close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Стельмащук Ольга Андреевна. Применение липосомальных частиц в терапевтической практике

код для вставки
5
6
7
ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Выпускная квалификационная работа на тему «Применение липосомальных
частиц в терапевтической практике».
Предмет ВКР: липосомальные частицы, созданные на базе природного
лецитина, полиэтилен гликоль, флуоресцентные красители.
Характер ВКР: прикладная научно-исследовательская работа.
Целью данной работы является изучение применения липосомальных
частиц в терапевтической практике.
Методы исследования: синтез липосомальных частиц метод обращения фаз,
исследование суспензии липосом методом оптической микроскопии, контроль
проникновения
флуоресцин
меченых
липосом
методом
флуоресцентной
спектроскопии, высокоскоростной капилляроскопией, гистологией образцов
тканей задействованных в эксперименте животных, оценка степени эхогенности с
помощью ульразвуковой диагностики.
Полученные
результаты:
липосомальные
частицы
могут
повысить
эффективность переноса флуоресцентного красителя в кровоток через желудочнокишечный тракт после перорального введения, включение полиэтиленгликоля в
состав липосомальной мембраны увеличивает длительность циркуляции в
кровотоке,
инкапсуляции
газа
влияет
на
уровень
контрастности
при
ультразвуковой диагностике.
Новизна: использование альтернативных методов доставки лекарственных
веществ при пероральном введении в организм, использование газосодержащих
липосом
для
повышения
эхоконтрастности
паренхиматозных
органов
в
ультразвуковой диагностике.
Область применения: фармацевтическое производство, таргентная доставка
лекарственных препаратов, ранняя диагностика заболеваний внутренних органов.
Возможность практической реализации: по результатам разработаны меры
применимые в крупномасштабном производстве средств доставки лекарственных
веществ.
8
АННОТАЦИЯ
Выпускная квалификационная работа на тему «Применение липосомальных
частиц в терапевтической практике».
Год защиты: 2018.
Направление подготовки: 19.04.01 «Биотехнология».
Студент группы: 61БТ-м Стельмащук О.А.
Руководитель: к.т.н. Винокуров А.Ю.
Ключевые слова: терапевтическая практика, липосомальные частицы,
таргентная доставка, лекарственные вещества, ультразвуковая диагностика,
флуоресцентная спектроскопия
Выпускная квалификационная работа состоит из введения, аналитического
обзора литературы, раздела объектов и методов исследования, экспериментальной
части, выводов и рекомендаций, списка использованных источников и
приложений.
Общий
объем работы
составляет
96 страницах. Работа содержит
17 рисунков, 1 таблица и 3 приложения. Список использованных источников
включает 51 наименований.
Графическая часть выпускной квалификационной работы выполнена в
редакторе презентаций Power Point 2010 и включает схемы, таблицы, графики и
диаграммы, представленные на 20 листах формата А4.
Данная выпускная квалификационная работа прошла проверку в системе
«Антиплагиат. ВУЗ», справка прилагается (приложение 1).
9
Содержание
Содержание ...................................................................................................................... 9
Введение ......................................................................................................................... 11
Глава 1 Аналитический обзор литературных источников ........................................ 13
1.1 Пути введения лекарственных веществ
13
1.1.1 Энтеральное введение
15
1.1.2 Парентеральное введение
18
1.2 Применение таргентной доставки в диагностической и лечебной практике
22
1.3 Липосомальные биоконтейнеры
26
1.4 Методы контроля доставки лекарственных препаратов
32
Выводы по 1 главе
34
Глава 2 Объекты и методы исследования ................................................................... 35
2.1 Объекты исследования
35
2.2 Методы исследования
36
2.2.1 Выделение холестерина
37
2.2.2 Синтез липосомальных частиц
38
2.2.3 Включение флуоресцентного красителя в липосомальную частицу
38
2.2.4 Контроль флуоресцеин меченых липосом флуоресцентной спектроскопии 40
2.2.5 Включение полиэтиленгликоля в состав липосомальной частицы
42
2.2.6 Включение биосовместимого газа в липосомальную частицу
42
2.2.8 Экспериментальные животные
43
2.2.9 Приготовление препаратов печени крыс
44
Глава 3 Результаты исследований и их анализ .......................................................... 45
3.1 Получение липосомальных частиц
45
10
3.2
Проникновение
флуоресцеин
меченых
липосом
парентеральном введение
в
кровоток
при
46
3.3 Влияние включения ПЭГ на транспортные свойства липосомальных частиц 52
3.3 Модель воздействия ультразвуковой волны на газосодержащие газсодержащие
липосомальные частицы
55
3.4 Контрастирующие свойства газосодержащих липосом
57
Выводы по 3 главе
59
Заключение .................................................................................................................... 60
Список использованных источников .......................................................................... 63
ПРИЛОЖЕНИЕ 1 ................................................ Ошибка! Закладка не определена.
ПРИЛОЖЕНИЕ 2 .......................................................................................................... 69
ПРИЛОЖЕНИЕ 2 .......................................................................................................... 85
11
ВВЕДЕНИЕ
Благодаря
синтезу
фармацевтических
клинических
исследованиях
наук,
химии
произошел
и
биотехнологии
прорыв
в
в
развитии
фармацевтических препаратов.
Процесс создания лекарственного вещества начинается с открытия
молекулы
лекарственного
средства, которая подтвердит терапевтическую
эффективность при апробации на различных видах заболеваний. Синтез и
изучение характеристик таких фармацевтических молекул лекарственных средств
на безопасность и терапевтическую эффективность являются предпосылкой для
дальнейших подробных исследований.
Исследования по созданию лекарственных веществ основаны на знании
основной причины заболевания и влиянии на организм.
Одним из перспективных направлений является создание инновационных
форм для таргетной доставки лекарственных препаратов к очагу поражения с
целью лечения и диагностики. Это вполне объяснимо, так как подобные решения
имеют широкий спектр применения, активно используются в диагностических
целях, профилактики и лечении различных заболеваний.
Одним из актуальных направлений адресной доставки препаратов является
создание биосовместимых нано контейнеров, аналогичных по строению липидной
компонентой биологической мембране – липосом. Липосомы – полые частицы,
содержание которых ограничено липидной мембраной. Они относятся к
обширному семейству везикулярных (пузырьковых) структур, образуемых
амфифильными молекулами.
Липосомы способны включать в себя самые разные вещества практически
без каких-либо ограничений в отношении их химической природы, свойств и
размера молекул [24]. С точки зрения биологической совместимости липосомы
идеальны как переносчики лекарственных препаратов. Кроме того, в липосомы
можно включать радиоактивные, рентгеноконтрастные, парамагнитные вещества,
а также вещества, отражающие ультразвук, с тем, чтобы улучшить качество
12
изображений, получаемых такими методами диагностики, как компьютерная
томография, рентгенография, сцинтиграфия и ультразвуковое исследование.
Целью данной работы является изучение применения липосомальных
частиц в терапевтической практике.
В этой связи задачами фундаментального исследования являются:
– проведение обзора существующих препаратов в терапевтической
практике;
– теоретическое и экспериментальное обоснование наиболее оптимального
липидного состава липосомальных наночастиц для перорального применения;
–
теоретическое
и
экспериментальное
обоснование
применения
липосомальных наночастиц в ультразвуковой диагностике.
Основными теоретическими методами исследования является анализ
литературных
источников,
а
также
моделирование
процесса
синтеза
липосомальных частиц с учетом требований к физико-химическим свойствам
лекарственных препаратов. В работе были использованы следующие методы
экспериментального
гомогенизация
исследования:
частиц
конвекционный
ультразвуком,
исследование
синтез
методами
липосом,
оптической
микроскопии, диализа, спектрофотометрии, флуоресцентной спектроскопии,
ульразвуковой диагностики.
Теоретическая значимость работы заключается в изучении влияния
включения
полиэтиленгликоля
в
состав
липосомальной
мембраны
на
эффективность проникновения из желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) в
системный кровоток, влияния инкапсуляции газа на уровень контрастности при
ультразвуковой диагностике.
Практическая
липосомальных
значимость
частиц
состоит
необходимого
в
отработке
размера,
процесса
способа
синтеза
инкапсуляции
биологически активных веществ в липосомальную частицу, применение метода
флуоресцентной спектроскопии для определения эффективности проникновения
флуоресцеин меченых частиц из ЖКТ в кровоток, использование ультразвуковой
диагностики для оценки степени контрастности газосодержащих липосом.
13
ГЛАВА 1 АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ИСТОЧНИКОВ
1.1 Пути введения лекарственных веществ
Одним из важнейших аспектов применения лекарственных веществ
является способ их введения в организм. Лекарственные вещества (ЛВ) вводятся в
организм несколькими путями: энтеральным или парентеральным [38, 48]
(рисунок 1).
Рисунок 1 – Пути введения лекарственных веществ
Энтеральный путь включает в себя пероральный, вагинальный и
ректальный методы введения веществ. Парентеральный путь включает в себя
14
иъекции, ингаляции, электрофорез, трансдермальные методы и введение через
слизистые оболочки [43, 45].
После попадания в организм происходит процесс распределения лекарств из
системного кровотока в различные органы и ткани. ЛВ, проникая в кровь, могут
находиться как в свободном (растворенном), так и связанном состоянии с
элементами крови, белками, липопротеинами состоянии. Лекарственные вещества
распространяются кровью по всему телу и равномерно распределяются по всему
объему крови до тех пор, пока состояние динамического равновесия не будет
установлено
в
соответствующем
органе.
Через
органы
с
интенсивным
кровообращением (сердце, легкие, мозг, печень) происходит большое количество
крови, и, соответственно, будет большее накопление ЛВ (рисунок 2) [41, 45].
Рисунок 2 – Распределение лекарственных веществ в организме
Для начала специфического действия ЛВ необходимо достичь минимальной
концентрации
в
организме,
которая
определяется
как
минимальная
терапевтическая доза (начальная доза). Дальнейшее усиление реакции организма
15
на вводимое лекарственное вещество будет зависеть от увеличения его
количества до эффективной терапевтической дозы и от того, как долго выбранная
лекарственная форма может обеспечить стабильную концентрацию в организме
[37, 42, 49].
1.1.1 Энтеральное введение
Многие препараты можно вводить перорально в виде жидкостей, капсул,
таблеток или жевательных таблеток. Поскольку употребление ЛВ является
наиболее удобным и, как правило, самым безопасным и наименее дорогостоящим,
он чаще всего используется. Однако у него есть ограничения из-за того, как
лекарственное средство обычно проходит через пищеварительный тракт. Для
препаратов, вводимых перорально, абсорбция может начинаться во рту и в
желудке. Однако большинство лекарств обычно всасывается из тонкой кишки.
Препарат проходит через стенку кишечника и перемещается в печень перед
транспортировкой через кровоток в его целевой участок. Кишечная стенка и
печень химически изменяют (метаболизируют) многие лекарства, уменьшая
количество лекарственного вещества, достигающих кровотока. Следовательно,
эти препараты часто вводятся в меньших дозах при внутривенном введении для
получения такого же эффекта [13, 19, 22, 47].
В общей структуре ЖКТ можно выделить следующие барьеры на пути
проникновения препаратов в кровоток: желудочный сок с кислой реакцией среды
(рН находится в пределах 1,2-2,0), содержащий кроме того ряд неспецифических
протеаз (например, пепсин), просвет кишечника с целым набором гидролизующих
ферментов – трипсином, альфа-химотрипсином, эластазой и карбоксипептидазой,
слизистые оболочки кишечника, мембраны клеток эпителия [51]. Наконец,
попавшие
в
кровоток
молекулы
лекарственного
вещества
подвергаются
активному воздействию протеаз сыворотки крови [34].
Тем не менее, вопрос о совершенствовании пероральных способов
применения лекарств остается крайне актуальным ввиду:
16
–
их относительной простоты и доступности для пациентов (что особенно
важно при постоянной заместительной терапии, при которой инъекции до
четырех раз в день крайне неудобны для пациента, тем более, если требуют
участия квалифицированного медицинского работника);
–
отсутствия жестких требований стерильности при производстве препаратов
перорального применения;
–
-обеспечения (во многих случаях) большего соответствия механизма
действия препарата естественным процессам при заместительной терапии (так,
пероральное введение рекомбинантного инсулина обеспечивало бы его первичное
поступление в печень и лишь затем – в периферические ткани, как это имеет
место в случае эндогенного гормона).
На сегодняшний день механизмы межмолекулярных взаимодействий, в том
числе
с
участием
пептидов
выходят
на
первый
план
в
понимании
фундаментальных основ влияния биологически активных веществ на организм
человека. Поэтому их изучение в аспекте включения пептидных молекул в микрои наноконтейнеры на основе липосом и полисахаридов, представляет научную
значимость.
Знание этих механизмов может быть использовано как при создании форм
доставки конкретных лекарственных веществ, так и при конструировании новых
соединений, пригодных для включения в структуру носителей, что определяет
практическую значимость данной работы.
Когда препарат принимается перорально, пищевые продукты и другие
лекарственные средства в пищеварительном тракте могут влиять на количество и
скорость всасывания препарата. Таким образом, некоторые лекарства следует
принимать на пустой желудок, другие следует принимать с пищей, другие нельзя
принимать с некоторыми другими наркотиками, а третьи не могут приниматься
орально.
Многие препараты подвержены деградации в среде желудочно-кишечного
тракта. Кроме того, слизистая оболочка тонкого кишечника препятствует
проникновению многих лекарственных веществ в кровоток. Высокая вязкость и
17
адгезия слизистых вместе с обилием вспомогательных веществ могут серьезно
замедлить распространение препарата через слой слизистой оболочки. Этот слой
имеет толщину 100 800 мкм и включает комплекс высокоразветвленных
гликопротеинов, липидов, макромолекул клеток и сыворотки и других клеточных
остатков. Однако лекарственное средство может проходить через желудочнокишечный тракт с использованием модифицированной липосомы. Исследования
кишечной проницаемости показали, что частицы на основе липидов могут
абсорбироваться, если их диаметр не значительно превышает 500 нм [14].
Транспортными свойствами липосомальных частиц можно управлять путем
добавления полимерного покрытия к поверхности. Эти покрытия могут
противостоять деградации во враждебной среде желудочно-кишечного тракта,
которая включает соли желчных кислот и ферментов. Например, поджелудочная
липаза
обычно
растворяет
незащищенный
липидный
бислой.
Полимер
полистирола или поли (этиленгликоль) (ПЭГ) позволяет липосомальным
частицам проникать в кишечную слизь. Это было впервые подтверждено одной
исследовательской группой (Фармацевтический университет Гифу, Япония) [13],
которая
изучила
использование
перорально
вводимых
липосом
для
целенаправленной доставки химиотерапевтических агентов для лечения рака
кишечника. Способность проникать дает возможность для уникальных решений
определенных медицинских проблем, из-за совершенной биосовместимости
липосом в качестве носителей лекарственных средств. Кроме того, липосомы
могут содержать радиоактивные, рентгеноконтрастные или парамагнитные
вещества и вещества, которые отражают ультразвук для улучшения качества
изображений, полученных с помощью таких диагностических методов, как
компьютерная томография, рентгеновское излучение, ультразвук и сцинтиграфия
[15-23].
Некоторые перорально вводимые препараты раздражают пищеварительный
тракт.
Например,
аспирин
и
большинство
других
нестероидных
противовоспалительных препаратов (НПВП) могут повредить слизистой желудка
и тонкой кишки, что потенциально вызовет или усугубит существующие язвы.
18
Другие препараты абсорбируются плохо или беспорядочно в пищеварительном
тракте или разрушаются кислотой и пищеварительными ферментами в желудке
[35]. Другие пути введения необходимы, если пероральный путь не может
использоваться, например:
–
когда человек не может принимать что-либо через рот;
–
когда препарат следует вводить быстро или в точной или очень высокой
дозе;
–
когда препарат плохо или неустойчиво абсорбируется из пищеварительного
тракта.
Некоторые лекарства могут вводиться вагинально женщинам в виде
раствора, таблетки, крема, геля, суппозитория или кольца. Препарат медленно
абсорбируется через стенку влагалища. Этот путь часто используется для того,
чтобы давать эстроген женщинам во время менопаузы, чтобы облегчить
вагинальные симптомы, такие как сухость, болезненность и покраснение.
Многие лекарства, которые вводятся перорально, также можно вводить
ректально в виде суппозитория. В этой форме лекарство смешивают с восковым
веществом, которое растворяется или разжижается после того, как оно
вставляется в прямую кишку. Поскольку стенка прямой кишки тонкая и ее
кровоснабжение богато, препарат легко абсорбируется. Суппозиторий предписан
для людей, которые не могут принимать препарат перорально, потому что у них
есть тошнота, не могут проглотить или иметь ограничения на еду, как это
требуется до и после многих хирургических операций. Препараты, которые
можно вводить ректально, включают ацетаминофен (для лихорадки), диазепам
(для судорог) и слабительные (для запоров). Лекарственные средства, которые
раздражают в форме суппозитория, возможно, необходимо назначать путем
инъекции.
1.1.2 Парентеральное введение
Несмотря на преимущества пероральных препаратов наиболее широко
применяют в практике парентеральные методы (преимущественно – инъекции),
19
при которых действующее вещество минует желудочно-кишечный тракт (далее –
ЖКТ). Это обусловлено как свойствами собственно лекарственных веществ
(особенно пептидов), так
Действующим
началом
и физиологическими особенностями
пептидных
препаратов
выступают
человека.
вещества
с
молекулярной массой, колеблющейся в широких пределах (от 250 до нескольких
тысяч Да). (Как следует из правила Липински, молекулярная масса свыше 500 Да
ведет к существенному ухудшению процессов адсорбции и диффузии веществ).
Кроме того, пептидная связь, образующая остов рассматриваемого класса
веществ, достаточно лабильна и относительно легко разрушается под действием
физико-химических (например, кислой реакции среды) или биохимических
(например, гидролизующих ферментов) факторов. Молекулы большинства
пептидов характеризуются высокой гидрофильностью и наличием электрического
заряда, определяемого аминокислотным составом.
Введение инъекцией (парентеральное введение) включает в себя следующие
пути: подкожный (под кожу), внутримышечный (в мышцу) внутривенное (в вену),
интрадекальный (в спинной мозг) [26].
Лекарственный препарат можно приготовить или изготовить таким
образом, чтобы продлить поглощение лекарственного средства из места инъекции
в течение нескольких часов, дней или дольше. Такие продукты не нужно вводить
так часто, как лекарственные продукты с более быстрым всасыванием.
Иногда препарат вводят через кожную иглу (подкожный, внутримышечный
или внутривенный), путем патча (трансдермальный путь) или путем имплантации
[1, 20].
Для подкожного пути иглу вводят в жировую ткань непосредственно под
кожу. После инъекции препарата он переходит в маленькие кровеносные сосуды
(капилляры) и уносится кровотоком. Альтернативно, препарат достигает
кровотока через лимфатические сосуды. Большие по размеру белки, такие как
инсулин, обычно достигают кровотока через лимфатические сосуды, потому что
эти лекарства медленно перемещаются из тканей в капилляры. Подкожный путь
20
используется для многих белковых лекарств, потому что такие препараты будут
разрушаться в пищеварительном тракте, если их принимать перорально [7].
Некоторые
лекарства
(такие
как
прогестины,
используемые
для
гормонального контроля рождаемости) могут быть назначены путем вставки
пластиковых капсул под кожу (имплантация) [5]. Хотя этот способ введения
редко используется, его основным преимуществом является обеспечение
долгосрочного терапевтического эффекта (например, этоногестрел, который
имплантирован для контрацепции, может длиться до 3 лет).
Внутримышечный
путь
предпочтительнее
подкожного
пути,
когда
необходимы большие объемы лекарственного продукта. Поскольку мышцы лежат
ниже кожи и жировых тканей, используется более длинная игла. ЛВ обычно
вводят в мышцы плеча, бедра или ягодицы. Как быстро препарат всасывается в
кровоток, частично зависит от кровоснабжения мышц: чем меньше тканевое
кровенаполнение, тем дольше требуется поглощение лекарства.
Для внутривенного введения иглу вводят непосредственно в вену. Раствор,
содержащий лекарственное средство, можно назначать в разовой дозе или в виде
непрерывной инфузии. Для инфузии раствор перемещают под действием силы
тяжести (из складного полиэтиленового пакета) или, чаще всего, с помощью
инфузионного насоса через тонкую гибкую трубку в трубку (катетер),
вставленную в вену, обычно в предплечье. Внутривенное введение - лучший
способ быстро и точно контролировать точную дозу по всему телу. Он также
используется для раздражающих растворов, которые могут вызвать боль и
повреждение тканей, если они назначаются подкожной или внутримышечной
инъекцией. Внутривенную инъекцию может быть сложнее вводить, чем
подкожную или внутримышечную, потому что введение иглы или катетера в
вену может быть затруднено, особенно если человек страдает ожирением. При
внутривенном введении лекарство доставляется немедленно в кровоток и имеет
тенденцию к более быстрому воздействию на организм, чем каким-либо другим
путем. Следовательно, практикующие врачи внимательно следят за людьми,
которые получают внутривенную инъекцию для выявления признаков того, что
21
препарат работает или вызывает нежелательные побочные эффекты. Кроме того,
эффект лекарственного средства, введенного этим путем, имеет тенденцию
длиться более короткое время. Поэтому некоторые препараты должны быть
введены непрерывной инфузией, чтобы поддерживать постоянный эффект.
Для интратекального пути между двумя позвонками в нижнем отделе
позвоночника и в спинном мозге вставляют иглу. Затем препарат вводится в
спинномозговой канал. Небольшое количество местного анестетика часто
используется для онемения места инъекции. Этот маршрут используется, когда
необходим препарат для быстрого или локального воздействия на мозг, спинной
мозг или слои ткани, покрывающие их (менинги), например, для лечения
инфекций этих структур. Анестетики и анальгетики (такие как морфин) иногда
даются таким образом [5, 35, 39].
Некоторые препараты помещаются под языком (сублингвально) или между
деснами и зубами (букально), чтобы они могли растворяться и всасываться
непосредственно в небольшые кровеносные сосуды, которые лежат под языком.
Эти препараты не проглатываются. Подъязычный путь особенно хорош для
нитроглицерина, который используется для снятия стенокардии, потому что
абсорбция протекает быстро, и препарат сразу же поступает в кровоток, не пройдя
сначала через стенку кишечника и печень. Тем не менее, большинство лекарств
нельзя принимать таким образом, потому что они могут быть абсорбированы не
полностью или беспорядочно [39, 44].
Для лечения глазных нарушений (таких как глаукома, конъюнктивит и
травмы) можно смешивать с неактивными веществами, чтобы сделать жидкость,
гель или мазь для нанесения на глаз. Жидкие глазные капли относительно просты
в использовании, но могут слишком быстро стекать с глаз, чтобы хорошо
впитываться. Композиции геля и мази позволяют дольше поддерживать контакт с
поверхностью глаза, но они могут размывать зрение. Также доступны твердые
вставки, которые выпускают препарат непрерывно и медленно, но их трудно
вводить и удерживать на месте. Окулярные препараты почти всегда используются
для местных эффектов. Например, для снятия сухих глаз используются
22
искусственные слезы. Другие лекарственные средства (например, применяемые
для лечения глаукомы, такие как ацетазоламид и бетаксолол, а также те, которые
используются для расширения зрачков, таких как фенилэфрин и тропикамид)
создают локальный эффект (действуя непосредственно на глаза) после того, как
они поглощаются через роговицу и конъюнктиву. Некоторые из этих препаратов
затем попадают в кровоток и могут вызывать нежелательные побочные эффекты
на другие части тела [40].
Уколы, используемые для лечения воспаления и инфекции уха, могут
применяться непосредственно к пораженным ушам. Капли уха, содержащие
растворы или суспензии, обычно применяются только к наружному ушному
каналу. Перед тем, как наносить капли уха, люди должны тщательно очистить ухо
влажной тряпкой и высушить. Если препараты не используются в течение
длительного времени или не используются слишком много, в кровь поступает
мало лекарств, поэтому побочные эффекты тела отсутствуют или минимальны.
ЛВ, которые могут быть назначены отическим путем, включают гидрокортизон.
1.2 Применение таргентной доставки в диагностической и лечебной
практике
Клиницисты исторически пытались адресно направить воздействия ЛВ в
область заболевания органа, подверженную риску или затронутую болезнью. В
зависимости от лекарства, способа его доставки и того, как реагируют организм,
иногда возникают побочные эффекты. Эти побочные эффекты могут сильно
различаться от человека к человеку по типу и тяжести. Например, пероральный
препарат для сезонной аллергии может вызвать нежелательную сонливость или
расстройство желудка.
Воздействие лекарственными средствами локально, а не системно (влияет
на весь организм) является распространенным способом снижения побочных
эффектов и токсичности препарата при максимальном эффекте. Местная
(используемая на коже) антибактериальная мазь для локализованной инфекции
или инъекция кортизона при заболевании сустава может избежать некоторых
23
системных побочных эффектов этих лекарств [36, 37]. Существуют и другие
способы достижения целевой доставки лекарств, но некоторые лекарства могут
предоставляться только системно. Известно, что заболевания поражают не весь
организм, а развиваются в отдельных органах и тканях. Так, например, при раке
главные события происходят в месте расположения опухоли, при инфаркте
миокарда – в мышце сердца, при дизентерии – в кишечнике. Поэтому и лечение
пойдет быстрее и успешнее, если лекарства будут действовать непосредственно в
очаге заболевания. Особенно это важно в тех случаях, когда приходится иметь
дело с весьма ядовитыми препаратами, которые хорошо лечат саму болезнь, но
при этом плохо влияют на другие системы организма. Часто это свойство
некоторых лекарств заставляет отказываться от использования их и применять
менее эффективные. Однако создать нужную концентрацию лекарственных
веществ в пораженных болезнью местах, не затрагивая остальные, – задача
непростая. Ведь медикаменты, каким бы способом их ни вводили, расходятся по
всему организму более или менее равномерно. А чтобы они попали в нужные
места, сделали вывод медики, необходим какой-то носитель, который бы мог их
туда доставить. Одним из перспективных и прогрессивных направлений адресной
доставки препаратов является создание биосовместимых наноконтейнеров,
аналогичных по строению с липидной компонентой биологических мембран –
липосом.
Нацеливание препарата на конкретную область не только повышает
терапевтическую эффективность лекарственных средств, но и приводит к
снижению токсичности препарата. Это позволяет использовать более низкие дозы
лекарственного средства в терапии [12].
Пассивная таргентная доставка относится к накоплению лекарственного
средства
на
противораковые
определенном
препараты.
участке,
Это
наиболее
объясняется
часто
используются
физико-химическими
или
фармакологическими факторами болезни. Следовательно, в случае лечения рака,
размер
и
поверхностные
свойства
средств
доставки
лекарств
должны
контролироваться специально, чтобы избежать захвата ретикуло-эндотелиальной
24
системой (ВИЭ) для максимизации времени обращения и возможности доставки.
При пассивной таргентной доставке введение ЛВ осуществляется через систему
кровообращения. Высвобождение лекарства ограничивается избирательными
участками в пределах мишенний, таких как опухоль. Другими примерами
являются доставка противомалярийных препаратов и лечение лейшая, бруцеллеза,
кандидоза [8].
Активная
таргетная
доставка
применяется
с
использованием
специфического лиганд-взаимодействия, по типу рецептора для внутриклеточной
локализации. Данный метод реализуется несколькими способами.
Носители лекарств распространяются в капиллярном слое определенного
участка ткани или органа, например в лимфатических сосудах, перинеальной
полости, множественных полостях, мозговых желудочках и глазах, суставах.
Выборочная доставка лекарств используется для конкретных типов клеток,
таких как опухолевые клетки, а не здоровые клетки, например селективная
доставка лекарств в печени.
Доставке лекарств специально к внутриклеточному сайту целевых клеток,
например рецептор на основе лиганда лекарственного комплекса доставляется в
клетку эндоцитозом [12, 18].
Патологический процесс при различных заболеваниях развивается в
отдельных органах и тканях, оказывая влияние на весь организм. Например, при
раке основные изменения происходят в месте расположения опухоли, при
инфаркте миокарда – в мышце сердца. Поэтому выявление патологических
изменений
на
более
ранних
этапах
развития
заболевания
приведет
своевременному началу лечения. Особенно это важно в тех случаях, когда
приходится иметь дело с быстро прогрессирующими формами болезни. При
диагностике онкологических заболеваний на 1 стадии, выживаемость пациентов
составляет 98%, на 2 стадии – 79 %, на 3 стадии – 55%, на 4 стадии – 12%. При
отсутствии каких-либо мероприятий по раннему выявлению или скринингу,
заболевания диагностируются на поздних стадиях, когда радикальное лечение
уже не может помочь [25, 26].
25
В последнее время широкое внедрение в клиническую практику получили
такие методы инструментальной диагностики, как ультразвуковое исследование с
допплерографией (УЗИ, УЗДГ) и эластографией, компьютерная томография (КТ)
и магнитно-резонансная томография (МРТ). Возможности любого из этих видов
инструментальной диагностики многократно увеличиваются при использовании
контрастных средств, которые можно разделить на 3 группы:
1) рентгеноконтрастные средства (РКС);
2) магнитно-резонансные контрастные средства (МРКС);
3) ультразвуковые контрастные средства (УЗКС).
Ультразвуковое исследование с контрастированием является одним из
наиболее эффективных методов диагностики диффузного и очагового поражения
органов брюшной полости. Оно дает возможность проведения исследования в
условиях реального времени и не имеет ограничений [14, 36, 46, 50]. В отличие от
МРТ и КТ нет противопоказаний для пациентов с кардиостимуляторами. По
степени вымывания контраста можно судить о типе поражения, что важно для
постановки точного диагноза.
Из-за высокой стоимости контрастных препаратов (для проведения УЗИ с
контрастированием в РФ применяются только импортные контрасты) не каждый
пациент может позволить себе данную процедуру. По статистике gidmed каждый
8-10 пациент отказывается от диагностики заболевания по причине финансовой
несостоятельности [50]. Выделяют несколько классов эхо контрастные препараты
(ЭКП). Препарат первого поколения «Эховист» представляет собой простые
микропузырьки газа с галактозой, обладает коротким временем визуализации.
Препарат второго поколения «Левовист» содержит микропузырьки газа с
галактозой, стабилизированные пальмитиновой кислотой. Препарат третьего
поколения
«Соновью»
является
гетерогенной
фосфолипидной
системой,
содержащей микропузырьки газа – гексафторида серы, стабилизированные
пальмитиновой кислотой [17]. Существенным моментом в визуализации
исследуемого
субстрата
при
использовании
ЭКП
является
время
контрастирования, для ЭКП первого и второго поколения это составило не более
26
2 мин, что не всегда достаточно для выявления изменений исследуемого
субстрата. Более длительное время контрастирования было получено у ЭКП
третьего поколения, которое составило не менее 6 мин.
Кроме перечисленных выше наиболее распространенных препаратов
существует большое количество образцов контрастных средств, представляющих
собой
микрокапсулы
альбумина
человека,
липидные
микросферы,
микропузырьки, заключенные в желатин, микропузырьки, стабилизированные
микрокристаллами галактозы [15].
1.3 Липосомальные биоконтейнеры
Название липосомы происходит от двух греческих слов: «Липос», что
означает «жир», а «Сома» означает тело.
Липосомы были впервые описаны британским гематологом д-ром Bangham
в 1964 году, в Институте в Кембридже. Они были обнаружены, когда Bangham
тестировал новый электронный микроскоп путем добавления отрицательного
пятна для сухих фосфолипидов [10]. Липосома – крошечный пузырь (везикула),
выполненный из того же материала, что и клеточная мембрана. Липосомы могут
быть заполнены лекарственными веществами и использоваться как средство
доставки при лечении рака и других заболеваний. Мембраны обычно состоят из
фосфолипидов, обладающих амфотерными свойствами.
Как правило, амфифильность молекул фосфолипидов, связана с наличием в
их структуре гидрофильной полярной головкой, сродной к воде, и неполярных
углеводородных
цепей,
имеющих
водоотталкивающий
характер.
Данные
различия частей внутри одной молекулы позволяет собираться в липидном
бислое, где гидрофобные цепи обращены к друг другу, создавая неполярную
область мембраны, а полярные головки находятся на поверхности и защищают
углеводородные цепи от водной среды (рисунок 3).
27
Рисунок 3 – Структура липосомальной частицы
Свойства липосом и их поведение определяются прежде всего наличием у
них замкнутой мембранной оболочки. Несмотря на молекулярную толщину,
липидный бислой (бимолекулярный липидный слой) отличается исключительной
механической прочностью и гибкостью. Благодаря этому липосомы сохраняют
целостность при различных повреждающих воздействиях, а их мембрана обладает
способностью к самозалечиванию возникающих в ней структурных дефектов.
Вместе с тем гибкость бислоя и его текучесть придают липосомам высокую
пластичность.
Данная структура частиц позволяет включать внутрь лекарственные
препараты, витамины, генетический материал. Включение специфичных белков в
структуру липидной пленки, позволяет достигнуть адресность к органам
мишеням, за счет узнавания при прохождении гистогематического барьера,
мембраны клеток и субклеточных структур.
В случае одного двухслойного инкапсулирования водного ядра, говорят о
малых или больших однослойных везикулах, тогда как в случае многих
28
концентрических бислоев речь идет о больших многослойных везикулах [29].
Липосомы используются для доставки лекарств из-за их уникальных свойств.
Фактически, они могут содержать широкий спектр гидрофильных и
гидрофобных диагностических или терапевтических агентов, обеспечивающих
больший объем полезной нагрузки на одну частицу и защиту инкапсулированных
агентов из метаболических процессов. Один из основных недостатки обычных
липосом были быстрыми клиренс из крови из-за адсорбции плазмы белки.
Решением этой проблемы стало создание «формы второго поколения», которые
называются стерически стабилизированные липосомами. Они доказали имеют
благоприятные фармакокинетические свойства in vivo из-за формирования на
поверхности
гидрофильного
углевода или
полимера, обычно
липидного
производного полиэтиленгликоля (ПЭГ), что делает их привлекательные
транспортные средства для доставки противораковых препаратов [27].
Кроме того, композиция липидного бислоя может быть модулирована для
получения других желательных свойств, включая пролонгированные периоды
полураспада
циркуляции
(стелс-липосомы).
Они
способны
образовывать
комплекс с нуклеиновыми кислотами для опосредованного доставки генов или
генетическое
регулирование
и
способны
поставлять
инкапсулированные
содержимое цитозоля через эндосомальный/лизосомальный путь [2]. Липосомы
обладают несколькими свойствами которые могут быть полезны в различных
приложениях. Самые ранние варианты практического применения, особенно в
области доставки лекарств, появилась в 1970-х годах.
Уже долгое время одной из основных целей разработки лекарственных
препаратов
является
создание
лекарств,
принимаемых
перорально
и
всасывающихся в кровоток максимально непосредственно и быстро.
Однако, многие лекарства расщепляются в печени до поступления в
системный кровоток. В результате пресистемного метаболизма, протекающего в
результате того, что введённые перорально лекарства проходят через кишечник и
печень (где происходит их разрушение), прежде чем попадают в кровь.
29
Использование липосомальных наночастиц при пероральном применении
позволяет лекарствам, принимаемым перорально, идти в обход печени. Эта
технология использует естественную нано-систему транспорта липидов, которая
обеспечивает доставку лекарства из кишечника через лимфатическую систему
прямо в кровоток [43, 44]. Технология может потенциально применяться для
целого ряда препаратов, которые затруднительно провести в кровообращение
через печень, а также для лекарственных средств, нацеленных на лимфатическую
систему.
Нацеленная именно на всасывание препарата в лимфатическую систему (а
не в кровь, поступающую в воротную вену печени), эта технология модифицирует
лекарства так, что они химически имитируют жиры пищи. В отличие от
большинства компонентов пищи, жиры после всасывания собираются в липидные
нано-капли или включаются в липопротеины и транспортируются в кровоток
через лимфу.
Лимфа попадает непосредственно в кровь и не проходит через печень. Это
может
значительно
повысить
эффективность
препаратов
с
проблемой
пресистемного метаболизма, таких как тестостерон. Во-вторых, лимфатическая
система является ключевой частью иммунной системы, она помогает бороться с
болезнями и регулирует иммунный ответ на инфекцию. Следовательно, доставка
лекарства непосредственно в лимфу может повысить эффективность препаратов,
предназначенных для стимуляции иммунной системы, например, для борьбы с
раком, или же подавлять иммунную систему при аутоиммунных заболеваниях,
таких как болезнь Крона [45].
Применение
липосом
обеспечивает прочную
основу
в
разработке
различных коммерческих продуктов для лечения заболеваний путем таргентной
доставки
лекарственных
веществ.
Промышленное
применение
включает
использование липосом в качестве средств доставки лекарств транспортные
средства
в
медицине,
как
адъюванты
при
вакцинации,
усилители
сигнала/носителей в медицинской диагностике и аналитической биохимии,
30
солюбилизаторы для различных ингредиентов, а также матрица поддержки для
различных ингредиентов и усилителей проникновения в косметику [9, 31, 33].
Благодаря высокому сродству к биологическим мембранам, липосомы
имеют ряд преимуществ, таких как, высокая биодоступность и биоразлагаемость,
широкий
спектр
включаемых
лекарственных
веществ,
адресность,
пролонгированное действие. Включение таких препаратов в липосомы может
значительно повысить их терапевтическую эффективность, поскольку, с одной
стороны, препарат, находящийся в липосоме, защищен ее мембраной от действия
неблагоприятных факторов, а с другой – та же мембрана не позволяет токсичному
препарату превысить допустимую концентрацию в биологических жидкостях
организма. Липосома в данном случае выполняет роль хранилища, из которого
препарат высвобождается постепенно, в нужных дозах и в течение требуемого
промежутка времени.
Процесс взаимодействия липосомальной частицы и клетки зависит от
состава и характера липидного слоя, соответственно, может происходить поразному. Везикула может адсорбироваться с дельнейшим поглощением клеткой,
(рисунок
4)
в
процессе
эндоцитоза
происходит
высвобождение
инкапсулированных веществ в полость клетки. Благодаря сродству липидного
состава с составом мембраны клетки возможно их слияние, что влияет на
функциональные качества мембран клеток, увеличение или уменьшение каналов
между ними.
31
Рисунок 4 – Компьютерная модель процесса слияния липосомальной и
клеточной мембраны
Особый интерес представляет оральный таргентный перенос препаратов
белковой природы, поскольку их структура без дополнительной защиты быстро
разрушается в желудке [11, 14].
Например, для того чтобы достичь рецептора на клеточной мембране,
липосома с инсулином должна противостоять крайним значениям рН среды в
ЖКТ, преодолеть стенку слизистой кишки или желудка и сохранить свою
структуру в кровяном русле или в токе лимфы. На всех этапах сложного пути
именно природа липидов определяет характер взаимодействия липосом с
окружающей средой.
Защищенность
ЛВ
от
разрушения
ферментами
определяется
эффективностью встраивания инсулина, зависящей от метода приготовления
липосом. Например, липосомы, полученные по методу обращенных фаз (упариванием органического растворителя из эмульсии «липид — вода»), в наибольшей
степени предохраняют инсулин от разрушения [3]. Уменьшение размеров
последних
от
2000
протеолитическими
до
100
ферментами.
нм
способствует
Эффективная
разрушению
защита
инсулина
инсулина
от
32
протеолитического действия проназы наблюдается при введении в липосомы
холестерина. Доведение холестерина в смеси липидов до соотношения 1:1 в 3 раза
увеличивает устойчивость к воздействию желчи. Липосомы, с фазовым
переходом выше температуры тела, способны сорбироваться на клеточной
мембране и тем самым могут быть выведены из зоны действия протеаз. Такие
липосомы эффективно поглощаются клеткой путем клеточного эндоцитоза.
Липосомы с фазовым переходом ниже, а так же те, у которых фазовый переход
выше температуры тела связываются с трипсинчувствительными центрами на
поверхности клеток, содержимое первых при этом выходит наружу, а вторых
остаются интактными. Оба типа липосом контактируют с одними и теми же или
близко расположенными участками клеточной поверхности, с разным характером
взаимодействия. Липосомы с фазовым переходом выше температуры тела в
физиологических условиях при 37°С проникают через кишечную стенку в
интактном виде и попадают к кровоток через капиляры [3].
В кровяном русле липосомы могут дестабилизироваться компонентами
крови — альбумином, липопротеинами низкой плотности и т. д. На стабильность
липосом оказывает влияние характер их состав и свойства поверхности.
1.4 Методы контроля доставки лекарственных препаратов
Необходимость следить за эффективностью проникновения носителей
лекарственных средств должна быть учтена во время развития целенаправленной
доставки лекарств. Проникновение лекарств контролируется в доклинических
исследованиях с использованием инвазивных методов и неинвазивных методов.
В настоящее время неинвазивные методы оптической диагностики,
основанные на принципах спектрофотометрии и флуоресцентного анализа,
широко используются в медицине, фармакологии, биологии и химии. Оптическая
диагностика и методы на основе фотоники представляют особый интерес для
разработки новых лекарств из-за их низкой стоимости, универсальности и
высокой чувствительности [5]. Разработка и тестирование нового препарата
включает
изучение
его
метаболизма,
что
требует
сочетания
высокой
33
чувствительности, работоспособности и простоты автоматизации. Таким образом,
представляет интерес разработка быстрых методов мониторинга различных
биомедицинских и биотехнологических процессов. Оптическая когерентная
томография (ОКТ) эффективно использовалась для оценки эффективности
транскутанной доставки вакцин.
В некоторых случаях для оценки кинетики
высвобождения лекарственного средства может использоваться спектроскопия
ближнего
инфракрасного
излучения
(NIRS)
[6].
Кроме
того,
NIRS
и
спектроскопия комбинационного рассеяния света могут использоваться для
получения одного спектра, который обеспечивает универсальную и многомерную
информацию о лекарственном средстве, включая его физические, химические и
количественные
визуализации
характеристики
успешно
[7].
используются
Кроме
того,
приборы
для
изучения
доставки
оптической
лекарств.
Прижизненная микроскопия (IVM) позволяет неинвазивный непрерывный
мониторинг
движения
препарата
в
организме.
Фотоакустическая
(PA)
визуализация используется для имитации транспорта лекарств и оценки
накопления веществ в органе или опухолевой ткани, что особенно важно во время
фотодинамической терапии (ФДТ) [8-9]. Однако эти методы имеют ряд
недостатков, которые препятствуют их повсеместному использованию в
биотехнологических
процессах
фармацевтической
промышленности.
К
некоторым недостаткам относятся трудности с выполнением процедуры,
длительность измерений, потребность в высококвалифицированном техническом
персонале для запуска оборудования и высокая стоимость оборудования.
Лазерная флуоресцентная спектроскопия (ЛФС), используемая в биофотонике,
лишена многих из этих недостатков и может достаточно автоматизировать
измерения по большому числу объектов исследования.
ЛФС обладает значительным потенциалом в открытии лекарственных
средств не только при разработке новой лекарственной формулы, но и в
доклинических и клинических испытаниях. В том числе ЛФС может найти
применение и при изучении свойств наноконтейнеров, которые все чаще
34
используются для доставки лекарств нового поколения. Одним из типов
наноразмерной системы доставки лекарств являются липосомы [10-12].
Выводы по 1 главе
Липосомы представляют собой везикулы, состоящие из одной или
нескольких фосфолипидных мембран, внутри липосом находится водное
пространство.
В
водное
пространство
липосом
могут
быть
включены
водорастворимые препараты, а в липидный бислой - гидрофобные. Липосомы
способны
транспортировать лекарственное средство,
снижать
его
общетоксическое действие, увеличивать терапевтический эффект. Основываясь
на этих свойствах, липосомальные системы доставки препаратов могут
обусловливать фармакологическое преимущество перед свободными формами
лекарств.
Применение
липосомальных
частиц,
способствует
увеличению
эффективности прохождения транспортируемого вещества в кровеносную
систему без возникновения нежелательных реакций для организма. Также была
доказана принципиальная возможность использования липосом в качестве
переносчика
лекарственных
препаратов,
обладающих
цитотоксическим
действием. Исходя из полученных результатов можно сделать вывод, что
липосомальные
препараты
могут
найти
перспективное
применение
в
антимикробной, противовирусной и противоопухолевой терапии.
Одним из перспективных подходов является использование иммунолипосом
или других лиганд-связанных липосом, которые характеризуются интеграцией с
молекулярной мишенью и лекарственной доставкой. Эти агенты могут вызывать
лиганд-опосредованную интернализацию и внутриклеточную доставку лекарства,
таким образом, добиваясь значительной селекции и эффективности доставки к
опухолевой клетке, включая резистентные опухоли. В настоящее время
липосомальные частицы в ряде случаев могут значительно уменьшать механизмы
резистентности, основанной, в основном, на изменении фармакокинетики,
биодоступности и токсичности, по сравнению со свободным лекарством.
35
ГЛАВА 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные исследования проводили в условиях
лаборатории
кафедры «Промышленной химии и промышленной биотехнологии», так же
научно-технологического
государственного
центра
бюджетного
Биомедицинская
фотоника
образовательного
Федерального
учреждения
высшего
образования «Орловского государственный университет им. И.С. Тургенеева» и
проблемной
научно-исследовательской
лаборатории
«Диагностические
исследования и малоинвазивные технологии» Смоленского государственного
медицинского университета.
2.1 Объекты исследования
В качестве объектов исследования в работе были использованы:
–
лецитин из подсолнечника (производитель – ООО «ЮВИКС-ФАРМ»,
г. Краснодар);
– холестерин, выделенный из мозга крупно рогатого скота;
– ПЭГ 400 (квалификация ч.д.а., производитель НеваРеактив);
– флуоресцентный краситель эозин-Y (динатриевая соль 2,4,5,7тетрабромфлуоресцеина);
– хлороформ, (квалификация ч.д.а., производитель НеваРеактив);
– раствор 0,9 % NaCl (изотонический раствор);
– крысы линии Wistar (СОП ЦДИ ЗАО «Ретиноиды»);
– Золетил 100 (Vibrac, Франция);
– Микротом.
36
2.2 Методы исследования
Рисунок 5 – Схема экспериментальных исследований
37
2.2.1 Выделение холестерина
Для выделения холестерина был использован мозг крупнорогатого скота.
Измельченный
материал
многократно
экстрагировали
ацетоном
в
фильтровальной установке патронного вида (рисунок 6) с дальнейшей вакуумной
отгонкой растворителя. Остаток подвергали обработке этиловым спиртом,
охлаждению
в
морозильной
камере
и
последующим
выделением
кристаллического холестерина декантированием жидкости. Охлаждение над
осадочной жидкости проводили многократно, до прекращения выпадением
кристаллического холестерина, что позволило увеличить выход вещества
Рисунок 6 – Экспериментальные установки для выделения холестерина на
основе экстрактора Сокслета
Кристалический осадок после высушивали при комнатной температуре
образовывал кристаллы белого цвета, для идентификации которых
проведена качественная реакция Шиффа на холестерин.
была
38
2.2.2 Синтез липосомальных частиц
Навеску лецитина 0,0328 г растворяли в 2 мл хлороформа, с последующем
добавлением 0,0072 г холестерина. Для предотвращения процессов окисления
липидного состава, добавляли антиоксидант в количестве 0,02 % от общей массы
липосом. В качестве антиоксиданта был использован раствор α-токоферол
ацетата. Полученную дисперсию выдерживали до полного растворения веществ и
переносили в круглодонную колбу. После полного растворения проводили
выпаривание хлороформа на роторном испарителе при t = 400С, при пониженном
давлении, создаваемым вакуумным насосом, до полного удаления растворителя.
затем колбу выдерживали при пониженном давлении сутки. После окончания
выпаривания в круглодонной колбе образуется тонкая липидная пленка.
Для получения липосом, растворяли липидную пленку в 5,4 мл
изотонического раствора до появления белой эмульсии. В данных условиях
происходит спонтанное образование многослойных везикул. Для процесса
пассивной
инкапсуляции
лекарственного
препарата,
его
добавляют
к
изотоническому раствору и производли перемешивание. Максимальная загрузка
достигается,
при
длительной
гидратации
липида
на
низких
оборотах
перемешивания, чем при максимальных оборотах, но коротком времени.
Отделение не включённого материала осуществляется центрифугированием, с
дальнейшим декантированием, а осадок ресуспензировали в физиологическом
растворе.
2.2.3 Включение флуоресцентного красителя в липосомальную частицу
Липосомы были получены с использованием метода обращения фаз.
Флуоресцентный
краситель
эозин-Y
(динатриевая
соль
2,4,5,7-
тетрабромфлуоресцеина) с максимальной собственной флуоресценцией в области
520 ± 5 нм инкапсулировали внутри липосом посредством пассивного включения
во время гидратации пленки (рисунок 7).
39
Рисунок 7 – Экспериментальная установка для получения липосомальных
частиц методом обращения фаз
Для пустых липосом без инкапсулированного красителя липидную пленку
гидратировали стерильным физиологическим раствором. Неиспользованный
эозин-Y удаляли из суспензии липосом, используя диализ против солевого
раствора [27].
Выбор
оптимального
красителя
для
флуоресцентной
диагностики
проводили в соответствии с рядом требований. Красителю должны быть
свойственны: высокая селективность накопления в клетках и тканях (по
сравнению с нормальными), высокий квантовый выход флуоресценции, быстрое
выведение из организма, отсутствие побочных эффектов на ткани и организм в
целом. Не должен быть высоким квантовый выход фотоиндуцированной
генерации синглетного кислорода или каких-либо других цитотоксических
агентов в отличие от противоположного требования к красителям, используемым
для
фотодинамической
терапии
опухолей.
40
В настоящее время в лабораториях, разрабатывающих методику лазерной
флуоресцентной диагностики, чаще всего используются в качестве красителей
гематопорфирин (ГП), производные гематопорфирина (ПГП) эозин (динатриевая
соль флюоресцеина). В то время как первые два красителя используются также и
для фотодинамической терапии, эозин оказывается более подходящим именно для
диагностики.
Так,
он
обеспечивает
контрастность
наблюдения
в
свете
флуоресценции на фоне нормальных тканей не менее 50:1 по сравнению с 5:1 у
ПГП [30].
2.2.4 Контроль флуоресцеин меченых липосом флуоресцентной
спектроскопии
Для
проведения
флуоресцентный
канал
флуоресцентной
с
зондом
спектроскопии
волоконной
оптики,
использовался
последовательно
соединенным с многофункциональной лазерной неинвазивной диагностической
лазерной системой «LAKK-M» (ООО «НПП« ЛАЗМА », Москва, Россия)
(рисунок 8) [24]. Система обеспечивает многоволновое возбуждение, детектирует
излучение и обрабатывает сигнал флуоресценции. Его источники света включают
светодиод M365F1 (Thorlabs, Inc., Newton, NJ, USA) (длина волны = 365 нм,
мощность = 1,5 мВт) и полупроводниковый лазер с квантовой точкой (QD) LP450SF15 (Thorlabs) (длина волны = 450 нм, Мощность = 3,5 мВт), который имеет
высокую эффективность и низкий уровень шума относительной интенсивности.
Вышеупомянутые
силы
возбуждения
флуоресценции
предусмотрены
на
наконечнике волоконного зонда, который индуцирует поток возбуждающего
света в ткани не более 0,16 Вт/м2 для 365 нм и 0,37 Вт/м2 для 450 нм. Спектрометр
представлял собой полихроматор с дифракционной решеткой, а в качестве
детектора использовалась линия CCD (TCD1304AP, Toshiba, Токио, Япония) [6,
28]
41
a)
б)
Рисунок 8 – Схематическое изображение установки, используемой для
исследования переноса флуоресцеинмеченых липосомальных наночастиц у
мышей с использованием лазерной системы «LAKK-M»: а) общий вид
экспериментальной установки; б) оптоволоконный зонд.
Экспериментальные исследования соответствовали Директиве ЕС 2010/63 /
ЕС, которая определяет гуманное отношение к животным и относится к
принципам Three Rs (замена, сокращение и уточнение). Все исследования были
одобрены Этическим комитетом Орловского государственного университета.
Модельными животными были клинически здоровые мыши из линии CD-1,
42
которые были разделены на четыре группы с использованием аналогового метода.
Вне эксперимента животные получали одну и ту же пищу. Первая группа (n = 5)
была контрольной и не получала никаких лекарств во время эксперимента. Вторая
группа (n = 5) получала липосомы без красителя, третья группа (n = 5) получала
чистый краситель без липосом, а четвертая группа (n = 5) получала липосомы с
включенным флуоресцентным красителем. Концентрация эозина-Y в рационе
групп 3 и 4 составляла 5 мг / кг массы тела.
Измерения флуоресценции проводились на проксимальном конце хвоста.
Площадь исследуемой кожи перед каждым измерением обезжиривали 96%
раствором этанола. Волоконно-оптический зонд для измерения флуоресценции
помещали
вертикально
к
поверхности
хвоста.
Для
уменьшения
фотообесцвечивания ткань подвергали воздействию оптического излучения не
более 2 секунд за измерение. Перед введением препарата измеряли фоновую
флуоресценцию на двух длинах волн возбуждения 365 и 450 нм. Спектры
флуоресценции на этих длинах волн регистрировали во время введения и каждые
15 мин в течение 2 часов.
2.2.5 Включение полиэтиленгликоля в состав липосомальной частицы
Липосомы были получены по п. 2.2.2 с добавлением ПЭГ 400 на в состав
липидной
пленки,
на
этапе
растворения
компонентов
в
органическом
растворители.
2.2.6 Включение биосовместимого газа в липосомальную частицу
Липосомальные частицы были получены по методике, описанной в п 2.2.2.
Включение газа в частицы осуществлялось с помощью пропускания
нанообъемов газа через базовую эмульсионную систему в условиях воздействия
ультразвуковых волн. Диспергация ультразвуком позволила создавать частицы
необходимого размера от 1-5 мкм.
2.2.7 Определение степени контрастности
43
Был использован метод ультразвуковой диагностики на аппарате Esaote
MyLab 50, с частотой от 1-8 МГц.
Для имитации сосудов были использованы тонкостенные латексные трубки,
по которым пропускали изотонический раствор со скоростью от 0 до 20 см/с
(рисунок 9).
Рисунок 9 – Фантомная установка сосудов для ультразвуковой диагностики
Введение липосом в модельную систему позволило оценить качество
предлагаемых частиц с позиций повышения эхогенности в просвете трубки.
2.2.8 Экспериментальные животные
Экспериментальные исследования проводились на клинически здоровых
самцах крыс Wistar в возрасте 5 месяцев (n = 6 в группе).
44
Крысы были получены из ФГБУН НЦБМТ ФМБА России (филиал
«Андреевка»). До перевода животных в чистую зону вивария и начала
эксперимента животных содержали в карантине в течение 14 дней. При
помещении в карантин ветврач проводил первичную оценку состояния
прибывших животных с занесением результатов осмотра в соответствующий акт,
а также осуществлял ежедневный осмотр животных. Непосредственно перед
переводом в чистую зону и формированием экспериментальных групп ветврач
проводил клинический осмотр животных, после чего он проводил передачу
животных в эксперимент.
В исследование были отобраны животные без признаков отклонений в
состоянии здоровья так, чтобы средняя масса тела животных одного пола
статистически не отличалась между группами. Каждому животному был присвоен
индивидуальный номер.
Основные правила содержания и ухода соответствовали нормативам,
изложенным в санитарных правилах по устройству, оборудованию и содержанию
экспериментально-биологических клиник (вивариев) и в положении-руководстве
«Лабораторные животные». Все процедуры по рутинному уходу за животными
выполняли в соответствии с СОП ЦДИ ЗАО «Ретиноиды».
2.2.9 Приготовление препаратов печени крыс
Материал печени забран у самцов крыс линии Wistar. Кусочки печени
опытных крыс фиксировали в 10 %-ном нейтральном формалине и заливали в
парафиновые блоки по стандартной методике, из которых затем с помощью
микротома приготавливали срезы, толщиной 5–7 мкм.
Препараты для микроскопии готовили на предметных стеклах.
45
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ АНАЛИЗ
3.1 Получение липосомальных частиц
В процессе отработки технологии получения липосомальных частиц были
получены сферические везикулы с липидной оболочкой. Дальнейшее определение
размера и контроль качества синтезируемых липосом было проведено методом
оптического микрокопирования на биомедицинском микроскопе Биомед-6, при
увеличении х1200. Размер частиц по предлагаемой технологии составляет до 8 мкм
(рисунок 10).
Рисунок 10 – Микроскопия липосомальных частиц
Данная
методика
инкапсулировать
позволяет
широкий
спектр
нам
получить
биологически
липосомы
активных
способные
веществ
для
перорального и трансдермального применения. Подбор фосфолипидного состава
и фиксирование антител на поверхности липидного бислоя, создания заряда на
поверхности
липосомального
контейнера
позволяет
преодолевать
пищеварительные и клеточные барьеры при доставке лекарственного препарата.
46
3.2 Проникновение флуоресцеин меченых липосом в кровоток при
парентеральном введение
Анализ устойчивости к агрессивной пищеварительной среде, и уровень
биодоступности планировали проводить на модельных системах (in vitro)
и
живых системах (in vivo). Один из способов верификации заключается в
инкапсулировании флуоресцентных красителей с дальнейшем выявлением при
прохождение модельных систем. Эффективность проникновения липосомальных
частиц в кровеносное русло при пероральном применении оценивались методом
флуоресцентной спектроскопии [24].
Указанная система измерения ранее использовалась для изучения тканевого
метаболизма путем регистрации флуоресценции различных биомаркеров кожи.
Эти исследования показали, что при зондировании биологических тканей
ультрафиолетовым светом (например, 365 нм) максимум флуоресцентного
излучения эндогенного никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) находился в
диапазоне длин волн 450 470 нм. При возбуждении синим светом (например, 430450 нм) пик флуоресценции флавинов находился в диапазоне около 510 520 нм.
Таким образом, глубина зондирования этой системы достаточна для чрескожных
измерений на животных моделях [25].
Основными эндогенными флуоресцентными компонентами кожи мыши
являются коллаген и эластин, а также (в меньшей степени) NADH, флавинадениндинуклеотид (FAD), порфирины и липофусцин [6, 21, 32]. Большинство из
этих веществ флуоресцируют при 365 и 450 нм, тогда как эозин-Y и флуоресцеин
слабо поглощают 365 нм и сильно поглощают и флуоресцируют при 450 нм.
Измерения, полученные с использованием длины волны возбуждения 365 нм, не
показали статистически значимого различия в интенсивности флуоресценции для
всех четырех групп, вероятно, из-за низкого проникновения сигнала УФ
возбуждения через кожу, где был помещен зонд.
Сглаженные и усредненные спектры для длины волны возбуждения 450 нм,
полученные одновременно (перед введением и через 30, 60, 90 минут после
введения частиц) для каждой группы представлены на рисунке 6. Эти спектры
47
показывают статистически значимое увеличение интенсивности флуоресценции В
диапазоне длин волн 480 700 нм в группе мышей, которые получали липосомы с
инкапсулированным флуоресцентным красителем. В этой группе зафексировано
выраженное увеличение (140% от исходного уровня) в средней пиковой
интенсивности флуоресценции от 260 ± 39 до 420 ± 36 а.е. через 30 мин после
введения липосомы (рисунок 1г). Это увеличение интенсивности флуоресценции
было намного выше, чем для группы мышей, получавших чистый краситель, то
есть от 283 ± 42 до 351 ± 23 а.е. (которая не превышает 110% от исходного
уровня) в те же моменты времени (рис. 11д). Мыши, которые получали пустые
липосомы и контрольная группа, не демонстрировали статистически значимых
изменений интенсивности флуоресценции (рисунок 11а и 11б). В таблице 1
представлены усредненные значения максимумов спектров флуоресценции для
четырех групп мышей в течение семи измерений.
Таблица 1 – Максимумы интенсивности флуоресценции четырех групп мышей
Интенсивность флуоресценции (a.е.)
Время
(мин)
Контрольная
группа
Группа
получавшая
липосомы
0
15
259 ± 53
261 ± 31
286 ± 41
286 ± 53
Группа
получавшая
липосомы
красителем
260 ± 39
282 ± 39
30
45
60
75
90
250 ± 41
251 ± 19
258 ± 21
252 ± 41
249 ± 41
287 ± 31
307 ± 41
290 ± 19
259 ± 21
251 ± 41
420 ± 36
360 ± 31
275 ± 22
290 ± 42
289 ± 42
Группа
получавшая
с чистый
краситель
283 ± 42
298 ± 25
351 ± 23
333 ± 39
325 ± 44
270 ± 25
260 ± 41
48
а)
б)
49
в)
г)
Рисунок 11 – Спектры флуоресценции для длины волны возбуждения 450
нм (сглаженные и усредненные для одного и того же периода времени для каждой
группы): (a) контрольная группа; (б) группу, которая получала пустые липосомы;
(в) группу, которая получала липосомы с включенным флуоресцентным
красителем; (г) группа, получившая чистый флуоресцентный краситель
50
Изменение сигнала флуоресценции как функция времени представлено на
рисунке 12.
а)
б)
Рисунок 12 – Флуоресценция как функция времени: (а) контрольная группа
и группа, которые получали пустые липосомы; (б) группу, которая получала
липосомы с включенным флуоресцентным красителем и группой, которая
получала флуоресцентный краситель
Была проведена микроскопия препаратов печени задействованных в
эксперименте животных. Так же накопление флуоресцентного красителя в
51
печени, оценивалось
на установке высокоскоростной капилляроскопии с
интенсивностью излучения 450 нм (рисунок 12).
Рисунок 13 – Снимок препарата печени животного, получавшего эозин, на
установке высокоскоростной капилляроскопии при воздействии длины волны 450
нм
Рисунок 14 – Снимок препарата печени животного, контрольной группы, на
установке высокоскоростной капилляроскопии при воздействии длины волны 450
нм
На снимке видны пятна свечения эозина, накопленного печению введения
красителя в организм.
52
3.3 Влияние включения ПЭГ на транспортные свойства
липосомальных частиц
Используя в этой работе метод флуоресцентной спектроскопии, смогли
оценить эффективность проникновения липосомы с различным химическим
составом в кровь при пероральном введении. Сначала был выполнен подбор
подходящей длины волны для исследования. При измерении на 365 нам длины
волны воздействия не наблюдалось статистически значимых изменений. Это
можно объяснить низким уровнем проникновения лазера в наполненные
кровеносными сосудами слоями крови. Статистически значимые данные были
получены в работе, когда был использован лазер с длиной волной 450 нам.
Результаты были представлены, как среднее значение группы ± стандартное
отклонение (в произвольных единицах).
Липосомы без включения ПЭГ не приводили к статистически значимым
изменениям интенсивности флуоресценции (рис.15а). Это может быть связано с
разрушением частиц под воздействием агрессивной среды желудочно-кишечного
тракта и высвобождением красителя в просвете кишечника. Увеличение средней
пиковой интенсивности флуоресценции от 240 ± 39 до 425 ± 25 а.е. наблюдалось.
В группе мышей, которые получали липосомы частицы с ПЭГ (рис.15б).
После введения красителя через 30 минут наблюдалась максимальная
интенсивность флюоресценции с дальнейшим падением во времени, что связанно
с выведением из организма.
53
а)
б)
Рисунок 15 – Спектры флуоресценции группы, получавшей липосомы без
ПЭГ (а), и группа, получавшая липосомы с ПЭГ (б)
54
Увеличение количества флуоресцентного красителя в потоке крови
демонстрирует
роль
использованного
обусловлено проникновением
ПЭГ-
400
в
липосомах,
которое
частиц через слизистую оболочку и кишечные
эпителии. Это делает адгезию липосом к слизистой оболочке более интенсивный,
что может быть связано с уменьшением электростатического отталкивания в
системе
«липосомы-слизистая
оболочка».
Слизистые
волокна
кишечника
содержат гликозилированные и отрицательно заряженные области, в то же время
лецитин подсолнечника, который использовался для изготовления липосом,
содержит значительное количество (по сравнению с фосфатидилхолином)
отрицательно заряженных фосфатидной кислоты и фосфатидилинозитола. Таким
образом, липосомы без ПЭГ могут отталкиваться слизистой оболочкой. Уровень
ПЭГ маскирует поверхностный заряд наночастиц. Кроме того, ПЭГ может
предотвратить агрегацию наночастиц путем образования защитного слоя воды.
Это делает липосомы недостаточными для проникновения через плотную
пористую структуру слизи. В результате повышается эффективность захвата
липосом из просвета кишечника. С другой стороны, ПЭГ имеет молекулярный
размер, которого был достаточный для сильного связывания и удерживания
липосом в слизи. Из-за относительно низкого стерического взаимодействия и
гидрофобные силы с гидрофобных доменами молекул муцина, ПЭГилированные
липосомы характеризуются высокой диффузией через слизистую оболочку и
способностью взаимодействия с клетками эпителия кишечника.
ПЭГ-покрытие на липидном слое позволяло липосомальным частицам
проникать в слой кишечной слизи [13]. Результаты наших экспериментов
показывают, что липосомальные частицы могут повысить эффективность
переноса флуоресцентного красителя в кровоток через желудочно-кишечный
тракт после перорального введения.
55
3.3 Модель воздействия ультразвуковой волны на газосодержащие
газсодержащие липосомальные частицы
Ультразвук представляет собой самый безопасный, быстрый и наименее
дорогостоящий
метод
сканирования
среди
многих
видов
медицинских
диагностик. По сравнению с такими методами, как магнитно-резонансная
томография,
качество
изображения
часто
уступает,
поэтому
появляется
необходимость улучшения контрастности изображения. В последние 20-30 лет
газосодержащие липосомальные частицы стали применяться, как наиболее
эффективный тип веществ для контрастирования в ультразвуковой радиографии.
Эффективность
газосодержащих
липосомальных
частиц
обусловлена
их
динамическим ответом на применение ультразвуковой волны. В результате
воздействия ультразвука они совершают объемные колебания (пульсации) и
следовательно, рассеивают гораздо больше энергии, чем жесткие сферы такого же
размера.
Эластичность
использовано
моделируется
уравнение
с
учетом
Рэлея-Плессето,
вязкого
описывающее
затухания.
Было
динамику
таких
газосодержащих частиц [4, 23].
Уравнение доказывает, что поверхностный слой подвержен деформации,
которую образует давление Лапласа и тем самым стабилизирует пузырек от
растворения. Было представлено дисперсионное соотношение, описывающее
распространение линейных волн давления в жидкостях, содержащих суспензии
этих газосодержащих частиц. Было обнаружено, что резонансные частоты
отдельных частиц имеют тенденцию к увеличению по мере увеличения модуля
жесткости; демпфирование, обеспечиваемое вязкостью оболочки, доминирует в
тепловых эффектах для радиусов частиц менее ~ 10 мкм; коэффициент затухания
в пузырьковой жидкости уменьшается по мере увеличения жесткости или
вязкости поверхностного слоя; инкапсулированные пузырьки с жесткостью
оболочки более ~ 85 МПа обеспечивают более полное деление рассеяния на
единицу затухания в нижнем диапазоне биомедицинских частот, чем свободные
частицы эквивалентного размера.
56
Было выявлена зависимость резонансного ответа от диаметра пузырька
(рисунок 16)[4].
Рисунок 16 – Зависимость резонансной частоты от диаметра
газосодержащей частицы
Современные пульсовые ультразвуковые аппараты используют принцип
суммации сигналов. Импульсы от тканей имеют линейный характер, а от
газосодержащих частиц – нелинейный[16]. Частицы начинают пульсировать с
определенной резонансной частотой и выдают ответ, отличный от тканевого
(рисунок 17).
По средствам обработки, сигналы обрабатываются и на аппарате
отображаются нелинейные контрастные участки.
57
8
Рисунок 17 – Схематическое изображение принципа пульсового
сканирования
Было выявлено что для увеличение ультразвукового сигнала необходимо
воздействие импульса 1-50 Мгц, что соответствует диапазону резонансных
колебаний липосомальных частиц наполненных газом. Диаметр частиц должен
составлять до 8 мкм. Это так же необходимо для движения в кровеносной
системе, без риска развития легочной тромбоэмболии[15].
3.4 Контрастирующие свойства газосодержащих липосом
Экспериментальные липосомы, заполненные газом, были апробированы на
повышение степени эхогенности в режиме серой шкалы. На рисунке 18 видна
разница
в
степени
физиологическим
эхогенности
раствором,
а
двух
второй
полых
сосудов,
физиологическим
один
заполнен
раствором
с
газосодержащимися липосомами. Исследования проводились на аппарате Esaote
MyLab 50, с частотой от 1-8 МГц.
58
а)
Без частиц
С частицами
б)
Рисунок 18 – Изображение апробации липосомальных частиц: а) в
сагиттальной плоскости, б) поперечной плоскости
Повышение эхогенных свойств газосодержащих липосомальных частиц,
главным образом, достигается увеличением отношения «сигнал-шум» на записях
кривой кровотока. Наличие микрочастиц (пузырьки газа) в контрастном
препарате обеспечивает эхоусиливающий эффект путем рассеивания энергии
ультразвука в различных направлениях. Возрастание акустического обратного
59
рассеяния приводит к увеличению силы эхосигнала, регистрируемого от
кровотока и изображения тканей в режиме серой шкалы. Данное свойство
особенно актуально, когда детали исследуемой структуры не являются
достаточно отличимыми от окружающей ткани на ультразвуковом изображении.
Выводы по 3 главе
Результаты экспериментов позволяют сделать заключение о том, липосомы
способные инкапсулировать широкий спектр биологически активных веществ для
перорального и трансдермального применения.
При оценке влияния полиэтиленгликоля на транспортные способности
липосом, было выявлено, что липосомы без включения ПЭГ не приводили к
статистически значимым изменениям интенсивности флуоресценции. Это .может
быть связано с разрушением частиц под воздействием агрессивной среды
желудочно-кишечного
тракта
и
высвобождением
красителя
в
просвете
кишечника. ПЭГ-покрытие на липидном слое позволяло липосомальным
частицам проникать в слой кишечной слизи.
Было выявлено что для увеличение ультразвукового сигнала необходимо
воздействие импульса 1-50 Мгц, что соответствует диапазону резонансных
колебаний липосомальных частиц наполненных газом. Диаметр частиц должен
составлять до 8 мкм. Это так же необходимо для движения в кровеносной
системе, без риска развития легочной тромбоэмболии.
При апробации липосомальных частиц было получено повышение
эхокотрастности при ультразвуковой диагностики фантомной установки.
60
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Проведенные экспериментальные исследования позволили предположить,
что
приготовленные
липосомальные
частицы
позволяют
увеличить
эффективность прохождения транспортируемого вещества в кровеносную
систему через желудочно-кишечный тракт при пероральном применении. Также
было доказана принципиальная возможность проведения транскутатного in vivo и
in
situ
экспресс
контроля
проникновения
и
распределения,
описанных
липосомальных форм в организме по кровеносному руслу с помощью
флуоресцентной спектроскопии. Полученные результаты могут найти применение
в области диагностики периферического кровообращения, с помощью включения
контрастных веществ в липосомальные наночастицы.
ПЭГ значительно влияет на фармакокинетику липосом за счет увеличения
времени кровообращения в крови от 2 до 24 ч у грызунов (мышей и крыс) и более
45 ч у людей. Время циркуляции зависит от размера частиц и характеристик
полимерного покрытия. Однако это продление не наблюдалось в этом
исследовании. Интенсивность флуоресценции возвращалась к базовому уровню
через 60-90 мин после перорального введения.
При
использование
исследования
метода
эффективности
флуоресцентной
проникновения
спектроскопии
флуоресцентно
для
окрашенных
липосом в систему кровообращения при пероральном приеме наблюдалось
повышение интенсивности флуоресценции от 260 до 39 а.е. До введения до 420 ±
36 а.е. Через 30 мин после перорального введения флуоресцентного контрастного
вещества, инкапсулированного в липосомальные частицы. Для группы, которой
вводился чистый краситель, интенсивность флуоресценции слегка увеличилась с
283 ± 42 до 351 ± 23 а.е. Через 30 мин после введения. Была подтверждена
возможность экспресс-лазерных оптических методов in vivo и in situ для контроля
транскутанного
проникновения
и
распределения
липосомальных
форм,
предназначенных для перорального введения. Таким образом, в дополнение к уже
широко используемому LFS, он имеет потенциал для использования в новом
61
приложении. Результаты показывают, что он может быть использован для
чрескожных измерений in vivo и контролируемого введения лекарственного
средства. Вместо трудоемкого гистологического анализа ткани подход метод
флуоресцентной спектроскопии позволяет проводить неинвазивные измерения и
долгосрочные исследования на одном и том же животном, что может ускорить
процесс
открытия
флуоресцентной
лекарственного
спектроскопии
средства.
может
также
Использование
повысить
оптической
статистическую
значимость и достоверность клинических испытаний и сократить количество
животных и их страдания. Данные, полученные этим методом, могут
предоставить информацию о фармакодинамике и оптимальной дозировке
препарата. Результаты могут быть затем использованы для разработки новых
препаратов для чрескожной доставки и для высокопроизводительного скрининга,
которое происходит во время тестирования.
Создания сферических многослойных липосомальных структур было
осуществлено на базе фосфодилхолина (соевый лецитин), холестерина и
полиэтиленгликоля (ПЭГ-400) с включенным биосовместимым газом. В качестве
базовой технологии был использован метод обращения фаз, при котором
происходит контролируемое образование многослойных везикул. Физическим
принципом, лежащим в основе данной технологии, является повышение
коэффициента отражения ультразвука на градиенте акустического импеданса.
Градиент акустического импеданса был создан пассивной инкапсуляцией в
липосомальные формы биосовместимого газа. Данный метод помог получить
однородную
и
стабильную
от
коалесценции
суспензию.
Использование
наночастиц, заполненных гексафторидом серы, (в отличие от воздуха) позволяет
получить улучшенную устойчивость против повышения давления крови, которое
происходит в левом желудочке сердца во время систолы.
Использованные природные фосфолипиды (в отличие от полимерных
систем доставки лекарственных веществ) полностью биодеградируемы и
биосовместимы,
что
позволяет
избежать
гемодинамические, анафилактические реакции.
побочные эффекты
такие
как
62
В кровяном русле липосомы могут дестабилизироваться компонентами
крови — альбумином, липопротеинами низкой плотности и т. д. На стабильность
липосом оказывает влияние характер их состав и свойства поверхности.
Добавление холестерина позволяет получить наиболее прочные и стабильные
частицы,
что
было
подтверждено
хранением
с
последующим
микроскопированием. Наличие холестерина в фосфолипидном слое, позволяет
образовать стабильную устойчивую к внешним факторам мембрану.
Так же стабильность в кровеносном русле достигалась с помощью
включенного в оболочку ПЭГ-400. Из-за способности блокировать механизмы
поглощения липосом клетками ретикуло-эндотелиальной системы, за счет
создания избыточного осмотического давления в примембранной области,
везикулы, содержащие производные ПЭГ (стерически стабилизированные
липосомы) устойчивы к коалесценции. Данные свойства позволят препарату
циркулировать в организме, проходя все круги кровообращения, и достигать
необходимые для диагностики паренхиматозные органы.
Было обнаружено, что резонансные частоты отдельных пузырьков имеют
тенденцию
к
увеличению
по
мере
увеличения
модуля
жесткости
и
демпфирование, обеспечиваемое вязкостью оболочки, для радиусов пузырьков
менее ~ 10 мкм.
Была описана модель инкапсуляции газа в липосомальной частице в
процессе самоорганизации частиц. Оптимальный вариант газового содержимого
являться биосовместимый газ с низким уровнем растворимости в жидкостях, что
позволит выводиться из кровеносной системы через дыхательные пути.
При разработке технологии получения липосомальных частиц,
была
получена стабильная от коалисценции эмульсия газосодержащих липосом,
имеющая длительную циркуляцию в кровеносной системе, за счет включения
холестерина и полиэтиленгликоля в состав мембраны.
Были получены липосомальные частицы с размерами до 8 мкм,
повышающие эхогенность по серой шкале при тестировании на ультразвуковом
аппарате Esaote MyLab 50, с частотой от 1-8 МГц.
63
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Baker M. The whole picture // Nature. ‒ 2010. ‒ T. 463. ‒ C. 977.
2. Bangham A. Liposomes: the Babraham connection // Chemistry and physics of lipids.
‒ 1993. ‒ T. 64, № 1-3. ‒ C. 275-285.
3. Chen Z., Wang J., Sun W., Archibong E., Kahkoska A. R., Zhang X., Lu Y., Ligler F.
S., Buse J. B., Gu Z. Synthetic beta cells for fusion-mediated dynamic insulin secretion
// Nature chemical biology. ‒ 2018. ‒ T. 14, № 1. ‒ C. 86.
4. Church C. C. The effects of an elastic solid surface layer on the radial pulsations of
gas bubbles // The Journal of the Acoustical Society of America. ‒ 1995. ‒ T. 97, № 3. ‒
C. 1510-1521.
5. Cobey K. D., Pollet T. V., Roberts S. C., Buunk A. P. Hormonal birth control use and
relationship jealousy: Evidence for estrogen dosage effects // Personality and Individual
Differences. ‒ 2011. ‒ T. 50, № 2. ‒ C. 315-317.
6. Dunaev A. V., Dremin V. V., Zherebtsov E. A., Rafailov I. E., Litvinova K. S.,
Palmer S. G., Stewart N. A., Sokolovski S. G., Rafailov E. U. Individual variability
analysis of fluorescence parameters measured in skin with different levels of nutritive
blood flow // Med Eng Phys. ‒ 2015. ‒ T. 37, № 6. ‒ C. 574-83.
7. Feldberg W., Sherwood S. Injections of drugs into the lateral ventricle of the cat //
The Journal of physiology. ‒ 1954. ‒ T. 123, № 1. ‒ C. 148-167.
8. Gref R., Minamitake Y., Peracchia M. T., Trubetskoy V., Torchilin V., Langer R.
Biodegradable long-circulating polymeric nanospheres // Science. ‒ 1994. ‒ T. 263, №
5153. ‒ C. 1600-1603.
9. Liposome technology Targeted Drug Delivery and Biological Interaction, vol. 3. /
Gregoriadis G.: CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1984.
10. Hostetler K. Y., Kumar R., Stuhmiller L. M. Liponucleotide-containing liposomes //
Book Liponucleotide-containing liposomes / EditorGoogle Patents, 1993.
11. Kajimoto K., Katsumi T., Nakamura T., Kataoka M., Harashima H. Liposome
Microencapsulation for the Surface Modification and Improved Entrapment of
64
Cytochrome c for Targeted Delivery // Journal of the American Oil Chemists' Society. ‒
2018. ‒ T. 95, № 1. ‒ C. 101-109.
12. Kannagi R., Izawa M., Koike T., Miyazaki K., Kimura N. Carbohydrate‐mediated
cell adhesion in cancer metastasis and angiogenesis // Cancer science. ‒ 2004. ‒ T. 95,
№ 5. ‒ C. 377-384.
13. Karn P. R., Vanić Z., Pepić I., Škalko-Basnet N. Mucoadhesive liposomal delivery
systems: the choice of coating material // Drug Development and Industrial Pharmacy. ‒
2011. ‒ T. 37, № 4. ‒ C. 482-488.
14. Kaufmann B. A., Lindner J. R. Molecular imaging with targeted contrast ultrasound
// Current opinion in biotechnology. ‒ 2007. ‒ T. 18, № 1. ‒ C. 11-16.
15. Klaveness J., Rongved P., Stubberud L. Microbubble-generating contrast agents for
ultrasound and magnetic resonance imaging // Book Microbubble-generating contrast
agents for ultrasound and magnetic resonance imaging / EditorGoogle Patents, 1996.
16. Koruk H., Choi J. J. Displacement of a bubble by acoustic radiation force into a
fluid–tissue interface // The Journal of the Acoustical Society of America. ‒ 2018. ‒ T.
143, № 4. ‒ C. 2535-2540.
17. Kudo M., Tomita S., Tochio H., Mimura J., Okabe Y., Kashida H., Hirasa M., Ibuki
Y., Todo A. Sonography with intraarterial infusion of carbon dioxide microbubbles
(sonographic angiography): value in differential diagnosis of hepatic tumors // AJR.
American journal of roentgenology. ‒ 1992. ‒ T. 158, № 1. ‒ C. 65-74.
18. Manish G., Vimukta S. Targeted drug delivery system: a review // Res J Chem Sci.
‒ 2011. ‒ T. 1, № 2. ‒ C. 135-138.
19. Martin F., Martin M. Demonstration of antigens related to colonic cancer in the
human digestive system // International journal of cancer. ‒ 1970. ‒ T. 6, № 3. ‒ C. 352360.
20. Meyer G. Device for preparing a medicinal substance solution, suspension or
emulsion // Book Device for preparing a medicinal substance solution, suspension or
emulsion / EditorGoogle Patents, 1996.
65
21. Palmer S., Litvinova K., Dunaev A., Fleming S., McGloin D., Nabi G. Changes in
autofluorescence based organoid model of muscle invasive urinary bladder cancer //
Biomedical optics express. ‒ 2016. ‒ T. 7, № 4. ‒ C. 1193-1200.
22. Sastry S. V., Nyshadham J. R., Fix J. A. Recent technological advances in oral drug
delivery–a review // Pharmaceutical science & technology today. ‒ 2000. ‒ T. 3, № 4. ‒
C. 138-145.
23. Schneider M. Design of an ultrasound contrast agent for myocardial perfusion //
Echocardiography. ‒ 2000. ‒ T. 17, № s6.
24. Sercombe L., Veerati T., Moheimani F., Wu S. Y., Sood A. K., Hua S. Advances
and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery // Frontiers in Pharmacology. ‒
2015. ‒ T. 6. ‒ C. 286.
25. Smirnova O. D., Rogatkin D. A., Litvinova K. S. COLLAGEN AS IN VIVO
QUANTITATIVE FLUORESCENT BIOMARKERS OF ABNORMAL TISSUE
CHANGES // Journal of Innovative Optical Health Sciences. ‒ 2012. ‒ T. 05, № 02. ‒
C. 1250010.
26. Smith A. Evaluation of poly (lactic acid) as a biodegradable drug delivery system
for parenteral administration // International journal of pharmaceutics. ‒ 1986. ‒ T. 30,
№ 2-3. ‒ C. 215-220.
27. Stelmashchuk O., Zherebtsov E., Zherebtsova A., Kuznetsova E., Vinokurov A.,
Dunaev A., Mamoshin A., Snimshchikova I., Borsukov A., Bykov A., Meglinski I.
Non-invasive control of influence of polyethylene glycol on transport function of
fluorescent colored liposomal nanoparticles // Progress in Biomedical Optics and
Imaging - Proceedings of SPIE. ‒ T. 10336 ‒, 2017. ‒.
28. Stelmashchuk O., Zherebtsov E., Zherebtsova A., Kuznetsova E., Vinokurov A.,
Dunaev A., Mamoshin A., Snimshchikova I., Borsukov A., Bykov A., Meglinski I.
Noninvasive control of the transport function of fluorescent coloured liposomal
nanoparticles // Laser Physics Letters. ‒ 2017. ‒ T. 14, № 6.
29. Szoka F., Papahadjopoulos D. Procedure for preparation of liposomes with large
internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation // Proceedings of
the national academy of sciences. ‒ 1978. ‒ T. 75, № 9. ‒ C. 4194-4198.
66
30. Tarakanchikova Y. V., Avsievich T., Zherebtsov E., Vainio S., Meglinski I., Popov
A. Optical characterization of polymeric nanocapsules interaction with the cell
membrane and in vivo analysis // Frontiers in Optics 2017 10.1364/FIO.2017.JTu2A.78:
OSA Technical Digest (online) ‒ Washington, D.C.: Optical Society of America, 2017.
‒ C. JTu2A.78.
31. Torchilin V. P. Immobilization of specific proteins on liposome surface: systems for
drug targeting // Liposome Technology. ‒ 2018. ‒ T. 3. ‒ C. 75-94.
32. Tuchin V. V., Tuchin V. Tissue optics: light scattering methods and instruments for
medical diagnosis //. ‒ 2007.
33. Van Rooijen N., Sanders A. Liposome mediated depletion of macrophages:
mechanism of action, preparation of liposomes and applications // Journal of
immunological methods. ‒ 1994. ‒ T. 174, № 1-2. ‒ C. 83-93.
34. Verma R. K., Garg S. Drug delivery technologies and future directions //
Pharmaceutical Technology. ‒ 2001. ‒ T. 25, № 2. ‒ C. 1-14.
35. Oral controlled release formulation design and drug delivery: theory to practice. /
Wen H., Park K.: John Wiley & Sons, 2011.
36. Аскерова Н. Н., Кармазановский Г. Г. Контрастное усиление изображения
препаратом SonoVue®: пути усовершенствования ультразвуковой диагностики
очаговой патологии органов брюшной полости и забрюшинного пространства //
Медицинская визуализация. ‒ 2015. № 1. ‒ C. 115-125.
37. Белоусов Ю., Моисеев В., Лепахин В. Клиническая фармакология и
фармакотерапия: Руководство для врачей // Москва. ‒ 1997. ‒ C. 532.
38. Береговых В., Пятигорская Н., Прудкевич Ю., Кедик С. Трансдермальные
терапевтические системы доставки лекарственных средств // Вестник МИТХТ. ‒
2012. ‒ T. 7, № 5. ‒ C. 17-22.
39. Декопов А., Шабалов В. Хроническая интратекальная терапия баклофеном у
пациентов с тяжелой спастичностью // Бюллетень Национального общества по
изучению болезни Паркинсона и расстройств движений–2012–№. ‒ 2012. ‒ C. 1216.
67
40. Заплатников А. Топические деконгестанты в педиатрической практике:
безопасность и клиническая эффективность // Педиатрия. Журнал им. ГН
Сперанского. ‒ 2006. ‒ T. 85, № 6.
41. Токсикологическая химия. / Крамаренко В. Ф.: Рипол Классик, 1989.
42. Клиническая фармакология. / Кукес В. Г.: ГЭОТАР-Медиа, 2009.
43. Технология мягких лекарственных форм. Учебное пособие. / Марченко Л.,
Русак А., Смехова И.: Litres, 2017.
44. Мяделец О. Гистофизиология и эмбриогенез органов ротовой полости // Book
Гистофизиология и эмбриогенез органов ротовой полости / EditorВГМУ, 2003.
45. Наглядная фармакология: учебное пособие для вузов. / Нил М. Д.: ГЭОТАРМедиа, 2011.
46. Пельц В. Современное состояние диагностики и хирургического лечения
острого панкреатита // Сибирский медицинский журнал (Томск). ‒ 2010. ‒ T. 25,
№ 4-1.
47. Перцев И., Зупанец И., Дегтярева Т., Перцев І., Зупанець І. Правильное
применение лекарств как фактор обеспечения их эффективности. Способы
введения лекарств в организм //. ‒ 2001.
48. Перцев И., Перцев І., Зупанец И., Зупанець І., Шевченко Л., Тихонов А.,
Тихонов О., Пиминов А., Пімінов О., Дегтярева Т. Фармацевтические и медико–
биологические аспекты лекарств: учебник Том 1 // Book Фармацевтические и
медико–биологические аспекты лекарств: учебник Том 1 / Editor, 1999.
49. Сутугин М., Сутугін М. Наркотические вещества в свете новой классификации
//. ‒ 2011.
50. Фомина С. В., Завадовская В., Юсубов М., Дрыгунова Л., Филимонов В.
Контрастные препараты для ультразвукового исследования // Бюллетень
сибирской медицины. ‒ 2011. ‒ T. 10, № 6.
51. Щербак В., Щербак Н. Функциональные нарушения желудочно-кишечного
тракта у детей // Забайкальский медицинский вестник. ‒ 2014. ‒ T. 1. ‒ C. 123-31.
68
69
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
Научные публикации
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
ПРИЛОЖЕНИЕ 2
Сертификаты участия в научных конференциях
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа