close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Прокопенкова Наталья Владимировна. Определение аминокислот в биологически активных добавках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

код для вставки
АННОТАЦИЯ
Выпускная квалификационная работа изложена на 74 страницах
печатного текста, состоит из 4 глав, содержит 19 рисунков, 18 таблиц, 7
формул, 13 схем и список цитируемой литературы из 59 наименований.
Ключевые слова: высокоэффективная жидкостная хроматография,
биологически-активные добавки, аминокислоты.
Краткая
характеристика
работы.
Потребность
организма
в
аминокислотах и белках велика. Зачастую в полной мере получить
необходимый набор аминокислот с пищей затруднительно. Широкий
ассортимент фармацевтических препаратов и биологически активных
добавок в наше время позволяет получать необходимые аминокислоты в
достаточном для организма человека и животных количестве при условии
соответствия применяемого препарата заявленным требованиям, что создает
необходимость в оценке качества и безопасности данной группы товаров для
потребителя.
Остро данная проблема стоит при количественном определении
отдельных аминокислот в составе биологически активных добавок (БАД) к
пище. Это связанно с многокомпонентностью и сложностью состава данной
группы препаратов. Интерес представляют современные методы контроля
количественного содержания АК в БАД. Далеко не все лаборатории
оснащены необходимыми приборами и оборудованием для качественного и
количественного определения компонентного состава БАД.
Это делает необходимым адаптировать уже аттестованные методики к
определенному оснащению фармацевтических и контрольно-аналитических
лабораторий,
или
разрабатывать
максимально
простые
методики
определения аминокислот в БАД. Перспективным при решении данного
вопроса
представляется
метод
высокоэффективной
жидкостной
хроматографии (далее ВЭЖХ) с включением предколоночной дериватизации
в пробородготовку.
Целью настоящей работы является поиск оптимальных условий
определения некоторых аминокислот в биологически – активных добавках
методом ВЭЖХ, а так же мониторинг качества ряда препаратов из розничной
торговли.
Обобщены
и
систематизированы
литературные
данные
об
аминокислотах и путях попадания в организм и их биологической роли, а так
же проведен анализ и систематизация известных в настоящее время методов
определения аминокислот в БАД.
Показано, что хроматографические
методы используются для одновременного разделения, идентификации и
количественного
определения
АК
(методы
БХ,
ТСХ,
ГХ,
ВЭЖХ,
ионообменной хроматографии).
Метод
исследования:
высокоэффективная
–
жидкостная
хроматография.
Новизна результатов. Поиск оптимальных условий определения
некоторых аминокислот в БАД. Мониторинг качества биологически –
активных добавок, а так же изучение влияния времени хранения на
содержание АК в целевом продукте.
Область применения и возможность практической реализации.
Полученные результаты могут быть использованы при разработке методов
определения аминокислот в реальных обьектах.
2
ОГЛАВЛЕНИЕ
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ……………………………………………….. 6
Глава 1. Общие сведения об аминокислотах и способах их определения 6
1.1. Общая характеристика аминокислот и их биологическое
значение………………………………………………………………….... 6
1.2. Методы определения аминокислот………………………………..... 10
1.2.1. Определение аминокислотного состава методом ВЭЖХ….... 12
1.2.2. Флуориметрическое определение аминокислот……………... 15
1.2.3. Бумажная хроматография……………………………………... 16
1.2.4. Тонкослойная хроматография………………………………… 17
1.2.5. Метод газовой хроматографии………………………………... 18
1.2.6. Определение методом Къельдаля…………………………….. 19
1.2.7. Определение кислотно-основными методами……………….. 20
1.2.8. Методы основанные на реакции с нингидридом…………….. 21
1.2.9. Другие специфичные реакции на индивидуальные
аминокислоты…………………………………………………………. 22
1.2.10. Высоковольтный электрофорез на инертных носителях…... 25
Глава 2. Мониторинг качества биологически-активных добавок…….… 27
2.1. Проблема фальсификации…………………………………………... 29
2.1.1. Проблема объективной необходимости БАД………………... 29
2.1.2. Проблема стандартизации БАД……………………………….. 30
2.1.3. Проблема качества исходного сырья…………………………. 30
2.1.4. Проблема проведения испытаний качества БАД……………. 31
2.2. Должная организация контроля качества БАД отделом контроля
качества……………………………………………………………………. 31
Выводы к теоретической части……………………………………………. 37
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Методика эксперимента…………..……………………………… 38
3
3.1. Используемые реактивы……………………………………………... 38
3.2. Измерительная вспомогательные растворы………………………... 39
3.3 Измерительная аппаратура и вспомогательное оборудование……. 40
3.4. Методики проведения испытаний…………………………………... 40
3.4.1. Приготовление стандартных растворов……………………… 41
3.4.2. Подготовка...........……………………………………………… 41
3.4.3. Проведение предколоночной дериватизации стандартов и
испытуемых растворов……………………………………………….. 42
3.4.4. Подготовка хроматографической системы…………………... 42
3.4.5. Условия определения аминокислот методом ВЭЖХ при
градиентном элюировании…………………………………………… 42
3.4.6. Условия определения аминокислот методом ВЭЖХ при
изократическом элюировании……………………………………….. 43
3.5. Математическая обработка результатов эксперимента…………… 43
Глава IV. Результаты и их обсуждение…………………………………… 46
4.1. Результаты исследований продукта «Аэрорелакс» методом
ВЭЖХ с изократическим элюированием……………………………….. 46
4.2. Результаты исследований продукта «Vitime man» методом
ВЭЖХ с градиентным элюированием…………………………………... 50
4.3. Результаты исследований продукта «Прегнотон» методом ВЭЖХ
с изократическим элюированием………………………………………... 58
4.4. Изучение стабильности аминокислот в биологически активных
добавках………………………………………………………………….... 62
Выводы к экспериментальной части……………………………………… 67
ВЫВОДЫ…………………………………………………………………… 68
Список используемой литературы………………………………………… 69
4
ВВЕДЕНИЕ
Важность аминокислот (АК) для организма человека определяется их
ролью,
выполняемой
во
всех
процессах
жизнедеятельности:
являются
нейромедиаторами (нейротрансмиттерами), снабжают мышцы необходимой
энергией, а также выполняют другие важные функции.
Ежегодно в мире производится более 200 тыс. тонн аминокислот, которые
используются в основном, как пищевые добавки и компоненты кормов для скота.
Аминокислоты, особенно, незаменимые представляют большой интерес для
медицины и пищевой промышленности.
Потребность организма в АК и белках велика. Зачастую в полной мере
получить необходимый набор аминокислот с пищей затруднительно. Широкий
ассортимент фармацевтических препаратов и биологически активных добавок в
наше время позволяет получать необходимые аминокислоты в достаточном для
организма человека и животных количестве при условии соответствия
применяемого препарата заявленным требованиям, что создает необходимость в
оценке качества и безопасности данной группы товаров для потребителя.
Остро данная проблема стоит при количественном определении отдельных
аминокислот в составе биологически активных добавок (БАД) к пище. Это
связанно с многокомпонентностью и сложностью состава данной группы
препаратов.
Интерес
представляют
современные
методы
контроля
количественного содержания АК в БАД. Далеко не все лаборатории оснащены
необходимыми
приборами
и
оборудованием
для
качественного
и
количественного определения компонентного состава БАД.
Это делает необходимым адаптировать уже аттестованные методики к
определенному оснащению фармацевтических и контрольно-аналитических
лабораторий, или разрабатывать максимально простые методики определения
аминокислот
в
БАД.
Перспективным
при
решении
данного
вопроса
представляется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее
ВЭЖХ) с включением предколоночной дериватизации в пробородготовку.
5
Целью
настоящей
работы
является
поиск
оптимальных
условий
определения некоторых аминокислот в биологически – активных добавках
методом ВЭЖХ, а так же мониторинг качества ряда препаратов из розничной
торговли.
Для
достижения
поставленной
цели
сформулированы
следующие
теоретические и практические задачи:

обобщить и систематизировать литературные данные о биологической
значимости аминокислот, путях их поступления в организм человека;

обобщить и систематизировать литературные данные о способах и
методиках определения аминокислот;

оценить возможность применения и подобрать оптимальные условия
изократического
элюирования
для
ВЭЖХ
определения
аминокислот
в
биологически – активных добавках;

адаптировать метод градиентного элюирования для ВЭЖХ при
определении аминокислот в многокомпонентных БАД;

провести определение аминокислот в выбранных для испытания БАД
методом ВЭЖХ с изократическим и градиентным элюированием;
Предмет исследования: ВЭЖХ как метод определения АК.
Объект исследований: содержание аминокислот в биологически активных
добавках.
Научная
и
практическая
новизна
работы
связанна
с
поиском
оптимальных условий определения некоторых аминокислот в БАД. Мониторинге
качества биологически – активных добавок, а так же изучение влияния времени
хранения на содержание АК в целевом продукте.
6
ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Глава 1. Общие сведения об аминокислотах и способах их определения
1.1. Общая характеристика аминокислот и их биологическое значение
В живых клетках синтезируется множество макромолекул (белков,
нуклеиновых кислот, полисахаридов), которые играют роль структурных
компонентов,
генетической
биокатализаторов,
информации
[1].
гормонов,
рецепторов
Эти макромолекулы
или
хранилищ
представляют
собой
биополимеры, построенные из мономерных единиц, или строительных блоков. В
нуклеиновых кислотах мономерными единицами служат нуклеотиды, в сложных
полисахаридах – сахара и их производные, в белках L-α-аминокислоты [2]. В
работе далее речь пойдет о белках и более подробно – об аминокислотах.
Первая аминокислота, аспарагин, была открыта еще в 1806 году. Последней
из обнаруженных аминокислот оказался треонин, который удалось выделить
лишь в 1938 году [1].
Каждая аминокислота имеет тривиальное
название, иногда связанное с
источником происхождения. Например, аспарагин впервые был обнаружен в
аспарагусе, глютаминовая кислота в клейковине (глютене) пшеницы.
Аминокислоты (мономерное звено белковой молекулы) – это карбоновые
кислоты, содержание аминную и карбиксильную группировку у одного и того же
атома углерода [3].
В организме человека найдено около 70 аминокислот, причем 20 из них
входит в состав белков – протеиногенные аминокислоты [3].
Существует достаточно большое количество оснований для классификации
аминокислот.
По полярности радикала аминокислоты:

неполярные: аланин, глицин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, пролин,
триптофан, фенилаланин

полярные, незаряженные при рН=7: аспарагин, глутамин, серин, тирозин,
треонин, цистеин
7

полярные, заряженные отрицательно при pH=7: аспарагиновая кислота,
глутаминовая кислота

полярные, заряженные положительно при pH=7: аргинин, гистидин, лизин.
С вышеприведенной классификацией согласуется классификация по
степени гидрофильности – способности связывать молекулы:
 высокогидрофильные:
аспарагин,
аспарагиновая
кислота,
аргинин,
гистидин, глютамин, глютаминовая кислота и лизин (почти всегда
располагаются на внешней поверхности молекул белка).
 умеренно гидрофильные: пролин, серин, тирозин, треонин и триптофан.
 гидрофобные: аланин, валин, глицин, изолейцин, лейцин, метионин,
цистеин и фенилаланин, которые располагаются в основном внутри молекул
белка [4].
Общая формула аминокислот имеет вид:
Кроме карбонильной и аминной групп аминокислоты содержат боковые
радикалы, определяющие свойства молекулы.
По функциональным группам:

алифатические
моноаминомонокарбоновые:
аланин,
валин,
глицин,
изолейцин, лейцин (боковые цепи содержат лишь атомы углерода и
водорода);

оксимоноаминокарбоновые: серин, треонин (содержат - ОН группы)

моноаминодикарбоновые: аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота
(содержат две карбоксильные группы)

амиды моноаминодикарбоновых кислот: аспарагин, глутамин (содержат
атом азота в составе второй карбоксильной группы)

диаминомонокарбоновые:
аргинин,
гистидин,
лизин
(содержат
аминогруппы)

серосодержащие: цистеин (цистин), метионин (содержат атом серы)
две
8

ароматические: фенилаланин, тирозин

гетероциклические: триптофан, гистидин, пролин (также входит в группу
иминокислот)

иминокислоты: пролин (также входит в группу гетероциклических),
включает циклическое имидазольное кольцо, благодаря чему вызывает
изгибы в полипептидной цепочке белка, что очень важно, например, для
структуры белка соединительной ткани коллагена, где пролина очень
много.
Из двадцати биогенных аминокислот только десять синтезируются в
организме – заменимые аминокислоты. Остальные – незаменимые, то есть
должны поступать в организм с пищей в количествах достаточных для роста [3] .
Недостаточность какой – либо незаменимой аминокислоты приводят к остановке
роста и развитию клинической картины, напоминающей авитаминоз.
В таблице 1 представлена классификация по данному основанию.
Таблица 1. Заменимые и незаменимые аминокислоты
Заменимые
Аланин, аспарагин, аспарагиновая к-та, глицин,
глутамин, глутаминовая кислота, пролин, серин,
тирозин, цистеин (цистин)
Незаменимые
Аргинин*, валин, гистидин*, изолейцин, лейцин,
лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин
*-
полунезаменимые аминокислоты – могут синтезироваться в организме, но в количестве
недостаточном для сохранения нормальной жизнедеятельности организма человека.
Аминокислоты выполняют помимо строительной ряд других важных
функций. Некоторые участвуют в передаче нервных импульсов (глицин и
глутаминовая кислота) [2]. Фенилаланин является предшественником ряда
гормонов, осуществляющих многие регуляторные реакции в организме, метионин
– основной донор метильных группировок при синтезе адреналина, креатина и
источник
серы
при
образовании
тиамина.
Валин
участвует
пантотеновой кислоты, треонин – предшественник витамина В12 [5].
в
синтезе
9
Аминокислоты, находящиеся в свободном состоянии или входящие в состав
других небелковых соединении, выполняют важную функцию во многих
метаболических процессах.
Например аминокислоты орнитин, цитруллин участвуют в метаболизме
мочевины, β – аланин – составная часть кофермента А и пантетеина, таурин – в
составе коньюгатов желчных кислот находится в желчи, γ – аминомасляная
кислота (ГАМК) нейромедиатор, образующийся из глутамата в ткани мозга, β –
аминоизомасляная кислота – конечный продукт катаболизма пиримидинов [6].
Аминокислоты широко применяются в медицинской практике. В первую
очередь это относится к таким аминокислотам, как метионин, гистидин,
глутаминовая и аспарагиновая кислоты.
Таким образом, дефицит аминокислот, способствующий нарушению многих
обменных процессов, должен восполняться за счет введения соответствующих
экзогенных аминокислот.
Ряд заболеваний связаны с нарушениями транспорта аминокислот внутрь
клеток. Эти заболевания часто сопровождаются значительным повышением
содержания одной или нескольких аминокислот в моче; такое состояние
называют аминоацидурией.
Снабжение организма человека необходимым количеством аминокислот –
основная функция пищевого белка.
Нарушение сбалансированности аминокислотного состава пищевого белка
приводит к нарушению синтеза собственных белков, сдвигая динамическое
равновесие белкового анаболизма и катаболизма в сторону преобладания распада
собственных белков организма, в том числе белков и ферментов. Недостаток той
или иной незаменимой аминокислоты лимитирует использование других
аминокислот в процессе биосинтеза белка. Например, в составе тканевого белка
валин, аргинин и триптофан содержатся в равных количествах (1:1:1), но если в
пищевом рационе их соотношение составляет 1:1:0,5, то усвоение всех указанных
аминокислот происходит по аминокислоте, содержащейся в минимальном
количестве. Следствием этого является неполноценный синтез тканевого белка, а
10
неусвоенные аминокислоты при накоплении в крови в повышенных дозах могут
оказать
токсическое
аминокислотному
действие.
составу
Полноценность
может
быть
пищевого
оценена
при
белка
сравнении
его
по
с
аминокислотным составом «идеального белка». Для взрослого человека в
качестве
«идеального
Продовольственного
белка»
комитета
применяют
Всемирной
аминокислотную
организации
шкалу
здравоохранения
(ФАО/ВОЗ, табл. 2). Так называемая «шкала ФАО» содержит минимальные
требования
к
биологической
ценности
белка,
способного
удовлетворять
потребность в незаменимых аминокислотах у взрослых людей при минимальном
уровне требований к качеству жизни [5,7].
Таблица 2. Аминокислотная шкала ФАО/ВОЗ
Незаменимая
Содержание (мг) в 1 г
аминокислота
«идеального белка»
Валин (Вал)
50
Лейцин (Лей)
70
Изолейцин (Иле)
40
Лизин (Лиз)
55
Метионин (Мет) +
Цистеин (Цис)
35
Треонин (Тре)
40
Триптофан (Три)
10
Фенилалание (Фен) +
Тирозин (Тир)
60
1.2. Методы определения аминокислот
В настоящее время для определения аминокислот в БАД и используемом
для его производства сырье применяют ряд методов, которые являются
сравнительно простыми и дешевыми, однако отличаются недостаточной
специфичностью и воспроизводимостью результатов, а также невозможностью
определения сразу нескольких аминокислот в одном продукте.
11
Титриметрические методы (являются наиболее доступными и точными)
рекомендованы нормативной документацией и широко используются для
количественного определения
АК в фармацевтических
субстанциях или
однокомпонентных биологически активных добавках.
УФ-спектрофотометрия,
ИК-спектроскопия
(высокоинформативные
методы, используемые в основном для анализа АК в субстанциях или
монопрепаратах) не могут быть использованы в анализе многокомпонентных
смесей АК без предварительного разделения.
Метод поляриметрии дает важную информацию при анализе субстанции
АК, но не пригоден для анализа суммы изомеров оптически активных веществ без
их
предварительного
разделения.
Он
применяется
для
определения
специфического вращения аминокислот в субстанциях.
Масс-спектрометрический
информативных
методов
анализ
–
исследования
один
из
самых
АК
в
составе
точных
и
сложных
многокомпонентных растительных объектов, позволяющий решить все задачи за
одну аналитическую процедуру. Однако широкое применение данного метода
остается все еще невозможным из-за высокой стоимости оборудования,
вспомогательных реактивов, трудности в эксплуатации прибора, а следовательно,
и
значительной
себестоимости
одного
анализа.
Все
это
не
позволяет
рекомендовать его для включения в нормативную документацию, методики
которой должны удовлетворять требованиям рутинного анализа.
Ферментативные
и
изотопные
методы
характеризуются
высокой
чувствительностью, однако они также не нашли широкого распространения на
практике в связи со сложностью проведения анализа и высокой стоимостью
оборудования.
Электрохимические методы широко применяются для разделения и
количественного определения АК в сложных многокомпонентных объектах в
нативном виде или в виде различных производных. Использование метода
капиллярного электрофореза является наиболее целесообразным для определения
АК в различных объектах, в том числе и фармацевтического назначения. При
12
сравнении данного метода с ВЭЖХ можно выделить следующие преимущества
первого: высокая эффективность разделения, недоступная для ВЭЖХ; отсутствие
необходимости
в
хроматографических
дорогостоящих
высокочистых
колонках;
органических
минимальный
растворителей
и
расход
реактивов;
экспрессность анализа, а также отсутствие необходимости в предколоночной
модификации. Применение метода капиллярного электрофореза пока не нашло в
России
широкого
применения
в
аминокислотном
анализе
объектов
фармацевтического назначения из-за невозможности разделения и определения
всех незаменимых АК за одну процедуру, а также ввиду отсутствия
аттестованных методик.
Для данных исследований целесообразно применение хроматографических
методов, в частности метода высокоэффективной жидкостной хроматографии
(далее
ВЭЖХ),
позволяющего
определять
сразу
несколько
отдельных
аминокислот в составе многокомпонентных смесей.
1.1.1. Определение аминокислотного состава методом ВЭЖХ
ВЭЖХ - один из эффективных методов разделения сложных смесей
веществ, широко применяемый как в аналитической химии, так и в химической
технологии.
Основой
хроматографического
разделения
является
участие
компонентов разделяемой смеси в сложной системе Ван-дер-Ваальсовых
взаимодействий (преимущественно межмолекулярных) на границе раздела фаз.
Как способ анализа, ВЭЖХ входит в состав группы методов, которая, ввиду
сложности
исследуемых
объектов, включает
предварительное
разделение
исходной сложной смеси на относительно простые. Полученные простые смеси
затем
анализируются
обычными
физико-химическими
методами
или
специальными методами, созданными для хроматографии [8].
Несмотря на многообразие методик ВЭЖХ в анализе АК, наиболее
доступным
является
обращено
-
фазовый
(ОФ)
вариант
ВЭЖХ
со
спектрофотометрическим или флуориметрическим детектированием [9].
Для успешного разделения и детектирования АК переводят в гидрофобные
и поглощающие свет производные, т.е. проводят дериватизацию. Основными
13
требованиями к выбору дериватизирующего агента являются быстрота и
образование стабильных производных. Различают пред- и послеколоночную
дериватизацию [10].
В предколоночной дериватизации (до аналитического разделения) реакцию
обычно проводят вручную во флаконах перед введением в хроматограф.
В послеколоночной дериватизации реакцию проводят автоматически путем
добавления реагента после разделения АК. Этот метод обычно требует меньшей
подготовки пробы и процедур по очистке, имеет меньше помех от реагентов,
используемых для дериватизации, а получаемые результаты в целом более
воспроизводимы [10]. В качестве реагентов для дериватизации применяют ортофталевый
альдегид,
нафталин
-
2,3
-
дикарбоксиальдегид,
9-
флуоренилметилхлороформиат и другие.
Отсутствие хромофорных групп в большинстве молекул аминокислот
требует стадии дериватизации.
Автор [11] описывает пример разделения смеси аминокислот методом ОФ
ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией
присутствии
меркаптопропионовой
кислоты
орто-фталевым альдегидом в
градиетным
элюированием.
Подвижные фазы представляют собой водные ацетатные буферные растворы с
метанолом и ацетонитрилом. В качестве неподвижной фазы в данном случае
использовалась колонка Agilent Hypersil AA-ODs. Детектирование производных
осуществляли фотометрически при λ=338 нм.
Времена удерживания данного определения представлены в таблице 3:
14
Таблица 3. Времена удерживания аминокислот (мин)
Аминокислоты
Время
Аминокислоты
удерживания,
мин
5-гидрокситриптофан
9,02
Лейцин
Лизина
Аланин
7,45
гидрохлорид
Аргинин
7,73
Метионин
Аспарагин
3,72
Орнитин
Аспарагиновая
кислота
1,72
Фенилаланин
Цитрулин
6,81
Пролин
Цистин
10,43
Серин
Глутаминовая
кислота
1,99
Таурин
Глутамин
5,47
Треонин
Глицин
5,81
Тирозин
Гистидина
моногидрат
5,66
Триптофан
Изолейцин
12,62
Валин
Время
удерживания,
мин
13,36
13,89
11,07
13,39
12,43
17,89
4,71
7,58
6,12
9,02
12,61
10,85
Авторы в статье [12] предлагают методику определения важнейших АК в
сложных матрицах биологического происхождения методом ОФ ВЭЖХ с УФдетектированием. При этом используется кислотный гидролиз и модификация АК
раствором
фенилизотиоцианата
в
изопропиловом
спирте
с
получением
фенилтиогидантоинов по схеме:
Схема 1. Получение фенилтиогидантоиновых производных.
Определение аминокислот проводили на жидкостном хроматографе
Shimadzu LC-20 Prominence, (Япония) с УФ-детектированием (при 254 нм).
Хроматографическая колонка 250×4.6 мм Supelco С18, 5 мкм (США).
Хроматографический анализ проводили в градиентном режиме при расходе
15
элюента 1,2 мл/мин и температуре термостата колонки 40°С. В качестве
подвижной фазы использовали смесь 6.0 M раствора ацетата натрия с рН 5.5
(компонент А), 1% раствор изопропилового спирта в ацетонитриле (компонент В)
и 6.0 M раствора ацетата натрия с рН 4.05 (компонент С). Использовали
стандартные образцы аминокислот, представленных ниже на хроматограмме.
Рис. 1. Хроматограмма стандартной смеси аминокислот после модификации
ФИТЦ
В статье описано, что на стандартных смесях оптимизированы условия
хроматографического
разделения
АК.
Установлено,
что
разделение
АК
обеспечивается за счёт уменьшения рН подвижной фазы с 5.5 до 4.05. Также
хроматографические параметры, при варьировании состава и рН подвижной фазы
на завершающем участке хроматограммы.
1.1.2. Флуориметрическое определение аминокислот
ВЭЖХ в сочетании с лазерно-индуцированной флуориметрией (ЛИФ) –
один из наиболее чувствительных методов определения флуоресцирующих
веществ [13]. Принципиальной особенностью ВЭЖХ является малый объем
(0,001–10 мкл), в котором происходит детектирование определяемых соединений.
Применение ЛИФ как метода детектирования в ВЭЖХ позволяет использовать
высокую плотность мощности светового потока возбуждающего излучения.
Однако такие возможности в полной мере могут быть реализованы только для
достаточно фотоустойчивых систем. Производные аминокислот, образующиеся
16
по стандартной реакции с ОФА и 2-меркаптоэтанолом обладают невысокой
химической устойчивостью и под воздействием мощного лазерного излучения
быстро разлагаются [14].
Авторы
[15]
на
высокочувствительного
примере
определения
глицина
изучили
аминокислот
по
возможность
флуоресценции
их
производных, образующихся в результате реакции с водными растворами ортофталевого альдегида и нуклеофильных агентов - цианида калия, сульфита натрия
и N-ацетил-L-цистеина. В статье показано, что химическая устойчивость
образующихся флуоресцирующих соединений (замещенные изоиндолы) и их
фотохимическая устойчивость под воздействием мощного импульсного лазерного
излучения выше, а аналитические характеристики реагентов не уступают
стандартно используемому реагенту для определения аминокислот – смеси ортофталевого
альдегида
с
2-меркаптоэтанолом.
Также
был
приведен
ряд
преимуществ использования новых нуклеофильных агентов (сульфит натрия,
цианид калия) для флуориметрического и спектрофотометрического определения
аминокислот по реакции с ОФА.
1.1.3. Бумажная хроматография
Этот используется для идентификации компонентов смеси АК с ди- и
трипептидами, получаемых при частичном гидролизе белков и полипептидов [16].
Компоненты гидролизата распределяются между водой, адсорбированной
на целлюлозе и являющейся неподвижной фазой, и органическим растворителем подвижной фазой, которая движется вдоль листа хроматографической бумаги
вверх или вниз. В качестве подвижной фазы можно использовать смесь бутанол –
уксусная кислота – вода (4:1:5). Более липофильные аминокислоты сильнее
увлекаются органическим растворителем, более гидрофильные – проявляют
большую тенденцию связываться с неподвижной фазой. Гомологические
соединения, отличающиеся даже на одно метиленовое звено, движутся с
различной
скоростью
и
легко
могут
быть
разделены.
По
окончании
хроматографии бумагу высушивают, обрабатывают проявителем (0,5 % раствор
нингидрина в смеси ацетон – ледяная уксусная кислота – вода) и нагревают в
17
течение нескольких минут. Аминокислоты проявляются в виде окрашенных
пятен. Подвижность – постоянная величина, характерная для каждого соединения
–возрастает
с
увеличением
молекулярной
массы.
Для
аминокислот
с
неразветвленной цепью величина подвижности несколько больше, чем для
соответствующих изомеров. Введение в молекулу полярных групп снижает
подвижность соединения. Аминокислоты с объемными неполярными боковыми
цепями (лейцин, изолейцин, фенилаланин, триптофан и др.) перемещаются
быстрее, чем аминокислоты с более короткими неполярными боковыми цепями
(пролин, аланин, глицин) или полярными боковыми цепями (треонин, аргинин,
цистеин, гистидин, лизин). Это обусловлено большей растворимостью полярных
молекул в гидрофильной стационарной фазе и неполярных – в органических
растворителях [16-19].
Бумажная хроматография может быть использована для количественной
оценки содержания аминокислот. Каждое пятно вырезают и элюируют
подходящим растворителем; затем проводят количественный колориметрический
(нингидриновый) анализ. В другом варианте бумагу опрыскивают нингидрином и
измеряют с помощью фотометра интенсивность окрашивания пятна в отраженном
или проходящем свете. При полуколичественной оценке содержание аминокислот
оценивают по площади пятен на хроматограмме, которые пропорциональны
концентрациям аминокислот в разделяемой смеси [18-20].
1.1.4. Тонкослойная хроматография
Для
разделения
и
определения
аминокислот
может
быть
также
использована тонкослойная хроматография (далее ТСХ), которая существует в
двух вариантах: адсорбционная и распределительная.
Распределительная ТСХ (РТСХ) сходна с распределительной на бумаге,
адсорбционная ТСХ (АТСХ) основана на совершенно других принципах. При
проведении РТСХ на порошке целлюлозы или других относительно инертных
носителях можно использовать такие же системы растворителей и проявляющие
реагенты, как и при хроматографии на бумаге.
18
В ряде случаев идентифицировать все зоны на хроматограммах методом
ТСХ затруднительно, т.к. зоны некоторых АК имеют близкие значения Rf. Для
ТСХ всего спектра известных АК до сих пор не подобраны универсальные
условия разделения (сорбент и система растворителей). Это связано с тем, что сам
объект – смесь АК – условно разделяется на две группы: с низкими (до 0,3) и
высокими
(0,3-1,0)
значениями
коэффициента
подвижности
Rf.
АК
с
промежуточными значениями Rf не поддаются интерпретации известными
способом из-за перегруженности этой области АК и неэффективности систем
растворителей для их разделения [21].
АТСХ применяется, в основном, для разделения таких неполярных
соединений, как липиды [22-23].
1.1.5. Метод газовой хроматографии
АК могут быть определены также методом газовой хроматографии (ГХ), но
перед анализом их, как правило, переводят в летучие соединения. Данный метод
пробоподготовки подходит не для всех аминокислот. Так на схеме 2 показан
механизм перевода АК в альдегид с помощью нингидрина:
Схема 2. Получение альдегидов из АК.
Аминокислоты можно также перевести в летучие эфиры (алкильные эфиры,
метильные эфиры оксикислот, метиловые эфиры хлорзамещенных кислот и др.),
анализируемые далее методом ГХ [24].
1.1.6. Определение АК методом Къельдаля
Общим методом для определения всех азотсодержащих органических
веществ, в том числе и для аминокислот, является метод Къельдаля. Принцип
19
метода заключается в окислительной деструкции вещества под действием
концентрированной серной кислоты в присутствии катализатора меди сульфата и
калия сульфата согласно схеме 3:
Схема 3. Сернокислотная деструкция АК.
После охлаждения смеси, колбу в которой проводилась минерализация,
герметично подсоединяют к прибору Къельдаля. Затем в реакционную среду
добавляют избыток щелочи (схема 4):
(NH4)2SO4 + 2 NaOH → 2 NH3 ↑ + Na2SO4 + 2 H2O
Схема 4. Образование аммиака при добавлении щелочей
Выделившийся аммиак количественно отгоняют с водяным паром в
приемник с борной кислотой, которая связывает аммиак с образованием аммония
тетрагидроксобората согласно схеме 5:
B(OH)3 + H2O → HB(OH)4
NH3 + HB(OH)4 → NH4[B(OH)4]
Схема 5. Образование аммония тетрагидроксобората
Далее
образующуюся
соль
аммония
тетрагидроксобората
титруют
стандартным раствором хлороводородной кислоты согласно схеме 6:
NH4[B(OH)4] + HCl → H[B(OH)4] +NH4Cl
Схема 6. Взаимодействие аммония тетрагидроксобората с
хлороводородной кислотой
Это испытание унифицировано и изложено в ОФС 2.1.«Определение азота в
органических соединениях методом Кьельдаля» [25].
1.1.7. Определение АК кислотно-основными методами.
Непосредственно
титрование
АК
кислотно-основным
методом
по
карбоксильной или аминогруппе в водной среде сопровождается большой
погрешностью. Это объясняется тем, что в водных растворах аминокислоты
20
существуют в виде внутренней соли. Титрование ацидиметрическим методом по
аминогруппе возможно только в неводной среде в присутствии ледяной уксусной
кислоты [26]. Эта кислота подавляет диссоциацию карбоксильной группы и
усиливает основные свойства аминогруппы (схема 7):
Схема 7. Взаимодействие АК с хлорной кислотой
Титрование
алкалиметрическим
методом
по
карбоксильной
группе
возможно только в присутствии формальдегида. Альдегид связывает аминогруппу
и понижает ее основность вследствие р, π-сопряжения в образовавшейся
иминогруппе. Данный метод называется формольным титрованием или по имени
автора титрованием по Сёренсену [27] (схема 8):
Схема 8. Реакции, протекающие при формольном титровании
1.1.8. Методы основанные на реакции с нингидридом
Для анализа аминокислот также широко используют методы, основанные на
реакции с нингидрином [28-34].
Нингидрин специфичен к алифатическим или алициклическим первичным
аминогруппам.
Для α-аминокислот нингидриновая реакция протекает по схеме 9. На первой
стадии
протекает
декарбоксилирования:
реакция
окислительного
дезаминирования
и
21
Схема 9. Окислительное дезаминирование и декарбоксилирование АК
Затем молекулы окисленного и восстановленного нингидрина вступают в
реакцию конденсации с выделяющимся в ходе окисления аммиаком с
образованием красителя Руэмана [35] (схема 10):
Схема 10. Образование сине – фиолетового комплекса Руэмана
Спектрофотометрия в видимой области и фотоэлектроколориметрия,
основанные на определении продуктов взаимодействия АК с нингидрином при
длинах волн 440-490 и 570 нм, нашедшие наибольшее распространение в анализе
свободных АК в сложных комплексных препаратах, относятся к самым подробно
описанным в литературе и простым в использовании. Однако они дают
представление только о суммарном содержании АК в пересчете на какую-либо
АК, без достоверной информации о присутствии индивидуальных АК в объекте.
22
Кроме того, следует отметить, что продукты реакции α-АК с нингидрином
характеризуются невысокой стабильностью оптической плотности во времени.
Концентрированные растворы аминокислот и амидов также можно
определить биуретовой реакцией (более специфична для белков и пептидов).
Реакция осуществляется прибавлением к щелочному раствору биурета,
разбавленного водного раствора соли меди (II) с образованием комплексного
соединения фиолетового цвета с красным или синим оттенком [36].
1.1.9. Другие специфичные реакции на индивидуальные аминокислоты
Аминокислоты и некоторые другие соединения, содержащие аминогруппу,
конденсируются в щелочной среде с 1,2-нафтохинон-4-сульфокислотой с
образованием окрашенных в красный, желтый, оранжевый цвет производных 1,2нафтохинонмоноимина [28].
Схема 10. Образование производных 1,2-нафтохинонмоноимина
Глицин взаимодействует с ο-фталевым диальдегидом с образованием яркозеленого продукта:
Схема 11. Реакция взаимодействия глицина с ο-фталевым диальдегидом
23
Для определения триптофана может быть использована реакция с 4диметиламинобензальдегидом. Продукт реакции окрашен в фиолетовый цвет
(Аmax = 590 нм) и по интенсивности окраски определяют содержание триптофана
в анализируемом растворе [28,30].
Схема 12. Реакция взаимодействия триптофана с
4-диметиламинобензальдегидом
Для
количественного
определения
аминокислот,
содержащих
серу,
используется броматометрический метод, основанный на следующей реакции:
Схема 13. Реакция взаимодействия цистеина с гидроксидом натрия и броматом
калия
Раствор цистеина в 1 % растворе NaOH вливают в колбу с притертой
пробкой, добавляют 0,1 Н раствор бромата калия, сухой бромид калия и
подкисляют 10 % HCl.
Образующийся
в
результате
реакции
бром,
количество
которого
эквивалентно количеству бромата калия, реагирует с аминокислотой. Через 10
мин
прибавляют
иодид
калия,
который
вступает
в
реакцию
с
24
непрореагировавшим бромом, и титруют выделившийся иод 0,1 н раствором
тиосульфата натрия с крахмалом в качестве индикатора.
Количество тиосульфата, который пошел на титрование, эквивалентно
количеству брома, не вступившего в реакцию с аминокислотой. По разнице
между количеством добавленного бромата калия и тиосульфата находят
количество брома, пошедшего на реакцию с аминокислотой, а значит, и
количество аминокислоты. Метионин определяют аналогично. Метионин при
этом окисляется до сульфона:
Схема 13. Окисление метионина до сульфона
Эта реакция при определенных условиях позволяет очень точно определить
содержание метионина [37-39].
Для определения аргинина, гистидина, тирозина предложена реакция с 1нафтолом. В присутствии гипохлорита натрия (NaOCl) раствор окрашивается в
красный цвет. Пробу, растворенную в 50 % этаноле, содержащую аминокислоту,
охлаждают льдом и добавляют 10 % раствор NaOCl и раствор нафтола. Продукт
реакции окрашен в красный цвет (l max = 550 нм). По интенсивности окраски
полученного раствора определяют содержание аминокислот [28, 39].
Схема 13. Реакция аргинина с 1-нафтолом
25
Представленные данные систематизированы ниже в следующей таблице
[28, 29, 37-39]:
Таблица 4. Некоторые качественные и количественные реакции на
индивидуальные АК
АК
Реагент, условия
Признак
Аргинин, гистидин и
1-нафтол в
Красное окрашивание
тирозин
присутствии
гипохлорита натрия
NaOCl
Глицин
о-фталевый
Ярко-зеленое
диальдегид
окрашивание
Триптофана
4-диметилФиолетовое
аминобензальдегид
окрашивание
Серосодержащие
Бромат калия в
Метод обратного
аминокислоты
щелочной среде
титрования с
тиосульфатом натрия
1.1.10. Высоковольтный электрофорез на инертных носителях
В биохимии широкое применение нашло разделение АК, полипептидов и
других aмфолитов (молекул, суммарный заряд которых зависит от рН среды) под
действием
нaложенного
постоянного
электрического
поля.
Это
метод
высоковольтного электрофорезa на инертных носителях. При разделении
аминокислот в качестве инертных носителей чаще всего используют полоски
бумаги или тонкие слои целлюлозного порошка. Разделение проводят в течение
0,5–2 ч при напряжении 2000–5000 В в зависимости от суммарных зарядов
aмфолитов и их молекулярных масс. Среди молекул, несущих одинаковый заряд,
те, что легче, мигрируют быстрее. Но более важным параметром при разделении
является суммарный заряд. Метод применяется для разделения аминокислот,
низкомолекулярных пептидов, некоторых белков, нуклеотидов.
Образец помещают на носитель, смaчивaют буфером с соответствующим
рН и соединяют с буферным резервуаром полоской фильтровальной бумaги.
Бумaгу прикрывают стеклянной плaстинкой или погружают в углеводородный
рaстворитель для охлаждения. В электрическом поле молекулы, несущие при
26
данном рН отрицательный заряд, мигрируют к аноду, а те, которые несут
положительный заряд, – к катоду. Далее, высушенную электрофореграмму
«проявляют» нингидрином (при работе с aминокислотами, пептидaми) [28,31,40].
Следует
отметить,
что
вышеперечисленные
методы:
бумажной,
тонкослойной хроматографии, газохроматографические и ряд других в настоящее
время практически не используются, вследствие худшей воспроизводимости и
большой длительности.
27
Глава 2. Мониторинг качества БАД к пище
Специалисты утверждают, что рацион человека в наши дни должен
содержать
более
600 различных
веществ
(нутриентов).
К сожалению,
сбалансированный рацион по всем пищевым веществам могут себе позволить
далеко не все. Тут и приходят на помощь биологически БАД - концентраты
натуральных природных веществ, выделенных из пищевого сырья животного
(в том
числе
морского),
минерального,
растительного
происхождения,
или же полученные путем химического синтеза вещества, идентичные природным
аналогам. Подавляющее их большинство обладает различными лечебными
свойствами, если поступает в организм в определенных количествах, пропорциях
и сочетаниях. Основное отличие от лекарственных средств состоит в том, что
БАД помогают организму провести самонастройку и устранить нарушения,
приводящие к развитию того или иного заболевания. БАД не работают вместо
регуляторных систем организма, а устраняют дефицит или избыток каких-либо
соединений в организме человека. Применение их позволяет последовательно
восстанавливать организм без нанесения ему ущерба, без разрушительных
побочных действий, свойственных многим лекарствам [43,44].
Ситуация, сложившаяся сегодня на рынке БАД в Российской Федерации,
едва ли поддается контролю. Разнообразие БАД стремительно увеличивается, с
каждым годом
составляя
всё большую
конкуренцию
лекарственным и
гомеопатическим препаратам. На сегодняшний день в России зарегистрировано
более 5000 наименований БАД [41-47].
Основная цель реализации БАД, как и в любом другом бизнесе, это
получение прибыли. Но при этом нельзя забывать, что продукция содержит
биологически активные вещества (далее БАВ), поэтому именно обеспечение её
качества должно быть приоритетной задачей. К сожалению, производители и
дистрибьюторы БАД часто забывают о том, что несут ответственность за жизнь и
здоровье потребителя.
В
соответствии
с
действующими
законодательными
документами
Российской Федерации БАД не подлежат обязательной сертификации, возникает
28
необходимость создания системы, которая подтверждала бы эффективность и
соответствие
свойств
продукции,
декларированных
производителем
или
продавцом, защищала бы права потребителей в отношении приобретения
продукции ненадлежащего качества, опасной для жизни и здоровья. Именно с
этой целью Федеральной службой по защите прав потребителей и благополучия
человека была утверждена и внесена в Единый реестр систем добровольной
сертификации 7 июля 2005 года. Система добровольной сертификации
биологически активных добавок к пище, пищевых добавок и пищевых продуктов,
полученных из генетически модифицированных продуктов [49,58].
Целью
создания
системы
сертификации
является
удостоверения
соответствия биологических активных добавок к пище стандартам и требованиям
сертификации, повышения качества продукции и создания уверенности у
приобретателей
в
качестве,
безопасности
и
эффективности
продукции
конкретного изготовителя.
В организационную структуру Системы входят: Федеральная служба по
защите прав потребителей и благополучия человека, которая управляет Системой
и организует условия для ее функционирования; Центральный орган по
сертификации, организующий и координирующий деятельность органов по
сертификации и испытательных лабораторий, а также сами органы по
сертификации
и
испытательные
лаборатории/центры,
осуществляющие
подтверждение соответствия продукции [49].
Проведение их сертификации подразумевает лабораторные исследования
разных партий одного и того же наименования для определения стабильности
качества, соответствия нормативным документам и требованиям Федеральной
службы по надзору в сфере защиты прав потребителя и благополучия человека.
Кроме того, в различных схемах сертификации проводится анализ состояния
производства.
Предусмотрена
также
возможность
сертификации
систем
менеджмента качества производства. За всеми видами сертифицированной
продукции, а также за ее производством устанавливается периодический
инспекционный контроль.
29
При наличии материалов по оценке эффективности БАД, проведенных при
сертификации, рекомендации производителя/поставщика биологически активных
добавок к пище для восполнения дефицита биологически активных веществ, для
оптимизации углеводного, жирового, белкового, витаминного и других видов
обмена веществ при различных функциональных состояниях, для нормализации
и/или улучшения функционального состояния органов и систем организма
человека включаются в сертификат добровольной сертификации. В соответствии
с действующими нормативными документами подтверждение эффективности
продукции
может
осуществляться
в
специализированных
медицинских
учреждениях системы РАН, РАМН, Минздравсоцразвития (клиники НИИ,
профильные клинические больницы, кафедры и клиники медицинских ВУЗов),
имеющих лицензию на соответствующий вид деятельности [43,49].
Таким
образом,
после
проведения
добровольной
сертификации
производитель/поставщик сможет с полной уверенностью в соблюдении
действующего законодательства информировать своего потребителя не только о
безопасности продукции и количественном содержании биологически активных
компонентов в БАД, но и об эффективности БАД в соответствии с заявленными
свойствами, а потребительский рынок будет защищен от недобросовестных
производителей и наплыва продукции ненадлежащего качества.
2.1. Проблема фальсификации БАД
Существует множество проблем связанных с качеством БАД, ниже
рассмотрим самые актуальные из них:
2.1.1. Проблема объективной необходимости БАД
Для
создaния
эффективных
БАД
требуются
квaлифицированные,
длительные и детaльные исследования пищевой ценности, фaрмaкологической
aктивности, физико-химических свойств продукции, изучение совместимости
компонентов, входящих в их состав и многое другое, что в сумме позволит
позиционировать продукцию как объективно необходимую для некой группы
потребителей [48].
30
Не каждый рaзработчик БАД может себе позволить эти дорогостоящие
исследования. Обычно дело ограничивается стaндартной процедурой сaнитарноэпидемиологической
экспертизы,
включающей
в
себя
подтверждение
безопасности продукта (микробиологическая чистота, содержание пестицидов,
токсичных элементов, рaдионуклидов) и наличия БАВ. В нaстоящее время у
некоторых крупных производителей наметились тенденции более глубоких
прорaботок рецептуры БАД, методов их стaндартизации, изучения стaбильности
[49].
2.1.2. Проблема стандартизации БАД
Целью стандартизации БАД и изложения методик испытаний в технических
условиях (далее ТУ) является гарантия стабильного качества продукции в
процессе серийного производствах [50]. У большинства зарегистрированных БАД
в разделе ТУ “Методы контроля качества продукции” приводятся ссылки на
методические руководства, ГОСТы, фармакопейные статьи или выдержки из них.
Как правило, указанные в ТУ методики не подходят для испытаний
декларируемой продукции, так как в них не отработаны методы пробоподготовки,
не учтено влияние на испытание других компонентов, что приводит не только к
существенным ошибкам при качественном и количественном определении БАВ,
но и к невозможности воспроизведения методик и, следовательно, получения
достоверного результата. Совершенно очевидно, что для каждого вида продукции
требуются отработанные в лабораторных условиях методики количественного и
качественного определения БАВ, а также физико-химических показателей. Для
разработки и статистического подтверждения методик требуются десятки, а
иногда и сотни испытаний.
2.1.3. Проблема качества исходного сырья
Формально всё сырьё, приобретаемое для производства БАД, должно
иметь сертификаты качества, протоколы испытаний, спецификации или другие
документы [51,52]. Но практика показывает, что при нарушении условий
хранения и транспортировки, качество сырья может ухудшаться, что не всегда
отражается на его внешнем виде. Следовательно, подтверждение пригодности
31
исходного сырья для производства, требует проведения испытаний на
соответствие нормативной документации (так называемый, входной контроль),
что будет гарантировать качество готовой продукции БАД (исключая
технологические ошибки).
2.1.4. Проблема проведения испытаний качества БАД
Из-за
высокой
производители
стоимости
могут
позволить
аналитического
себе
оборудования
оснастить
и
не
все
аккредитовать
производственную лабораторию. Поэтому многие из них проводят испытания по
договорам с аккредитованными на данный вид деятельности контрольно –
аналитическими или испытательными лабораториями. Для проведения испытаний
такой специфической продукции, как БАД, которая выпускается в разных формах
(таблетки, капсулы, пастилки, растворы, спреи, гели, порошки и др.) необходим
опыт и соответствующая подготовка специалистов, современные высокоточные
средства измерений, испытательное оборудование и стандартные образцы [52].
Реклaма БАД в СМИ постоянно увеличивает объем их продаж. Нaм бы
хотелось, чтобы производители уделяли должное внимание кaчеству своей
продукции, так как реaлизация некaчественной продукции дискредитирует не
только сaм продукт, но и ложится “черным пятном” на репутацию производителя,
тем самым оказывает негативное влияние на отношение к БАД у потребителей.
Решение выше перечисленных проблем позволит зaщитить добросовестных
производителей и здоровье потребителей [50,53].
2.2. Должная организация контроля качества БАД
На каждом предприятии, выпускающем БАД, должен быть отдел контроля
качества, независимый от других подразделений. К отделу контроля качества
относятся одна или несколько контрольно-аналитических лабораторий. Для
выполнения своих функций отдел должен быть обеспечен всеми необходимыми
ресурсами [50].
На отдел возлагаются также обязанности по разработке, аттестации
(вaлидации), внедрению всех инструкций (методик) по контролю качества;
хранению
контрольных
образцов
материалов
и
продукции;
контролю
32
правильности маркировки упаковок с материалами и продукцией; обеспечению
контроля стабильности продукции; участию в расследовании рекламаций,
связанных с качеством продукции, и т.п. Все эти функции должны выполняться в
соответствии с утвержденными инструкциями с оформлением протоколов (при
необходимости) [50,53,54].
При оценке качества готовой продукции следует рассматривать все
сопутствующие
факторы,
в
т.ч.
условия
производства,
результаты
внутрипроизводственного контроля, анализ производственной документации (в т.
ч. документации на упаковку), соответствие спецификациям на готовую
продукцию и состояние окончательной упаковки готовой продукции.
Сотрудники
отдела
контроля
качества
должны
иметь
доступ
в
производственные зоны для отбора проб и проведения анализа. Помещения и
оборудование контрольных лабораторий должны соответствовать общим и
специальным требованиям, предъявляемым к зонам контроля качества.
Персонал, помещения и оборудование лабораторий должны соответствовать
виду и объему производства. В отдельных случаях допускается использование
сторонних лабораторий при условии выполнения ими требований, и внесения
соответствующих записей в протоколы контроля качества [50, 55].
К документации по контролю качества относятся:

спецификации;

методики отбора проб;

методики и протоколы проведения испытаний (в т. ч. аналитические
операционные листы и/или лабораторные журналы);

аналитические отчеты и/или паспорта;

результаты
контроля
окружающей среды
в производственных
помещениях;


протоколы аттестации (валидации) аналитических методов;
методики
и
протоколы
калибровки
(поверки)
приборов
и
обслуживания аппаратуры. Эта информация всегда должна быть готова к
представлению в отдел контроля качества [50].
33
Документация по контролю качества, относящаяся к протоколам серий
продукции, должна храниться в течение одного года после истечения срока
годности серии [51,55].
Для некоторых данных (например, результатов аналитических испытаний,
выходов
готовой
продукции,
параметров
окружающей
среды
и
т.п.)
целесообразно хранить протоколы в виде, позволяющем оценивать тенденции
изменения параметров.
В дополнение к протоколам серий продукции следует хранить в доступном
виде и другую первичную информацию (например, лабораторные журналы и/или
протоколы).
Отбор проб должен проводиться в соответствии с утвержденными
инструкциями, включающими в себя:

методику отбора проб;

перечень используемого оборудования;

количество отбираемых проб;

инструкции по разделению отобранной пробы на части (при
необходимости);

тип и характеристики тары для отбора проб;

нанесение маркировки на тару с отобранными пробами;

специальные
меры
предосторожности,
особенно
относительно
стерильных и опасных веществ;

условия хранения;

инструкции по очистке и хранению оборудования для отбора проб.
Отобранные контрольные образцы должны представлять репрезентативную
выборку
серии
материалов
или
продукции.
Возможен
отбор
проб,
характеризующих критические стадии технологического процесса (например, его
начало или окончание).
На маркировке тары с отобранными пробами должны быть указаны ее
содержимое, даты отбора проб и упаковки, из которых эти пробы были отобраны.
34
Отобранные пробы каждой серии готовой продукции должны храниться в
течение одного года после истечения срока ее годности. Готовая продукция
должна, как правило, храниться в своей окончательной упаковке и в
рекомендованных условиях. Контрольные образцы исходного сырья (кроме
растворителей, газов и воды) должны храниться не менее двух лет после выдачи
разрешения на реализацию продукции, если это допускается их стабильностью.
При
меньшем
периоде
стабильности,
указанном
в
соответствующей
спецификации, время хранения может быть сокращено. Количество контрольных
образцов исходного сырья, материалов и продукции должно быть достаточным
для проведения их полного повторного контроля. При необходимости срок
хранения образцов исходного сырья должен быть не менее срока хранения
соответствующей готовой продукции [56].
Аналитические методики должны быть аттестованы (валидированы), в
случае, если они не изложены в [58]. Все испытания, приведенные в нормативной
документации, должны быть выполнены в соответствии с утвержденными
методиками.
Полученные результаты испытаний должны оформляться документально с
тщательной проверкой всех внесенных данных. Все расчеты должны тщательно
проверяться.
Проводимые испытания следует оформлять документально с указанием:

наименования материала или продукции и дозированной формы;

номера серии и наименования производителя и/или поставщика;

ссылки на соответствующие спецификации и методики испытаний;

результатов испытаний, в т. ч. наблюдения, вычисления и ссылки на
все паспорта анализов;

даты проведения испытаний;

фамилий и инициалов лиц, проводивших испытание;

фамилий и инициалов лиц, подтверждавших проведение испытаний и
результаты вычислений;
35

однозначного заключения о выдаче разрешения или отклонении
продукции, даты и подписи ответственного лица.
Все операции по внутрипроизводственному контролю, в т. ч. операции,
выполняемые лицами, непосредственно работающими в производственных зонах,
должны проводиться в соответствии с методиками, утвержденными отделом
контроля качества, а их результаты оформляться документально.
Особое внимание следует уделять качеству лабораторных реактивов, мерной
лабораторной посуды и титрованных растворов, стандартных образцов и
питательных сред. Они должны готовиться в соответствии с письменными
инструкциями.
Реактивы, предназначенные для длительного использования, должны иметь
маркировку с указанием даты приготовления и с подписями исполнителей. На
этикетке
должен
быть
указан
срок
годности
нестабильных
реактивов,
питательных сред и специфические условия их хранения. Для титрованных
растворов
следует
указывать
дату
последнего
установления
титра
и
соответствующий поправочный коэффициент.
При необходимости на таре следует указывать дату получения каждого
вещества, используемого для проведения испытаний (например, реактивов и
стандартных образцов) с соответствующими инструкциями по их использованию
и хранению. В некоторых случаях после получения или перед использованием
реактива может возникнуть необходимость проведения его испытания на
подлинность и/или другого испытания [57].
Требования к безопасности и пищевой ценности БАД устанавливаются
санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами [50] и дополнением
N 1 к этим санитарным правилам СанПиН 2.3.2.1153-02 (введено в действие с
01.01.2003 г.). Последний документ уточняет и дополняет перечень БАВ,
компонентов пищи и продуктов, являющихся их источниками, которые не
допускаются при производстве БАД. Производство и оборот БАД в настоящее
время регулируется санитарно-эпидемиологическими правилами и нормативами
[50]. Правила определяют требования, обязательные для исполнения при
36
разработке и производстве БАД, их ввозе, хранении, транспортировке и
реализации на территории Российской Федерации.
Учитывая, что БАД являются дополнительными источниками пищевых и
биологически активных веществ, в них регламентируется содержание основных
действующих веществ. Таким образом, одной из основных задач в системе
контроля за качеством и подлинностью БАД является качественное и
количественное определение основных биологически активных компонентов в
соответствии с Руководством [58] (введены с 30.06.2003 г.) и методическими
рекомендациями [59] (введены со 02.07.2004 г.). Указанные документы позволяют
соотносить уровни содержания основных действующих веществ с уровнями
суточного потребления в составе рациона.
Производство и оборот БАД допускается только после проведения
подтверждения их соответствия действующим нормативным документам в
порядке, установленном действующим законодательством.
В настоящее время документами подтверждающими соответствие БАД к
пище государственным санитарно-эпидемиологическим правилам и нормативам,
в
частности,
являются:
эпидемиологическое
регистрационное
заключение
регистрации продукции.
или
удостоверение,
свидетельство
о
санитарно-
государственной
37
Выводы к теоретической части
Обобщены и систематизированы литературные данные об аминокислотах и
путях попадания в организм и их биологической роли, а так же проведен анализ и
систематизация известных в настоящее время методов определения аминокислот
в БАД.
Показано, что хроматографические методы используются для
одновременного разделения, идентификации и количественного определения АК
(методы БХ, ТСХ, ГХ, ВЭЖХ, ионообменной хроматографии). Это связано в
первую очередь с тем, что метод ВЭЖХ позволяет не только разделить
большинство эссенциальных АК, но и определить оптические изомеры, что
является одной из главных задач фармацевтического анализа.
38
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Методика эксперимента (подготовка и проведение испытаний)
Экспериментальная часть работы заключалась в адаптации методики [25]
определения АК методом ОФ ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией, для
последующего определения АК в БАД с разным аминокислотным составом.
3 образца БАД разработанные ООО «Внешторг Фарма» с разным
содержанием аминокислот и сложностью матрицы, а именно «Аэрорелакс»,
«Vitime man», «Прегнотон».
Согласно [11] разделение АК в стандартной смеси проведено методом
градиентной ВЭЖХ (Приложение 2). Данный метод для определения АК в БАД
неприменим, так как их состав более сложен (по сравнению со стандартной
смесью АК), определение затруднено влиянием других витаминоподобных и
вспомогательных веществ. В связи с необходимостью определения одной и
четырех АК в
БАД различного состава необходим подбор соответствующих
методов пробоподготовки и проведения испытаний.
3.1. Используемые реактивы

Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61-75

Кислота хлористоводородная по ГОСТ 3118-77

Кислота борная по ГОСТ 9656-75

Кислота меркаптоуксусная (тиогликолевая), CAS 68-11-1

Фталевый альдегид 99%, для синтеза, CAS 643-79-8

Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77

Метанол для ВЭЖХ, ГОСТ 6995-77 с изм. 1

Ацетонитрил для ВЭЖХ CAS 67-64-1.

Триметиламин 45% раствор в воде, CAS: 75-50-3.

Натрий уксуснокислый тригидрат по ГОСТ 199-78.

Натрия тетраборат декагидрат по ГОСТ 4199-76.

ОРА реагент, CAS RN 643-79-8.

Фильтры с диаметром пор 0,45 мкм, ТУ 2642-001-68085491.
39
3.2. Используемые вспомогательные растворы

Подвижная фаза А (ПФ А): 1,360 ± 0,025 г ацетата натрия тригидрата
растворить в 500 мл воды очищенной в мерной колбе вместимостью 1000 мл;
добавить 0,9 мл триметиламина, довести рН до 7,2 ± 0,05 уксусной кислотой 1%.

Подвижная фаза В. (ПФ В): 1,360 ± 0,025 г ацетата натрия тригидрата
растворить в 500 мл воды очищенной в мерной колбе вместимостью 1000 мл;
добавить 100 мл воды очищенной, довести рН до 7,2± 0,05 уксусной кислотой
1%, добавить 200 мл метанола и 200 мл ацетонитрила, перемешать.

Боратный буфер: 7,6 г тетрабората натрия декагидрата растворить в
100 мл воды очищенной, довести рН до 10,4 раствором гидроксида натрия 4%,
отфильтровать через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм».

1% раствор уксусной кислоты: в мерную колбу на 100 мл добавить 30
мл воды очищенной, поместить 1 мл ледяной уксусной кислоты, довести до метки
водой очищенной.

4% раствор гидроксида натрия: в мерную колбу на 100 мл поместить
4 г гидроксида натрия, растворить в 50 мл воды очищенной, довести до метки
водой очищенной.

30% раствор гидроксида натрия: в мерную колбу на 100 мл
поместить 30 г гидроксида натрия, растворить в 50 мл воды очищенной, довести
до метки водой очищенной, перемешать.

0,4 М раствор кислоты борной: поместить 2,472 г борной кислоты в
мерную колбу на 100 мл, растворить в 50 мл воды очищенной, довести до метки
водой очищенной.

ОРА – реагент: поместить 0,5 г фталевого альдегида в мерную колбу
вместимостью 50 мл, добавить 2,5 мл метанола, растворить фталевый альдегид,
довести до метки 0,4 М раствором борной кислотой, перемешать, довести рН
полученного раствора до 10,4 раствором гидроксида натрия 30%, добавить 1 мл
меркаптоуксусной кислоты, довести рН полученного раствора до 10,4 раствором
40
гидроксида натрия 30%. Допускается использование готового ОРА-реагента от
производителя.

Раствор хлористоводородной кислоты, для разведения проб: в
мерную колбу с объёмом 1000 мл поместить 200 мл воды очищенной, осторожно
прилить 8,7 мл хлористоводородной кислоты, довести до метки водой
очищенной.
3.3. Измерительная аппаратура и вспомогательное оборудование
Вся
измерительная
аппаратура,
используемая
в
работе,
прошла
метрологическую аттестацию в соответствии с требованиями государственных
стандартов.
Взвешивание реактивов, стандартных и испытуемых образцов проводилось
с использованием аналитических весов Меттлер Толедо АТ 261 с погрешностью
измерений 0,0001г.
Для определения рН использован анализатор жидкости Эксперт 001 с
погрешностью 0,05 ед.
Использован жидкостной хроматограф с диодноматричным детектором
«Waters Breeze» («Waters Corporation», США). Хроматографическое разделение
проводили на колонке для ОФ-ВЭЖХ Agilent Hypersil AA-ODs (сорбент
силикагель с модифицированные октадецильными группами). Предколонка:
Security Guard 4 x 3.0 с сорбентом, соответствующим колонке.
Для пробоподготовки и приготовлении вспомогательных растворов были
использованы ультразвуковая ванна ПСБ-4035-05, магнитная мешалка ПЭ 6100,
микродозатор 1-канальный SOCOREX ACURA, а также посуда лабораторная
стеклянная по ГОСТ 25336-82 [60].
3.4. Методики проведения испытаний
Для определения аминокислот применяли ПФ А и B для градиентоного и
изократического элюирования (методика приготовления описана в п. 3.1.).
Колонку термостатировали при 40 ºС. Математическая обработка хроматограмм
осуществлялась в программе Microsoft Excel.
41
3.4.1. Приготовление стандартных растворов
Подготовить пять пронумерованных мерных колб, вместимостью 50 мл.
В каждую колбу поместить навеску межгосударственного стандартного
образца аминокислоты в диапазоне от 0,0020 г до 0,0100 г (точная навеска)
Добавить 30 мл раствора хлористоводородной кислоты для разведения
проб.
Поместить в ультразвуковую ванну при температуре 40°С на 10 минут.
Остудить, довести хлористоводородной кислотой для разведения проб до
метки, перемешать.
Отфильтровать через двойной фильтр «Синяя лента».
Хранить стандартные растворы при 40 ºС до времени дериватизации
(п.3.3.3.) и последующего инжектирования.
3.4.2. Подготовка пробы
Отобрать среднюю пробу продукта. Найти средний вес таблетки/капсулы
m1.
Растереть содержимое 10 таблеток/капсул в ступке, либо в другом
устройстве, обеспечивающем равномерное измельчение с конечным размером
зёрен не более 0,2 мм.
Взять навеску препарата, содержащую от 0,005 до 0,01 г одной или
нескольких аминокислот (точная навеска) и поместить в мерную колбу объёмом
50 мл.
Добавить 30 мл хлористоводородной кислоты для разведения проб.
Поместить в ультразвуковую ванну при 40°С на 10 минут, перемешать.
Остудить под струёй холодной воды. Довести до метки раствором
хлористоводородной кислоты для разведения проб, перемешать.
Отфильтровать через двойной фильтр «Синяя лента». Дериватизацию
испытуемых образцов провести согласно пункту 3.3.3.
До дериватизации хранить растворы испытуемых образцов на водяной бане
при 40°С.
42
3.4.3. Проведение предколоночной дериватизации стандартных и
испытуемых растворов

С помощью микродозатора поместить 200 мкл боратного буфера в
виалу объёмом 1,5 мл.

Добавить 40 мкл ОРА-реагента.

Добавить 40 мкл стандартного раствора или испытуемой пробы.

Перемешать, набирая и сливая дозатор 10 раз.

Выдержать приготовленную пробу 3 минуты (но не более 5 мин,
вследствие нестойкости комплекса), после чего ввести в инжектор.
3.4.4. Подготовка хроматографической системы

Включить прибор.

Запустить
инструментальный
метод
для
промывки
прибора.
Инструментальный метод включает в себя условия хроматографирования.

Для того чтобы вывести хроматографическую систему в рабочий
режим, следует промывать её достаточным количеством подвижной фазы до
стабильной базовой линии при постоянном давлении не менее 40 минут.

Ввести стандартный раствор 2-3 раза для насыщения колонки
анализируемыми веществами и получения стабильных результатов.

Далее ввести стандартные и испытуемые образцы.
3.4.5. Условия определения аминокислот методом ВЭЖХ при градиентном
элюировании
Используемый детектор: диодноматричный.
Длины волн: диапазон детектирования от 210 до 450 нм; идентификация и
количественное определение - 338 нм.
Объём инжекции: 10 мкл.
Поток: 0,7 мл/мин.
Условия градиентного элюирования с учетом времени на уравновешивание
системы для следующего закола представлены в таблице 5.
43
Таблица 5. Условия градиентного элюирования
Время,
Мин
0
17
18
24
22
40
ПФ А,
%
100
40
0
0
100
100
ПФ В,
%
0
60
100
100
0
0
3.4.6. Условия определения аминокислот методом ВЭЖХ при
изократическом элюировании
Детектор: диодноматричный.
Длины волн: диапазон детектирования от 210 до 450 нм; идентификация и
количественное определение - 338 нм.
Объём инжекции: 10 мкл.
Поток: 0,45 мл/мин.
Время инжекции: 10 минут.
Элюент: ПФ А и Б в соотношении 86%:24%.
3.5. Математическая обработка результатов эксперимента
Концентрацию
первичного
стандартного
образца
аминокислоты
(в
пересчете на чистое вещество) рассчитать по следующей формуле:
Формула 1.
где m-навеска первичного стандартного образца аминокислоты, мг;
Р – чистота стандарта, %;
V – объем разведения образца, мл.
Построить для каждой аминокислоты графики зависимости содержания в
навеске от площади хроматографического пика с учетом чистоты стандарта,
прямая должна проходить через начало координат.
Вывести калибровочное уравнение по формуле:
44
Формула 2.
где k – тангенс угла наклона калибровочной прямой.
аминокислоты
– площадь пика, соответствующая аминокислоте по времени
удерживания.
Идентифицировать пики по времени удерживания.
Найти количественное содержание аминокислот, исходя из калибровочного
графика по формуле 5:
, где
Формула 3.
m – содержание аминокислоты, мг/таб ;
m пробы – масса навески, г ;
k – тангенс угла наклона калибровочной прямой;
аминокислоты
– площадь пика, соответствующего аминокислоте по времени
удерживания
m1 – средний вес таблетки/капсулы, г.
Рассчитать среднее значение содержания основного вещества по формуле 6:
,
Формула 4.
где n – объем выборки,n=6;
– значение содержания.
Рассчитать стандартное отклонение S величины фактора отклика по
формуле:
,
Формула 5.
Коэффициент вариации V рассчитали по формуле:
45
,
Формула 6.
Доверительный интервал рассчитываем по формуле:
,
коэффициент Стьюдента при р=0,95 и n=6 равен tр,f=2.6.
Формула 7.
46
Глава 4. Результаты исследований
Оптимальные условия хроматографирования аминокислот определяли по
методике, описанной в п. 3.4.
4.1. Результаты исследований продукта «Аэрорелакс» методом
ВЭЖХ с изократическим элюированием
Заявленное содержание глицина в БАД: 525±75 мг/табл.
Были приготовлены шесть растворов первичного стандартного образца
глицина с шестью различными концентрациями (с ≈10; 8; 6; 4; 2; 1 мг / на 50 мл
растворителя).Первая концентрация использовалась как контрольный образец.С
использованием этих растворов были определены:
 линейная зависимость площади пика от концентрации;
 уравнение регрессионной прямой (калибровочная прямая)
Точные навески первичного глицина приведены в таблице 7.
Концентрацию первичного стандартного образца глицина (в пересчете на
чистое вещество) рассчитали по следующей формуле №1
Пример расчета для стандарта глицина №1
Навеска первичного стандартного образца m=10,69 мг;
Чистота стандарта = 99,9%;
Разведение пробы проводилось в мерной колбе вместимостью 50 мл.
Концентрация раствора первичного стандартного образца составляет:
Результаты расчетов концентрации всех шести проб представлены в
таблице 6.
По хроматограммам заколов каждого из шести первичных стандартных
образцов определили площадь идентифицируемого пика глицина. Результаты
представлены в таблице 7. Хроматограмма первого стандартного образца
представлена на рисунке 2.
47
Рис 2. Хроматограмма стандартного образца глицина.
Определили зависимость площади пика от концентрации и получили график
линейной зависимости площади от концентрации стандартного образца (рис.3).
0,25
y = 0,0000000640x
R² = 0,9863285538
С глицина, мг/мл
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
Площадь пика глицина
Рис. 3. График линейной зависимости площади от концентрации стандартного
образца.
Линейное уравнение имеет вид: y =0,0000000640х, где:
48
у – измеряемая величина;
a – свободный член линейной зависимости, a=0,0000000640
Статистические характеристики линейной регрессии представлены в
таблице 6:
Таблица 6.
Статистические характеристики
линейной регрессии
Уравнение прямой
Наклон а
Результат
y = 0,0000000640х
0,0000000640
Таблица 7.
№ п/п
Навеска (m), мг
1
2
3
4
5
6
10,69
8,24
6,08
4,26
2,23
1,12
с (m×0,999)/50
мг/мл
0,212
0,163
0,120
0,084
0,044
0,022
Площадь пика S
3358695
2531716
1979498
1055412
505684
216841
Были приготовлены 6 растворов образца «Аэрорелакс» с близкими
концентрациями (с ≈130,0 мг/50 мл растворителя). Навески образца продукта
«Аэрорелакс» представлены в таблице 8.
Содержание глицина в этих растворах было рассчитано при помощи
калибровочной прямой y = 0,0000000640х.
Каждый из растворов был однократно инжектирован и проанализирован в
соответствии с выбранным методом количественного определения.
Полученные значения площадей пиков представлены в таблице 6.
Пример расчета для образца «Аэрорелакс» №1
Навеска образца № 1 m=0,12801 г;
Разведение пробы проводилось в мерной колбе вместимостью 50 мл.
Концентрацию образца №1 (рассчитали по следующей формуле №1):
49
Результаты расчетов концентрации всех шести проб представлены в
таблице 8.
Содержание глицина в образце №1 вычислили по формуле 3.
Таблица 8
№
п/п
1
2
3
4
5
6
Навеска
(m), мг
0,12801
0,12676
0,13056
0,12896
0,13254
0,13154
С (m)/50
мг/мл
0,0025602
0,0025352
0,0026112
0,0025792
0,0026508
0,0026308
k
S пика
0,000000064
0,000000064
0,000000064
0,000000064
0,000000064
0,000000064
20084373
19957865
20357865
19892017
20557865
20599865
Средний вес,
г
1
1
1
1
1
1
Х
502,0701
503,8275
498,9673
493,5984
496,3420
501,1371
Рассчитали среднее значение содержания основного вещества по формуле
4:
Рассчитали стандартное отклонение s величины фактора отклика по
формуле 5:
Коэффициент вариации V рассчитали по формуле 6:
Доверительный интервал рассчитываем по формуле 7:
Статистические характеристики содержания глицина в БАД «Аэрорелакс»
представлены в таблице 9.
50
Таблица 9.
статистические характеристики
Среднее значение
Стандартное отклонение
Коэффициент вариации, %
Доверительный интервал (Р=95%)
Результат, (мг)
499,32
3,82
0,01
499,32±3,82
Хроматограмма первого образца представлена на рисунке 4.
Рис 4.Хроматограмма образца БАД «Аэрорелакс».
4.2. Результаты исследований продукта «Vitime Мan» методом
градиентного элюирования
«Vitime Man» заявлено содержание 4х аминокислот:
Аргинин: 50±7,5 мг/табл.
Валин: 30,0±4,5 мг/табл.
Изо-Лейцин: 30,0±4,5 мг/табл.
Лейцин: 60,0±9,0 мг/табл.
Были приготовлены пять растворов первичных стандартных образцов
аминокислот, в первых четырех из них содержалась каждая аминокислота по
отдельности для идентификации, в пятом все вместе, с концентрациями до 10 мг
на 50 мл растворителя. С использованием этих растворов были определены:
51
 линейная зависимость площади пика от концентрации;
 уравнение регрессионной прямой (калибровочная прямая)
Точные навески первичных стандартных образцов приведены в таблице 10.
Концентрацию первичных стандартных образцов (в пересчете на чистое
вещество) рассчитали по формуле №1.
Пример расчета для стандарта аргинина №1
Навеска первичного стандартного образца m=10,48 мг;
Чистота стандарта = 99,3%;
Разведение пробы проводилось в мерной колбе вместимостью 50 мл.
Концентрация раствора первичного стандартного образца составляет:
Результаты расчетов концентрации всех стандартных образцов аминокислот
представлены в таблице 10.
По хроматограммам заколов каждого из четырех первичных стандартных
образцов
определили
площадь
идентифицируемых
пиков
аминокислот.
Результаты представлены в таблице 10. Хроматограммы стандартных образцов
представлены на рисунках 5,7 - 10.
Рис.5. Хроматограмма стандартного образца агринина.
52
Определили зависимость площадей пиков стандартов от концентраций и
получили четыре графика линейной зависимости площади от концентрации
стандартных образцов (рис.6).
0,25
y = 0,0000001701x
R² = 0,9994615040
С аргинина, мг/мл
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
Площадь пика аргинина
Рис.6. График линейной зависимости площади от концентрации стандартного
образца.
Линейное уравнение имеет вид: y =0,00000001701х, где:
у – измеряемая величина;
a – свободный член линейной зависимости, a=0,00000001701
Статистические характеристики линейных регрессий стандартных образцов
аминокислот представлены в таблице 11.
53
Рис.7. Хроматограмма стандартного образца валина.
Рис.8. Хроматограмма стандартного образца лейцина.
54
Таблица 10.
Название
№ п/п
Навеска
(m), мг
Чистота
стандарта (Р), %
с (m×Р)/50
мг/мл
Площадь
пика S
Аргинин
1
2
1
2
1
2
1
2
10,48
8,16
10,96
7,49
10,56
8,57
10,53
6,37
99,30%
99,30%
100%
100%
100%
100%
100%
100%
0,208
0,162
0,219
0,150
0,211
0,171
0,211
0,127
1210434
969204
2204328
1507017
1768632
1490554
1797026
1174406
Валин
Изолейцин
Лейцин
Таблица 11.
Статистические характеристики
линейных регрессий
Уравнение прямой аргинина
Наклон а
Уравнение прямой валина
Наклон а
Уравнение прямой изолейцина
Наклон а
Уравнение прямой лейцина
Наклон а
Результат
y = 0,00000001701х
0,00000001701
y = 0,00000000994х
0,00000000994
y = 0,0000001176х
0,0000001176
y = 0,0000001146х
0,0000001146
Рис 9. Хроматограмма стандартного образца изолейцина.
55
Рис 10. Хроматограмма суммы аминокислот.
Каждый из растворов был однократно инжектирован и проанализирован в
соответствии с выбранным методом количественного определения.
Пример расчета для образца «Vitime man» №1 на примере содержания аргинина.
Навеска образца m=0,15466 г;
Разведение пробы проводилось в мерной колбе вместимостью 50 мл.
Концентрацию образца (рассчитали по следующей формуле №1):
Результаты расчетов концентрации всех шести проб представлены в
таблице 12.
Содержание агринина в образце №1 вычислили по формуле 3.
56
Таблица 12.
№ п/п
Навеска
(m), мг
1
2
3
4
5
6
0,15466
0,15268
0,15061
0,14031
0,15401
0,15396
С
(m×0,993)/50
мг/мл
0,0030932
0,0030536
0,0030122
0,0028062
0,0030802
0,0030792
Средний
вес, г
K
S пика
Х
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
0,8
1,701E-07
1,701E-07
1,701E-07
1,701E-07
1,701E-07
1,701E-07
1240687
1225586
1205113
1181746
1235786
1225562
54,58189
54,61676
54,44253
57,30596
54,59573
54,16163
Рассчитали среднее значение содержания основного вещества по формуле
4:
Рассчитали стандартное отклонение s величины фактора отклика по
формуле 5:
Коэффициент вариации V рассчитали по формуле 6:
Доверительный интервал рассчитываем по формуле 7:
Статистические характеристики содержания аргинина в БАД «Vitime man»
представлены в таблице 13.
Таблица 13.
статистические характеристики
Среднее значение
Стандартное отклонение
Коэффициент вариации, %
Доверительный интервал (Р=95%)
Результат, (мг)
54,95
1,17
2,12
54,95±1,17
Одна из полученных хроматограмм отображена на рисунке 11.
57
Рис.11. Хроматограмма продукта «Vitime man».
По такому же принципу было рассчитано содержание остальных АК в
продукте, а так же статистические характеристики для каждой из них. Результаты
представлены в таблице 14.
Таблица 14.
Название
Статистические характеристики
Среднее значение
(площадь×мл/мг)
Стандартное отклонение
(площадь×мл/мг)
Коэффициент вариации
Доверительный интервал (Р=95%)
Валин
Результат,
(мг)
Изолейцин
Результат,
(мг)
Лейцин
Результат,
(мг)
27,75
26,11
54,7
1,04
1,09
1,12
3,73
27,75±1,04
3,58
26,11±1,09
3,61
54,7±1,12
58
4.3. Результаты исследований продукта «Прегнотон» методом
изократического элюирования
Заявленное содержание аргинина в БАД: 777,75 – 1052,25 мг/саше.
Были приготовлены шесть растворов первичного стандартного образца
глицина с шестью различными концентрациями (с ≈10; 8; 6; 4; 2; 1 мг / на 50 мл
растворителя). С использованием этих растворов были определены:
 линейная зависимость площади пика от концентрации;
 уравнение регрессионной прямой (калибровочная прямая)
Точные навески первичного аргинина приведены в таблице 16.
Концентрацию первичного стандартного образца аргинина (в пересчете на
чистое вещество) рассчитали по следующей формуле №1
Пример расчета для стандарта аргинина №1
Навеска первичного стандартного образца m=10,09 мг;
Чистота стандарта = 99,3 %;
Разведение пробы проводилось в мерной колбе вместимостью 50 мл.
Концентрация раствора первичного стандартного образца составляет:
Результаты расчетов концентрации всех шести проб представлены в
таблице 16.
.
По хроматограммам заколов каждого из шести первичных стандартных
образцов определили площади идентифицируемых пиков аргинина. Результаты
представлены в таблице 16. Хроматограмма первого стандартного образца
представлена на рисунке 12.
59
Рис 12. Хроматограмма стандартного образца аргинина.
Определили зависимость площади пика от концентрации и получили график
линейной зависимости площади от концентрации стандартного образца (рис.13).
0,25
y = 0,0000000988x
R² = 0,9938685301
С аргинина, мг/мл
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
500000
1000000
1500000
Площадь пика аргинина
2000000
2500000
Рис. 13. График линейной зависимости площади от концентрации стандартного
образца
60
Линейное уравнение имеет вид: y =0,0000000988х, где:
у – измеряемая величина;
a – свободный член линейной зависимости, a=0,0000000988
Статистические характеристики линейной регрессии представлены в
таблице 15:
Таблица 15
Статистические характеристики
линейной регрессии
Уравнение прямой
Наклон а
Результат
y = 0,0000000988х
0,0000000988
Таблица 16
№ п/п
Навеска (m),
мг
1
2
3
4
5
6
10,09
8,56
6,34
4,86
2,31
1,03
с
(m×0,993)/50 Площадь пика S
мг/мл
0,200
2068974
0,170
1618741
0,126
1254781
0,097
1036518
0,046
523663
0,02
254756
Были приготовлены 6 растворов образца «Прегнотон» с близкими
концентрациями (с ≈60,0 мг/50 мл растворителя). Навески образца продукта
«Прегнотон» представлены в таблице 8.
Содержание аргинина в этих растворах было рассчитано при помощи
калибровочной прямой y = 0,0000000988х.
Каждый из растворов был однократно инжектирован и проанализирован в
соответствии с выбранным методом количественного определения.
Полученные значения площадей пиков представлены в таблице 17.
Пример расчета для образца «Прегнотон» №1
Навеска образца № 1 m=0,06030 г;
Разведение пробы проводилось в мерной колбе вместимостью 50 мл.
Концентрацию образца №1 (рассчитали по формуле №1):
61
Результаты расчетов концентрации всех шести проб представлены в
таблице 17.
Содержание аргинина в образце №1 вычислили по формуле 3.
Таблица 17
№ п/п
1
2
3
4
5
6
Навеска
(m), мг
0,06030
0,05787
0,06433
0,06523
0,06355
0,06752
С (m)/50
мг/мл
0,001206
0,0011574
0,0012865
0,0013051
0,0012709
0,001350
Средний
вес, г
5
5
5
5
5
5
K
S пика
Х
9,88E-08
9,88E-08
9,88E-08
9,88E-08
9,88E-08
9,88E-08
2075888
2004763
2209473
2260251
2205472
2330296
850,3223
855,6704
848,4102
855,5390
857,2420
852,4493
Рассчитали среднее значение содержания основного вещества по формуле
4:
Рассчитали стандартное отклонение s величины фактора отклика по
формуле 5:
Коэффициент вариации V рассчитали по формуле 6:
Доверительный интервал рассчитываем по формуле 7:
Статистические характеристики содержания аргинина в БАД «Прегнотон»
представлены в таблице 18.
62
Таблица 18.
статистические характеристики
Среднее значение
Стандартное отклонение
Коэффициент вариации, %
Доверительный интервал (Р=95%)
Результат, (мг)
850,1139
3,45
0,41
850,1139±3,67
Хроматограмма образца «Прегнотон» представлена на рисунке 13.
Рис.13. Хроматограмма образца «Прегнотон».
4.4. Изучение стабильности аминокислот в БАД
Содержания аминокислот в БАД на протяжении 729 суток хранения (0
сутки, 92 сутки, 181 сутки, 365 сутки, 729 сутки) определяли по методикам,
описанным в п. 3.4. По полученным данным строили графики зависимоти
содержания АК от времени.
Содержание глицина в БАД «Аэрорелакс» представлено на рисунке 14.
63
Содержание глицина, мг/табл
505
500
499,32
495
494,9
490,3
490
485
480
475
471,6
470
468,4
465
0
100
200
300
400
500
Хранение, сутки
600
700
800
Рис.14. График зависимости содержания глицина в БАД «Аэрорелакс» от
времени.
Из графика зависимости мы видим, что разрушение аминокислоты
происходит
постепенно,
на
729
сутки
хранения
содержание
глицина
соответствует заявленному.
Содержание АК в БАД «Vitime man» представлено на рис.15-18.
Содержание аргинина, мг/табл
56
55
54,95
54
53,08
53
52
51
50,36
50
49
48,30
48
47,21
47
46
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Хранение, сутки
Рис.15. График зависимости содержания аргинина в БАД «Vitime man» от
времени.
64
Содержание валина, мг/табл
28
27,8
27,75
27,6
27,4
27,31
27,2
27
26,93
26,85
26,8
26,64
26,6
26,4
0
100
200
300
400
500
Хранение, сутки
600
700
800
Рис.16. График зависимости содержания валина в БАД «Vitime man» от
времени.
Содержание изолейцина, мг/табл
26,15
26,11
26,1
26,05
26,03
26
26,00
25,95
25,9
25,90
25,87
25,85
0
100
200
300
400
500
Хранение, сутки
600
700
800
Рис.17. График зависимости содержания изолейцина в БАД «Vitime man»
от времени.
65
Содержание лейцина, мг/табл
55
54,7
54,5
54
53,5
53,2
53
52,95
52,86
52,5
52,31
52
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Хранение, сутки
Рис.18. График зависимости содержания лейцина в БАД «Vitime man» от
времени.
Из графиков зависимости мы видим, что разрушение АК происходит
постепенно, на 729 сутки хранения содержание АК соответствует заявленному.
Содержание аргинина в БАД «Прегнотон» представлено на рис.19.
Содержание аргинина, мг/табл
855
850,12
850
845
840
835
830,2
830
828,6
825
821,54
820
817,8
815
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Хранение, сутки
Рис.19. График зависимости содержания аргинина в БАД «Прегнотон» от
времени.
66
Из графика зависимости мы видим, что разрушение АК происходит
постепенно, на 729 сутки хранения содержание АК соответствует заявленному.
67
Выводы к экспериментальной части
1. В работе адаптирована методика определения аминокислот в БАД
имеющих наиболее сложный состав с применением ВЭЖХ при помощи
градиентного элюирования и дериватизации орто - фталевым альдегидом.
Найдены оптимальные условия определения аналитов.
2. Проведен мониторинг содержания заявленного количества аминокислот
в биологически - активных добавках «Аэрорелакс», «Vitime man», «Прегнотон»
разработанных компанией ООО «Внешторг Фарма», выявлено, что содержание
целевого компонента – аминокислот соответствует прописанной норме (мг/табл),
(мг/саше).
3. Изучена стабильность аминокислот в различных БАД на протяжении
указанного срока хранения (2 года). Сделаны практические рекомендации о связи
содержания аминокислот в препаратах и времени их хранения.
68
Выводы:
1. В работе обобщены и систематизированы литературные данные об
аминокислотах, их биологической роли, а так же путях попадания в организм
человека и их биологической роли. Проведен анализ и систематизация известных
в настоящее время методов определения аминокислот в БАД.
2. Проведен
литературный
обзор
основных
способов
и
методик
определения аминокислот, изучены теоретические аспекты их действия,
проведено
сравнение
статистических
характеристик
с
целью
подбора
оптимальных условий для конкретных аналитических целей.
4. В работе адаптирована методика определения аминокислот в БАД
имеющих наиболее сложный состав с применением ВЭЖХ при помощи
градиентного элюирования и дериватизации орто - фталевым альдегидом.
Найдены оптимальные условия определения аналитов.
5. Проведен мониторинг содержания заявленного количества аминокислот
в биологически - активных добавках «Аэрорелакс», «Vitime man», «Прегнотон»
разработанных компанией ООО «Внешторг Фарма», выявлено, что содержание
целевого компонента – аминокислот соответствует прописанной норме (мг/табл),
(мг/саше).
6. Изучена стабильность содержания аминокислот в различных БАД на
протяжении указанного срока хранения (2 года). Сделаны практические
рекомендации о связи содержания аминокислот в препаратах и времени их
хранения.
69
Список используемой литературы.
1.
Биохимия: Учебник / Под. ред.Е.С. Северина. – 4-е изд., испр. – М.: ГЕОТАР
– Медиа, 2006. Б-63 – 784 с.
2.
Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека: В 2-х томах.
Т. 1. Пер. с англ.: — М.: Мир, 1993. - 384 с.
3.
Биохимия: учеб. для вузов / В.П., Комов, В.Н. Шведова. – М.:Дрофа, 2004.638, с.:ил. – (Высшее образование: Современный учебник).
4.
Лысиков, Ю.А. Аминокислоты в питании человека / Ю.А. Лысиков //
Экспериментальная и клиническая гастроэнтология. – 2012. – N2. – C.88 –
105
5.
Open Library. «Аминокислоты и пептиды в промышленности и медицине»:
[Электронный ресурс]. – Режим доступа: http://oplib.ru/ mashinostroenie
/view/379675_aminokisloty_kak_lekarstvennye_veschestva.
6.
Никитина, Л. П. Биохимия азотистый обмен в норме и при патологии:
учебное пособие / Л.П. Никитина, А.Ц. Гомбоева, Н.С. Кузнецова; под ред.
проф. Б.С. Хышиктуева. – Чита, 2009. – 22с.
7.
Определение показателей биологической ценности продуктов питания
расчетным методом: методические указания к лаб. занятиям по дисциплине
«Техническая биохимия» для студентов, обучающихся по направлению
«Биотехнология» дневной формы обучения / НГТУ; сост.: Т.Н. Соколова,
В.М. Прохоров, В.Р. Карташов, Н. Новгород, 2015. – 7 с.
8.
«Высокоэффективная
жидкостная
хромматография.
Применение
в
фармацевтическом анализе»: [Электронный ресурс]. – Режим доступа:
http://helpiks.org/ 8-37772.html
9.
Долгоносов А. М, Рудаков О. Б., Прудковский А. Г. Колоночная
аналитическая
хроматография:
практика,
теория,
моделирование:
Монография. — 2-е изд., испр. - СПб.: Издательство «Лань», 2015. — 468 с.:
ил. — (Учебники для вузов. Специальная литература).
70
10. Тринеева О.В. Методы контроля аминокислот в фармацевтическом анализе
(обзор) / О.В. Тринеева // Разработка и регистрация лекарственных средств. –
2015. – №11.
11. Методы анализа минорных биологически активных веществ пищи / Под ред.
В.А. Тутельяна и К.И. Эллера. – М.: Издательство «Династия», 2010. –160 с.
12. Руденко А.О. Определение важнейших аминокислот в сложных объектах
биологического происхождения методом обращённо-фазовой ВЭЖХ с
получением фенилтиогидантоинов аминокислот / O.А. Руденко, Л.А.
Карцова // Сорбционные и хроматографические процессы. 2010. Т.10. Вып. 2.
– Санкт-Петербургский государственный Университет, Санкт-Петербург.
13. Бекетов
В.И.
Флуореметрическое
определение
аминокислот
и
фотохимическая устойчивость продуктов их реакции с ортофталевым
альдегидом под воздействием мощного импульсного лазерного излучения /
В.И. Бекетов, Р.Д. Воронина, Н.Б. Зоров // Вестник. Моск. Ун-та. Сер. 2.
химия. 2012. Т. 53. № 4
14. Orwar O., Sandberg. H., Jacobson I. et al. // Anal. Chem. 1994. 66. N 24. P. 4471.
15. Zuman P. // Chem. Rev. 2004. 104. N 7. P. 3217.
16. Биохимия : практикум : учеб.-метод. пособие / Г. Г. Борисова, Н. В. Чукина,
И. С. Киселева, М. Г. Малева ; под общ. ред. Г. Г. Борисовой ; М-во
образования и науки Рос. Федерации, Урал. федер. ун-т. — Екатеринбург :
Изд-во Урал. ун-та, 2017. — 116 с.
17. Шугалей, И.В., Гарабаджиу А.В. Химия белка. Учебное пособие / И. В.
Шугалей, А.В. Гарабаджиу — СПб.: Проспект Науки, 2010. — 200 с.
18. Артеменко А.И., Тикунова И.В., Ануфриев Е. К. Практикум по органической
химии: Учеб. Пособие для студентов строит. Спец. вузов. – 3-е изд., испр. –
М.: Высшая школа, 2001. –187 с., ил.
19. Б.
Г.
Беленький.
Лабораторное
руководство
по
смежным
хроматографическим методам , пер. с англ., т. 1, М., 1982, с. 58-151.
и
71
20. Васильев В. П. Аналитическая химия, В 2 кн. Кн. 2 Физико-химические
методы анализа: Учеб. для студ. вузов, обучающихся по химико-технол.
спец. – 4-е изд., стереотип. – М.: Дрофа, 2004 – 384 с.
21. Сакодынского В.И. Аналитическая хроматография / Под ред. В.И.
Сакодынского и др. М.: Химия, 1993, с. 19 – 21.
22. Кнорре Д.Г. Физическая химия / Д. Г. Кнорре, Л. Ф. Крылова, В.С.
Музыкантов. - М.: Высш. шк., 1990. – 416с.
23. Алесковский В.Б. Физико-химические методы анализа. Практическое
руководство / В.Б. Алесковский , М.И. Булатов - Л.: Химия, 1988. – 376 с.
24. Ольшанова К.М. Практикум по хроматографическому анализу / К.М.
Олышанова - М.: Высш. школа, 1970. – 312с.
25. ОФС.1.2.3.0011.15. Определение азота в органических соединениях методом
Къельдаля.
26. ГОСТ 25179-2014 «Молоко и молочные продукты. Методы определения
массовой доли белка».
27. Аминокислотный и минеральный состав надземной части Atragene Speciosa /
И.В. Шилова, Е.А. Краснов, Н.В. Барановская и др. // Хим.-фарм. журн. –
2002. – Т. 36, № 11. – С. 36–38.
28. Балаховский И.С. Определение суммарного количества аминокислот в крови и других биологических жидкостях / И.С. Балаховский, В.А. Варфоломеев // Лаб. дело. – 1977. – № 4. – С. 213–216.
29. Бестужева С.В. Разделение и количественное определение свободных аминокислот в сыворотке крови на пластинах Фиксион 50 х 8 / С.В. Бестужева //
Лаб. дело. – 1977. – № 3. – С. 133–136.
30. Бондаренко Б.Н. Количественное определение аминокислот при хроматографии в тонком слое / Б.Н. Бондаренко // Лаб. дело. – 1984. – № 2. – С. 118–
120.
31. Доссон Р. Справочник биохимика / Р. Доссон, Д. Эллиот – М.: Мир, 1991. –
544 с.
72
32. Зенкова Е.А. 1,2,3,4-тетрагидро-1,4-диоксо-2,2,3,3-тетрагидроксинафта-лин
как реагент для обнаружения биогенных аминов методом ТСХ и источник
получения нингидринового реактива / Е.А. Зенкова, Е.В. Дегтярев // Хим.фарм. журн. – 2000. – Т. 34, № 2. – С. 46–48.
33. Зенкова Е.А. Оптимизация получения нингидринового реактива из 1,2,3,4тетрагидро-1,4-диоксо-2,2,3,3-тетрагидроксинафталина (оксолина) и возможности его применения / Е.А. Зенкова, Е.В. Дегтярев // Хим.-фарм. журн. –
2000. – Т. 34, № 3. – С. 31–33.
34. Khan A.A. Studies of the kinetics and mechanism of interaction of α-aminoacids
with ninhydrin // J. Indian Chem. Soc. – 1989. – VOL. 66, № 7. – P. 454–456.
35. Машковский, М.Д. Лекарственные средства: В 2-х Т. – 14-е изд. перераб. и
доп. – М.: Новая волна, 2000. – Т. 1–2.
36. Тыжигирова, В. В. Анализ комбинированных лекарственных препаратов:
учебное пособие / В. В. Тыжигирова; ФГБОУ ВО ИГМУ Минздрава России,
Кафедра фармацевтической и токсикологической химии. – Иркутск: ИГМУ,
2016. – 108 с.
37. Фармацевтическая химия: учебник / под ред. Г. В Раменской. – М. : БИНОМ.
Лаборатория знаний, 2015. – 467 с.
38. Химия биологически активных и природных соединений / Под ред. Н.А.
Преображенского, Р.П. Евстигнеевой. – М.: Химия, 1970. – 512 с.
39. Мельситова, И. В. Качество и безопасность продуктов питания: пособие. В 2
ч. Ч. 1. Качество продуктов питания / И. В. Мельситова. – Минск: БГУ, 2014.
40. Суханов, Б.П. Состояние и перспективы развития законодательной базы
оборота биологически активных добавок к пище в некоторых странах мира /
Б.П. Суханов [и др.] // Вопросы питания. - 2005. -№ 6. – С. 37-40.
41. Бреднева, Н.Д. Биологически активные добавки к пище: правовое
регулирование рынка, распространение, контроль качества и перспективы
развития / Н.Д. Бреднева, В.В. Тихонова, Т.А. Угрюмова // Порядок отбора и
контроля наркотических веществ, психотропных веществ и биологически
73
активных добавок к пище: учеб.-метод, пособие. - Тюмень: Изд. центр
"Академия", 2004. – С. 3-29.
42. Суханов, Б.П. Биологически активные добавки к пище. Сообщение 1 / Б.П.
Суханов, М.Г. Керимова // Вопросы питания. – 2004- № 3. – С. 31-34.
43. Суханов, Б.П. Биологически активные добавки к пище: законодательная и
нормативная база. Сообщение 2. / Б.П. Суханов, М.Г. Керимова // Вопросы
питания. – 2004 - № 6. – С. 40-48.
44. Евдокимова, О.В. Что такое БАД и с чем их едят? / О.В. Евдокимова //
Фармацевтические ведомости. – 2005. - № 2. – С. 7-9.
45. Суханов, Б.П. Требования к БАД в свете современной законодательной базы
/ Б.П. Суханов, М.Г. Керимова // Фармацевтические ведомости. – 2005. - № 2.
– С. 13-18.
46. Тутельян, В.А. Реализация концепции государственной политики здорового
питания
населения
России
на
региональном
уровне:
формирование
региональной политики и региональных программ. Методические аспекты
разработки и реализации программ / В.А. Тутельян, Б.П. Суханов и др. //
Вопросы питания. – 2005. - N° 2. – С. 3-8.
47. Позняковский В.М. Пищевые и биологически активные добавки./ В.А.
Позняковский., А.Н. Австриевских. // Москва - Кемерово: Издат. объед.
«Российские университеты», 2005. – 275с.
48. Булдаков А.С. Пищевые добавки. / А.С. Булдаков // Cправочник. СанктПетербург, 1996.
49. СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой
ценности пищевых продуктов».
50. Постановление Правительства Российской Федерации от 29 сентября 1997 г.
№
1263
«Об
некачественных
утверждении
и
опасных
Положения
о
проведении
продовольственного
сырья
экспертизы
и
пищевых
продуктов».
51. «Проведение испытаний качества БАД »: [Электронный ресурс]. – Режим
доступа: http://stydopedia.ru/ 4x4e51.html
74
52. МУК
2.3.2.721-98
«Определение
безопасности
и
эффективности
биологически активных добавок к пище».
53. Постановление Правительства Российской Федерации от 29 сентября 1997 г.
№
1263
«Об
некачественных
утверждении
и
опасных
Положения
о
проведении
продовольственного
сырья
экспертизы
и
пищевых
продуктов».
54. Федеральный
закон
«О
санитарно-эпидемиологическом
благополучии
населения» от 30 марта 1999 г. № 52-ФЗ.
55. ОФС.1.1.0004.15. Отбор проб. – С.5-13.
56. ПНД Ф 12.10.1-2000 «Методические рекомендации по проверке качества
химических реактивов, используемых при выполнении количественного
химического анализа».
57. Р 4.1.1672-03 «Руководство по методам контроля качества и безопасности
биологически активных добавок к пище».
58. МР
2.3.1.1915-04
«Рекомендуемые
уровни
потребления
пищевых
и
биологически активных веществ».
59. ГОСТ 25336-82 «Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы,
основные параметры и размеры».
75
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа