry / S.I. Haider, A. Ashtok. – Taylor & Francis Group, 2009. –
865 p.
66.
Harzevili, F.D. Microbial Biotechnology: Progress and Trends /
F.D. Harzevili, H. Chen [eds.]. – CRC Press, 2014. – 381 p.
67.
Hogg, S. Essential microbiology / S. Hogg. – John Wiley and Sons,
2005. – 468 p.
68.
Hogg, S. Essential microbiology / S. Hogg. – 2-nd edition. – Wiley,
2013. – 527 p.
69.
Ju, H. NanoBiosensing: Principles, Development and Application /
H. Ju, X. Zhang, J. Wang. – Springer: Science+Business Media, 2011. – 586 p.
70.
Kambiz, V. Porous media: applications in biological systems and
biotechnology / V. Kambiz. – CRC Press, 2011. – 632 p.
71.
Kimball, N. Glossary of Biotechnology Terms / N. Kimball. – 3-rd
edition. – CRC Press, 2002. – 304 p.
72.
Lynd,
L.R.
Microbial
Cellulose
Utilization:
Fundamentals
and
Biotechnology / L.R. Lynd, P.J. Weimer, W.H. Van Zyl, I.S. Pretorius // Microbiol Mol
Biol Rev. – 2002. – P. 739-745.
73.
Maczulak, A. Allies and Enemies: How the World Depends on Bacteria /
A. Maczulak. – Pearson Education, 2011. – 224 p.
74.
Madigan, M. Brock Biology of Microorganisms / M. Madi-gan. – Pearson
Education, 2012. – 1155 p.
92
75.
Meyer, U. Fundamentals of Tissue Engineering and Regenerative
Medicine / U. Meyer, Th. Meyer, J. Handschel, H.P. Wiesmann [eds.]. – Springer,
2009. – 1054 p.
76.
Newell-McGloughlin, M. The Evolution of Biotechnology. From
Natufians to Nanotechnology / M. Newell-McGloughlin, E. Re. – Springer, 2007. –
276 p.
77.
Ratledge, C. Basic Biotechnology / C. Ratledge, K. Bjorn. – Cambridge
University Press: Medical, 2006. – 666 p.
78.
Satyanarayana, T. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial
Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles / T. Satyanarayana, J. Littlechild, Y.
Kawarabayasi [eds.]. – 2-nd edition. – Springer, 2013. – 951 p.
79.
Singh,
U.S.
Microbial
biotechnology
/
U.S.
Singh,
K. Kapoor. – Oxford book company, 2010. – 310 р.
80.
Singleton, P. Dictionary of Microbiology & Molecular Biology /
P. Singleton, D. Sainsbury. – Wiley, 2006. – 903 p.
81.
Slonczewski,
J.L.,
Microbiology
An
Evolving
Science
/
J.L. Slonczewski, J.W. Foster. – 2-nd edition. – W.W. Norton & Company, Inc., 2011. 787 p.
82.
Shukla,
P.
Advances
in
Enzyme
Biotechnology
/
P.
Shukla,
B.I. Pletschke [eds.]. – Springer, 2013. – 179 p.
83.
Walker,
J.M.
Molecular
Biology
and
Biotechnology
/
J.M. Walker, R. Rapley. – Royal Society of Chemistry: Science, 2000. – 563 p.
84.
Wick, C.H. Identifying Microbes by Mass Spectrometry Proteomics /
C.H. Wick. – Taylor & Francis Group, 2014. – 283 p.
85.
Zhi, C.L. Modelling and Optimization of Biotechnological Processes.
Artificial Intelligence Approaches / C.L. Zhi, N.S. Kiong, C.S. Kiong. – Springer,
2006. – 123 p.
86.
Zhong, J.J. Future Trends in Biotechnology / J.J. Zhong. – Springer,
2013. – 183 p.
93
Ilpn.noxenue
tu$fT$TAl'ffiAT
t0$crsEf"tf"tbtM yMoM
CNPABKA
o pe3y,braTax npoBepKlt TeKcToBoro AoKyMeHTa
Ha Hannqhe 3ahMcTBoBaHhfi
flpoeepxa BbtnorHeHa
Aarop pa6orsl
B
chcreMe
llaHexxosa AHHa Cepreeeta
Oaxyrsrel xaQe4pa,
HoMep rpynnbl
Tun pa6orsr
HaseaHre pa6orur
Oco6ex Hocrl n onyq eH hs qer,n toron rlTllrt ecxux SepmeHroa ra
Bacillus acidocaldarius
Haaaarrae Qaiaa
flaHeHxoea A.C.docx
flpoqexr aaumcrBoBaHhfl
7t,57
flpoqexr qurrpoBaHrf,
r,o2%
fl
poqerr
op!4 rrHa,nbHocrh
,{ara npoeepxu
Mo4yrr notcxa
%
87,4r%
09:04:59 29
rvran
2018 r.
Konbllo ey:oa, Mo4y_nr noucxa "O|EOV BO OTy rau. 14.C.TypreHeaa,', Mo4y.nu noucxa
fi , Mo4ynu noracxa nepeQpa:r poaan rfi lzl nrepHer,
Mo4yrs n orcxa nepeSp atupoaaauil eLl BRARY. RU, MoAynb norcxa lzlrrepHer,
KorneKqr4F eLIBRARY.RU, L.lnnapoeaHre, KorreKL{1,4fl pfE, Cao4nan xonnexqun 3EC
o6u4eyn orpe6r.rrerbH btx aulpaNenu
Pa6ory npoaepraan
LLJaR n
oea,i-l
togmula Bach,nbeBHa
OtlO npoBepFrcqefo
Ky3HeqoBa EreHa AHaroruesHa
Qly'O
lara
A4A{,%1".
no4nucu
9ro6ur y6e4rrscn
B noAra4HHOCTrl
npoBepnpllefo
CnpaBRr,
hcnorb3yire QR-xoA, xoropuri
coAepxHT ccbrnxy Ha oT{er.
Orger xa Bonpoc, nB.ntercn nr o6napyxenHoe 3atMcreosaHhe
KOppeKrHbrM, c14cTeMa ocTaB/t9eT Ha ycMoTpeHlre npoBepf, |oqero.
flpegocraerexxae rnQopruaqrn He noA.fl exhr rcnorb3oeaHnto B
KOMMe0qecxhx ue,n8x.
I
94
Приложение 2
Паспорт штамма, выдаваемого из Всероссийской коллекции
промышленных микроорганизмов (ВКПМ)
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа