close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

Борисова Юлия Романовна. Твердотельные тест-системы на основе алюмосиликатов для определения тетрациклина в реальных объектах

код для вставки
АННОТАЦИЯ
Выпускная квалификационная работа изложена на 60 страницах, содержит
введение, 4 главы, заключение, список литературы. В работе представлены 4
таблицы и 20 рисунков.
Ключевые слова: тетрациклин, тест-системы, алюмосиликаты, наночастицы,
тонкопленочное покрытие.
Целью выпускной квалификационной работы является разработка тестсистемы для определения тетрациклина в реальных объектах путем получения и
изучения оптических свойств материалов на основе наночастиц железа(III),
иммобилизованных в матрице тонкой пленки синтетического алюмосиликата.
Для достижения поставленной цели в работе были решены следующие
задачи:

систематический анализ литературных источников по проблемам
мониторинга содержания антибиотиков тетрациклинового ряда в
объектах сложного химического состава и методах их определения;

синтез наночастиц на основе Fe(III), исследование влияния
условий получения на их гранулометрический состав;

получение тонкопленочных покрытий алюмосиликатов на
подложке с заданными характеристиками;

изучение морфологии поверхности пленок алюмосиликата до и
после сорбционного модифицирования нанокластерами Fe(III);

спектрофотометрическое изучение реакции взаимодействия
Fe(III) с тетрациклином в растворе;

изучение оптических свойств систем «Алюмосиликат - Fe(III)»
по отношению к тетрациклину.
Научная и практическая значимость работы заключается в следующем:
впервые изучены тест-системы на основе алюмосиликатов для определения
тетрациклина. Полученные данные могут быть использованы при разработке
тест-системы для определения тетрациклина в реальных объектах при скрининганализе.
2
Оглавление
ВВЕДЕНИЕ ...................................................................................................................... 4
I. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ ....................................................................................... 6
Глава 1. Общая характеристика тетрациклина и способов его определения ........... 6
1.1 Общие сведения, применение, воздействие на организм человека ..................... 6
1.2 Пути попадания в продукты питания...................................................................... 9
1.3 Мониторинг содержания в продуктах питания ................................................... 10
1.4 Методы определения остаточных количеств в продуктах питания .................. 11
1.4.1 Определение методом ВЭЖХ ............................................................................. 11
1.4.2 Люминесцентные методы.................................................................................... 12
1.4.3 Электрохимические методы ................................................................................ 14
1.4.4 Скрининговые методы ......................................................................................... 15
1.4.5 Иммунологические и микробиологические методы ........................................ 16
1.4.6 Тест-методы .......................................................................................................... 17
Глава 2. Тест-системы: общая характеристика .......................................................... 19
2.1 Характеристика тест-систем и требования к ним ................................................ 19
2.2 Системы регистрации визуального сигнала ......................................................... 20
2.2.1 Индикаторные порошки ...................................................................................... 21
2.2.2 Индикаторные трубки .......................................................................................... 22
2.3 Способы использования реагентов ....................................................................... 23
2.4 Способы физической и химической иммобилизации реагентов ....................... 24
2.5 Тест-методы определения тетрациклина .............................................................. 26
2.6 Применение алюмосиликатов в химическом анализе ......................................... 27
Выводы к теоретической части.................................................................................... 30
II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ........................................................................ 31
Глава 3. Методика проведения эксперимента ............................................................ 31
3.1 Используемые приборы и реактивы ...................................................................... 31
3.2 Условия выполнения анализа ................................................................................ 32
3.3 Методика определения сорбционной ёмкости пленки алюмосиликата ............ 32
3.4 Методика получения ИК-спектров........................................................................ 32
3
3.5 Методика получения наночастиц на основе Fe(III) ............................................. 33
3.6 Методика получение тонкопленочных покрытий на основе алюмосиликата
и Fe(III) на подложке .............................................................................................. 33
3.7 Методика тест-определения тетрациклина в водных растворах ....................... 34
3.8 Методика определения спектра диффузного отражения .................................... 35
Глава 4. Результаты исследования и их обсуждение................................................. 37
4.1 Синтез наночастиц на основе Fe(III), исследование влияния способа
их получения на размер частиц ............................................................................ 37
4.2 Получение
тонкопленочных
покрытий
на
основе
алюмосиликата
и нанокластеров Fe(III) на подложке .................................................................... 38
4.3 Спектрофотометрическое исследование реакции взаимодействия Fe(III)
и нано-Fe(III) с тетрациклином.............................................................................. 43
4.4 Апробация способа определения тетрациклина в модельных растворах ......... 47
4.4.1 Состав объектов анализа ..................................................................................... 47
4.4.2 Отбор и предварительная подготовка пробы .................................................... 49
4.4.3 Методика определения тетрациклина ................................................................ 50
4.4.4 Апробация методики............................................................................................ 50
Выводы к экспериментальной части ........................................................................... 53
ЗАКЛЮЧЕНИЕ ............................................................................................................. 54
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................... 55
4
ВВЕДЕНИЕ
Антибиотики
тетрациклинового
ряда
применяют
в
пищевой
промышленности и животноводстве для улучшения потребительских свойств
продуктов питания и снижения их себестоимости. Это одна из самых широко
используемых групп фармацевтических препаратов данного типа. Токсичность и
канцерогенность действия тетрациклиновых антибиотиков при регулярном
поступлении в организм человека с пищевыми продуктами (возникновение
аллергических реакций, дисбактериозов, подавление активности ферментов,
изменение микрофлоры кишечника и др.) делает необходимым мониторинг
качества и безопасности продуктов питания.
Известны различные методы количественного определения антибиотиков
тетрациклинового
ряда:
например,
фотометрический,
ВЭЖХ
с
масс-
спектрометрическим или УФ-детектированием, иммуноферментный анализ. К их
недостаткам можно отнести сложность, низкую чувствительность или высокую
стоимость проведения анализа. В связи с этим необходима разработка способов
анализа проб экспрессным, доступным, дешевым и простым методом. Данным
параметрам соответствуют оптические тест-системы, позволяющие получить
информацию о концентрации определяемого вещества в реальном объекте
практически мгновенно при этом визуализируя её. Известно, что антибиотики
тетрациклинового ряда при взаимодействии с ионами Fe(III) образуют
интенсивно окрашенный комплекс, что возможно использовать при тестопределении этих веществ. Однако, чувствительность данной реакции в растворе
невысока. Для улучшения данного параметра проводят реакцию на поверхности
твердого тела, тем самым добиваясь эффекта концентрирования.
Целью данной работы является разработка тест-системы для определения
тетрациклина в реальных объектах путем получения и изучения оптических
свойств материалов на основе наночастиц железа(III) иммобилизованных в
матрице тонкой пленки синтетического алюмосиликата.
Иммобилизация наночастиц Fe(III) на алюмосиликатной подложке позволит
увеличить чувствительность
определения
тетрациклина за счет
эффекта
5
концентрирования с одной стороны, а также происходит увеличение молярного
коэффициента поглощения комплекса «Fe-тетрациклин» при переходе к
наночастицам металла. Отметим, что белый цвет покрытия из алюмосиликата
делает удобным как визуальное, так и инструментальное детектирование.
Для достижения поставленной цели были сформулированы и решены
следующие теоретические и практические задачи:

систематический анализ литературных источников по проблемам
мониторинга содержания антибиотиков тетрациклинового ряда в
объектах сложного химического состава и методах их определения;

синтез наночастиц на основе Fe(III), исследование влияния
условий получения на их гранулометрический состав;

получение тонкопленочных покрытий алюмосиликатов на
подложке с заданными характеристиками;

изучение морфологии поверхности пленок алюмосиликата до и
после сорбционного модифицирования нанокластерами Fe(III);

спектрофотометрическое изучение реакции взаимодействия
Fe(III) с тетрациклином в растворе;

изучение оптических свойств систем «Алюмосиликат - Fe(III)»
по отношению к тетрациклину.
Научная и практическая значимость работы заключается в следующем:
впервые изучены тест-системы на основе алюмосиликатов для определения
тетрациклина. Полученные данные могут быть использованы при разработке
тест-системы для определения тетрациклина в реальных объектах при скрининганализе.
6
I. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
Глава 1. Общая характеристика тетрациклина и способов его определения
1.1 Общие сведения, применение, воздействие на организм человека
Тетрациклины – большая группа препаратов с общей основной структурой
и механизмом действия (рис.1.). Наиболее применяемыми антибиотиками данного
ряда являются досициклин, тетрациклин, окситетрациклин [1].
Рис. 1. Общая формула тетрациклинов
Тетрациклины являются прототипом антимикробных препаратов широкого
спектра действия. Они обладают бактериостатическим действием, т.е. угнетают
биосинтез белков микробной клетки в рибосомах. Препараты данного вида
действуют на многие грамположительные и грамотрицательные бактерии. На
вирусы и грибы не оказывают никакого влияния [2].
Тетрациклины бывают:
1) биосинтетическими (тетрациклин) (рис.2.);
2) полусинтетическими (доксициклин, метациклин)
Биосинтетические
жизнедеятельности
тетрациклины
лучистых
грибов.
представляют
В
основе
их
собой
структуры
продукт
лежит
конденсированная четырехциклическая тетрациклиновая система.
Характерным свойством тетрациклинов является разложение их щелочью с
образованием изотетрациклинов, что сопровождается усилением окрашивания по
сравнению с самим антибиотиком [3].
7
Кроме общих реакций, присущих всем тетрациклинам (реакция с раствором
хлорида железа (III), разложение щелочами, образование азокрасителя), отличить
их друг от друга можно по различному окрашиванию при действии
концентрированной серной кислоты. При этом образуются ангидротетрациклины,
окрашенные для каждого тетрациклина в определенный цвет, например, в случае
окситетрациклина образуется пурпурно-красное окрашивание, а в случае
тетрациклина – фиолетовое [4].
В медицине тетрациклины применяются при таких заболеваниях:

заболевания кожи (фурункул, угревая сыпь и др.);

сифилис;

инфекции
урогенитального
тракта
(хламидиоз,
уреаплазмоз,
миколазмоз);

клещевой боррелиоз;

лечение инфекций, вызванных актиномицетами;

бронхит, трахеит, пневмония.
На фармакологическом рынке в данное время эта группа антибиотиков
представлена двумя основными представителями [5]:

Тетрациклин – чаще используется при поражении кожи или глаз
различными инфекциями.

Доксициклин – используется для терапии инфекции урогенитального
тракта и других тяжелых инфекций. Этот антибиотик оказывает меньшее
негативное влияние на организм.
Тетрациклин представляет собой желтый кристаллический порошок без
запаха, горького вкуса. Желтая окраска обусловлена наличием хромофоров в
структуре веществ. Это обстоятельство обусловливает способность тетрациклина
поглощать свет как в ультрафиолетовой, так и в видимой областях спектра. При
хранении на свету темнеет. Тетрациклин мало растворим в воде, умеренно
растворим в 95% спирте [6].
8
Рис. 2. Химическая формула тетрациклина
Тетрациклин всасывается в кишечнике не полностью (около 60%),
длительность действия 6 часов. Данный препарат обладает устойчивостью по
отношению к жидкостям организма (плазма, моча, желчь) [7].
Тетрациклин образует труднорастворимые невсасывающиеся комплексы с
ионами металлов, при этом снижается его противомикробная активность.
Поэтому не следует одновременно принимать внутрь тетрациклин с молочными
продуктами, антацидными средствами, препаратами железа и другими металлами.
Тетрациклин в основном экскретируется почками в неизменном виде, и при
нарушении их функции накапливается в организме.
Помимо лечебных свойств, данные антибиотики могут оказывать и
негативное воздействие. Тетрациклины считаются токсичными антибиотиками,
также обладают тератогенностью. Кроме этого, представители данного класса
антибиотиков достоверно тормозят процессы остеогенеза и метаболизма костной
ткани. Антибиотики данного ряда депонируются в костной ткани, поэтому в
раннем возрасте возможны нарушения развития костной ткани и зубов;
тетрациклины не рекомендуют назначать детям до 8 лет, беременным и
кормящим матерям [8].
Побочные эффекты и осложнения от применения тетрациклина [9]:

раздражает слизистые ЖКТ при приеме лекарственного средства
внутрь, что является одной из основных причин диспептических
9
явлений (тошноты, рвоты, поноса), глоссита, стоматита и других
нарушений;

оказывает токсическое действие на печень, почки, систему
крови;

угнетает синтез белка, усиливает выделение из организма
аминокислот, воды, некоторых витаминов группы В и других
соединений;

депонируется в тканях, богатых кальцием, связывается с ионами
кальция, при этом нарушается структура скелета, происходит
повреждение зубов и окрашивание их в желтый цвет;

угнетает кишечную микрофлору и способствует развитию
кандидамикоза, суперинфекции (стафилококковый энтерит);

вызывает головокружение;

повышает чувствительность кожи к солнечному свету;

может вызывать явление менингизма;

просроченный препарат разрушает канальцы почек;

повышение внутричерепного давления;

вызывает аллергические реакции.
1.2 Пути попадания в продукты питания
Антибиотики в пищевых продуктах могут иметь следующие происхождения
[10]:
1) Природные компоненты некоторых пищевых продуктов с выраженным
антибиотическим действием (молоко, чеснок, лук, пряности, мед, яичный белок).
Эти вещества могут извлекаться из продукта и использоваться в пищевой
промышленности или медицине.
2) Образуются
в
результате
пищевых
продуктов
при
ферментативных процессах (например, при ферментации сыров);
3) Попадают в результате лечебно-ветеринарных мероприятий;
микробно-
10
4) используются в виде биостимуляторов - их добавляют в корм для
улучшения его усвояемости и стимуляции роста животных [11];
5) обработка антибиотиками помогает увеличить срок свежести мяса и
улучшить его качество.
Вследствие того, что группы применяемых антибиотиков у людей и
животных в сельском хозяйстве одинаковы, остаточные количества антибиотиков
в пищевых продуктах способствуют появлению устойчивых штаммов и у людей.
Соответственно
у
людей,
употребляющих
такие
продукты,
развивается
иммунитет к приему антибиотиков, и для получения ожидаемого эффекта при
лечении требуются все более сильные препараты [12].
1.3 Мониторинг содержания в продуктах питания
Использование в течение длительного времени в пищу продуктов
животного происхождения, которые содержат антибиотики, оказывает плохое для
здоровья
воздействие,
способствует
появлению
устойчивости
к
данным
лекарственным препаратам [13].
Лекарственные средства антибактериального происхождения влияют на
организм сенсибилизирующе, увеличивают аллергические и анафилактические
реакции, повреждают микрофлору кишечника и приводят к дисбактериозу [14].
Наиболее часто встречают в продуктах питания такие антибиотики, как
пенициллин, тетрациклин, стрептомицин и другие [15].
Антибактериальные препараты применяются в фермерском хозяйстве для
роста, увеличения эффективности откорма животных и для лечения болезней
животных.
Антибиотики тетрациклиновой группы встречаются в молоке и молочных
продуктах, яйцах, мясе, мясных продуктах, субпродуктах, меде.
В РФ действуют санитарно-эпидемиологические правила и нормативы, где
четко регламентируется содержание ряда антибиотиков в сырье и продуктах
животного происхождения [16,17].
11
Техническими
регламентами
таможенного
союза
не
допускается
содержание следующих антибиотиков [18]:
- в молоке и молочной продукции: левомицетина (хлорамфеникола) –
(менее 0,001мг/кг), тетрациклиновой группы – (менее 0,001мг/кг) [19] ,
- в мясе и мясной продукции: левомицетина – (менее 0,001мг/кг),
тетрациклиновой группы – (менее 0,001мг/кг), бацитрацина – (менее 0,02мг/кг)
[20].
Обеспечение безопасности пищевых продуктов на содержание в них
антибиотиков должна взять организация лабораторного контроля на наличие
антибиотиков в продуктах питания.
1.4 Методы определения остаточных количеств в продуктах питания
1.4.1 Определение методом ВЭЖХ
Широкое
применение
при
хроматографические методы анализа.
определении
антибиотиков
нашли
Метод ВЭЖХ позволяет провести
хроматографическое разделение антибиотиков тетрациклиновой группы и их
разновидностей. Метод заключается в проведении предварительной стадии
твердофазной экстракции в обращенно-фазном варианте и последующем
разделении и определении индивидуальных компонентов методом ВЭЖХ с массспектрометрическим детектированием [21].
Хроматографическое разделение тетрациклинов проводят на неподвижных
фазах с алкильными функциональными группами [22]. Содержание в пробе
антибиотика выполняют расчетом с помощью градуировочной характеристики
путем вычисления отношения площади пика фрагментного иона к площади
внутреннего стандарта и последующего соотношения с градуировочной кривой.
Некоторые из исследований приведены в таблице 1 [23].
12
Табл.1. Хроматографические методы определения антибиотиков в пищевых
продуктах
Антибиотик
Метод
окситетрациклин
ВЭЖХ
Условия
Предел
Объект
определения
обнаружения
анализа
ФЛ детектор
20 нг/г
рыбное
филе
окситетрациклин
ВЭЖХ
ФЛ детектор
0,04 мкг/г
ткани
свиней
окситетрациклин
ВЭЖХ
тетрациклин
постколон. ФЛ
1 нг/мл
коровье
детектир.
2 нг/мл
молоко
хлортетрациклин
4 нг/мл
1.4.2 Люминесцентные методы
Определение
антибиотиков
в
пищевых
продуктах
основано
на
использовании сенсибилизирированной люминесценции ионов Eu (III) и Tb (III) .
Антибиотики
обладают
высокими
значениями
молярных
коэффициентов
поглощения, что позволяет им эффективно поглощать энергию возбуждения.
Антибактериальные средства тетрациклинового ряда образуют с ионами
лантанидов комплексные соединения, в которых ионы Eu (III) и Tb (III)
обнаруживают интенсивную люминесценцию при =615 нм [24]. Для снижения
предела обнаружения при люминесцентном определении антибиотиков в качестве
аналитических форм часто используют разнолигандные комплексы, в которых в
качестве второго лиганда вводятся органические основания или донорноактивные вещества, такие как 1,10-фенантролин (Фен), триоктилфосфиноксид
(ТОФО),
β-дикетоны,
этилендиаминтетраацетат
(ЭДТА),
β-циклодекстрин,
оксикарбоновые кислоты и другие лиганды. Некоторые из этих исследований
приведены в таблице 2.
13
Методика предусматривает определение тетрациклина в курином мясе
непосредственно в фазе сорбента по люминесценции его комплекса с ионом Eu
(III), в присутствии цитрат – ионов и катионного ПАВ – цетилтриметиламмоний
хлорида [25].
Использование кинетической спектрофлуориметрии и разрешенной во
времени люминесценции иона Eu (III) дает возможность существенно повысить
избирательность при определении тетрациклина. При этом в качестве второго
лиганда применяют теноилтрифторацетон в присутствии тритона X-100, что
позволяет определять антибиотики в молоке с пределом обнаружения 0,04 и 0,125
мкг/мл соответственно без предварительного разделения.
Хемилюминесцентное определение тетрациклина в меде основано на
сенсибилизированной люминесценции ионов европия (III) в системе тетрациклин
«H2O2 - Fe (II)/Fe(III)». Предел обнаружения – 5,0·10-8 моль/л.
В некоторых исследованиях в качестве аналитического сигнала используют
собственную молекулярную люминесценцию антибиотиков.
Для быстрого определения тетрациклинов в мышечной ткани и почках
свиней антибиотики предварительно экстрагируют этилацетатом. Методом
твердофазной
экстракции
на
катионообменной
колонке
проводят
концентрирование и очищение экстракта. После чего регистрируют собственную
люминесценцию аналита.
Чувствительность метода составляет 0,1; 0,05; 0,2 мг/кг.
14
Табл.2. Определение антибиотиков по сенсибилизированной люминесценции
ионов лантанидов (III)
Антибиотик
Ион
Условия
Предел
Объект
Ln(III)
эксперимента
обнаружения
анализа
рН7,4,
окситетрациклин
Eu
цитрат-ион,
-циклодекстрин
окситетрациклин
Eu
ЭДТА, рН 9,0
5.0 нг/мл
6.7·10-9 моль/л
3.0 нг/г
молоко
корм для
животных
тетрациклин
окситетрациклин
хлортетрациклин
Eu
метанол, рН 9,0,
Amderlite XAD-4
2.3 ·10-9 моль/л
молоко
доксициклин
мицеллярные
хлортетрациклин
Eu
среды, ТОФО,
2.0 ·10-9 моль/л
рН 6,7
грудное
молоко
ТФ люм.ЭДТА,
хлортетрациклин
Eu
цитрат, ЦТА,
сорбент-картридж
19.0 нг/г
куриное мясо
0.04 нг/мл
молоко
для ВЭЖХ
кинетич. метод,
тетрациклин
Eu
рН 7,4, ТТА,
тритон Х-100
1.4.3 Электрохимические методы
Существуют методики электрохимического определения тетрациклина в
молоке с использованием амперометрического титрования и ионометрии. При
этом в качестве электродноактивного вещества мембран ионселективных
электродов использованы ионные ассоциаты антибиотиков тетрациклинового
15
ряда с гетерополианионами структуры Кеггина. В случае амперометрического
определения в качестве титранта применяют 12-молибдофосфорную кислоту. Эти
методики отличаются высокой чувствительностью, простотой и селективностью.
Пределы обнаружения составляют 7·10-6 - 1·10-5 моль/л [26].
Также изучены ионселективные электроды с мембраной на основе
электродно-активных соединений из анионообменников, азосоединений и
фталоцианатов металлов для определения антибиотиков.
Метод дифференциальной импульсной вольтамперометрии использован для
одновременного
определения
окситетрациклина,
тетрациклина
и
хлортетрациклина. В качестве стационарного применяется ртутный электрод
(висящая ртутная капля).
1.4.4 Скрининговые методы
В современном мире растет потребность появления новых методов
контроля для анализа таких объектов как, пищевые продукты, лекарственные
препараты, биологические жидкости. В результате значительно возрастает число
проб, которые необходимо анализировать. Альтернативным решением данной
проблемы
является
более
широкое
использование
методологии скрининга. Удобность этой методологии состоит в том, что когда
контролируемый компонент присутствует не во всех пробах
или если
присутствует, то в концентрациях, ниже нормируемой [27].
Предварительное обследование должно быть простым, дешевым, не
требующим высокой квалификации исполнителя, а главное оно должно быстро
обрабатывать большое число проб. При таком обследовании возможно два
результата – положительный и отрицательный. Пробы с отрицательным
результатом отсеиваются, а с положительным передаются для анализа с
использованием более мощных методов анализа.
Скрининг можно выполнять в аналитической лаборатории, но
удобнее
проводить исследование, как можно ближе к месту, где находятся анализируемые
16
объекты.
Для
анализа
желательны
«полевые»
приемы
скрининга
и
соответствующие средства для этого (карманные, переносимые и т.п.).
Тетрациклин
можно
определить
различными
иммунохимическими
методами, основанными на высокоспецифичных реакциях антиген-антитело. Эти
методы относятся к скрининговым методом анализа, они отличаются простотой
выполнения
аналитических
операций,
экспрессностью,
высокой
чувствительностью и селективностью, а также возможностью автоматизации и
использования
для
массовых
анализов.
Чаще
всего
используют
метод
твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA). C помощью метода
ИФА проведено определение тетрациклина в мясных продуктах, молоке, меде и
яйцах [28].
В настоящее время для определения тетрациклина в различных матрицах
активно разрабатываются иммуносенсорные методы, как более гибкие, быстрые и
менее трудоемкие, в отличие от ИФА. Недостатком этих методов является
высокая стоимость оборудования, а преимущество заключается в on-site
тестировании, т.е. образцы могут быть проанализированы непосредственно на
рабочем месте [29].
В качестве оборудования предложен одноразовый амперометрический
магнитный иммуносенсор для определения тетрациклинов в молоке, антитела
которого
были
иммобилизованы
на
поверхность
магнитных
шариков,
функционализованных протеином G. Амперометрический бисенсор на основе
screenprinted dual carbon electrode, использовали для одновременного определения
тетрациклина в молоке.
В качестве скрининговых методов определения тетрациклина в пищевых
продуктах животного происхождения перед хроматографическим определением
используется радио-иммунологический тест Charm II.
1.4.5 Иммунологические и микробиологические методы
В
молочной
промышленности
применяются
иммунологические
и
микробиологические тесты производства датской компании «Христиан Хансен» ,
17
- «Beta Sta
», «Tetra Sta
», «Beta Sta
Combo», «Copan Tes » для определения
антибиотиков.
С учетом требований, предъявляемых к экспресс-методам мониторинга
продовольствия (чувствительность, селективность метода, скорость получения
результатов, стоимость выполнения анализов), широко применяемым является
метод иммуноферментного анализа, в частности его разновидность - метод
ELISA, удовлетворяющий всем требованиям, предъявляемым к методам
рутинного контроля.
Принцип метода основан на конкуренции свободного антибиотика из
измеряемой пробы и антибиотика, предварительно иммобилизованного на
твердой фазе в составе белкового конъюгата, за центры связывания специфичных
к конкретному антибактериальному препарату антител.
Широкое применение нашли микробиологические методы, позволяющие
определять минимальные концентрации антибиотиков в продуктах питания. Они
базируются на непосредственном биологическом действии антибиотиков на
чувствительные штаммы микроорганизмов и поэтому являются наиболее
специфичными и объективными [30].
Содержание
тетрациклина
выявляют
микробиологическим
методом
диффузии в агар по величине торможения роста тест культур Bac.cereus ATCC
11778 (с чувствительностью 0,01 ЕД/г/мл).
1.4.6 Тест-методы
Методы тест-систем характеризуются простотой и удобством применения.
Они не требуют дополнительного оборудования или считывающего устройства,
позволяют проводить анализ в полевых условиях. Тестовые полоски с
результатами анализа долго сохраняются и могут быть использованы для
сравнительной оценки определений достаточно длительный срок [31].
Существуют
такие
тетрациклинового ряда, как:
тест-методы
для
определения
антибиотиков
18
«Tetrastar» – экспресс–тест, основанный на анализе специфического
рецептора тетрациклиновой группы, имеет высокую чувствительность к
антибиотикам группы тетрациклина. Чувствительность составляет 60-80 мкг/кг.
«Betastar Combo» – экспресс–тест, обладающий чувствительностью к
антибиотикам двух групп: бета–лактамов и тетрациклинов. Чувствительность
теста – от 2 до 50 мкг/кг.
Набор Ridascreen Tetracyclin представляет собой тест-систему для иммуноферментного анализа в комплекте с необходимыми реагентами, предназначен для
обнаружения сверхмалых остаточных концентраций тетрациклинов в мясе, меде и
молоке [32].
Тест «Снап Тетрациклин» так же является имунноферментным методом
определения остаточного тетрациклина, хлортетрациклина и окситетрациклина в
сыром цельном коровьем молоке на уровне, не превышающем допустимые
стандарты.
Все перечисленные тест-системы обладают рядом преимуществ:

высокая чувствительность;

экспрессность;

простота применения;

устойчивый результат анализа во времени.
Однако они имеют и недостатки:

специфичность условий хранения;

дороговизна.
19
Глава 2. Тест-системы: общая характеристика
2.1 Характеристика тест-систем и требования к ним
В химическом анализе тестирование (тест) – это быстрый и однозначный
отклик (оценка) на присутствие и/или содержания определяемого химического
компонента в образце.
Тест-системы - это простые, портативные, легкие и дешевые аналитические
средства и соответствующие экспрессные методики, которые позволяют
обнаружить и определить вещества без существенной пробоподготовки (иногда
без отбора проб), без использования сложных стационарных приборов,
лабораторного оборудования, без самой лаборатории, без сложной обработки
результатов, а также подготовленного персонала; в большинстве случаев
применяют автономные средства однократного использования.
Использование аналитических реакций и реагентов в условиях и формах,
обеспечивающих получение визуально наблюдаемого или легко измеряемого
эффекта является общим принципом всех химических тест-методов.
Требования к тест-системам:
1. При оценке наличия нужного компонента предпочтительнее ошибочное
«да», чем ошибочное «нет»;
2. Экспрессность метода, т.е. используемые химические реакции должны
протекать быстро;
3. Минимальное число операций;
4. Границы раздела по-разному окрашенных зон, при визуальной оценке,
должны быть четкими, изменения окраски достаточно контрастными и
другое.
Перспективным в данной области является использование химических сенсоров.
Под химическими сенсорами обычно понимают датчик, помещенный в
анализируемую среду, который непрерывно и обратимо регистрирует содержание
какого-либо одного компонента [33].
20
Тест-системы нашли обширное применение в анализе воздуха рабочей
зоны, обнаружение и количественное определение содержания наркотических
веществ и алкоголя, клинические исследования (определение сахара в крови).
Классификация тест-систем приведена в схеме 1.
Схема 1.Классификация тест-систем
2.2 Системы регистрации визуального сигнала
Самыми распространенными в тест-методах являются визуальные методы:
они самые дешевые и простые. Оценка изменений окраски при взаимодействии
21
тест-средства с определяемым компонентом является очень известным способом.
В качестве примера можно привести появление окрашивания в трубке при
обнаружении паров алкоголя в выдыхаемом воздухе водителей автомобиля.
Визуальные методы используются в качественном, полуколичественном, а
иногда и в количественном анализе. Точность визуальных методов недостаточно
высокая. К этим методам относится капельный анализ [34].
В последнее время появилась возможность создавать портативные приборы,
такие как фотометры, рефлектометры, люминометры, турбидиметры. Нашли
широкое применение аналитические приборы карманного типа с автономным
электропитанием, которые характеризуются простотой использования.
Также для визуальной регистрации аналитического сигнала используют
такие тест-средства как: бумажные индикаторные полоски, индикаторные трубки,
таблетки.
2.2.1 Индикаторные порошки
Индикаторные порошки – это смеси необходимых реагентов для
определения веществ, либо сыпучие материал, на которых находятся реагенты. В
первом случае концентрацию определяют по интенсивности окраски жидкости
после внесения индикаторного порошка и его растворения анализируемом
растворе.
Во
втором
случае
индикаторный
порошок
вносят
в
пробу,
перемешивают и определяют концентрацию по интенсивности окраски.
Индикаторные порошки могут быть помещены в специальные приборы для
тест-определений, показанные на рисунке 3.
22
Рис. 3. Прибор для тест-определений с использованием индикаторных
порошков:1-колориметрическая трубка; 2- анализируемый раствор; 3 –
индикаторный порошок
Сочетание сорбционного концентрирования определяемого компонента из
разбавленных растворов с его визуальным определением на поверхности
объясняет использование индикаторных порошков. Высокая чувствительность
определения возникает за счет высокой прозрачности индикаторных порошков. С
увеличением удельной площади поверхности чувствительность определения
возрастает.
2.2.2 Индикаторные трубки
Индикаторные трубки – это стеклянные трубки заполненные носителем с
закрепленным на нем реагентом. Через трубку пропускают определенный объем
анализируемой жидкости. Данную операцию можно провести с помощью
шприца, за счет гидростатического давления или за счет капиллярных сил,
опустив трубку в анализируемую жидкость и подождав, когда жидкость
поднимется до конца заполняющего трубку слоя сорбента. В результате
взаимодействия
между
закрепленным
реагентом
и
аналитом
образуется
соединение, имеющее окраску, отличную от окраски слоя сорбента. Длина
окрашенной зоны зависит от концентрации аналита.
Способы определения концентрации с помощью индикаторных трубок с
принудительным пропусканием анализируемой жидкости, методом погружения и
23
поднятия
жидкости
за счет капиллярных
сил, методом погружения с
использованием гидростатического давления представлены на рисунке 4 .
Рис. 4. Способы определения концентрации с помощью индикаторных трубок с
принудительным пропусканием анализируемой жидкости (а), методом
погружения и поднятия жидкости за счет капиллярных сил (б), методом
погружения с использованием гидростатического давления (в): 1- анализируемая
жидкость; 2 – индикаторная трубка; 3 – окрашенная зона сорбента
2.3 Способы использования реагентов
Известны три основных вида использования аналитических реагентов в
тест-системах:
1) Применение в виде заранее приготовленных и фасованных растворов;
В этом случае обычно используют водные растворы, их помещают в
ампулы, капельницы, закрытые пробирки. Концентрация реагентов соответствует
ожидаемой концентрации определяемого компонента.
2) Применение в форме заранее взвешенных и упакованных доз в виде
порошков, шариков, таблеток и т.п.
Кроме аналитических реагентов в тест-средства вводят и другие вещества –
восстановители или окислители, буферы, маскирующие агенты, смачивающие
соединения и др.
3) Иммобилизованные на твердую матрицу (носитель).
24
В
роли
твердого
носителя
может
использоваться
бумага,
ткань,
синтетические органические полимеры, силикагель и др.
Существенное значение имеет природа носителя, способ его приготовления
и способ его иммобилизации. Реагент иммобилизируют адсорбцией, испарением
растворителя после импрегнирования раствором реагента в этом растворителе,
другими физическими методами или химической иммобилизацией. Недостатком
таких тест-систем является частичное смывание реагентов
при контакте с
раствором.
2.4 Способы физической и химической иммобилизации реагентов
Существуют практически неограниченные возможности для направленного
изменения
химико-аналитических
свойств
сорбентов
посредством
модифицирования их различными реагентами. Иммобилизация – это процесс о
фиксации соединений на поверхности носителя или процесс переноса вещества из
гомогенной подвижной фазы на поверхность твердой фазы-носителя и его
закрепление за счет специфических взаимодействий. Иммобилизированные тестсредства классифицируют по трем основным признакам:

по способу иммобилизации (физическая за счет физической
сорбции; химическая - за счет ковалентной прививки модификатора);

по типу модификатора (органический и неорганический);

по типу носителя (смолы, пенополиуретаны, силикагели,
мембраны).
Способ физической иммобилизации чаще всего зависит от носителя, но
также важна химическая природа реагента – модификатора или сорбируемого
вещества. Предпочтительны малорастворимые в воде реагенты, т.к. с ними
получаются более стабильные при хранении тест-формы, которые слабо
вымываются из тест-матрицы при контакте с исследуемой жидкостью [34].
Все методы физической иммобилизации разделяют на три группы:
25
1. адсорбция на поверхности нерастворимого носителя (в том случае, когда
удерживающая поверхность или часть поверхности носителя «омывается»
внешней средой (жидкой или газообразной);
2. включение в массу носителя (включение в двухфазную реакционную
среду, где препарат может находиться только в одной из фаз);
3. иммобилизация в полимерных пленках (мембранах) (вещество и
небольшая часть внешней среды помещены в замкнутый объем, отделенный от
остальной среды избирательно проницаемой мембраной, размер пор, в которой
таковы, что субстраты и продукты через них проникают, а иммобилизованный
препарат удерживается внутри замкнутого объема).
Способы физической иммобилизации реагентов:
1.
Иммобилизация на поверхности носителя.
При иммобилизации на носителе препарат может быть зафиксирован
различными силами:
– ионные, гидрофобные, водородные и др.;
– комплексообразующие;
– химически удерживающая матрица должна иметь особые группировки,
способные реагировать с компонентами препарата (этот случай можно
рассматривать как хемосорбцию); либо для ковалентного связывания препарата с
носителем необходим специальный сшивающий агент.
2.
Иммобилизация в массе носителя.
Сила, позволяющая удерживать вещество в объеме носителя, может
реализовываться как обездвиживание за счет физических факторов (просто
массой носителя, т. е. механически), так и фиксация с образованием ковалентных
связей между компонентами препарата и веществом матрицы (препарат
«вшивается» в носитель) (рис. 5).
В этом варианте иммобилизации получается более высокая концентрация
иммобилизованного вещества в носителе, позволяющая повысить продуктивность
процесса в целом. Преимуществом этого вида иммобилизации по сравнению с
иммобилизацией на носителе заключается
в хороших эксплуатационных
26
свойствах
получаемых
систем,
в том
числе
и
защищены
от
многих
неблагоприятных факторов окружающей среды.
Рис.5. Иммобилизация в массе носителя
(1-носитель; 2-препарат; 3- внешняя среда)
3.
Иммобилизация в полимерных пленках (мембранах).
Существуют различные вариации этого метода, но они различаются лишь
способами получения избирательно проницаемой мембраны и ее природой.
Важным фактором является толщина мембраны – с ее уменьшением происходит
повышение
проявляемой
иммобилизованным
веществом
активности,
что
определяется возможностью увеличения диффузии субстрата к сенсору.
При химической иммобилизации в качестве носителей используют бумагу,
органополимерные сорбенты и силикагели.
2.5 Тест-методы определения тетрациклина
Работа тест-систем основана на принципе
иммунохроматографического
анализа.
На первой стадии анализа тетрациклин из пробы связывается с конъюгатом
антител в лунках. При нанесении пробы на иммунохроматографическую полоску
несвязанные антитела связываются с антигеном, нанесенным на мембрану
полоски, в результате чего образуется окрашенная полоса в зоне Т [35].
27
Если в пробе содержится тетрациклин в концентрации выше его предела
обнаружения, окрашенная полоса в зоне Т не образуется. Появление полосы в
зоне С свидетельствует о правильности работы теста.
В обезжиренном молоке предел обнаружения тетрациклина составляет 100
мкг/л. Результат теста будет отрицательным, если в пробе содержится не более
100 мкг/л.
2.6 Применение алюмосиликатов в химическом анализе
Силикаты – это соли кремниевых кислот. Основным структурным
элементом силикатов являются тетраэдры, которые образуются атомами кремния
с четырьмя атомами кислорода.
Алюмосиликаты
–
это
такие
силикаты,
в
которых
кремний
в
кремнийкислородных тетраэдрах частично замещен алюминием. Простейшим
соединением
подобного
рода
является
алюмокремниевая
кислота.
Алюмосиликаты делятся на природные и синтетические. Синтетические
алюмосиликаты, образующие основную кристаллическую фазу керамических
материалов,
стекольной,
применяют
в
фарфоровой
качестве
и
футеровочного
металлургической
материала
агрегатов
промышленности,
как
изоляционные материалы. Алюмосиликаты типа природных цеолитов используют
в качестве адсорбентов при очистке, осушке и разделении газов, для умягчения
воды, в хроматографии, в качестве катализаторов или носителей катализаторов и
др.
Алюмосиликатный природный сорбент отличается уникально высокой
сорбционной
способностью
к
ионам
тяжелых
металлов,
в
том
числе
радиоактивных элементов.
Фильтрование на природных цеолитах или других природных сорбентах
используется
для
повышения
эффективности
биосорбционной
очистки. Биологическая очистка бытовых и промышленных стоков и методы
биотехнологии для очистки воды от тяжелых металлов — перспективные области
исследований.
28
Алюмосиликаты все чаще и чаще применяются в химическом анализе,
потому что они обладают такими свойствами, как экономичность, доступность,
импортозамещаемость.
Они
нашли
применение
в
самых
разнообразных
ионообменных, каталитических и адсорбционных процессах.
Широкое применение алюмосиликаты нашли при сорбции бензапирена,
который относится к сильным канцерогенам. Методика проведения данного
анализа описана в работе [36].
Также
нашли
сельскохозяйственных
применение
природных
алюмосиликаты
объектов.
Описание
при
данной
очистке
работы
представлено в методике [37].
Для определения антибиотиков в молочных продуктах также применяются
алюмосиликаты. В данной работе матрицей для химического модифицирования
железом служил синтетический алюмосиликат типа NaX. Выбор данного
материала обусловлен простотой его получения, высокими сорбционными
свойствами, дешевизной и хорошими цветометрическими характеристиками [38].
Также в последние годы приобретает все большее значение разработка
процессов адсорбционной очистки нефтепродуктов, связанных с применением
алюмосиликатов и внедрение непрерывных схем этих процессов. Примером
может служить очистка бензинов непредельного состава адсорбционным
методом.
Применение искусственных и природных алюмосиликатов позволяет
заменять одни катиониты, находящиеся в растворе, другими. Если пропустить
речную
воду
или
воду
из
других
источников
через
алюмосиликаты,
предварительно обработанные раствором поваренной соли, можно добиться ее
умягчения в результате замены катионитов кальция, магния, определяющих
жесткость воды, на катионы натрия.
В современном мире ставится такая задача по применению алюмосиликатов
- это расширение ассортимента с целью их применения в качестве эффективных
реагентов:
29

адсорбента для процессов очистки углеводородных фракций от
серосодержащих соединений;

катализатора при конверсии углеводородов;

компонента для получения синтетических цеолитов, в качестве
связующего для изготовления литейных форм.
30
Выводы к теоретической части
Обобщены и систематизированы литературные данные о применении
антибиотика тетрациклинового ряда - тетрациклина в животноводстве, пищевой
промышленности, медицине и ветеринарии. Приведены пути его поступления в
организм человека, показано негативное воздействие на него.
Проведен обзор основных методов и методик определения остаточных
количеств антибиотиков в продуктах животного происхождения. Изучены
основные аналитические характеристики методов, показаны их плюсы и минусы.
Большое внимание уделено существующим на данный момент тест – методикам
определения тетрациклина, показаны их достоинства и недостатки.
31
II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Глава 3. Методика проведения эксперимента
3.1 Используемые приборы и реактивы
Реактивы: Все используемые реактивы имели квалификацию «ос.ч.»,
«х.ч.», «ч.», «ч.д.а.». Растворы приготовлены на бидистиллированной воде.
Исходный
раствор
Fe(III)
с
концентрацией
0,01
моль/л
готовили
растворением точной навески FeCl3·6H2O в бидистиллированной воде. Рабочие
растворы с концентрациями
0,002 моль/л готовили разбавлением исходного
раствора в день выполнения эксперимента.
В качестве спектрофотометрического реагента для определения Fe(III)
использовали водный раствор салициловой кислоты с концентрацией 2,5 мг/мл.
Исходный раствор тетрациклина с концентрацией 0,01 моль/л получали
растворением
точной
навески
фармацевтического
препарата
в
бидистиллированной воде. Рабочие растворы готовили разбавлением исходного
маточного раствора.
Морфологию
микроскопом
поверхности
исследовали
сканирующим
зондовым
СММ-2000. С учетом диэлектрических свойств использовали
режим атомно-силовой микроскопии (АСМ). Исследуемая поверхность обладала
достаточной твердостью для использования контактной моды. Сканирование
проводили кантилевером MSCT-AUNM с радиусом закругления зонда ~30 нм.
Обработка и количественный анализ АСМ изображений осуществляли с
помощью программы Scan Master for SMM-2000 v. 6.7.02.
При получении синтетического алюмосиликата использовали Na2SiO3
квалификации «х.ч.».
Приборы:
Измерение массы проводилось на аналитических весах Ohaus Explorer Pro
EP114.
Перемешивание
растворов
осуществляли
на
магнитных
Используемый фильтр «Белая лента».
ИК-спектры получали на ИК-спектрометре ФСМ 2202.
мешалках.
32
Получение
пленки
алюмосиликата
проводили
электрохимически.
Использовали источник тока, в качестве подложки служил алюминий марки A99
(99,98%).
Вся аппаратура, примененная для опытов,
прошла метрологическую
аттестацию в соответствии с требованиями государственных стандартов.
3.2 Условия выполнения анализа
Научно-исследовательская работа проведена при следующих условиях:

температура окружающего воздуха 20±5 °С,

относительная влажность воздуха от 30 до 80%,

атмосферное давление от 630 до 800 мм.рт.ст,

напряжение питающей сети 220±10 В.
3.3 Методика определения сорбционной ёмкости
пленки алюмосиликата
Определяли количество сорбированного элемента в каждом опыте, делая
пересчет на 1 г сорбента по формуле (1):
СЕС 
А
М

г / г  (1),
где А – масса вещества в аликвоте исходного раствора, мг; M – масса
сорбента в эксперименте, г.
3.4 Методика получения ИК-спектров
Для удаления воды, все необходимые реактивы и посуду, нужно
предварительно прокалить в течение 5 часов при температуре 120ºС.
После этого необходимо очистить посуду изопропиловым спиртом для
удаления частиц и других загрязнений.
Для снятия ИК-спектров исследуемого вещества использовали метод
прессования таблеток с KBr. В навеску 0,3 г KBr для ИК-спектрометрии, вносится
0,001 г образца алюмосиликата [39]. Смесь истирается в фарфоровой ступке и
33
формируется в таблетки на гидравлическом прессе с использованием специальной
пресс-формы. Таблетка получается прозрачная или полупрозрачная.
Далее снимается ИК-спектр пропускания полученного образца.
Обработка полученных ИК-спектров проводится с помощи программы
FSpec 4.1.
Для того чтобы расшифровать спектры необходимо учесть проявление в
них адсорбированной воды, которая всегда находится в некотором количестве в
гигроскопичном КВr (1640 и 3450 см-1).
3.5 Методика получения наночастиц на основе Fe(III)
Нанокластеры на основе железа(III) получали путем гидролиза соли FeCl3
(2·10-3 М). В работе нами получены образцы золя при следующих условиях:
1) гидролиз при нагревании с последующей УЗ-обработкой;
2) гидролиз при нагревании с одновременной УЗ-обработкой.
Во
всех
экспериментах
температура
нагревания
составляла
85°С,
продолжительность УЗ-обработки 15 минут, 25 кГц.
Далее из полученного золя аликвотную часть наносили на кремниевую
пластину
и
высушивали
её
до
воздушно-сухого
состояния.
Размерные
характеристики частиц определяли методом атомно-силовой микроскопии
(микроскоп СММ 2000) .
3.6 Методика получение тонкопленочных покрытий на основе
алюмосиликата и Fe(III) на подложке
При электролизе водного раствора силиката натрия при различном
напряжении на аноде происходит формирование механически прочной пленки
алюмосиликата [40] с высокой степенью адгезии к поверхности подложки. В
качестве материала подложки использовали алюминий марки А99 (99,99%),
который предварительно готовили по методике заключающейся в первичной
шлифовке
пастой
ГОИ,
далее
обработкой
поверхности
смесью
кислот
HF/HCl/HNO3/Н2О (1:20:10:69) и дальнейшем обжиге при температуре 550°С.
34
Непосредственно
перед
элеткролизом
полученную
подложку
протирали
изопропиловым спиртом.
Контроль поверхности подложки проводили металлографическим методом
(микроскоп Альтами МЕТ 1 С).
3.7 Методика тест-определения тетрациклина в водных растворах
В спектре поглощения водного раствора тетрациклина наблюдается две
широкие полосы с максимумами при 265 и 345-360 нм (рис. 6). Контроль за
распределением тетрациклина в системе водный раствор – сорбент осуществляли,
измеряя оптическую плотность растворов до и после сорбции в максимуме
поглощения самой длинноволновой полосы при 345-360 нм. Градуировочный
графики для определения тетрациклина в водных растворах показаны на рисунке
7.
Рис.6. Спектры поглощения водного раствора тетрациклина
35
Изучение
вариантах:
1
возможности
-
статическом
тест определения
(при
проводили
перемешивании)
с
в
нескольких
детектированием
порошкообразного сорбента и таблетированного - после прессования; и 2 динамическом – при пропускании водного раствора тетрациклина различной
концентрации через колонку наполненную модифицированным цеолитом.
Исходя из эксперимента, времени проведения методики и её трудоемкости
оптимальным является динамический метод.
Рис.7. Градуировочный график для определения тетрациклина
3.8 Методика определения спектра диффузного отражения
После проведения сорбции сорбенты отделяли от растворов, высушивали на
воздухе и измеряли спектр диффузного отражения. Для этого измеряли
коэффициент диффузного отражения (R) образцов в диапазоне 380 - 720 нм с
шагом 5 нм. Полученные данные в виде массива коэффициентов диффузного
отражения для различных длин волн использовали для дальнейшего расчета
функции Гуревича – Кубелки – Мунка (F) по формуле (2):
36
(1  R ) 2 2,3c
F

(2),
2R
S
где R-диффузное отражение; Ɛ – молярный коэффициент поглощения
вещества в фазе сорбента, c- концентрация, S – коэффициент рассеивания.
Для бесконечно толстого слоя частиц с диаметром несколько микрометров
окрашенных порошкообразных материалов используют формулу (3) , которая
связывает диффузное отражение с оптическими характеристиками образца:
(1  R  ) 2 / 2R    / s (3),
где R∞-абсолютное диффузное отражение, β-коэффициент поглощения, sкоэффициент рассеяния света [41].
Для слабопоглощающих образцов, которые содержат сорбированные
соединения используют формулу (4):
β=2,3Ɛс (4),
где Ɛ-молярный коэффициент поглощения сорбата, с - его концентрация.
Отсюда следует, что
функция Кубелки-Мунка линейно связана с
концентрацией сорбата, а зависимость F=f( ) совпадает со спектром его
поглощения в растворе.
37
Глава 4. Результаты исследования и их обсуждение
4.1 Синтез наночастиц на основе Fe(III), исследование влияния способа
их получения на размер частиц
В работе нами получены образцы золя при следующих условиях:
1) гидролиз при нагревании (85 ºС) с последующей УЗ-обработкой (25 кГЦ,
15-20 минут);
2) гидролиз при нагревании (85 ºС) с одновременной УЗ-обработкой (25
кГЦ, 15-20 минут);
Далее из полученного золя аликвотную часть наносили на кремниевую
пластину и высушивали её до воздушно-сухого состояния [42].
В качестве примера на рисунке 9 приведена морфология поверхности
кремниевой пластины после осаждения частиц, полученных методом №1.
Рис. 9. Морфология поверхности образца №1 на кремниевой пластинке.
2D АСМ-кадр (слева); 3D АСМ-кадр (справа)
Анализ результатов определения гранулометрического состава частиц
железа(III) дает следующие результаты: частицы, полученные по методу №1
имеют широкий разброс размеров от 160 нм до 620 нм, средний размер частиц
составляет 250-300 нм; для образца золей №2 разброс размеров частиц
значительно уже от 70 нм до 330 нм, средний размер 170-220 нм.
Гидролиза FeCl3 проходит согласно уравнению:
38
FeCl3 + 3Н2О = Fe(ОН)3 + 3НСl.
В результате происходит образование мицеллы следующего состава:
{m[Fe(OH)3]nFeO+(n–x)Cl-}+x·xCl-.
Далее в работе использовали нанокластеры на основе Fe(III) полученные в
следующих
условиях:
нагревании
2·10-3М
водного
раствора
FeCl3
при
температуре 85°С и одновременной УЗ-обработкой с частотой излучения 25кГц в
течение 15-20 минут.
4.2 Получение тонкопленочных покрытий на основе алюмосиликата и
нанокластеров Fe(III) на подложке
При электролизе водного раствора Na2SiO3 при различном напряжении на
аноде происходит формирование механически прочной пленки алюмосиликата с
высокой степенью адгезии к поверхности подложки [43].
Идентификацию природы образующегося покрытия проводили путем
сравнения полос поглощения (ПП) в его ИК-спектре с характеристическими ПП
для алюмосиликатов (рис.10). Спектр формируется из двух интенсивных полос в
диапазоне волновых чисел 400 – 625 см-1 и 900 – 1300 см-1, каждая из которых
имеет тонкую структуру в виде наплывов. Данные полосы поглощения отнесены
к колебаниям внутри тетраэдров [(Al,Si)O4]-каркаса. Поглощение валентных и
деформационных колебаний Si-O-связей представлено интенсивной уширенной
полосой с максимумами при 1006 см-1. Полоса поглощения при 876 см-1 может
быть отнесена к колебаниям ОН-групп, принадлежащих Si-OH или Si-O(H)-Al.
Полоса поглощения при 705 см-1 связана с деформационными колебаниями Si-OSi-связей кремнекислородного тетраэдра SiO4. К различного рода колебаниям SiO-Al, O-Si-O, Si-O-H групп относятся полосы поглощения при 587 см -1 и средней
интенсивности при 451 см-1. Полоса поглощения с частотой 1652 см-1
соответствует деформационным колебаниям молекул воды.
39
Рис. 10. ИК-спектр пленки
Ключевую роль в эффективности практического применения пленки
алюмосиликата в качестве матрицы-носителя
при дальнейшем получении
композиционного материала с заданными оптическими свойствами играют
особенности его пористой структуры в совокупности определяющиеся текстурой
материала. Возможность направленного контроля текстурных характеристик
матрицы
обеспечивает
целостность
покрытия
и
воспроизводимость
его
характеристик.
Нами определено влияние внешних факторов, связанных с технологией
получения покрытия (напряжение, концентрация исходных веществ) на его
структурно-геометрические характеристики: толщина, морфология и удельная
площадь поверхности.
Влияние напряжения изучали в диапазоне 8-26 В, концентрацию NaOH
составляла от 0.05 М до 0.20 М, концентрация водного раствора Na2SiO3 во всех
случаях была постоянной и составляла 0.5 М.
40
Общий
вид
поверхности
исходной
алюминиевой
подложки
после
подготовки по методике [40] приведен на рисунке 11.
Рис. 11. Поверхность исходной алюминиевой подложки после подготовки
Типичное АСМ-изображение поверхности изучаемого материала при
различном напряжении представлено на рисунке 12. Структурными элементами
формируемой поверхности являются отдельные глобулы или их агломераты,
плотно
прилегающих
друг
к
другу
и
образующих
единый
каркас
с
многочисленными порами. Из анализа полученных АСМ кадров следует, что
диаметр глобул колеблется в интервале ~ 170 нм ÷ 200 нм, диаметр агломератов
составляет ~ 400 нм ÷ 800 нм; поры, образующиеся между глобулами, имеют
ширину от 15-20 нм до 35-40 нм, а диаметр пор образующихся за счет
дефектности структуры поверхности пленки составляет от 60 нм до 120-150 нм.
41
Рис. 12. АСМ-изображение поверхности подложки после электролиза при
напряжении 22 В (слева) и 8 В (справа)
Установлено, что толщина пленки зависит от величины приложенного при
электролизе напряжения и исходной концентрации Na2SiO3. Так повышение
напряжения при электролизе приводит к образованию более тонкого покрытия.
На рисунке 12 слева на право напряжение уменьшалось и составляло 26 В,
22 В, 16 В и 12 В, а толщина пленки соответственно увеличивалась от 200-300 нм
до 15 мкм. Толщина пленки при достижении окончания её роста составляет ~1516
мкм
не
зависимо
от
величины
приложенного
напряжения.
Среднеквадратичная шероховатость профиля Rq составляет 18±2 нм (22 В) и
80±7 нм (12 В), а средний масштаб шероховатости Ra характеризуется размерами
14±2 нм (22 В) и 74±4 нм (l=300 нм).
Пример некоторых полученных образцов приведен на рисунке 13.
42
Рис. 13. Примеры образцов с покрытием из алюмосиликатов
Исходя из необходимости видимого визуального детектирования окраски
подложки, величины шероховатости её поверхности и удельной площади
поверхности нами выбраны условия для получения покрытий: 0.5 М раствор
Na2SiO3 и напряжение 12 В.
Полученное покрытие на основе алюмосиликата выступало в качестве
матрицы для дальнейшей иммобилизации нанокластеров на основе Fe(III) путем
их сорбции из золя. Техника его получения заключалась в нагревании 2·10 -3М
водного раствора соли при температуре 85°С и одновременной УЗ-обработкой с
частотой 25кГц в течение 15-20 минут. Химизм происходящего процесса и
природа образующейся частицы рассмотрены в [42].
Размер полученных частиц определен исходя из их АСМ-изображения (рис.
4) после осаждения на алюминиевую подложку с известной морфологией
поверхности. Основная доля наночастиц имеет диаметр от 130 нм до 150 нм.
Морфология поверхности полученной системы представлена на рисунке 14.
Из него прослеживаются образования по размерам сопоставимые с диаметром
нанокластеров Fe(III) ~ 150-170 нм.
43
Рис. 14. АСМ-изображение поверхности подложки после электролиза при
напряжении 22 В (слева), 8 В (в центре) и после сорбции нанокластеров Fe(III)
(справа)
4.3 Спектрофотометрическое исследование реакции взаимодействия Fe(III) и
нано-Fe(III) с тетрациклином
Химическое взаимодействие между железом и тетрациклином протекает по
следующей схеме, изображенной на рисунке 15.
Рис.15.Взаимодействие тетрациклина и железа
На рисунке 16 в качестве примера приведены спектры поглощения
комплекса тетрациклин – наночастицы железа (III), и тетрациклин – ионы железа.
Из рисунка видно увеличение оптической плотности в первой системе по
сравнению со второй, т.е. при переходе к наночастицам на основе железа
44
молярный коэффициент поглощения для изучаемых нами систем увеличивается
на ≈20% [44].
Рис.16. Спектр комплексного соединения нанокластеров железа (1) и ионов
железа (2) с тетрациклином
Далее фиксировали спектры диффузного отражения (спектрофотометр СФ
56
с
приставкой
СДО)
алюмосиликатной
иммобилизованными наночастицами
матрицы,
матрицы
с
железа, и образующихся комплексов с
тетрациклином. На рисунках 17-18 приведены данные спектры. Из них следует,
что наблюдается образование специфической полосы поглощения характерной
для комплекса система алюмосиликат-наночастицы железа-тетрациклин, что
возможно
использовать
твердотельных тест систем.
в
анализе
реальных
объектов
при
разработке
45
Рис. 17. Спектр диффузного отражения алюмосиликатной матрицы с
наночастицами Fe(III)
Рис. 18. Спектр диффузного отражения тест-системы после сорбции
тетрациклина
46
Проверку возможности тест определения антибиотиков проводили из
модельных водных систем с различной концентрацией тетрациклина
доксициклина.
Спектры
диффузного
отражения
обрабатывали,
и
применяя
функцию Гуревич-Кубелки-Мунка [45]. На рисунке 19 приведены спектры,
полученные
после
определения
тетрациклина
в
водных
растворах
с
увеличивающейся концентрацией тетрациклина от 0.4 мкг/мл до 4 мкг/мл.
Наблюдается
количественная
зависимость
«концентрация
антибиотика
–
величина аналитического сигнала».
Рис. 19. Спектры, полученные после определения тетрациклина в водных
растворах с увеличивающейся концентрацией тетрациклина
от 0.4 мкг/мл до 4 мкг/мл.
Анализ метрологических характеристик показывает достаточно высокую
чувствительность,
потенциально
позволяющую
количественно
определять
47
антибиотики в реальных объектах (мази, продукты питания). Отмечается
визуальное изменение окраски покрытия при переходе к более высоким
концентрациям антибиотиков в растворе [46].
4.4 Апробация способа определения тетрациклина в модельных растворах
4.4.1 Состав объектов анализа
Производство молока стало крупной отраслью промышленности в
современном мире.
Молоко является сложным по составу питательным продуктом, содержащее
более 100 различных веществ в форме раствора, взвеси или водяной эмульсии.
Казеин – это основной молочный белок, который присутствует в виде большого
числа, не осаждающихся, твердых частиц размером порядка 30-300 нм. Сами
частицы называются кластерами, а в молоке они формируют образование,
называемое коллоидной взвесью [47]. Жир и жирорастворимые витамины
содержатся в молоке в виде эмульсии, т.е. в виде взвеси глобул (шариков),
которые не смешиваются с водой молока. Также есть вещества, которые
полностью растворяются в воде молока. К ним относятся: лактоза, некоторые
белки (сывороточный белок), минеральные соли и другие вещества.
Молоко обладает уникальным питательным балансом. Индикатором этого
баланса является количество воды в молоке. У всех животных вода является
питательным веществом, которое требуется в наибольших количествах. Молоко
является источником большого количества воды - оно состоит из воды
приблизительно на 90%. Содержание воды в молоке регулируется количеством
лактозы, синтезированной секреторными клетками молочных желез. Вода,
необходимая для секреции молока, поступает в молочные железы через кровоток.
Основным углеводом молока является лактоза. Концентрация лактозы в
молоке практически постоянна и составляет в среднем около 5% (4,8-5,2%).
Молекулы, которые образуют лактозу, присутствуют в молоке в гораздо меньших
концентрациях: глюкоза – 14 мг/100г, и галактоза – 12 мг/100г.
48
Аминокислоты – это строительный блок белков. Концентрация белка в
молоке колеблется от 3,0 до 4,0% (30-40 грамм на литр). Значение этой
концентрации зависит от породы коров и пропорционально количеству жира в
молоке. Существует зависимость между количеством жира и количеством белка в
молоке - чем больше жира, тем больше белка. Белки в молоке делятся на две
основные группы: казеины (80%) и сывороточные белки (20%). Все белки молока
относятся к группе полноценных, т.е. содержащих в своем составе все 20
аминокислот. В их числе 8 незаменимых аминокислот, которые не могут
синтезироваться в организме человека и должны поступать с пищей. Отсутствие
хотя бы одной из них влечет за собой нарушение обмена веществ. Среди
незаменимых аминокислот особенно важны три: метионин, лизин и триптофан.
Метионин - регулирует жировой обмен и предотвращает ожирение печени. Лизин
- тесно связан с кроветворением. Недостаток его в пище приводит к тому, что
нарушается кровообразование, уменьшается число красных кровяных телец эритроцитов, уменьшается количество гемоглобина. При недостатке в пище
лизина нарушается обмен азота, отмечается истощение мышц, нарушается
кальцификация костей и возникает ряд изменений в печени и легких. Триптофан необходим для синтеза некоторых важных соединений (никотиновая кислота,
серотонин). Нарушения его обмена могут приводить к слабоумию. Также
нарушения обмена триптофана могут служит показателем таких заболеваний, как
туберкулез, рак, диабет.
Жиры в молоке обычно от 3,5 до 6,0% в зависимости от породы коров и
кормовой практики. Основная часть жиров в молоке существует в виде
триглицеридов, образованных соединением глицерина и жирных кислот.
Исследование
минерального
состава
золы
молока
с
применением
полярографии, ионометрии, атомно-абсорбционной спектрометрии и других
современных методов, показало наличие в нём более 50 элементов. Они
подразделяются на макро- и микроэлементы.
49
Минеральными веществами, входящими в состав молока, являются
кальций, магний, калий, натрий, фосфор, хлор и сера, а также соли – фосфаты,
цитраты и хлориды.
Микроэлементами принято считать минеральные вещества, концентрация
которых невелика и измеряется в микрограммах на 1 кг продукта. К ним
относятся железо, медь, цинк, марганец, кобальт, йод, молибден, фтор, алюминий,
кремний, селен, олово, хром, свинец и др. В молоке они связаны с оболочками
жировых шариков (Fe, Cu), казеином и сывороточными белками (I, Se, Zn, Al,),
входят в состав ферментов (Fe, Mo, Mn, Zn, Se), витаминов (Co). Их количество в
молоке значительно колеблется в зависимости от состава кормов, почвы, воды,
состояния здоровья животного, а также условий обработки и хранения молока.
Микроэлементы обеспечивают построение и активность жизненно важных
ферментов, витаминов, гормонов, без которых невозможно превращение
поступающих в организм животного (человека) пищевых веществ. Также от
поступления
многих
микроэлементов
зависит
жизнедеятельность
микроорганизмов рубца жвачных животных, участвующих в переваривании
корма и синтезе многих важных соединений (витаминов, аминокислот).
4.4.2 Отбор и предварительная подготовка пробы
В молоке присутствуют компоненты, мешающие проведению анализа
(молочный жир, белок). В ходе анализа были поставлены две основные задачи:
установить алгоритм предварительной пробоподготовки, позволяющий устранить
влияние
матрицы,
а
также
найти
оптимальные
условия
сорбционного
концентрирования и инструментального определения тетрациклина предлагаемой
тест-системой.
Первая стадия определения тетрациклина в молоке и молочных продуктах
включает пробоподготовку - удаление из пробы белков и жира. Для этого в 150250 см3 анализируемого продукта вносят 2-3 см3 концентрированной уксусной
кислоты и термостатируют при 50-55С в течение 5-10 мин. Не рекомендуется
вести процесс при большей температуре, т.к. это может вызвать деструкцию
50
тетрациклина. Далее пробу перемешивают и центрифугируют 5-7 мин при 30005000 об/мин. Центрифугат переносят в колбу, доводят рН среды до 2,5 50%
азотной кислотой и добавляют 25 см3 универсальной буферной смеси (рН=2,50)
[48].
Вторая стадия: сорбция тетрациклина [49]. В полученный центрифугат
вносят пластинку тест-системы. Дают ей постоять 20-25 минут.
Третья стадия: заключается в инструментальном определении концентрации
аналита в растворе в соответствии со спектром диффузного отражения по заранее
построенному градуировочному графику.
4.4.3 Методика определения тетрациклина
Заключительная стадия анализа предполагает определение тетрациклина
методом СДО-СФ при длине волны 410 нм. Содержание тетрациклина в пробе
определяют методом градуировочного графика.
Построение градуировочной кривой. В 5 колб на 100 см3 вносят 0,1; 0,5; 1,0;
2,0; 4,0 см3 16 мкг/мл раствора тетрациклина и доводят объем до метки
дистиллированной водой. В каждую колбу вносят тест пластинку и дают постоять
20 мин. Полученные тест-пластинки анализируют методом СДО-СФ при
=410нм. По полученным данным строят график в координатах «оптическая
плотность – содержание тетрациклина в пробе».
4.4.4 Апробация методики
Для апробации разработанной методики проводили анализ образцов молока
и молочных продуктов, содержащих точно известное количество тетрациклина.
Для всех исследуемых образцов после их предварительной пробоподготовки и
последующего химического анализа получены соответствующие результаты,
которые представлены в таблице 3.
Анализ метрологических характеристик способа определения тетрациклина
в молоке и молочных продуктах показывает высокую чувствительность,
избирательность
и
воспроизводимость
результатов.
Предел
определения
51
тетрациклина по предлагаемой методике (рассчитанный по 3 критерию)
составляет 80 мкг/кг.
Табл. 3.Результаты определения тетрациклина в молоке и молочных
продуктах (n=5, P=0,95)
Введено, мкг/см3
Так
Найдено, мкг/см3
sr
0,000
-
-
0,040
0,035±0,006
0,12
0,160
0,159±0,015
0,07
0,480
0,482±0,041
0,06
же
проведено
изучение
некоторых
молочных
продуктов
с
использованием разработанной нами методики.
Для проведения анализа взяты образцы:

молочная продукции компании ОАО «Юнимилк» (кефир «Для всей
семьи», 2,5% жира, произведено в России, г. Орел);

молочная
продукции
компании
ОАО
«Юнимилк»
(молоко
«Простоквашино», 2,5% жира, произведено в России, г. Липецк);

молочная продукции компании ООО «Маслово» (молоко 2,5% жира,
произведено в Орловской области, село Маслово).
Результаты определения остаточных количеств тетрациклина в изучаемых
молочных продуктах представлены в таблице 4 и на рисунке 20.
52
Табл. 4. Результаты определения тетрациклина в изучаемых молочных
продуктах (n=5, P=0,95, Vпробы=160 мл)
№
п
Введено,
Наименование продукта
мкг
/
Найдено, мкг
Содержание,
мкг/л
п
1
Кефир «Для всей семьи»
2 Молоко «Простоквашино»
3
Молоко «Маслово»
0
2,660,55
16
18,780,49
0
0,820,71
16
16,480,64
0
3,090,48
16
19,030,52
16,020,55
6,51,7
30,620,44
Рис.20. Результаты СФ-СДО определения тетрациклина в изучаемых
молочных продуктах
53
Выводы к экспериментальной части
1. Выявлены оптимальные условия получения тонкопленочного покрытия на
основе
синтетического
алюмосиликата
(0.5 М раствор Na2SiO3
и
напряжение 12 В), которое было использовано в качестве матрицы для
иммобилизации нанокластеров на основе Fe(III). Получена твердотельная
сенсорная система на основе тонкопленочного покрытия синтетического
алюмосиликата и нанокластеров железа(III) для определения тетрациклина.
2. Проведено спектрофотометрическое исследование реакции взаимодействия
Fe(III) и нано-Fe(III), что показало увеличение молярного коэффициента
поглощения при реакции наночастиц железа с тетрациклином.
3. Определена практическая возможность использования данной системы на
модельных водных растворах тетрациклина.
54
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. Проведен
литературный
обзор
применения
и
путей
поступления
антибиотиков и в частности тетрациклина в организм человека, методах и
методиках контроля их содержания.
2. Обобщены и систематизированы литературные данные о тест-методах
определения антибиотиков, их достоинствах и недостатках.
3. Получена твердотельная сенсорная система на основе тонкопленочного
покрытия синтетического алюмосиликата и нанокластеров железа(III) для
определения тетрациклина. Определены оптимальные условия получения
тонкопленочного покрытия на основе синтетического алюмосиликата
(0.5 М раствор Na2SiO3 и напряжение 12 В), которое использовано в
качестве матрицы для иммобилизации нанокластеров на основе Fe(III).
4. Проведено спектрофотометрическое исследование реакции взаимодействия
Fe(III) и нано-Fe(III), что показало увеличение молярного коэффициента
поглощения при реакции наночастиц железа с тетрациклином.
5. Определена практическая возможность использования данной системы на
модельных растворах тетрациклина.
6. Показаны перспективы создания портативных компактных приборов для
определения антибиотиков тетрациклиновой группы в продуктах питания,
работающих на принципах оптического изменения окраски тест-систем.
55
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1.
Харкевич, Д.А. Фармакология: учебник / Д.А. Харкевич - М.: ГЭОТАРМедиа, 2017. - 760с.
2.
Майский, В.В. Фармакология: учебное пособие: в 2 ч. / В.В. Майский. - М.:
ГЭОТАР-Медиа, 2003 . - 2 ч.
3.
Чабанова, В.С. Фармакология: учебное пособие / В.С. Чабанова. – Минск:
Высшая школа, 2009. – 445 с.
4.
Беликов В.Г. Фармацевтическая химия: в 2 ч. / В.Г. Беликов. – М.: Высшая
школа, 1993. – 2 ч.
5.
Мелентьева Г.А. Фармацевтическая химия; 2-е изд. / Г.А. Мелентьева, Л.А.
Антонова – М.: Медицина, 1993. – 405с.
6.
Арзамасцев,
А.П.Фармацевтическая
химия:
учебное
пособие
/
А.П.Арзамасцев - М.: ГОЭТАР – Медиа, 2006 г.-268 с.
7.
Катцунг, Б.Г. Фармакология: в 2 т. / Бертрам Г. Катцунг – Санкт Петербург:
Бином, 2007. – 2т.
8.
Аксенов В.И. Антибиотики в продуктах животноводства / В.И. Аксенов, В.Ф.
Ковалев – М.: Колос, 1977. – 160с.
9.
Воробьева
Т.В.
Влияние
на
организм
антибиотических
примесей,
обнаруживаемых в продуктах питания животного происхождения / Т.В.
Ворбьева // Рациональное питание: Сб. науч. тр. Киев: Здоровье. – 1980. –
Вып. 15. – С.56 – 58.
10. Мозгов, И.Е. Антибиотики в животноводстве и ветеринарии / И.Е. Мозгов. –
М.: Сельхозиздат, 1963. – 264с.
11. Кононова,
С.П.
Применение
антибиотиков
в
кормлении
сельскохозяйственных животных / С.П. Кононова // Обз, инф. ВНИИТЭИСХ.
– М.: 1973.
12. Мурох, В.И. Загрязненность пищевых продуктов антибиотиками / В.И.
Мурох, В.К. Криничная, Д.Б. Меламед – Минск, 1991. – 39с.
56
13. Булатов, В.В., Хохоев, Т.Х., Дикий, В.В., Заонегин, С.В., Бабин, В.Н.
Проблема малых и сверхмалых доз в токсикологии. Фундаментальные и
прикладные аспекты // Рос. хим. ж. – 2002. – Т. XLVI, № 6. – С. 58–62.
14. Симецкий, O.A. Санитарное значение примеси антибиотиков в молоке.
Санитария производства молока / O.A. Симецкий – М.: Колос, 1974. – с.
4565.
15. Контроль за остаточным содержанием антибиотиков в продуктах питания //
БИОФАЙЛ
научный информационный журнал (официальный сайт)
[Электронный
ресурс].
–
–
2010.
Режим
доступа:
http://biofile.ru/bio/17884.html. – Дата доступа: 12.05.2018.
16. СанПиН
2.3.2.560-96
Государственная
система
санитарно-
эпидемиологического нормирования РФ «Гигиенические требования к
качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов».–
М.: 1997.
17. СанПиН
2.3.2.1078-01
эпидемиологического
Государственная
нормирования
РФ
система
санитарно-
«Гигиенические
требования
безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов» – М. – 2001.
18. Технический регламент Таможенного Союза ТР ТС 021/2011 2 «О
безопасности пищевой продукции».
19. Технический
регламент
Таможенного
Союза
ТР
ТС
033/2013
«О
безопасности молока и молочной продукции».
20. Технический регламент Таможенного Союза ТР ТС 034/2013
«О
безопасности мяса и мясной продукции».
21. Попков, В.А., Пузаков, С.А. Общая химия: учебник / В.А.Попков, С.А.
Пузаков – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010 – 673-674с.
22. Соколова, Л.И. Определение левомицетина и тетрациклина в пищевых
продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / Л.И.
Соколова, А.П. Черняев // ЖАХ. – 2001. – № 11. – С. 1178 - 1180.
23. ГОСТ
Р
53601-2009.
Метод
определения
остаточного
содержания
антибиотиков тетрациклиновой группы с помощью высокоэффективной
57
жидкостной
хроматографии
с
масс-спектрометрическим
детектором.
Национальный стандарт Российской федерации. Издание официальное. – М.:
Стардантинформ, 2010. – 15с.
24. Спектрофотометрические
и
люминесцентные
методы
определения
лантаноидов / Н.С. Полуэктов, Л.И. Кононенко, Н.П. Ефрюшина, С.В.
Бельтюкова. - Киев: Наукова думка, 1989. - 256 с.
25. ГОСТ 7202.0-74 «Мясо птицы». – М.: Стандартин-форм, 1974. – 8с.
26. Бельтюкова, С.В., Ливенцова, Е.О. Методы определения антибиотиков в
пищевых продуктах: обзор.
/ Научные труды Одесской национальной
академии пищевых технологий / С.В. Бельтюкова, Е.О. Ливенцова, – Од.:
2012. – 13с.
27. Золотов, Ю.А. О химическом анализе и о том, что вокруг него: учебное
пособие / Ю.А.Золотов – М.: Наука, 2004 г. - 477 с.
28. Пономарева, Е.А. Обработка условий и постановки ИФА для определения
антибиотиков тетрациклинового ряда / Е.А. Пономарева, A.A. Комаров //
Материалы первого съезда фармакологов России. 2007. - С. 500 - 503.
29. ГОСТ Р 53774-2010. Молоко и молочные продукты. Иммуноферментные
методы определения наличия антибиотиков. – М.: Стандартин-форм, 2010. –
11 с.
30. МУК
4.1.2158-07
Определение
остаточных
количеств
антибиотиков
тетрациклиновой группы и сульфаниламидных препаратов в продуктах
животного происхождения методом иммуноферментного анализа.
31. ГОСТ Р 51600-2000 Молоко. Методы определения наличия антибиотиков. –
М.: Стардантин-форм, 2010. – 10с.
32. Определение тетрациклина в молоке и в меде. Тест-система RIDASCREEN
Tetracyclin //
ресурс].
ОДО «КомПродСервис» (официальный сайт) [Электронный
–
2014.
–
http://www.komprod.com/ru/products/pr2/antibacterial/.
10.05.2018
Режим
–
доступа:
Дата
доступа
58
33. Золотов, Ю.А. Химические тест-методы анализа / Ю.А Золотов, В. М.
Иванов, В.Г. Амелин. – М.: Едиториал УРСС, 2002. – 302 с.
34. Золотов, Ю.А. Основы аналитической химии: учебник для вузов: в 2 кн. /
Ю.А Золотов, Е.Н. Дорохова.  М.: Высшая школа, 2004. 413 с.  1 кн. 
Общие вопросы. Методы разделения.
35. Удалова,
А.Ю.
Сорбционное
концентрирование
антибиотиков
тетрациклиновой группы для их последующего определения: дис. к-та хим.
наук: 02.00.02 /Удалова Алла Юрьевна. – М., 2015. – 153 с.
36. Osckotskaya E.R., Gribanov E.N., Taskanova E.V. Determining benzo(a)pyrene in
objects in light industry by HPLC after preconcentration with aluminosilicate //
Moscow University Chemistry Bulletin – 2017. – Т. 72– № 4. – С. 183-186.
37. Грибанов
Е.Н.,
Оскотская
спектрометрическое
Э.Р.,
определение
Саунина
пестицидов
И.В.
Хромато-масс-
различных
классов
в
растительных объектах / Заводская лаборатория. Диагностика материалов. –
2017. – Т.83. – №5. – С. 5-8.
38. Оскотская Э.Р., Грибанов Е.Н., Калинин М.Н., Митяева Е.В., Панферова Е.В.
Цветометрическое и тест-определение тетрациклина и доксициклина в
молоке и молочных продуктах после сорбционного концентрирования на
химически модифицированном алюмосиликате // Вестник Московского
университета. Серия 2: Химия. – 2016. – Т.56. – № 5. – С. 296-300.
39. Тарасевич, Б.Н. Основы ИК спектроскопии с преобразованием Фурье.
Подготовка проб в ИК спектроскопии / Б.Н.Тарасевич // Пособие к
спецпрактикуму по физико-химическим методам.  М.: МГУ,2012.  С.17-22.
40. Грибанов
Е.Н.
Получение
тонкопленочного
покрытия
на
основе
алюмосиликатов // XIV Российская ежегодная конференция молодых
научных
сотрудников
и
аспирантов
«Физико-химия
и
технология
неорганических материалов» (с международным участием). М: ИМЕТ РАН,
2017. – С. 447-449.
59
41. Рамазанова
Г.Р.
Сорбционно-спектроскопическое
определение
синтетических анионных пищевых красителей: дис. к-та хим. наук: 02.00.02
/Рамазанова Гюсселем Рамисовна. – М., 2016. – 166 c.
42. Напольский К.С. Синтез пространственно упорядоченных металл-оксидных
нанокомпозитов на основе пористого Al2O3 / Под ред. А.Р. Кауля. – М.:
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, 2008. – 211
с.
43. М.В. Жуков, В.В. Левичев Получение наноструктурированных пленок Al2O3
методом электрохимического анодирования / Научно-технический вестник
информационных технологий, механики и оптики. – 2013. – Т.85. – № 3. – С.
143-146.
44. Булатов
М.И.,
Калинкин
И.П.
Практическое
рукодовство
по
фотометрическим методам анализа – 5e издание, перераб. – Л.: Химия, 1986 –
432 c.
45. Кортюм Г., Браун В., Герцог Г. Принципы и методика измерения в
спектроскопии диффузного отражения // Успехи физ. наук. – 1965 . – Т.85. –
№ 2. – С. 365-379.
46. Салмахаева
A.M.
Исследование
сорбционного
концентрирования
тетрациклина на различных сорбентах // Естественные науки. Журнал
фундаментальных и прикладных исследований – 2009. – Т. 29. – № 4. – С.
190-199.
47. Савицкая, Т. А. Коллоидная химия: лаб. практикум для студентов,
обучающихся по спец. 1-31 05 01 «Химия (по направлениям)» / Т. А.
Савицкая, М. Б. Черепенников, М. П. Шевелева – Минск: БГУ, 2012. – 14-15
с.
48. ГОСТ 3622-68 Молоко и молочные продукты отбор проб и подготовка их к
испытанию. Межгосударственный стандарт. Использование и издание
официальное. – М.: Стардантин-форм, 2009. – 10с.
49. Оскотская
Э.Р.,
Грибанов
Е.Н.,
Калинин
М.Н.
Сорбционно-
хроматографическое определение тетрациклина в молоке и молочных
60
продуктах // Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. – 2014 .
– №5 . – С.50-54.
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа